特許 5676538 ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドを含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5676538

(24)【登録日】2015年1月9日

(45)【発行日】2015年2月25日

(54)【発明の名称】ポリペプチド、ポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドを含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150205BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20150205BHJP

   C07K 4/10 20060101ALI20150205BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150205BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150205BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20150205BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150205BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K7/06

   C07K4/10

   A61K37/02

   A61P3/10

   A61P1/16

   A61P13/12

【請求項の数】6

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2012-198300(P2012-198300)

(22)【出願日】2012年9月10日

(65)【公開番号】特開2013-240317(P2013-240317A)

(43)【公開日】2013年12月5日

【審査請求日】2012年9月10日

(31)【優先権主張番号】101117779

(32)【優先日】2012年5月18日

(33)【優先権主張国】TW

(73)【特許権者】

【識別番号】509075457

【氏名又は名称】中國醫藥大學

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(72)【発明者】

【氏名】侯 庭▲鑛▼

(72)【発明者】

【氏名】項 千芸

【審査官】 荒木 英則

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１２４８２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０３６２９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０１０９６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１１−２５４７４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１０２６９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０６４３５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５０４２２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／０９

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／４２

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ｃ０７Ｋ ４／００− ７／０６

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＤＢ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＶＡＲＰＰＴＩＧ（配列番号７）のアミノ酸配列又は配列番号７において１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列からなり、
前記相同的アミノ酸配列は、配列番号８−配列番号１７８からなる群より選択されたアミノ酸配列である、
単離されたポリペプチド。

【請求項2】

配列番号７及び配列番号２１からなる群より選択されたアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択された、配列番号１の部分的アミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。

【請求項4】

前記配列番号１の部分的アミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列である、
ことを特徴とする請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。

【請求項6】

有効量の請求項１乃至４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドを含む、血糖を低下させること、糖化ヘモグロビンを低下させること、及び糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させることの少なくとも１つの治療における使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリペプチド及びポリペプチドの使用に関し、特にはインスリン受容体に結合することができ、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させる効果を有するポリペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

糖尿病は、代謝異常の慢性疾患である。糖尿病の主要因は、インスリンの不足、身体におけるインスリンの機能不全、又は先天的な遺伝子異常及び後天的な環境の組み合わせにより引き起こされるインスリン耐性である。結果として、糖の利用能力が低下し、又は該能力の完全な欠損さえ引き起こし、ひいては、さらに血糖を上昇させ、身体におけるタンパク質及び脂質の代謝に悪影響を与える。加えて、糖尿病は、他の慢性的な合併症を引き起こし、それには、眼底、神経（運動神経、感覚神経、及び自律神経を含む）、肝臓及び腎臓、大血管（脳血管障害、冠動脈疾患、及び末梢血管の閉塞を含む）の病理学的変化、糖尿病性足病変等が含まれる。

【0003】

世界保健機関（ＷＨＯ）からの統計値によると、世界中の糖尿病患者数は、１９８５年の約３０００万人から２０００年の１億７１００万人以上へと劇的に増加してきた。ＷＨＯはさらに、世界中の糖尿病患者数は、２０３０年には３億４６００万人以上となることを示唆する。さらに、米国における糖尿病及びその合併症に対する医療費は、１９９７年の４４０億ＵＳドルから２００７年の１７４０億ＵＳドルへと増加した。糖尿病患者数の増加に伴い、効果的に血糖を調節することのできる物質又は医薬品の開発が重要となる。

【0004】

インスリンは、１９２２年から糖尿病の治療に対して主に使われてきた。しかしながら、インスリンの不足は、膵臓機能の異常の一要因にすぎない。したがって、糖尿病治療でのインスリンの単独使用では、効果に限界がある。

【0005】

インスリン以外に、糖尿病の治療に用いられる他の薬剤が存在する。血糖を低下させるために用いられるこれらの薬剤は、それらのメカニズムに従って、５つのグループに分類され得る。第１のグループは、スルホニルウレア（ＳＵ）からなり、それは、膵臓からのインスリン分泌を促進し、組織球のインスリン受容体数を増やす。第２のグループは、安息香酸誘導体からなり、それはインスリン分泌を刺激することができる。第３のグループは、ビグアナイトからなり、それは、胃又は腸における糖の吸収を阻害し、肝臓における糖の生成を阻害し、組織における糖取り込みを促進する。第４のグループは、α−グルコシダーゼ阻害薬からなり、それは、二糖を、腸管により吸収され得る単糖へと分解させないようにする。第５のグループは、インスリン増感剤からなり、それは、末梢組織及び肝細胞のインスリン抵抗性を軽減させる。それにもかかわらず、各グループの前述の薬剤は、異なる副作用を有する。例えば、スルホニルウレアは、発疹及び血糖レベル低下を引き起こし得；安息香酸誘導体は、血糖のレベルを低下させ得；ビグアナイトは、乳酸アシドーシス並びに胃及び腸の疾患を引き起こし得；α−グルコシダーゼ阻害薬は、胃及び腸の疾患を引き起こし得；インスリン増感剤は、肝機能異常及び肝細胞傷害を引き起こし得る。したがって、血糖低下機能を有し、かつ副作用がより少ない薬剤の開発が重要となる。

【0006】

通常の化合物とは異なり、ポリペプチドは、代謝をより良く調節し、器官により良く受容され、その結果、副作用発症がより少なくなる。したがって、多くのポリペプチドは、ここ十年、世界中で研究されてきており、臨床的な治療において適用されてきた。例えば、特許文献１は、グルカゴン様ペプチド−１類似体を開示し、それは、血糖を低下させる。一方、特許文献２は、ヒト膵島ペプチド（ＨＩＰ）を用いた、血糖を低下させるための薬剤を開示し、ＨＩＰは膵炎に関連したタンパク質前駆体の活性フラグメントである。

【0007】

さらに、ポリペプチドは、血糖低下活性を有することが見出され、植物抽出物から得られ得る。例えば、特許文献３は、ニガウリ由来の血糖低下活性を有するポリペプチドを開示する。該ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＫＴＮＭＫＨＭＡＧＡＡＡＡＧＡＶＶＧであり、該ポリペプチドの分子量は、１０ｋＤａ未満である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】台湾特許第Ｉ２８３６８４号

【特許文献2】米国特許第７３９３９１９号明細書

【特許文献3】米国特許第６１２７３３８号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

それゆえ、血糖を調節するための多くの薬剤が存在するにもかかわらず、単独での、糖尿病を治療するための方法又は薬学的組成物、又は異なる病原性メカニズムでとの組み合わせがいまだに必要とされる。

