特許 5693779 エンドプラスミンに対する抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5693779

(24)【登録日】2015年2月13日

(45)【発行日】2015年4月1日

(54)【発明の名称】エンドプラスミンに対する抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20150312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150312BHJP

   A61K 51/00 20060101ALI20150312BHJP

   A61K 31/7072 20060101ALI20150312BHJP

   A61K 31/58 20060101ALI20150312BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150312BHJP

   A61P 39/04 20060101ALI20150312BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20150312BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150312BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150312BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/30ZNA

   A61K39/395 T

   A61K39/395 L

   A61K43/00

   A61K31/7072

   A61K31/58

   A61P35/00

   A61P39/04

   G01N33/574 A

   !C12N15/00 A

   !C12P21/08

【請求項の数】34

【全頁数】88

(21)【出願番号】特願2014-220445(P2014-220445)

(22)【出願日】2014年10月29日

(62)【分割の表示】特願2013-515490(P2013-515490)の分割

【原出願日】2011年6月15日

(65)【公開番号】特開2015-38143(P2015-38143A)

(43)【公開日】2015年2月26日

【審査請求日】2014年10月29日

(31)【優先権主張番号】61/355,516

(32)【優先日】2010年6月16日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】506339556

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ソルダノ フェローン

(72)【発明者】

【氏名】シンフイ ワン

(72)【発明者】

【氏名】トーマス ピー． コンラッズ

(72)【発明者】

【氏名】エルヴィラ ファヴォイノ

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン フッド

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２３８５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／１１３０７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０８７２０５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／２８−１６／３０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ここで、該抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸２６〜３３（ＣＤＲ１）、配列番号１のアミノ酸５１〜５８（ＣＤＲ２）、配列番号１のアミノ酸９７〜１０３（ＣＤＲ３）を含み、該抗体の軽鎖可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸２７〜３２（ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸５０〜５２（ＣＤＲ２）および配列番号２のアミノ酸８９〜９７（ＣＤＲ３）を含み、
ここで、該抗体または抗原結合フラグメントがエンドプラスミンに特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

配列番号１を含む、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項3】

配列番号２を含む、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項4】

配列番号１および配列番号２を含む、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’_２フラグメント、単鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）である、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記抗原結合フラグメントがｓｃＦｖである、請求項５に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項7】

前記抗体がＩｇＧである、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記抗体または抗原結合フラグメントが標識されている、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記標識が、蛍光標識、酵素標識または放射性標識である、請求項８に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項10】

請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。

【請求項11】

エフェクター分子に連結された請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを含む、単離された免疫結合体。

【請求項12】

前記エフェクター分子が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）またはそのバリアントもしくはフラグメントである、請求項１１に記載の単離された免疫結合体。

【請求項13】

前記エフェクター分子が、サイトカイン、ケモカイン、化学療法因子または放射性ヌクレオチドである、請求項１１に記載の単離された免疫結合体。

【請求項14】

前記エフェクター分子が、サイトカインまたはケモカインである、請求項１３に記載の単離された免疫結合体。

【請求項15】

請求項１２に記載の単離された免疫結合体および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。

【請求項16】

エンドプラスミンを発現するがんを有すると診断された被験体を処置するための、請求項１に記載の抗体を含む、組成物。

【請求項17】

前記がんが、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、卵巣がん、膀胱がんまたは膵臓腺癌である、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記被験体への前記組成物の投与が、転移の数またはサイズを減少させる、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記組成物が、治療有効量の化学療法因子と組み合わせて投与されるものであることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項20】

前記化学療法因子が、５−フルオロウラシル、シクロパミン、放射線照射またはそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

被験体由来のサンプルへの請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を、被験体におけるがんの検出を補助するための、またはがんの診断を補助するための指標とする方法であって：
請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと該サンプルとを接触させる工程；および
該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出する工程
を包含し、ここで、コントロールサンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合と比べた、該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合の増加は、該被験体におけるがんの検出を補助するか、または該被験体におけるがんの診断を補助する、方法。

【請求項22】

被験体由来のサンプルへの請求項１０に記載の組成物中の前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を、被験体におけるがんの検出を補助するための、またはがんの診断を補助するための指標とする方法であって：
請求項１０に記載の組成物中の前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと該サンプルとを接触させる工程；および
該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出する工程
を包含し、ここで、コントロールサンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合と比べた、該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合の増加は、該被験体におけるがんの検出を補助するか、または該被験体におけるがんの診断を補助する、方法。

【請求項23】

被験体由来のサンプルへの請求項１１に記載の単離された免疫結合体の前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を、被験体におけるがんの検出を補助するための、またはがんの診断を補助するための指標とする方法であって：
請求項１１に記載の単離された免疫結合体の前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと該サンプルとを接触させる工程；および
該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出する工程
を包含し、ここで、コントロールサンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合と比べた、該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合の増加は、該被験体におけるがんの検出を補助するか、または該被験体におけるがんの診断を補助する、方法。

【請求項24】

前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、直接標識されている、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントに特異的に結合する二次抗体と前記サンプルとを接触させる工程、および
該二次抗体の結合を検出する工程
をさらに包含し、
ここで、コントロールサンプルへの該二次抗体の結合と比べた、該サンプルへの該二次抗体の結合の増加は、前記被験体におけるがんの検出を補助するか、または該被験体におけるがんの診断を補助する、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項26】

前記がんが、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんである、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項27】

前記コントロールサンプルが、がんを有しない被験体由来のサンプルである、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

前記がんが転移性である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の方法。

【請求項29】

生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する方法であって、
該生物学的サンプルを、請求項１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと接触させる工程；および
該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出する工程、
を包含し、ここで、コントロールサンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの結合と比べた、該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合の増加は、生物学的サンプルにおけるエンドプラスミンの存在を検出する、方法。

【請求項30】

前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが直接標識されている、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントに特異的に結合する二次抗体を、前記生物学的サンプルと接触させる工程をさらに包含し、
ここで、コントロールサンプルへの該二次抗体の結合と比べた二次抗体の結合の増加は、該生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記エンドプラスミンがグリコシル化される、請求項１〜９のいずれかに記載の単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項33】

前記エンドプラスミンがグリコシル化される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項34】

前記エンドプラスミンがグリコシル化される、請求項１１に記載の単離された免疫結合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、２０１０年６月１６日に出願された米国仮出願第６１／３５５，５１６号の利益を主張する。

【0002】

政府支援の陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈからの助成金番号ＣＡ１０５５００および助成金番号ＣＡ１３８１８８に従って米国政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明のある特定の権利を有する。

【0003】

分野
これは、抗体の分野、具体的には、エンドプラスミンに特異的に結合する完全ヒト抗体に関する。

【背景技術】

【0004】

背景
メラノーマは、メラノサイトまたはメラノサイト関連母斑細胞に由来する高悪性度でしばしば転移性の腫瘍である（非特許文献１）。メラノーマは、全皮膚がんのおよそ３パーセントを占め、メラノーマの世界的な増加は、女性の肺がんを除く他のいずれの新生物によっても越えられない（“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９１）（ｅｄｓ．）Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．，Ｌｅｃｈｔｉｍａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４２頁；非特許文献２）。メラノーマが、明らかに皮膚に局在化しているときであっても、患者の最大３０％が、全身転移を起こし、大部分が死亡する（非特許文献２）。メラノーマを処置する従来の様式としては、外科術、放射線照射および化学療法が挙げられる。過去１０年間で、メラノーマを処置するための有望な新規方法として免疫療法および他の分子方法が登場してきた。

【0005】

がんに対する免疫応答がヒトに存在するという有力な証拠は、メラノーマ沈着物内にリンパ球が存在することによって提供される。これらのリンパ球は、単離されると、自己のメラノーマ上および同種のメラノーマ上の特異的な腫瘍抗原を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性様式で認識することができる（非特許文献３；非特許文献４）；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。転移性メラノーマを有する患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、インビトロにおいて、メラノサイト−メラノーマ系列特異的組織抗原を含む共有抗原を認識する（非特許文献１１；非特許文献１２）。多くのメラノーマ患者が、これらの腫瘍に対して細胞性応答および体液性応答を開始するという事実、ならびにメラノーマが、ＭＨＣ抗原と腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方を発現するという事実は、さらなるメラノーマ抗原の同定および特徴づけが、メラノーマを有する患者の免疫療法にとって重要であり得ることを示唆している。しかしながら、なおもメラノーマおよび他のがんを処置するための新しい様式が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】“Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（１９９１）（ｅｄｓ．）Ａｂｂａｓ Ａ．Ｋ．，Ｌｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．，Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：３４０−３４１頁

【非特許文献2】Ｋｉｒｋｗｏｏｄ ａｎｄ Ａｇａｒｗａｌａ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ７：１−１６

【非特許文献3】Ｉｔｏｈら（１９８６），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：３０１１−３０１７

【非特許文献4】Ｍｕｕｌら（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：９８９−９９５

【非特許文献5】Ｔｏｐａｌｉａｎら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３７１４−３７２５

【非特許文献6】Ｄａｒｒｏｗら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３３２９−３３３５

【非特許文献7】Ｈｏｍら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１０：１５３−１６４

【非特許文献8】Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：６３８−６４３

【非特許文献9】Ｈｏｍら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１３：１８−３０

【非特許文献10】Ｏ’Ｎｅｉｌら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１４１０−１４１８

【非特許文献11】Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１４：８８−９３

【非特許文献12】Ａｎｉｃｈｉｎｉら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：９８９−９９８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

要旨
エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体およびこれらの抗体の抗原結合フラグメントが、本明細書中に開示される。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、完全ヒト抗体である。これらの抗体は、ヒトエンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌａｍｉｎ）に対して高親和性を有し、がんを処置するためおよび／または診断するために使用され得る。１つの例において、そのモノクローナル抗体は、ｓｃＦｖである。

【0008】

いくつかの実施形態において、開示される抗体は、エンドプラスミンを発現する腫瘍（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がん）を検出するために有用である。他の実施形態において、開示される抗体は、腫瘍（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がん）を処置するために有用である。

【0009】

これらの抗体をコードする組換え核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、およびこれらの発現ベクターで形質転換された宿主細胞もまた、本明細書中に開示される。

【0010】

前述のおよび他の特徴および利点は、添付の図を参照して進むいくつかの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるだろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体は、配列番号１のアミノ酸２６〜３３（ＣＤＲ１）、配列番号１のアミノ酸５１〜５８（ＣＤＲ２）、配列番号１のアミノ酸９７〜１０３（ＣＤＲ３）またはその２つもしくは３つの組み合わせを含み、該抗体は、ヒトエンドプラスミンに特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
（項目２）
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸２７〜３２（ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸５０〜５２（ＣＤＲ２）、配列番号２のアミノ酸８９〜９７（ＣＤＲ３）またはその２つもしくは３つの組み合わせを含む、項目１に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目３）
前記抗体の重鎖可変ドメインが、配列番号１のアミノ酸２６〜３３（ＣＤＲ１）、配列番号１のアミノ酸５１〜５８（ＣＤＲ２）、配列番号１のアミノ酸９７〜１０３（ＣＤＲ３）を含み、該抗体の軽鎖の可変ドメインが、配列番号２のアミノ酸２７〜３２（ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸５０〜５２（ＣＤＲ２）および配列番号２のアミノ酸８９〜９７（ＣＤＲ３）を含む、項目１〜２のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目４）
前記抗体の重鎖が、配列番号１を含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目５）
前記抗体の軽鎖が、配列番号２を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目６）
前記抗体の重鎖が、配列番号１を含み、該抗体の軽鎖が、配列番号２を含む、項目１〜５のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目７）
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’_２フラグメント、単鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）またはジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）である、項目１〜６のいずれかに記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目８）
前記抗体がｓｃＦｖである、項目７に記載のヒトモノクローナル抗体の単離された抗原結合フラグメント。
（項目９）
前記抗体がＩｇＧである、項目１〜８のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１０）
前記抗体が標識されている、項目１〜９のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１１）
前記標識が、蛍光標識、酵素標識または放射性標識である、項目１０に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメント。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
（項目１３）
エフェクター分子に連結された項目１〜９のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを含む、単離された免疫結合体。
（項目１４）
前記エフェクター分子が、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ）またはそのバリアントもしくはフラグメントである、項目１３に記載の単離された免疫結合体。
（項目１５）
項目１４に記載の単離された免疫結合体および薬学的に許容され得るキャリアを含む、組成物。
（項目１６）
エンドプラスミンを発現するがんを有すると診断された被験体を処置する方法であって、
治療有効量の項目１２または項目１５に記載の組成物を該被験体に投与し、
それによって、該被験体内のエンドプラスミンを発現するがんを処置する工程を包含する、方法。
（項目１７）
前記がんが、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、卵巣がん、膀胱がんまたは膵臓腺癌である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記被験体を処置する工程が、転移の数またはサイズを減少させる工程を包含する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
被験体においてがんを検出するかまたはがんの診断を確認する方法であって：
項目１〜１１のいずれか１項に記載の単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントと該被験体由来のサンプルとを接触させる工程；および
該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合を検出する工程
を包含し、ここで、コントロールサンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合の結合と比べた、該サンプルへの該単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントの結合の増加は、該被験体においてがんを検出するか、または該被験体におけるがんの診断を確認する、方法。
（項目２０）
前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントが、直接標識されている、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記単離されたヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントに特異的に結合する二次抗体と前記サンプルとを接触させる工程、および
該二次抗体の結合を検出する工程
をさらに包含し、
コントロールサンプルへの該二次抗体の結合と比べた、該サンプルへの該二次抗体の結合の増加は、該被験体におけるがんを検出するか、または該被験体におけるがんの診断を確認する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記がんが、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんである、項目１９〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記コントロールサンプルが、がんを有しない被験体由来のサンプルである、項目１９〜２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記サンプルが、血液、尿、バイオプシー、血清、痰、血漿または脳脊髄液サンプルである、項目１９〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記がんが転移性である、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
項目１〜１１のいずれかに記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
（項目２７）
前記ヒトモノクローナル抗体のＶ_Ｈドメインが、配列番号３のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む、項目２６に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子。
（項目２８）
前記ヒトモノクローナル抗体のＶ_Ｌドメインが、配列番号４のヌクレオチド配列またはその縮重バリアントを含む、項目２６または項目２７に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子。
（項目２９）
異種プロモーターに作動可能に連結された、項目２６〜２８のいずれか１項に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子。
（項目３０）
項目２６〜２９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子を含む、発現ベクター。
（項目３１）
項目２５〜２８のいずれか１項に記載の核酸分子または項目３０に記載の発現ベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
（項目３２）
治療有効量の化学療法因子を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
（項目３３）
前記化学療法因子が、５−フルオロウラシル、シクロパミン、放射線照射またはそれらの組み合わせである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記エフェクター分子が、サイトカイン、ケモカイン、化学療法因子または放射性ヌクレオチドである、項目１３に記載の免疫結合体。
（項目３５）
前記エフェクター分子が、サイトカインまたはケモカインである、項目３４に記載の免疫結合体。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1a】図１ａは、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ１１５８を用いたファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーのパニングを示す。このファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーは、異なる特異性を有するｓｃＦｖフラグメントをディスプレイする大量のファージを含んでいる。そのライブラリーを、ＷＭ１１５８メラノーマ細胞懸濁液の入ったチューブに加えた。このチューブを洗浄して、結合していないファージを除去した後、結合したファージを、高ｐＨで溶出し、細菌宿主の大腸菌ＴＧ１において増幅した。３回パニングした後、単離されたクローンを、培養されたヒトＬＧ２ Ｂリンパ系細胞に吸収させることにより、ヒトのメラノーマ細胞とリンパ系細胞とが共有するＡｇに結合したファージを除去した。次いで、単離されたファージを、ＥＬＩＳＡにおいてＷＭ１１５８細胞との反応性についてスクリーニングした。

【図1b】図１ｂは、ＷＭ１１５８細胞を用いてファージディスプレイ抗体ライブラリーをパニングすることによって単離されたｓｃＦｖ Ｗ９と、メラノーマ細胞株ＷＭ１１５８およびＢリンパ系細胞株ＬＧ２との異なる反応性を示す。ＷＭ１１５８細胞を、９６ウェルプレートにプレーティングし、室温で２時間、ｓｃＦｖ Ｗ９とインキュベートした。ｓｃＦｖの結合を、ｃ−ｍｙｃ特異的ｍＡｂ ９Ｅ１０およびＨＰＲ−ストレプトアビジンを用いて検出した。関連性のない抗原を認識するｓｃＦｖ１１９およびＬＧ２細胞をネガティブコントロールとして使用した。ｓｃＦｖ Ｗ９は、ＷＭ１１５８細胞株と特異的に反応する。

【図2】図２は、ｓｃＦｖ Ｗ９と多くのタイプのヒト細胞株との反応性を示す。６つのメラノーマ細胞株、４つの乳がん細胞株、１つの頭頸部扁平上皮細胞がん細胞株、３つの膵がん細胞株、１つの膀胱がん細胞株、１つの肺がん細胞株、１つの上皮がん細胞株、１つの結腸がん細胞株、１つの腎がん細胞株、１つの前立腺がん細胞株および１つの卵巣がん細胞株を、９６ウェルプレートにプレーティングし、室温で２時間、ｓｃＦｖ Ｗ９とインキュベートした。ｓｃＦｖの結合を、ｃ−ｍｙｃ特異的ｍＡｂ ９Ｅ１０およびＨＰＲ−ストレプトアビジンを用いて検出した。ｓｃＦｖ Ｗ９は、メラノーマ細胞株のすべて、２つの乳がん細胞株、ならびに頭頸部扁平上皮細胞がん細胞株、膵がん細胞株、膀胱がん細胞株、肺がん細胞株、上皮がん細胞株、腎がん細胞株、卵巣がん細胞株および神経膠腫がん細胞株と反応した。

【図3a】図３ａおよび３ｂは、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される抗原としてのエンドプラスミンの同定を示す。ＷＭ１１５８メラノーマ細胞溶解産物を、ｓｃＦｖ Ｗ９を用いて免疫沈降した。ＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂ ＴＰ２５．９９およびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ｓｃＦｖ Ｃ２１をコントロールとして使用した。沈殿物中のタンパク質を還元１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、クマシーブルーで染色した。９４ＫＤａが、Ｗ９沈殿物に独特だった（Ａ）。Ｔ２４（膀胱がん）、ＳＵＭ１４９（乳がん）およびＳＬＲ２１（腎がん）細胞株の溶解産物から、同じ結果が得られた。特異的バンドを、ＳＤＳゲルから切り出し、質量分析によって解析した。９４ＫＤａのバンドにおいて同定されたヒトタンパク質は、エンドプラスミンである。

【図3b】図３ａおよび３ｂは、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される抗原としてのエンドプラスミンの同定を示す。ＷＭ１１５８メラノーマ細胞溶解産物を、ｓｃＦｖ Ｗ９を用いて免疫沈降した。ＨＬＡクラスＩ特異的ｍＡｂ ＴＰ２５．９９およびＨＭＷ−ＭＡＡ特異的ｓｃＦｖ Ｃ２１をコントロールとして使用した。沈殿物中のタンパク質を還元１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離し、クマシーブルーで染色した。９４ＫＤａが、Ｗ９沈殿物に独特だった（Ａ）。Ｔ２４（膀胱がん）、ＳＵＭ１４９（乳がん）およびＳＬＲ２１（腎がん）細胞株の溶解産物から、同じ結果が得られた。特異的バンドを、ＳＤＳゲルから切り出し、質量分析によって解析した。９４ＫＤａのバンドにおいて同定されたヒトタンパク質は、エンドプラスミンである。

【図4】図４は、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される決定基の発現における炭水化物の役割を示す。ＣＯＬＯ３８細胞を、０．５μｇ／ｍｌのツニカマイシンの存在下において７２時間培養した。ＤＭＳＯだけを含む培地中でインキュベートされた細胞およびｍＡｂ ＴＰ２５．９９をコントロールとして使用した。ｓｃＦｖ Ｗ９の結合についてＥＬＩＳＡによって細胞を試験した。細胞を、４℃で２時間、ｓｃＦｖ Ｗ９とインキュベートした。ｍＡｂ ９Ｅ１０およびＨＰＲ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、ｓｃＦｖの結合を検出した。４５０ｎｍにおいて吸光度を読んだ。ツニカマイシン処理は、ＣＯＬＯ３８細胞へのｓｃＦｖ Ｗ９の結合の大幅な減少を誘導した。したがって、炭水化物は、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される決定基の発現において役割を果たす。

【図5】図５ａおよび５ｂは、組換えイヌエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）に対するｓｃＦｖ Ｗ９の反応性の特異性を示す。アミノ酸配列においてヒトエンドプラスミン（ｅｎｏｄｐｌａｓｍｉｎ）（Ｇｒｐ９４）と９８．５％の相同性を示す組換えイヌエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）を、９６ウェルプレートに２０μｇ／ウェルで固定化し、室温で２時間、ｓｃＦｖ Ｗ９とインキュベートした。ｓｃＦｖの結合を、ｍＡｂ ９Ｅ１０およびＨＰＲ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。４５０ｎｍにおいて吸光度を読んだ。ｓｃＦｖ１１９およびＢＳＡをネガティブコントロールとして使用した。ｓｃＦｖ Ｗ９は、細胞膜上に発現されるエンドプラスミンの決定基を認識する。

【図6】図６は、組換えイヌエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）による、ＣＯＬＯ３８細胞に対するｓｃＦｖ Ｗ９の結合の用量依存的阻害を示す。組換えイヌエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）の２倍希釈物を、ｓｃＦｖ Ｗ９とプレインキュベートした。その混合物を、ＣＯＬＯ３８細胞が播種された９６ウェルプレートに加えた。ｓｃＦｖの結合を、ｍＡｂ ９Ｅ１０およびＨＰＲ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いて検出した。４５０ｎｍにおいて吸光度を読んだ。Ｂ_２ｍをコントロールとして使用した。組換えイヌＧｒｐ９４は、ＣＯＬＯ３８細胞に対するｓｃＦｖ Ｗ９の結合を特異的に阻害する。

【図7】図７ａおよび７ｂは、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合に対する、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）ｃＤＮＡによる２９３細胞のトランスフェクションの影響を示す。２９３細胞を、エレクトロポレーションによって３μｇのＧｒｐ９４ ＨＳＰ９０Ｂ１ ｃＤＮＡクローンでトランスフェクトした。細胞を、ｓｃＦｖ Ｗ９およびｍＡｂ ９Ｅ１０とインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ｐＣＭＶ６−ＸＬ４ベクターをコントロールとして使用した。トランスフェクトされていない（Ｕｎｔｒａｓｆｅｃｔｅｄ）細胞をコントロールとして使用した。エレクトロポレーションは、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合を増加させる。ｓｃＦｖによって認識される抗原の発現は、熱ショックによって制御される。

【図8】図８ａおよび８ｂは、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合に対する、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）ｓｈＲＮＡによるＦＯ−１細胞の形質導入の影響を示す。ＦＯ−１細胞に、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）ｓｈＲＮＡおよびコントロールｓｈＲＮＡ（ＡＢＣＢ５）を形質導入した。細胞を、ｓｃＦｖ Ｗ９およびｍＡｂ ９Ｅ１０とインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）ｓｈＲＮＡは、コントロールｓｈＲＮＡと比べて、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合を阻害した。

【図9】図９は、ｍＡｂ Ｗ９によって認識されるエピトープの発現における炭水化物の役割を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２（５×１０^５）を、５％ＣＯ２恒温器において５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中、２μｌのα−２（３，６，８．９）−ノイラミニダーゼありまたはなしで３７℃において２４時間インキュベートした。次いで、処理された細胞をｍＡｂ Ｗ９で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。ｍＡｂ ＴＰ２５．９９で処理された細胞をコントロールとして使用した。

