特許 5695810 高比重リポ蛋白中のコレステロール測定方法および該方法に用いる試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5695810

(24)【登録日】2015年2月13日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】高比重リポ蛋白中のコレステロール測定方法および該方法に用いる試薬

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/60 20060101AFI20150319BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20150319BHJP

   C12Q 1/32 20060101ALI20150319BHJP

   C12Q 1/44 20060101ALI20150319BHJP

   G01N 33/92 20060101ALI20150319BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/60

   C12Q1/26

   C12Q1/32

   C12Q1/44

   G01N33/92 A

【請求項の数】20

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2014-561213(P2014-561213)

(86)(22)【出願日】2014年9月1日

(86)【国際出願番号】JP2014072934

【審査請求日】2014年12月19日

(31)【優先権主張番号】特願2013-180140(P2013-180140)

(32)【優先日】2013年8月30日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2013-247966(P2013-247966)

(32)【優先日】2013年11月29日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】390037327

【氏名又は名称】積水メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】大田 美恵子

(72)【発明者】

【氏名】大野 愛子

【審査官】 一宮 里枝

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第９５／０２４５０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平３−０１０６９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１１６４００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Lipid Research，１９７０年，Vol. 11, No. 6，pages 583-595

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｇ０１Ｎ ３３／９２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

高比重リポ蛋白コレステロール測定方法であって、
測定試料と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）：

【化1】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、およびポリアニオンの存在下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、請求項１記載の方法。

【請求項3】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。

【請求項5】

さらにアルブミンの存在下で前記工程を行う、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。

【請求項6】

さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物の存在下で前記工程を行う、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。

【請求項7】

下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む高比重リポ蛋白コレステロール測定用試薬。
（ａ）一般式（Ｉ）：

【化2】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、
（ｂ）ポリアニオン、
（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素

【請求項8】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、請求項７記載の試薬。

【請求項9】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、請求項７又は８記載の試薬。

【請求項10】

ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、請求項７〜９のいずれか１項記載の試薬。

【請求項11】

さらにアルブミンを含有する、請求項７〜１０のいずれか１項記載の試薬。

【請求項12】

さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含有する、請求項７〜１１のいずれか１項記載の試薬。

【請求項13】

（ａ）一般式（Ｉ）および（ｂ）ポリアニオンを含む第１の試薬セットと、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含む第２の試薬セットとを含む、請求項７〜１２のいずれか１項記載の試薬。

【請求項14】

下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、高比重リポ蛋白コレステロール測定用試薬キット。
（ａ）一般式（Ｉ）：

【化3】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、
（ｂ）ポリアニオン、
（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素

【請求項15】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、請求項１４記載のキット。

【請求項16】

一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、請求項１４又は１５記載のキット。

【請求項17】

ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、請求項１４〜１６のいずれか１項記載のキット。

【請求項18】

さらにアルブミンを含有する、請求項１４〜１７のいずれか１項記載のキット。

【請求項19】

さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含有する、請求項１４〜１８のいずれか１項記載のキット。

【請求項20】

（ａ）一般式（Ｉ）および（ｂ）ポリアニオンを含む第１の試薬セットと、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含む第２の試薬セットとを含む、請求項１４〜１９のいずれか１項記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、簡便かつ正確に、高比重リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法、および該方法に使用する試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

生体の主要な脂質であるコレステロール、中性脂肪（以下、トリグリセリドまたはＴＧということがある）およびリン脂質は、血液中においてアポ蛋白と共にリポ蛋白を形成して存在している。このリポ蛋白は、物理的な性状の違いにより、カイロミクロン、超低比重リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬということがある）、低比重リポ蛋白（以下、ＬＤＬということがある）、高比重リポ蛋白（以下、ＨＤＬということがある）などに分類される。これらのうちＨＤＬは、生体中の各組織からコレステロールを受け取るため、細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であることが知られている。このため、ＨＤＬ中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃということがある）の血中濃度の把握は、動脈硬化性疾患の発症予知に有用であるとして臨床現場で幅広く測定されている。

