特許 5686593 ＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰからなる群より選ばれる不安定な抗原を定量するための免疫アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5686593

(24)【登録日】2015年1月30日

(45)【発行日】2015年3月18日

(54)【発明の名称】ＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰからなる群より選ばれる不安定な抗原を定量するための免疫アッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20150226BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20150226BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20150226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150226BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 B

   G01N33/577 B

   C07K16/18ZNA

   !C12P21/08

【請求項の数】1

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2010-502538(P2010-502538)

(86)(22)【出願日】2008年4月14日

(65)【公表番号】特表2010-523994(P2010-523994A)

(43)【公表日】2010年7月15日

(86)【国際出願番号】FI2008050184

(87)【国際公開番号】WO2008125733

(87)【国際公開日】20081023

【審査請求日】2011年2月1日

(31)【優先権主張番号】20075251

(32)【優先日】2007年4月13日

(33)【優先権主張国】FI

(31)【優先権主張番号】60/911,603

(32)【優先日】2007年4月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508347579

【氏名又は名称】ヒュテスト アエルテーデー．

【氏名又は名称原語表記】ＨＹＴＥＳＴ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100116838

【弁理士】

【氏名又は名称】渡邉 潤三

(72)【発明者】

【氏名】タムー，ナタリア，エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】カトゥルーカ，アレクセイ，ジー．

(72)【発明者】

【氏名】フィラトフ，ブラディミール，エル．

(72)【発明者】

【氏名】コロソヴァ，オルガ，ブイ．

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／００４３１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特許第３５１６６５５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 Karl J, Borgya A, Gallusser A, Huber E, Krueger K, Rollinger W, Schenk J.，Development of a novel, N-terminal-proBNP (NT-proBNP) assay with a low detection limit.，Scand J Clin Lab Invest Suppl，１９９９年，Vol.230，Page.177-181

【文献】 Teramura Y, Arima Y, Iwata H.，Surface plasmon resonance-based highly sensitive immunosensing for brain natriuretic peptide using nanobeads for signal amplification.，Anal Biochem，２００６年１０月，Vol.357,No.2，Page.208-215

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、およびそれらの断片をサンプルから検出するための免疫アッセイの方法であって、
（ａ）抗原を、ＢＮＰ分子の_１１ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ_２２（配列番号３）断片に特異的な第１抗体と接触させて、１次免疫複合体を得、
（ｂ）工程（ａ）で得た１次免疫複合体を、該１次免疫複合体を認識し、且つ、遊離のＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰやそれらの断片、および遊離の第１抗体を全く認識しないか、もしくは該１次免疫複合体を認識する際の親和性の１０分の１以下の低い親和性でもって認識する第２抗体と接触させて、２次免疫複合体を得、そして
（ｃ）２次免疫複合体の形成を検出する
ことを包含し、上記工程（ａ）〜（ｃ）によって検出されたタンパク質は、ＢＮＰ内またはｐｒｏＢＮＰ内で離れて位置する複数のエピトープのそれぞれに特異的な抗体を用いて検出したタンパク質よりも、見かけ上の安定性が高まっていることを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は免疫アッセイに関し、不安定な抗原を検出するための免疫アッセイの方法を提供する。本発明の方法は、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰおよびそれらの断片の検出に特に適している。

【背景技術】

【0002】

ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰは、臨床において広く使用されている、心不全（ＨＦ）の信頼性の高いマーカーである。ＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰ分子由来のＢＮＰ断片の異なるエピトープに特異的な２種のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を使用する数種のサンドウィッチ免疫アッセイ（従来のアッセイ）が、文献に記載されている。

【0003】

ＢＮＰ分子は、水溶液中では急速に免疫学的活性を喪失する非常に不安定な分子として知られている。このような活性の喪失は、通常、ペプチドのタンパク分解と関連している。抗原の定性的または定量的な免疫検出に一般的に用いられているサンドウィッチ免疫アッセイは、２種以上の異なるエピトープのそれぞれに特異的な２種以上の抗体を使用する。エピトープ間の距離が長いほど、抗体に対応する複数のエピトープの間にタンパク分解部位が含まれる確率が上昇するため、抗原のタンパク分解に対するアッセイの感受性が上昇する。それとは逆に、エピトープが互い近くに位置しているほど、エピトープ間で分子のタンパク分解性開裂が生じる確率も減少する。

