特許 5675098 ＤＮＡ分子の増幅および解離挙動を監視するシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5675098

(24)【登録日】2015年1月9日

(45)【発行日】2015年2月25日

(54)【発明の名称】ＤＮＡ分子の増幅および解離挙動を監視するシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150205BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20150205BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20150205BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20150205BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150205BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 A

   C12M1/34 Z

   C12M1/00 A

   G01N37/00 101

   !C12N15/00 A

【請求項の数】29

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2009-518229(P2009-518229)

(86)(22)【出願日】2007年6月27日

(65)【公表番号】特表2009-542207(P2009-542207A)

(43)【公表日】2009年12月3日

(86)【国際出願番号】US2007014827

(87)【国際公開番号】WO2008005241

(87)【国際公開日】20080110

【審査請求日】2010年5月21日

(31)【優先権主張番号】60/806,440

(32)【優先日】2006年6月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】11/606,006

(32)【優先日】2006年11月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507028217

【氏名又は名称】キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＯＮ Ｕ．Ｓ． ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100094112

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 讓

(74)【代理人】

【識別番号】100096943

【弁理士】

【氏名又は名称】臼井 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100102808

【弁理士】

【氏名又は名称】高梨 憲通

(74)【代理人】

【識別番号】100128646

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 恒夫

(74)【代理人】

【識別番号】100128668

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 正巳

(74)【代理人】

【識別番号】100134393

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 克彦

(74)【代理人】

【識別番号】100136799

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 亜希

(72)【発明者】

【氏名】ハッソン，ケントン，シー．

(72)【発明者】

【氏名】デイル，グレゴリー，エー．

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２５７５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１１２３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２５３４６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２６１３５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−０５２３９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３０５２１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Mol. BioSyst.，２００６年 ５月１７日，Vol.2，p.292-298

【文献】 Anal. Chem.，２００３年，Vol.75，p.2414-2420

【文献】 第3回化学とマイクロシステム研究会 講演予稿集，２００１年，p.5

【文献】 Anal. Chem.，２００６年 ４月 １日，vol.78，p.2220-2225

【文献】 Cellular and Molecular Biology，２００４年，Vol.50, No.3，p.217-224

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）核酸を含む１つのボーラスをマイクロチャネル内に導入すること、
（ｂ）前記ボーラスを前記マイクロチャネルに通して強制的に移動させること、
（ｃ）前記ボーラスが前記マイクロチャネルを通って移動している間、（ｉ）前記ボーラスの温度サイクルを繰り返して前記ボーラス中に含まれる核酸を増幅し、（ｉｉ）各温度サイクルあたり少なくとも一度、イメージセンサによって前記ボーラスの画像を取り込み、前記取り込んだ画像を処理して前記ボーラスから放射された光の強度を決定することを含む方法で、所定の発光強度閾値に達しているかを判定すること、
（ｄ）前記所定発光強度閾値に達しなかったという前記判定の結果に応答して、ステップ（ｃ）を繰り返し、
（ｅ）前記所定発光強度閾値に達したという前記判定の結果に応答して、前記温度サイクルを停止して、前記ボーラスが依然として前記マイクロチャネルを通って移動している間、連続的に一定の割合で前記ボーラスの温度を上げることにより前記ボーラス中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させ、イメージセンサを使用して前記ボーラスの画像を取り込むこと、ただし前記増幅が停止しボーラス中のｓｓＤＮＡへの遷移のための熱勾配がはじまる時の、前記ボーラスのチャネルの長さに沿った位置が前記発光強度閾値により決定される、
を含む核酸の増幅と解離を監視する方法。

【請求項2】

前期所定の発光強度閾値に達しているかを判定するステップが、（ａ）前記決定した強度を表す値をある閾値と比較するステップ、または（ｂ）前記ボーラスからの発光の強度変化率を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記決定した強度を表す値が前記閾値よりも大きいという前記判定の結果に応答して、前記ボーラス中の前記ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させるための処理を開始するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記処理を開始する前記ステップが、加熱システムを構成してボーラスの温度を緩やかに上昇させることを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記温度を一定またはほぼ一定の速度で上昇させる、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記一定の速度が毎秒約０．１℃と２℃の間にある、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記イメージセンサを使用して前記ボーラスの画像を取り込むステップが、前記イメージセンサの視野内で対象となる領域を決定し、次いで前記イメージセンサの、対象となる前記領域に対応する画素だけを読み出すことを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ステップ（ｃ）が、（ｉｉｉ）（ａ）前記ボーラスに少なくとも所定の回数のＰＣＲ温度サイクルをかけたかどうか、（ｂ）特定の時点から少なくとも所定の時間が経過したかどうか、および／または（ｃ）前記ボーラスが前記マイクロチャネルの既定の領域に入ったかどうかを判定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

マイクロ流体チャネルを備える基板と、
前記マイクロ流体チャネルの少なくとも一部分に熱を加え、またそこから熱を吸収するように動作可能な熱発生ユニットと、
前記チャネルの前記部分がイメージセンサの視野内に入るように前記基板に対して配置された前記イメージセンサと、
前記イメージセンサに結合された画像処理システムであって、（ｉ）前記イメージセンサから画像データを受け取り、（ｉｉ）前記イメージセンサからの画像データを使用して、（ａ）前記チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上であるかどうか、または（ｂ）前記チャネルの前記部分を通って移動する前記核酸試料からの発光の強度変化率が所定の閾値以下であるかどうか、を判定するように構成された画像処理システムと、
温度コントローラであって、前記熱発生ユニットを制御するように構成され、かつ前記熱発生ユニットが、（ａ）前記チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上である、または（ｂ）前記核酸試料からの発光の強度変化率が所定の閾値以下である、と判定する前記画像処理システムに応答して、前記チャネルの前記部分の温度に第１の温度から第２の温度まで一定の割合で緩やかに勾配を付けるように構成された温度コントローラとを含む、ただし前記増幅が停止し前記核酸試料中のｓｓＤＮＡへの遷移のための熱勾配がはじまる時の、前記核酸試料のチャネルの長さに沿った位置が前記発光強度閾値により決定される、光学分析システム。

【請求項10】

前記温度コントローラがさらに、所定の入力に応答して前記熱発生ユニットが前記チャネルの前記部分の温度サイクルを繰り返すように構成される、請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