【図10】図１０は、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２がん開始細胞上における、ｍＡｂ Ｗ９によって認識される細胞外のエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）エピトープの発現を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を、ＡＬＤＨ活性を検出するためにＡＬＤＥＦＬＵＯＲとインキュベートし（試験）、ｍＡｂ Ｗ９で染色した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ＋ＤＡＥＢインヒビターとインキュベートされ、ｍＡｂ Ｗ９で染色した細胞を、参照として使用した（コントロール）。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と同定されたがん開始細胞のパーセンテージが示されている。

【図11】図１１は、外科的に取り出されたヒト膵臓腺癌病変のｍＡｂ Ｗ９による免疫組織化学的染色を示す。外科的に取り出されたヒト膵臓腺癌病変および同じ患者由来の正常膵臓組織の凍結切片を、ｍＡｂ Ｗ９（１μｇ／ｍｌ）で染色した（×２００）。

【図12】図１２は、ｍＡｂ Ｗ９を使用することによる、ヒト基底乳がん（ｂａｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上およびヒトメラノーマ異種移植片ＭＶ３上でのエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）発現のＩＨＣ染色解析を示す。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された、ヒト基底乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ヒト乳管がん（ｌｕｍｉｎａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）ＭＣＦ−７細胞およびヒトメラノーマ異種移植片ＭＶ３をｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）で染色した（×２００）。ｍＡｂ Ｗ９による免疫組織化学的（Ｉｍｍｕｎｏｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）染色は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＭＶ３異種移植片が、ｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）で強く染色されることを示した。ＭＣＦ−７細胞では染色は検出されなかった。

【図13】図１３は、ｍＡｂ Ｗ９は、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）を発現している腫瘍細胞の成長を有意に阻害したことを示す。ヒトがん細胞（１×１０^４／ウェル）を、９６ウェルプレート（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１％ＦＣＳ）に播種し、ｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）で７２時間、処理した。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。次いで、細胞をＭＴＴアッセイによって試験した。結果が、成長阻害の％として表されている。^＊ｐ値＜０．０５；^＊＊ｐ値＜０．０１。

【図14】図１４は、ｍＡｂ Ｗ９抗体による、がん細胞のアポトーシスの誘導を示す。ヒトＭＶ３（メラノーマ）およびＭＩＡＰａＣａ−２（膵臓腺癌）細胞（４×１０^５／ｍｌ）を、それぞれ２４時間および３時間飢餓にし、次いで、１．５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でｍＡｂ Ｗ９（５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。６時間後、アネキシンＶ／ＰＩで染色することによって、アポトーシス細胞のパーセンテージについて細胞を調べた。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をネガティブコントロールとして使用した。

【図15】図１５は、ヒトメラノーマＭ２１細胞における、ｍＡｂ Ｗ９抗体による、切断型ＰＡＲＰの誘導を示す。ヒトメラノーマＭ２１細胞（４×１０^５／ｍｌ）を、１．５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で７２時間、ｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞溶解産物を、ウエスタンブロット解析において、切断型ＰＡＲＰについて試験した。β−アクチンを充填コントロールとして使用した。ｍＡｂ Ｗ９は、切断型ＰＡＲＰの発現を大幅に増加させた。

【図16】図１６は、ヒトメラノーマＭＶ３細胞における、ｍＡｂ Ｗ９抗体による、切断型カスパーゼ−３の誘導を示す。ヒトメラノーマＭＶ３細胞（４×１０^５／ｍｌ）を、２４時間飢餓にし、次いで、１．５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中でｍＡｂ Ｗ９（５０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。細胞溶解産物を、ウエスタンブロットにおいて、切断型カスパーゼ−３について試験した。β−アクチンを充填コントロールとして使用した。生じたバンドの密度を、ＩＭＡＧＪ（登録商標）ソフトウェアを用いて測定し、β−アクチンのバンドの密度に対して正規化し、それぞれのバンドの下に示す。ｍＡｂ Ｗ９は、切断型カスパーゼ−３の発現を大幅に増加させた。ＨＩｇで処理された細胞では、影響は検出されなかった。

【図17】図１７は、ｍＡｂ Ｗ９によって媒介されるヒトメラノーマＭＶ３細胞の細胞依存性溶解を示す。ヒトメラノーマＭＶ３細胞を、５０μＣｉの^５１Ｃｒで標識し、０．４×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、９６ウェル組織培養Ｕ底アッセイプレートにおいてｍＡｂ Ｗ９（５０、１０、２μｇ／ｍｌ）と混和した。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＭＣ（４０：１ Ｅ：Ｔ）を加え、ＣＯ_２恒温器内において３７℃で４時間インキュベートした。Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒにおいて、細胞（ｅｌｌ）を含まない上清をカウントすることによって、^５１Ｃｒの放出を測定した。

【図18】図１８は、ｍＡｂ Ｗ９によって媒介されるヒトメラノーマＭＶ３細胞の補体依存性溶解を示す。ヒトメラノーマＭＶ３細胞を、５０μＣｉの^５１Ｃｒで標識し、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。標的細胞を、ヒト血清補体の存在下においてｍＡｂ Ｗ９（５０、１０、２μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。ヒトＩｇ（Ｈｉｇ）をコントロールとして使用した。ＣＯ_２恒温器内において３７℃で２時間インキュベートした後、Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒにおいて、細胞を含まない上清をカウントすることによって、^５１Ｃｒの放出を測定した。

【図19】図１９は、ｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２がん開始細胞のインビトロ増殖の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を３７℃で４８時間、ｍＡｂ Ｗ９（２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。次いで、細胞を回収し、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）で染色した（試験）。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）＋ＤＡＥＢで染色された細胞を参照として使用した（コントロール）。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と同定されたがん開始細胞のパーセンテージが示されている。

【図20】図２０は、膵臓ＭＩＡＰａＣａ−２細胞およびＰＡＮＣ１細胞における、シグナル伝達経路ＲＡＳ−ＭＥＫ−ＥＲＫおよびＦＡＫのｍＡｂ Ｗ９による阻害を示す。ヒト膵臓ＭＩＡＰａＣａ−２細胞およびＰＡＮＣ１細胞を、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地の入った６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１．０×１０^５の濃度で播種し、３７℃で４８時間、Ｗ９上清、コントロール上清とインキュベートするか、または処理しなかった。細胞溶解産物を、抗ＲＡＳ、Ｃ−Ｒａｆ、リン酸化（ｐ）−ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１／２、（ｐ）−ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７）、ＦＡＫ、β−カテニン、ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）およびＡＫＴ ｍＡｂを用いるウエスタンブロットにおいて試験した。カルネキシンおよびβ−アクチンを充填コントロールとして使用した。

【図21】図２１は、ヒトメラノーマＭ２１細胞におけるｍＡｂ Ｗ９によるシグナル伝達経路の阻害を示す。ヒトメラノーマＭ２１細胞を、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地の入った６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり１．０×１０^５の濃度で播種し、ｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）と７２時間インキュベートした。抗リン酸化（ｐ）−ＡＫＴ、Ｂｃｌ−２、Ｃ−Ｒａｆ、（ｐ）−ＥＲＫ１／２、ＰＫＣα、β−カテニンｍＡｂを用いるウエスタンブロットにおいて、細胞溶解産物を試験した。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）およびＰＢＳをネガティブコントロールとして使用した。カルネキシンを充填コントロールとして使用した。

【図22】図２２は、ヒトメラノーマＭＶ３細胞におけるｍＡｂ Ｗ９によるシグナル伝達経路の阻害を示す。ヒトメラノーマＭＶ３細胞を、ＲＰＭＩ１６４０において３７℃で６時間、ｍＡｂ Ｗ９とインキュベートした。次いで、細胞溶解産物を調製し、抗ＲＡＳ、Ｍｅｔ、ｐ−Ｍｅｔ、β−カテニン、Ｒａｓ、Ｃ−ＲＡＦ、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２．Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４を用いるウエスタンブロットにおいて試験した。β−アクチンを充填コントロールとして使用した。ＨＩｇとインキュベートされた細胞をコントロールとして使用した。

【図23】図２３は、ｍＡｂ Ｗ９で処置されたマウスにおける、確立された肺転移の減少を示す。ＭＶ３メラノーマ細胞（１．４×１０^８／マウス）をｉ．ｖ．注射した。１５日後、マウスを４８時間ごとにｍＡｂ Ｗ９で処置した（１００μｇ／マウス、ｉ．ｖ．）。２５日目に、マウスを屠殺し、肺を回収し、ホルマリン固定し、腫瘍面積の解析のためにＨ＆Ｅ染色した。示されている値は、各群の平均腫瘍面積である。^＊＊は、ｐ値＜０．０１を示している。

【図24】図２４は、ＵＡＣＣ−２５７メラノーマ細胞によるエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）発現の化学療法因子による増強を示す。ヒトメラノーマＵＡＣＣ−２５７細胞（２×１０^５／ｍｌ）を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、５−ＦＵ（３００μＭ）、シスプラチン（１０μＭ）およびパクリタキセル（２０ｎＭ）と４８時間インキュベートした。細胞を回収し、ｍＡｂ Ｗ９で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。処理されていない細胞をコントロールとして使用した。染色された細胞のパーセンテージおよび平均蛍光強度（ＭＦＩ）が示されている。

【図25】図２５ａおよび２５ｂは、５−ＦＵおよびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌（ａｄｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の増殖の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を、９６ウェルプレート（ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％ＦＣＳ）において播種し（１ウェルあたり２．５×１０^３細胞）、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃において１、２、３日間、５−ＦＵ（１０μＭ）（Ａ．）またはシクロパミン（２０μＭ）（Ｂ．）と併用してｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）で処理した。次いで、細胞をＭＴＴアッセイによって試験した。５４０ｎｍにおけるＯ．Ｄ．値は生細胞を示す。

【図26】図２６は、５−ＦＵおよびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２がん開始細胞のインビトロ増殖の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を、３７℃で４８時間、ｍＡｂ Ｗ９（２５μｇ／ｍｌ）、シクロパミン（２０μＭ）および５−ＦＵ（１０μＭ）とインキュベートした。次いで、細胞を、ＤＥＡＢインヒビターありまたはなしで、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲで染色することにより、ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞を同定した。抗ＨＬＡクラスＩ ｍＡｂ ＴＰ２５．９９をコントロールとして使用した。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と同定されたがん開始細胞のパーセンテージが示されている。

【図27】図２７は、５−ＦＵおよびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞（４×１０^５／ｍｌ）を、３時間飢餓にし、次いで、１．５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中においてｍＡｂ Ｗ９（１０μｇ／ｍｌ）、シクロパミン（２０μＭ）および５−ＦＵ（１０μＭ）とインキュベートした。２４時間後、アネキシンＶ／ＰＩで染色することによって、アポトーシス細胞のパーセンテージについて細胞を調べた。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。ＨＩｇをネガティブコントロールとして使用した。

【図28】図２８ａおよび２８ｂは、放射線照射およびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２がん開始細胞のインビトロ増殖の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞（４×１０^５／ｍｌ）に、２０Ｇｙの線量を照射し（パネルＡ．）、それを３７℃で７２時間、ｍＡｂ Ｗ９（１０μｇ／ｍｌ）およびシクロパミン（２０μＭ）とインキュベートした。次いで、細胞を、ＤＥＡＢインヒビターありまたはなしで、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲで染色することにより、ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞を同定した。照射されていない細胞をコントロールとして使用した（パネルＢ．）。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と同定されたがん開始細胞のパーセンテージが示されている。

【図29】図２９は、放射線照射およびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるアポトーシスの誘導を示す。ヒト膵臓腺癌ＭｉａＰａＣａ−２細胞（４×１０^５／ｍｌ）に、２０Ｇｙの線量を照射し、それをｍＡｂ Ｗ９（２０μｇ／ｍｌ）およびシクロパミン（２０μＭ）とインキュベートした。８時間後、アネキシンＶ／ＰＩで染色することによって、アポトーシス細胞のパーセンテージについて細胞を試験した。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。照射されていない細胞およびヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。

【図30】図３０は、５−ＦＵおよびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるシグナル伝達経路の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を、３７℃で２日間、ｍＡｂ Ｗ９、シクロパミン（２０μＭ）および５−ＦＵ（１０μＭ）とインキュベートした（パネルＤ）。次いで、細胞溶解産物を調製し、抗ＲＡＳ、Ｃ−Ｒａｆ、リン酸化（ｐ）−ＭＥＫ（Ｓｅｒ２１７／２２１）、ＭＥＫ、ｐＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ ｍＡｂを用いるウエスタンブロットにおいて試験した。カルネキシンを充填コントロールとして使用した。ｍＡｂ Ｗ９単独（パネルＡ）、ｍＡｂ Ｗ９およびシクロパミン（パネルＢ）ならびにｍＡｂ Ｗ９および５ＦＵ（パネルＣ）とインキュベートされた細胞をコントロールとして使用した。

【図31】図３１は、放射線照射およびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９による、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞におけるシグナル伝達経路の阻害を示す。ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に、２０Ｇｙの線量を照射し、それを３７℃で４８時間、ｍＡｂ Ｗ９（１０μｇ／ｍｌ）およびシクロパミン（２０μＭ）とインキュベートした。次いで、細胞溶解産物を調製し、抗ＲＡＳ、リン酸化（ｐ）−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、ＥＲＫ、ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ、ＳＨｈ、ＧＬＩ１ ｍＡｂを用いるウエスタンブロットによって試験した。カルネキシンを充填コントロールとして使用した。カルネキシンおよびβ−アクチンを充填コントロールとして使用した。

【発明を実施するための形態】

【0012】

配列表
添付の配列表に列挙される核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されているように、ヌクレオチド塩基に対する標準的な文字の省略形、およびアミノ酸に対する３文字コードを用いて示される。各核酸配列の片方の鎖だけが示されるが、相補鎖は、表示される鎖に対する任意の参照によって含められると理解される。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０１１年６月１５日、１９．４ＫＢ］として提出されており、それは、本明細書中に参考として援用される。

【0013】

配列番号１は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体の重鎖のアミノ酸配列である。

【0014】

配列番号２は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体の軽鎖のアミノ酸配列である。

【0015】

配列番号３は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体の重鎖をコードする核酸配列である。

【0016】

配列番号４は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体の軽鎖の核酸配列である。

【0017】

配列番号５は、ヒトエンドプラスミンのアミノ酸配列である。

【0018】

配列番号６は、ヒトエンドプラスミンをコードする核酸配列である。

【0019】

配列番号７および８は、エンドプラスミンポリペプチドのアミノ酸配列である。

【0020】

（詳細な説明）
Ｉ．省略形
５−ＦＵ：フルオロウラシル
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害
Ａｇ：抗原
ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}：アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｒｉｇｈｔ）
アネキシンＶ：アネキシンＡ５
β−カテニン：カドヘリン結合タンパク質
Ｂ−Ｒａｆ：セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＢ−Ｒａｆ
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ：相補性決定領域
Ｃ−Ｒａｆ：ＲＡＦ癌原遺伝子セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼ
ＤＥＡＢ：４−（ジエチルアミノ）ベンズアルデヒド
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＥＲ：小胞体
ＥＲＫ１／２：細胞外シグナル制御キナーゼ１／２
ＦＡＫ：接着斑キナーゼ
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＦＲ：フレームワーク領域
ＧＬＩ１：神経膠腫関連癌遺伝子ホモログ１
Ｇｒｐ：グルコース調節タンパク質
Ｇｙ：グレイ
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ
Ｉｇ：免疫グロブリン
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＥＫ：マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ
Ｍｅｔ：ｃ−Ｍｅｔ
Ｏ．Ｄ．：光学濃度
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｐ−ＥＲＫ１／２：リン酸化細胞外シグナル制御キナーゼ１／２
ｐ−ＦＡＫ：リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙａｌｔｅｄ）接着斑キナーゼ
ＰＩ：ヨウ化プロピジウム
ＲＡＳ：ＲＡｔ肉腫
ｓｃＦｖ：Ｖ_ＨとＶ_Ｌの両方の単鎖可変領域
ＳＨＨ：ソニックヘッジホッグホモログ
Ｖ_Ｈ：可変重鎖領域
Ｖ_Ｌ：可変軽鎖領域。

【0021】

ＩＩ．用語
別段述べられない限り、専門用語は、慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓによる出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．による出版，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．による出版，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見られ得る。

【0022】

本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語の説明が以下に提供される：
抗体：抗原（例えば、エンドプラスミンまたはそのフラグメント）のエピトープを特異的に認識し、それに特異的に結合する、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、その各々が、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）領域および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめると、Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、抗体によって認識される抗原への結合に関与する。

【0023】

抗体には、インタクトな免疫グロブリンおよびバリアントが含まれる。エンドプラスミンなどの抗原に特異的に結合する抗体の機能的フラグメント（抗原結合フラグメント）（例えば、標的抗原に特異的に結合する、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’_２フラグメント、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」））は、当該分野で周知である。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合された融合タンパク質であり、それらの鎖は、ｄｓＦｖでは、それらの鎖の会合を安定化するジスルフィド結合を導入するように変異されている。この用語は、遺伝的に操作された形態（例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合体抗体（例えば、二重特異性抗体））も包含する。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３^ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７もまた参照のこと。機能的フラグメントは、ヒトエンドプラスミンなどの標的抗原に特異的に結合するので、「抗原結合」フラグメントとも呼ばれる。

【0024】

通常、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には２つのタイプ、ラムダ（λ）およびカッパー（κ）が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。

【0025】

重鎖および軽鎖の各々が、定常領域および可変領域を含む（それらの領域は、「ドメイン」としても知られる）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、一体となって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、定義されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１（本明細書によって参考として援用される）を参照のこと）。現在、Ｋａｂａｔデータベースが、オンラインで維持されており、ＣＤＲ配列が決定され得る（例えば、インターネット上で利用可能なＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴプログラムバージョン：３．２．１８．，２０１１年３月２９日、およびＢｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６，Ｗ５０３−５０８，２００８を参照のこと））。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、３次元空間にＣＤＲを配置し、整列させるように働く。

【0026】

ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から順番にナンバリングされたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称され、また、代表的には、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、Ｖ_ＨＣＤＲ３は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置するのに対し、Ｖ_ＬＣＤＲ１は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ１である。エンドプラスミンに結合する抗体は、一般に、特異的なＶ_Ｈ領域配列およびＶ_Ｌ領域配列、ひいては、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは、抗体ごとに異なるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけが、抗原結合に直接関わる。これらのＣＤＲ内の位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。

【0027】

「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域のことを指す。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」に対する言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域のことを指す。

【0028】

「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンまたは単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合によってハイブリッド抗体を形成する細胞を作製することによって、作製される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。

【0029】

「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種由来のフレームワーク残基、およびエンドプラスミンに特異的に結合するマウス抗体などの別の種由来のＣＤＲ（一般に抗原結合性を付与する）を有する。

【0030】

「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも呼ばれる）は、ヒトフレームワーク領域、およびヒト免疫グロブリン由来のすべてのＣＤＲを含む抗体である。１つの例において、フレームワークおよびＣＤＲは、同じ起源のヒト重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかしながら、１つのヒト抗体のフレームワークは、異なるヒト抗体のＣＤＲを含むように操作され得る。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域、および非ヒト（例えば、マウス、ラットまたは合成）免疫グロブリンの１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。１つの実施形態において、そのすべてのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおいてドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％（例えば、約９５％またはそれ以上）同一でなければならない。ゆえに、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分（おそらくＣＤＲを除く）が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたはヒト化抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得られたアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化モノクローナル抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合性または他の免疫グロブリンの機能に対して実質的に影響しない追加の保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作を用いて構築され得る（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。

【0031】

抗原：抗体の産生または動物におけるＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物または物質（動物に注射されるかまたは吸収される組成物を含む）。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物（異種の免疫原によって誘導されるものを含む）と反応する。例示的な抗原は、エンドプラスミンである。用語「抗原」は、関係する抗原性エピトープのすべてを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位のことを指す。エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露された際にも保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、通常、独特の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。

【0032】

抗原は、組織特異的抗原または疾患特異的抗原であり得る。組織特異的抗原は、疾患特異的抗原でもあり得るので、これらの用語は、排他的ではない。組織特異的抗原は、単一の組織などの限られた数の組織において発現される。組織特異的抗原の特定の非限定的な例は、メラノーマ特異的抗原、または神経膠腫、乳房、肺、前立腺、腎臓もしくは膀胱に特異的な抗原である。疾患特異的抗原は、疾患プロセス（例えば、メラノーマまたは別のタイプのがん）と一致して発現される。疾患特異的抗原の特定の非限定的な例は、その発現が腫瘍の形成（例えば、メラノーマおよび／もしくは神経膠腫ならびに／または別のタイプのがん）と相関するかまたはそれを予測する抗原（例えば、エンドプラスミン）である。疾患特異的抗原は、Ｔ細胞またはＢ細胞によって認識される抗原であり得る。

【0033】

増幅：核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子）の増幅とは、試料中の核酸分子のコピー数を増加させる手法の使用のことを指す。増幅の例は、被験体から回収された生物学的サンプル中の核酸鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でオリゴヌクレオチドプライマー対とそのサンプルとを接触させる、ポリメラーゼ連鎖反応である。それらのプライマーは、好適な条件下で伸長され、鋳型から解離され、次いで、再アニールされ、伸長され、解離されることにより、その核酸のコピー数を増幅する。増幅産物は、標準的な手法を用いる、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはライゲーションおよび／または核酸配列決定によって特徴づけられ得る。増幅の他の例としては、米国特許第５，７４４，３１１号に開示されているような鎖置換増幅；米国特許第６，０３３，８８１号に開示されているような転写を含まない等温増幅；ＷＯ９０／０１０６９に開示されているような修復連鎖反応増幅；ＥＰ−Ａ−３２０３０８に開示されているようなリガーゼ連鎖反応増幅；米国特許第５，４２７，９３０号に開示されているようなギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅；および米国特許第６，０２５，１３４号に開示されているようなＮＡＳＢＡ^ＴＭＲＮＡ転写を含まない増幅が挙げられる。

【0034】

動物：生存している多細胞脊椎動物であり、例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリー。哺乳動物という用語は、ヒトと、非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方を含む。

【0035】

結合親和性：抗原に対する抗体の親和性。１つの実施形態において、親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１−１０６，１９７９に記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の変法によって計算される。別の実施形態において、結合親和性は、抗原／抗体の解離速度によって測定される。別の実施形態において、高結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態において、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。抗体は、高親和性でエンドプラスミンなどの抗原に「特異的に結合」し、他の無関係の抗原に有意に結合しない。

【0036】

乳がん：良性または悪性であり得る、乳房組織の新生物の状態。乳がんの最も一般的なタイプは、腺管癌である。非浸潤性乳管癌は、乳管の非侵襲性の新生物の状態である。小葉癌腫は、侵襲性の疾患ではないが、癌腫が発症し得る指標である。乳房の浸潤性（悪性）癌腫は、ステージ（Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢおよびＩＶ）に分けることができる。

【0037】

化学療法因子：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置における治療上の有用性を備えた任意の化学因子。そのような疾患としては、腫瘍、新生物およびがん、ならびに乾癬などの肥厚成長を特徴とする疾患が挙げられる。いくつかの実施形態において、化学療法因子は、乳房、メラノーマおよび／または神経膠腫の処置において有用な薬剤である。１つの実施形態において、化学療法因子は、放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法因子を容易に識別することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおけるＳｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ ｅｄ．，（著作権）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＩｎｃにおけるＰｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７； Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ ＨＪ（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。併用化学療法は、がんを処置するための２つ以上の薬剤の被験体への投与（例えば、放射性化合物または化学的化合物と併用されるエンドプラスミンに特異的に結合する抗体の投与）である。

【0038】

キメラ抗体：２つの異なる抗体（代表的には、異なる種である）に由来する配列を含む抗体。最も代表的には、キメラ抗体は、ヒト抗体ドメインおよびマウス抗体ドメイン、一般に、ヒト定常領域、ならびにマウス可変領域、マウスＣＤＲおよび／またはマウスＳＤＲを含む。