【0010】

本発明は、前述の需要を研究し、インスリン受容体に結合することができ、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させる効果を有し、特には糖尿病の治療に用いられ得る新規のポリペプチドを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の第一の目的は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択される配列番号１の部分的アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することである。

【0012】

本発明の他の目的は、ＩＶＡＲＰＰＴＩＧのアミノ酸配列（配列番号７）又は配列番号７の１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することであり、該相同的アミノ酸配列は、配列番号８−配列番号１７８からなる群より選択されるアミノ酸配列である。

【0013】

本発明のさらなる目的は、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、及び配列番号１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することである。

【0014】

本発明のさらなる目的は、ＲＹＫＹＱＸ_１Ｘ_２ＹＩ（配列番号１８９）のアミノ酸配列又は配列番号１８９の１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することであり、Ｘ_１はシステイン又はトリプトファンであり、Ｘ_２はフェニルアラニン又はトリプトファンである。

【0015】

本発明のさらなる目的は、上述のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供することである。

【0016】

本発明のさらなる目的は、有効量の上述のポリペプチド及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、インスリン受容体（ＩＲ）に結合することができ、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させる効果を有する医薬組成物を提供することである。

【0017】

本発明のさらなる目的は、有効量の上述のポリペプチドを対象に投与することを含む、血糖を低下させること、糖化ヘモグロビンを低下させること、及び糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させることの少なくとも１つのための方法を提供することである。

【0018】

詳細な技術及び本発明のために実施された好ましい実施態様は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図面とともに後述の段落において記載される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）及びインスリン受容体を示す分子ドッキングイメージの図である。

【図2】ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリン受容体の自己リン酸化を促進することを示す免疫ブロット分析像の図である。

【図3】ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリンシグナル経路関連遺伝子のタンパク質発現を促進することを示すウェスタンブロット分析像の図である。

【図4】ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＧＬＵＴ４発現を促進することを示す免疫組織化学的染色像の図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明のいくつかの実施態様が下記に詳細に開示される。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施態様において具体化され得、本明細書に記載される実施態様に限定されるべきではない。加えて、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に後述の特許請求の範囲において）用いられる“一”、“該”又は同様の用語は、単数形式及び複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。

【0021】

本明細書において用いられる“相同的アミノ酸配列”の用語は、本明細書において他に言及のない限り、ポリペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換により生じたアミノ酸配列を意味する。さらに、本明細書において用いられる“相同的ポリペプチド”の用語は、本明細書において他に言及のない限り、ポリペプチドのアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸の置換により生じたものに相同するポリペプチドを意味する。

【0022】

インスリンのようなリガンドが細胞のインスリン受容体（ＩＲ）に結合すると、インスリン受容体の自己リン酸化が引き起こされ、その結果、関連遺伝子の転写及び翻訳を含む下流のシグナル変換反応を誘発し、グルコース輸送を誘発して細胞外グルコース濃度又は血中のグルコース濃度を低下させ血糖の低下作用を実現させる、ということが知られてきた。

【0023】

本発明の発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列（全部で６８アミノ酸）を有するポリペプチドをさまざまなセグメントに分割し、又はさらに１つ又は複数のアミノ酸の変異技術により前記セグメントを修飾すると、種々のポリペプチドが提供され得ることを見出した。前記ポリペプチドは、インスリン受容体に結合し得、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、及び糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させ得る。特定の理論に縛られるものではないが、本発明のポリペプチドは、インスリン受容体に結合し得、その結果、インスリン受容体の自己リン酸化のメカニズムを誘発し、前述の作用を実現させると考えられる。

【0024】

したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列（全部で６８アミノ酸）を有するポリペプチドを分割することにより得られ、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択された配列番号１の部分的アミノ酸配列を有する第一のポリペプチドを提供する。第一のポリペプチドのアミノ酸配列は好ましくは、配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列である。本明細書において、配列番号２は、配列番号１のアミノ酸配列での１番目−１９番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列であり；配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列での１７番目−３５番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列であり；配列番号４は、配列番号１のアミノ酸配列での３４番目−５２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列であり；配列番号５は、配列番号１のアミノ酸配列での４５番目−６８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列であり；配列番号６は、配列番号１のアミノ酸配列での５５番目−６８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列である。本明細書において、本発明のポリペプチドは、“インスリン受容体結合タンパク質；ＩＲＢＰ”と称される。例えば、配列番号１に記載される６８アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドは、“ＩＲＢＰ−１−６８”とされ、配列番号２のアミノ酸（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列での１番目−１９番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列）は、“ＩＲＢＰ−１−１９”とされる。

【0025】

本発明はまた、下記のアミノ酸配列又は配列番号７の相同的アミノ酸配列を有する第二のポリペプチドを提供する。
ＩＶＡＲＰＰＴＩＧ（配列番号７）
配列番号７は、配列番号１のアミノ酸配列での６０番目−６８番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を表す部分的アミノ酸配列であり（すなわち、ＩＲＢＰ−６０−６８）、それは配列番号１のアミノ酸配列から生じる。相同的アミノ酸配列は、種々のアミノ酸による配列番号７のアミノ酸配列におけるアミノ酸への１つのアミノ酸の置換技術を行うことにより得られ、配列番号８−配列番号１７８からなる群より選択されるアミノ酸配列を表す。第二のポリペプチドは好ましくは、配列番号７又は配列番号２１のアミノ酸配列である。

【0026】

さらに、本発明はまた、第三のポリペプチドを提供し、それはさまざまなアミノ酸による、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）での３−６つのアミノ酸へのアミノ酸の変異／置換を行うことにより得られ（すなわち、３−６つのアミノ酸の置換）、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、及び配列番号１８８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、第三のポリペプチドは、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８５、及び配列番号１８６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。

【0027】

本発明はまた、下記のアミノ酸配列又は下記のアミノ酸配列において１つのアミノ酸の置換により生じる相同的アミノ酸配列を有する第四のポリペプチドを提供する。
ＲＹＫＹＱＸ_１Ｘ_２ＹＩ（配列番号１８９）
Ｘ_１はシステイン又はトリプトファンであり、Ｘ_２はフェニルアラニン又はトリプトファンである。本発明の第四のポリペプチドは、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）での９つのアミノ酸へのアミノ酸置換を行うことにより得られ、またインスリン受容体に結合して血糖レベルを低下させ得る。

【0028】

本発明の一実施態様において、第四のポリペプチドは、配列番号１８９のアミノ酸配列を有する。Ｘ_１は好ましくはシステインであり、Ｘ_２は好ましくはフェニルアラニン又はトリプトファンである。本発明の他の実施態様において、第四のポリペプチドは、ＲＹＫＹＱＣＦＹＩ（配列番号１９１）のアミノ酸配列を有し（すなわち、Ｘ_１はシステインであり、Ｘ_２はフェニルアラニンである）、又は配列番号１９１における１つのアミノ酸の変異／置換より生じる相同的アミノ酸配列を有する。該相同的アミノ酸配列は、配列番号１９４−配列番号３６４からなる群より選択されるアミノ酸配列である。

