特許 5693243 フラボノール化合物、生物活性抽出物又はフラクション、薬理学的組成物、医薬品及び製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5693243

(24)【登録日】2015年2月13日

(45)【発行日】2015年4月1日

(54)【発明の名称】フラボノール化合物、生物活性抽出物又はフラクション、薬理学的組成物、医薬品及び製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 407/04 20060101AFI20150312BHJP

【ＦＩ】

   C07D407/04

【請求項の数】3

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2010-549257(P2010-549257)

(86)(22)【出願日】2009年3月3日

(65)【公表番号】特表2011-513390(P2011-513390A)

(43)【公表日】2011年4月28日

(86)【国際出願番号】IN2009000146

(87)【国際公開番号】WO2009110003

(87)【国際公開日】20090911

【審査請求日】2012年2月17日

(31)【優先権主張番号】534/DEL/2008

(32)【優先日】2008年3月5日

(33)【優先権主張国】IN

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】596020691

【氏名又は名称】カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100081318

【弁理士】

【氏名又は名称】羽切 正治

(72)【発明者】

【氏名】マウリヤ、ラケシュ

(72)【発明者】

【氏名】ラーワト、プリーティ

(72)【発明者】

【氏名】シャラン、クナール

(72)【発明者】

【氏名】シディキ、ジャエド、アクタル

(72)【発明者】

【氏名】スワランカル、ガウラヴ

(72)【発明者】

【氏名】ミシュラ、ジータンジャリ

(72)【発明者】

【氏名】マニカヴァサガム、ラクシュミ

(72)【発明者】

【氏名】ジャイン、ギリシュ、クマール

(72)【発明者】

【氏名】アリヤー、カマル、ラーム

(72)【発明者】

【氏名】チャットパドヤイ、ナイベドヤ

【審査官】 爾見 武志

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１０５８５９４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０９２６６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Arch Pharm Res，(2004), Vol.27, No.7，p.751-756

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｄ ４０７／０４

ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウルムスワリチアーナから得た抽出物又はフラクション及び一般式２で表される化合物の製造方法であって、当該製造方法は
（ａ）植物であるウルムスワリチアーナを得る工程と、
（ｂ）当該植物材料を粉化する工程と、
（ｃ）当該粉化した植物材料をプロトン性溶媒で室温下抽出する
工程と、
（ｄ）当該抽出物をろ過する工程と、
（ｅ）減圧下で当該抽出物を濃縮する工程と、
（ｆ）抽出物をヘキサンで処理して粉状化して非極性組成物を除去する工程と、
（ｇ）真空下で残留物を乾燥させて自由流動性粉状にすることにより望ましい抽出物を得る工程と、
（ｈ）工程（ｇ）で得た抽出物を水中に溶解する工程と、
（ｉ）ｎ−ブタノールを添加して水溶性抽出物を沈殿させる工程と、
（ｊ）白色沈殿物をろ過してＫ０５８を得る工程と、
（ｋ）メタノールとエチルアセテートの混合物で得られた化合物を結晶化する工程と、
（ｌ）当該化合物をろ過する工程と、
（ｍ）当該化合物を乾燥して、自由流動性白色粉状の形態でＫ０５８を得る工程と、
（ｎ）ろ液と粉末をアセトンで濃縮する工程と、
（ｏ）化合物Ｋ０１２、Ｋ０６８、Ｋ１００をアセトン可溶フラクションから従来のクロマトグラフ法により分離する工程と、
（ｐ）抽出物及びアセトン可溶フラクション中でＫ０５８、Ｋ０１２、Ｋ０６８、Ｋ１００を定量する工程、
とを含むことを特徴とする製造方法。
（一般式２）

【請求項2】

抽出用に使用されたアルコールはメタノール、エタノール、プロパノール、又はこれらの適切な組み合わせからなるグループより選択されることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

粉砕に使用される溶媒は、アセトン、エチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、エチルアセテート、メタノール、又はこれらの適切な組み合わせからなるグループより選択されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患に関連するさまざまな医学的適応の予防及び／又は治療に有用な自然源から分離した新規なフラボノール化合物、新規な植物抽出物、フラクション、及びその純化合物を提供する医薬成分の分野に関し、ヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に関する。更に本発明は、ニレ科に属するウルムスワリチアーナから分離した生物活性抽出物／フラクション及びその化合物の作製プロセスに関し、本発明の主な態様は、医薬的に許容される塩や成分である。

【背景技術】

【0002】

骨粗しょう症は、「低骨量」とも定義され、高齢化社会の問題の１つとされる。骨粗しょう症は、老人人口における骨組織の微細構造の異常を特徴とし、骨の脆弱性が増大し、骨折の危険性が増加する疾患である。骨粗しょう症の骨折は、脊髄、腰、橈骨遠位端等に最もよく起こる。危険性は男性に比べて女性の方が高く、５０歳以降急激に増加する。骨粗しょう症に罹りやすくなる要因として、家系、遺伝的素因、ホルモン因子、不適切な栄養、ある種の薬物の摂取、運動不足、及び病気等が挙げられる。重度の骨粗しょう症の場合、生活の質が著しく損なわれる。５０歳以上の５０％以上の女性及び３０％の男性が骨粗しょう症に罹ることが知られている。女性の場合さらに、更年期以降数年間で急激に骨量の低下率が加速される。

【0003】

南アジアの女性の間では、最大骨量（ＰＢＭ）が低下した患者と骨粗しょう症の患者との間に因果関係が認められている（S. Adami. 骨粗しょう症国際会議 1：S27-30, 1994）。ＰＢＭは正常な発育として達成される骨量の最高レベルとして定義されるものである。青年期は、ＰＢＭの半分以上が１０代の間に蓄積されるため、骨の健康スパンにおいて最も重要な期間である。人生における前半期に、骨吸収より造骨の方が大きく骨量が増加する。青年期に達成されたＰＢＭは、少なくとも７０歳になるまで骨格の脆弱性の重要な決定因子となる（L.A. Soyka, W.P. Fairfiled, A. Klibanski. J Clin Endocrinol Metab, 11：3951-3963, 2000）。ＰＢＭの達成後、造骨より骨吸収の方が加速され、骨密度が減少していく。加齢と共に次第に進行する骨量の低下はノーマルである一方、骨粗しょう症のリスクが最も高い人というのは、最適なＰＢＭを達成できない人及び／又は骨量の低下を加速させている人である。又、ＰＢＭの低下により脆弱性骨折の危険が更に増す。

【0004】

従って、若年期に高いＰＢＭを有する人たちは老年期にも高い骨量を有する傾向があるため、骨格の発育時にＰＢＭを増加させる作用因子があれば、骨粗しょう症を予防する上で望ましい。ＰＢＭ達成の正確なタイミングは定かではなく骨格部位によりさまざまであるが、骨のミネラルの付着による質量増大がこのタイミング以降も続くため、ＰＢＭは身長の伸びが止まってからも数年は維持される。大腿骨の面密度（ＢＭＤ）は２０歳ぐらいでピークに達する。一方、その後６〜１０年後に最大全骨格量を達成する。これは成長ホルモン（ＧＨ）のタンパク同化作用が停止してから大分経過してからである。

【0005】

骨量低下疾患に使用できる薬剤として、主にカルシウム、ビタミンＤとその類似体、カルシトニン、ビスフォスフォネート、ラロキシフェン、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）等が挙げられ、それらは骨吸収率を低下させることによって骨量低下率を遅らせる作用をする。これら抗吸収剤をタイムリーに投与することにより、骨量低下を予防することができる。

【0006】

しかし、ホルモン補充療法は卵巣摘出術後や更年期障害の女性において骨量の低下を予防する上で効果的であるものの、子宮内膜増殖症や癌のリスクを増大させる［Grady, D. Grebretsadik, T. Ernestwr, V. Petitti, D. Gynecol. 85, 304-313（1995）, Beresford S. A. Weiss, N. S. Voigt, L. F. McKnight, B. Lancet 349, 458-461（1997）］、乳癌［Riggs, L. Hartmann, L. C. J. Med. 348-618-629,（2003）］、及び血栓塞栓症［Delmas, P.D. Lancet 359, 2018-2026（2002）］。

【0007】

腎結石を促進させることがカルシウム療法の副作用として挙げられる。更にカルシトニンの使用の際の主なデメリットはコストが高いことである。又、カルシトニン治療を受ける何人かに速成耐性が促進される可能性がある。

【0008】

ビスフォスフォネートは吸収されにくく、胃腸刺激、下痢、便秘を引き起こす可能性がある。ラロキシフェンは顔面紅潮、深部静脈血栓症、肺塞栓症、及び脚のけいれんを引き起こすことが報告されている［Clemett, D.；Spencer, C. M. Drugs 60,380-409（2000）］。

【0009】

ＰＢＭの達成に関する要因として、先天性、食事、ホルモン、運動、ライフスタイル、薬、及び病気等が挙げられる。ＰＢＭ増加を狙った治療的介入は、エストロゲンの状態、食事からのカルシウム摂取、及び運動等の制御因子に限られる。カルシウムの摂取は、所謂閾値摂取（１０００ｍｇ／日）まで適切であると思われるが、高い摂取量が付加的利益をもたらすようには思えない。運動は、機械的ストレスが加わる骨格領域のみに影響を及ぼす。エストロゲン投与は、重度膣炎等のような状態においてのみに現実的となる。明らかに、栄養不足は、南アジア女性、特に人生の後半期に骨量低下になりやすい女性のＰＢＭ欠如の主な理由の１つである。従って、ＰＢＭを促進する作用因子が、骨量低下疾患に対する治療的示唆となる。

【0010】

上記治療とこれに伴う副作用を鑑みると、骨粗しょう症及びＰＢＭが達成できない場合に対する予防及び治療の代替オプションを模索する必要がある。

【0011】

伝統医学というのは現代科学が健康の分野にも応用される以前の人間社会に存在する古代医療行為を指す。主な健康管理の根源としての伝統医学の重要性は、１９７６年伝統医学プログラムを世界的に発表することにより、世界保健機関（ＷＨＯ）により初めて正式に認められた。伝統医学には、骨の病気を治療する可能性があるたくさんの生薬がある。しかしながら、イプリフラボン、天然物誘導体を除いて、伝統医学の開発や使用の可能性を評価する実習指導が充分に行われなかった。イプリフラボン、天然物誘導体は以下の適応例に臨床的に使用されている［Fujita, T.；Yoshikawa, S.；Ono, K.；Inoue, T.；Orimo, H. J. Clin. Exp. Med. 138, 113-141（1986），Passeri, M.；Biondi, M. ；Costi, D. ；Bufalino, L.；Castiglione, g. N.；DiPeppe, C.；Abate, G. Bone Miner. 19（Suppl. 1），S57-62（1992）］。漢方薬がたやすく入手でき、安く、そして化学合成薬品より安全であると信じられている。インドでは、ウパニシャッドや仏教の哲学やその他インドの学派の台頭と共にアユルベーダ医療が現れた。ハーブはアユルベーダ医療において重要な役割を果たしている。このようなアユルベーダ漢方薬として、ウルムスワリチアーナプランションが挙げられる。クマオンの心霊治療家の周囲では、この植物を骨折治療に使用する［Gaur, R. D. Flora of District Garhwal, North West Himalaya. Trans Media, Srinagar（Garhwal）, India, 1999, pp. 86；Arya, K. R.；Agarwal, S. C. Indian J. Traditional Knowledge, In Press］。しかし、骨粗しょう症や骨系疾患、及び関連疾患に対する効果は科学的に解明されてはいない。

【0012】

よって、動物や人間において試験的に骨の同化作用や造骨の可能性を発揮する有望なハーブ製品や生物機能性単一分子ベースの薬品、もしくは植物由来の純粋生物機能性分子の混合物等を早急に開発する必要があった。ウルムスワリチアーナは、その抽出物やフラクション及びバイオマーカー成分の造骨反応の真の可能性を研究開発するのに適切な例である。実験によると、抽出物、フラクションから分離した生薬エキス、アセトン可溶性フラクション及び純化合物は有望な造骨活性を発揮することが分かった。