【0004】

非常に小さな分子を対象とした免疫アッセイ方法に関する記載もあり、そこには抗メタタイプ抗体と呼ばれる抗体の使用も含まれている。このような方法は、例えばジゴキシンの検出（Self et al, 1994, Clin. Chem. 40:2035-2041）およびアンジオテンシンIIの検出（Towbin et al, 1995, J. Immunol. Meth. 181:167-176）について開示されている。

【0005】

しかしながら、このような方法は非常に特異的なモノクローナル抗体を必要するため、種々の検体に応用することは簡単ではない。

【0006】

発明の詳細な説明
本願明細書に、ヒト血液中のＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰの定量化のための免疫アッセイについて記載する。このアッセイを「不均等サンドウィッチ法」と命名した。このアッセイは、全ての不安定な抗原の免疫検出に応用可能である。

【0007】

本願で開示する免疫アッセイは２種の異なるモノクローナル抗体を使用する。ＢＮＰまたはｐｒｏＢＮＰの検出において、第１モノクローナル抗体（モノクローナル抗体２４Ｃ５）は、ＢＮＰのアミノ酸残基１１番〜２２番（₁₁ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ₂₂）（ｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基８７番〜９８番に対応）を包含する領域（またはこの領域の一部分）に特異的である（図１）。第２抗体（即ち、モノクローナル抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４）はシグナル発生成分によって標識されており、第１抗体と抗原（ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰまたはそれらの断片であって、該断片は、アミノ酸残基₁₁ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ₂₂またはこのアミノ酸配列内の少なくとも３個のアミノ酸残基を包含するものである）からなる免疫複合体を認識する。第２抗体は、遊離の抗原やその断片、または遊離のモノクローナル抗体２４Ｃ５を認識しない（または１０分の１以下の低い親和性でもって認識する）。従って、モノクローナル抗体２４Ｃ５とＢＮＰ（またはｐｒｏＢＮＰやそれらの断片）を包含する１次免疫複合体は、第２抗体（モノクローナル抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４）の抗原となる。

【0008】

従って、本発明の一般的な目的は、不安定な抗原をサンプルから検出するための、以下の工程を包含する免疫アッセイの方法を提供することである。
（ａ）目的の抗原を、この抗原分子の第１エピトープに特異的な第１抗体と接触させて、１次免疫複合体を得、
（ｂ）工程（ａ）で得た１次免疫複合体を、１次免疫複合体を認識し、目的の抗原と第１抗体によって形成された第２エピトープに特異的な抗体であって、遊離の抗原やその断片、または遊離の第１抗体を認識することができないか、１次免疫複合体を認識する際の親和性の１０分の１以下の低い親和性でもって認識する抗体である第２抗体と接触させて、２次免疫複合体を得、そして
（ｃ）２次免疫複合体の形成を検出する。

【0009】

本発明の詳細な目的は、ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、およびそれらの断片からなる群より選ばれる不安定な抗原をサンプルから検出するための、以下の工程を包含する免疫アッセイの方法を提供することである。
（ａ）抗原を、ＢＮＰ分子の₁₁ＦＧＲＫＭＤＲＩＳＳＳＳ₂₂断片またはそこに含まれる少なくとも３個のアミノ酸残基を包含する部分配列からなるペプチドに特異的な第１抗体と接触させて、１次免疫複合体を得、
（ｂ）工程（ａ）で得た１次免疫複合体を、１次免疫複合体を認識する抗体であって、遊離のＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰやそれらの断片、または遊離の第１抗体を認識することができないか、１次免疫複合体を認識する際の親和性の１０分の１以下の低い親和性でもって認識する抗体である第２抗体と接触させて、２次免疫複合体を得、そして
（ｃ）２次免疫複合体の形成を検出する。