【0003】

ＨＤＬ−Ｃの測定方法としては、測定試料中のＨＤＬとＨＤＬ以外のリポ蛋白とを分離分画する工程を必要としない、いわゆるホモジニアスＨＤＬ−Ｃ直接測定法（以下、従来法ということがある）に分類される臨床検査用の試薬が多数市販され、ルーチン検査で使用されるに至っている（非特許文献１、４）。しかしながら、これらの実用化された臨床検査用の方法・試薬であっても、測定精度に関してなお課題があり、特に脂質異常検体において、基準測定法（非特許文献２、３）で測定した場合の測定値と、各種試薬で測定した場合の測定値の乖離は、国際的に問題視されていた（非特許文献４）。

【0004】

従来法の多くは、ＨＤＬ−Ｃの測定に先立ち、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの全部または一部をＨＤＬ−Ｃ測定の主反応（以下、単に主反応ということがある）に関与しないよう反応液中より消去する方法（例えば、特許文献１、２）、または、ＨＤＬ−Ｃの測定時にＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールがＨＤＬ−Ｃ測定の主反応に関与しないよう、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの反応を抑制する方法（例えば、特許文献３〜６）に分類することができるが、該従来法において、ＨＤＬ以外のリポ蛋白として括られているＶＬＤＬとＬＤＬの性状は同一ではないため、ＶＬＤＬに起因する測定誤差の解消が課題となっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第９８／２６０９０号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２０００／０７８９９９号パンフレット

【特許文献3】国際公開第９５／２４５０２号パンフレット

【特許文献4】国際公開第２００４／０３５８１６号パンフレット

【特許文献5】国際公開第２００５／１００５９１号パンフレット

【特許文献6】国際公開第２００６／１１８１９９号パンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：９ １５７９−１５９６（２００１）

【非特許文献2】Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ ２６９−２７５（１９９１）

【非特許文献3】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：１０ １８０３−１８１２（１９９９）

【非特許文献4】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６：６ ９７７−９８６（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従って、本発明の目的は、脂質異常症のような特殊な病態の患者検体を測定試料とする場合であっても、ＤＣＭ（Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ）などの基準測定法の測定値との一致性を向上させることが可能な化合物を見出し、これを利用したＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、前記課題について鋭意研究を行った結果、ＨＤＬ−Ｃの測定に際し、ホスホニウム塩およびポリアニオンの存在下にコレステロール酸化酵素などのコレステロール測定用酵素と測定試料を混合すると、該コレステロール測定用酵素のＶＬＤＬへの反応性を大幅に抑制することが可能であり、ＨＤＬ−Ｃをより高い精度で測定できることを見出した。

【0009】

すなわち、本発明は、以下に関するものである。
[１] 高比重リポ蛋白コレステロール測定方法であって、
測定試料と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、一般式（Ｉ）：

【化1】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、およびポリアニオンの存在下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
［２］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、［１］記載の方法。
［３］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、［１］又は［２］記載の方法。
［４］ ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法。
［５］ さらにアルブミンの存在下で前記工程を行う、［１］〜［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］ さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物の存在下で前記工程を行う、［１］〜［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］ 下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む高比重リポ蛋白コレステロール測定用試薬。
（ａ）一般式（Ｉ）：

【化2】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、
（ｂ）ポリアニオン、
（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素
［８］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、［７］記載の試薬。
［９］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、［７］又は［８］記載の試薬。
［１０］ ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、［７］〜［９］のいずれか１項記載の試薬。
［１１］ さらにアルブミンを含有する、［７］〜［１０］のいずれか１項記載の試薬。
［１２］ さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含有する、［７］〜［１１］のいずれか１項記載の試薬。
［１３］ （ａ）一般式（Ｉ）および（ｂ）ポリアニオンを含む第１の試薬セットと、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含む第２の試薬セットとを含む、［７］〜［１２］のいずれか１項記載の試薬。
［１４］ 高比重リポ蛋白コレステロール測定に使用される、下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含むキット。
（ａ）一般式（Ｉ）：