【0013】

ウルムスワリチアーナプランションはニレ科に属し、アフガニスタンから西ネパールに亘るヒマラヤに分布する［Dictionary of Indian Folk Medicine 及び Ethnobotany edited by Jain, S. K., Deep Publications, Paschim Vihar, New Delhi, India, 1991, pp183］。この植物の葉は飼料として、樹皮は強い繊維として消費される。インドでは、この植物はＣｈａｍａｒｍｏｕと地元で呼ばれるクマオン及びガルワール・ヒマラヤに生息し、高さ３５ｍにもなる落葉性の木である。この木はこれまで、化学的に及び薬理学的に調査されることはなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明の主な目的は、ウルムスワリチアーナから、骨疾患の管理、予防又は治療に有用な新規な化合物や生物活性抽出物／フラクションを作製することである。

【0015】

本発明の他の目的は、生物活性抽出物／フラクションのマーカー化合物を同定することである。

【0016】

本発明の更なる他の目的は、個々の成分を分離するプロセスを提供することである。

【0017】

本発明の更なる他の目的は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療のための、及びヒト及び動物の健康的な骨格成長における骨量（ＰＢＭ）最大量の達成のための薬理学的成分を提供することである。

【0018】

[発明の要約]
本発明は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患に関連するさまざまな医学的適応の予防及び／又は治療に有用な自然源から分離した新規なフラボノール化合物、新規な植物抽出物、フラクション、及びその純化合物を提供する医薬成分の分野に関し、ヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に関する。更に本発明は、ニレ科に属するウルムスワリチアーナから分離した生物活性抽出物／フラクション及びその化合物の作製プロセスに関し、本発明の主な態様は、医薬的に許容される塩や成分である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】抽出物、フラクション、及びウルムスワリチアーナの幹の皮より分離される生薬エキス及び純フラクションを示すフローチャートである。

【図2】ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、ラットにおけるＯｖｘ−誘発による骨量低下を抑制する。摘出された骨におけるＢＭＤ（骨密度）をＤＥＸＡにより測定した。体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２で９０日間治療したＯｖｘラットを、Ｏｖｘラット、賦形剤で治療した擬似手術のラットと比較した。（Ａ）大腿骨全体、（Ｂ）大腿骨頸、（Ｃ）大腿骨骨幹軸、（Ｄ）第４腰椎をそれぞれ示す（擬似手術のラットのＢＭＤと比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、ＯｖｘコントロールのラットのＢＭＤと比較した場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【図3】ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、ラットの子宮レベルではエストロゲン性を示さない。擬似手術を受けたコントロールラット及びＯｖｘラットに対して、体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２で９０日間治療したラットの子宮重量を示す。擬似コントロールラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、Ｏｖｘラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１；ｂ−Ｐ＜０．０１；ａ−Ｐ＜０．０５を満たす。

【図4】ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物やフラクションは、若いラットのＰＢＭを促進する。摘出された骨におけるＢＭＤをＤＥＸＡにより測定した。（Ａ）７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２及び５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｆ００６（９１４／Ｃ００２のフラクション）で治療した成長過程の雌ラットの大腿骨を、賦形剤で治療したコントロールラットと比較した。（Ｂ）コントロールラットの第４腰椎と７５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｃ００２で治療したラットを示す（＊＊＊−Ｐ ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【図5】ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、若いラットの骨幹細胞の成長を促進する。７５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｃ００２で治療した成長過程の雌ラットから得たＢＭＣ（骨髄細胞）を賦形剤で治療したコントロールラットのそれと比較した。（Ａ）アルカリ ホスファターゼ−アッセイ（骨芽細胞への分化）を示し、（Ｂ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真（骨髄細胞のミネラル化）を示し、及び（Ｃ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）を示す。

【図6】ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物はインビトロで頭蓋冠骨芽細胞への分化を促進する。頭蓋冠骨芽細胞を、１及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療し、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）生産物を定量した。＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。

【図7】ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物は、頭蓋冠骨芽細胞のミネラル化をインビトロで促進する。頭蓋冠骨芽細胞は、１及び１００ｎＭの濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療した。（Ａ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化を示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）コッサ法により染色された骨芽細胞の顕微鏡写真を示す。

【図8】Ｋ０５８は、頭蓋冠骨芽細胞の増殖を促進する。頭蓋冠骨芽細胞を１及び１００ｎＭ濃度のＫ０５８で治療し、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイが行われた。＊＊＊−＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。

【図9】ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物は、ＢＭＣｓ（骨髄細胞）のインビトロでのミネラル化を促進する。１及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００でＢＭＣを治療し、ミネラル化が行われた。（Ａ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化を示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【図10】Ｋ０６８及びＫ１００は、ネズミの前脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞への分化を抑制する。（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞を１μＭ、１００ｎＭ及び１ｎＭ濃度のＫ０６８及びＫ１００で治療し、オイルレッド−Ｏ染色が行われた。染色が抽出され定量された。＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。（Ｂ）１００ｎＭ及び１ｎＭ濃度のＫ０６８及びＫ１００で３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を８日間（脂肪細胞分化の時間）治療した後の、脂肪細胞分化−特異的遺伝子の半定量的ＲＴ ＰＣＲを示す。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡローディングコントロールとして使用した。同じような結果を示す３種の個別実験の典型的なゲルの像を示す。

【図11】Ｋ０５８は、さまざまな骨芽細胞特異的遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させる。１００ｎＭ濃度のＫ０５８で頭蓋冠骨芽細胞をさまざまな時点で治療した後の、さまざまな骨芽細胞ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ ＰＣＲを示す。ＧＡＰＤＨが内的ローディングコントロールとして使用された。同じような結果を示す３種の個別実験の典型的なゲルの像を示す。

【図12】Ｋ０５８及びＫ０１２はインビトロでエストロゲン性や抗エストロゲン性を有しない。１７β−エストラジオールで治療したIshikawa細胞はＡＬＰ生成を刺激する。（Ａ）コントロールに比べて１０^−８Ｍ １７β−エストラジオールで治療することにより、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の著しい増加が見られた。さまざまな濃度のＫ０５８、Ｋ０１２及びラロキシフェンは反応を示さなかった。（Ｂ）１０^−８Ｍ１７β−エストラジオールの存在下でＫ０１２、Ｋ０５８及びラロキシフェンの様々な濃度下でのＡＬＰレベルを示す。

【図13】Ｋ０５８はラットにおけるＯｖｘ−誘発骨量低下を減少させる。摘出された骨におけるＢＭＤがＤＥＸＡによって測定された。１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で９０日間治療したＯｖｘラットを、Ｏｖｘラット、賦形剤で治療した擬似手術のコントロールラットと比較した。（Ａ）大腿骨全体、（Ｂ）大腿骨頸、（Ｃ）大腿骨骨幹軸、（Ｄ）第４腰椎、（Ｅ）脛骨（擬似手術のＢＭＤと比較する場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、ＯｖｘコントロールのＢＭＤと比較する場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【図14】Ｋ０５８は、ラットの子宮レベルではエストロゲン性を示さない。擬似手術のコントロールラット、Ｏｖｘラットと比較して、体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で９０日間治療したラットの子宮重量を示す。擬似手術のコントロールラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、Ｏｖｘラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ａ−Ｐ＜０．０５を満たす。

【図15】Ｋ０５８は若いラットにおいてＰＢＭを促進する。摘出された骨においてＢＭＤをＤＥＸＡにより測定した。５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で治療した成長過程の雌ラットを、賦形剤で治療したコントロールラットと比較した。大腿骨骨幹軸におけるＢＭＤを示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【図16】Ｋ０５８は、若いラットにおける骨幹細胞の成長を促進する。５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で３０日間治療した成長過程の雌ラットから得たＢＭＣを、賦形剤で治療したコントロールラットと比較した。（Ａ）アルカリホスファターゼ−アッセイを示し、（Ｂ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真を示し、及び（Ｃ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）を示す。

【図17】Ｋ０１２はラットにおけるＯｖｘ−誘発骨量低下を減少させる。摘出された骨におけるＢＭＤをＤＥＸＡによって測定した。１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０１２で９０日間治療したＯｖｘラットを、Ｏｖｘラット、賦形剤で治療した擬似手術のコントロールラットと比較した。（Ａ）大腿骨頸、（Ｂ）脛骨全体、（Ｃ）頭側の脛骨、（Ｄ）脛腓骨の分離点、（Ｅ）腰椎全体、及び（Ｆ）第２腰椎をそれぞれ示す（擬似手術のＢＭＤと比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、ＯｖｘコントロールのＢＭＤと比較した場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【図18】Ｋ０１２は、ラットの子宮レベルではエストロゲン性を示さない。擬似手術のコントロールラットとＯｖｘラットの子宮重量と比較して、体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０１２で９０日間治療したラットの子宮重量を示す（擬似手術のコントロールラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、Ｏｖｘラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ａ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【0020】

[発明の詳細な説明]
従って、本発明は一般式１で表せるフラボノール化合物を提供し、ここでＲ１及びＲ２はＨ、ＯＨからなるグループより選択される。

本発明の一実施形態によると、一般式１で表せる化合物がウルムスワリチアーナから分離される。
本発明の他の実施形態によると、前記化合物は骨疾患の治療に有用である。

【0021】

従って、本発明は骨疾患の管理治療に有用な、ウルムスワリチアーナから得た生物活性抽出物／フラクションを提供することであって、前記抽出物／フラクションは一般式２で表されるマーカー化合物を含むことを特徴とする。

【0022】

（一般式２）

【0023】

ここで、マーカー化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００はそれぞれ６．７−１２％、１．７−４．５％、０．６−１．２％、１．７-４．５％の範囲である。

【0024】

本発明の一実施形態によると、前記抽出物は、マーカー化合物Ｋ０１２（６．７−９％）、Ｋ０５８（３．３−４．５％）、Ｋ０６８（０．６−０．７％）、Ｋ１００（１．７−２．６％）を含むウルムスワリチアーナのアルコール抽出物より得る。

【0025】

本発明の他の実施形態によると、アセトン可溶フラクションは、マーカー化合物Ｋ０１２（７．９−１２％）、Ｋ０５８（１．７−３．０％）、Ｋ０６８（０．７−１．２％）及びＫ１００（２．５−４．５％）を含むアルコール抽出物から得る。

【0026】

本発明の更に他の実施形態によると、アルコールフラクション／アセトン可溶フラクションは、エストロゲン欠乏下で骨温存作用を有する。

【0027】

本発明の更に他の実施形態によると、アルコールフラクションは、骨髄の骨幹細胞を増加することによってＰＢＭの達成度を増大する。

【0028】

本発明の更に他の実施形態によると、生物活性抽出物／フラクションは、ウルムスワリチアーナの幹の皮や枝から選択された植物から得てもよい。

【0029】

ウルムスワリチアーナから得た生物活性抽出物／フラクション又は一般式１で表されるそのマーカー化合物は、個別に又は組み合わせて、骨疾患の管理、予防、又は治療に使用される。

【0030】

アルコール抽出物の有効投与量は５００−７５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、アセトン可溶フラクションの有効投与量は２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。
（一般式２）

【0031】

一般式２で表される薬理学的に好ましい塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、シュウ酸塩、フマル酸エステル塩、コハク酸エステル塩、及び酒石酸塩からなる。

【0032】

一般式２で表される化合物、Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００は、０．１ｎＭ〜１．０μＭの間の濃度で治療した頭蓋冠骨芽細胞におけるコントロール（賦形剤）（図６）と比べて７０〜１００％のＡＬＰを増加させることが分かった。

【0033】

一般式２で表わされる化合物は、コントロール（賦形剤）と比べて、Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、及びＫ１００で治療した骨芽細胞において新生カルシウムの沈殿が１０〜２５％増加することが分かった（図７Ａ及び図７Ｂ）。

【0034】

一般式１で表される化合物は、骨格の成長又は骨量維持のための造骨に必要なＢＭＣｓのミネラル化を促進する。

【0035】

一般式１で表される化合物は０．２５−１．０（Ｋ０６８）：１．０−５．０（Ｋ１００）：２．５−７．５（Ｋ０５８）：５．０−１２．５（Ｋ０１２）の範囲内の率で組み合わせて使用される。