【0029】

本発明の第一−第四のポリペプチドのすべては、インスリン受容体に結合して血糖を低下させ得、ひいては糖尿病（Ｉ型糖尿病及びＩＩ型糖尿病を含む）を治療し、糖化ヘモグロビンを低下させ糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させるというように糖尿病患者における順次のプロセスを改善させ得る。

【0030】

糖尿病の治療に対する臨床的背景において用いられるインスリン及び台湾特許第Ｉ３４２７８１号及び日本国特許第４７７２８８４号において開示されたＩＲＢＰ−１−６８ポリペプチド（配列番号１）に比して、本発明のポリペプチドは、下記の利点を有する；第一に、本発明のポリペプチドは、より長さの短いアミノ酸配列及び優れた血糖低下活性を有し、その結果、同様の薬剤の効果を提供する一方で、血糖を低下させるポリペプチドの製造コストを低減させ得、患者の経済的負担を低減させる；第二に、本発明のポリペプチドは、より短いアミノ酸配列を有し、より小さい分子量を有し、それは糖尿病患者に投与後より容易に吸収され得、ひいてはそのバイオアベイラビリティを増加させ得、臨床治療に対して優位となる；第三に、本発明の各ポリペプチドは、異なる長さ及び異なる構成のアミノ酸を有し、その結果、各患者の違い（例えば、性別、年齢、症状、疾患コンディション、及び薬剤への反応）に基づいたより柔軟な治療アプローチを提供し得る。

【0031】

本発明のポリペプチドは、植物抽出、人工的合成、遺伝子組み換え技術、又はこれらの組み合わせにより得られ得る。本明細書において人工的合成は、所望のポリペプチドに依存して、アミノ酸が、化学的方法又は化学的合成の原理を適用するペプチド合成機を用いる方法を含む手動の方法により配列において結合され得ることを意味する。したがって、人工的合成の方法は概して、以下の利点を有する：合成プロセスの間容易にポリペプチドの一次構造を変えること、特定のアミノ酸を都合よく付加すること、及びポリペプチドの末端を都合よく修飾することである。

【0032】

本発明のポリペプチドを合成するのに用いられ得る化学的合成方法は、固相の合成方法と液相の合成方法とに分けられ得る。一般に、液相の合成方法では、各アミノ酸の各結合工程後に抽出操作を行う必要がある。加えて、抽出由来のペプチド中間体は通常混合物であるため、クロマトグラフィー精製工程も必要とされる。言い換えると、ポリペプチドを合成するために液相の合成方法を用いることは、高純度の生成物を得るための面倒な抽出及びクロマトグラフィー精製工程を含む。

【0033】

液相の合成方法とは異なり、固相の合成方法は、まったく別の方法で行われる。アミノ酸の結合反応は、溶媒中の固体のポリマー粒子（又はポリマー支持体）上で起こる。この方法において、所望のポリペプチドのＮ末端アミノ酸は、まずポリマー粒子に共有結合され、次に他のアミノ酸が特定の結合方法で配列に結合される。最終的に、ポリペプチドが完成する。ポリマー粒子は溶媒に溶解されないため、ポリマー粒子（及びポリマー粒子に連結された所望のポリペプチド）は、合成プロセス後の洗浄及びろ過操作により反応試薬及び副産物から分離され得る。すなわち、固相の合成方法においては、全体の合成プロセスの最後で、１つの精製工程のみが必要とされる。すなわち、液相の合成方法とは異なり、固相の合成方法は、比較的利便性がよく、合成時間を著しく低減させることができ、その結果、長鎖ポリペプチドの合成の観点においてより利益が多い。

【0034】

現在、自動的にポリペプチドを合成するための装置が多種開発されてきており、例えば、固相ペプチド合成機、液相ペプチド合成機、マイクロ波ペプチド合成機等である。それらはすべて、要求に応じて、本発明のポリペプチドの合成に対して選択され得る。

【0035】

本発明のポリペプチドはまた、遺伝子組み換え技術により合成され得る。本明細書においては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後ポリヌクレオチドを発現させて本発明のポリペプチドを生成させる。宿主細胞は大腸菌又は酵母であり得、発現ベクターは例えばｐＱＳｔｒｅｐ２、ｐＱＳｔｒｅｐ４、ｐＧＥＸ−６Ｐ１、ｐＱＴＥＶ等といった購入可能な通常のベクターから選択され得る。

【0036】

さらに、本発明のポリペプチドはまた、植物抽出物から得られ得る。ニガウリ、カカロット（ｋａｋｏｒｏｔ）、キュウリ、カボチャ、ゴード、スイカ、カラスウリの種子、カラスウリの根、及びこれらの組み合わせといったウリ科由来の植物の抽出物から得られ得る、血糖を調節することのできるいくつかのポリペプチドが存在する。ウリ科由来の植物の抽出物中の血糖を調節することのできるポリペプチドは、すべて相同的ポリペプチドに属することがタンパク質電気泳動により証明されてきた。それにもかかわらず、本発明のポリペプチドはまた、ヒャクニチソウ、タルウマゴヤシ、ぶどう、グレープフルーツ、セイヨウニワトコ、シロイヌナズナ、米、及びこれらの組み合わせといった、ウリ科由来の植物以外の植物から得られ得る。すなわち、本発明のポリペプチドのソースは、ウリ科由来の植物に限定されない。

【0037】

例えば、ニガウリの植物抽出物は、下記の工程により得られ得る。すなわち、本発明のポリペプチドは、植物抽出物を精製することにより（例えば、タンパク質電気泳動又はクロマトグラフィー精製を用いる）得られ得る。まず、ニガウリを溶媒中に浸漬し、粗懸濁液を得る。該溶媒は、リン酸塩緩衝液溶液、クエン酸塩緩衝液溶液、水等であり得る。ニガウリは、ブレンダー又はグラインダーで粉砕され得る。粗懸濁液中の粒子を１２，０００ｒｐｍから１５，０００ｒｐｍの速度で遠心分離機により液相から除去し、その後、上清を０．１μｍから０．５μｍの孔径のフィルターを用いてろ過する。ろ液をその後３０ｋＤａカットオフの薄膜フィルターに通す。最後に、ろ液を収集し、本発明のポリペプチドを含む水溶性のニガウリ抽出物を得る。薄膜フィルターは、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒ等といった従来の薄膜フィルター製品から選択され得る。その後、所望のポリペプチドをタンパク質電気泳動又はクロマトグラフィー精製といった精製方法を用いることにより単離することができる。得られたポリペプチドを任意に、特定のプロテアーゼにより消化し、所望のポリペプチドセグメントを得ることができる。本明細書において、プロテアーゼに特別な制限はなく、例えば、限定されることなく、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ等であってもよい。最後に、保存剤（例えば、安息香酸ナトリウム、サリチル酸等）を任意に加えることができる。ポリペプチドは、−８０℃で保存される。