イメージセンサ・コントローラをさらに含み、前記イメージセンサ・コントローラが、前記イメージセンサに、前記熱発生ユニットが前記チャネルの前記部分の温度サイクルを繰り返している間、前記イメージセンサの視野内にある前記チャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を取り込ませるように動作可能である、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記イメージセンサ・コントローラが、前記イメージセンサに、前記熱発生ユニットが前記チャネルの前記部分の温度に勾配を付けている間、前記イメージセンサの視野内にある前記チャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を取り込ませるように動作可能である、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記イメージセンサ・コントローラが、前記イメージセンサに、前記熱発生ユニットが前記チャネルの前記部分の温度サイクルを繰り返している間、前記イメージセンサの視野内にある前記チャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を９０秒ごとに少なくとも１枚取り込ませるように動作可能である、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記イメージセンサ・コントローラが、前記イメージセンサに、前記熱発生ユニットが前記チャネルの前記部分の温度に勾配を付けている間、前記イメージセンサの視野内にある前記チャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を少なくとも毎秒５枚取り込ませるように動作可能である、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記熱発生ユニットが、前記チャネルの前記部分に加える熱量を毎秒約０．１℃から２℃の間のある熱勾配率で間断なく増加させることによって、前記チャネルの前記部分の温度に勾配を付けるように構成される、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記チャネルの前記部分向けの電磁放射を生成する励起源をさらに含む、請求項９に記載のシステム。

【請求項17】

（ａ）前記チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上である、または（ｂ）前記核酸試料からの発光の強度変化率が所定の閾値以下である、と判定する前記画像処理システムに応答して、前記チャネルの前記部分の少なくともセグメントを照光する第２の励起源をさらに含む、請求項１６に記載のシステム。

【請求項18】

前記イメージセンサがＣＭＯＳイメージセンサであり、前記第２の励起源がレーザである、請求項１７に記載のシステム。

【請求項19】

チャネルを備える基板を含むシステムにおいて、
リアルタイムＰＣＲ試薬を含む溶液の試料を前記チャネルに通して強制的に移動させること、ならびに、
前記試料が前記チャネルの分析領域を通って移動している間、
（ａ）前記試料の温度サイクルを所定発光強度閾値を満たすまで繰り返すステップと、
（ｂ）各温度サイクルあたり少なくとも一度、イメージセンサによって前記試料の画像を取り込み、前記取り込んだ画像を処理して前記試料から放射された光の強度を決定することにより、前記試料中の核酸が十分に増幅されているかを判定するステップと、
（ｃ）前記試料中の核酸が十分に増幅されたという前記判定の結果に応答して、前記試料の温度サイクルを停止して、ステップ（ａ）を実施した後に、前記試料の温度を第１の温度から第２の温度まで緩やかに一定の割合で上昇させるステップ、ただし前記増幅が停止し前記試料中のｓｓＤＮＡへの遷移のための熱勾配がはじまる時の、前記試料のチャネルの長さに沿った位置が前記発光強度閾値により決定される、と、
（ｄ）前記試料の温度を緩やかに上昇させる前記ステップを実施している間、イメージセンサを使用して前記試料からの発光を監視するステップとを実施することを含む核酸の増幅と解離を監視する方法。

【請求項20】

前記試料中の前記核酸が十分に増幅されたかどうかを判定する前記ステップが、前記試料から放射された光の強度を決定すること、および前記決定した強度をある強度閾値と比較することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記イメージセンサを使用して前記試料の画像を取り込む前記ステップが、前記イメージセンサの視野内で対象となる領域を決定し、次いで前記イメージセンサの、対象となる前記領域に対応する画素だけを読み出すことを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記試料の温度サイクルを繰り返す前記ステップが、以下の（ｉ）前記試料の温度を第１の温度またはその近くの温度に少なくとも第１の期間保持するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の後に、加熱源を使用して前記試料の温度が前記第１の温度から第２の温度になるように加熱するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の後に、前記試料の温度を前記第２の温度またはその近くの温度に少なくとも第２の期間保持するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の後に、前記加熱源を使用して前記試料の温度が前記第２の温度から第３の温度になるように加熱するステップと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）の後に、前記試料の温度を前記第３の温度またはその近くの温度に少なくとも第３の期間保持するステップとを１回または複数回実施することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記試料の温度を前記第１の温度から前記第２の温度まで緩やかに上昇させる前記ステップが、前記温度を一定またはほぼ一定の速度で上昇させることを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記一定の速度が毎秒約０．１℃と１℃の間にある、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記温度を一定またはほぼ一定の速度で上昇させることが、前記温度を前記速度で少なくとも約１分間上昇させることを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記試料にかけた温度サイクルの回数の記録を取るステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項27】

前記試料に少なくとも所定の回数の温度サイクルをかけたかどうかを判定するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

特定の時点から少なくとも所定の時間が経過したかどうかを判定するステップをさらに含む請求項１９に記載の方法。

【請求項29】

前記チャネルの既定の領域に前記試料が入ったかどうかを判定するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＤＮＡ分子の増幅およびそのＤＮＡ分子の解離挙動を監視するシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0002】

核酸を検出することは、医学、法科学、産業プロセス、作物および動物の育種、ならびに他の多くの分野の中心になっている。疾病状態（例えば癌）、感染性微生物（例えばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾病の診断および見通し、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の正確な鑑識、産業用微生物を繁殖させる能力、および他の多くの技法のための広く普及した技術である。対象となる核酸の完全性についての判定は、感染症または癌の病状に関係することがある。微量の核酸を検出するための最も強力で基本的な技術は、核酸配列の一部またはすべてを何回も複製してから、その増幅生成物を分析することである。ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲは、ＤＮＡを増幅するためのよく知られている技法である。

【0003】

ＰＣＲを用いると、単一の鋳型ＤＮＡ分子から始めて数百万のＤＮＡコピーを迅速に生成することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡを１本ずつの鎖に変性させること、その変性鎖にプライマーをアニーリングすること、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によってプライマーを伸長させることからなる３段階の温度サイクルを含む。このサイクルが何回も繰り返され、その結果、処理の終了時には検出および分析するのに十分なだけのコピーがあるようになる。ＰＣＲに関する全般的な詳細については、SambrookおよびRussell、「Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (3rd Ed.)」、Vols. 1−3、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N．Y．(2000)、F. M. Ausubel他「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates, IncとJohn Wiley & Sons, Incの合弁企業であるCurrent Protocols編集（２００５年にかけて補遺あり）、およびM.A. Innis他「PCR Protocols A Guide to Methods and Applications」、Academic Press Inc.、San Diego, Calif.編集(1990)を参照されたい。