【0039】

ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）：内部の非コードセグメント（イントロン）および転写を決定する制御配列を欠くＤＮＡの小片。ｃＤＮＡは、細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡからの逆転写によって研究室において合成される。

【0040】

化学療法因子：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置における治療上の有用性を備えた因子（例えば、抗腫瘍薬）。そのような疾患としては、腫瘍、新生物およびがん、ならびに乾癬などの肥厚成長を特徴とする疾患が挙げられる。１つの実施形態において、化学療法因子は、固形腫瘍などの新生物の処置において有用な薬剤である。化学療法因子は、タンパク質または非タンパク質の薬剤（例えば、小分子薬、抗体、ペプチド、タンパク質および免疫調節物質）であり得る。１つの実施形態において、化学療法因子は、放射性分子である。当業者は、化学療法因子を容易に識別することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおけるＳｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ ｅｄ．，（著作権）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＩｎｃにおけるＰｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７；Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ，Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ ＨＪ（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。

【0041】

保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体の親和性に実質的に影響しないかまたはその親和性を低下させない置換である。例えば、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体は、多くとも約１個、多くとも約２個、多くとも約５個、多くとも（ｍｏｓｔ）約１０個、または多くとも約１５個の保存的置換を含み得、元のエンドプラスミンポリペプチドに特異的に結合し得る。保存的変更（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）という用語は、抗体がエンドプラスミンに特異的に結合するのであれば、置換されていない親アミノ酸の代わりに、置換されたアミノ酸を使用することも含む。非保存的置換は、活性またはエンドプラスミンへの結合性を低下させる置換である。

【0042】

機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群が、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
相補性決定領域（ＣＤＲ）：天然のＩｇ結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一体となって規定するアミノ酸配列。Ｉｇの軽鎖および重鎖の各々は、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲを有する。

【0043】

接触：直接的な物理的会合の配置；固体の形態と液体の形態での両方を含む。

【0044】

細胞傷害性：生物の残りの部分の細胞とは対照的に、標的化されるように意図された細胞に対する、免疫毒素などの分子の毒性。１つの実施形態において、対照的に、用語「毒性」は、免疫毒素の標的化部分によって標的化されるように意図された細胞である細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性のことを指し、用語「動物毒性」は、免疫毒素によって標的化されるように意図された細胞以外の細胞に対する免疫毒素の毒性による動物に対する免疫毒素の毒性のことを指す。

【0045】

縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重した配列を含む、エンドプラスミンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然のアミノ酸が存在し、そのほとんどが、２つ以上のコドンによって指定される。それゆえ、縮重ヌクレオチド配列によってコードされるエンドプラスミンポリペプチドのアミノ酸配列が変更されない限り、そのヌクレオチド配列のすべてが、本開示に含まれる。

【0046】

診断：病理学的状態（例えば、メラノーマ、卵巣がん、乳がんまたは神経膠腫であるがこれらに限定されない）の存在または性質を特定すること。診断方法は、その感度および特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査で陽性と出る罹患個体のパーセンテージ（真陽性のパーセント）である。診断アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、ここで、偽陽性率は、検査で陽性と出る疾患を有しない個体の割合と定義される。特定の診断方法は、ある状態の確定診断を提供しない可能性があるが、その方法が、診断に役立つ陽性の指標を提供する場合、その方法で十分である。「予後」は、がんまたは転移などの病理学的状態の発生の確率（例えば、重症度）である。

【0047】

エフェクター分子：キメラ分子が標的としている細胞に対して所望の効果を有するように意図されたキメラ分子の一部。エフェクター分子は、エフェクター部分（ＥＭ）、治療薬もしくは診断薬、または類似の用語としても知られる。

【0048】

治療薬には、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸または誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物または組換えウイルスのような化合物が含まれる。核酸の治療用部分および診断用部分は、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有結合性架橋のための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドを含む。あるいは、抗エンドプラスミン抗体などの標的化部分に連結された分子は、被包系（例えば、治療用組成物（例えば、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）または循環系への直接的な露出から保護され得る別の治療部分）を含むリポソームまたはミセル）であり得る。抗体に付着されたリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；およびＣｏｎｎｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５，１９８５を参照のこと）。診断用剤または診断用部分は、放射性同位体および他の検出可能な標識を含む。そのような目的のために有用な検出可能な標識もまた、当該分野で周知であり、それらとしては、放射性同位元素（例えば、^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^９９ｍＴｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎおよび^１２５Ｉ）、フルオロフォア、化学発光剤および酵素が挙げられる。

【0049】

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である、すなわち、特定の免疫応答を誘発する、分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原性エピトープに特異的に結合する。エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置される連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、通常、変性溶媒に曝露された際にも保持されるのに対し、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、通常、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、通常、独特の空間的コンフォメーションにおいて少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ（１９９６）を参照のこと。エピトープは、グリコシル化され得る。したがって、抗体は、グリコシル化された形態（またはグリコシル化されていない形態）のタンパク質に特異的に結合し得る。

【0050】

エンドプラスミン：熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）ファミリーの小胞体（ＥＲ）常在メンバーであるグルコース調節タンパク質（Ｇｒｐ）９４（Ｇｒｐ９４）としても知られるタンパク質。インビボでは、ｈｓｐ９０およびエンドプラスミンは、クライアントタンパク質と相互作用し、それらをユビキチン依存性のプロテアソーム分解から保護するように機能する。エンドプラスミンタンパク質は、すべての細胞型において恒常的に発現されるが、その発現は、低グルコースレベル、細胞外の低ｐＨ、変異タンパク質の発現およびウイルス感染を含む様々なストレス条件下においてアップレギュレートされる。熱ショックタンパク質は、細胞保護機能を有し、アポトーシスを直接または間接的に調節する。

【0051】

エンドプラスミンの細胞表面発現が、肝細胞癌種、結腸直腸癌腫および肺がん細胞を含む腫瘍細胞において増加すること、ならびにエンドプラスミンが、一部の腫瘍細胞に対して抗アポトーシス作用を有することが示されている。さらに、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染が、肝硬変および肝細胞癌種（ＨＣＣ）に進行するときに、高レベルのエンドプラスミンが観察された。Ｈｓｐ９０およびエンドプラスミンのインヒビター（例えば、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）（ＧＡ）およびその低毒性誘導体１７−ＡＡＧ）が、がんの処置における有効性について研究されている。

【0052】

エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）をコードする例示的な核酸としては：ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３２９９、ＢＣ０６６６５６（ヒト）；ＮＭ＿０１１６３１（マウス）；ＮＭ＿００１０４５７６３：（Ｘｅｎｏｐｕｓ（Ｓｉｌｕｒａｎａ）ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）；ＮＭ＿２１４１０３（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）ＮＭ＿９８２１０（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）；ＮＭ＿００１０１２１９７（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；ＮＭ＿００１１３４１０１：Ｐｏｎｇｏ ａｂｅｌｉｉ；ＮＭ＿００１００３３２７（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ（Ｇｒｐ９４）；ＮＭ＿２０４２８９（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0053】

発現調節配列：作動可能に連結された異種核酸配列の発現を制御する核酸配列。発現調節配列が、核酸配列の転写、適切な場合においては翻訳を調節し、制御するとき、その発現調節配列は、その核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現調節配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前に存在する開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の維持、および終止コドンを含み得る。用語「調節配列」は、その存在が発現に影響し得、また、その存在が有益である追加の構成要素（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得る、構成要素を最低限含むように意図されている。発現調節配列は、プロモーターを含み得る。

【0054】

プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小配列である。プロモーター依存的な遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的または外部シグナルもしくは外部の物質により誘導性となるように調節可能にするのに十分なプロモーターエレメントもまた含まれる；そのようなエレメントは、その遺伝子の５’または３’領域に配置され得る。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。例えば、細菌系におけるクローニングの際、誘導性プロモーター（例えば、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）など）が使用され得る。１つの実施形態において、哺乳動物細胞系におけるクローニングでは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る。組換えＤＮＡ法または合成法によって作製されたプロモーターもまた、核酸配列の転写を提供するために使用され得る。

【0055】

発現調節配列：作動可能に連結された異種核酸配列の発現を制御する核酸配列。発現調節配列が、核酸配列の転写、適切な場合においては翻訳を調節し、制御するとき、その発現調節配列は、その核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、発現調節配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前に存在する開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の維持、および終止コドンを含み得る。用語「調節配列」は、その存在が発現に影響し得、また、その存在が有益である追加の構成要素（例えば、リーダー配列および融合パートナー配列）を含み得る、構成要素を最低限含むように意図されている。発現調節配列は、プロモーターを含み得る。

【0056】

プロモーターは、転写を指示するのに十分な最小配列である。プロモーター依存的な遺伝子発現を細胞型特異的、組織特異的または外部シグナルもしくは外部の物質により誘導性となるように調節可能にするのに十分なプロモーターエレメントもまた含まれる；そのようなエレメントは、その遺伝子の５’または３’領域に配置され得る。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。例えば、細菌系におけるクローニングの際、誘導性プロモーター（例えば、バクテリオファージラムダのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）など）が使用され得る。１つの実施形態において、哺乳動物細胞系におけるクローニングでは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る。組換えＤＮＡ法または合成法によって作製されたプロモーターもまた、核酸配列の転写を提供するために使用され得る。

【0057】

発現：核酸からタンパク質への翻訳。タンパク質は、発現されて、細胞内に残留し得るか、細胞表面膜の構成要素になり得るか、または細胞外マトリックスもしくは細胞外の媒質中に分泌され得る。

【0058】

フレームワーク領域：ＣＤＲ間に挿入されるアミノ酸配列。フレームワーク領域には、可変軽鎖フレームワーク領域および可変重鎖フレームワーク領域が含まれる。フレームワーク領域は、抗原結合にとって適切な配向でＣＤＲを保持するように働く。

【0059】

神経膠腫：任意の発生状態における神経膠から構成される腫瘍。神経膠腫は、脳および脊髄のすべての内因性の新生物（例えば、星状細胞腫、上衣腫および乏突起膠腫）を含む。「低悪性度」神経膠腫は、十分に分化している（未分化でない）；これらは、良性であり、患者に対してより良好な予後の前兆になる。「高悪性度」神経膠腫は、分化していないか、または未分化である；これらは、悪性であり、より不良な予後をもたらす。

【0060】

グリコシル化：抗原などのタンパク質への炭水化物の共有結合性結合。グリコシル化には、Ｎ結合型グリコシル化、Ｏ結合型グリコシル化およびＣ結合型グリコシル化が含まれる。

【0061】

ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答：ヒト被験体に投与されたマウス抗体の可変領域および定常領域に対するその患者における免疫応答。抗体の反復投与によって、患者の血清からその抗体がクリアランスされる速度が増大し得、また、患者においてアレルギー反応が誘発され得る。

【0062】

宿主細胞：ベクターが伝播され得、そのＤＮＡが発現され得る、細胞。その細胞は、原核生物または真核生物の細胞であり得る。この用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も含む。複製中に生じる変異が存在し得るので、すべての子孫が、親細胞と同一でない可能性があることが理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」が使用されるとき、そのような子孫も含まれる。

【0063】

免疫応答：刺激に対する免疫系の細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞または単球）の応答。１つの実施形態において、その応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。１つの実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞応答（例えば、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答）である。別の実施形態において、その応答は、Ｂ細胞応答であり、特定の抗体の産生をもたらす。

【0064】

免疫結合体：目的の抗原（例えば、ヒトエンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌａｓｍ））に特異的に結合する抗体またはその機能的フラグメントへのエフェクター分子の共有結合。そのエフェクター分子は、検出可能な標識、免疫毒素、サイトカインまたはケモカインであり得る。毒素の特定の非限定的な例としては、アブリン、リシン、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（ＰＥ、例えば、ＰＥ３５、ＰＥ３７、ＰＥ３８およびＰＥ４０）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素もしくはそれらの改変された毒素、または直接もしくは間接的に細胞の成長を阻害するかもしくは細胞を殺滅する他の毒性物質が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的には、肝臓毒性によって死をもたらす、高度に毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥおよびＤＴは、その毒素の天然の標的化構成要素（例えば、ＰＥのドメインＩａおよびＤＴのＢ鎖）を除去し、それを抗体などの異なる標的化部分で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態に改変され得る。「キメラ分子」は、エフェクター分子に結合体化（連結）された、リガンドまたは抗体などの標的化部分である。用語「結合体化された」または「連結された」とは、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすることを指す。１つの実施形態において、抗体は、エフェクター分子に接続される。別の実施形態において、エフェクター分子に接続された抗体は、体内での半減期を延長するために、タンパク質またはペプチドに対して脂質または他の分子とさらに接続される。その連結は、化学的手段または組換え手段によるものであり得る。１つの実施形態において、その連結は、化学的であり、ここで、抗体部分とエフェクター分子との反応は、それらの２つの分子間に形成される共有結合を作製することにより、１つの分子を形成する。ペプチドリンカー（短いペプチド配列）が、必要に応じて、抗体とエフェクター分子との間に含められ得る。本来、免疫結合体は、別個の機能性を備える２つの分子（例えば、抗体およびエフェクター分子）から調製されたので、それらは、時折、「キメラ分子」とも称される。ゆえに、用語「キメラ分子」は、本明細書中で使用されるとき、エフェクター分子に結合体化（連結）された、リガンドまたは抗体などの標的化部分のことを指す。

【0065】

免疫原性ペプチド：対立遺伝子特異的モチーフまたはＮ末端反復などの他の配列を含むペプチド（そのペプチドは、ＭＨＣ分子に結合し、免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答またはＢ細胞応答（例えば、抗体産生）を誘導する）。

【0066】

１つの実施形態において、免疫原性ペプチドは、配列モチーフまたは他の方法（例えば、当該分野で公知の、ニューラルネット判定または多項式判定）を用いて同定される。代表的には、ある特定の親和性で結合する高確率をもたらし、免疫原性であるスコアを有するペプチドを選択するために、ペプチドの「結合閾値」を決定するアルゴリズムが使用される。そのアルゴリズムは、特定の位置における特定のアミノ酸のＭＨＣ結合性に対する作用、特定の位置における特定のアミノ酸の抗体結合性に対する作用、またはモチーフ含有ペプチドにおける特定の置換の結合に対する作用に基づく。免疫原性ペプチドの状況の中で、「保存された残基」は、ランダムな分布によって予想される頻度よりも有意に高い頻度でペプチド内の特定の位置に出現する残基である。１つの実施形態において、保存された残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る残基である。１つの特定の非限定的な例において、免疫原性ポリペプチドは、エンドプラスミンの領域またはそのフラグメントを含み、ここで、そのポリペプチドは、完全長エンドプラスミンポリペプチドを発現する宿主細胞の細胞表面上に発現される。

【0067】

免疫原性組成物：エンドプラスミンポリペプチドを発現している細胞に対して測定可能なＣＴＬ応答を誘導するかまたはエンドプラスミンポリペプチドに対して測定可能なＢ細胞応答（例えば、抗体の産生）を誘導するポリペプチド（例えば、エンドプラスミンポリペプチド）を含む組成物。免疫原性組成物は、サイトカインの産生も誘導し得る。それはさらに、エンドプラスミンポリペプチドを発現するために使用され得る（ひいては、このポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために使用され得る）エンドプラスミンポリペプチドをコードする単離された核酸のことを指す。インビトロで使用する場合、免疫原性組成物は、単離されたタンパク質またはペプチドエピトープからなり得る。インビボで使用する場合、免疫原性組成物は、通常、薬学的に許容され得るキャリア中のタンパク質もしくは免疫原性ペプチド、および／または他の剤を含み得る。特定の任意のペプチド（例えば、エンドプラスミンポリペプチド）またはそのポリペプチドをコードする核酸は、当該分野において認められたアッセイによってＣＴＬ応答またはＢ細胞応答を誘導する能力について容易に試験され得る。免疫原性組成物は、当業者に周知のアジュバントを含み得る。

【0068】

免疫学的に反応性の条件：特定のエピトープに対して産生された抗体が、実質的にすべての他のエピトープに対する結合よりも検出可能に高い程度に、および／または実質的にすべての他のエピトープに対する結合を実質的に除外する程度にそのエピトープに結合するのを可能にする条件に対する言及を含む。免疫学的に反応性の条件は、抗体結合反応の形式に依存し、代表的には、イムノアッセイプロトコルにおいて利用される条件またはインビボで遭遇する条件である。イムノアッセイの形式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，前出を参照のこと。それらの方法において使用される免疫学的に反応性の条件は、通常、生存している哺乳動物内または哺乳動物細胞内の条件（例えば、温度、容量オスモル濃度およびｐＨ）に対する言及を含む「生理学的条件」である。一部の器官が、極端な条件に供されることが認識されるが、生物体内および細胞内の環境は、通常、およそｐＨ７（すなわち、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０、より代表的には、ｐＨ６．５〜７．５）にあり、主要な溶媒として水を含み、０℃より高く５０℃より低い温度である。容量オスモル濃度は、細胞の生存能および増殖を支援する範囲内である。

【0069】

単離：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞小器官）は、その構成要素が天然に存在する環境（例えば、細胞）内の他の生物学的構成要素、すなわち、他の染色体のおよび染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞小器官から実質的に分離されているか、または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。この用語は、宿主細胞内の組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。

【0070】

標識：その分子の検出を容易にするために別の分子（例えば、抗体またはタンパク質）に直接または間接的に結合体化される検出可能な化合物または組成物。標識の特定の非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素の連結および放射性同位元素が挙げられる。１つの例において、「標識された抗体」とは、抗体における別の分子の組み込みのことを指す。例えば、標識は、検出可能なマーカー（例えば、放射標識されたアミノ酸の組み込み、または標識されたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分とポリペプチドとの結合）である。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当該分野で公知であり、それらを使用してよい。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（例えば、^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^９９ｍＴｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎおよび^１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド燐光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）または磁性物質（例えば、ガドリニウムキレート）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。

【0071】

リンカー：ある場合には、リンカーは、可変重鎖と可変軽鎖とを間接的に結合するように働く抗体結合フラグメント（例えば、Ｆｖフラグメント）内のペプチドである。「リンカー」は、抗体などの標的化部分を、細胞毒または検出可能な標識などのエフェクター分子に連結するように働くペプチドのことも指し得る。

【0072】

用語「結合体化する」、「接続する」、「結合する」または「連結する」とは、２つのポリペプチドを１つの連続したポリペプチド分子にすること、またはｓｃＦｖなどのポリペプチドに放射性核種もしくは他の分子を共有結合的に結合することを指す。特定の文脈において、それらの用語は、抗体部分などのリガンドをエフェクター分子に接続することに対する言及を包含する。その連結は、化学的手段または組換え手段による連結であり得る。「化学的手段」とは、抗体部分とエフェクター分子との間の反応（それにより、それらの２つの分子の間に共有結合が形成されて１つの分子が形成される）のことを指す。

【0073】

哺乳動物：この用語は、ヒトと非ヒト哺乳動物の両方を包含する。同様に、用語「被験体」は、ヒト被験体と動物被験体の両方を包含する。

【0074】

主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）：ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）をはじめとした、種々の種において報告されている組織適合性抗原系を包含するように意図された総称。用語「モチーフ」とは、特定のＭＨＣ対立遺伝子によって認識される、明確な長さのペプチド、通常、約８〜約１１アミノ酸における残基のパターンのことを指す。そのペプチドモチーフは、代表的には、各ＭＨＣ対立遺伝子によって異なり、高度に保存された残基および結合陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）残基のパターンが異なる。

【0075】

メラノーマ：メラノサイト（メラニン色素を産生する細胞）から起こるがんの一形態。メラノサイトは、主に皮膚に見られるが、腸および眼にも存在する。皮膚におけるメラノーマとしては、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、末端部黒子様黒色腫および悪性黒子（メラノーマ）が挙げられる。上記タイプのいずれもが、メラニンを産生し得るか、またはメラニン欠乏であり得る。同様に、任意のサブタイプが、高悪性度の挙動、および局所的な再発の傾向のマーカーである線維形成（神経親和性を有する高密度線維反応）を示し得る。他のメラノーマとしては、明細胞肉腫、粘膜黒色腫（ｍｕｃｏｓａｌ ｍｅｌａｎｏｍａ）およびブドウ膜黒色腫が挙げられる。

【0076】

予後に影響する特徴は、ミリメートル単位の腫瘍の厚さ（ブレスロー深さ（Ｂｒｅｓｌｏｗ’ｓ ｄｅｐｔｈ））、皮膚構造に関係する深さ（クラークレベル）、メラノーマのタイプ、潰瘍化の存在、リンパ／神経周囲の浸潤の存在、腫瘍浸潤リンパ球の存在（存在する場合、予後はより良好である）、病変の位置、衛星病巣の存在、および局所転移または遠隔転移の存在である。メラノーマが、リンパ節に広がっているとき、最も重要な因子の１つは、悪性病変を有する結節の数である。結節内の悪性病変の程度もまた重要であり；悪性病変が単に微視的である微小転移は、マクロ転移よりも好ましい予後を有する。遠隔転移が存在するとき、５年生存率は、１０パーセント未満であり；生存期間の中央値は、６〜１２ヶ月である。皮膚および肺への転移は、より良好な予後を有する。脳、骨および肝臓への転移は、より不良な予後を伴う。

【0077】

メラノーマは、以下のとおりステージ分け（ｓｔａｇｅｄ）され得る：
ステージ０：上皮内黒色腫（クラークレベルＩ）、１００％生存
ステージＩ／ＩＩ：浸潤性メラノーマ、８５〜９５％生存
Ｔ１ａ：１．００ｍｍ未満の原発性、潰瘍化なし、クラークレベルＩＩ〜ＩＩＩ
Ｔ１ｂ：１．００ｍｍ未満の原発性、潰瘍化ありまたはクラークレベルＩＶ〜Ｖ
Ｔ２ａ：１．００〜２．００ｍｍの原発性、潰瘍化なし
ステージＩＩ：高リスクメラノーマ、４０〜８５％生存
Ｔ２ｂ：１．００〜２．００ｍｍの原発性、潰瘍化あり
Ｔ３ａ：２．００〜４．００ｍｍの原発性、潰瘍化なし
Ｔ３ｂ：２．００〜４．００ｍｍの原発性、潰瘍化あり
Ｔ４ａ：４．００ｍｍ以上の原発性、潰瘍化なし
Ｔ４ｂ：４．００ｍｍ以上の原発性、潰瘍化あり
ステージＩＩＩ：領域転移、２５〜６０％生存
Ｎ１：１つの陽性リンパ節
Ｎ２：２〜３つの陽性リンパ節、または領域皮膚／イントランジット転移
Ｎ３：４つの陽性リンパ節、またはリンパ節および領域皮膚／イントランジット転移
ステージＩＶ：遠隔転移、９〜１５％生存
Ｍ１ａ：遠隔皮膚転移、正常な乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）
Ｍ１ｂ：肺転移、正常なＬＤＨ
Ｍ１ｃ：他の遠隔転移または高ＬＤＨを伴う任意の遠隔転移
モノクローナル抗体：Ｂリンパ球の単一クローン、単一抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞、または抗体ライブラリー内の特定のファージによって産生される抗体（そのモノクローナル抗体は、明確なセットのＣＤＲを含み、かつ目的の標的抗原に特異的に結合する）。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば（これらに限定されないが）ミエローマ細胞と免疫脾臓細胞との融合によってハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、または抗体配列のファージディスプレイライブラリーから選択することによって、作製される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体および完全ヒトモノクローナル抗体が含まれる。本明細書中で使用されるとき、モノクローナル抗体の機能的フラグメントには、そのモノクローナル抗体に対する標的タンパク質（抗原結合）に特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＲｖまたはＦａｂであるがこれらに限定されない）が含まれる。モノクローナル抗体は、グリコシル化されたエピトープなどの抗原性エピトープに特異的に結合する。モノクローナル抗体には、二官能性抗体（ここで、１つ以上のＣＤＲセットが、エンドプラスミンなどの標的抗原に特異的に結合する）ならびにエフェクター機能が増強されたＦｃおよび他のグリコール操作抗体が含まれる。