【0010】

本発明者らは、本発明の方法に適応可能な特異的モノクローナル抗体の開発に成功した。これら抗体を提供することも本発明の特定の目的である。

【0011】

ここに記載する不均等サンドウィッチ法は、離れて位置する複数のエピトープのそれぞれに特異的な抗体を使用するアッセイと比べて、抗原のタンパク分解に対して並外れた非感受性を発揮する。

【0012】

さらにこのような手法は、他の１種以上の抗原と類似した抗原（即ち、複数の異なるエピトープをその表面に有しているものの、特定の抗原を他の抗原から区別するための独自のエピトープは１つ（または複数であっても非常に限られた数）である抗原）の、免疫検出のために開発したアッセイとしても使用することができる。

【0013】

実施例
注： 安定Ｅｕ−キレートで標識した抗体を、全ての実験において検出用抗体として使用した。実験で使用したモノクローナル抗体２４Ｃ５、Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４、５７Ｈ３および５０Ｅ１は、フィンランド国、トゥルク、ヒュテスト アエルテーデー（Hytest Ltd）より入手可能である。

【実施例1】

【0014】

抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と複合体を形成していないＢＮＰやｐｒｏＢＮＰを認識しない（図２）
図２Ａおよび図２Ｂに示した実験においては、抗原（それぞれＢＮＰおよびｐｒｏＢＮＰ）をプレートの被覆に使用し、直接免疫アッセイによってＥｕ−標識抗体を抗原で試験した。抗体２４Ｃ５は両方の形態の抗原を認識したが、モノクローナル抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、２種の抗原のいずれに対しても応答を示さなかった（シグナルはバックグラウンド値と同等）。

【0015】

図２Ｃに示した実験においては、ＢＮＰ分子上の種々のエピトープに対して特異的なポリクローナル抗体でプレートを被覆した。第２工程では、プレートをまずＢＮＰと共にインキュベートし、次にＥｕ−標識抗体とインキュベートした。このような手法は、プレート表面に対していろいろな配向で抗原を結合する助けとなり、プレート表面上の分子の配向が実験結果に影響しないことを保証する。この実験においては、上述と同じ結果が得られた。即ち、モノクローナル抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と複合体を形成していない抗原を認識することはできなかった。

【実施例2】

【0016】

抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と免疫複合体を形成しているＢＮＰおよびペプチド１１−２２を認識することができる（図３）
モノクローナル抗体２４Ｃ５は、ＢＮＰ分子の１１番〜２２番断片またはｐｒｏＢＮＰの対応する８７番〜９８番領域に特異的である。免疫複合体である２４Ｃ５ − ＢＮＰおよび２４Ｃ５ − ペプチド１１−２２がモノクローナル抗体であるＡｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４によって認識され得ることを示すために、モノクローナル抗体２４Ｃ５を用いてプレートを被覆し、その後、プレートをＢＮＰ、またはＢＮＰ配列のアミノ酸１１番〜２２番に対応する合成ペプチド（ペプチド１１−２２）と共にインキュベートした。モノクローナル抗体２４Ｃ５と抗原との間に免疫複合体が形成された後、プレートをＥｕ−標識抗体であるＡｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４、またはＢＮＰ分子の２６番〜３２番領域に特異的な５７Ｈ３と共にインキュベートした。

【0017】

不均等サンドウィッチ法はＢＮＰとペプチドをほぼ同じ効率で認識する。抗体２４Ｃ５（被覆） − ５７Ｈ３−Ｅｕを使用するアッセイは、ペプチド１１−２２を認識しなかった（シグナルはバックグラウンド値と同等）。