【0004】

いくつかの応用例では、増幅処理が進行しているときにＤＮＡ生成物の蓄積を監視することが重要である。リアルタイムＰＣＲとは、反応が進むにつれ増幅されたＤＮＡ生成物の蓄積をＰＣＲサイクルごとに通常１回測定する、発展中の一連の技法を指す。増幅処理を経時的に監視することにより、処理の効率を判定すること、ならびにＤＮＡ鋳型分子の初期濃度を推定することが可能になる。リアルタイムＰＣＲに関する全般的な詳細については、K. Edwards他「Real-Time PCR: An Essential Guide」、Horizon Bioscience, Norwich, U.K.編集(2004)を参照されたい。

【0005】

より最近では、ＰＣＲおよび他の増幅反応を行う高い処理能力の手法がいくつか開発されており、これには、例えば、マイクロ流体デバイス内での増幅反応、ならびに増幅された核酸をこのデバイス内またはデバイス上で検出および分析する方法が含まれる。増幅用の試料の熱サイクルの繰返しは通常、２つの方法のうちの１つで実施される。第１の方法では、従来のＰＣＲ機器とほとんど同じように試料溶液がデバイス内に装填され、温度の時間サイクルが繰り返される。第２の方法では、空間的に温度が変化する各区域を試料溶液がポンプで連続的に通される。例えば、Lagally他「Anal Chem 73」(2001)、565〜570頁、Kopp他「Science 280」(1998)、1046-1048頁、Park他「Anal Chem 75」(2003)、6029-6033頁、Hahn他の国際公開ＷＯ２００５／０７５６８３号、Enzelberger他の米国特許第６９６０４３７号、およびKnapp他の米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号を参照されたい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国仮特許出願第６０／８０６４４０号

【特許文献2】国際公開ＷＯ２００５／０７５６８３号

【特許文献3】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】SambrookおよびRussell、「Molecular Cloning -- A Laboratory Manual (3rd Ed.)」、Vols. 1-3、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y. (2000)

【非特許文献2】F. M. Ausubel他「Current Protocols in Molecular Biology」、Greene Publishing Associates, IncとJohn Wiley & Sons, Incの合弁企業であるCurrent Protocols編集（２００５年にかけて補遺あり）

【非特許文献3】M.A. Innis他「PCR Protocols A Guide to Methods and Applications」、Academic Press Inc.、San Diego, Calif.編集(1990)

【非特許文献4】K. Edwards他「Real-Time PCR: An Essential Guide」、Horizon Bioscience, Norwich,編集U.K. (2004)

【非特許文献5】Lagally他「Anal Chem 73」(2001)、565〜570頁、Kopp他の「Science 280」(1998)、1046-1048頁

【非特許文献6】Kopp他「Science 280」(1998)、1046-1048頁

【非特許文献7】Park他「Anal Chem 75」(2003)、6029-6033頁

【非特許文献8】Wittwer他「Clinical Chemistry 49」(2003)、853〜860頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

元のＤＮＡ分子の十分な数のコピーがあれば、そのＤＮＡを特徴付けることができる。ＤＮＡを特徴付ける１つの方法は、温度上昇によりＤＮＡが２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に遷移するときのＤＮＡの解離挙動を調べることである。ｄｓＤＮＡからｓｓＤＮＡにＤＮＡを遷移させる処理は、「高精度温度（熱）溶解ＨＲＴｍ」処理、または簡単に「高精度溶解」処理と呼ばれることがある。

【0009】

したがって、ＤＮＡ増幅処理を監視し、ＤＮＡの解離挙動を判定するシステムが求められている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、リアルタイムＰＣＲおよびＨＲＴｍ分析を実施し監視するシステムおよび方法に関する。

【0011】

一態様では、本発明は、（ａ）核酸を含む少なくとも１つのボーラスをマイクロチャネル内に導入するステップと、（ｂ）ボーラスをマイクロチャネルに通して強制的に移動させるステップと、（ｃ）ボーラスがマイクロチャネルを通って移動している間、ボーラス中に含まれる核酸を増幅するステップと、イメージセンサを使用して、核酸が十分に増幅されたかどうかを判定するステップと、（ｄ）核酸が十分に増幅されていない場合はステップ（ｃ）を繰り返し、そうでない場合は、ボーラスが依然としてマイクロチャネルを通って移動している間、ボーラス中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させ、イメージセンサを使用してボーラスの画像を取り込むステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、イメージセンサを使用してボーラスの画像を取り込むステップは、対象となる領域を決定し、次いでイメージセンサの、対象となる領域内にある画素だけを読み出すこと、および毎秒少なくとも約５枚のボーラスの画像を取り込むことを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、核酸が十分に増幅されたかどうかをイメージセンサを使用して判定するステップは、イメージセンサを使用してボーラスの画像を取り込むステップと、取り込んだ画像データを処理して、ボーラスから放射された光の強度を決定するステップとを含む。決定した強度を示す値をある閾値と比較して、核酸が十分に増幅されたかどうかを判定することができる。

【0013】

いくつかの実施形態では、核酸が十分に増幅されたと判定した後、ボーラス中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させる処理を開始する（例えば、決定した強度を表す値が閾値よりも大きいことを比較の結果が示している場合は、少なくともその判定が行われた直後に溶解処理を開始する）。

【0014】

いくつかの実施形態では、処理を開始するステップは、加熱システムを構成してボーラスの温度を緩やかに上昇させることを含む。好ましくは、温度は一定またはほぼ一定の速度（例えば、毎秒約０．１℃から１℃の間の一定の速度）で上昇させる。

【0015】

別の一態様で、本発明は以下の要素を含むシステム、すなわち、マイクロ流体チャネルを備える基板と、マイクロ流体チャネルの少なくとも一部分に熱を加え、またそこから熱を吸収するように動作可能な熱発生ユニットと、チャネルの前記部分がイメージセンサの視野内に入るように基板に対して配置されたイメージセンサと、イメージセンサに結合された画像処理システムであって、（ｉ）イメージセンサから画像データを受け取り、（ｉｉ）イメージセンサからの画像データを使用して、チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上であるかどうかを判定するように構成された画像処理システムと、温度コントローラであって、熱発生ユニットを制御するように構成され、かつ熱発生ユニットが、チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上であると判定する画像処理システムに応答して、チャネルの一部分の温度に第１の温度から第２の温度まで緩やかに勾配を付けるように構成された温度コントローラとを含むシステムを提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、熱発生ユニットは、加える熱量を毎秒約０．１℃から１℃の間のある熱勾配率で間断なく増加させることによって、温度に勾配を付けるように構成される。温度コントローラはさらに、熱発生ユニットが、所定の入力に応答してチャネルの一部分の温度サイクルを繰り返すように構成することができる。