【0036】

一般式２で表される化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８は、骨芽細胞の増殖、分化、及びミネラル化を促進した。

【0037】

一般式２で表される化合物Ｋ０６８、及びＫ１００は、骨芽細胞の分化、ミネラル化を促進し、３Ｔ３ Ｌ１細胞株において脂質活性を抑制する。

【0038】

一般式１で表される化合物Ｋ０５８は、骨芽細胞の機能を促進し破骨細胞の機能を抑制するさまざまな遺伝子の合成を上方調整して造骨作用を発揮する。

【0039】

一般式１で表される化合物Ｋ０５８は、１０ｎＭ〜１．０μＭの範囲の濃度下で行う２５〜７５％の頭蓋冠骨芽細胞のセミコンフルエント培養でＢｒｄＵの取り込み（細胞増殖）を刺激する（図８）。

【0040】

一般式１で表される化合物Ｋ０５８は、骨芽細胞の機能を促進し破骨細胞の機能を抑制するさまざまな遺伝子の合成を上方調整して造骨作用を発揮する。

【0041】

従って、本発明はウルムスワリチアーナから得た有効な量の生物活性抽出物／フラクション、又は一般式２で表されるそのマーカー化合物を個別に又は組み合わせた状態で、１種以上の薬理学的に好ましい任意の添加剤、キャリア、及び希釈剤と共に含む薬理学的成分を提供する。

【0042】

本発明の一実施形態によると上記成分は、一般式２で表されるＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００からなるグループから選択された化合物を個別に又は組み合わせた状態で、１種以上の薬理学的に好ましい任意の添加剤、キャリア、及び希釈剤と共に含む。

【0043】

本発明の他の実施形態によると、使用される希釈剤はでんぷん、乳糖、第二リン酸カルシウムから選択してもよい。

【0044】

本発明の一実施形態によると、薬理学的に好ましい潤滑剤の形態の添加剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステオロート、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、又はその他同様な性質を有する物質単独又はその組み合わせからなるグループから選択してもよい。

【0045】

本発明の更に他の実施形態によると、アルコール抽出物に対して体重当たり少なくとも５００−７５０ｍｇ／Ｋｇ、アセトン可溶フラクションに対して２５−１００ｍｇ／Ｋｇの上記成分の投与を行う。

【0046】

本発明の一実施形態によると、ウルムスワリチアーナからアルコール抽出物（Ｃ００２）が抽出され、このＣ００２は、エストロゲン欠乏下で骨温存作用を有し、子宮レベルでのエストロゲン拮抗作用を有さず、成長過程の雌ラットにおける骨髄の骨幹細胞を増加させることによってＰＢＭ達成度を上げることができる。

【0047】

薬理学的成分を必要とする被験者の骨疾患を治療する方法であって、前記薬理学的成分を被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。

【0048】

本発明の更に他の実施形態によると、前記薬理学的成分は、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹膜内投与、又は筋肉内投与で投与される。

【0049】

従って、本発明はウルムスワリチアーナから得た抽出物／フラクション及びその化合物の作製プロセスを提供し、当該プロセスは
（ａ）植物であるウルムスワリチアーナを得る工程と、
（ｂ）当該植物材料を粉化する工程と、
（ｃ）当該粉化した植物材料をプロトン性溶媒で室温下抽出する工程と、
（ｄ）当該抽出物をろ過する工程と、
（ｅ）減圧下で当該抽出物を濃縮する工程と、
（ｆ）抽出物をヘキサンで処理して粉状化して非極性組成物を除去する工程と、
（ｇ）真空下で残留物を乾燥して自由流動性粉状にすることにより望ましい抽出物を得る工程と、
（ｈ）上記工程（ｇ）で得た抽出物を水中に溶解する工程と、
（ｉ）ｎ−ブタノールを添加して水溶性抽出物を沈殿させる工程と、
（ｊ）白色沈殿物をろ過してＫ０５８を得る工程と、
（ｋ）メタノールとエチルアセテートの混合物で得られた化合物を結晶化する工程と、
（ｌ）当該化合物をろ過する工程と、
（ｍ）当該化合物を乾燥して、自由流動性白色粉状の形態でＫ０５８を得る工程と、 （ｎ）ろ液と粉末をアセトンで濃縮する工程と、
（ｏ）化合物Ｋ０１２、Ｋ０６８、Ｋ１００をアセトン可溶フラクションから従来のクロマトグラフ法により分離する工程と、
（ｐ）抽出物及びアセトン可溶フラクション中でＫ０５８、Ｋ０１２、Ｋ０６８、Ｋ１００を定量する工程
と、を含む。

【0050】

本発明の実施形態において、抽出用に使用されたアルコールはメタノール、エタノール、プロパノール、又はこれらの適切な組み合わせからなるグループより選択される。
本発明の他の実施形態において、粉砕に使用される溶媒は、アセトン、エチルメチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、エチルアセテート、メタノール、又はこれらの適切な組み合わせからなるグループより選択される。

【0051】

本発明は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症候群に関連したさまざまな医学的適応の症状の予防又は治療のため、自然源から純化合物を抽出、分別、及び分離するプロセスを提供する。

【0052】

ウルムスワリチアーナから抽出物を作製するプロセスは、アルコールで植物材料を抽出するステップと、脂肪族非極性組成物をヘキサンで処理して粉状化することにより除去するステップとを含む。

【0053】

このようにして得た抽出物は栄養製品、健康補助食品、又は医薬成分として有用であり、経口投与に適したいかなる投与形態に作製してもよい。

【0054】

ウルムスワリチアーナの抽出物から有効成分を分離するプロセスは、抽出物を水に溶解するステップと、その化合物をｎ−ブタノールで沈殿させるステップとを含む。もしくは、このプロセスで得た化合物を水溶ベースの溶液から抽出してもよい。このようにして得た有効成分は栄養製品、健康補助食品、又は医薬成分として有用であり、経口投与に適したいかなる投与形態に作製してもよい。

【0055】

ここでいう疾患や病気を予防又は治療する方法とは、そのような治療を必要とする個々のヒト又はその他の哺乳動物又は他のいかなる動物に対し、本発明に係る治療的に有効な量の１種以上の薬剤を投与するステップを含む。

【0056】

本発明の薬剤、又は医薬的に好ましい塩、又は一種以上のキャリア、賦形剤等を含む医薬的に好ましいその組成物の投薬計画や投与形態は、ここに記載される疾患や病気の状態によって様々であり、関わった開業医の診断次第である。

【0057】

本発明の薬剤、又は医薬的に好ましい塩、又は一種以上のキャリア、賦形剤等を含む医薬的に好ましいその組成物は、週に１回、又は週に２回、又は１日１回又は１日２回又は１日３回又は更に分割して、０．１ｍｇ〜５０００ｍｇの範囲、より好ましくは０．５〜１０００ｍｇの範囲、更に好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇの範囲の量で、効果的に投与される。

【0058】

上記投与は、例えば経口、全体、局部又は局所、静脈内、動脈内、筋肉注射、皮下、腹膜、経皮、口腔、経鼻、吸入、膣内、直腸、経皮、又は他のいかなる適切な手段の適切なルートで、従来の液状又は固形状の形態で投与され、医薬的に好ましいキャリア、賦形剤等を含む本発明の化合物又は医薬的に好ましい塩又はその医薬的に好ましい成分に関して、従来の送達、制御された送達、または狙いを定めた送達を達成した。

【0059】

本発明の薬剤又は医薬的に好ましい塩又は医薬的に好ましいその組成物の好ましい投与形態は経口である。経口組成物は一般的に本発明の薬剤又は医薬的に好ましいその組成物及び１種以上の医薬的に好ましい賦形剤などを含む。

【0060】

タブレット、ピル、カプセル、顆粒等の経口組成物は、以下の医薬的に好ましい賦形剤を含んでもよい。
１．ラクトース、マニトール、ソルビトール、微晶質のセルロース、サクロース、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウム、又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物かその適切な組み合わせ；
２．ガムトラガカント、アカシアガム、メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニル、ピロリドン、でんぷん、又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物単独かその適切な組み合わせ；
３．又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物単独かその適切な組み合わせ；
４．ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステオロート、タルク、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム等の潤滑剤、又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物単独かその適切な組み合わせ；
５．コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤、又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物単独かその適切な組み合わせ；
６．サクロース、サッカリン等の甘味料、又は他の同様な性質を有する他のいかなる含有物単独かその適切な組み合わせ；
７．ペパーミント、メチル・サリチル酸、オレンジフレーバー、バニラフレーバー等の香料添加剤、又は他の医薬的に好ましいフレーバー単独かその適切な組み合わせ；
８．セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン等の湿潤剤、又は他の医薬的に好ましいフレーバー単独かその適切な組み合わせ；
９．カオリン、ベントナイト粘土等の吸収剤、又は他の医薬的に好ましいフレーバー単独かその適切な組み合わせ、及び
１０．ワックス、パラフィン等の溶液遅延剤、又は他の医薬的に好ましいフレーバー単独かその適切な組み合わせ。

【0061】

従って本発明は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患、特に骨関連の疾患や症状に関連する治療及び管理に関する従来の問題点を克服しようとすることであり、更に青年期の骨格成長の際に起こる最大骨量の達成を促進することである。本発明に記載のウルムスワリチアーナから得た生薬エキスやアセトン可溶フラクション及び純化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００は、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療に有用であり、ヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に有用である。

【0062】

本発明の主な目的は、ウルムスワリチアーナから抽出される生薬エキスを医薬的に好ましい形態で提供して、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する適用可能性の増大を図ることである。

【0063】

本発明の他の目的は、ウルムスワリチアーナから抽出されるアセトン可溶性フラクションを医薬的に好ましい形態で提供して、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する適用可能性の増大を図ることである。

【0064】

本発明の更に他の目的は、ウルムスワリチアーナから抽出される単独の純化合物を医薬的に好ましい形態で提供して、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する適用可能性の増大を図ることである。

【0065】

本発明の更に他の目的は、ウルムスワリチアーナから抽出される２種または２種以上の純化合物の混合物を適切な割合で医薬的に好ましい形態で提供して、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する適用可能性の増大を図ることである。

【0066】

従って本発明は、ウルムスワリチアーナから抽出される生薬エキス又はアセトン可溶フラクション又は単独純化合物又は２種または２種以上の純化合物の混合物を適切な割合で医薬的に好ましい形態で提供して、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療の際の、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する適用可能性の増大を図ることである。

【0067】

本発明の一実施形態によると、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に有用な生薬エキスは、ウルムスワリチアーナという植物の幹の皮や枝から作製される。

【0068】

本発明の更に他の実施形態によると、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に有用なアセトン可溶フラクションは、ウルムスワリチアーナという植物の幹の皮や枝から作製される。

【0069】

本発明の更に他の実施形態によると、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療の際の、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に有用な単独純化合物は、ウルムスワリチアーナという植物の幹の皮や枝の生薬エキスやアセトン可溶フラクションから抽出される。

【0070】

本発明の更に他の実施形態によると、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療の際の、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に有用なウルムスワリチアーナの生薬エキス又はアセトン可溶フラクション中の単独純化合物の割合や絶対濃度は、ＨＰＬＣベースの定量方法を使用して抽出された。

【0071】

本発明の更に他の実施形態によると、ウルムスワリチアーナの生薬エキス又はアセトン可溶フラクション中の単独純化合物は、既知のプロトコールや手順を使用してインビトロ及びインビボで評価され、ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の管理、予防及び治療やヒト及び動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に対する有用性が確立され証明された。

【0072】

以下の実施例はあくまでも説明のために挙げられたものであって、本発明の技術的範囲を制限するものと解釈されてはならない。

【実施例】

【0073】

１．幹の皮から得た抽出物
ウルムスワリチアーナ（Plant code No.914,5kg）の粉状の幹の皮をエタノール（２０Ｌ）付着させたガラスのパーコレータに置き、室温下で約１６時間（一晩）静置した。そして浸透物を採取した。この抽出プロセスを４回繰り返した。複合抽出物をろ過し、４５℃で凝縮し、６６０ｇ（１３．２％、９１４−Ｃ００２）の抽出物重量が得られた。