【0078】

新形成、悪性病変、がんまたは腫瘍：細胞の異常かつ制御されない成長の結果。新形成、悪性病変、がんおよび腫瘍は、しばしば交換可能に使用される。個体内の腫瘍の量は、その腫瘍の数、体積または重量として測定され得る「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織を浸潤し、かつ／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。血液学的腫瘍の例としては、白血病（急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（緩徐進行型および高悪性型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および骨髄形成異常が挙げられる。

【0079】

肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん（基底乳癌腫（ｂａｓａｌ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺管癌および小葉乳癌腫（ｌｏｂｕｌａｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌腫、扁平上皮癌、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺乳頭癌腫、褐色細胞腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌腫およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。

【0080】

いくつかの例において、腫瘍は、メラノーマ、乳がん、腎がん、神経膠腫または扁平上皮癌（例えば、頭頸部がん）である。

【0081】

核酸：ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらの関連する天然に存在する構造的バリアントおよび合成の天然に存在しないアナログ）、それらの関連する天然に存在する構造的バリアントおよび天然に存在しない合成アナログから構成されるポリマー。したがって、この用語は、ヌクレオチドおよびそれらの間の結合が、天然に存在しない合成アナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などであるがこれらに限定されない）を含む、ヌクレオチドポリマーを包含する。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を用いて、合成され得る。用語「オリゴヌクレオチド」は、代表的には、一般に約５０ヌクレオチド以下の、短いポリヌクレオチドのことを指す。ヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表されるとき、これは、「Ｔ」を「Ｕ」が置き換えるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むと理解される。

【0082】

ヌクレオチド配列を記載するために、従来の表示法が本明細書中で使用される：一本鎖ヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の左方向が、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物にヌクレオチドが５’から３’に付加される方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コーディング鎖」と称され；ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’に配置されるＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と称され；ＲＮＡと同じ配列を有し、コーディングＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’に存在するＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と称される。

【0083】

「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖の形態において、ｍＲＮＡと相補的であるかまたは同一であるＤＮＡのことを指す。

【0084】

「コードする」とは、規定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または規定のアミノ酸の配列を有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働くポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれらに起因する生物学的特性のことを指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって生成されるｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生体系においてタンパク質を生成する場合、タンパク質をコードする。コーディング鎖（そのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に提供される）と非コーディング鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される）の両方が、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称され得る。別段明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。

【0085】

「組換え核酸」とは、天然では共に接続されていないヌクレオチド配列を有する核酸のことを指す。これは、好適な宿主細胞を形質転換するために使用され得る、増幅されたまたは組み立てられた核酸を含む核酸ベクターを包含する。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と称される。次いで、その遺伝子は、組換え宿主細胞において発現されることにより、「組換えポリペプチド」などを産生する。組換え核酸は、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）も果たし得る。

【0086】

その配列が第１配列であるポリヌクレオチドが、その配列が第２配列であるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする場合、その第１配列は、第２配列に対して「アンチセンス」である。

【0087】

２つ以上のヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の配列の関係性を記載するために使用される用語としては、「参照配列」、「から選択される」、「比較範囲（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｎｄｏｗ）」、「同一」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的に同一」、「相補的」および「実質的に相補的」が挙げられる。

【0088】

核酸配列を配列比較する場合、通常、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するときは、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用する。比較のために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。比較するための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または手作業によるアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ １９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照のこと）によって行われ得る。

【0089】

有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０，１９８７のプログレッシブ・アラインメント法の簡便法を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３，１９８９に記載された方法に似ている。ＰＩＬＥＵＰを用いるとき、パーセント配列同一性の関係性を決定するために、以下のパラメータを用いて、参照配列が他の試験配列と比較される：デフォルトのギャップウェイト（３．００）、デフォルトのギャップ長ウェイト（０．１０）および重み付けされたエンドギャップ。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ（例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５，１９８４）から入手することができる。

【0090】

パーセント配列同一性および配列類似性を測定するのに適した別のアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９７７に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１というワード長（Ｗ）、５０というアラインメント（Ｂ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列用）は、デフォルトとして３というワード長（Ｗ）および１０という期待値（Ｅ）ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５，１９８９を参照のこと）を使用する。

【0091】

オリゴヌクレオチド：最大約１００ヌクレオチド塩基長の直鎖状のポリヌクレオチド配列。

【0092】

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：いかなる終止コドンもなくアミノ酸をコードするひと続きのヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は、通常、ペプチドに翻訳可能である。

【0093】

作動可能に連結される：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係性で配置されるとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、異種プロモーターなどのプロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、２つのタンパク質コード領域を接続する必要がある場合、同じ読み枠において連続している。

【0094】

医薬品：被験体または細胞に適切に投与されたときに、所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学的化合物または組成物。

【0095】

薬学的に許容され得るキャリア：薬学的に許容され得る有用なキャリアは、従来のキャリアである。Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５には、本明細書中に開示される融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。

【0096】

一般に、キャリアの性質は、使用される特定の投与様式に依存する。例えば、非経口用の製剤は、通常、薬学的かつ生理的に許容され得る流体（例えば、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセルの形態）の場合、従来の無毒性固体キャリアとしては、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性のキャリアに加えて、少量の無毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。

【0097】

ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドまたは核酸配列という用語は、ヌクレオチドの少なくとも１０塩基長の多量体型のことを指す。組換えポリヌクレオチドは、それが由来する生物の天然に存在するゲノムでは直接連続する２つのコード配列が直接連続しない（一方が５’末端、もう一方が３’末端に存在する）ポリヌクレオチドを含む。それゆえ、この用語は、例えば、ベクター；自己複製プラスミドもしくはウイルス；または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡを包含する。そのヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの改変された形態であり得る。この用語は、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡを包含する。

【0098】

ポリペプチド：長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係ない、アミノ酸の任意の鎖。１つの実施形態において、ポリペプチドは、エンドプラスミンポリペプチドである。「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によってポリペプチドに組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸模倣物のことを指す。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシ末端（Ｃ末端）を有する。

【0099】

疾患を予防する、処置するまたは回復させる：疾患を「予防する」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置する」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、それらの徴候または症状を回復させる治療的介入（例えば、腫瘍量の減少、または転移の数もしくは（ｏｆ）サイズの減少）のことを指す。「回復させる」とは、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の減少のことを指す。

【0100】

プローブおよびプライマー：プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合された、単離された核酸を含む。プライマーは、短い核酸、好ましくは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、１５ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールされることにより、プライマーと標的ＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し得、次いで、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当該分野で公知の他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅のために使用され得る。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性がその長さに伴って高まることを認識する。したがって、例えば、２０個連続したヌクレオチドを含むプライマーは、わずか１５ヌクレオチドの対応するプライマーよりも高い特異性で標的にアニールする。したがって、より高い特異性を得るために、２０、２５、３０、３５、４０、５０またはそれ以上連続したヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーが選択され得る。

【0101】

プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を指示する一連の核酸調節配列である。プロモーターは、必要な核酸配列を転写開始部位付近に含む（例えば、ポリメラーゼＩＩタイププロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）。プロモーターは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対も離れて配置され得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含む。構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４，１９８７を参照のこと）。

【0102】

プロモーターの特定の非限定的な例としては、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復配列；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が挙げられ、それらが使用され得る。組換えＤＮＡ法または合成法によって作製されたプロモーターもまた使用され得る。ポリヌクレオチドは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターに挿入され得る。発現ベクターは、代表的には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特定の核酸配列を含む。

【0103】

精製：精製という用語は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸は、その核酸が、細胞内のその天然の環境における核酸よりも濃縮されている核酸である。同様に、精製されたペプチド調製物は、そのペプチドまたはタンパク質が、細胞内のその天然の環境におけるペプチドまたはタンパク質よりも濃縮されているペプチド調製物である。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製のことを表す。１つの実施形態において、ある調製物は、タンパク質またはペプチドが、その調製物の総ペプチド含有量または総タンパク質含有量の少なくとも５０％（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％であるがこれらに限定されない）に相当するように、精製されている（または単離されている）。本明細書中に開示されるエンドプラスミンポリペプチドは、当該分野で公知の任意の手段によって精製され得る（および／または合成され得る）（例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０；およびＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２を参照のこと）。

【0104】

組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別途分離された配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製された配列を有する、核酸である。この人工的な組み合わせは、化学的合成によって、またはより一般的には、単離された核酸のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作法によって、達成されることが多い。

【0105】

組換え毒素：細胞標的化部分が毒素に融合されたキメラタンパク質（Ｐａｓｔａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１１７３−１１７７，１９９１）。細胞標的化部分が、抗体のＦｖ部分である場合、その分子は、組換え免疫毒素と呼ばれる（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３３９：３９４−３９７，１９８９）。その毒素部分は、ほとんどの正常細胞上に存在する毒素レセプターに結合できないように遺伝的に変更されている。組換え免疫毒素は、抗原結合ドメインによって認識される細胞を選択的に殺滅する。これらの組換え毒素および免疫毒素は、がん、例えば、エンドプラスミンを発現しているがんを処置するために使用され得る。

【0106】

選択的にハイブリダイズする：関係のないヌクレオチド配列を排除する中程度または高度にストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーション。

【0107】

核酸ハイブリダイゼーション反応では、特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために使用される条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変動する。例えば、その核酸のハイブリダイズ領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えば、ＧＣ対ＡＴ含有量）および核酸タイプ（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）が、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮され得る。追加の考慮すべき点は、核酸の一方が、例えば、フィルター上に、固定化されているかどうかである。

【0108】

漸進的に高くなるストリンジェンシー条件の特定の非限定的な例は、以下のとおりである：ほぼ室温での２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ハイブリダイゼーション条件）；ほぼ室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低ストリンジェンシー条件）；約４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中程度のストリンジェンシー条件）；および約６８℃での０．１×ＳＳＣ（高ストリンジェンシー条件）。当業者は、これらの条件に対するバリエーションを容易に決定することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。これらの条件のうちの１つだけ、例えば、高ストリンジェンシー条件を用いて洗浄が行われ得るか、またはそれらの条件の各々が、列挙された工程のいずれかまたはすべてを繰り返しつつ、例えば、上に列挙された順序で各１０〜１５分にわたって用いられ得る。しかしながら、上で述べたように、最適条件は、関わる特定のハイブリダイゼーション反応に応じて変動し、経験的に決定され得る。

【0109】

配列同一性：アミノ酸配列間の類似性は、別途、配列同一性と称される、配列間の類似性に関して表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性（または類似性もしくは相同性）に関して測定されることが多い；そのパーセンテージが高いほど、その２つの配列はより似ている。エンドプラスミンポリペプチドのホモログまたはバリアントは、標準的な方法を用いてアラインメントされたとき、比較的高い程度の配列同一性を有する。

【0110】

比較するために配列をアラインメントする方法は、当該分野で周知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４には、配列アラインメント法および相同性の計算に関する詳細な考察が提供されている。

【0111】

ＮＣＢＩベーシックローカルアラインメントサーチツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連して使用するために、いくつかの供給源（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびインターネット上を含む）から入手可能である。どのようにしてこのプログラムを用いて配列同一性を決定するのかの説明は、インターネット上のＮＣＢＩのウェブサイトにおいて入手可能である。

【0112】

エンドプラスミンポリペプチドのホモログおよびバリアントは、代表的には、デフォルトのパラメータに設定されたＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２．０，ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐを用いたエンドプラスミンのアミノ酸配列との完全長のアラインメントに対してカウントされるとき、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸より長いアミノ酸配列を比較する場合、デフォルトのパラメータ（１１というギャップ存在コスト（ｇａｐ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｃｏｓｔ）および１という１残基当たりのギャップコスト（ｐｅｒ ｒｅｓｉｄｕｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ））に設定されたデフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を用いて、Ｂｌａｓｔ２配列関数が使用される。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントするとき、そのアラインメントは、デフォルトのパラメータ（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を使用するＢｌａｓｔ２配列関数を用いて行われるべきである。参照配列に対してさらにより高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価されるとき、高いパーセンテージ同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性）を示す。全体の配列より小さい配列が、配列同一性のために比較されるとき、ホモログおよびバリアントは、代表的には、１０〜２０アミノ酸という狭い範囲にわたって少なくとも８０％の配列同一性を有し、参照配列との類似性に応じて、少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有し得る。そのような狭い範囲に対して配列同一性を測定するための方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトにおいて利用可能である。当業者は、これらの配列同一性の範囲が、単に指針として提供されることを認識する；提供される範囲に入らない非常に有意なホモログを得ることができることも全く可能である。

【0113】

特異的結合物質：規定された標的にしか実質的に結合しない物質。したがって、エンドプラスミン特異的結合物質は、実質的にエンドプラスミンポリペプチドに結合する物質である。１つの実施形態において、特異的結合物質は、エンドプラスミンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

【0114】

扁平上皮癌：皮膚、眼、様々な内部器官の表面、ならびにいくつかの腺の中空器官および管の裏打ちを形成する薄い平らな細胞である扁平上皮細胞から起こる、がんの１タイプ。扁平上皮癌は、類表皮癌腫とも称される。扁平上皮癌の１タイプは、頭頸部（ｈｅａｄ
ａｎｄ ｎｅｃｋ ｈｅａｄ）扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）である。頭頸部扁平上皮癌には、鼻腔、洞、口唇、口腔、唾液腺、のどおよび喉頭のがんが含まれる。ＨＮＳＣＣは、以下のとおりステージ分けされ得る：
ステージ０：腫瘍のエビデンスなし。
ステージＩ：腫瘍の最大径は、２ｃｍ以下である；領域リンパ節転移または遠隔転移のエビデンスなし。
ステージＩＩ：腫瘍は、２ｃｍより大きいが４ｃｍ以下である；領域リンパ節転移または遠隔転移のエビデンスなし。
ステージＩＩＩ：腫瘍は、４ｃｍより大きい；場合によっては、腫瘍は、リンパ節に広がっている；遠隔転移のエビデンスなし。
ステージＩＶ：腫瘍は、リンパ節に広がっている；場合によっては、遠隔転移が存在する。

【0115】

被験体：ヒト被験体と動物被験体（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む）の両方を含むカテゴリーである、生存している多細胞脊椎動物。

【0116】

Ｔ細胞：免疫応答に絶対必要な白血球。Ｔ細胞としては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ４^＋Ｔリンパ球は、「分化クラスター４」（ＣＤ４）として知られるマーカーを表面上に保持する免疫細胞である。「ヘルパー」Ｔ細胞と呼ばれることが多いこれらの細胞は、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含む免疫応答を指揮するのを助ける。ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、「分化クラスター８」（ＣＤ８）マーカーを保持する。１つの実施形態において、ＣＤ８Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。別の実施形態において、ＣＤ８細胞は、サプレッサーＴ細胞である。

【0117】

治療有効量：処置される被験体において所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量。例えば、これは、腫瘍の成長を阻害するかまたは抑制するのに必要な量であり得る。１つの実施形態において、治療有効量は、腫瘍を排除するかまたは転移の数もしくはサイズを減少させるのに必要な量である。被験体に投与されたときに、所望のインビトロ効果を達成すると示された標的組織濃度（例えば、腫瘍において）を達成する投与量が一般に使用される。

【0118】

毒素：細胞に対して細胞傷害性である分子。毒素には、アブリン、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素（ＤＴ）、ボツリヌス毒素、サポリン、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）もしくはゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）またはそれらの改変された毒素が含まれる。例えば、ＰＥおよびＤＴは、代表的には、肝臓毒性によって死をもたらす、高度に毒性の化合物である。しかしながら、ＰＥおよびＤＴは、その毒素の天然の標的化構成要素（例えば、ＰＥのドメインＩａまたはＤＴのＢ鎖）を除去し、それを抗体などの異なる標的化部分で置き換えることによって、免疫毒素として使用するための形態に改変され得る。

【0119】

形質導入：形質導入された細胞は、分子生物学の手法によって核酸分子を導入された細胞である。本明細書中で使用されるとき、形質導入という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入し得るすべての手法（ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクションおよびパーティクルガン法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）による裸のＤＮＡの導入を含む）を包含する。

【0120】

ベクター：宿主細胞に導入され、それにより、形質転換された宿主細胞をもたらす、核酸分子。ベクターは、宿主細胞においてその複製を可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子および当該分野で公知の他の遺伝的エレメントも含み得る。

【0121】

別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。核酸またはポリペプチドに対して与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値が、近似値であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記に記載される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の全体が、参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、その材料、方法および例は、単なる例示であって、限定すると意図されない。

【0122】

ＩＩＩ．エンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体
完全ヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を含む、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）に特異的に結合する抗体が作製された。これらの抗体および／またはその抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｄｉｎｇ）フラグメントは、エンドプラスミンを単離するために使用され得、エンドプラスミンを発現する腫瘍（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がんまたは膵がんであるがこれらに限定されない）を検出するためおよび／または処置するために使用され得る。これらの抗体は、検出可能な標識またはエフェクター分子に結合体化され得る。

【0123】

１つの実施形態において、上記抗体は、グリコシル化されたエンドプラスミンに特異的に結合する。したがって、この実施形態において、それらの抗体は、グリコシル化されていないエンドプラスミンや関係のない抗原に特異的に結合しない。

【0124】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントが本明細書中に開示される。１つの例において、ヒトエンドプラスミンは、以下
に示されるようなアミノ酸配列を有する：

【0125】

【化1】

【0126】

配列番号５、本明細書中に参考として援用される、２０１０年６月１６日において入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３２９９も参照のこと）。

【0127】

別の例では、エンドプラスミンは、以下に示されるような核酸配列によってコードされる：

【0128】

【化2】

【0129】

配列番号６、本明細書中で参考として援用される、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号ＮＭ＿００３２９９、２０１０年６月１６日も参照のこと。

【0130】

当業者（Ｏｎｃｅ ｏｆ ｓｋｉｌｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｒｔ）は、分子生物学における標準的な方法を用いてエンドプラスミンなどのポリペプチドを作製するために核酸配列を容易に使用することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。本明細書中に記載される治療薬および抗体を用いて、当業者は、機能的に等価な核酸（例えば、配列が異なるが同じＥＭまたは抗体配列をコードする核酸）を含む種々のクローンを容易に構築することができる。したがって、本発明は、抗体ならびにその結合体および融合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0131】

グリコシル化されたエンドプラスミンなどのヒトエンドプラスミンに特異的に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体およびそのフラグメントが本明細書中に記載される。いくつかの実施形態において、そのヒトモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖである。提供されるヒトモノクローナル抗体またはその機能的フラグメント（ヒトエンドプラスミンに特異的に結合する）および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物も記載される。これらの抗体をコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクター、およびその核酸を発現する単離された宿主細胞もまた提供される。

【0132】

ヒトエンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫結合体もまた本明細書中に記載される。その免疫結合体は、任意の治療薬、毒素または他の部分を含み得る。１つの例において、その毒素は、ＰＥまたはそのバリアントもしくはフラグメントである。その免疫結合体を含む組成物も記載される。

【0133】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物は、スクリーニング、研究、検出および治療の目的のために使用され得る。例えば、そのヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、競合イムノアッセイなどにおいて、エンドプラスミンに特異的に結合する他の抗体を識別するために使用され得る。

【0134】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物は、がん（例えば、正常細胞と比べてエンドプラスミンの高発現を示すがん）と診断された被験体を処置するために使用され得る。例えば、その抗体は、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんを処置するために使用され得る。メラノーマには、拡散性メラノーマ、結節性黒色腫、末端部黒子様黒色腫および悪性黒子（メラノーマ）が含まれる。扁平上皮癌としては、頭頸部扁平上皮癌および肺の扁平上皮がんが挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

上記エンドプラスミン抗体を含む組成物は、転移を予防するため、または微小転移の数（例えば、領域リンパ節への微小転移）を減少させるためにも使用され得る。そのエンドプラスミン抗体を含む免疫結合体は、がんを有すると診断された患者を処置するためにも使用され得る。そのヒトモノクローナル抗体は、被験体におけるがんを診断するため（転移の検出を含む）にも使用され得る。例えば、そのヒトモノクローナル抗体は、高レベルのエンドプラスミンを検出するために、患者由来のサンプル（例えば、血清サンプル）と接触され得る。本明細書中に提供される抗体および組成物は、被験体におけるがんを検出するため、または患者におけるがんの診断を確認するためにも使用され得る。

【0136】

ヒトエンドプラスミンに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体およびエンドプラスミンに特異的に結合するその機能的フラグメント（抗原結合フラグメント）が本明細書中に開示される。マウスモノクローナル抗体を臨床で使用する際の主な限界は、その処置を受けた患者においてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が生じることである。ＨＡＭＡ応答は、アレルギー反応および投与された抗体が血清からクリアランスされる速度の上昇を含み得る。親モノクローナル抗体の抗原結合親和性を維持するように試みつつ、ＨＡＭＡ応答を最小にする様々なタイプの改変モノクローナル抗体が開発されている。改変モノクローナル抗体の１タイプは、マウス抗原結合可変領域がヒト定常ドメインに連結されたヒト−マウスキメラである（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｌｏｍ，Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．（Ｅｄ．），１９８９）。改変モノクローナル抗体の第２のタイプは、相補性決定領域（ＣＤＲ）が移植されたまたはヒト化されたモノクローナル抗体である（Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １４：２４３−２４６，１９９３）。しかしながら、本明細書中に開示される抗体は、完全ヒト抗体であり；フレームワーク領域とＣＤＲの両方が、ヒト配列に由来する。したがって、これらの抗体がヒト被験体に投与されるとき、ＨＡＭＡは誘導されない。

【0137】

いくつかの実施形態において、上記ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１として示される重鎖アミノ酸配列の可変鎖の少なくとも一部を含み、エンドプラスミンに特異的に結合する。例えば、そのヒトモノクローナル抗体は、ＳＤＲ（特異性決定残基）、ＣＤＲまたは可変領域を含み得る。下記に示されるアミノ酸配列において、定常領域は太字であり、ＣＤＲには、下線が引かれている：

【0138】

【化3】

【0139】

いくつかの実施形態において、上記ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１として示される重鎖アミノ酸配列の少なくとも一部を含み、エンドプラスミンに特異的に結合する。いくつかの例において、その抗体の軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つは、配列番号１のアミノ酸２６〜３３（ＣＤＲ１）、配列番号１のアミノ酸５１〜５８（ＣＤＲ２）および配列番号１のアミノ酸９７〜１０３（ＣＤＲ３）として示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。追加の例において、その抗体の重鎖は、配列番号１のアミノ酸２６〜３３（ＣＤＲ１）、配列番号１のアミノ酸５１〜５８（ＣＤＲ２）および配列番号１のアミノ酸９７〜１０３（ＣＤＲ３）として示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、その抗体の重鎖の可変領域は、配列番号１のアミノ酸１〜１１３を含み得るか、またはそれからなり得る。その抗体の重鎖は、配列番号１を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0140】

いくつかの実施形態において、上記ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２として示される軽鎖アミノ酸配列の可変領域の少なくとも一部を含み、エンドプラスミンに特異的に結合する。下記に示されるアミノ酸配列において、定常領域は太字であり、ＣＤＲには、下線が引かれている：