【0017】

このシステムはさらに、イメージセンサ・コントローラを含むことができる。このイメージセンサ・コントローラは、イメージセンサに、熱発生ユニットがチャネルの一部分の温度サイクルを繰り返している間、イメージセンサの視野内にあるチャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を取り込ませるように動作可能とすることができる。イメージセンサ・コントローラはまた、イメージセンサに、熱発生ユニットがチャネルの一部分の温度に勾配を付けている間、イメージセンサの視野内にあるチャネルの前記部分の少なくともセグメントの画像を取り込ませるように動作可能とすることもできる。いくつかの実施形態では、イメージセンサ・コントローラは、イメージセンサに、熱発生ユニットが温度サイクルを繰り返している間９０秒ごとに少なくとも１枚の画像を取り込ませ、熱発生ユニットが温度に勾配を付けている間に毎秒少なくとも５枚の画像を取り込ませるように動作可能とすることができる。

【0018】

このシステムはまた、チャネルの一部分向けの電磁放射を生成する励起源も含む。いくつかの実施形態では、システムはさらに、チャネルの前記部分を通って移動する核酸試料からの発光の強度が所定の発光強度閾値以上であると判定する画像処理システムに応答して、チャネルの少なくとも一部分のセグメントを照光する第２の励起源も含む。

【0019】

別の一態様では、本発明は、（ｉ）リアルタイムＰＣＲ試薬を含む溶液の試料をチャネルに通して強制的に移動させるステップと、（ｉｉ）チャネルの分析領域を通って試料が移動している間に、（ａ）所定の事象が発生するまで試料の温度サイクルを繰り返すステップ、（ｂ）ステップ（ａ）を実施した後、試料の温度を第１の温度から第２の温度まで緩やかに上昇させるステップ、および（ｃ）試料の温度を緩やかに上昇させるステップの間、イメージセンサを使用して試料からの発光を監視するステップ、を実施するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、試料の温度を第１の温度から第２の温度まで緩やかに上昇させるステップは、その温度を（例えば、毎秒約０．１℃と１℃の間の）一定またはほぼ一定の速度で上昇させることを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、この方法はさらに、所定の事象が発生したかどうかを判定するステップを含むこともできる。このステップは、例えば、試料から放射された光の強度を決定するステップと、この決定した強度をある強度閾値と比較することによって、試料中の核酸が十分に増幅されたかどうかを判定するステップとを含むことができる。試料から放射された光の強度を決定するステップは、イメージセンサを使用して試料の画像を取り込むステップを含むことができ、この画像取込みステップは、対象となる領域を決定し、次いでイメージセンサの、対象となる領域内にある画素だけを読み出すことを含むことができる。

【0021】

本発明の上記および他の実施形態を以下に、添付の図面を参照して説明する。

【0022】

本明細書に組み入れられ本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の様々な実施形態を示す。図面では、同じ参照番号が、同じ要素または機能的に類似の要素を示す。さらに、参照番号の左端の数字は、その参照番号が最初に現れた図面を特定する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】一実施形態によるゲノム分析システムの機能ブロック図である。

【図2】一実施形態によるバイオチップの上面図である。

【図3】一実施形態によるイメージセンサの図である。

【図4】一実施形態による処理を示す流れ図である。

【図5】一実施形態によるゲノム分析システムの機能ブロック図である。

【図6】一実施形態による第１の温度プロファイルを示す線図である。

【図7】一実施形態による第２の温度プロファイルを示す線図である。

【図8】画像処理システムの一実施形態を示す機能ブロック図である。

【図9】一実施形態による核酸分析システムの機能ブロック図である。

【図10】一実施形態による処理を示す流れ図である。

【図11】例示的な温度プロファイルである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

図面を参照すると、図１は、一実施形態による核酸分析システム１００を示している。図１に示すように、システム１００は、ＰＣＲ処理区域１０４（すなわち、ＤＮＡが増幅される区域）およびＨＲＴｍ分析区域１０６（すなわち、増幅されたＤＮＡの解離挙動が調べられる区域）を有するマイクロ流体バイオチップ１０２を含む。

【0025】

図２は、いくつかの実施形態によるバイオチップ１０２の上面図である。図２に示すように、バイオチップ１０２は、多数のマイクロ流体チャネル２０２を含む。示した例では、８本のマイクロ流体チャネルがあるが、チップ１０２は８本よりも多いまたは少ないチャネルを有しうることが企図されている。示したように、各マイクロ流体チャネルの第１の部分はＰＣＲ処理区域１０４内にあり、各マイクロ流体チャネルの第２の部分はＨＲＴｍ分析区域１０６内にあるものとすることができる。図１にさらに示すように、区域１０６は区域１０４にすぐ続き、区域１０４の長さは区域１０６の長さよりもかなり長くすることができる（例えば、区域１０４の長さを区域１０６の５倍の長さにすることができる）。

【0026】

図１は、区域１０４と１０６の間に小さなギャップがあることを示しているが、これらの区域の間にはギャップが存在しないことが企図されている（すなわち、区域１０６は区域１０４にすぐ続くだけでなく、共通の境界を区域１０４と共有もしていることが企図されている）。いくつかの実施形態では、システム１００が使用中のとき、少なくとも１つのチャネル２０２が、リアルタイムＰＣＲ試薬を含む溶液の試料（すなわち「ボーラス」）を受け入れる。ボーラスが、ＨＲＴｍ区域１０６に入る前にＰＣＲ区域１０４を横断するように、強制的にボーラスをチャネルに通して移動させることができる。マイクロ流体デバイス内でＰＣＲを実施する１つのシステムおよび方法が、２００６年８月１７日出願の米国特許出願第１１／５０５３５８号に開示されている。同出願を参照により本明細書に組み込む。