【実施例3】

【0018】

抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と免疫複合体を形成するｐｒｏＢＮＰを認識することができる（図４）
不均等サンドウィッチ法は、従来のアッセイと同じ効率でｐｒｏＢＮＰを認識する。本発明者らはモノクローナル抗体２４Ｃ５を用いてプレートを被覆し、その後プレートを、初めに組み換えｐｒｏＢＮＰ（５ｎｇ／ｍｌ）、続いてＥｕ−標識抗体であるＡｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４、またはＢＮＰ分子の２６番〜３２番領域に特異的な５７Ｈ３と共にインキュベートした。不均等サンドウィッチ法と従来の免疫アッセイのそれぞれで得られたシグナルは同等であった。そこで、新規なアッセイはｐｒｏＢＮＰの定量的免疫検出に使用可能であると結論付けた。

【実施例4】

【0019】

抗原の見かけ上の安定性（図５）
合成ＢＮＰ（Bachem製）をプールした正常ヒト血漿に加え（２ｎｇ／ｍｌ）、＋４℃で種々の時間インキュベートし、免疫活性を３種の異なるアッセイ、即ち、１種の従来法と２種の不均等サンドウィッチ法で試験した。

【0020】

本願明細書に記載した不均等サンドウィッチ法によって決定した抗原の見かけ上の安定性は、ＢＮＰ分子の異なる部位に特異的な２種のモノクローナル抗体を使用する従来のＢＮＰアッセイによって決定した安定性と比べて有意に高かった。従来のアッセイの一例として、ＢＮＰ分子の領域２６番〜３２番に特異的なモノクローナル抗体５０Ｅ１とＢＮＰ分子の領域１１番〜２２番に特異的なモノクローナル抗体２４Ｃ５を用いるアッセイを使用した。不均等サンドウィッチ法を免疫活性の決定に使用した場合には、免疫活性の約７０％（Ａｂ−ＢＮＰ２を用いたアッセイとＡｂ−ＢＮＰ４を用いたアッセイがそれぞれ６９．８％と６８％）が＋４℃において２４時間インキュベートした後に観察され、従来のアッセイの場合は２８％しか観察されなかった。インキュベーション開始から６日後には、従来のアッセイ法では免疫活性が見られなかったが、不均等サンドウィッチ法の場合には、初期免疫活性の約１／４が観察された。

【実施例5】

【0021】

心不全患者（ＨＦ患者）血液および健常ドナー血液におけるＢＮＰ／ｐｒｏＢＮＰの測定（図６）
従来のＢＮＰアッセイのみならず、不均等サンドウィッチ法も“ＢＮＰ免疫活性”を示す抗原の２つの形態、即ち、ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰ、をヒト血液中から検出することができる。数人のＨＦ患者および健常ドナーから得た血液サンプルについて、以下の３種のアッセイで試験した：ＢＮＰ分子の２６番〜３２番断片に特異的な捕捉モノクローナル抗体５０Ｅ１と検出モノクローナル抗体２４Ｃ５−Ｅｕを用いた１種の従来法、および２種の不均等サンドウィッチ法。全てのアッセイにおいて、合成ＢＮＰを検量に用いた。図６から明らかなように、３種のアッセイによる試験結果は非常に類似していた。いくつかのサンプルにおいては、従来のアッセイによる試験結果は不均等サンドウィッチ法よりも低かった。この観察結果は、このようなサンプルにおいてはＢＮＰが部分的に分解されていたものの、不均等サンドウィッチ法において抗原はより高い見かけ上の安定性を提示するため、これらアッセイで決定した抗原値は従来のアッセイよりも高くなったと説明することができる。

【実施例6】

【0022】

検量曲線（図７）
合成ＢＮＰを抗原として使用した２種の不均等サンドウィッチ法および１種の従来アッセイのための検量曲線を、図７（Ａ、ＢとＣ）に示した。両方の不均等サンドウィッチ法が、従来のアッセイと同等の高感受性を示し、ヒト血液中のＢＮＰ免疫活性およびｐｒｏＢＮＰ免疫活性の厳密な検出にも使用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＢＮＰとｐｒｏＢＮＰの構造およびモノクローナル抗体２４Ｃ５のエピトープ特異性。モノクローナル抗体２４Ｃ５は、ＢＮＰ分子のアミノ酸残基１１番〜２２番を包含する断片およびｐｒｏＢＮＰのアミノ酸残基８７番〜９８番からなる断片（灰色で示した）を認識する。