【化3】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、
（ｂ）ポリアニオン、
（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素
［１５］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、Ｒ¹が直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜１６のアルキル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴が直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜４のアルキル基である、［１４］記載のキット。
［１６］ 一般式（Ｉ）で表される化合物が、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、およびトリブチルヘキサデシルホスホニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物である、［１４］又は［１５］記載のキット。
［１７］ ポリアニオンが、リンタングステン酸ナトリウムまたはデキストラン硫酸である、［１４］〜［１６］のいずれか１項記載のキット。
［１８］ さらにアルブミンを含有する、［１４］〜［１７］のいずれか１項記載のキット。
［１９］ さらにポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、３級アミン、および４級アンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも一つの化合物を含有する、［１４］〜［１８］のいずれか１項記載のキット。
［２０］ （ａ）一般式（Ｉ）および（ｂ）ポリアニオンを含む第１の試薬セットと、（ｃ）コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含む第２の試薬セットとを含む、［１４］〜［１９］のいずれか１項記載のキット。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、測定試料を遠心分離するなどの前処理の必要がなく、簡便な操作で効率良くＨＤＬ−Ｃを定量することができる。また、少量の測定試料で特異的な測定が可能であるため、種々の自動分析装置に適用でき、臨床検査の領域においても極めて有用である。また、本発明によるＨＤＬ−Ｃ測定は、測定に使用する試薬の組成が２価金属を必須成分として含有しない組成であるため、分析装置に負荷をかけないという利点も有している。さらに、特に、従来法では測定誤差が生じていた、ＶＬＤＬを多く含む検体、例えばトリグリセリドが高値であって、総コレステロール、およびＬＤＬコレステロールが概ね正常値である、ＩＶ型高脂血症のような検体における測定精度が大幅に改善するという利点を有するものである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

一実施形態において、本発明は、高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）測定方法を提供する。本発明方法は、ＨＤＬを含有する測定試料について、ポリアニオンおよびホスホニウム塩化合物の存在下で、公知のコレステロール測定用試薬を用いてＨＤＬ−Ｃを測定することにより実施される。

【0012】

本発明の方法に供される測定試料としては、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびカイロミクロンなどのリポ蛋白を含む可能性がある検体であればいずれのものでもよく、例えば、血清、血漿などの体液やその希釈物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

【0013】

本明細書において、ＨＤＬ−Ｃ測定に使用されるコレステロールを基質とする酵素を、コレステロール測定用酵素と総称する。コレステロール測定用酵素としては、コレステロールエステル加水分解酵素（リパーゼに分類されるものを含む）、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素などが挙げられる。

【0014】

以下、臨床検査の分野で汎用されているＨＤＬ−Ｃ測定法である二工程（二試薬）で行う測定系をモデルに本発明方法の説明をする。二工程測定系（または二試薬測定系）とは、最初に第一試薬を用いて、ＨＤＬ以外のリポ蛋白のコレステロールのコレステロール測定用酵素への反応性を抑制する工程（第１工程）を行い、続いてコレステロール測定用酵素を含む第二試薬を添加してコレステロール測定工程（第２工程）を行う方法である。なお、以下の本明細書において、二工程測定系の第１工程、第２工程をそれぞれ単に第１工程、第２工程ということがある。

【0015】

本発明の方法における第１工程では、測定試料にポリアニオンおよびホスホニウム塩化合物を添加し、該測定試料中のＨＤＬ以外のリポ蛋白を、ポリアニオンおよびホスホニウム塩化合物を用いて処理する。ここで「処理」とは、ＨＤＬ以外のリポ蛋白の粒子表面にポリアニオンおよびホスホニウム塩化合物が静電気的に結合することをいう。本工程においては、ポリアニオンおよびホスホニウム塩化合物の添加量によっては、ポリアニオンを介してＨＤＬ以外のリポ蛋白粒子が集合（いわゆる凝集）する場合があるが、この凝集現象は本発明の効果を得るために必須ではない。第１工程は、上記「処理」によって、引き続く第２工程におけるＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールのコレステロール測定用酵素との反応性を低下させることを目的としたものである。