【0141】

【化4】

【0142】

いくつかの例において、その抗体の軽鎖のＣＤＲのうちの少なくとも１つは、配列番号２のアミノ酸２７〜３２（ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸５０〜５２（ＣＤＲ２）および配列番号２のアミノ酸８９〜９７（ＣＤＲ３）として示されるアミノ酸配列のうちの１つ以上を含む。追加の例において、その抗体の軽鎖は、配列番号２のアミノ酸アミノ酸２７〜３２（ＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸５０〜５２（ＣＤＲ２）および配列番号２のアミノ酸８９〜９７（ＣＤＲ３）を含む。その抗体の軽鎖の可変領域は、配列番号２のアミノ酸１〜１０７を含み得るか、またはそれからなり得る。その抗体の軽鎖は、配列番号２を含み得るか、またはそれからなり得る。

【0143】

いくつかの実施形態において、上記ヒトモノクローナル抗体は、標識されている。いくつかの例において、その標識は、蛍光標識、酵素標識または放射性標識である。

【0144】

上記モノクローナル抗体は、任意のアイソタイプであり得る。そのモノクローナル抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ_１またはＩｇＧ_２）であり得る。エンドプラスミンに特異的に結合する抗体のクラスは、別のクラスにスイッチされ得る。１つの態様において、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈをコードする核酸分子は、それぞれ軽鎖または重鎖の定常領域をコードするいかなる核酸配列も含まないように、当該分野で周知の方法を用いて単離される。次いで、Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈをコードする核酸分子は、異なるクラスの免疫グロブリン分子由来のＣ_ＬまたはＣ_Ｈをコードする核酸配列に作動可能に連結される。これは、当該分野で公知であるように、Ｃ_ＬまたはＣ_Ｈ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成され得る。例えば、本来ＩｇＭだったエンドプラスミンに特異的に結合する抗体が、ＩｇＧにクラススイッチされ得る。クラススイッチは、１つのＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに（例えば、ＩｇＧ_１からＩｇＧ_２に）変換するために使用され得る。

【0145】

完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒトフレームワーク領域を含む。そのヒトフレームワーク領域は、配列番号１または配列番号２（これらの配列は、ＣＤＲ配列ならびにフレームワーク配列を含む）の一方または両方に開示されるフレームワーク領域を含み得る。しかしながら、それらのフレームワーク領域は、別の起源由来であることもできる。使用され得るフレームワーク配列の追加の例としては、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０７４０７１（例えば、配列番号１〜１６を参照のこと）に開示されている重鎖および軽鎖のアミノ酸フレームワーク配列が挙げられる。

【0146】

重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、エンドプラスミン上のエピトープ決定基に結合する抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖおよびＦｖ）が、本開示によって包含される。これらの抗体フラグメントは、その抗原、すなわち、ヒトエンドプラスミンに特異的に結合する能力を保持し、ゆえに、それは、抗原結合フラグメントである。これらのフラグメントとしては：
（１）Ｆａｂ（抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含み、ホール抗体をパパイン酵素で消化することによって作製され、インタクトな軽鎖および一方の重鎖の一部をもたらすことができる、フラグメント）；
（２）Ｆａｂ’（抗体分子のこのフラグメントは、ホール抗体をペプシンで処理した後、還元することにより得られ、インタクトな軽鎖および重鎖の一部をもたらすことができる；抗体分子１つあたり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる）；
（３）（Ｆａｂ’）_２（ホール抗体をペプシン酵素で処理することによって（その後の還元は行わない）得ることができる、抗体のフラグメント；Ｆ（ａｂ’）_２は、２つのジスルフィド結合によって保持される２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である）；
（４）Ｆｖ（２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作されたフラグメント）；および
（５）単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）（遺伝的に融合された一本鎖分子として、好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む、遺伝的に操作された分子として定義される）
（６）単鎖抗体の二量体（ｓｃＦＶ_２）（ｓｃＦＶの二量体として定義され、これは「ミニ抗体」とも呼ばれる）
が挙げられる。

【0147】

これらのフラグメントを作製する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８を参照のこと）。

【0148】

実施形態のさらなる群において、上記抗体は、代表的には、約２５ｋＤａであり、各重鎖および各軽鎖あたり３つのＣＤＲとともに完全な抗原結合部位を含む、Ｆｖ抗体である。これらの抗体を作製するために、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、宿主細胞において２つの個別の核酸構築物から発現され得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、隣接せずに発現される場合、Ｆｖ抗体の鎖は、代表的には、非共有結合性の相互作用によって保持される。しかしながら、これらの鎖は、希釈されると解離する傾向があるので、グルタルアルデヒド、分子間ジスルフィドまたはペプチドリンカーによってそれらの鎖を架橋する方法が開発されている。したがって、１つの例において、Ｆｖは、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）であり得、ここで、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ジスルフィド結合によって化学的に連結されている。

【0149】

追加の例において、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによって接続されたＶ_Ｈ鎖およびＶ_Ｌ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶ_ＨドメインおよびＶ_ＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。その構造遺伝子は、発現ベクターに挿入され、それは、続いて大腸菌などの宿主細胞に導入される。その組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを橋架けするリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを作製するための方法は、当該分野で公知である（Ｗｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，９７頁，１９９１；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３，１９８８；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１，１９９３；およびＳａｎｄｈｕ，前出を参照のこと）。単鎖抗体の二量体（ｓｃＦＶ_２）もまた企図される。

【0150】

抗体フラグメントは、抗体のタンパク分解性加水分解によって、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌内での発現によって、調製され得る。抗体フラグメントは、従来の方法によるホール抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントは、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され、それにより、Ｆ（ａｂ’）_２と表される５Ｓフラグメントがもたらされ得る。このフラグメントは、チオール還元剤、および必要に応じて、ジスルフィド結合の切断から生じるスルフヒドリル基に対するブロック基を用いてさらに切断され、それにより、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価フラグメントがもたらされ得る。あるいは、ペプシンを用いた酵素的切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する（米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号ならびにそれらに含まれている参考文献；Ｎｉｓｏｎｈｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０，１９６０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９，１９５９；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，４２２頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９６７；ならびにＣｏｌｉｇａｎらの２．８．１−２．８．１０および２．１０．１−２．１０．４項を参照のこと）。

【0151】

それらのフラグメントが、インタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限り、抗体を切断する他の方法（例えば、一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成する重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝的手法）も使用してよい。

【0152】

当業者は、ヒトエンドプラスミンに特異的に結合する抗体の保存的バリアントが作製され得ることを了解する。ｄｓＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントにおいて使用されるそのような保存的バリアントは、正しいフォールディングおよびＶ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域との間の安定化のために必要とされる不可欠なアミノ酸残基を保持し、その分子の低ｐＩおよび低毒性を保つために残基の電荷特性を保持する。収量を高めるために、アミノ酸置換（例えば、多くとも１つ、多くとも２つ、多くとも３つ、多くとも４つ、または多くとも５つのアミノ酸置換）が、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域において行われ得る。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群が、互いに保存的置換であると考えられるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0153】

ＩＶ．治療用部分および診断用部分における使用
ヒトエンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその機能的フラグメントは、治療方法および診断方法（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんの処置および検出のための方法）において使用され得る。治療的に使用する場合、それらの方法は、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がん（例えば、膵臓腺癌）の処置などのために、エンドプラスミンに特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合フラグメントを被験体に投与する工程を包含し得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療薬に結合体化され得る。免疫結合体としては、抗体への治療薬の共有結合が存在する分子が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬は、特定の標的分子または標的分子を有する細胞に向けられた特定の生物学的活性を有する薬剤である。当業者は、治療薬が、様々な薬物（例えば、ビンブラスチン、ダウノマイシンなど）、細胞毒（例えば、天然のまたは改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素またはジフテリア毒素）、それ自体が薬理学的組成物を含む被包剤（例えば、リポソーム）、放射性物質（例えば、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３Ｈおよび^３５Ｓ）ならびに他の標識、標的部分およびリガンドを含み得ることを認識する。

【0155】

本明細書中に記載されるエンドプラスミン特異的ヒトモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントと共に毒素を使用することにより、免疫毒素が作製され得る。例示的な毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素およびそのサブユニット、ならびにボツリヌス毒素Ａ〜Ｆが挙げられる。これらの毒素は、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から容易に入手可能である。企図される毒素には、本明細書中に記載される毒素のバリアントも含まれる（例えば、米国特許第５，０７９，１６３号および同第４，６８９，４０１号を参照のこと参照のこと）。１つの実施形態において、毒素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）（米国特許第５，６０２，０９５号）である。本明細書中で使用されるとき、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素」とは、天然の（天然に存在する）完全長ＰＥまたは改変されたＰＥのことを指す。そのような改変としては、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩおよびＩＩＩにおける様々なアミノ酸欠失、単一アミノ酸置換、ならびにカルボキシル末端における１つ以上の配列の付加が挙げられ得るが、これらに限定されない（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１，１９８９を参照のこと）。１つの実施形態において、ＰＥの細胞傷害性フラグメントは、天然のＰＥの少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の細胞傷害性を保持する。いくつかの例において、その細胞傷害性フラグメントは、天然のＰＥよりも毒性である。

【0156】

天然のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）は、真核細胞におけるタンパク質合成を阻害する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって分泌される極めて活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）である。ＰＥの作用方法は、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活性化である。その外毒素は、細胞傷害性を引き起こすように協調する３つの構造ドメインを含む。ドメイン１ａは、細胞結合を媒介する。ドメインＩＩは、サイトゾルへの移行に関与し、ドメインＩＩＩは、伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂの機能は、不明である。本明細書中に記載されるモノクローナル抗体とともに使用されるＰＥには、天然の配列、天然の配列の細胞傷害性フラグメント、ならびに天然のＰＥの保存的に改変されたバリアントおよびその細胞傷害性フラグメントが含まれ得る。ＰＥの細胞傷害性フラグメントには、標的細胞におけるその後のタンパク分解性プロセシングまたは他のプロセシングありまたはなしで細胞傷害性であるフラグメントが含まれる。ＰＥの細胞傷害性フラグメントには、ＰＥ４０、ＰＥ３８およびＰＥ３５が含まれる。ＰＥおよびそのバリアントのさらなる説明については、例えば、米国特許第４，８９２，８２７号；同第５，５１２，６５８号；同第５，６０２，０９５号；同第５，６０８，０３９号；同第５，８２１，２３８号；および同第５，８５４，０４４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５１６４３；Ｐａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３５８−３３６２，１９９１；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４７０−９４７５，１９８８；Ｐａｓｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３３：Ｃ１−Ｃ６，１９９７（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0157】

本明細書中に記載される抗体およびその抗原結合フラグメントは、任意の数の異なる診断用化合物または治療用化合物を、表面上にエンドプラスミンを発現している細胞に標的化するためにも使用され得る。したがって、本開示の抗体は、細胞表面エンドプラスミンを発現している細胞に直接送達されるべき薬物に直接またはリンカーを介して結合され得る。治療薬としては、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物または組換えウイルスのような化合物が挙げられる。核酸の治療用部分および診断用部分には、アンチセンス核酸、一本鎖または二重鎖ＤＮＡとの共有結合性架橋用の誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。

【0158】

あるいは、抗エンドプラスミン抗体に連結される分子は、被包系（例えば、治療用組成物（例えば、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）を含むリポソームまたはミセル）、または好ましくは循環系への直接的な露出を遮蔽された別の治療用部分）であり得る。抗体に結合されたリポソームを調製する手段は、当業者に周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号；Ｃｏｎｎｏｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２８：３４１−３６５，１９８５を参照のこと）。

【0159】

本明細書中に開示される抗体は、さらなる治療薬に結合体化され得、そして／または逐次投与もしくは同時投与を用いて追加の薬剤（ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）とともに使用され得る。特定の治療薬の選択は、特定の標的分子または標的細胞、および所望の生物学的作用に依存する。したがって、例えば、その治療薬は、特定の標的細胞の死をもたらすために使用される細胞毒であり得る。逆に、非致死性の生物学的応答の惹起が望まれる場合、その治療薬は、非致死性の薬理学的物質、または非致死性の薬理学的物質を含むリポソームに結合体化され得る。

【0160】

上記治療薬は、サイトカインまたはケモカインでもあり得る。「サイトカイン」は、細胞間のメディエーターとして別の細胞に作用する、１つの細胞集団によって放出されるタンパク質またはペプチドのクラスである。サイトカインは、免疫調節物質として作用し得る。サイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、成長因子および従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。したがって、実施形態は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）；腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバー；ヒト成長ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトーゲン、ＯＢタンパク質；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α；ＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−２１）、ｋｉｔ−リガンドもしくはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジンまたはエンドスタチンを利用する。これらのサイトカインには、天然の起源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。

【0161】

ケモカインもまた、本明細書中に開示される抗体に結合体化され得る。ケモカインは、主に化学誘引物質および特定の白血球細胞サブタイプのアクチベーターとして作用する小型（およそ約４〜約１４ｋＤａ）の誘導性の分泌型炎症促進性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインの産生は、炎症性サイトカイン、成長因子および病原性の刺激物によって誘導される。ケモカインタンパク質は、保存されたアミノ酸配列モチーフに基づいてサブファミリー（アルファ、ベータおよびデルタ）に分けられ、アミノ末端に隣接する最初の２つのシステインの位置に基づいて４つの高度に保存された群（ＣＸＣ、ＣＣ、ＣおよびＣＸ３Ｃ）に分類される。現在までに、５０を超えるケモカインが発見されており、少なくとも１８個のヒト７回膜貫通ドメイン（７ＴＭ）ケモカインレセプターが存在する。有用なケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１およびフラクタルカインが挙げられるが、これらに限定されない。

【0162】

上記治療薬は、化学療法因子であり得る。１つの実施形態において、その化学療法因子は、放射性分子である。当業者は、有用な化学療法因子を容易に特定することができる（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおけるＳｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６；Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２^ｎｄ ｅｄ．，（著作権）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，ＩｎｃにおけるＰｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７；Ｂａｌｔｚｅｒ Ｌ．，Ｂｅｒｋｅｒｙ Ｒ．（ｅｄｓ）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ ＤＳ，Ｋｎｏｂｆ ＭＦ，Ｄｕｒｉｖａｇｅ ＨＪ（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３を参照のこと）。化学療法因子には、当業者に公知であるもの（５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、アザチオプリン、シクロパミン、シクロホスファミド、代謝拮抗物質（例えば、フルダラビン）、抗悪性腫瘍薬（例えば、エトポシド、ドキソルビシン、メトトレキサートおよびビンクリスチン）、カルボプラチン、シスプラチン、ダカルバジン、テモゾロミド、ＰＡＲＰインヒビターおよびタキサン（例えば、タキソール）が挙げられるがこれらに限定されない）が含まれる。ラパマイシンもまた、化学療法因子として使用されている。

【0163】

エフェクター分子（例えば、放射性ヌクレオチド、サイトカイン、ケモカインおよび化学療法因子であるがこれらに限定されない）は、当業者に公知の任意の数の手段を用いて、目的の抗体に連結され得る。共有結合性の結合手段と非共有結合性の結合手段の両方を使用してよい。エフェクター分子を抗体に結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に応じて変化する。ポリペプチドは、代表的には、抗体上の好適な官能基との反応のために利用可能な種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ_２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含み、それにより、エフェクター分子の結合がもたらされる。あるいは、抗体は、さらなる反応性の官能基を露出するためにまたは結合するために誘導体化される。その誘導体化は、いくつかのリンカー分子（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能なもの）のうちのいずれかの結合を含み得る。そのリンカーは、抗体をエフェクター分子に接続するために使用される任意の分子であり得る。そのリンカーは、抗体とエフェクター分子の両方と共有結合を形成することができる。好適なリンカーは、当業者に周知であり、それらとしては、直鎖もしくは分枝鎖の炭素リンカー、複素環式炭素リンカーまたはペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーは、その側基を介して（例えば、システインとのジスルフィド結合を介して）、構成要素であるアミノ酸に、または末端のアミノ酸のアルファ炭素アミノ基およびカルボキシル基に、接続され得る。

【0164】

いくつかの状況では、免疫結合体がその標的部位に達したときに、エフェクター分子が抗体から取り除かれることが望ましい。それゆえ、これらの状況では、免疫結合体は、標的部位の近傍で切断可能な結合を含む。抗体からエフェクター分子を放出するリンカーの切断は、酵素活性、または免疫結合体が標的細胞内もしくは標的部位の近傍において供される条件によって促され得る。

【0165】

種々の放射性診断化合物、放射性治療化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）薬物、毒素、ポリペプチドおよび他の物質を抗体に結合させることについて報告されている多数の方法に照らして、当業者は、所与の物質を抗体または他のポリペプチドに結合させるために適した方法を決定することができる。

【0166】

本明細書中に開示されるエンドプラスミンに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントは、誘導体化され得るか、または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。一般に、それらの抗体またはその一部は、エンドプラスミンへの結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように、誘導体化される。例えば、その抗体は、１つ以上の他の分子実体（例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出物質、医薬品、および／またはその抗体もしくは抗体部分と別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介し得るタンパク質もしくはペプチドに機能的に連結され得る（化学的結合、遺伝的融合、非共有結合性会合またはその他によって）。

【0167】

誘導体化抗体の１タイプは、２つ以上の抗体（二重特異性抗体を作製するような、同じタイプまたは異なるタイプの抗体）を架橋することによって作製される。好適な架橋剤としては、適切なスペーサーによって分離された２つの識別可能で反応性の基を有するヘテロ二官能性である架橋剤（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性である架橋剤（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が挙げられる。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能である。

【0168】

エンドプラスミンを検出するための方法（エンドプラスミンを発現している細胞（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんの細胞）を検出するための方法を含む）が、本明細書中に提供される。これらの方法は、被験体由来のサンプルを、本明細書中に開示されるようなエンドプラスミンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程を包含し得る。その方法は、原発腫瘍を検出するために使用され得るか、または転移を検出するために使用され得る。

【0169】

いくつかの実施形態において、被験体におけるがんを検出するためまたはがんの診断を確認するための方法が提供される。その方法は、被験体由来の生物学的サンプルを、エンドプラスミンに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させる工程、および単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとサンプルとの結合を検出する工程を包含する。単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントとコントロールサンプルとの結合と比較したときの、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと上記サンプルとの結合の増加は、その被験体におけるがんを検出するか、またはその被験体におけるがんの診断を確認する。そのコントロールは、がんを有しないと判明している被験体由来のサンプル、または標準的な値であり得る。

【0170】

上記サンプルは、任意のサンプルであり得、それらとしては、バイオプシー、オートプシーおよび病理検体由来の組織が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的サンプルには、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片も含まれる。生物学的サンプルには、さらに、血液、血清、血漿、痰および髄液などの体液が含まれる。

【0171】

いくつかの実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体（一次抗体（ｆｉｒｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ））は、標識されておらず、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体に結合し得る二次抗体または他の分子が、標識されている。当業者に周知であるように、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合できる二次抗体が選択される。例えば、一次抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、プロテインＡおよびプロテインＧ（この両方ともが商業的に入手可能である）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0172】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な部分で標識され得る。有用な検出物質としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）クロリド、フィコエリトリン、ランタニド燐光体などをはじめとした蛍光性の化合物が挙げられる。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などの生物発光マーカーもまた有用である。抗体は、検出に有用な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど）でも標識され得る。抗体が検出可能な酵素で標識されるとき、識別され得る反応産物を産生するためにその酵素が使用する追加の試薬を加えることによってその抗体は検出され得る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼという物質が存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンを加えることにより、視覚的に検出可能な有色の反応産物がもたらされる。抗体は、ビオチンでも標識され得、そしてそれは、アビジンまたはストレプトアビジンの結合を間接的に測定することによって検出され得る。アビジン自体が、酵素または蛍光標識で標識され得ることに注意すべきである。

【0173】

抗体は、ガドリニウムなどの磁性物質で標識され得る。抗体は、ランタニド（例えば、ユウロピウムおよびジスプロシウム）およびマンガンでも標識され得る。超常磁性酸化鉄などの常磁性粒子もまた、標識として有用である。抗体は、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）でも標識され得る。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。

【0174】

抗体は、放射標識されたアミノ酸でも標識され得る。その放射標識は、診断目的と治療目的の両方のために使用され得る。例えば、その放射標識は、Ｘ線、発光スペクトル、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ（ｃｏｍｍｕｔｅｄ）断層撮影（ＣＴ）スキャン、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）または他の診断法によって、エンドプラスミンを検出するために使用され得る。ポリペプチドに対する標識の例としては、以下の放射性同位体または放射性ヌクレオチド：^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^９９ｍＴｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎおよび^１２５Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。

【0175】

また、抗体は、化学基（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基または炭水化物基）を用いて誘導体化され得る。これらの基は、その抗体の生物学的特徴を改善するため（例えば、血清半減期を延長するため、または組織結合性を高めるため）に有用であり得る。

【0176】

また、本明細書中に記載される抗体は、検出可能な標識に共有結合的または非共有結合的に連結され得る。そのように使用するのに適した検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可能な任意の組成物が含まれる。有用な標識としては、磁気ビーズ、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射標識（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて通常使用されるその他のもの）および比色標識（例えば、コロイド金または色ガラス）、またはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。これらの抗体は、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙｓ）（ＥＬＩＳＡ）をはじめとした種々のイムノアッセイにおいて使用され得る。

【0177】

そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、放射標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され、蛍光マーカーは、光検出器を用いて検出されることにより、放射された照度が検出され得る。酵素標識は、代表的には、その酵素に基質を提供し、その基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を検出することによって検出され、比色標識は、単純に有色の標識を可視化することによって検出される。

【0178】

１つの実施形態において、血液サンプルなどの生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出するためのキットが提供される。ポリペプチドを検出するためのキットは、代表的には、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体のいずれか）を備える。いくつかの実施形態において、Ｆｖフラグメントなどの抗体フラグメントが、そのキットに含められる。インビボで使用するために、その抗体は、ｓｃＦｖフラグメントであり得る。さらなる実施形態において、その抗体は、標識されている（例えば、蛍光標識、放射標識または酵素標識で）。

【0179】

１つの実施形態において、キットは、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体を使用する手段を開示している指示材料を備える。その指示材料は、書面、電子的形態（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク）、または視覚によるもの（例えば、ビデオファイル）であり得る。そのキットは、そのキットが意図されている特定の用途を容易にする追加の構成要素も備え得る。したがって、例えば、そのキットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに備え得る。そのキットは、特定の方法を実施するために日常的に使用されるバッファーおよび他の試薬をさらに備え得る。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。

【0180】

１つの実施形態において、診断キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、使用される特定の形式によって変化し得るが、生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する方法は、通常、免疫学的に反応性の条件下でエンドプラスミンと特異的に反応する抗体とその生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。その抗体は、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合することが可能になることで免疫複合体を形成し、その免疫複合体（結合した抗体）の存在が、直接または間接的に検出される。

【0181】

Ｖ．エンドプラスミン抗体のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本明細書中に提供されるポリペプチド（抗体、その抗原結合フラグメント、免疫結合体および融合タンパク質を含むがこれらに限定されない）をコードする核酸分子（ポリヌクレオチドとも称される）は、本明細書中に提供されるアミノ酸配列、当該分野において入手可能な配列および遺伝暗号を用いて、当業者によって容易に作製され得る。さらに、当業者は、機能的に等価な核酸（例えば、配列が異なるが同じエフェクター分子または抗体配列をコードする核酸）を含む種々のクローンを容易に構築することができる。したがって、抗体、結合体および融合タンパク質をコードする核酸が、本明細書中に提供される。

【0182】

いくつかの実施形態において、エンドプラスミンヒトモノクローナル抗体は、配列番号３を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶ_Ｈドメインを有する。いくつかの実施形態において、エンドプラスミンヒトモノクローナル抗体は、配列番号４を含むヌクレオチド配列によってコードされるＶ_Ｌドメインを有する。例示的な核酸配列は、下記に提供される：