【0074】

２．枝から得た抽出物
ウルムスワリチアーナ（Plant code No.4669,4kg）の粉状の枝をエタノール（１８Ｌ）付着させたガラスのパーコレータに置き、室温下で約１６時間（一晩）静置した。そして浸透物を採取した。この抽出プロセスを４回繰り返した。複合抽出物をろ過し、４５℃で凝縮し、３５０ｇ（８．７％、Ｃ００２）の抽出物重量が得られた。

【0075】

３．分別
エタノール抽出物（９１４−Ｃ００２、１００ｇ）をヘキサン（２００ｍｌ×５）で処理し粉状化した。それから、ヘキサン可溶フラクションを減圧下４０℃で凝縮して得られたヘキサンフラクションの重量は１０ｇ（１０％、Ｆ００３）であった。それから、ヘキサンで処理して粉状化後得られた残留物を水中（５００ｍｌ）に溶解し、ｎ−ブタノール（５００ｍｌ）を添加して沈殿させた。こうして得られた固形物をろ過し蒸留水で洗浄した。２．６ｇ（２．６％、Ｋ０５８）の純化合物が、メタノールとエチレンアセテートの混合液で結晶化することにより得られた。ろ過物は、回転式蒸発器を使用して４５℃で凝縮された。残留物はアセトン（２００ｍｌ×４）で粉状化された。複合アセトン可溶フラクションを減圧下で濃縮した。こうして得られたアセトン可溶フラクションの重量は６９．０ｇ（Ｆ００４）であり、得られたアセトン不溶性フラクションは１８．４ｇ、（Ｆ００５）であった。

【0076】

ウルムスワリチアーナからの抽出、分化、及び分離方法を示す概略図を図１に示す。
図１はウルムスワリチアーナからの、生薬エキス及び純フラクションの抽出、分化、及び分離を示すフローチャートである。

【0077】

４．ウルムスワリチアーナのアセトン可溶フラクション（Ｆ００４）からの分離
シリカゲル（２３０−４００、網目構造）に対して、溶離液としてＣＨＣｌ_３：（５％）ａｑＭｅＯＨ（９３：７）を使用し、ＣＨＣｌ_３とＭｅＯＨ（ＣＨＣｌ_３に対して５％水溶液）を使用したアセトン可溶フラクション（６９．０ｇ）のクロマトグラフィにより、Ｋ０６８（０．２００ｇ．（０．２％）を得ることができ、溶離液としてＣＨＣｌ_３：（５％）ａｑ ＭｅＯＨ（９０：１０）を使用しＫ１００（０．２０ｇ．、０．２０％）を得ることができ、溶離液としてＣＨＣｌ_３：（５％）ａｑ ＭｅＯＨ（８７：１３）を使用しＫ０１２（２．５ｇ．２．５％）を得ることができた。これら化合物は、詳細な分光学的研究により特徴付けられた。Ｋ０５８とＫ１００は新規な化合物でありＫ０６８とＫ０１２は公知の化合物である。

【0078】

【0079】

５．Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００の特性評価
Ｋ０５８：（２Ｓ，３Ｓ）−（＋）−３’，４’，５，７−terahydroxydihydroflavonol−６−Ｃ−β−Ｄ−glucopyranoside．
Ｙｉｅｌｄ：２．６ｇ．（２．６％）；ａｍｏｒｐｈｏｕｓ；ＵＶλ_ｍａｘＭｅＯＨ：２９０，３２７ｎｍ；［α］_Ｄ^２５＋１．３３^０（ｃ，０．０９８；ＭｅＯＨ）；）．
ＣＤ（ＭｅＯＨ）Δε_３０４+３６．２７ Δε_３３２−１２．２１．ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４６７［Ｍ＋１］^＋；Ｃ_２１Ｈ_２２Ｏ_１２；^１Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ_６，３００ＭＨｚ）δ：４．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，Ｈ−２），４．４９（１Ｈ， ｍ，Ｈ−３），５．９２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８，６．８７（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５’），６．７４（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２’，６’），４．８７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１''ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ＯＨ ｓｉｇｎａｌ），３．１４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２''，５''），３．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３''），３．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−４''），４．０１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６''ａ），４．４７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６''ｂ），１２．４８（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−５），９．１１（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−３），９．０５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−３’），４．８４（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ），４．６２（１Ｈ，ｂｒｓ，ＯＨ）．^１３Ｃ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ_６，７５ＭＨｚ）δ：８３．０（Ｃ−２），７１．６３（Ｃ−３），１９７．９（Ｃ−４），１６２．６（Ｃ−５），１０６．０（Ｃ−６），１６６．０（Ｃ−７），９４．８（Ｃ−８），１６１．３（Ｃ−９），１００．２（Ｃ−１０），１２８．０（Ｃ−１’），１１５．３（Ｃ−２’），１４５．８（Ｃ−３’），１４５．０（Ｃ−４’），１１５．３（Ｃ−５’），１１９．４（Ｃ−６’），７２．９（Ｃ−１''），７０．７（Ｃ−２''），７９．１（Ｃ−３''），７０．３（Ｃ−４''），８１．５（Ｃ−５''），６１．６（Ｃ−６''）．

【0080】

Ｋ０１２（６−Glucopyranosyl−３，３’，４’，５，７−pentahydroxyflavone）：Ｙｉｅｌｄ：２．５ｇ．（２．５％）；ａｍｏｒｐｈｏｕｓ；ＵＶλ_ｍａｘＭｅＯＨ：−−−−ｎｍ；［α］_Ｄ^２５＋９．７９^０（ｃ，０．０６１２；ＤＭＳＯ）；ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４６５［Ｍ＋１］^＋；Ｃ_２１Ｈ_２０Ｏ_１２；^１Ｈ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ_６，３００ＭＨｚ）δ ６．４８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，Ｈ−２’），６．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−５’），７．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５，２．１Ｈｚ，Ｈ−６’），４．５９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−１''），and other suger protons are at ４．０５−３．２０（５Ｈ，ｍ，Ｈ−２''−６''），１３．０６（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−１２），９．３５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ−３）．^１３Ｃ ＮＭＲ：（ＤＭＳＯ−ｄ_６，７５ＭＨｚ）δ：１４４．２（Ｃ−２），１３４．７（Ｃ−３），１７５．２（Ｃ−４），１５９．０（Ｃ−５），１０７．２（Ｃ−６），１６２．２（Ｃ−７），９２．２（Ｃ−８），１５４．２（Ｃ−９），１０１．８（Ｃ−１０），１２１．０（Ｃ−１’），１１４．７（Ｃ−２’），１４５．７（Ｃ−３’），１４６．８（Ｃ−４’），１１４．１（Ｃ−５’），１１９．２（Ｃ−６’），７２．２（Ｃ−１''），６９．７（Ｃ−２''），７８．１（Ｃ−３''），６９．３（Ｃ−４''），８０．７（Ｃ−５''），６０．６（Ｃ−６''）．

【0081】

Ｋ０６８（６−Glucopyranosyl−４’，５，７−trihydroxyflavanone）：
Ｙｉｅｌｄ：０．２００ｇ．（０．２％）；ｍｐ：１９５−１９６°Ｃ；ＵＶλ_ｍａｘＭｅＯＨ：２９２，３２８ｎｍ；［α］_Ｄ^２５＋２９．３２^０（ｃ，０．１３３；ＭｅＯＨ）；ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ４３５［Ｍ＋１］^＋；Ｃ_２１Ｈ_２２Ｏ_１０；^１Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤ_３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ：５．３５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，２．３Ｈｚ，Ｈ−２），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．３，１７．１Ｈｚ，Ｈ−３ａ），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．４，１７．１Ｈｚ，Ｈ−３ｂ），５．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），７．３２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−２’，６’），６．８２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４，Ｈ−３’，５’），４．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｈ−１''，），４．１１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−２''），３．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３''），３．３０（２Ｈ，ｍ，Ｈ−４''，５''），３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．２，１２．３Ｈｚ，Ｊ＝５．２，１２．３Ｈｚ，Ｈ−６''ｂ），３．７３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６''ａ）；^１３Ｃ ＮＭＲ：（ＣＤ_３ＯＤ，７５ＭＨｚ）δ：８２．９（Ｃ−２），４４．０（Ｃ−３），１９８．２（Ｃ−４），１６４．３（Ｃ−５），１０６．１（Ｃ−６），１６７．４（Ｃ−７），９６．５（Ｃ−８），１５９．１（Ｃ−９），１０３．４（Ｃ−１０），１３１．０（Ｃ−１’），１２９．１（Ｃ−２’），１１６．１（Ｃ−３’），１６４．６（Ｃ−４’），１１６．１（Ｃ−５’），１２９．１（Ｃ−６’）， ７５．３（Ｃ−１''），７２．７（Ｃ−２''），８０．２（Ｃ−３''），７１．９（Ｃ−４''），８０．０（Ｃ−５''），６３（Ｃ−６''）．

【0082】

Ｋ１００：（２Ｓ，３Ｓ）−（＋）−４’，５，７−trihydroxydihydroflavonol−６−Ｃ−β−Ｄ−glucopyranoside．
Ｙｉｅｌｄ：０．２０ｇ．（０．２０％）；amrphous；ＵＶλ_ｍａｘ ＭｅＯＨ：２９６，３３４ｎｍ；［α］_Ｄ^２５＋４８．６９^０（ｃ，０．１１５；ＭｅＯＨ）；ＣＤ（ＭｅＯＨ）Δε_２９９+２７．３５ Δε_３２８−１５．５６．ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ４５１［Ｍ＋１］^＋；Ｃ_２１Ｈ_２２Ｏ_１１；^１Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤ_３ＯＤ，３００ＭＨｚ）δ：４．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ−２），４．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ，Ｈ−３），５．９５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８），７．３４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−２’，６’），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｈ−３’，５’），４．８２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１''ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ＯＨ ｓｉｇｎａｌ），４．１３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，Ｈ−２''），３．８６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．１，１２．３Ｈｚ，Ｈ−６''ａ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．９，１２．３Ｈｚ，Ｈ−６''ｂ），３．４５−３．３５（３Ｈ，ｍ， Ｈ−３''，４''，５''），^１３Ｃ ＮＭＲ：（ＣＤ_３ＯＤ，７５ＭＨｚ），δ：８５．０（Ｃ−２），７２（Ｃ−３），１９８．９（Ｃ−４）， １６３．９（Ｃ−５），１０６．３（Ｃ−６），１６７．４（Ｃ−７），９６．４（Ｃ−８），１５９．２（Ｃ−９），１０１．８（Ｃ−１０），１２９．２（Ｃ−１’），１３０．４（Ｃ−２’），１１６．２（Ｃ−３’），１６４．１（Ｃ−４’），１１６．２（Ｃ−５’），１３０．４ （Ｃ−６’），７５．２（Ｃ−１''），７２．６（Ｃ−２''），８０．２（Ｃ−３''），７１．９（Ｃ−４''），８２．６（Ｃ−５''），６２．９（Ｃ−６''）．

【0083】

６．生薬エキス中及びアセテート可溶フラクション中のＫ０５８、Ｋ０１２、Ｋ０６８、Ｋ１００
ＨＰＬＣ−ＰＤＡベースの分析方法が、生薬エキスやアセトン可溶フラクション中のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００の絶対定量化を行うために使用された。メタノールを使用したコラムＣ−１８において分析が行われた：水系移動相として、一分間当たり０．５ｍｌの流量に水を設定した。クロマトグラムにおいて、マーカーＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００が１５±０．８、８．３±０．８、１４．３±０．８、１０±０．８分でそれぞれ個別に現れた。日内及び日間分析により、純マーカーＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００の精密度を０．９９以上の相関係数で０．５−１６μｇ／ｍｌの濃度範囲に実現した。生薬エキス及びアセトン可溶フラクションを上記方法を使用して分析し、生薬エキスとアセトン可溶フラクション中のこれら４種のマーカー化合物の絶対濃度が棒グラフにより表された。Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、Ｋ１００は生薬エキス中ではそれぞれ６．７−９％、３．３−４．５％、０．６−０．７％及び１．７−２．６％の濃度範囲に現れ、アセトン可溶フラクション中では７．９−１２％、１．７−３．０％、０．７−１．２％及び２．５−４．５％の濃度範囲にそれぞれ現れることが分かった。