【0027】

図１に戻って参照すると、ゲノム分析システム１００はさらに、イメージセンサ１０８、イメージセンサ１０８を制御するコントローラ１１０、およびイメージセンサ１０８によって生成された画像データを処理する画像処理システム１１２を含む。イメージセンサ１０８は、ＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサ、または他のイメージセンサを使用して実施することができる。例えば、一実施形態では、センサ１０８は、有効画素１２．７メガの解像度でサイズが３６×２４ｍｍのＣＭＯＳセンサであり、キヤノン株式会社から入手可能である。

【0028】

イメージセンサ１０８は、第１のイメージセンサ領域１２１および第２のイメージセンサ領域１２２を有する。イメージセンサ領域１２１は、イメージセンサ領域１２２とは異なる視野を有する。好ましい実施形態では、イメージセンサ１０８は、ＰＣＲ処理区域１０４の少なくとも一部分がセンサ領域１２１の視野内に入り、ＨＲＴｍ区域１０６の少なくとも一部分がセンサ領域１２２の視野内に入るように、チップ１０２に対して配置される。

【0029】

次に図３を参照すると、図３は、イメージセンサ１０８の光感知面の図である。この図は、２つのイメージセンサ領域１２１、１２２をよりよく示している。示されているように、イメージセンサ領域１２２の面積は、イメージセンサ領域１２１の面積よりもかなり小さくすることができる（例えば１／５以下の面積）。いくつかの実施形態では、２つの領域１２１、１２２の幅は同じであるが長さが異なる。

【0030】

次に図８を参照すると、図８は、画像処理システム１１２の一実施形態を示す機能ブロック図である。図８に示したように、システム１１２は、イメージセンサ１０８からデータ出力を受け取る。システム１１２は、イメージセンサ１０８からのデータを増幅する増幅器８０２を含むことができる。１つの非限定的な実施形態では、増幅器８０２は、ＩＳＯ ３２００を超える感度が得られるようにデータを増幅することができる増幅されたデータは、例えば１６ビットアナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）変換器８０４によってデジタル信号に変換することができる。一実施形態では、１６ビットＡ／Ｄ変換器を使用すると、高いレベルのダイナミック・レンジおよび最下位ビット分解能が得られる。Ａ／Ｄ変換器８０４からのデジタル信号出力は、フレーミング回路８０６によって処理することができ、この回路は、イメージセンサ領域１２１から生成されたデータを区域１のデータ・バッファ８０８内に記憶し、イメージセンサ領域１２２から生成されたデータを区域２のデータ・バッファ８１０内に記憶するように構成することができる。プログラム可能データ・プロセッサ８１２は、バッファ８１０および８０８内のデータを処理して、とりわけ区域１０４および１０６からの蛍光強度を決定し記録するようにプログラムすることができる。

【0031】

上述のようにイメージセンサ１０８およびチップ１０２を構成することによって、単一のイメージセンサが、（ｉ）ＰＣＲ区域１０４からの発光強度に対応するデータを生成し、（ｉｉ）ＨＲＴｍ区域１０６からの発光強度に対応するデータを生成することができる。したがって、単一のイメージセンサだけを使用しながら、システム１００は、（１）ＤＮＡの試料の増幅、および（２）別のＤＮＡ試料の解離挙動、を同時に監視することができる。

【0032】

図１にさらに示すように、システム１００は、１つまたは複数の熱発生装置を含むことができる。示した実施形態では、システム１００は第１の熱発生装置１１４、第２の熱発生装置１１６、および装置１１４、１１６を制御するコントローラ１１８を含む。一実施形態では、第１の熱発生装置は、ＰＣＲ処理区域１０４内に第１の熱区域を生成し、第２の熱発生装置は、ＨＲＴｍ分析区域１０６内に第２の熱区域を生成する。

【0033】

各熱発生装置１１４、１１６は、熱をチップ１０２に供給し、かつ／またはそこから熱を吸収するように構成され、したがって、１つまたは複数の熱源および／またはヒート・シンクを含むことができる（例えば、各熱発生装置１１４、１１６は、ペルチェ素子、あるいは他の熱源またはヒート・シンクを含むことができる）。より詳細には、示した実施形態において、熱装置１１４は、熱をＰＣＲ区域１０４に供給し、かつ／またはそこから熱を吸収するように構成され、熱装置１１６は、熱をＨＲＴｍ区域１０６に供給し、かつ／またはそこから熱を吸収するように構成される。

【0034】

１つの温度コントローラだけが示されているが、各熱発生装置はそれぞれのコントローラを有しうることが企図されている。さらに、システム１００は、単一の温度コントローラを有することがあるが、各熱発生装置は独立に動作させることができ、そうして装置１１６を使用して区域１０６内でＨＲＴｍ分析を行うことができる一方で、同時に装置１１４を使用して区域１０４内でＰＣＲが行われるようになる。

【0035】

つまり、いくつかの実施形態では、第１の熱発生装置１１４は、ボーラスが区域１０４内にある間、熱発生装置１１４が区域１０４内で温度サイクルを繰り返してＰＣＲを実現するように構成され、熱発生装置１１６は、ボーラスが区域１０６に入ったときに、ほぼ間断なく増大する量の熱を熱発生装置１１６が区域１０６に加えてボーラスがＨＲＴｍ分析にかけられる（すなわち、ボーラス中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させる）ように構成される。一例では、熱発生装置１１６は、一般に毎秒０．１〜２℃の熱勾配率を与えることができ、好ましい勾配率は毎秒０．５〜１℃である。

【0036】

次にセンサ・コントローラ１１０に注目すると、センサ１１０は、ＨＲＴｍ分析区域内でＨＴＲｍ分析にかけられる各ボーラスについて、イメージセンサ・コントローラ１１０が、イメージセンサ領域１２２から好ましくは少なくとも毎秒１０枚の画像を、ボーラスがＨＲＴｍ分析にかけられる間の少なくとも約１分間センサ１０８に取り込ませるように構成することができる（一般にセンサ１０８は、中断なしの約５分の持続時間で画像を取り込む）。勾配率がより急な実施形態では、イメージセンサ・コントローラ１１０は、毎秒約２０枚の画像の割合でセンサ１０８に画像を取り込ませることができる。多くの実施形態では、目標は、０．１℃またはそれより良い温度分解能を達成することである。

【0037】

いくつかの実施形態では、１０画像／秒の高いフレーム率を実現するのに、センサはＣＭＯＳセンサを用いて実施することができ、コントローラは、対象となる画素だけ（例えば、イメージセンサ領域１２２内の画素の一部またはすべて）を読み出すためにＣＭＯＳセンサに窓を設けるように構成することができる。