【0183】

【化5】

【0184】

【化6】

【0185】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはエンドプラスミンに特異的に結合するその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニング、またはＮａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９，１９７９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１，１９７９のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２，１９８１のジエチルホスホルアミダイト法；例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８，１９８４に記載されているように、例えば自動合成装置を用いた、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２（２０）：１８５９−１８６２，１９８１に記載されている固相ホスホルアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接的な化学的合成を含む任意の好適な方法によって調製され得る。化学的合成は、一本鎖のオリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的な配列とのハイブリダイゼーション、またはその一本鎖を鋳型として使用してＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって二本鎖ＤＮＡに変換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学的合成が、通常、約１００塩基の配列に限定されるが、それより長い配列は、より短い配列のライゲーションによって得られる場合があることを認識することになる。

【0186】

エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはエンドプラスミンに特異的に結合するその機能的フラグメントをコードする例示的な核酸は、クローニング法によって調製され得る。適切なクローニング法および配列決定法の例、ならびに多くのクローニングの実施を通じて当業者を導くのに十分な指示は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ｂｅｒｇｅｒ
ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ（ｅｄｓ．），前出およびＡｕｓｕｂｅｌ，前出に見られる。生物学的試薬および実験機器の製造者からの製品情報もまた、有用な情報を提供する。そのような製造者としては、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ならびに当業者に公知の他の多くの商業的供給源が挙げられる。

【0187】

天然のエフェクター分子（ＥＭ）または抗エンドプラスミン抗体をコードする核酸は、本開示のＥＭ、抗体または免疫結合体を形成するために改変され得る。部位特異的変異誘発による改変が、当該分野で周知である。核酸は、増幅法によっても調製され得る。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）が挙げられる。多種多様のクローニング法、宿主細胞およびインビトロ増幅法が、当業者に周知である。

【0188】

１つの実施形態において、免疫結合体は、ヒトエンドプラスミン特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするｃＤＮＡを、ＥＭをコードするｃＤＮＡを含むベクターに挿入することによって調製される。その挿入は、その抗体およびＥＭが、機能的な抗体領域および機能的なＥＭ領域を含む１つの連続したポリペプチドとしてインフレームで読まれるように、行われる。１つの実施形態において、ＥＭ、標識または酵素をコードするｃＤＮＡは、そのＥＭ、標識または酵素が抗体のカルボキシル末端に配置されるように、その抗体にライゲートされる。別の実施形態において、そのＥＭ、標識または酵素は、抗体のアミノ末端に配置される。別の例では、ＥＭ、標識または酵素をコードするｃＤＮＡは、そのＥＭ、標識または酵素が重鎖可変領域のカルボキシル末端に配置されるように、抗体の重鎖可変領域にライゲートされる。続いて、その重鎖可変領域は、ジスルフィド結合を用いてその抗体の軽鎖可変領域にライゲートされ得る。なおも別の例では、ＥＭ、標識または酵素をコードするｃＤＮＡは、そのＥＭ、標識または酵素が軽鎖可変領域のカルボキシル末端に配置されるように、抗体の軽鎖可変領域にライゲートされる。続いて、その軽鎖可変領域は、ジスルフィド結合を用いてその抗体の重鎖可変領域にライゲートされ得る。

【0189】

いったん、ＥＭ、抗エンドプラスミン抗体、その抗原結合フラグメントまたは免疫結合体をコードする核酸が単離され、クローニングされると、組換え的に操作された細胞（例えば、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物の細胞）において所望のタンパク質が発現され得る。当業者は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母および様々な高等真核細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびミエローマ細胞株）を含む、タンパク質の発現のために利用可能な数多くの発現系に精通していると予想される。

【0190】

上記抗体またはそのフラグメントをコードする１つ以上のＤＮＡ配列は、好適な宿主細胞にＤＮＡを移行させることによってインビトロにおいて発現され得る。その細胞は、原核生物または真核生物の細胞であり得る。その用語は、対象の宿主細胞の任意の子孫も包含する。複製中に生じる変異が存在し得るので、すべての子孫が親細胞と同一でない可能性があることが理解される。安定的な移行（外来ＤＮＡが宿主において持続的に維持されることを意味する）の方法は、当該分野で公知である。目的の抗体を発現するハイブリドーマもまた、本開示によって包含される。

【0191】

本明細書中に記載される単離された抗体および抗体フラグメントをコードする核酸の発現は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを異種プロモーター（構成的または誘導性である）に作動可能に連結した後、それを発現カセットに組み込むことによって達成され得る。それらのカセットは、原核生物または真核生物における複製および組み込みに好適であり得る。代表的な発現カセットは、上記タンパク質をコードするＤＮＡの発現の制御に有用な特定の配列を含む。例えば、その発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質をコードする遺伝子の前に存在する開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするその遺伝子の正しい読み枠の維持、および終止コドンを含み得る。

【0192】

クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るために、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを最低限含む発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌の場合、これは、プロモーター（例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはラムダプロモーター）、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合、調節配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスに由来する、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み得、さらにスプライスドナー配列およびアクセプター配列を含み得る。上記カセットは、周知の方法（例えば、大腸菌の場合は形質転換またはエレクトロポレーション、および哺乳動物細胞の場合はリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクション）によって、選択された宿主細胞に移入され得る。それらのカセットによって形質転換された細胞は、そのカセットに含まれる遺伝子（例えば、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子）によって付与された抗生物質に対するｍによって選択され得る。

【0193】

宿主が真核生物であるとき、上記のようなリン酸カルシウム共沈物としてのＤＮＡのトランスフェクションの方法、従来の機械的手順（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入）またはウイルスベクターが使用され得る。また、真核細胞は、抗体、標識された抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列と、選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）とで共形質転換され得る。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を使用することにより、真核細胞を一過性に感染させるかまたは形質転換し、タンパク質を発現させる（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｄ．，１９８２を参照のこと）。当業者は、発現系（例えば、高等真核細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびミエローマ細胞株）を含む細胞においてタンパク質を産生する際に有用なプラスミドおよびベクター）を容易に使用することができる。

【0194】

本明細書中に記載されるポリペプチド（すなわち、ヒトエンドプラスミン特異的モノクローナル抗体またはその抗体を含む免疫結合体）をコードする核酸に対して、その生物学的活性を低下させずに、改変が行われ得る。いくつかの改変は、標的化分子のクローニング、発現または融合タンパク質への組み込みを促進するように行われ得る。そのような改変は、当業者に周知であり、それらとしては、例えば、終止コドン、開始部位を提供するためにアミノ末端に付加されるメチオニン、好都合に配置される制限酵素認識部位を作製するためにいずれかの末端に配置される追加のアミノ酸、または精製工程において役立つ追加のアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）が挙げられる。組換え法に加えて、本開示の免疫結合体、エフェクター部分および抗体は、当該分野で周知の標準的なペプチド合成法を用いることによっても、全体的にまたは部分的に構築され得る。

【0195】

組換え免疫結合体、抗体および／またはエフェクター分子は、いったん発現されると、当該分野の標準的な手順（硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含む）に従って精製され得る（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２を広く参照のこと）。その抗体、免疫結合体およびエフェクター分子は、１００％純粋である必要はない。いったん、要望どおり部分的にまたは均一に（治療的に使用される場合）精製されると、そのポリペプチドは、エンドトキシンを実質的に含むべきでない。

【0196】

大腸菌などの細菌から単鎖抗体を発現するための方法および／または適切な活性型（単鎖抗体を含む）にリフォールディングする方法は、報告されており、周知であり、本明細書中に開示される抗体に適用可能である。Ｂｕｃｈｎｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０，１９９２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：５４５，１９９１；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５，１９８９およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４，１９８９（すべてが本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0197】

しばしば、大腸菌または他の細菌由来の機能的な異種タンパク質が、封入体から単離されるが、それは、強力な変性剤を用いた可溶化およびその後のリフォールディングを必要とする。当該分野で周知であるように、ジスルフィド結合を切り離すためには、可溶化工程中に還元剤が存在しなければならない。還元剤を含む例示的な緩衝液は：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、６Ｍグアニジン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３Ｍ ＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。ジスルフィド結合の再酸化は、Ｓａｘｅｎａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：５０１５−５０２１，１９７０（本明細書中で参考として援用される）に記載されているように、また、特に、Ｂｕｃｈｎｅｒら、前出に記載されているように、還元型および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下において生じ得る。

【0198】

再生は、代表的には、変性され還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液に希釈すること（例えば、１００倍）によって達成される。例示的な緩衝液は、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および２ｍＭ ＥＤＴＡである。

【0199】

２本鎖抗体（ｔｗｏ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）精製プロトコルに対する変法として、重鎖領域および軽鎖領域は、別々に可溶化され、還元され、次いで、リフォールディング溶液中で混和される。これらの２つのタンパク質が、一方のタンパク質が他方に対して５倍モル過剰であることを超えないようなモル比で混合されるとき、例示的な収量が得られる。酸化還元シャフリングが完了した後、過剰な酸化型グルタチオンまたは他の低分子量の酸化化合物が、リフォールディング溶液に加えられ得る。

【0200】

組換え法に加えて、本明細書中に開示される抗体、標識抗体およびそれらの抗原結合フラグメントは、標準的なペプチド合成法を用いることによっても、全体的にまたは部分的に構築され得る。約５０アミノ酸長未満のポリペプチドの固相合成は、その配列のＣ末端のアミノ酸を不溶性の支持体に結合させた後、その配列における残りのアミノ酸を逐次的に付加することによって、達成され得る。固相合成のための手法は、Ｂａｒａｎｙ＆Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ．ｐｐ．３−２８４；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５６，１９６３およびＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，１９８４に記載されている。より長いタンパク質は、より短いフラグメントのアミノ末端とカルボキシル末端との縮合によって合成され得る。カルボキシル末端の活性化によってペプチド結合を形成する方法（例えば、結合試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｍｉｄｅ）を使用することによる方法）は、当該分野で周知である。

【0201】

ＶＩ．組成物および治療方法
キャリア、およびエンドプラスミンに特異的に結合する抗体またはエンドプラスミンに特異的に結合するその抗原結合フラグメントの１つ以上を含む組成物が本明細書中に提供される。免疫結合体または免疫毒素を含む組成物も提供される。それらの組成物は、被験体に投与するための単位剤形で調製され得る。投与の量およびタイミングは、所望の目的を達成するために、処置している医師の判断による。その抗体は、全身性投与または局所（例えば、腫瘍内）投与のために製剤化され得る。１つの例において、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体は、静脈内投与などの非経口投与のために製剤化される。

【0202】

投与するための組成物は、水性キャリアなどの薬学的に許容され得るキャリアに溶解された、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体（またはエンドプラスミンに特異的に結合するその機能的フラグメント）の溶液を含み得る。種々の水性キャリア、例えば、緩衝食塩水などが使用され得る。これらの溶液は、滅菌されており、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌法によって滅菌され得る。それらの組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。これらの製剤における抗体の濃度は、広く変動し得、選択される特定の投与様式および被験体の要望に従って、主に液量、粘度、体重などに基づいて選択され得る。

【0203】

静脈内投与用の代表的な薬学的組成物は、１日あたり被験体１人あたり約０．１〜１０ｍｇの抗体を含む。特に、その薬剤が隔離された部位に投与される場合、および循環系またはリンパ系（例えば、体腔または器官の管腔）に投与されない場合、１日あたり被験体１人あたり０．１から約１００ｍｇまでの投薬量が使用され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）のような刊行物に詳細に記載されている。

【0204】

抗体は、凍結乾燥された形態で提供され得、投与前に滅菌水で再水和され得るが、それらは、既知濃度の滅菌された溶液としても提供される。次いで、その抗体溶液は、０．９％塩化ナトリウム，ＵＳＰを含む輸液バッグに加えられ、そして代表的には、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で投与される。１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の承認以来、米国で販売されている抗体薬の投与について当該分野においてかなりの経験が入手可能である。抗体は、静脈内プッシュまたはボーラスではなく緩徐な注入によって投与され得る。１つの例において、より多い負荷用量が投与され、続いて、低レベルの維持用量が投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇという最初の負荷用量が、およそ９０分間にわたって注入された後、先の用量が十分に許容されていた場合、４〜８週間にわたって１週間に１回、２ｍｇ／ｋｇという維持用量が、３０分間にわたって注入され得る。

【0205】

エンドプラスミンに特異的に結合する抗体（もしくはその抗原結合フラグメントまたはそれらの免疫結合体）は、がん細胞などの細胞の成長を遅延させるためまたは阻害するために投与され得る。これらの用途において、治療有効量の抗体が、がん細胞の成長、複製もしくは転移を阻害するのに十分な量、またはがんの徴候もしくは症状を阻害するのに十分な量で被験体に投与される。いくつかの実施形態において、それらの抗体は、転移の発生を阻害するためもしくは予防するために、または転移（ｍｅｔａｓａｓｅｓ）（例えば、微小転移、例えば、領域リンパ節への微小転移）のサイズもしくは数を減少させるために、被験体に投与される（Ｇｏｔｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４（１１）：３４０１−３４０７，２００８）。

【0206】

好適な被験体には、エンドプラスミンを発現するがん（例えば、メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんであるがこれらに限定されない）と診断された被験体が含まれ得る。ヒトエンドプラスミン特異的抗体の治療有効量は、その疾患の重症度および患者の全体的な健康状態に依存する。その抗体の治療有効量は、症状（複数可）の主観的な軽減、または臨床医もしくは他の資格のある観察者が注目したときに客観的に識別可能な改善を提供する量である。これらの組成物は、別の化学療法因子と併せて、同時にまたは逐次的に投与され得る。

【0207】

現在、多くの化学療法因子が当該分野で公知である。１つの実施形態において、その化学療法因子は、有糸分裂インヒビター、アルキル化剤、抗代謝産物、挿入性抗生物質、成長因子インヒビター、細胞周期インヒビター、酵素、トポイソメラーゼインヒビター、抗生存剤（ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｇｅｎｔｓ）、生物学的応答変更物質、抗ホルモン剤、例えば、抗アンドロゲン剤、および抗血管新生剤からなる群から選択される。

【0208】

抗血管新生剤（例えば、ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）インヒビター、ＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）インヒビターおよびＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）インヒビター）が、本発明の化合物とともに使用され得る。有用なＣＯＸ−ＩＩインヒビターの例としては、ＣＥＬＥＢＲＥＸ^ＴＭ（セレコキシブ（ａｌｅｃｏｘｉｂ））、バルデコキシブおよびロフェコキシブが挙げられる。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターの例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開）、欧州特許出願番号９７３０４９７１．１（１９９７年７月８日出願）、欧州特許出願番号９９３０８６１７．２（１９９９年１０月２９日出願）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開）、欧州特許公開６０６，０４６（１９９４年７月１３日公開）、欧州特許公開９３１，７８８（１９９９年７月２８日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開）、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３（１９９８年７月２１日出願）、欧州特許出願番号９９３０２２３２．１（１９９９年３月２５日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）および欧州特許公開７８０，３８６（１９９７年６月２５日公開）に記載されている。１つの例において、上記ＭＭＰインヒビターは、投与しても関節痛を誘導しない。別の例では、上記ＭＭＰインヒビターは、他のマトリックス−メタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２およびＭＭＰ−１３）と比べてＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害する。有用なＭＭＰインヒビターのいくつかの特定の例は、ＡＧ−３３４０、ＲＯ３２−３５５５、ＲＳ１３−０８３０、３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−エキソ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；（Ｒ）３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；３−エキソ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサビシクロ（ｏｘａｉｃｙｃｌｏ）［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；３−エンド−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ（ｉｃｙｃｌｏ）［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および（Ｒ）３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；ならびに前記化合物の薬学的に許容され得る塩および溶媒和化合物である。

【0209】

エンドプラスミンに特異的に結合する抗体はまた、シグナル伝達インヒビター（例えば、ＥＧＦ−Ｒ（上皮成長因子レセプター）応答を阻害し得る物質、例えば、ＥＧＦ−Ｒ抗体、ＥＧＦ抗体、およびＥＧＦ−Ｒインヒビターである分子；ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）インヒビター、例えば、ＶＥＧＦレセプターおよびＶＥＧＦを阻害し得る分子；ならびにｅｒｂＢ２レセプターインヒビター、例えば、ｅｒｂＢ２レセプターに結合する有機分子または抗体、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ^ＴＭ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））とともに使用され得る。ＥＧＦ−Ｒインヒビターは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、ＷＯ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公開）、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）および米国特許第５，７４７，４９８号（１９９８年５月５日発行）に記載されている。ＥＧＦＲ阻害物質としては、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ ２２Ｍａｂ（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ／Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、ＥＭＤ−５５９０（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、ＭＤＸ−４４７／Ｈ−４７７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ．およびＭｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、ならびに化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＣＰ７０１（Ｃｅｐｈａｌｏｎ）、レフルノミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｕｇｅｎ）、Ｃｌ−１０３３（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、Ｃｌ−１０３３／ＰＤ１８３，８０５（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、ＣＬ−３８７，７８５（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）、ＢＢＲ−１６１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ／Ｒｏｃｈｅ）、Ｎａａｍｉｄｉｎｅ Ａ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＲＣ−３９４０−ＩＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＢＩＢＸ−１３８２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＯＬＸ−１０３（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）、ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ＥＧＦ融合毒素（Ｓｅｒａｇｅｎ Ｉｎｃ．）、ＤＡＢ−３８９（Ｓｅｒａｇｅｎ／Ｌｉｌｇａｎｄ）、ＺＭ−２５２８０８（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ）、ＲＧ−５０８６４（ＩＮＳＥＲＭ）、ＬＦＭ−Ａ１２（Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＷＨＩ−Ｐ９７（Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ）、ＫＴ−８３９１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ）およびＥＧＦ−Ｒ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ／Ｃｅｎｔｒｏ ｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（ＣＩＭ））も挙げられるが、これらに限定されない。

【0210】

ＶＥＧＦインヒビター、例えば、ＳＵ−５４１６およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ Ｉｎｃ．）、ＳＨ−２６８（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）ならびにＮＸ−１８３８（ＮｅＸｓｔａｒ）もまた、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体とともに使用され得る。ＶＥＧＦインヒビターは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公開）、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７（１９９９年５月３日出願）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公開）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日発行）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日公開）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日発行）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公開）およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）に記載されている。いくつかの特定のＶＥＧＦインヒビターの他の例は、ＩＭ８６２（Ｃｙｔｒａｎ Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体；ならびにＲｉｂｏｚｙｍｅおよびＣｈｉｒｏｎ製の合成リボザイムであるアンギオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）である。これらのおよび他のＶＥＧＦインヒビターが、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体とともに使用され得る。

【0211】

ＥｒｂＢ２レセプターインヒビター（例えば、ＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ ｐｉｃ）ならびにモノクローナル抗体ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）および２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ））、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公開）、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）および米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に示されているものは、本発明の化合物とさらに併用され得る。有用なＥｒｂＢ２レセプターインヒビターは、１９９９年１月２７日出願の米国仮出願番号６０／１１７，３４１および１９９９年１月２７日出願の米国仮出願番号６０／１１７，３４６にも記載されている。

【0212】

エンドプラスミンに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合フラグメント）は、サイトカインもしくはケモカインとともに使用され得、そして／またはそれらに結合体化され得るか、あるいはサイトカインもしくはケモカインに結合体化され得る。例示的なサイトカインとしては、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）；腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）メンバー；ヒト成長ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトーゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｉｏｎ）（ＴＮＦ）−α；ＴＮＦ−β；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子（ＮＧＦ）、例えば、ＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−α；ＴＧＦ−β；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−２１）、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジンならびにエンドスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。好適なケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１およびフラクタルカインが挙げられるが、これらに限定されない。

【0213】

メラノーマなどのがんを処置する場合、本明細書中に開示される抗体は、外科的処置、または別の治療薬（ダカルバジン（ＤＴＩＣとも呼ばれる）、テモゾロミド、ＰＡＲＰインヒビターまたはインターロイキン−２（ＩＬ−２）もしくはインターフェロン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）、あるいはこれらの薬剤の組み合わせを含む）とともに使用され得る。表在型メラノーマの処置の場合、それらの抗体は、イミキモドとともに使用され得る。頭頸部扁平上皮癌の処置の場合、本明細書中に提供される抗体は、外科術、放射線治療、化学療法、他の抗体（例えば、セツキシマブおよびベバシズマブ）または小分子治療薬（例えば、エルロチニブ）とともに使用され得る。

【0214】

上記組成物の単回投与または複数回投与は、患者が必要とし、許容する投与量および頻度に応じて投与される。いかなる事象においても、その組成物は、患者を効率的に処置するのに十分な量の本明細書中に開示される少なくとも１つの抗体（またはその抗原結合フラグメント）を提供するべきである。その投与量は、１回投与され得るが、治療結果が達成されるまでまたは副作用が治療の中止の根拠となるまで周期的に適用され得る。１つの例において、ある用量の抗体が、１日おきに３０分間注入される。この例では、約１〜約１０用量が、投与され得る（例えば、３または６用量が１日おきに投与され得る）。さらなる例では、約５〜約１０日間にわたって持続注入が行われる。所望の治療結果が達成されるまで、被験体は、毎月などの一定間隔で処置され得る。一般に、その用量は、患者に対して許容できない毒性をもたらさずに、疾患の症状または徴候を処置するかまたは回復させるのに十分である。

【0215】

制御放出の非経口製剤が、埋没物、油性注射剤または微粒子系として作製され得る。タンパク質送達系の概観については、本明細書中で参考として援用されるＢａｎｇａ，Ａ．Ｊ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，（１９９５）を参照のこと。微粒子系には、ミクロスフェア、微小粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子が含まれる。マイクロカプセルは、細胞毒または薬物などの治療用タンパク質を中央のコアとして含む。ミクロスフェアでは、治療薬は、粒子全体に分散されている。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフェアおよびマイクロカプセルは、一般にそれぞれナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと称される。毛細血管は、およそ５μｍの直径を有するので、ナノ粒子だけが静脈内に投与される。微小粒子は、代表的には、直径がおよそ１００μｍであり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Ｋｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．２１９−３４２（１９９４）；およびＴｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂｉ，Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３１５−３３９，（１９９２）（その両方が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

【0216】

本明細書中に開示される抗体組成物のイオン制御放出のために、ポリマーが使用され得る。制御された薬物送達において使用するための様々な分解可能および分解不可能な重合体マトリックスが当該分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７−５４２，１９９３）。例えば、ブロック共重合体であるポロキサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温では粘稠性であるが流動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。それは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤化および持続性送達にとって有効なビヒクルであると示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５−４３４，１９９２；およびＰｅｃら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８−６５，１９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５−２２４，１９９４）。さらに別の態様では、リポソームは、脂質のカプセルに入っている薬物の制御放出ならびに薬物標的化のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ（１９９３））。治療用タンパク質の制御された送達のためのさらなる系が数多く知られている（米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，１８８，８３７号；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；米国特許第４，８３７，０２８号；米国特許第４，９５７，７３５号；米国特許第５，０１９，３６９号；米国特許第５，０５５，３０３号；米国特許第５，５１４，６７０号；米国特許第５，４１３，７９７号；米国特許第５，２６８，１６４号；米国特許第５，００４，６９７号；米国特許第４，９０２，５０５号；米国特許第５，５０６，２０６号；米国特許第５，２７１，９６１号；米国特許第５，２５４，３４２号および米国特許第５，５３４，４９６号を参照のこと）。

【0217】

エフェクター分子に共有結合的に連結された、エンドプラスミンに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射免疫療法または放射免疫ガイド下手術をはじめとした種々の目的のために使用され得る。例えば、エンドプラスミン抗体は、放射性同位元素に連結され得、そしてエンドプラスミンを発現している腫瘍を処置する免疫療法において使用され得る。放射性同位元素に共有結合的に連結されたヒトエンドプラスミン抗体は、放射免疫ガイド下手術において腫瘍の位置を突き止めるために有用であり、その結果、その腫瘍を外科的に除去することができる。１つの実施形態において、約１０ｍＣｉの放射標識されたヒトエンドプラスミンモノクローナル抗体が、被験体に投与される。他の実施形態において、約１５ｍＣｉ、約２０ｍＣｉ、約５０ｍＣｉ、約７５ｍＣｉまたは約１００ｍＣｉの放射標識されたヒトエンドプラスミンモノクローナル抗体が、被験体に投与される。他の実施形態において、約１００ｍＣｉ〜約１００ｍＣｉの放射標識された（ｒａｄｉｏｌａｂｌｅｄ）ヒトエンドプラスミンモノクローナル抗体が、被験体に投与される。