【0084】

７．生物学的評価
ヒト及び動物に起こるエストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患の予防又は治療において、エストロゲン依存性又は独立型の病気又は症状又は疾患に対して使用するため、更に哺乳動物の健康的な骨格成長の際の最大骨量（ＰＢＭ）の達成に使用するため本発明の植物抽出物及び純化合物を評価した。次に、本発明に係る幹の皮のエタノール抽出物や分離された化合物の評価のための詳細な手順を説明する。しかしながら、以下の実施例に記載する実験活動は本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。

【0085】

７．１ 造骨活動を決定するテスト手順
本発明のテスト抽出物のテスト溶液を１０ｍＭの備蓄ジメチルスルホキシド中に作製し、１ｎＭ及び１００ｎＭの濃度の培地で希釈し、造骨活動をインビトロで評価した。対照実験において、テスト物質の代わりに同濃度のＤＭＳＯを使用した。

【0086】

７．２ 骨芽細胞培養
骨芽細胞は間葉性幹細胞より生じる。前骨芽細胞の豊富なソースの１つとしてラットの新生児の頭蓋冠細胞が挙げられる。骨芽細胞は骨髄にも存在する。培養の過程で、前骨芽細胞はその特徴的な３段階を経て、段階ごとに特異遺伝子の発現をする。これら段階は以下の通りである。
・増殖及び分化：１〜１２日
遺伝子−アルカリホスファターゼ、コラーゲン−Ｉ、オステオカルシン等。
・細胞外マトリックスの成熟：１２〜１８日
遺伝子−オステオカルシン、オステオポンチン、フィブロネクチン
・ミネラル化：１４〜３５日
特徴−石灰化（根粒の形成）
エタノール抽出物は、０．００２５％の希釈でも培地中に沈殿することがわかっているにもかかわらず、インビトロの研究では含まれていなかった。というのは、おそらく豊富な非極性群の存在によるものと考えられる。従って、骨芽細胞や前脂肪細胞に関する純化合物をテストしてみた。

【0087】

７．３ 卵巣切除したＳＤラットにおけるウルムスワリチアーナの生薬エキス（Ｃ００２）による治療
体重当たり５００−７５０ｍｇ／ｋｇの投与量でＣ００２のエタノール抽出物を、左右卵巣切除後（Ｏｖｘ）のＳＤラット（１８０−２００ｇ）に経口で毎日与えた。これが、閉経後の骨量低下のヒトの状態を模倣した骨減少（骨量低下）に関する動物モデルとして最も広く使用されるものである。抽出物はアカシアガム（賦形剤）として与えた。擬似手術のラットと卵巣摘出手術後の（Ｏｖｘ）ラットがコントロールとして使用され、アカシアガムのみが与えられた。１０匹のラットからなるグループのそれぞれは次の通りであった：処女膜のある擬似手術群、Ｏｖｘ、Ｏｖｘ＋５００ｍｇ／ｋｇの抽出物及びＯｖｘ＋７５０ｍｇ／ｋｇの抽出物。治療は手術後２４時間してからスタートし、９０日間続けた。９０日後ラットが順応したところで、代謝ケージに移し、２４時間えさを与えず水のみで尿サンプルを採取した。２４時間後、ラットをケージに戻し不断給餌でえさを与え、更に２４時間以前と同じように抽出物の経口投与を開始した。その後ラットを安楽死させ解剖し採血し、骨（脛骨、大腿骨、ＬＬ１−Ｌ４腰椎）及び子宮を採取した。

【0088】

７．４ 骨密度の測定（ＢＭＤ）
大腿骨（全体、頭部、首）、脛骨（全体、頭部、脛踵腓骨分離点）及び腰椎（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４）の骨密度がＤＥＸＡにより求められた。

【0089】

７．５ 成長過程のＳＤラットにおけるＣ００２及びＦ００４（Ｃ００２のフラクション）による治療
生後２１日のＳＤラットの雌を１グループ１０匹ずつの３グループに分ける；コントロール（賦形剤治療を受けるもの）、７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２生薬エキス、及び５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｆ００４。賦形剤治療はアカシアガムで３０日間経口投与により与えられた。３０日の投与完了後、ラットを安楽死させ、３本の骨（大腿骨脛骨、Ｌ１−Ｌ４腰椎）が採取された。

【0090】

７．６ 骨密度の測定（ＢＭＤ）
大腿骨（全体、頭部、首）、脛骨（全体、頭部、脛踵腓骨分離点）及び腰椎（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４）の骨密度がＤＥＸＡにより求められた。

【0091】

７．７ ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）定量化のための骨髄の体外培養とＣ００２治療を受けた若いラットの体内ミネラル化
コントロールラット及びＣ００２治療を受けたラットの右の大腿骨を、ラットの部検によりＰＢＳ中に無菌で採取した。軟組織を取り除き、大腿骨の両端を滅菌鋏で切り抜き、針でそれぞれの骨の膝のジョイントエンドに穴を形成し、１０％のウシ胎仔血清髄液、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストプレトマイシン（Sigma, Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を補充したα−ＭＥＭからなるコントロール賦形剤（ＣＭ）で骨幹から骨髄を洗い流した。細胞をこの賦形剤中に懸濁し、この懸濁液を８００ｒｐｍで５分間沈降させた。細胞を新鮮なＣＭで再懸濁し、血球計算器を使用して細胞数をカウントした。１０００００及び２０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルを、１０ｍＭ−β−グリセロリン酸塩、５０μｇ／ｍｌＬ−アスコルビン酸及び１０^−８ Ｍデキサメタゾンを補充したＣＭ中３７℃、５％ＣＯ_２下、加湿雰囲気中、４８−ウェル及び１２−ウェルプレート上でそれぞれ培養した。この賦形剤は一日おきに置き換えた（John et al., 2002；Connolly, 1995；Gebhart and Lane, 1991；Gurpinar et al., 2003；Lan and Wang, 2003）。ＡＬＰ活性を求めるため細胞を９日間保持し、修飾された状態でAkiyama et al により修飾を加えたＡＬＰ活性を求めた。簡潔に言うと、細胞は一度ＰＢＳで洗い流され、その後ＡＬＰバッファ（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ、ｐＨ９．０）を添加し、３７℃で培養することによりＡＬＰ活性が測定され、マイクロプレート分光光度計を使用して吸収度（４０５ｎｍ）が測定された。統計的優位性が両側検定により求められた。

【0092】

インビトロミネラル化において、細胞を上記のように２１日間保持し、その後固化（ＰＢＳ中４％のＨＣＨＯで２０分間）した。それからサンプルをナノ純水で洗い流し、４０ｍＭのアリザリンレッドＳにより１０分間室温で染色した。サンプルは水で５回洗い流した。染色ウェルの顕微鏡写真を撮った。その後、１０％（ｗ／ｖ）の塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）を使用して、ｐＨ７．０、１０ｎＭのリン酸ナトリウム中、室温下１５分間、アリザリンレッドＳを抽出し、結果得られた溶液をマイクロプレート・リーダーで解読し、標準波長６２０ｎｍに対してテスト波長５４０ｎｍを得た。

【0093】

７．８ 原発性骨芽細胞の培養
上記のように多少の修飾を加えた新生児ラットの頭蓋冠細胞を用意した（Chattopadhyay et al., Endocrinology 145：3451-62, 2004）。簡潔に言うと、頭蓋冠骨芽細胞を培養するため、新生児ＳＤラット（生後１〜３日）から得た前頭骨や頭頂骨がα−ＭＥＭ中の０．１％のコラゲナーゼ／０．１％のディスパーゼで５連続消化された。２番目〜５番目の消化生成物が、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン、非本質アミノ酸溶液とピルビン酸溶液を補充したα−ＭＥＭ中、大気中５％ＣＯ_２下３７℃で、結合し密集した。

【0094】

７．９ ＢｒｄＵ細胞の増殖アッセイ
増殖細胞におけるＤＮＡ合成中のＢｒｄＵの取り込みに基づいて細胞増殖を測定するためにＢｒｄＵアッセイを使用した（Chattopadhyay et al., Endocrinology 145：3451-62, 2004）。頭蓋冠骨芽細胞を９６−ウェル プレート上（２０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）に接種した。細胞は２４時間付着され、その後α−ＭＥＭ賦形剤を含む０．５％ＦＣＳ中で枯渇させ、それから２４時間さまざまな濃度のＫ０５８による治療を施し、その後製造者（Roche Biochemicals, Rotkreuz, Switzerland）からはＢｒｄＵ ＥＬＩＳＡ法と呼ばれる方法により細胞の増殖を認めた。反応が終わる４時間前にＢｒｄＵ溶液を添加した。ＢｒｄＵ培養を４時間行い、細胞を固化し変性させ続いて抗−ＢｒｄＵ抗体で治療し、その反応基質により免疫複合体を検知した。吸収率は３７０ｎｍと測定された。

【0095】

７．１０ アルカリホスファターゼアッセイ
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイのため、骨芽細胞を通常の成長賦形剤における９６−ウェル（２０００ｃｅｌｌｓ／ウェル）プレート上に置いた。２４時間後、細胞がコンフルエント単層を形成した時、賦形剤を１０％ＦＢＳ、１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を補充したα−ＭＥＭ 賦形剤と置き換えた。１ｎＭ及び１００ｎＭ濃度のテスト化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００の濃度を異ならせて、治療を行った。誘導後４８時間経過すると、骨芽細胞のＡＬＰ活性が、Akiyama et al（Exp Cell Res 235：362-369, 1997）に記載されるように、多少の修正を加えた状態で求められた。簡潔に言うと、細胞は一度ＰＢＳで洗い流され、その後ＡＬＰバッファ（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ、ｐＨ９．０）を添加し、３７℃で培養することによりＡＬＰ活性が測定され、マイクロプレート分光光度計を使用して吸収度（４０５ｎｍ）が測定された。統計的優位性が両側検定により求められた。

【0096】

７．１１ 頭蓋冠骨芽細胞のインビトロでのミネラル化
骨再生のための材料の開発に関して、細胞がミネラル化したマトリックスを生成する能力は重要である。骨芽細胞の細胞外マトリックスのミネラル化は塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）の抽出と組み合わせたアリザリンレッドＳ細胞（ＡＲ−Ｓ）を使用して求められた（Stanford et al, J. Biol. Chem. 270：9420-9428；1995.）。アリザリンレッドは新生カルシウム塩と選択的に結合する染料であり、カルシウムミネラル組織化学に広く使用されている。１０ｍＭβ−グリセロリン酸塩、５０μｇ／ｍｌＬ−アスコルビン酸を補充した培地中、１ｎＭ及び１００ｎＭ濃度のテスト化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ０１００を使用し、１００００ｃｅｌｌｓ／ウェルを含む６個のウェルプレートに細胞を接種した。ＰＢＳで洗い流しその後、固化する（４％のＨＣＨＯで２０分間）。染色されたウェルの顕微鏡写真が撮られた。続いて、１０％（ｗ／ｖ）の塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）を使用して、ｐＨ７．０、１０ｎＭのリン酸ナトリウム中、室温下１５分間、アリザリンレッドＳを抽出し、結果得られた溶液をマイクロプレート・リーダーで解読し、標準波長６２０ｎｍに対してテスト波長５４０ｎｍを得た。
コッサ染色法により、ミネラル化根粒も見られた（A. M. Chou et al. Materials Science and Engineering C 20（2002）77-83.）。２１日間の培養後、組織培養ウェル中の細胞はＰＢＳで洗浄し５％（ｗ／ｖ）の硝酸銀溶液に４５分間湿潤した。そして蒸留水で洗い流した後、５％（ｗ／ｖ）の重炭酸ナトリウムホルマリン中、８分間固化させた。最後に、５％（ｗ／ｖ）のチオ硫酸塩溶液に５分間湿潤し、水で１５分間完全に洗浄して顕微鏡写真を撮った。