【図2A】抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と複合体を形成していないＢＮＰやｐｒｏＢＮＰを認識しない。Ｅｕ−標識モノクローナル抗体２４Ｃ５、Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４（２００ｎｇ／ウェル）を、５０ｎｇ／ウェルのＢＮＰで被覆したプレート内でインキュベートした。

【図2B】抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と複合体を形成していないＢＮＰやｐｒｏＢＮＰを認識しない。Ｅｕ−標識モノクローナル抗体２４Ｃ５、Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４（２００ｎｇ／ウェル）を、１００ｎｇ／ウェルのｐｒｏＢＮＰで被覆したプレート内でインキュベートした。

【図2C】抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と複合体を形成していないＢＮＰやｐｒｏＢＮＰを認識しない。Ｅｕ−標識モノクローナル抗体２４Ｃ５、Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４（２００ｎｇ／ウェル）を、ＢＮＰ（０．５ｎｇ／ウェル）とプレインキュベートしたポリクローナル抗ＢＮＰ抗体（２μｇ／ウェル）で被覆したプレート内でインキュベートした。

【図3】抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５とＢＮＰ（またはペプチド１１−２２）との免疫複合体を認識することができる。３つの工程からなるアッセイのプロトコルは次の通りである。 第１工程：プレートを捕捉モノクローナル抗体２４Ｃ５でプレコートし、 第２工程：プレートを洗浄した後、抗原（ＢＮＰまたはペプチド１１−２２）と共にインキュベートし、 第３工程：プレートを洗浄した後、検出用（Ｅｕ³⁺標識）抗体（Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４または５７Ｈ３）と共にインキュベートした。洗浄後、増幅溶液を添加し、シグナルを測定した。

【図4】抗体Ａｂ−ＢＮＰ２とＡｂ−ＢＮＰ４は、モノクローナル抗体２４Ｃ５と免疫複合体を形成するｐｒｏＢＮＰを認識することができる。３つの工程からなるアッセイのプロトコルは次の通りである。 第１工程：プレートを捕捉モノクローナル抗体２４Ｃ５でプレコートし、 第２工程：プレートを洗浄した後、ｐｒｏＢＮＰ（５ｎｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、 第３工程：プレートを洗浄した後、検出用抗体（Ａｂ−ＢＮＰ２、Ａｂ−ＢＮＰ４または５７Ｈ３）と共にインキュベートした。洗浄後、増幅溶液を添加し、シグナルを測定した。

【図5】正常ヒト血漿中のＢＮＰの安定性。合成ＢＮＰをプールした正常ヒト血漿に加え（２ｎｇ／ｍｌ）、＋４℃で種々の時間インキュベートした。免疫活性を３種の異なるアッセイ、即ち、１種の従来法と２種の不均等サンドウィッチ法で試験した。

【図6】ＨＦ患者および健常ドナーの血液におけるＢＮＰ／ｐｒｏＢＮＰ測定。心不全患者６人の血漿サンプル（ＨＦ１〜ＨＦ６）および健常ドナーの血漿サンプル（ＮＰ１〜ＮＰ４）を３種のアッセイで試験した。合成ＢＮＰ（Bachem製）を全てのアッセイの検量に使用した。

【図7A】従来のアッセイ（５０Ｅ１ − ２４Ｃ５-Ｅｕ）のための検量曲線。抗原： 合成ＢＮＰ（Bachem製）。

【図7B】不均等サンドウィッチ法（２４Ｃ５ − Ａｂ−ＢＮＰ２）のための検量曲線。抗原： 合成ＢＮＰ（Bachem製）。

【図7C】不均等サンドウィッチ法（２４Ｃ５ − Ａｂ−ＢＮＰ４）のための検量曲線。抗原： 合成ＢＮＰ（Bachem製）。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]