【0016】

続いて第２工程では、従来公知の方法を使用してＨＤＬ−Ｃの測定を行う。リポ蛋白中に含まれるコレステロールとしては、エステル型コレステロール（以下、コレステロールエステルということがある）および遊離型コレステロールがある。エステル型コレステロールは、コレステロールエステル加水分解酵素により加水分解され、遊離型コレステロールと脂肪酸へ変換される。ここで生じた遊離型コレステロールは、元々存在する遊離型コレステロールと共に、コレステロール測定用酵素（例えば、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素）の基質となる。コレステロール測定用酵素としてコレステロール酸化酵素を用いる場合は、遊離型コレステロールは酸化されて、コレステノンと過酸化水素へ変換される。ここに、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物を反応させ、生じたキノン色素の吸光度を測定することにより、ＨＤＬに含まれるエステル型コレステロールと遊離型コレステロールの和、すなわちＨＤＬ−Ｃ量を測定することができる。また、コレステロール測定用酵素としてコレステロール脱水素酵素を用いる場合は、補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を吸光度に基づいて測定することにより、ＨＤＬ−Ｃ量を測定することができる。

【0017】

本発明に用いられるホスホニウム塩化合物としては、一般式（Ｉ）：

【化4】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物（以下、化合物（Ｉ）ということがある）が挙げられる。

【0018】

化合物（Ｉ）におけるＲ¹で表される直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基としては、例えばオクチル、イソオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘンイコシル、ドコシル（ベヘニル）などの基が挙げられ、炭素数８〜１８のアルキル基であることが好ましく、炭素数１２〜１６の直鎖アルキル基であることがより好ましい。

【0019】

化合物（Ｉ）におけるＲ¹で表される直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基としては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、シトロネリル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル、ヘンイコセニル、ドコセニルなどの基が挙げられ、炭素数８〜１８の直鎖アルケニル基であることがより好ましい。

【0020】

化合物（Ｉ）におけるＲ²、Ｒ³またはＲ⁴で表される直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどの基が挙げられ、炭素数１〜４の直鎖アルキル基であることが好ましい。

【0021】

化合物（Ｉ）におけるＲ²、Ｒ³またはＲ⁴で表される直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基としては、例えばビニル、１−プロペニル、アリル（２−プロペニル）、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられ、炭素数２〜４の直鎖アルケニル基であることがより好ましい。

【0022】

化合物（Ｉ）におけるＸ^-で表される陰イオンとしては、例えば水酸化物イオン、ハロゲンイオン、無機酸由来の陰イオン、有機酸由来の陰イオンなどが挙げられる。ハロゲンイオンとしては、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどが挙げられる。無機酸由来の陰イオンとしては、例えば硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオンなどが挙げられる。有機酸由来の陰イオンとしては、例えばギ酸イオン、酢酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、グルタミン酸イオンなどのカルボン酸イオンなどが挙げられる。

【0023】

本発明方法においては、ホスホニウム塩化合物として、上述した化合物（Ｉ）を単独でまたは２種類以上を組み合わせて使用することができる。化合物（Ｉ）の好ましい例としては、トリメチルオクチルホスホニウム塩、トリメチルドデシルホスホニウム塩、トリメチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリエチルオクチルホスホニウム塩、トリエチルドデシルホスホニウム塩、トリエチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリブチルオクチルホスホニウム塩、トリブチルドデシルホスホニウム塩、トリブチルヘキサデシルホスホニウム塩、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム塩などが挙げられる。ホスホニウム塩としては、好ましくはクロリドおよびブロミドとの塩が挙げられる。化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えば、トリブチル−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド（いずれも、東京化成工業株式会社）、トリヘキシルテトラデシルホスホニウムブロミド、トリヘキシルテトラデシルホスホニウムテトラフルオロボレート（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。また当業者は、Ｇｒｅｅｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５ １４３−１５２（２００３）、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９ ２３５３−２３５８（２００７）、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５ ７３４−７３６（２００７）の記載を参照して例えば、トリメチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、トリエチルドデシルホスホニウムブロミド、トリエチルヘキサデシルホスホニウムクロリドなどの、式（Ｉ）で示されるホスホニウム塩化合物を合成することもできる。