【0218】

被験体における腫瘍をインビボで検出する方法は、放射性同位元素などのエフェクター分子と複合体化された、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を包含する。投与された放射標識抗体が腫瘍に局在化するのを可能にするのに十分な時間が経過した後、その腫瘍は検出される。１つの特定の非限定的な例において、放射標識された免疫複合体は、手持ち式のガンマ検出プローブを用いて検出される。いくつかの実施形態において、その腫瘍は、ＭＲＩ、ＣＴスキャンまたはＰＥＴスキャンによって検出される。エンドプラスミンを発現している原発腫瘍、転移した腫瘍または細胞が検出され得る。例えば、放射性同位元素などのエフェクター分子と複合体化されたヒトエンドプラスミンモノクローナル抗体が、外科術または処置の前に被験体に投与される。１つの特定の実施形態において、検出工程が外科術の前に行われることにより、腫瘍の位置が突き止められる。別の実施形態において、検出工程は、放射免疫ガイド下手術におけるように、外科術中に行われることにより、例えば、腫瘍の位置が検出された後、除去される。放射性同位元素などのエフェクター分子と複合体化されたヒトエンドプラスミンモノクローナル抗体は、外科術または処置の後にも被験体に投与され得、それにより、その処置の有効性が判定される（例えば、腫瘍の完全な除去が保証されるか、または腫瘍の再発が検出される）。したがって、それらの抗体は、治療薬として（例えば、腫瘍に対する免疫療法の場合）、または放射免疫ガイド下手術を行うために、有用である。

【0219】

ＶＩ．診断方法およびキット
エンドプラスミンの発現をインビトロで検出するための方法が本明細書中に提供される。１つの例において、エンドプラスミンの発現は、生物学的サンプルにおいて検出される。そのサンプルは、任意のサンプルであり得、それらとしては、バイオプシー、オートプシーおよび病理検体由来の組織が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的サンプルには、組織の切片、例えば、組織学的目的のために採取された凍結切片も含まれる。生物学的サンプルには、さらに、血液、血清、血漿、痰、髄液または尿などの体液が含まれる。

【0220】

いくつかの実施形態において、悪性病変（例えば、扁平上皮癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌）、メラノーマ、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がん）を検出するための方法が提供される。エンドプラスミンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、被験体内のがんを検出するため、または被験体におけるがんの診断を確認するために、被験体由来の血清サンプル中のエンドプラスミンを検出するために使用され得る。それらの抗体は、転移性の病変の元の病変を特定するためにも使用され得る。

【0221】

本開示は、生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出するための方法を提供し、ここで、その方法は、エンドプラスミンに結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントと生物学的サンプルとを、免疫複合体の形成をもたらす条件下で接触させる工程、およびその免疫複合体を検出することにより、その生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する工程を包含する。１つの例において、サンプル中のエンドプラスミンの検出は、被験体が悪性病変を有することを示す。別の例では、サンプル中のエンドプラスミンの検出は、被験体におけるがんの診断を確認するものである。さらなる例では、エンドプラスミンの検出は、転移の存在を確認するかまたは検出するものである。

【0222】

いくつかの実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、被験体内の腫瘍の検出または診断（例えば、被験体における腫瘍の診断の確認）のために使用される。他の実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療の有効性を検出するために使用される。例えば、エンドプラスミンを発現すると知られる悪性病変を有する被験体に治療薬が投与される。その方法は、エンドプラスミンに結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントと生物学的サンプルとを、免疫複合体の形成をもたらす条件下で接触させる工程、およびその免疫複合体を検出することにより、生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する工程を包含し得る。処置前の被験体由来のサンプルまたは対照基準などのコントロールと比較したときのエンドプラスミンの量の減少は、その治療薬がその悪性病変の処置に有効であることを示す。いくつかの例において、コントロールと比較したときのエンドプラスミンの量の増加は、その治療薬がその悪性病変の処置に有効でないことを示す。

【0223】

いくつかの実施形態において、検出は、インビボにおける検出であり得る。エンドプラスミンに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射性同位元素と複合体化され得る。投与された放射標識抗体が腫瘍に局在化するのを可能にするのに十分な時間が経過した後、その腫瘍は、ＭＲＩ、ＣＴスキャンまたはＰＥＴスキャンなどによって検出される（上記を参照のこと）。

【0224】

１つの実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識で直接標識される。別の実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメント（一次抗体）は、標識されず、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体に結合し得る二次抗体または他の分子が、標識される。当業者に周知であるように、特定の種およびクラスの一次抗体に特異的に結合することができる二次抗体が選択される。例えば、一次抗体が、ヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒトＩｇＧであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、プロテインＡおよびプロテインＧ（この両方ともが商業的に入手可能である）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0225】

上記抗体または二次抗体に適した標識は、上に記載されており、それらとしては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁性物質および放射性材料が挙げられる。好適な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的かつ例示的な発光材料は、ルミノールであり；非限定的かつ例示的な磁性物質は、ガドリニウムであり、非限定的かつ例示的な放射性標識としては、^３５Ｓ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^９９ｍＴｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎおよび^１２５Ｉが挙げられる。

【0226】

代替の実施形態において、エンドプラスミンは、検出可能な物質で標識されたエンドプラスミン標準物質およびエンドプラスミンに特異的に結合する標識されていないヒト抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このアッセイでは、生物学的サンプル、標識されたエンドプラスミン標準物質およびエンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントが混合され、標識されていない抗体に結合した標識されたエンドプラスミン標準物質の量が測定される。生物学的サンプル中のエンドプラスミンの量は、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに結合した標識されたエンドプラスミン標準物質の量に反比例する。

【0227】

本明細書中に開示されるイムノアッセイおよび方法は、いくつかの目的のために使用され得る。１つの実施形態において、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞培養物中の細胞内のエンドプラスミンの産生を検出するために使用され得る。別の実施形態において、その抗体は、生物学的サンプル中のエンドプラスミンの量を検出するために使用され得る。エンドプラスミンの高発現は、いくつかのタイプのがん（メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんが挙げられるがこれらに限定されない）に関連する。１つの実施形態において、生物学的サンプル（例えば、血清サンプルまたは組織サンプル）中のエンドプラスミンを検出するためのキットが提供される。例えば、被験体におけるがんの診断を確認するために、組織学的検査用の組織サンプルを得るためにバイオプシーが行われ得る。あるいは、エンドプラスミンタンパク質の存在を検出するために、血清サンプルを得てもよい。ポリペプチドを検出するためのキットは、代表的には、エンドプラスミンに特異的に結合するヒト抗体（例えば、本明細書中に開示される抗体のいずれか）を備える。いくつかの実施形態において、抗体フラグメント（例えば、ＦｖフラグメントもしくはｓｃＦｖまたはＦａｂ）がそのキットに含められる。さらなる実施形態において、その抗体は、標識される（例えば、蛍光標識、放射性標識または酵素標識で）。

【0228】

１つの実施形態において、キットは、エンドプラスミンに特異的に結合する抗体を使用する手段を開示している指示材料を備える。その指示材料は、書面、電子的形態（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク）、または視覚によるもの（例えば、ビデオファイル）であり得る。そのキットは、そのキットが意図されている特定の用途を容易にする追加の構成要素も備え得る。したがって、例えば、そのキットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識に対する酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体などの適切な二次標識など）をさらに備え得る。そのキットは、特定の方法を実施するために日常的に使用されるバッファーおよび他の試薬をさらに備え得る。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。

【0229】

１つの実施形態において、診断キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、使用される特定の形式によって変化し得るが、生物学的サンプル中のエンドプラスミンを検出する方法は、通常、免疫学的に反応性の条件下でエンドプラスミンポリペプチドと特異的に反応する抗体または抗体フラグメントとその生物学的サンプルとを接触させる工程を包含する。その抗体は、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合することが可能になることで免疫複合体を形成し、その免疫複合体（結合した抗体）の存在が、直接または間接的に検出される。

【0230】

上記抗体が、被験体におけるがんを検出するためまたはがんの診断を確認するために使用されるとき、その診断に関する情報は、電子媒体または紙媒体などの表現媒体上に表示され得る。電子媒体としては、例えば、コンピュータデータベース、ディスプレイモニターまたは電子的医療記録が挙げられ得る。紙媒体としては、例えば、研究室または臨床医によって記録された検査結果または紙の記録が挙げられる。

【0231】

いくつかの実施形態において、いったん腫瘍（例えば、メラノーマ）の診断が行われたら、被験体は、その腫瘍（例えば、メラノーマ）について処置される。例えば、その処置は、原発性もしくは転移性の病変の外科的切除、および／またはその疾患を処置するための化学療法レジメンの投与を含み得る。

【0232】

細胞表面マーカーの存在または非存在を判定する方法は、当該分野で周知である。例えば、上記抗体が、他の化合物（酵素、磁気ビーズ、コロイド状の磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物を含むがこれらに限定されない）に結合体化され得る。その抗体は、イムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学的アッセイであるがこれらに限定されない）においても利用され得る。その抗体は、蛍光顕微鏡観察または蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）のためにも使用され得る。ＦＡＣＳは、細胞を分離するためまたは分取するために、他の洗練された検出レベル中でも複数のカラーチャネル、小角光散乱検出チャネルおよび鈍角光散乱検出チャネル、ならびにインピーダンスチャネルを使用する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照のこと）。本明細書中に開示されるようなエンドプラスミンに特異的に結合するいずれのヒト抗体も、これらのアッセイにおいて使用することができる。したがって、それらの抗体は、従来のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタンブロットまたは免疫沈降を含むがこれらに限定されない）において使用され得る。

【0233】

別段説明されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「および」を含むと意図される。核酸またはポリペプチドに対して与えられたすべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量の値が、近似値であり、説明のために提供されていることが、さらに理解されるべきである。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価の方法および材料は、本開示の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が、下記に記載される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の全体が、参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、その材料、方法および例は、単なる例示であって、限定すると意図されていない。

【0234】

本開示は、以下の非限定的な実施例によって例証される。

【実施例】

【0235】

有力な臨床エビデンスから、抗体ベースの免疫療法が、血液学的悪性腫瘍および固形腫瘍の処置において有効であり得ることが示された。開発された抗体の特異性に対する腫瘍抗原の免疫原性の影響を排除するために、合成ファージ一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）ライブラリーを使用して、悪性細胞上でアップレギュレートされる細胞表面分子を認識するヒト抗体が単離された。エンドプラスミンに特異的に結合する抗体が単離された。

【0236】

ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ１１５８を用いた合成ファージｓｃＦｖライブラリーのパニングによって、大パネルのヒト細胞株と高反応性を示すＷ９という名称のｓｃＦｖフラグメントが単離された。細胞株からｓｃＦｖ Ｗ９によって免疫沈降された抗原のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、９４ＫＤａの構成要素が同定された。その抗原の発現が、ツニカマイシンとインキュベートされた細胞上では著しく減少したので、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される決定基は、炭水化物を含む。様々な細胞株からｓｃＦｖ Ｗ９によって免疫沈降されたバンドの質量分析ベースの解析によって、９０ＫＤａ分子シャペロンファミリーのメンバーであるエンドプラスミンとして９４ＫＤａの構成要素が同定された。この結論は、ヒトエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）とアミノ酸配列において９８．５％の相同性を示すエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）組換えイヌタンパク質に対するｓｃＦｖ Ｗ９の反応性によって裏づけられた。ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される決定基は、正常細胞上には発現されない。その抗体は、アポトーシスの誘導に有効であり、がん細胞の成長を阻害した。したがって、本明細書中に開示される結果は、ｓｃＦｖ Ｗ９などのエンドプラスミンに特異的に結合する抗体が、悪性疾患の免疫療法にとって有用であることを実証する。これらの抗体は、悪性疾患を検出するためにも使用され得る。

【0237】

実施例１
材料および方法
下記の実施例では、以下の材料および方法を使用した：
細胞株：ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ１１５８、ＭＶ３、ＣＯＬＯ３８、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ｍ１４およびＦＯ−１、ヒト乳癌腫細胞株ＳＵＭ１４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ヒト頭頸部がん細胞株ＰＣＩ−１３、ヒト膵臓細胞株Ｐａｎｃ２．０３、Ｐａｎｃ３．２７、Ｐａｎｃ１０．０５、ヒト結腸がん細胞株４０−１６、ヒト腎がん細胞株ＳＬＲ２１、ヒト前立腺がん細胞株Ｄｕ１４５、ヒト卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ３、ヒト神経膠腫がん細胞株Ｕ−１３８、ヒト子宮頸がん細胞株ＨｅＬａ、ならびにヒトＢリンパ系細胞株ＬＧ２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ＵＳＡ）中で維持した。ヒト膀胱がん細胞株Ｔ２４、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９、ヒト類表皮がん細胞株Ａ４３１、ヒト神経膠腫がん細胞株Ａ−１７２およびヒト２９３細胞株を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で増殖させた。細胞は、５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃において培養した。

【0238】

モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ抗体および試薬：Ｃ−ｍｙｃ腫瘍性タンパク質特異的マウスｍＡｂ ９Ｅ１０（Ｅｖａｎ，ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９８５ Ｄｅｃ；５（１２）：３６１０−６）およびＨＬＡ−クラスＩ抗原特異的マウスｍＡｂ ＴＰ２５．９９（Ｄ’Ｕｒｓｏら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１ Ｊａｎｕａｒｙ；８７（１）：２８４−２９２）は、以前に報告されている。抗抗ｉｄ ｓｃＦｖ ＃１１９（Ｗａｎｇら、１９９７．Ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ
ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｉｎ ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ｙ．Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ｋｅｎｎｅｄｙ，ａｎｄ Ｓ．Ｆｅｒｒｏｎｅ，ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．５２３）は、抗ｉｄ ｍＡｂ ＭＫ２−２３を用いたパニングによって、合成ｓｃＦｖライブラリー（＃１）（Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４．Ｅｍｂｏ Ｊ １３：６９２−６９８）から単離された。マウスｍＡｂは、逐次的な硫酸アンモニウム沈殿およびカプリル酸沈殿（Ｔｅｍｐｏｎｉら、１９８９，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８：８５−９５）によって腹水から精製された。ｍＡｂ調製物の純度および活性は、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび結合アッセイにおいて対応する抗原を用いた試験によって評価された。ＨＲＰ−抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。ヤギ抗マウスＩｇ抗体のＲ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）で標識されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）組換えイヌタンパク質は、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。

【0239】

ファージディスプレイライブラリー：ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体の半合成ファージライブラリーを、Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４，Ｅｍｂｏ Ｊ １３：６９２−６９８）に記載されているように構築した。

【0240】

ファージディスプレイｓｃＦｖ抗体の選択：メラノーマ細胞に結合するファージディスプレイｓｃＦｖ抗体を、以前に報告されたように（Ｎｏｒｏｎｈａら、１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：２９６８−２９７６）ファージディスプレイｓｃＦｖ抗体ライブラリーから単離した。簡潔には、ファージ粒子（１×１０^３）を、１×１０^７個のＷＭ１１５８メラノーマ細胞が入ったポリプロピレン培養チューブに加えた。Ｒ／Ｔで９０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで６回洗浄することによって、結合していないファージを除去した。２００μｌの０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ＝２．２）を加えることによって、結合したファージを溶出した。４回パニングを行った後、単離されたクローンを、ヒトＢリンパ系細胞であるＬＧ−２に吸着させることにより、ヒトメラノーマ細胞とリンパ系細胞によって共有されるＡｇに結合しているファージを除去した。

【0241】

結合アッセイ：腫瘍細胞株およびエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）組換えイヌタンパク質と可溶性ｓｃＦｖ Ｗ９抗体との反応性を試験するＥＬＩＳＡを、記載されているように（Ｎｏｒｏｎｈａら、１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：２９６８−２９７６）行った。結果は、４５０ｎｍにおける光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の吸光度として表現される。

【0242】

免疫沈降実験：ＷＭ１１５８細胞（３×１０^７）を洗浄し、ペレットにし、プロテアーゼインヒビターを含む１．５ｍｌの溶解緩衝液（１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｒｉｄｅ）を含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、４ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０）中で溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞溶解産物を１３，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清を回収し、ＰＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とインキュベートすることによって事前に精製し、１５μｇのｍＡｂ ９Ｅ１０およびｓｃＦｖ Ｗ９の周辺質調製物ならびに１１９（ネガティブコントロール）を事前に備えさせた１５μｌの充填プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが入ったチューブに移した。４℃で２時間インキュベートした後、ビーズをＰＢＳで４回、高塩緩衝液（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、０．１％ウシ血清アルブミン、１％ＮＰ４０）で２回、および溶解緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液中に溶出し、還元１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色した。

【0243】

ツニカマイシン処理：ＣＯＬＯ３８細胞を、０．５μｇ／ｍｌのツニカマイシン（ＭＰ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）の存在下、５％ＣＯ_２雰囲気、３７℃において７２時間培養した。ＤＭＳＯだけを含む培地中でインキュベートされた細胞をコントロールとして使用した。

【0244】

トランスフェクション：Ａｍａｘａヌクレオフェクション法を製造者の指示（Ａｍａｘａ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って使用して、２９３細胞を３μｇのＧｒｐ９４ ＨＳＰ９０Ｂ１ ｃＤＮＡクローン（Ｏｒｉｇｅｎｅ）でトランスフェクトした。ヌクレオフェクター（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）プログラムＱ−００１を使用した。トランスフェクションの後、直ちに細胞を、１０％ＦＢＳが補充された５００μｌの予め温めておいたＤＭＥＭ培養培地に懸濁し、加湿された３７℃の５％ＣＯ_２恒温器内において２４時間、６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクション効率を、ＧＦＰのフローサイトメトリー解析によって測定した。ｐＣＭＶ６−ＸＬ４ベクターをコントロールとして使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたトランスフェクションを、製造者の指示に従って行った。エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）ｓｉＲＮＡおよびコントロールｓｉＲＮＡ（フルオレセイン結合体）−Ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）による細胞のトランスフェクションを、製造者の指示に従って行った。

【0245】

以下の材料および方法も使用した（実施例５および９を参照のこと）：
細胞株、細胞溶解産物および組織。ヒトメラノーマ細胞株Ｍ２１、ＭＶ３およびＳＫ−ＭＥＬ−５、ヒト膵臓腺癌細胞株ＭｉａＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ１、ヒト神経膠腫細胞株Ｕ１３３８ＭＧ、ヒト乳癌細胞株ＳＵＭ１４９およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト中皮腫細胞株Ｐｈｉ、ヒト結腸がん細胞株ＲＫＯ、ヒト卵巣がんＯＶＣＡＲ３、ヒト肉腫細胞株ＨＴ１０８０、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＭＭ．８、ヒトＢリンパ系細胞株ＲＡＪＩ、ならびにマウスミエローマ細胞株ＮＳＯを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で維持した。細胞は、５％ＣＯ_２雰囲気中、３７℃において培養された。細胞溶解産物は、記載されているように（Ｄｅｓａｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８；５８（１１）：２４１７−２５）調製した。

【0246】

動物。Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤマウス（８〜１０週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃから入手した。

【0247】

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ｓｃＦｖ抗体および試薬。ＨＬＡクラスＩ抗原特異的マウスｍＡｂ ＴＰ２５．９９（Ｄｅｓａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００；１６５（６）：３２７５−８３）、カルネキシン特異的ｍＡｂ ＴＯ−５（充填コントロールして使用）を開発し、記載されているように（Ｏｇｉｎｏら、Ｔｉｓｓｕｅ
Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６２：３８５−３９３，２００３）特徴付けした。精製されたヒト免疫グロブリンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＦＡＫおよびリン酸化ＦＡＫ（Ｔｙｒ３９７）ならびにＥＲＫ１／２およびリン酸化４４／４２ＥＲＫ１／２、ＡＫＴおよびリン酸化４７３ＡＫＴ、ＭＥＴ リン酸化ＭＥＴ、ＰＫＣ、β−カテニン、Ｒａｓ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｃ−Ｒａｆ、切断型カスパーゼ−３、切断型カスパーゼ−７、ＳＨｈ、ＧＬＩ１およびβ−アクチンに特異的な抗体は、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびＣｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ラット抗エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）抗体は、ＳｔｒｅｓｓＧｅｎから購入した。マウスｍＡｂは、逐次的な硫酸アンモニウム沈殿およびカプリル酸沈殿（Ｔｅｍｐｏｎｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９８９；８（１）：８５−９５．）によって腹水から精製された。ｍＡｂ調製物の純度および活性は、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび結合アッセイにおいて対応する抗原を用いた試験によって評価された。

【0248】

ＨＲＰ−抗マウス、−ウサギおよびラット抗体、ならびにヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体のＲＰＥで標識されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃから購入した。ヤギ抗マウスＩｇ抗体のＲＰＥで標識されたＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。

【0249】

完全ヒトｍＡｂ Ｗ９の構築。ｓｃＦｖ Ｗ９可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）領域をコードする遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡライゲーションキットＭＩＧＨＴＹ ＭＩＸ（登録商標）（ＴＡＫＡＲＡ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を製造者の指示に従って使用して、それぞれｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋおよびｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）にクローニングした。

【0250】

完全ヒトｍＡｂ Ｗ９の発現および精製。エレクトロポレーション（ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（登録商標）ＩＩ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を製造者の指示に従って使用して、発現プラスミドｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋおよびｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１を、マウスミエローマ細胞株ＮＳＯに共トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＣＳ、ゼオシン（５０μｇ／ｍＬ）およびブラストサイジンＳ（１０μｇ／ｍＬ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中で選択した。次いで、ゼオシンおよびブラストサイジンＳに耐性の細胞を、限界希釈によって単一細胞にサブクローン化した。サブクローン化された細胞が使用した（ｓｐｅｎｔ）上清を、ヒトＦｃおよび（Ｆａｂ’）_２の発現ならびに対応する抗原との反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）プロテインＧ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従って使用して、使用した培養上清またはマウス腹水から完全ヒトｍＡｂ Ｗ９を精製した。精製されたｍＡｂ Ｗ９の純度および活性を、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗原結合アッセイによって測定した。

【0251】

エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）の脱グリコシル化（ｄｅｇｌｙｃｏｓａｙｌａｔｉｏｎ）。Ｇｒｐ９４^＋ＭＩＡＰａＣａ−２細胞（５×１０^５）を、５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中、２μｌのＰＮＧａｓｅ Ｆ、２μｌのＯ−グリコシダーゼおよび２μｌのα−２（３，６，８．９）−ノイラミニダーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｙｌｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）ありまたはなしで３７℃において２４時間インキュベートした。次いで、処理された細胞をｍＡｂ Ｗ９で染色し、フローサイトメトリー（Ｃｙａｎ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で解析した。

【0252】

フローサイトメトリー解析。細胞（２×１０^５）を、２μｇ／ｍｌのｍＡｂ Ｗ９（総体積１００μｌの２％ＢＳＡ−ＰＢＳに希釈されたもの）とともに４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで２回洗浄し、最適量のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体のＲＰＥ標識Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄した後、２％ホルムアルデヒド中で固定し、ＣＹＡＮ^ＴＭ ＡＤＰ ＬＸ ９ Ｃｏｌｏｒフローサイトメーター（Ｄａｋｏ）で解析した。ｍＡｂ ＴＰ２５．９９およびヒト免疫グロブリンをコントロールとして使用した。がん開始細胞結合アッセイのために、製造者の指示に従ってＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を予め染色した。