【0038】

いくつかの実施形態では、システム１００はさらに、区域１０４および／または１０６を照光するための励起源１３０（例えば、レーザまたは他の励起源）を含むことができる。追加の励起源（例えば励起源１３１）もまた使用することができる。システム１００はさらに、チップ１０２とイメージセンサ１０８の間に配置されたレンズ１４０を含むこともできる。このような実施形態では、レンズ１４０は、ＰＣＲ処理区域１０４から来る光１４５を第１のイメージセンサ領域１２１上に集束させ、ＨＲＴｍ分析区域１０６から来る光１４６を第２のイメージセンサ領域１２２上に集束させるように構成することができる。

【0039】

次に図４を参照すると、図４は、一実施形態による処理４００を示す流れ図である。処理４００はステップ４０２から始めることができ、ここでは、ＰＣＲ処理区域１０４（第１の熱区域）およびＨＲＴｍ分析区域１０６（第２の熱区域）を有するマイクロチャネルがあるマイクロ流体デバイス１０２を得る（図５参照）。ステップ４０３で、イメージセンサ（例えばイメージセンサ１０８）を得て、これを第１と第２の熱区域の両方が同時にイメージセンサの視野内に入るように配置する。

【0040】

ステップ４０４で、一連の試験溶液のボーラスをマイクロチャネル内に導入する（試験溶液は、試験溶液貯蔵器１５０内（図１参照）に貯蔵することができる）。ステップ４０６で、各ボーラスを、それがＰＣＲ処理区域を通過し、次いでＨＲＴｍ分析区域に入りそこを通って移動するように、チャネルに沿って強制的に移動させる。このステップは図５に図示してある。矢印５０１は、一連のボーラスが移動する方向を示す。いくつかの実施形態では、ボーラスは一定の速度で連続して移動する。

【0041】

ステップ４０８で、１つまたは複数のボーラスがＰＣＲ処理区域を通って移動する間、ＰＣＲ処理区域の温度サイクルを繰り返して各ボーラス中のＤＮＡを増幅する。図６は、いくつかの実施形態による、ステップ４０８が実施された結果としてのＰＣＲ処理区域の温度プロファイルを示す。図６に示すように、また当技術分野ではよく知られているように、１つの温度サイクルは、（１）ＰＣＲ処理区域の温度を第１の期間（ｐ１）（例えば５秒間）第１の温度（ｔ１）（例えば５２℃）に保持すること、（２）次に、温度をｔ１からｔ２（例えば７２℃）まで急速に上昇させ、第２の期間（ｐ２）（例えば１０秒間）温度をｔ２に保持すること、３）次に、温度をｔ２からｔ３（例えば９４℃）まで急速に上昇させ、第３の期間（ｐ３）（例えば５秒間）温度をｔ３に保持すること、および（４）次に、サイクルを繰り返すことができるように、温度を急速に下降させてｔ１まで戻すこと、からなる。上述の温度サイクルは、「ＰＣＲサイクル」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、ＰＣＲサイクルはある期間繰り返す（例えば、十分な量のＤＮＡを生成するのに必要なだけ長く、一般には約２０〜４０ＰＣＲサイクル）。

【0042】

ステップ４１０で、イメージセンサ１０８を使用して、ＰＣＲ処理区域内の少なくとも１つのボーラスの画像を、そのボーラスが区域を通って移動するとき、および上述のようにその区域の温度サイクルを繰り返しているときに取り込む。いくつかの実施形態では、画像は、図６に示すように、ＰＣＲサイクルの「中間」の間だけに取り込まれる（すなわち、温度がその間ｔ２に保持されている時間）。いくつかの実施形態では、センサ・コントローラ１１０は、ボーラスの画像を取り込むステップが、イメージセンサ１０８の画素のうちイメージセンサ領域１２１内にあるものだけ、あるいは、例えばボーラスからの光を受け取る画素、および周囲のじかに接する１つまたは複数の画素など、それらの画素の一部分だけを読み出すことを含むように画像取込みを制御し、かつイメージセンサ１０８に窓を設ける。

【0043】

ステップ４１２で、ステップ４１０で取り込まれた画像を、例えば画像処理システム１１２によって処理する。画像処理システム４１２は、時間の関数としてボーラスから放射される蛍光の強度を決定するためのソフトウェアでプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含むことができる。

【0044】

ステップ４１８で、ボーラスがＨＲＴｍ分析区域に入ったとき（またはその直後）に、またそれがその区域を通って移動する間、ＨＲＴｍ分析区域の温度を上昇させて、ボーラス中のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させる。図７は、いくつかの実施形態によるＨＲＴｍ分析区域の温度プロファイルを示す。図７に示した例では、第１のボーラスが時間ｔ１（またはその直後）にＨＲＴｍ分析区域に入り、その区域内に時間ｔ２（またはその直後）まで留まり、第２のボーラスが時間ｔ３（またはその直後）にＨＲＴｍ分析区域に入り、その区域内に時間ｔ４（またはその直後）まで留まる。図７に示すように、第１および第２の試料がＨＲＴｍ分析区域内にある間、その区域の温度は、温度ｔ１（例えば約６５℃）から温度ｔ２（例えば約９５℃）までほぼ一定の速度（例えば毎秒０．１〜１℃）で上昇することができ、この温度上昇が試料内のｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに遷移させるはずである。

【0045】

一実施形態では、ＰＣＲによる増幅は、蛍光色素を結合したｄｓＤＮＡの存在下で行われる。この色素は、ｓｓＤＮＡとは相互作用しないがｄｓＤＮＡと活発に結合し、この状態で明るく蛍光発光する。この蛍光の変化を用いて、まずＰＣＲ区域内のＤＮＡ濃度の増加を測定し、次に、ＨＲＴｍによって熱で誘発されたＤＮＡ解離を直接測定することができる。最初のうち、試料がｄｓＤＮＡとして出発するので、蛍光は溶解分析において強いが、温度が上昇し、ＤＮＡが１本鎖に解離するにつれて蛍光が減衰する。観察された「溶解」挙動は、特定のＤＮＡ試料に特有のものである。一般には溶解曲線が作成され、最初の溶解前の段階の強い蛍光から、溶解の段階の急激な蛍光の減少を経て溶解後の段階での基底蛍光までの遷移をグラフ化する。蛍光は、ＤＮＡに結合した色素が、２本鎖ＤＮＡが１本鎖に解離（溶解）するときに２本鎖ＤＮＡから開放されるにつれ減少する。蛍光の変化率が最大になる溶解段階の中間点で、分析されている特定のＤＮＡ断片の溶解温度（ＴＭ）を定義する。