【0024】

化合物（Ｉ）の濃度としては、本発明のＨＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、第１工程における反応液中の濃度が０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、第１工程における反応液中の濃度が０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましい。

【0025】

ポリアニオンとしては、本発明のＨＤＬ−Ｃの測定を可能とするポリアニオンであれば特に制限はなく、リンタングステン酸またはその塩、デキストラン硫酸またはその塩、ヘパリンまたはその塩、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。デキストラン硫酸としては、例えば、平均分子量が４０００〜２００万、好ましくは４０００〜５０万、より好ましくは４０００〜５万、例えば平均分子量４０００、５０００、１万、３万６０００、４万、５万、８万、２０万、５０万、１００万、２００万などのデキストラン硫酸が挙げられる。塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩などが挙げられる。また、本発明においては上記ポリアニオンを単独で用いても２種以上組み合わせて用いても良い。ポリアニオンの濃度としては、本発明のＨＤＬ−Ｃの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、第１工程における反応液中の濃度が０．００１〜１０重量％であることが好ましく、第１工程における反応液中の濃度が０．０１〜１重量％であることがより好ましい。

【0026】

コレステロール測定用酵素（コレステロールエステル加水分解酵素（リパーゼに分類されるものを含む）、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素など）、およびペルオキシダーゼについては、一般にコレステロール測定に使用されるものであれば何れでも差し支えなく使用できる。これらは、微生物由来、動物由来、植物由来などいずれの由来でもよく、また遺伝子操作により作られたものでも良く、化学修飾の有無も問わない。コレステロール測定用酵素は、単独で、あるいは２種類以上を組み合わせて使用することができる。またその使用量は酵素によって異なり、特に制限されるものではないが、第２工程における反応液中の濃度として０．００１〜１００単位／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００単位／ｍＬで使用することができる。ペルオキシダーゼの使用量にも制限はないが、第２工程における反応液中の濃度として０．００１〜１００単位／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００単位／ｍＬである。

【0027】

ペルオキシダーゼの存在下において、コレステロール酸化酵素の作用により生成した過酸化水素と反応してキノン色素を形成する化合物（以下、発色剤ということがある）としては、４−アミノアンチピリンおよびトリンダー試薬が挙げられる。トリンダー試薬としては、Ｎ，Ｎ−ビス（スルホブチル）−ｍ−トルイジン二ナトリウム（ＤＳＢｍＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）などが用いられるが、これらに限定されることはない。また発色剤の使用濃度は、所望する、キノン色素の形成量、反応液量、反応時間などに応じて適宜に選択が可能である。

【0028】

また、コレステロール脱水素酵素を使用する場合の補酵素ＮＡＤ（Ｐ）の使用濃度も適宜に選択が可能である。

【0029】

本発明方法を有利に実施するためには、上記したポリアニオン、ホスホニウム塩化合物、酵素、発色剤、補酵素などを適宜組み合わせて調製した試薬を使用することができる。またさらに、必要に応じて、アスコルビン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、ホスホリパーゼ、スフィンゴミエリナーゼなどのコレステロール測定用酵素以外の酵素や塩、ｐＨ調整のための緩衝剤、界面活性剤、アルブミンなどの蛋白質類、抗体、抗生物質、サポニン、レクチン、ジギトニン、シクロデキストリン、カリックスアレーンなど特定のリポ蛋白に親和性を有する物質や、キレート剤、糖などの安定化剤、防腐剤を配合することができる。また、マグネシウムイオンやカルシウムイオンのような２価金属は、酵素の安定化に寄与する場合があり、ＨＤＬ−Ｃ測定に影響を与えない（または測定装置に影響を与えない）濃度で添加することができる。

【0030】

これらのうち、緩衝剤としては、グッドの緩衝剤、リン酸、トリス、フタル酸塩など何れでもよく、反応液としてｐＨ４から１０の範囲で緩衝作用を有する条件が設定できるものであれば使用できる。その使用量は、特に制限されるものではないが、反応液中、０．０００５〜２ｍｏｌ／Ｌで、好ましくは０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌで使用される。いずれも実施にあたっては、使用する各種酵素の特性あるいは、試薬に含まれるその他の成分との関係などから、実験的に最適条件を選択することができる。