【0097】

７．１２ マウスの骨髄のインビトロでのミネラル化
大人のｂａｌｂ／ｃマウスが研究で使用された。文献（Maniatopoulos et al., Cell Tissue Res 1988；254：317-30.；Ishaug et al., J Biomed Mater Res 1997；36：17-28.）に記載されているように、マウスの大腿骨と脛骨から骨髄細胞（ＢＭＣ）が採取された。簡潔に言うと、エーテルで安楽死後、マウスの後足から骨を無菌で切除した。軟組織が取り除かれ、大腿骨の基部と脛骨の先端を滅菌鋏を使用して切り抜き、針でそれぞれの骨の膝のジョイントエンドに穴を形成し、１０％のウシ胎仔血清髄液、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストプレトマイシン（Sigma, Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を補充したα−ＭＥＭからなるコントロール賦形剤（ＣＭ）で骨幹から洗い流した。細胞をこの賦形剤中に懸濁し、全ての骨の細胞懸濁が一本の試験管内で化合された。この懸濁液を８００ｒｐｍで５分間沈降させた。血球計算器を使用して細胞数をカウントした。上澄みを吸引し、沈殿物を新鮮なＣＭ中で再懸濁し、その後１２ウェルプレートに接種した。２０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルを、１０ｍＭ−β−グリセロリン酸塩、５０μｇ／ｍｌ Ｌ−アスコルビン酸及び１０^−８Ｍデキサメタゾンを補充した同じ賦形剤中３７℃、５％ＣＯ_２下、加湿雰囲気中、１２−ウェルプレート上で培養した。この賦形剤は一日おきに置き換えた（John et al., Trends Biomater. Artif. Organs 2002；16（1）：28-33.；Connolly, Clin Orthop 1995；313：8-18.；Gebhart and Lane, Acta Orthop Belg 1991；57（2）：130-43.；Gurpinar et al., J Biomater Appl 2003；18（1）：25-33；Lan and Wang, Blood Substitutes, Biotechnol 2003；31（1）：59-68.）。１ｎＭ及び１００ｎＭの濃度でＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ０１００による治療が２１日間行われ、治療完了後、サンプルはＰＢＳで洗い流され、引き続き固化（４％のＨＣＨＯで２０分間）された。その後サンプルは超純水で洗い流され、４０ｍＭ ＡＲ−Ｓ、ｐＨ４．２下、室温で１０分間染色された。治療は２１日間行われ、治療完了後、サンプルはＰＢＳで洗い流され、引き続き固化（４％のＨＣＨＯで２０分間）された。染色されたウェルの顕微鏡写真を撮った。その後、１０％（ｗ／ｖ）の塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）を使用して、ｐＨ７．０、１０ｎＭのリン酸ナトリウム中、室温下１５分間、アリザリンレッドＳを抽出し、結果得られた溶液をマイクロプレート・リーダーで解読し、標準波長６２０ｎｍに対してテスト波長５４０ｎｍを得た。

【0098】

７．１３Ａ インビトロでの脂質生成
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を培養し密集させた。細胞の密集後２日を０日目と考える。０日目において、細胞を、誘発賦形剤［１μｇ／ｍｌのインシュリンを含む１０％の仔牛の血清／ＤＭＥＭ、及び１μＭのデキサメタゾンと５００ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）]で治療した。誘発賦形剤での治療後２日後、細胞をインシュリン［１μｇ／ｍｌのインシュリンを含む１０％の仔牛の血清]で治療した。通常０日目から８日後、細胞は完全に分化する。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞から脂肪細胞への分化に関してテスト化合物の効果を実験するため、１μＭ、１００ｎＭ及び１ｎｍの濃度のテスト化合物Ｋ０６８ 及びＫ１００を、分化期間中（０日目からスタートして８日）濃度を変化させながら使用した。脂質生成を評価するため、分化した細胞を４％のパラホルムアルデヒドｗ／ｖ中２０分間固化し、固化したものをＰＢＳで洗浄し、６０％のイソプロパノール中１５分間Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した。その後、それをＰＢＳで３回洗浄し、オービタルシェーカで３０分間室温に保ちながら８０％のイソプロパノールで染料を抽出した。抽出した染料のＯＤが５２０ｎｍの濃度で取り出された。

【0099】

７．１３Ｂ 逆転写酵素ポリメラーゼの連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＰＰＡＲ−γ（ペルオキシソーム増殖剤−活性受容体）とアディポネクチンの発現を評価するためＲＴ−ＰＣＲを行った。この研究では、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨが内部制御に使用された。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞を異なる条件下、８日間１０^−６、１０^−７及び１０^−９Ｍ濃度のＫ０６８及びＫ１００の存在下で培養し、脂肪細胞を形成した。培養後、細胞ＲＮＡを抽出し、製造者の指示によるキット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲは表１に示すオリゴヌクレオチドを使用して行った。

【0100】

【表1】

【0101】

７．１４ 逆転写酵素ポリメラーゼの連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｃｏｌ１（コラーゲンタイプＩ）、Ｃｂｆａ−１（コア結合因子−１）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＭＰ２（骨形態形成タンパク質２）、ＯＰＧ（オステオプロテジェリン）、及びＯＣＮ（オステオカルシン）のｍＲＮＡレベルを査定するためＲＴ−ＰＣＲを行った。この研究では、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−フォスフェイト デヒドロゲナーゼ）が内部制御に使用された。ＲＮＡが０、４、８、１２、２４、４８時間時点で抽出された。全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用して抽出した。単一段階ＲＴ ＰＣＲキット（Ｑａｉｇｅｎ製）を使用して、製造者の指示の下ＲＴ−ＰＣＲを行った。以下に示す一対の遺伝子特異的プライマーを使用した（表２）。

【0102】

【表2】

【0103】

７．１５ インビトロでのエストロゲン性
エストロゲン又はエストロゲン様物質（Littlefield et al, Endocrinology. 1990 Dec；127(6)：2757-62.）に反応してIshikawa細胞中にアルカリホスファターゼの発現が誘発された。Ishikawa細胞は、平底マイクロタイタープレートの９６−ウェルに、５０００ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で載置され、１０％のチャコールで処理されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むフェノールレッドの染色がないＤＭＥＭ中で培養された。２４時間の焼付け後、細胞の血清を１２時間かけて欠乏させた。その後、化合物のエストロゲン性をテストするため、細胞を、異なる濃度（１０^−６から１０^−１１Ｍ）の純化合物Ｋ０５８及びＫ０１２で治療した。同濃度のラロキシフェンも比較のために使用された。１０^−８Ｍのエストロゲン濃度が陽性対照として使用された。化合物による治療が、ＣＯ_２培養器内で３７℃に設定し、７２時間行われた。実験は、４回繰り返された。抗エストロゲン性の研究のため、１０^−６から１０^−１１Ｍ濃度の化合物Ｋ０１２及びＫ０５８に１０^−８Ｍのエストロゲンが添加された。７２時間の培養後、賦形剤が取り除かれ、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、軽く叩打して乾燥させた。プレートを−７０℃で１５分間静置し、引き続き室温に上げることにより細胞を凍結破断させた。その後プレートを氷上に置き、５０μｌの冷たいジエタノールアミン溶液（５ｍＭ Ｐ−ニトロフェニル フォスフェイト（ＰＮＰ）及び１Ｍのジエタノールアミン中の０．２５ｍＭ濃度のＭｇＣｌ_２）を各ウェルに添加した。発色（黄色）現象はＡＬＰ活性の機能であるため、プレートを３７℃で３０分間静置した。吸収度は４０５ｎｍと測定された。

【0104】

７．１６ 卵巣切除したＳＤラットのＫ０５８による治療
左右の卵巣切除後（Ｏｖｘ）、体重当たり１〜１０ｍｇ／ｋｇ濃度のＫ０５８をＳＤラット（１８０−２００ｇ）に経口で毎日与えた。これは、人間の更年期後の骨量減少の状態を想定した骨減少症の動物モデルとして最も広く使用されている方法である。抽出物は、アカシアガム（賦形剤）中に提供された。擬似手術ラットとＯｖｘラットがコントロールとして使用され、アカシアガムのみが与えられた。１０匹のラットからなるそれぞれのグループ及び全グループは次の通りである：処女膜のある擬似手術群、Ｏｖｘ、Ｏｖｘ＋１ｍｇ／ｋｇのＫ０５８及びＯｖｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８。治療は手術後２４時間してからスタートし、９０日間続けた。９０日後ラットが順応したところで、代謝ケージに移し、２４時間えさを与えず水のみで尿サンプルを採取した。２４時間後、ラットをケージに戻し不断給餌でえさを与え、更に２４時間以前と同じように抽出物の経口投与を開始した。その後ラットを安楽死させ解剖し採血し、骨（脛骨、大腿骨、腰椎）及び子宮を採取した。

【0105】

７．１７ 骨密度の測定（ＢＭＤ）
大腿骨（全体、頭部、首）、脛骨（全体、頭部、脛踵腓骨分離点）及び腰椎（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４）の骨密度がＤＥＸＡにより求められた。

【0106】

７．１８ 若いＳＤラットに対するＫ０５８による治療
離乳した雌のＳＤラット（生後２１日）を、それぞれ１０匹からなる二つのグループに分けた。コントロールラットにはアカシアガム（賦形剤）で治療しその他のグループは体重当たり５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で治療した。すべてのコントロールラット及び治療済みラットに対してＫ０５８又は賦形剤をアカシアガム中、毎日経口で３０日間与えた。３０日の投与完了後、ラットを安楽死させ、３本の骨（大腿骨脛骨、Ｌ１−Ｌ４腰椎）が採取された。
ａ）骨密度の測定（ＢＭＤ）
大腿骨（全体、頭部、首）、脛骨（全体、頭部、脛踵腓骨分離点）及び腰椎（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４）の骨密度がＤＥＸＡにより求められた。
ｂ）ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）定量化のための骨髄の体外培養とＫ０５８治療を受けた若いラットの体内ミネラル化
コントロールラット及びＫ０５８治療を受けたラットの右の大腿骨を、ラットの部検によりＰＢＳ中に無菌で採取した。軟組織を取り除き、大腿骨の両端を滅菌鋏で切り抜き、針でそれぞれの骨の膝のジョイントエンドに穴を形成し、１０％のウシ胎仔血清髄液、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストプレトマイシン（Sigma, Chemical Co., St. Louis, MO, USA）を補充したα−ＭＥＭからなるコントロール賦形剤（ＣＭ）で骨幹から骨髄を洗い流した。細胞をこの賦形剤中に懸濁し、この懸濁液を８００ｒｐｍで５分間沈降させた。細胞は新鮮なＣＭで再懸濁し、血球計算器を使用して細胞数をカウントした。１０００００及び２０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルを、１０ｍＭ−β−グリセロリン酸塩、５０μｇ／ｍｌ Ｌ−アスコルビン酸及び１０^−８Ｍデキサメタゾンを補充したＣＭ中３７℃、５％ＣＯ_２下、加湿雰囲気中、４８−ウェル及び１２−ウェルプレート上でそれぞれ培養した。この賦形剤は一日おきに置き換えた。（John et al., 2002；Connolly, 1995；Gebhart 及び Lane, 1991；Gurpinar et al., 2003；Lan 及び Wang, 2003）。ＡＬＰ活性を求めるため細胞を９日間保持し、上記のように修飾を加えてAkiyama et al によりＡＬＰ活性が求められた。簡潔に言うと、細胞は一度ＰＢＳで洗い流され、その後ＡＬＰバッファ（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ、ｐＨ９．０）を添加し、３７℃で培養することによりＡＬＰ活性が測定され、マイクロプレート分光光度計を使用して吸収度（４０５ｎｍ）が測定された。統計的優位性が両側検定により求められた。

【0107】

７．１９ 卵巣摘出されたＳＤラットに対するＫ０１２による治療
左右の卵巣切除後（Ｏｖｘ）、体重当たり１〜５ｍｇ／ｋｇ濃度のＫ０１２をＳＤラット（１８０−２００ｇ）に経口で毎日与えた。抽出物は、アカシアガム（賦形剤）中に提供された。擬似手術ラットとＯｖｘラットがコントロールとして使用され、アカシアガムのみが与えられた。１０匹のラットからなるそれぞれのグループ及び全グループは次の通りである：処女膜のある擬似手術群、Ｏｖｘ、Ｏｖｘ＋１ｍｇ／ｋｇのＫ０１２及びＯｖｘ＋５ｍｇ／ｋｇのＫ０１２。治療は手術後２４時間してからスタートし、９０日間続けた。９０日後ラットが順応したところで、代謝ケージに移し、２４時間えさを与えず水のみで尿サンプルを採取した。２４時間後、ラットをケージに戻し不断給餌でえさを与え、更に２４時間以前と同じように抽出物の経口投与を開始した。その後ラットを安楽死させ解剖し採血し、骨（脛骨、大腿骨、Ｌ１−Ｌ４腰椎）及び子宮を採取した。