【0038】

本発明のポリペプチドを単離するためにタンパク質電気泳動を用いることにおいて、二次元ゲル電気泳動がポリペプチドを特異的に単離するのに用いられ得る。最初に、上述の水溶性のニガウリ抽出物をタンパク質沈殿させ、その後タンパク質沈殿物を一次元目等電点電気泳動（ＩＥＦ）する。二日目に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルを調製し、ゲルスロットに注入し、エタノールを用いて平らにする。２０分後、エタノールをゲルスロットから注ぎ出し、ゲル片をＩＥＦで処理し、タンパク質分子量マーカーをサンプルウェルに各々注入する。その後、電気泳動を１１０ボルトで電流を用いて行う。染料がゲルの底まで動いたら電気泳動を中止する。ゲルをその後ゲル片から取り除き、染色試薬で染色する。その後、ゲル上の染色試薬を、洗浄バッファーを用いることで取り除き、ゲルを脱色バッファーを用いることで脱色する。最後に、９と１０との間の等電点の位置、及びゲル上の７ｋＤａから１０ｋＤａの分子量の位置のタンパク質のバンドを切り出して収集し、その後、本発明のポリペプチドを得る。

【0039】

さらに、本発明のポリペプチドは、前記の方法の組み合わせにより得られ得る。例えば、所望のポリペプチドのフラグメントをまず遺伝子組み換え又は植物抽出により得ることができ、その後、全長のポリペプチドが人工的合成により得られ得る。

【0040】

本発明のポリペプチドは、血糖を低下させるための医薬を製造するために用いられ得る。したがって、本発明はまた、有効量の本発明のポリペプチド及び薬学的に許容可能なキャリアを含む、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させるための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、獣医学的医薬及びヒトの医薬の両方に用いることができ、それは特に制限されることなく、いかなる適切な形態にもなり得、いかなる適切な方法によっても適用され得る。例えば、消化管においてポリペプチドが酵素により分解されないようにするために、本発明の医薬組成物は、皮下注射又は静脈内注射により投与されてもよく、血液により直接的に放出部位に運ばれる。本発明の医薬組成物が経口投与により投与される場合、医薬組成物は小腸の前半部分において胃酸及び酵素から自身を保護するために、吸収遅延剤を含んでいてもよい。

【0041】

皮下注射、又は静脈内注射に適する製剤のために、本発明の医薬組成物は、等張液、緩衝生理食塩溶液（例えば、リン酸緩衝液又はクエン酸緩衝液）、可溶化剤、乳化剤、及び他のキャリアといった、１又は２以上の添加剤を含有することで、静脈内注射剤、静脈内エマルション注射剤、粉末注射剤、懸濁注射剤、粉末−懸濁注射剤等を製造することができる。

【0042】

経口投与に適する製剤の製造方法に関して、本発明の医薬組成物は、溶媒、油性溶媒、希釈剤、安定化剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、抗酸化剤、結合剤、滑剤、吸湿剤等といった、本発明のポリペプチドの活性に悪影響を及ぼすことのない薬学上許容し得るキャリアを含有し得る。該医薬組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、流エキス剤、液剤、シロップ、懸濁液、エマルション、チンキ剤等といった、適切なアプローチにより、経口投与に適する剤型に調製され得る。

【0043】

任意に、該組成物の味及び外観を向上させるために、香料添加剤、トナー、着色剤等といった他の添加剤が、本発明の医薬組成物に加えられ得る。製剤の貯蔵性を向上させるために、適切な量の防腐剤、保存料、消毒剤、抗菌剤等もまた加えられ得る。該医薬組成物は任意に、製剤の効果を高め、又は処方への適応性を向上させるために、１又は２以上の他の活性成分を含み得る。例えば、インスリン、α−グルコシダーゼ阻害薬、インスリン増感剤及び他の活性成分といった１又は２以上の活性成分は、その他の活性成分が本発明のポリペプチドに悪影響を及ぼさない限りにおいて、本発明の医薬組成物に包含され得る。

【0044】

本発明のポリペプチドを含む医薬組成物が対象の要求に応じてヒト又は動物の血糖を低下させるために用いられる場合、本発明の医薬組成物は、１日１回、１日数回等といった、種々の投与頻度で適用され得る。例えば、経口投与により糖尿病の治療のためにヒトの身体に適用される場合、該医薬組成物の用量は、本発明のポリペプチドの量に基づき、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ−体重から約５０ｍｇ／ｋｇ−体重である。注射投与が適用される場合、血糖を低下させるための医薬組成物の１日の有効量は、１ナノモル／ｋｇ−体重から５ナノモル／ｋｇ−体重である。“ｍｇ／ｋｇ−体重”又は“ナノモル／ｋｇ−体重”の単位とは、体重１ｋｇあたり必要とされる用量を意味する。しかしながら、急性症状の患者では、臨床上の要求に応じて、該用量は数倍又は数十倍に増量され得る。

【0045】

本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドは、従来のクローン方法により得られ得る。例えば、ゲノムデオキシリボ核酸をまず植物細胞から抽出することができ、その後ポリメラーゼ鎖反応に対するテンプレートとして用いる。ポリメラーゼ鎖反応が完了後、本発明の単離されたポリヌクレオチドを提供するように生成物を精製する。

【0046】

本発明はさらに、本発明のポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において、血糖を低下させ、糖化ヘモグロビンを低下させ、及び糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させるための方法を提供する。該ポリペプチドは、医薬組成物といった、いかなる適切な形態としてでも投与され得る。該医薬組成物の投与形態及び用量は、前述の通りである。本発明のポリペプチドの血糖低下活性に伴い、本発明の方法は、特に糖尿病の治療に有用である。

【0047】

本発明はさらに、下記の通り特定の実施例により詳細に記述される。しかしながら、下記の実施例は本発明を記述するために単に提供されたものにすぎず、本発明の範囲はそれにより限定されない。

【実施例】

【0048】

（調製実施例）
（Ａ）ポリペプチド：添付された配列表において記載されるように、配列番号１−配列番号３６４のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、固相の合成方法により製造された。