【0046】

適切なｄｓＤＮＡ結合色素には、SYBR（登録商標）Green 1（Invitrogen Corp.、Carlsbad、米国カリフォルニア州）、SYTO（登録商標）9（Invitrogen Corp.、Carlsbad、米国カリフォルニア州）、LC Green（登録商標）（Idaho Technologies、Salt Lake City、米国ユタ州）、およびEva Green（商標）（Biotium Inc、Hayward、米国カリフォルニア州）が含まれる。これらの色素のうち、SYTO（登録商標）9、LC Green（登録商標）およびEva Green（商標）は、増幅反応での毒性が低く、したがって、ｄｓＤＮＡ試料の飽和をより大きくするようにより高い濃度で使用することができる。色素飽和がより大きいことは、測定される蛍光信号がより高い忠実度を有することを意味し、これは明らかに、溶解時に核酸鎖の非変性領域への動的な色素の再分配が少ないからであり、また色素が高い溶解温度の生成物の方を好まないからである（Wittwer他「Clinical Chemistry 49」(2003)、853〜860頁）。これらの特性の組合せにより、より大きな溶解感度、およびより高い分解能の溶解プロファイルが得られる。

【0047】

ステップ４２０で、イメージセンサ１０８を使用してＨＲＴｍ分析区域内のボーラスの画像を、ボーラスがその区域を通って移動するとき、かつその区域の温度が上述のように上昇する間に取り込む。いくつかの実施形態では、イメージセンサを使用してＨＲＴｍ分析区域内のボーラスの画像を取り込むとき、イメージセンサは、ステップ４１０でＰＣＲ処理区域内のボーラスの画像を取り込むためにそれを使用したときと同じ位置および向きにある。

【0048】

いくつかの実施形態では、ステップ４２０で、画像を高いフレーム率（例えば、毎秒５枚を超える画像、好ましくは少なくとも毎秒約１０枚の画像）で取り込む。いくつかの実施形態では、センサ・コントローラ１１０は、ボーラスの画像を取り込むステップが、イメージセンサ１０８の画素のうちイメージセンサ領域１２２内にあるものだけ、あるいは、例えばボーラスからの光を受け取る画素、および周囲のじかに接する１つまたは複数の画素など、それらの画素の一部分だけを読み出すことを含むように画像取込みを制御し、かつイメージセンサ１０８に窓を設ける。

【0049】

ステップ４２２で、ステップ４２０で取り込まれた画像を、例えば画像処理システム１１２によって処理する。画像処理システム４１２は、時間の関数としてボーラスから放射される蛍光の強度を決定するためのソフトウェアでプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含むことができる。

【0050】

図４に示したように、ステップ４１８〜４２０は、ステップ４０８〜４１０と同時に行われてよい。

【0051】

次に図９を参照すると、図９は、本発明の別の一実施形態による核酸分析システム９００を示す機能ブロック図である。

【0052】

図９に示すように、システム９００は、システム１００と同じ構成要素を多く含むことができる。例えば、システム９００は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する基板１０２、および少なくとも１つの熱発生ユニット１１４を含み、この熱発生ユニットは、例えば米国特許出願第１１／５０５３５８号に開示されている熱発生ユニットのように、マイクロ流体チャネルの少なくとも一部分に熱を供給し、かつ／またはそこから熱を吸収するように動作可能である。同出願を参照により本明細書に組み込む。システム９００はまた、装置１１４を制御する温度コントローラ１１８、マイクロ流体チャネルの少なくとも一部分がイメージセンサ１０８の視野内に入るように基板に対して配置されたイメージセンサ１０８、イメージセンサ・コントローラ１１０、およびイメージセンサ１０８に結合された画像処理システム１１２を含むこともできる。

【0053】

システム１００と同様に、システム９００を使用して核酸の試料（例えばボーラス９０２）を分析することができる。より詳細には、システム９００を使用してＤＮＡを増幅し、次に、増幅されたＤＮＡを溶解することができる。一実施形態では、ＤＮＡを増幅するために、リアルタイムＰＣＲ試薬を含む溶液の試料をマイクロ流体チャネル内に導入し、次に、当技術分野でよく知られた技法を用いて、それを矢印９０１の方向にチャネルに通して強制的に移動させることができる。

【0054】

試料がチャネルを通って移動している間に、熱発生装置１１４が上述のように試料の温度サイクルを繰り返すように、温度コントローラ１１８を構成することができる。例えば、所定の入力の受け取りに応答して、温度コントローラ１１８が、熱発生装置１１４により試料の温度サイクルを繰り返すようにできる。

【0055】

試料が増幅されている間、イメージセンサ・コントローラ１１０は、イメージセンサに、試料が配置されたチャネルのセグメントの画像を取り込ませることができ、それによって試料からの発光に対応する画像データが取り込まれる。いくつかの実施形態では、イメージセンサ・コントローラはイメージセンサ１０８に、サイクルごとに少なくとも１枚の画像を取り込ませることができ、また処理能力を改善するために、イメージセンサに窓を設けてセンサの画素アレイの所定の一部分だけを読み出すことができる。

【0056】

画像処理システム１１２は、この画像データをイメージセンサ１０８から受け取り、その画像データを使用して試料からの発光の強度が所定の発光強度の閾値以上であるかどうかを判定するように構成することができる。加えて、または別法として、画像処理システム１１２は、画像データを使用して試料からの発光の強度変化率を決定するように構成することもできる。

【0057】

さらに、温度コントローラ１１８は、特定の事象の発生に応じて、熱発生装置１１４が試料の温度に第１の温度（例えば約６５℃）から第２の温度（例えば９５℃）まで緩やかに勾配を付けるように構成することもできる。