【0108】

７．２０ 骨密度の測定（ＢＭＤ）
大腿骨（全体、頭部、首）、脛骨（全体、頭部、脛踵腓骨分離点）及び腰椎（ＬＶ１、ＬＶ２、ＬＶ３、ＬＶ４）の骨密度がＤＥＸＡにより求められた。

【0109】

８．Ｃ００２によるＯｖｘ−誘発骨量低下の予防
ウルムスワリチアーナ（体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇ）のエタノール抽出物（Ｃ００２）で９０日間治療したＯｖｘラットから摘出した骨のＢＭＤを、ＤＥＸＡにより測定した。得られたデータによると、７５０ｍｇ／ｋｇのエタノール抽出物で治療したＯｖｘラットは、賦形剤（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）で治療したＯｖｘグループと比べて、大腿骨（全体、首、骨幹部）におけるかなり高いＢＭＤを有していることが分かった。更に、７５０ｍｇ／ｋｇのエタノール抽出物で治療したＯｖｘラットは、賦形剤（図２Ｄ）で治療したＯｖｘグループと比べてＬＶ４腰椎（体重を支える腰椎）におけるかなり高いＢＭＤを有していることが分かった。そしてこの結果より、Ｃ００２は、エストロゲン欠乏下で骨温存作用を有することが分かった。

【0110】

図２：ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、ラットのＯｖｘ−誘発骨量低下を減少させる。摘出した骨におけるＢＭＤをＤＥＸＡにより測定した。体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２で９０日間治療したＯｖｘラットを、賦形剤で治療したＯｖｘ及び擬似手術ラット（コントロール）と比較した。（Ａ）大腿骨全体、（Ｂ）大腿骨頸、（Ｃ）大腿骨骨幹軸、（Ｄ）第４腰椎をそれぞれ示す（擬似手術のラットのＢＭＤと比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、ＯｖｘコントロールのラットのＢＭＤと比較した場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【0111】

９．Ｃ００２のエストロゲンアゴニスト効果の評価
卵巣摘出手術は子宮重量の減少をもたらすと同時にエストロゲン様作用は子宮重量の増加をもたらす。ウルムスワリチアーナ（体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇ）のエタノール抽出物（Ｃ００２）で９０日間治療したＯｖｘラットは、賦形剤で治療したＯｖｘラットと同等の賦形剤で治療した擬似手術ラットの子宮重量と比べて著しく子宮重量が減少した（図３）。従って、Ｃ００２は子宮レベルではエストロゲンアゴニスト効果がないことがわかる。

【0112】

図３：ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、子宮レベルではエストロゲン性がない。子宮重量が体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのラットで、Ｃ００２で９０日間治療したラットを、擬似手術ラット及びＯｖｘラット（コントロール）と比較した。コントロール擬似手術ラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし；コントロールＯｖｘラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１；ｂ−Ｐ＜０．０１；ａ−Ｐ＜０．０５を満たした。

【0113】

１０．ＳＤラットにおけるＰＢＭの達成
ａ）生後２１日の雌のラット（離乳期）を選択してＰＢＭを達成させるためのＣ００２の効果を調べた。体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２による治療をして３０日後、コントロールラット（賦形剤治療）と比較してＣ００２によるラットの大腿骨骨幹においてＢＭＤ値の急激な上昇が見られた（図４Ａ）。体重当たり７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２による治療したラットの中で、若いラットの第４腰椎のＢＭＤ値も増加した（図４Ｂ）。よって、Ｃ００２は、成長過程にある雌のラットにおけるＰＢＭの達成も改善することが分かった。

【0114】

ｂ）生後２１日の雌のラット（離乳期）を選択してＰＢＭを達成させるためのＣ００２（Ｆ００４）のフラクション効果を調べた。体重当たり５０ｍｇ／ｋｇのＦ００４による治療をして３０日後、コントロールラット（賦形剤治療）と比較してＦ００４によるラットの大腿骨骨幹においてＢＭＤ値の急激な上昇が見られた（図４Ａ）。よって、Ｆ００４、Ｃ００２のフラクションは成長過程の雌ラットにおけるＰＢＭの達成を促進することが分かった。

【0115】

図４：エタノール抽出物及びウルムスワリチアーナのフラクションは、若いラットにおけるＰＢＭを促進する。摘出した骨におけるＢＭＤを ＤＥＸＡにより測定した。７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２及び５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｆ００４（フラクション）で治療した成長過程の雌のラットを、賦形剤治療したコントロールラットと比較した。（Ａ）大腿骨体及び（Ｂ）第４腰椎をそれぞれ示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【0116】

１１．Ｃ００２による骨幹細胞の刺激
上記のように、骨髄中の骨幹細胞の増加をＡＬＰ活性により査定し、成長過程のラットにおけるＣ００２治療後のＢＭＣのミネラル化を査定した。ＡＬＰ活性、つまり骨幹分化量は、コントロールラットと比較してＣ００２治療したラットから得たＢＭＣにおいて著しく増加していることが分かった（図５Ａ）。更に、Ｃ００２治療したラットから得たＢＭＣのミネラル化がコントロールラット（賦形剤治療）のそれより著しく増加していることが分かった（図５Ｂ及び５Ｃ）。よって、Ｃ００２は骨髄における骨幹細胞を増加させ、ＰＢＭの達成を改善することが分かった。

【0117】

図５：ウルムスワリチアーナのエタノール抽出物は、若いラットにおける骨幹細胞の成長を促進する。７５０ｍｇ／ｋｇのＣ００２及び５０ｍｇ／ｋｇの９１４／Ｆ００４で治療した成長過程の雌のラットを、賦形剤治療したコントロールラットと比較した。（Ａ）アルカリホスファターゼアッセイ（骨芽細胞への分化）を示し、（Ｂ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真（骨髄細胞のミネラル化）を示し、及び（Ｃ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）を示す。

【0118】

１２．Ｆ００４から分離した４種の純化合物による骨芽細胞分化を刺激
骨芽細胞の分化を刺激して、Ｆ００４から分離した４種の純化合物Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００の能力をテストした。これら４種の化合物のさまざまな濃度（０．１ｎＭ〜１．０μＭ）で治療した頭蓋冠骨芽細胞は、コントロールラット（賦形剤治療）のそれと比較して、７０〜１００％のＡＬＰ活性の増加を示した（図６）。４種の分離された純化合物すべてが骨芽細胞の分化を刺激して、骨芽細胞が造骨作用及び重要な骨同化作用を発揮することが分かった。

【0119】

図６：ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物は、インビトロで頭蓋冠骨芽細胞の分化を促進する。頭蓋冠骨芽細胞を１及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療し、ＡＬＰ生成を定量化した。＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。

【0120】

１３．Ｆ００４から分離した４種の純化合物によって頭蓋冠骨芽細胞のミネラル化を刺激 ラットの頭蓋冠骨芽細胞（骨髄膜）による細胞外マトリックスのインビトロでのミネラル化を、アリザリン染色、抽出及びコッサ法による染色によって分析した。４種の化合物（１ｎＭ〜１００μＭの濃度）すべてを使用することによりミネラル化が著しく増加した（図７）。アリザリン染色、つまり新生カルシウムの沈殿量が、コントロールラット（賦形剤治療）のそれと比べて、Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、及びＫ１００で治療した骨芽細胞において１０〜２５％増加していることが分かった（図７Ａ及び７Ｂ）。酸性下でリン酸塩と反応しカルシウムとは反応せずミネラル化した根粒を測定するコッサ法染色は、コントロールラット（賦形剤治療）のそれと比較して、Ｋ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療した骨芽細胞で増加することが分かった（図７Ｃ）。よって、４種すべての化合物は、重要な骨同化作用である、膜質（頭蓋冠）骨から得た骨芽細胞における石灰化及びミネラル化した骨根粒形成を促進することが分かった。

【0121】

図７：ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物は、頭蓋冠骨芽細胞のインビトロでのミネラル化を促進する。頭蓋冠骨芽細胞を１及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療した。（Ａ）アリザリンレッドＳで染色した骨芽細胞の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）抽出後アリザリンレッドＳの定量化を示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。（Ｃ）コッサ法による染色された骨芽細胞の顕微鏡写真を示す。

【0122】

１４．Ｋ０５８によって頭蓋冠骨芽細胞増殖を刺激
１０ｎＭ〜１．０μＭ濃度のＫ０５８により刺激された頭蓋冠骨芽細胞のセミコンフルエント培養中のＢｒｄＵの取り込み（細胞増殖量）は２５〜７５％であった（図８）。 よって、Ｋ０５８は、重要な骨同化作用である骨芽細胞に対する細胞分裂促進作用を発揮することが分かった。

【0123】

図８：Ｋ０５８は、頭蓋冠骨芽細胞の増殖を促進する。頭蓋冠骨芽細胞を、１０及び１００ｎＭ濃度のＫ０５８で治療し、ＢｒｄＵ細胞増殖アッセイを行った。＊＊＊−＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。

【0124】

１５．Ｆ００４から分離した４種の純化合物によってＢＭＣミネラル化を刺激
検討した結果、植物エストロゲンやゲニステインがＢＭＣの骨芽細胞系列への分化、又はその関与を促進することができることが分かった（Heim et al,Endocrinology.2004 Feb;145(2):848-59.）。骨格成長（モデリング）や骨量維持（リモデリング）は、骨髄を含む皮質及び骨梁内で起こる。アリザリンレッド染色法により査定された１ｎＭ及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８、及びＫ１００により刺激した骨髄骨芽細胞のミネラル化が観察された（図９Ａ及び９Ｂ）。よって、４種の化合物すべてが、骨格成長及び骨量維持における造骨作用に必要なＢＭＣのミネラル化を促進することが分かった。

【0125】

図９：ウルムスワリチアーナから得た４種の純化合物は、ＢＭＣのインビトロでのミネラル化を促進する。ＢＭＣを、１及び１００ｎＭ濃度のＫ０１２、Ｋ０５８、Ｋ０６８及びＫ１００で治療し、ミネラル化を行った。（Ａ）アリザリンレッドＳで染色された細胞の顕微鏡写真を示す。（Ｂ）抽出後のアリザリンレッドＳ染色の定量化を示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【0126】

１６Ａ．Ｋ０６８及びＫ１００によるインビトロでの３Ｔ３ Ｌ１細胞における脂質生成の抑制
更年期及び老化−誘発の骨量低下の広く認められた態様として、骨髄脂質生成において、骨髄中の間充織幹細胞の通常のプールにおける脂肪細胞形成が増加するにつれ、更年期及び老化−誘発の骨量低下も増加し、結果、骨芽細胞がほとんど形成されなくなることが挙げられる。従って、骨粗しょう症の主な治療アプローチとして、脂肪細胞の分化を抑制することが挙げられる。３Ｔ３−Ｌ１は、脂肪細胞の分化におけるＫ０６８及びＫ１００の効果を調べるために使用されたマウスの前脂肪細胞である。データによると、１μＭ、１００ｎＭ及び１ｎｍ濃度のＫ０６８とＫ１００が、脂肪細胞の分化を著しく抑制することが分かった（図１０Ａ）。よって、Ｋ０６８とＫ１００が抗脂質生成効果を有することが分かった。

【0127】

１６Ｂ．Ｋ０６８及びＫ１００による３Ｔ３−Ｌ１における脂質生成遺伝子のｍＲＮＡレベルの下方制御
３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１０^−７及び１０^−９Ｍ濃度のＫ０６８及びＫ１００で８日間（脂肪細胞形成にかかる時間）治療した。セミ−定量ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＰＰＡＲ−γのｍＲＮＡレベルが減少すると共にアディポネクチン濃度も減少することが分かった（図１０Ｂ）。よって、脂肪細胞の分化を促進するさまざまな遺伝子の発現を下方調整することによりＫ０６８及びＫ１００は抗アディポネクチン作用を発揮することが分かった。