【0049】

（Ｂ）実験対象：ＢＡＬＢ／ｃ（血糖の代謝は正常である）、ＳＴＺ誘発（ストレプトゾトシン誘発Ｉ型糖尿病）、及びｏｂ／ｏｂ（先天性ＩＩ型糖尿病）の３種のマウスを用いて実験を行い、それらのマウスは、国立実験動物センター（台湾）により提供された。

【0050】

（実施例１）分子ドッキング分析
分子ドッキングアッセイを、下記の方法により行った：インスリン受容体（ＰＤＢコードは、２ＤＴＧである）及びインスリン受容体結合タンパク質（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を有するＩＲＢＰ−１−６８ポリペプチド；ＰＤＢコードは、１ＶＢＷである）のＰＤＢファイルを、タンパク質データバンクのウェブサイトから得た。そして、分子ドッキングソフトウェア（ＡｕｔｏＤｏｃｋ、バージョン３．０５及び４．０）及びグリッドベースのドッキングプログラムを用いて分子ドッキング分析を行い、それによりリガンド（すなわちＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１））とインスリン受容体との間の分子相互作用エネルギー（ファンデルワールス力、反発力、水素結合相互作用エネルギー、クーロン静電エネルギー、及び内部立体エネルギーを含む）を評価した。分析結果を表１に示した。ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）（図１の中央のブロック領域）はインスリン受容体に結合し得ることが示された。

【0051】

（実施例２）インスリン受容体自己リン酸化アッセイ
インスリンといったリガンドが細胞のインスリン受容体に結合すると、インスリン受容体の自己リン酸化が引き起こされ、その結果、関連遺伝子の転写及び翻訳を含む下流のシグナル変換反応が誘発され、グルコース輸送が誘発されて細胞外グルコース濃度又は血中のグルコース濃度が低下し、血糖の低下作用が実現されるということが知られてきた。したがって、本実施例では、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリン受容体の自己リン酸化を引き起こすことができるのかについて分析し、その結果ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリン受容体に結合することができるかを観察するために、インスリン受容体自己リン酸化アッセイを行う。該アッセイは、下記の工程により行われた：ヒトリンパ球細胞株（ＩＭ−９）を１６時間血清不足下（０．１％ＢＳＡで補完されたＲＰＭＩ培地）におき、その後３７℃で１５分間ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）で刺激し、冷却ＰＢＳで洗浄した。細胞を溶解して、約２５０ｍｇの全タンパク質を得、免疫沈降を抗インスリン受容体ポリクローナル抗体（Ｃ−１９）で行った。その後、タンパク質を４℃で２時間、タンパク質Ｇ−アガロースビーズ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に吸着させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに転換させ、エレクトロブロッティングによりイモビロン−Ｐ膜にうつした。膜を４℃で一晩、抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）でインキュベートし、免疫ブロット分析を行った。結果を図２に示した。図２において、免疫ブロット分析のより広いバンドは、より高いタンパク質発現レベルを表す。加えて、図２の結果は、リン酸化されたインスリン受容体のインスリン受容体に対する比率がＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）濃度の増加に伴い増大したことを示す。

【0052】

図２に示されるように、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）は、インスリン受容体の自己リン酸化を誘導し得、それはインスリン受容体に結合し得ることが示された。

【0053】

（実施例３）受容体結合アッセイ：ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）
ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリン受容体に結合し得るのかをさらに確認するために、全細胞の受容体結合アッセイを行った。

【0054】

まず、１．２×１０^６のヒトリンパ球細胞（ＩＭ−９）を、インスリン（コントロール）又はＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）で分けて、０．１％ウシ血清アルブミンを含有する１ｍｌ ＰＢＳ中、１５分間室温でインキュベートして、競合アッセイを行った。その後、^１２５Ｉでラベルしたインスリン（２０，０００ｃｐｍ／ｍｌ）をそれに加え、９０分間１６℃でインキュベートした。インキュベート後、細胞を氷冷し、４℃で１０分間、２０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを氷冷した洗浄バッファー（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で２回洗浄した。ペレットをガンマカウンターで計測した。各ポリペプチドに対して少なくとも３回、アッセイを行った。^１２５Ｉでラベルしたインスリンがインスリン受容体に結合するのを促進する各ポリペプチドの濃度（ＥＣ_５０）を表１に示した。ＥＣ_５０は、５０％の^１２５Ｉでラベルしたインスリンがインスリン受容体に結合するのを促進することのできるポリペプチドの濃度を意味する。ＥＣ_５０値が低いほど、結合促進効果が強いことを表す。

【表1】

【0055】

表１に示されるように、インスリン及びＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）の両方は、^１２５Ｉでラベルしたインスリンがインスリン受容体に結合するのを効果的に促進させることができる。ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）のＥＣ_５０は４．１５±１．７７ｎＭであり、インスリンのそれよりも低い。ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）は、インスリン受容体に結合することができ、インスリンがインスリン受容体に結合するのを促進させる効果においてより優れることが示された。

【0056】

（実施例４）グルコース取り込みアッセイ
血糖調節の鍵となる工程は、脂肪組織が血液からグルコースを取り込むことができ、それにより血糖を低下させることである。したがって、本実施例ではさらにアッセイプラットフォームとして３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いて、グルコース取り込みアッセイを行った。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を２４ウェルプレート中で培養し、４．５時間の飢餓期間後、脂肪細胞を３０分間、クレブスリンガー重炭酸塩バッファー（ＫＲＢ；１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１．２ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２％ウシ血清アルブミン、０．５ｍＭグルコース、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ７．４）中で、インスリン無し（ネガティブコントロール群）、１ｎＭインスリン（コントロール群）、及び１ｎＭインスリン＋ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）（実験群）に分けてインキュベートした。次に、さらに１０分間、［３Ｈ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（０．１μＣｉ／アッセイ）を添加した。細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳ中で可溶化させた。細胞における放射能をシンチレーションカウンターで測定し、結果を表２に示した。

【表2】

【0057】

表２においてインスリンの放射能の比率は、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２００４；７５：２６５３−６４を参照とした（参照により本明細書に全体的に取り込まれる）。表２に示されるように、インスリン及びＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）の両方は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース取り込みを促進させることができる。このアッセイは、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が脂肪細胞のグルコース取り込みを促進させることにより血糖低下効果を実現し得ることを示す。

【0058】

（実施例５）マイクロアレイ分析
ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のグルコース取り込みを促進させる潜在的メカニズムを調べるために、マイクロアレイアッセイにより全ゲノムのスキャニングを行った。