【0058】

例えば、温度コントローラ１１８は、（ａ）試料からの発光の強度が所定の発光強度の閾値以上である、または（ｂ）試料からの発光の強度変化率が所定の閾値以下である、と判定する画像処理システム１１２に応答して熱発生装置１１４が試料の温度に第１の温度から第２の温度まで緩やかに勾配を付けるように構成することもできる。他の実施形態では、温度コントローラ１１８は、（ａ）試料が少なくとも特定の回数の温度サイクルにかけられた、（ｂ）以前の特定の時点（例えば、試料がＰＣＲ処理区域１０４に入った時点、または試料がその最初の温度サイクルにかけられた時点）から所定の時間が経過した、または（ｃ）試料がチャネルの既定の領域内（例えばＨＲＴｍ区域１０６内）にある、という判定に応じて熱発生装置１１４が試料の温度に第１の温度から第２の温度まで緩やかに勾配を付けるように構成することができる。

【0059】

いくつかの実施形態では、特定の事象に応じて、温度コントローラ１１８は、熱発生装置１１４が、与える熱量を増加させることによって毎秒約０．１〜２℃の温度勾配率で温度に勾配を付けるようにすることができる。

【0060】

試料の温度に勾配が付けられている間、イメージセンサ・コントローラ１１０は、イメージセンサ１０８に、試料が配置されたチャネルのセグメントの画像を取り込ませることができ、それによって試料からの発光に対応する画像データが取り込まれる。より詳細には、いくつかの実施形態では、イメージセンサ・コントローラ１１０は、イメージセンサ１０８に、試料が配置されたチャネルのセグメントの少なくとも毎秒５枚の画像（また好ましくは毎秒１０枚以上の画像）を取り込ませる。

【0061】

いくつかの実施形態では、試料からの発光の強度が所定の発光強度の閾値以上であると判定する画像処理システム１１２に応答し、励起源１３１を使用して、試料が配置されたチャネルのセグメントを照光し、それによって、試料が熱溶解される間試料が照光される。

【0062】

次に図１０を参照すると、図１０は、上述の処理のステップの少なくともいくつかを示す流れ図である。図１０に示す処理は、ステップ１００２から始めることができ、ここでは、マイクロ流体チャネルを有するデバイスを得る。ステップ１００３で、イメージセンサをチャネルの少なくとも一部分がそのイメージセンサの視野内に入るように配置する。ステップ１００４で、溶液の試料をチャネル内に導入する。ステップ１００６で、試料をチャネルに沿って強制的に移動させる。ステップ１００８で、試料がチャネルを通って移動している間、試料の温度サイクルを繰り返して試料に含まれるＤＮＡを増幅する。

【0063】

ステップ１０１０で、ステップ１００８を実施している間、イメージセンサを使用して試料からの発光に対応する画像データを生成する。ステップ１０１２で、画像データを処理する（例えば、画像データを処理して発光強度を決定することができる）。ステップ１０１３で、ＤＮＡ溶解処理（例えばＨＲＴｍ）を開始すべきかどうかについて判定が行われる。開始すべきでない場合は、処理はステップ１００８に戻り、そうでない場合はステップ１０１８へ進む。

【0064】

上述のように、この判定を行うことができるいくつかの方法がある。例えば、一実施形態では、プロセッサ（例えば、温度コントローラ１１８のプロセッサ）が、試料にかけた温度サイクルの回数の記録を取り、その回数がある閾値と一致、またはそれを超えた場合に、溶解処理を開始すべきとする（すなわち処理はステップ１０１８へ進まなければならない）。別の一実施形態では、試料からの発光強度が所定の閾値以上であると判定された場合に、処理はステップ１０１８に進まなければならない。別の一実施形態では、溶解プロセスを開始すべきかどうかを判定するステップは、試料からの発光の強度変化率を調べること、およびその変化率が所定の閾値以下である場合に溶解処理を開始することを含む。さらに別の一実施形態では、溶解プロセスを開始すべきかどうかを判定するステップは、（ｉ）以前の特定の時点（例えば、試料がＰＣＲ処理区域１０４に入った時点、または試料がその最初の温度サイクルにかけられた時点）から所定の時間が経過したかどうか、または（ｉｉ）試料がチャネルの既定の領域内（例えばＨＲＴｍ区域１０６内）にあるかどうか、を判定することを含む。

【0065】

ステップ１０１８で、試料が所定の温度（例えば６５℃）に達するように熱を試料に加える、またはそれから取り除くことができ、次いで試料に熱を加えて試料中のＤＮＡを溶解する。上述のように、熱は、試料の温度がほぼ一定の速度で所定の温度（例えば、少なくとも約９５℃）まで上昇するように加えることができる。ステップ１０２０で、ステップ１０１８を実施している間、イメージセンサを使用して試料からの発光に対応する画像データを生成する。好ましくは、ステップ１０２０では、ステップ１０１０で取り込まれた画像よりも高いフレーム率で画像を取り込む（例えば、ステップ１０２０では、イメージセンサは毎秒少なくとも５枚、好ましくは約１０枚の画像を取り込むように構成することができる）。より高いフレーム率を実現するために、イメージセンサには、センサの画素アレイの画素すべてよりも少ない画素を読み出すように窓を設けることができる。ステップ１０２２で、ステップ１０２０で集めた画像データを処理することができる。

【0066】

次に図１１を参照すると、図１１は、上述の処理にかけられる試料の温度プロファイルを示す。図１１に示すように、試料に何回かの温度サイクルがかけられるように試料の温度サイクルをある期間繰り返す。示した例では、時間ｔ＝Ｔｉで、画像処理システムは、（ａ）試料からの発光の強度がある閾値と一致、またはそれを超えた、あるいは（ｂ）試料からの発光の強度変化率がある閾値以下である、との判定を行うが、そのどちらの判定も試料中のＤＮＡが十分に増幅されたことを示すものとすることができる。したがって、図１１に示すように、時間ｔ＝Ｔｉ近くで試料の温度が約６５℃になり、次に、試料の温度がほぼ一定の速度で上昇して所定の温度（例えば約９５℃）に達する。

【0067】

以上、本発明の様々な実施形態を説明してきたが、これらは限定ではなく例としてのみ提示したものであることを理解されたい。したがって、本発明の広がりおよび範囲は、上述の例示的実施形態のいずれによっても限定されるべきものではない。

【0068】

さらに、上述の処理は一連のステップとして示してあるが、これはただ単に説明のためである。したがって、いくつかのステップを追加しても、いくつかのステップを省略しても、またステップの順序を並べ替えてもよいことが企図されている。

【0069】

添付の特許請求の範囲では、語「ａ」および「ａｎ」は、「１つまたは複数の」と解釈されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】