【0253】

免疫組織化学。外科的に取り出されたヒト膵臓腺癌病変および正常な膵臓組織の凍結切片を、室温において２０分間、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。ｓｃＦｖ−ＦｃＣ２１によるＴＭＡスライドのＩＨＣ染色を、報告されているように（Ｗａｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ ２０１０）行った。染色された組織マイクロアレイスライドの像を、精査のために×２００の倍率でＯＬＹＭＰＵＳ（登録商標）ＢＸ５１顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＵＫ Ｌｔｄ）を用いて取得した。

【0254】

細胞増殖アッセイおよびＭＴＴアッセイ。９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０^４の密度で細胞を播種し、１％ＦＣＳが補充された培地中でｍＡｂ Ｗ９（５μｇ／ｍｌ）とともに３日間インキュベートした。１ウェルあたり１０μｌのテトラゾリウム構成要素メチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウムブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えることによって、種々の時点において生細胞数を計測し、その混合物を３７℃でおよそ３〜４時間インキュベートした。代謝的に活性な生細胞は、ＭＴＴを有色のホルマザン生成物（分光測光マイクロプレートリーダー（ＭＴＸ Ｌａｂ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ，Ｖｉｅｎｎａ，ＶＡ）において５４０ｎｍで測定される）に変換した。結果は、ＰＢＳのみとインキュベートされた生細胞の数を１００％基準として使用して、生細胞のパーセント阻害として表現された。

【0255】

アポトーシス。ｍＡｂ Ｗ９（５０μｇ／ｍＬ）とともに６時間インキュベートした後のアポトーシスおよびネクローシスのＭＶ３およびＭＩＡＰａｃａ−２細胞のフローサイトメトリー解析を、製造者の仕様書のとおり、アネキシンＶ−ＦＴＩＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色キット（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）によって行った。

【0256】

ウエスタンブロット。細胞溶解産物中のタンパク質を、８％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、０．４５μｍ（ポアサイズ）ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。４℃において一晩、５％脱脂粉乳＋２％ＢＳＡでブロッキングした後、膜を、適切な濃度の一次抗体とともに４℃において一晩、およびＨＲＰで標識されたそれぞれの２次抗体とともに室温において４５分間、連続的にインキュベートした。高感度化学発光系（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてバンドを視覚化し、バンド密度をＦＯＴＯ／Ａｎａｌｙｓｔ（登録商標）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ Ｅｃｌｉｐｓｅシステム（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ）を用いて読み出した。カルネキシン特異的ｍＡｂ ＴＯ−５およびβ−アクチン特異的ｍＡｂを、充填コントロールとして使用した。

【0257】

免疫沈降。ＭＶ３細胞（３×１０^７）を洗浄し、ペレットにし、プロテアーゼインヒビターを含む１．５ｍｌの溶解緩衝液（１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニルを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、４ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０）中で溶解した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞溶解産物を１３，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心した。上清を回収し、ＰＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とインキュベートすることによって事前に精製し、１０μｇのｍＡｂ ｍＡｂ Ｗ９を事前に備えさせた１０μｌの充填プロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅが入ったチューブに移した。４℃で２時間インキュベートした後、ビーズをＰＢＳで４回、高塩緩衝液（３５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、０．１％ウシ血清アルブミン、１％ＮＰ４０）で２回、および溶解緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を、ＳＤＳサンプル緩衝液中に溶出し、還元１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、０．４５μｍ（ポアサイズ）ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。そのブロッティングは、先に記載したように行った。

【0258】

ＡＤＣＣ：ＭＶ３細胞を、５０μＣｉの^５１Ｃｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識し、０．４×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。^５１Ｃｒで標識された細胞を、９６ウェル組織培養Ｕ底アッセイプレート（ＢＤ．Ｆａｌｃｏｎ）においてｍＡｂ Ｗ９と混合した（５０、１０およびμｇ／ｍｌ５０μｌ／ウェル）。ヒト免疫グロブリンをコントロールとして使用した。４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＭＣ（４０：１エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ））を加え、ＣＯ_２恒温器内において３７℃で４時間インキュベートした。Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｃｏｎｒｏｅ）を使用して、細胞を含まない上清をカウントすることによって、^５１Ｃｒの放出を測定した。この実験を、３つ組で２回行った。

【0259】

ＣＤＣ。標的細胞ＭＶ３を、５０μＣｉの^５１Ｃｒで標識し、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で再懸濁した。ＭＶ３細胞を、ＲＰＭＩ１６４０、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡで４倍希釈されたヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ）の存在下において、ｍＡｂ Ｗ９とインキュベートした（５０、１０およびμｇ／ｍｌ５０μｌ／ウェル）。ヒト免疫グロブリンをコントロールとして使用した。ＣＯ_２恒温器内において３７℃で２時間インキュベートした後、Ｐａｃｋａｒｄ ＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、細胞を含まない上清をカウントすることによって、^５１Ｃｒの放出を測定した。この実験を、３つ組で２回行った。

【0260】

確立されたヒトメラノーマ細胞由来の肺転移を有するマウスの処置。８週齢の雌ＳＣＩＤマウスの静脈内（ｉ．ｖ．）にヒトメラノーマＭＶ３細胞を注射した（１．４×１０^８細胞／マウス）。細胞をｉ．ｖ．注射した１５日後、マウスを１３匹のマウスずつ２つの群にランダムに分けた。一方の群のマウスに、４８時間ごとに合計３回、ｍＡｂ Ｗ９（１００μｇ／マウス）をｉ．ｖ．注射した。他方の群のマウスには、同じスケジュールを用いてヒト免疫グロブリンをｉ．ｖ．注射した。２５日目に、マウスを屠殺し、肺を回収し、ＦＦＰＥに供した。Ｈ＆Ｅ染色された肺組織切片を、転移について顕微鏡で検査した。

【0261】

統計解析。試験された群において得られた結果の差の統計的有意性を、スチューデントのｔ検定を用いて解析した。生存統計をＭＥＤＣＡＬＣ（登録商標）ソフトウェア（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて解析した。

【0262】

実施例２
メラノーマ細胞に結合するｓｃＦｖフラグメントの単離
合成ファージｓｃＦｖライブラリー（＃１）を、ＷＭ１１５８細胞を用いて４回のパニングに供した。単離されたファージを、培養されたヒトＬＧ−２ Ｂリンパ系細胞に吸収させることにより、ヒト細胞と共有されるＡｇに結合しているファージを除去した。可溶性ｓｃＦｖを、８０個のクローンから作製し、メラノーマ細胞との反応性について細胞ＥＬＩＳＡにおいて試験した。試験されたクローンのうち、Ｗ９と命名されたｓｃＦｖは、ＷＭ１１５８細胞株と強く反応した。ＬＧ−２細胞との反応性は検出されなかったので、その反応性は特異的だった。関連性のない抗原を認識するｓｃＦｖ ＃１１９を、ネガティブコントロールとして使用した（図１）。

【0263】

実施例３
ｓｃＦｖ Ｗ９の反応性
ヒト細胞株のパネルを用いるＥＬＩＳＡによって試験したとき、可溶性ｓｃＦｖ Ｗ９は、メラノーマ細胞株（ＭＶ３、ＣＯＬＯ３８、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ｍ１４、ＦＯ−１）、基底乳がん細胞株（ＳＵＭ１４９、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ）、頭頸部がん細胞株（ＰＣＩ−１３）、膵がん細胞株（ＰＡＮＣ２．０３、ＰＡＮＣ３．２７、ＰＡＮＣ１０．０５）、膀胱がん細胞株（Ｔ２４）、肺がん細胞株（Ａ５４９）、類表皮がん細胞株（Ａ４３１）、子宮頸がん細胞株（ＨｅＬａ）、腎がん細胞株（ＳＬＲ２１）、卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ３）および神経膠腫がん細胞株（Ｕ−１３８、Ａ−１７２）と反応した。そのｓｃＦｖフラグメントは、乳管がん細胞株（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ）、結腸がん細胞株４０−１６、前立腺がん細胞株Ｄｕ１４５およびＢリンパ系細胞株ＬＧ−２とは反応しなかった（図２）。

【0264】

正常組織に対するｓｃＦｖ Ｗ９の免疫反応性の免疫組織化学的解析の結果を下記に示す。結果は、試験された少なくとも２人の患者のバイオプシーに関する（^＋陽性）。

【0265】

【表1】

【0266】

ｓｃＦｖ Ｗ９による免疫組織化学的染色は、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）が、汗腺および腺房上皮だけによって発現されるが、種々の正常組織によっては発現されないことを示した。

【0267】

ｍＡｂ Ｗ９による免疫組織化学的染色は、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）エピトープが、正常組織では限られた分布を有し、また、膵臓腺癌病変において発現されることを示した（図１１）。その免疫組織化学的解析は、ｍＡｂ Ｗ９によって認識されるエピトープが、正常組織では限られた分布を有することを示した。さらに、ｍＡｂ Ｗ９は、外科的に取り出されたヒト膵臓腺癌病変だけを染色したが、同じ患者由来の正常な膵臓組織を染色しなかった。さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＶ３細胞株に由来する異種移植片はそれぞれ、ｍＡｂ Ｗ９によって強く染色されたが、ＭＣＦ−７では染色は検出されなかった（図１２）。

【0268】

実施例４
ｓｃＦｖ Ｗ９の特異性の免疫化学的解析およびタンデム質量分析によるＧｒｐ９４の同定
ＷＭ１１５８ａから得られた全細胞溶解産物の、ｓｃＦｖ Ｗ９を用いた免疫沈降によって、およそ１００ＫＤａにおける独特のバンドが同定された（図３）。ｓｃＦｖ ＃１１９をネガティブコントロールとして使用した。ＭＶ３（メラノーマ）、ＳＵＭ１４９（基底乳がん）、Ｔ２４（膀胱がん）およびＳＬＲ２１（腎がん）細胞株の溶解産物を使用したとき、同じ結果が得られた。種々の細胞溶解産物からの、ｓｃＦｖ Ｗ９によって免疫沈降された１００ＫＤａの特異的なバンドを切り出し、トリプシンでゲル内消化した。得られたトリプシン処理ペプチドの液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析による解析から、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）のみに由来する２つのトリプシン処理ペプチド（ＥＬＩＳＮＡＳＤＡＬＤＫ（配列番号７）およびＧＶＶＤＳＤＤＬＰＬＮＶＳＲ（配列番号８））が同定された（図４）。

【0269】

ｍＡｂ Ｗ９によって認識されるエピトープと腫瘍細胞との反応性が、ノイラミニダーゼとのインキュベート後に無くなったが、他のグリコシダーゼによって影響されなかったので、そのエピトープは、シアル酸残基（複数可）に大きく依存している（図９）。これらの実験のために、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２（５×１０^５）を、５０μｌのＲＰＭＩ１６４０培地中、２μｌのα−２（３，６，８．９）−ノイラミニダーゼありまたはなしで、５％ＣＯ２恒温器内、３７℃において２４時間インキュベートした。次いで、処理された細胞をｍＡｂ Ｗ９で染色し、フローサイトメトリーによって解析した。ｍＡｂ ＴＰ２５．９９で処理された細胞をコントロールとして使用した。

【0270】

ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を、ＡＬＤＨ活性を検出するためにＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）とインキュベートし（試験）、ｍＡｂ Ｗ９で染色した。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標）＋ＤＡＥＢインヒビターとインキュベートされ、ｍＡｂ Ｗ９で染色された細胞を参照として使用した（コントロール）。ヒトＩｇ（ＨＩｇ）をコントロールとして使用した。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と同定されたがん開始細胞のパーセンテージが示される。フロー解析は、ｍＡｂ Ｗ９が、同定されたＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞集団に結合したので、同じ抗体によって認識されるエピトープが、がん開始細胞によって発現されていることを示した（図１０）。

【0271】

実施例５
ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される決定基の発現に対するツニカマイシンの影響およびそのエピトープのさらなる特徴づけ
ｓｃＦｖ Ｗ９が、糖タンパク質のＮ−グリコシル化のインヒビターであるツニカマイシンで処理されたＣＯＬＯ３８細胞と反応しなかったので、このｓｃＦｖフラグメントによって認識されるエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）上のエピトープの発現にグリコシル化が関与する（図４）。ＤＭＳＯだけを用いたときは、阻害は観察されなかった。さらに、同じ条件下でのＴＰ２５．９９ｍＡｂ（コントロール）の場合も、阻害は観察されなかった。これらのデータから、ｓｃＦｖ Ｗ９によるエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）の認識には炭水化物が不可欠であることが示唆される。

【0272】

ｍＡｂ Ｗ９によって認識されるエピトープと腫瘍細胞との反応性が、ノイラミニダーゼとのインキュベート後に無くなったが、他のグリコシダーゼによって影響されなかったので、そのエピトープは、シアル酸残基（複数可）に大きく依存している（図９）。

【0273】

実施例６
エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）イヌ組換えタンパク質とｓｃＦｖ Ｗ９の反応性
ＢＳＡを用いたときは結合が検出されなかったので（ネガティブコントロール、図５Ｂ）、ｓｃＦｖ Ｗ９は、エンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎｔ）（Ｇｒｐ９４）イヌ組換えタンパク質（ＲＣ−Ｇｒｐ９４）と用量依存的様式で特異的に反応した（図５Ａ）。さらに、ＲＣ−Ｇｒｐ９４は、ＣＯＬＯ３８細胞とｓｃＦｖ Ｗ９との結合に用量依存的様式で特異的に影響した。β２−ミクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ）（ネガティブコントロール）が、阻害効果を示さなかったので、上記阻害は、用量依存的かつ特異的だった（図６）。

【0274】

実施例７
ｓｃＦｖ Ｗ９の結合に対するエレクトロポレーションの影響
エレクトロポレーションされる２９３細胞を、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）完全長ｃＤＮＡまたはベクター単独（ｐＣＭＶ−ＸＬ４、ネガティブコントロール）で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション効率（９４％）をＧＦＰ発現によって評価した。トランスフェクションの２４時間後に回収した細胞を、ｓｃＦｖ Ｗ９およびｍＡｂ ９Ｅ１０とインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。トランスフェクトされていない細胞をコントロールとして使用した。エンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌａｍｓｉｎ）（Ｇｒｐ９４）（図７Ａ）およびプラスミド単独（図７Ｂ）で処理された細胞において、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合の大幅な増加が観察された。これらのデータから、ｓｃＦｖの結合が、エレクトロポレーションによって増加したこと、および熱ショックが、ｓｃＦｖ Ｗ９によって認識される抗原の発現を制御することが示唆される。

【0275】

実施例８
ｓｃＦｖ Ｗ９の結合に対するエンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）に標的化されたｓｈＲＮＡの影響
ＦＯ−１細胞に、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）のノックダウンを行うためのｓｈＲＮＡ、またはコントロールとしてＡＢＣＢ５ ｓｈＲＮＡを形質導入した。形質導入の７２時間後に、細胞を回収し、ｓｃＦｖ Ｗ９およびｍＡｂ ９Ｅ１０とインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって解析した。Ｇｒｐ９４ ｓｈＲＮＡ（図８Ａ）は、コントロールｓｈＲＮＡ（図８Ｂ）と比べて、ｓｃＦｖ Ｗ９の結合を有意に阻害した。

【0276】

実施例９
がん細胞に対するｍＡｂ Ｗ９の影響
がん細胞に対するｍＡｂ Ｗ９の影響を評価した。具体的には、ＭＴＴ解析は、ｍＡｂ Ｗ９が、試験されたすべてのエンドプラスミン陽性（Ｇｒｐ９４＋）腫瘍細胞株の成長を有意に阻害したことを示した。しかしながら、Ｇｒｐ９４⁻Ｒａｊｉ細胞株では影響は観察されなかった。成長の阻害が、コントロールとして使用されたヒト免疫グロブリンを用いたときは観察されなかったので、抗増殖効果は、特異的だった（図１３）。したがって、ｍＡｂ Ｗ９は、がん細胞の増殖を阻害した。

【0277】

フロー解析は、ｍＡｂ Ｗ９が、ヒトメラノーマＭＶ３細胞および膵がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞においてアポトーシスを誘導したことを示した（それぞれ４８．９０％および５３．５６％のアポトーシス）。さらに、ウエスタンブロット解析は、ｍＡｂ Ｗ９で処理された細胞における、切断型カスパーゼ−３および切断型ＰＡＲＰの発現の有意な増加を示した（図１４、１５および１６）。したがって、ｍＡｂ Ｗ９は、がん細胞においてアポトーシスを誘導した。しかしながら、ｍＡｂ Ｗ９は、標的細胞の細胞依存性溶解も補体依存性溶解も媒介しなかった（図１７および１８）。

【0278】

さらに、ｍＡｂ Ｗ９は、ヒト膵臓腺癌ＭＩＡＰａＣａ−２がん開始細胞の増殖を阻害した。フロー解析は、ｍＡｂ Ｗ９で処理された細胞において、ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞と定義されるがん開始細胞のパーセンテージが、ヒト免疫グロブリンを用いたとき（ネガティブコントロール）と比べて５０％減少したことを示した（図１９）。ｍＡｂ Ｗ９で処理された細胞は、低レベルのＲａｓ、Ｃ−Ｒａｆ、ＰＣＫα、β−カテニンおよびＢｃｌ−２を有した。さらに、ｍＡｂ Ｗ９処理は、Ａｋｔ、Ｅｒｋ、Ｍｅｋ、ＦａｋおよびＭｅｔの活性化を阻害した（図２０〜２２）。ｍＡｂ Ｗ９を用いたプルダウンアッセイにおいて、エンドプラスミン（ｅｎｄｏｐｌｓｍｉｎ）（Ｇｒｐ９４）は、Ｍｅｔ、ＲａｓおよびＣ−Ｒａｆと共免疫沈降された（図２３）。

【0279】

Ｈ＆Ｅ染色された組織切片を、ＯＬＹＭＰＵＳ（登録商標）ＢＸ５１顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ（登録商標）ＵＫ Ｌｔｄ．）を用いて、ランダムに選択された５つの２００×視野／切片に存在する転移結節の累積面積について解析した。ＳＰＯＴ ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を用いることにより、各群に対する平均腫瘍面積を測定し、算出し、ＭＶ３腫瘍に対するこれらの値を、棒グラフに±ＳＤで提供する。ｍＡｂ Ｗ９で処置されたマウスは、アイソタイプコントロール抗体で処置されたマウスと比べて、転移の面積を統計学的に有意に（約５０％）減少させた（図２４）。

【0280】

エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）の発現は、化学療法因子によって増大した。フロー解析は、５−フルオロウラシル（ＦＵ）、シスプラチンおよびパクリタキセルによる処置が、エンドプラスミン（Ｇｒｐ９４）の表面発現を増加させたことを示した。その影響は特異的だった（図２５）。ＭＴＴの結果は、５−ＦＵおよびシクロパミンと併用されたｍＡｂ Ｗ９がそれぞれ、膵臓腺癌細胞の成長の阻害において、各薬剤単独よりも有効であることを示した（図２６）。フロー解析は、ｍＡｂ Ｗ９によるがん開始細胞の成長の阻害が、シクロパミンおよび５−ＦＵによって増強されることも示した。ｍＡｂ Ｗ９、シクロパミンおよび５−ＦＵとのインキュベート後に、ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞のおよそ９０％の成長阻害が検出された。対照的に、その阻害は、ｍＡｂ Ｗ９またはシクロパミンと個別にインキュベートされた培養物ではわずか５０％、５−ＦＵとインキュベートされた培養物では２０％、およびシクロパミンまたは５−ＦＵと併用してｍＡｂ Ｗ９とインキュベートされた培養物では７０％だった（図２７）。フロー解析は、ｍＡｂによるアポトーシスの誘導がシクロパミンおよび５−ＦＵによって増強されたことも示した。アポトーシスは、シクロパミンおよび５−ＦＵと併用されたｍＡｂ Ｗ９によって、細胞の７０％において誘導された。しかしながら、アポトーシスは、５−ＦＵ、シクロパミンまたは５−ＦＵとシクロパミンとの組み合わせで処理された細胞の３５％未満でしか誘導されなかった（図２８）。

【0281】

フロー解析は、ｍＡｂ Ｗ９によるがん開始細胞の成長の阻害が、放射線照射およびシクロパミンによって増強されたことも示した。ＡＬＤＨ^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞のおよそ９０％の成長阻害が、放射線照射およびシクロパミンと併用してｍＡｂ Ｗ９で処理した後に検出された。対照的に、阻害は、ｍＡｂ Ｗ９またはシクロパミンで個別に処理された培養物においておよそ５０％であり、放射線照射だけで処理された培養物では３０％未満だった（図２９）。フロー解析は、ｍＡｂによるアポトーシスの誘導が、放射線照射およびシクロパミンによって増強されたことを示した。アポトーシスは、放射線照射およびシクロパミンと併用したｍＡｂ Ｗ９によって、７３．８７％の細胞において誘導されたが、ｍＡｂ Ｗ９単独では２５％未満の細胞でしか誘導されなかった（図３０）。

【0282】

ＲａｓおよびＣ−Ｒａｆタンパク質レベルに対するｍＡｂ Ｗ９処理の影響も調べた。ＲａｓおよびＣ−Ｒａｆレベルは、シクロパミンおよび５−ＦＵによって増大した。Ｍｅｋ、ＥｒｋおよびＡｋｔの活性化の阻害において、相乗効果が見られた（図３１）。ＲａｓおよびＧＬＩ１タンパク質レベル、ならびにＥｒｋおよびＡｋｔの活性化の阻害におけるｍＡｂ Ｗ９処理の影響は、放射線照射およびシクロパミンによって増強された（図３２）。

【0283】

実施例１０
がんを処置するためのエンドプラスミン特異的モノクローナル抗体
この実施例には、エンドプラスミンの過剰発現を示すがん（本明細書中で「エンドプラスミン陽性」がんと称される）（メラノーマ、乳がん、頭頸部扁平上皮癌、腎がん、肺がん、神経膠腫、膀胱がん、卵巣がんまたは膵がんが挙げられるがこれらに限定されない）を処置するためのエンドプラスミン特異的ヒトモノクローナル抗体の使用が記載される。エンドプラスミン陽性がんを有すると診断された患者は、当該分野において標準的な手順に従って処置され得る。一般に、処置の選択肢としては、外科術、放射線治療、化学療法、免疫療法またはインターフェロン療法が挙げられる。

【0284】

この実施例では、エンドプラスミン陽性メラノーマと診断された患者に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）に連結されたエンドプラスミン特異的ヒトモノクローナル抗体を含む免疫結合体が投与される。ＰＥ免疫結合体の調製法は、報告されている（例えば、米国特許第７，０８１，５１８号および付与前の米国公開番号２００５／０２１４３０４（これらは本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。一部の患者では、その免疫結合体は、静脈内ボーラス注射によって１日おきに合計３〜６回投与される。他の患者では、その免疫結合体は、１０日間にわたって連続的な静脈内注入によって投与される。患者に投与される免疫結合体の用量は、患者の体重および性別、ならびに投与の様式および時間経過に応じて変動する。処置の後、がんの進行（腫瘍の成長および転移を含む）および疾病の他の臨床的徴候について患者を評価する。患者は、免疫結合体単独で、または１つ以上の標準的ながん処置法と併用して、処置され得る。例えば、メラノーマを除去する外科術を受けた患者は、続けて、免疫結合体で処置され得る。

【0285】

記載された方法または組成物の正確な詳細は、記載された本発明の精神から逸脱することなく変更され得るかまたは改変され得ることが明らかである。本発明者らは、下記の請求項の範囲内および精神内に入るそのような改変およびバリエーションのすべてを特許請求する。

【図1b】

【図2】

【図3b】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図13】

【図14】

【図17】

【図18】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図1a】

【図3a】

【図11】

【図12】

【図15】

【図16】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図30】

【図31】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]