【0059】

ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）処理又は非処理の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、米国）を用いて評価した。ＲＮＡインテグリティナンバーが８．０以上であるＲＮＡサンプルを選択した。マイクロアレイ分析を過去に開示された通りに行った（Ｃｈｅｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｑｕｉｎｏｃｌａｍｉｎｅ，ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５７（５）：７４６−７５６；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｄｒｕｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３２（２）：４２９−４３７；及びＨｓｉａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ−ｇｕｉｄｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｈｏｉｓｔ−ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０（１７）：３０４２−３０４９（参照により本明細書に全体的に取り込まれる）を参照のこと）。

【0060】

発現レベルが２倍まで増加又は減少したインスリンシグナル経路関連遺伝子又はアディポサイトカインシグナル経路関連遺伝子の数を計算し、表３に示した。

【表3】

【0061】

表３に示されるように、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるインスリンシグナル経路関連遺伝子の発現レベルを調節し、脂肪細胞のグルコース取り込みを促進させ血糖低下作用を実現することができる。

【0062】

（実施例６）ウェスタンブロッティング分析
ウェスタンブロッティング法により、インスリンシグナル経路関連遺伝子のタンパク質発現レベルを分析した。

【0063】

３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を２４時間３７℃で培養し、１６時間ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）で処理し、氷冷ＰＢＳで洗浄後、細胞スクレーパーを用いて収集し、３００μｌのサンプルバッファー（６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ドデシル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール、５０ｍＭジチオスレイトール、０．１％ブロモフェノールブルー）で溶解した。細胞溶解液のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）を用いて評価した。タンパク質（１０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、タンパク質のバンドをその後、電気泳動でニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）にうつした。膜をブロッキングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、５％スキムミルク粉末）でブロックし、抗−Ａｋｔ、抗−リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、抗−リン酸化Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、抗−リン酸化ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ ｄｅｌｅｔｅｄ ｏｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｎ）（Ｓｅｒ３８０）、抗−リン酸化ＧＳＫ−３β（グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β）（Ｓｅｒ９）、抗−リン酸化Ｒａｆ（Ｓｅｒ２５９）、抗−リン酸化ＰＤＫ１（リン酸化イノシチド依存性キナーゼ１）（Ｓｅｒ２４１）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、米国）で検査した。結果を図３に示した。図３に示される値は、ウェスタンブロッティング分析におけるバンドの強度を表す。より高い値は、標的タンパク質のより高い発現レベルを表す。

【0064】

図３に示されるように、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）は、ＰＤＫ−１、リン酸化−ＡＫｔ（Ｔｈｒ３０８）、リン酸化−ＡＫｔ（Ｓｅｒ４７３）、及びグルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）といったインスリンシグナル経路関連遺伝子のタンパク質発現レベルを増加させることができる。このアッセイの結果は、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるインスリンシグナル経路関連遺伝子の発現レベルを調節して、血糖を低下させることができることを示す。

【0065】

（実施例７）免疫化学的分析
免疫化学的分析は、下記の方法で行われた：３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を培養し、カバースライドに固定し、４℃で一晩、１：５０で希釈したＧＬＵＴ４に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）でインキュベートした。その後、細胞を２０分間室温でビオチン化された二次抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）でインキュベートした。その後、スライドをアビジン−ビオチン複合体試薬でインキュベートし、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｈｉｓｔｏｓｔａｉｎ（登録商標）−Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）で染色した。結果を図４に示した。

【0066】

図４に示されるように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の免疫化学的染色の結果はまた、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞のＧＬＵＴ４発現を促進させ得ることを示す。ＧＬＵＴ４は脂肪細胞においてグルコースを輸送することのできるタンパク質であることが知られてきた。したがって、上述のアッセイは、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がＧＬＵＴ４の発現を増加させることにより脂肪細胞のグルコース輸送を促進させ、その結果、血糖低下作用を実現し得ることを示す。

【0067】

実施例１−７のアッセイは、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）がインスリン受容体に結合し得、脂肪細胞のグルコース取り込みを促進して血糖を低下させ得ることを示す。

【0068】

（実施例８）受容体結合アッセイ：ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）の部分的アミノ酸配列
表４に示される部分的アミノ酸配列（配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及び配列番号７）を有するポリペプチドの受容体結合アッセイを、実施例２に記載される方法と同様の実験的方法を用いることにより行った。^１２５Ｉでラベルしたインスリンのインスリン受容体結合を促進するこれらのポリペプチドの濃度（ＥＣ_５０）を表４に示した。

【表4】

【0069】

表４に示されるように、ＩＲＢＰ−１−６８の部分的アミノ酸配列（すなわち、配列番号２−７）を有する本発明のポリペプチドのすべては、インスリンのインスリン受容体結合を促進させる効果を有する。ＩＲＢＰ−１−１９（配列番号２）、ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）及びＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）は、より良好な促進作用を有する。

【0070】

このアッセイの結果は、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）が１９アミノ酸（すなわち、ＩＲＢＰ−１−１９（配列番号２）及びＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６））又はさらに９アミノ酸に分割される場合、それはいまだにインスリン受容体に結合する効果を有することを示す。下記の実験を行って、さらにＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）を分析した。

【0071】

（実施例９）分子ドッキングアッセイ：ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチド
表５に示されるように、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列（配列番号８−配列番号１７８）を有するポリペプチドを固相の合成方法により製造し、実施例１に記載の方法と同様の方法により分子ドッキング分析を行った。

【0072】

ポリペプチドとインスリン受容体との間の分子間相互作用エネルギー（ファンデルワールス力、反発力、水素結合相互作用エネルギー、クーロン静電エネルギー、及び内部立体エネルギーを含む）を評価した。７０００から８０００のスコアを“＋”と表記し、８０００から９０００のスコアを“＋＋”と表記し、９０００から１００００のスコアを“＋＋＋”と表記した。ここで、より高いスコアは、ポリペプチドとインスリン受容体との間のより大きな相互作用エネルギーを表し、より強い結合作用を示唆する。

【表5】

【0073】

表５で示されるように、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列（配列番号８−配列番号１７８）を有するポリペプチドのすべては、異なるレベルのインスリン受容体への結合能を有する。

【0074】

（実施例１０）受容体結合アッセイ：ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチド
表５で示されるように、配列番号２１のアミノ酸配列を有するポリペプチド（すなわち、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列においてスレオニンをアラニンにより置換することで生じた相同的ポリペプチド；以後“ＩＲＢＰ−ＭＣ（配列番号２１）”と称する）の受容体結合アッセイを、実施例３で記載される方法と同様の実験的方法を用いることにより行った。結果を表６に示す。

【表6】

【0075】

表６に示されるように、^１２５Ｉでラベルしたインスリンのインスリン受容体への結合を促進させる、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）における１つのアミノ酸の置換により生じたＩＲＢＰ−ＭＣ（配列番号２１）の濃度は、０．８６±０．０５（ｎＭ）であり、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチドは、いまだインスリン受容体への結合能を有することが示された。