【0128】

図１０：Ｋ０６８及びＫ１００は、マウスの前脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１の脂質生成分化を抑制する。（Ａ）３Ｔ３−Ｌ１細胞を、１μＭ、１００ｎＭ及び１ｎＭ濃度のＫ０６８及びＫ１００で治療し、オイルレッド−Ｏ染色を行った。そして染色が抽出され定量化された。＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５；Ｎ＝３。（Ｂ）１００ｎＭ〜１ｎＭ濃度のＫ０６８及びＫ１００で前脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を８日間（脂肪細胞の分化にかかる時間）治療した後、さまざまな脂肪細胞の分化−特異遺伝子に対してセミ−定量化ＲＴ ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨが、ＲＮＡローディングコントロールとして使用された。３回の個別実験の典型的なゲルの像は同じような結果を示す。

【0129】

【表3】

【0130】

１７．Ｋ０５８による骨芽細胞における造骨遺伝子のｍＲＮＡレベルの上方調整
頭蓋冠骨芽細胞を、１０^−７Ｍ濃度のＫ０５８で０〜４８時間治療した。半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、コラーゲンＩ（ＣＯＬ−１）、転写因子−１（Ｃｂｆａ−１）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、オステオカルシン（ＯＣＮ）、及び造骨タンパク質−２（ＢＭＰ−２）のｍＲＮＡレベルの増加が明らかになった（図１１）。最も強力な破骨細胞形成抑制因子サイトカインであるオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）は骨芽細胞から分泌される。１０^−７Ｍ濃度のＫ０５８により、頭蓋冠骨芽細胞におけるＯＰＧのｍＲＮＡレベルが増加した（図１１）。Ｋ０５８は、骨芽細胞の活動を促進するさまざまな遺伝子の合成を上方調整し破骨細胞の活動を抑制することによって、造骨作用を発揮することが分かった。

【0131】

図１１：Ｋ０５８により、さまざまな骨芽細胞の特異遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加する。さまざまな時点で、１００ｎＭ濃度のＫ０５８で頭蓋冠骨芽細胞を治療した後の半定量的ＲＴ ＰＣＲによるさまざまな骨芽細胞のｍＲＮＡレベルを示す。ＧＡＰＤＨを内部標準として使用した。同じような結果を示す個別の実験を３回行ってその典型的ゲル写真を示す。

【0132】

１８．Ｋ０１２及びＫ０５８のインビトロエストロゲン性又はエストロゲン性プロフィール
Ishikawa細胞は、高レベルのエストロゲン受容体を発現するヒトの子宮内膜癌細胞であり、ＡＬＰレベルを増加することによりエストロゲンに反応する。Ｋ０１２及びＫ０５８（１０^−１１〜１０^−６Ｍ）で治療したIshikawa細胞は、ＡＬＰレベルを増加させなかったが、１０^−８Ｍ １７β−エストラジオールは、コントロール細胞（賦形剤治療細胞）に対して２５倍以上もＡＬＰ活性を刺激した（図１２Ａ）。更に、１０^−１１〜１０^−６Ｍの範囲の濃度のＫ０１２及びＫ０５８は、１７β−エストラジオールによる刺激でＡＬＰ活性を増加させなかった（図１２Ｂ）。よって、Ｋ０１２及びＫ０５８は、エストロゲンアゴニスト活性又は抗エストロゲン活性を有しないことが分かった。

【0133】

図１２：Ｋ０５８及びＫ０１２は、インビトロでエストロゲン性及び抗エストロゲン性を有しない。１７β−エストラジオールで治療したIshikawa細胞はＡＬＰ生成を刺激する。（Ａ）コントロール細胞に比べて１０^−８Ｍ １７β−エストラジオール使用によって著しいＡＬＰの増加を示す。さまざまな濃度のＫ０５８、Ｋ０１２及びラロキシフェンは反応を示さなかった。（Ｂ）１０^−８Ｍ １７β−エストラジオール存在下での、Ｋ０１２、Ｋ０５８及びラロキシフェンのさまざまな濃度におけるＡＬＰレベルを示す。

【0134】

１９．Ｋ０５８はＯｖｘ−誘発の骨量低下を低減する
Ｋ０５８（体重当たり１．０−５．０ｍｇ／ｋｇ）で９０日間治療したＯｖｘラットの切除した骨のＢＭＤをＤＥＸＡにより測定した。データによると、１．０−５．０ｍｇ／ｋｇで治療したＯｖｘラットは、賦形剤で治療したＯｖｘグループと比較して大腿骨（全体、首、骨幹部）におけるＢＭＤがかなり高いことが分かる（図１３Ａ、Ｂ及びＣ）。体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇ投与のＫ０５８は、賦形剤治療をしたＯｖｘグループと比較して（図１３Ｅ）、体重を支える関節Ｌ４腰椎（図１３Ｄ）においてより高いＢＭＤを発現し、体重当たり５ｍｇ／ｋｇで脛骨のＢＭＤを増加した。この結果より、Ｋ０５８は骨温存作用を有することが分かった。

【0135】

図１３：Ｋ０５８は、ラットにおけるＯｖｘ−誘発の骨量低下を低減することを示す。摘出された骨において、ＢＭＤがＤＥＸＡにより測定された。１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で９０日間治療したＯｖｘラットを、賦形剤で治療した擬似手術ラット（コントロール）と比較した。（Ａ）大腿骨全体、（Ｂ）大腿骨頸、（Ｃ）大腿骨骨幹軸、（Ｄ）第４腰椎、（Ｅ）脛骨をそれぞれ示す（擬似手術のＢＭＤと比較する場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たす。ＯｖｘコントロールのＢＭＤと比較する場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【0136】

２０．Ｋ０５８のインビトロでのエストロゲンアゴニストプロフィール
卵巣摘出は子宮重量を減少させるが、エストロゲン様活性を有する作用因子が子宮重量を増加させる。体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で９０日間治療したＯｖｘラットは、賦形剤で治療したＯｖｘラットと同等の賦形剤で治療した擬似手術ラットの子宮重量と比べて著しく子宮重量が減少した（図１４）。従って、Ｋ０５８は子宮レベルではエストロゲンアゴニスト作用を有しないことが分かる。

【0137】

図１４：Ｋ０５８は、子宮レベルではラットにエストロゲン性を発揮しないことを示す。体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で９０日間治療したラットの子宮重量を、擬似手術ラット及びＯｖｘラット（コントロール）の子宮重量と比較した。擬似手術のコントロールラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、Ｏｖｘコントロールラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ａ−Ｐ＜０．０５を満たす。

【0138】

２１．Ｋ０５８による若いラットにおけるピーク骨量の達成
ＰＢＭ達成を図るため、生後２１日の雌のラット（離乳期）を選択し、Ｋ０５８の効果を検討した。体重当たり５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で治療して３０日後、コントロールラット（賦形剤治療）と比べて大腿骨の骨幹部においてＢＭＤ値がかなり増加していることが分かった（図１５）。よって、Ｋ０５８により成長過程の雌のラットにおけるＰＢＭ達成が改善されることが分かった。

【0139】

図１５：Ｋ０５８が若いラットにおけるＰＢＭ達成を促進することを示す。摘出された骨においてＢＭＤがＤＥＸＡによって測定された。５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で治療した成長過程の雌ラットを、賦形剤治療のコントロールラットと比較した。大腿骨骨幹部におけるＢＭＤを示す（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）。

【0140】

２２．Ｋ０５８によって骨幹細胞を刺激
骨髄の骨幹細胞の増加を、以上記載したように成長過程のラットに対してＫ０５８による治療（体重当たり５．０ｍｇ／ｋｇ）しその後のＡＬＰ活性とＢＭＣのミネラル化により査定した。コントロールラットに比べて（図１６Ａ）、Ｋ０５８治療（体重当たり５．０ｍｇ／ｋｇ）のラットから得たＢＭＣにおいて、ＡＬＰ活性と骨芽分化量が著しく増加していることが分かった。又、Ｋ０５８治療のラットから得たＢＭＣのミネラル化は、コントロールラット（賦形剤治療）より著しく増加していた（図１６Ｂ及び１６Ｃ）。よって、Ｋ０５８は、骨髄における骨幹細胞を増加させることによりＰＢＭ達成を改善することが分かった。

【0141】

図１６：Ｋ０５８が若いラットにおいて骨幹細胞の増殖を促進することを示す。５ｍｇ／ｋｇのＫ０５８で３０日間治療した成長過程の雌ラットから得たＢＭＣを、賦形剤治療のコントロールラットと比較した。（Ａ）アルカリホスファターゼ−アッセイを示し、（Ｂ）アリザリンレッドＳ細胞の顕微鏡写真を示し、及び（Ｃ）抽出後のアリザリンレッドＳの定量化（＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５）を示す。

【0142】

２３．Ｋ０１２はＯｖｘ−誘発の骨量低下を低減する
Ｋ０１２（体重当たり１．０−５．０ｍｇ／ｋｇ）で９０日間治療したＯｖｘラットから摘出した骨のＢＭＤをＤＥＸＡにより測定した。データによると、５．０ｍｇ／ｋｇで治療したＯｖｘラットは、賦形剤で治療したＯｖｘグループと比較して大腿骨（全体、首、頭、骨梁間隙（ＴＦＳＰ））におけるＢＭＤがかなり高いことが分かる（図１７Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）。体重当たり５．０ｍｇ／ｋｇ投与のＫ０１２は、賦形剤治療をしたＯｖｘグループと比較して、全体及び第２腰椎（図１７Ｅ及びＦ）においてより高いＢＭＤを発現した。賦形剤治療したＯｖｘグループと比較した場合、ＢＭＤの増加は、体重当たり１．０ｍｇ／ｋｇのＫ０１２で治療したラットのＴＦＳＰにも見られた（図１７Ｄ）。この結果より、Ｋ０１２はエストロゲン欠乏下で骨温存作用を有することが分かった。

【0143】

図１７：Ｋ０１２がラットのＯｖｘ−誘発の骨量低下を低減することを示す。摘出した骨においてＢＭＤをＤＥＸＡによって測定した。１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０１２で９０日間治療したＯｖｘラットを、賦形剤治療したＯｖｘコントロールラット及び擬似手術のコントロールラットと比較した。（Ａ）大腿骨頸、（Ｂ）脛骨全体、（Ｃ）脛骨頭、（Ｄ）腓骨の骨梁間隙、（Ｅ）腰椎全体（Ｆ）第２腰椎をそれぞれ示す（擬似手術のＢＭＤと比較した場合＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊− Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、ｏｖｘコントロールのＢＭＤと比較した場合、ａ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ｃ−Ｐ＜０．０５を満たす）。

【0144】

２４．Ｋ０１２のインビトロでのエストロゲンアゴニストプロフィール
卵巣摘出は子宮重量を減少させるが、エストロゲン様活性を有する作用因子が子宮重量を増加させる。Ｋ０１２（体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇ）で９０日間治療したＯｖｘラットは、賦形剤で治療したＯｖｘラットと同等の賦形剤で治療した擬似手術ラットの子宮重量と比べて著しく子宮重量が減少した（図１８）。従って、Ｋ０１２は子宮レベルではエストロゲンアゴニスト作用を有しないことが分かる。

【0145】

図１８：Ｋ０１２は、子宮レベルではラットにエストロゲン性を発揮しないことを示す。体重当たり１．０及び５．０ｍｇ／ｋｇのＫ０１２で９０日間治療したラットの子宮重量を、擬似手術ラット及びＯｖｘラット（コントロール）の子宮重量と比較した。擬似手術のコントロールラットの子宮重量と比較した場合、＊＊＊−Ｐ＜０．００１、＊＊−Ｐ＜０．０１、＊−Ｐ＜０．０５を満たし、Ｏｖｘコントロールラットの子宮重量と比較した場合、ｃ−Ｐ＜０．００１、ｂ−Ｐ＜０．０１、ａ−Ｐ＜０．０５を満たす。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】