【0076】

加えて、表７に示されるように、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチドをさらに受容体結合アッセイにより分析した。本明細書において、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性は、ポリペプチド及びインスリン受容体の結合活性の指標として用いられた。インスリン受容体チロシンキナーゼの活性が高くなると、インスリン受容体へのポリペプチドの結合能が強くなることを表す。

【0077】

インスリン受容体チロシンキナーゼによるポリペプチドの結合能の評価のための実験的手法は、下記の通りである。ポリペプチド及びインスリン受容体を３０分間氷浴中に置き、その後等量の２×キナーゼバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６；５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；２００μＭ ＡＴＰ；２００ｍΜ バナジウム酸ナトリウム；５ｍｇ／Ｌ ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）；５０μＣｉ ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ／ｍｌ）をそれに加えた。サンプルを１０分間氷浴中に置いた。その後、ＴＣＡをそれに加え、フィルター紙上に基質（ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ））を沈殿させた。フィルター紙をガンマ線カウンターに置き、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性を放射強度より算出した。

【0078】

表７において、各群のポリペプチドは、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における特定のアミノ酸の置換により得られるポリペプチドのポリペプチド混合物である。例えば、ＩＲＢＰ−６０−６８−１＠は、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における第一のアミノ酸をアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、又はトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）により置換することで得られるポリペプチドのポリペプチド混合物を表し、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４８、配列番号６４、配列番号７３、配列番号８２、配列番号９１、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１７、配列番号１２５、配列番号１３４、配列番号１４３、配列番号１５２、配列番号１６１、配列番号１７０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

【表7】

【0079】

表７に示されるように、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における特定のアミノ酸の置換により得られるポリペプチドのポリペプチド混合物は、インスリン受容体への結合活性を有する。

【0080】

（実施例１１）受容体結合アッセイ：ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における複数のアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチド
表８に示されるように、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）における複数のアミノ酸の変異／置換（３−６アミノ酸の差し替え）により生じた相同的アミノ酸配列を有するポリペプチドを固相の合成方法により製造し、受容体結合アッセイを実施例３に記載と同様の方法で行った。前記相同的ポリペプチドの名称、配列、及びアッセイ結果を、表８に示した。

【表8】

【0081】

表８に示されるように、配列番号１７９−配列番号１８８のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、インスリンのインスリン受容体への結合を促進する能力を有し、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）の３−６つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有する相同的ポリペプチドはいまだ、インスリンのインスリン受容体への結合を促進する作用を有することが示され、ＩＲＢＰ−ＭＴ（配列番号１７９）、ＩＲＢＰ−ＣＭ（配列番号１８４）、ＩＲＢＰ−ＶＶ−１（配列番号１８５）及びＩＲＢＰ−ＣＰ（配列番号１８６）はより良好な促進作用を有する。

【0082】

（実施例１２）受容体結合アッセイ：ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のアミノ酸配列における複数のアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチド
実施例１に記載された方法により、９アミノ酸の長さを有し、インスリン受容体へのより良好な結合能を有する４つのポリペプチド（配列番号１９０−配列番号１９３のアミノ酸配列を有し、以後ＩＲＢＰ−９Ａ−ＩＲＢＰ−９Ｄと称する）を、分子ドッキングソフトウェアを用いることでスクリーニングして、分子ドッキング分析を行った。

【0083】

これらのポリペプチドは、ＲＹＫＹＱＸ_１Ｘ_２ＹＩ（配列番号１８９）の一般配列式を有し、Ｘ_１はシステイン又はトリプトファンであり、Ｘ_２はフェニルアラニン又はトリプトファンである。これらのポリペプチドを、実施例１０に記載されるような受容体結合アッセイにより分析した。インスリン受容体チロシンキナーゼの活性は、ポリペプチド及びインスリン受容体の結合活性の指標として用いられた。結果を表９に示す。

【表9】

【0084】

表９の結果は、ＩＲＢＰ−９Ａ−ＩＲＢＰ−９Ｄ（配列番号１９０−配列番号１９３）のポリペプチドがインスリン受容体に結合し得ることを示す。例えば、ＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）に対して、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性は、７９．７６±５．６４（Ｕ／ｍｌ）までであり得る。

【0085】

（実施例１３）分子ドッキングアッセイ：ＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）のアミノ酸配列における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的ポリペプチド
表１０に示されるように、ＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列（配列番号１９４−配列番号３６４）を有するポリペプチドを、固相の合成方法により製造した。分子ドッキング分析を実施例１に記載の方法と同様の方法により行い、リガンド（ポリペプチド）とインスリン受容体との間の相互作用エネルギー（ファンデルワールス力、反発力、水素結合相互作用エネルギー、クーロン静電エネルギー、及び内部立体エネルギーを含む）を評価した。８０００から１００００のスコアを“＋”と表記し、１００００から１２０００のスコアを“＋＋”と表記し、１２０００から１４０００のスコアを“＋＋＋”と表記した。ここで、より高いスコアは、ポリペプチドとインスリン受容体との間のより大きな相互作用エネルギーを表し、より強い結合作用を示唆する。

【表10】

【0086】

表１０に示されるように、ＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）における１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列（配列番号１９４−配列番号３６４）を有するポリペプチドのすべては、異なるレベルのインスリン受容体への結合能を有する。

【0087】

（実施例１４）血糖低下アッセイ
ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）、ＩＲＢＰの部分的アミノ酸配列を有するポリペプチド、及び部分的アミノ酸配列における複数のアミノ酸の置換により生じたポリペプチドを血糖低下アッセイにより分析した。まず、血糖の代謝が正常である３匹のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を１８時間絶食させ、一方、３匹の糖尿病マウス（ＳＴＺ誘発又はｏｂ／ｏｂ）を４時間絶食させた。表１１で示されるポリペプチド（１００μｌ、２．５×１０^−９モル／体重ｋｇ）を腹腔内注射により実験群における各マウスに投与した。コントロール群における各マウスには、１００μｌの水を投与した。１５分後、グルコース溶液（４ｇ／体重ｋｇ）を腹腔内注射により正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に投与し、グルコース溶液（１ｇ／体重ｋｇ）を糖尿病マウス（ＳＴＺ誘発又はｏｂ／ｏｂ）に投与して、マウスの血糖値を迅速に上昇させた。１５０分後、血液サンプルをマウスの尾から採り、血糖値をグルコメーター（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ Ａｄｖａｎｔａｇｅ、Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）で測定した。実験群及びコントロール群におけるマウスの血糖値を比較し、分析した。

【表11】

【0088】

表１１で示されるように、２．５×１０^−９モル／体重ｋｇのＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）又はそれから生じた相同的ポリペプチドは、正常マウス及び糖尿病マウスの両方の血糖値を効率的に低下させることができる。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群において、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）、ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）及びＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）のポリペプチドは、約６１％から７０％の血糖抑制率を達成することができる。ＳＴＺ誘発マウスの群において、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）、ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）、ＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）、ＩＲＢＰ−９Ａ（配列番号１９０）、ＩＲＢＰ−９Ｂ（配列番号１９１）、ＩＲＢＰ−９Ｃ（配列番号１９２）及びＩＲＢＰ−９Ｄ（配列番号１９３）のポリペプチドは、約２２％から６７％の血糖抑制率を達成することができる。ｏｂ／ｏｂ又はｄｂ／ｄｂマウスの群において、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）、ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）及びＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のポリペプチドは、約３３％から５５％の血糖抑制率を達成することができる。上述の結果は、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）、ＩＲＢＰ−１−６８（配列番号１）の部分的アミノ酸配列を有するポリペプチド、及び部分的アミノ酸配列における複数のアミノ酸の置換により生じたポリペプチドのすべてが血糖低下作用を有することを示す。

【0089】

（実施例１５）糖化ヘモグロビン値アッセイ
糖化ヘモグロビン値（ＨｂＡ１ｃ）は、生命体の血液中の赤血球に結合しているグルコースの濃度である。一般に、血糖の濃度がより高くなると、糖化ヘモグロビン値がより高くなり、糖化ヘモグロビン値は、糖尿病治療における薬剤の効果を評価するための指標となる。したがって、本実施例では、マウスの血糖値を制御することに対するポリペプチドの効果を、糖化ヘモグロビン値を測定することで評価した。

【0090】

表１２で示されるように、ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）及びＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のポリペプチドを糖尿病マウス（ＳＴＺ誘発）に投与した。実験群では、ポリペプチド（１×１０^−６モル／体重ｋｇ、２０μｌ）を実験群の各マウスに経口投与した。コントロール群では、各マウスに２０μｌの水を投与した。糖化ヘモグロビン値を２８日後に測定した。

【表12】

【0091】

表１２に示されるように、本発明のポリペプチドは、糖尿病マウスの糖化ヘモグロビン値を効果的に低下させることができ、該ポリペプチドはたしかに、糖尿病マウスの血糖値を低下させる効果を有することが示された。

【0092】

（実施例１６）肝臓インデックスの評価
肝−腎疾患といった合併症は糖尿病患者においてたいてい発症するため、本実施例では、マウスにおいて糖尿病により引き起こされた肝−腎疾患を制御することに対する本発明のポリペプチドの効果を、肝臓インデックスを測定することで評価した。

【0093】

ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）のポリペプチドを、実施例１４で記載される方法と同様の方法により実験群における糖尿病マウスに経口投与させた。２８日後、これらのマウスの肝臓インデックス（ＧＯＴ及びＧＰＴ）を測定し、糖尿病マウスにおける糖尿病により引き起こされた肝疾患に対する該ポリペプチドの効果を評価した。結果を表１３に示す。

【表13】

【0094】

表１３に示されるように、本発明のポリペプチドは、糖尿病マウスの肝臓インデックス（ＧＯＴ及びＧＰＴ）を効果的に低下させることができ、該ポリペプチドは、血糖値を低下させる効果により糖尿病マウスにおける糖尿病により引き起こされた肝疾患を改善させ得ることが示された。

【0095】

（実施例１７）腎臓インデックスの評価
ＩＲＢＰ−５０−６８（配列番号６）及びＩＲＢＰ−６０−６８（配列番号７）のポリペプチドを、実施例１４で記載される方法と同様の方法により実験群における糖尿病マウスに経口投与させた。２８日後、これらのマウスの血中の腎臓インデックス（ＢＵＮ及びＣＲＥ）を測定し、糖尿病により引き起こされた腎疾患に対する該ポリペプチドの効果を評価した。結果を表１４に示す。

【表14】

【0096】

表１４に示されるように、本発明のポリペプチドは、糖尿病マウスの腎臓インデックス（ＢＵＮ及びＣＲＥ）を効果的に低下させることができ、該ポリペプチドは、血糖値を低下させる効果により糖尿病マウスにおける糖尿病により引き起こされた腎疾患を改善させ得ることが示された。

【0097】

上記の開示は、技術の詳細及び本発明の特徴に関する。本技術分野における当業者であれば、本発明の特性を逸脱することなく、記述された本発明の開示及び示唆に基づき、種々の変更及び置換を行い得る。それにもかかわらず、このような変更及び置換が上記の記述において十分には開示されないが、それらは下記に添えられた特許請求の範囲において実質的にカバーされてきた。
（付記１）
ＩＶＡＲＰＰＴＩＧ（配列番号７）のアミノ酸配列又は配列番号７において１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有し、
前記相同的アミノ酸配列は、配列番号８−配列番号１７８からなる群より選択されたアミノ酸配列である、
単離されたポリペプチド。
（付記２）
配列番号７及び配列番号２１からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、付記１に記載のポリペプチド。
（付記３）
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６からなる群より選択された、配列番号１の部分的アミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
（付記４）
前記配列番号１の部分的アミノ酸配列は、配列番号２又は配列番号６のアミノ酸配列である、
ことを特徴とする付記３に記載のポリペプチド。
（付記５）
配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７及び配列番号１８８からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
（付記６）
配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８５及び配列番号１８６からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する、付記５に記載のポリペプチド。
（付記７）
ＲＹＫＹＱＸ１Ｘ２ＹＩ（配列番号１８９）のアミノ酸配列又は配列番号１８９において１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有し、
Ｘ１は、システイン又はトリプトファンであり、Ｘ２は、フェニルアラニン又はトリプトファンである、
単離されたポリペプチド。
（付記８）
配列番号１８９のアミノ酸配列を有する、付記７に記載のポリペプチド。
（付記９）
Ｘ１は、システインである、
ことを特徴とする付記７に記載のポリペプチド。
（付記１０）
ＲＹＫＹＱＣＦＹＩ（配列番号１９１）のアミノ酸配列又は配列番号１９１において１つのアミノ酸の置換により生じた相同的アミノ酸配列を有し、前記相同的アミノ酸配列は、配列番号１９４−配列番号３６４からなる群より選択されるアミノ酸配列である、
ことを特徴とする付記７に記載のポリペプチド。
（付記１１）
付記１乃至１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（付記１２）
有効量の付記１乃至１０のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドを含む、血糖を低下させること、糖化ヘモグロビンを低下させること、及び糖尿病により引き起こされる肝−腎疾患を改善させることの少なくとも１つの治療における使用のための医薬組成物。

【0098】

（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願１０１１１７７７９（出願日２０１２年５月１８日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]