【0031】

アルブミンは、本発明において感度や特異性を向上させる場合があり、好適に使用することが可能である。その種類は本発明のＨＤＬ−Ｃの測定を可能とするものであれば特に制限はないが、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト、卵白由来のアルブミンなどが挙げられ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。これらは遺伝子操作により作られたものでも良く、精製方法の如何や化学修飾の有無も問わない。その使用量は、特に制限されるものではないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０重量％であることが好ましく、０．１〜１重量％がより好ましい。

【0032】

界面活性剤は、本発明のＨＤＬ−Ｃの測定を可能とするものであれば特に制限はなく、従来公知のＨＤＬ−Ｃの測定に使用される界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤）の中から適宜選択して使用することができる。

【0033】

特にＨＤＬを選択的に可溶化する目的であれば、ＨＬＢ１３〜１４のポリオキシエチレン誘導体を好適に用いることができ、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテルがさらに好ましい。具体例（製品名）としては、エマルゲンＡ−９０、エマルゲンＢ−６６（いずれも、花王株式会社）が挙げられる。その濃度は第２工程の反応液中（別の表現をすれば第１工程、第２工程の反応混合物全体に対し）０．０５〜３重量％が好ましく、０．１〜１．５重量％がより好ましい。また、国際公開第２００４／０４８６０５号パンフレットに記載の多環型ポリオキシアルキレン誘導体も同様に使用することができる。

【0034】

また界面活性剤として、ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンが添加されていてもよい。ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンとしては、例えば一般式（ＩＩ）：

【化5】

（式中、Ｒ⁵は直鎖または分枝状のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ⁶は水素原子または（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_nＨを表し、ｍまたはｎは同一または異なって１〜１００の整数である）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）ということがある）が挙げられる。化合物（ＩＩ）におけるアルキル基およびアルケニル基としては、それぞれ例えば、化合物（Ｉ）に関して前述した直鎖または分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、直鎖または分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基などが挙げられ、炭素数１０〜１８のアルキル基またはアルケニル基であることが好ましい。

【0035】

ポリオキシエチレンアルキルアミンまたはポリオキシエチレンアルケニルアミンの具体例（製品）としては、例えばナイミーンＬ−２０１（Ｎ−ヒドロキシエチル−ラウリルアミン；日油株式会社）、ナイミーンＬ−２０７（ポリオキシエチレンラウリルアミン；日油株式会社）、ナイミーンＳ−２０４、ナイミーンＳ−２１０（ポリオキシエチレンステアリルアミン；日油株式会社）、ニューコールＯＤ−４２０（ポリオキシエチレンアルキルアミンエーテル；日本乳化剤株式会社）、パイオニンＤ−３１０４、パイオニンＤ−３１１０（ポリオキシエチレンラウリルアミノエーテル；竹本油脂株式会社）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ−２０５、Ｌ−２０７、Ｌ−２１０（ポリオキシエチレンラウリルアミン；青木油脂工業株式会社）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｓ−２０７、Ｓ−２１０（ポリオキシエチレンステアリルアミン；青木油脂工業株式会社）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｓ−２０７Ｔ（ポリオキシエチレン牛脂アミン；青木油脂工業株式会社）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｏ−２０５（ポリオキシエチレンオレイルアミン；青木油脂工業株式会社）などが挙げられる。

【0036】

ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるオキシエチレン鎖の重合度は、好ましくは１〜１００、より好ましくは１〜６０である。ポリオキシエチレンアルキルアミンおよびポリオキシエチレンアルケニルアミンはいずれか単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いても良い。またその使用量は、特に制限されるものではないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１重量％であることが好ましく、０．００１〜０．１重量％がより好ましい。

【0037】

また、界面活性剤として陽イオン性界面活性剤やアミノ基を有する界面活性剤が含まれていてもよく、それらの例としては、３級アミンおよび４級アンモニウム塩が挙げられる。３級アミンとしては、例えば一般式（ＩＩＩ）：

【化6】

（式中、Ｒ⁷は、直鎖または分枝状の炭素数６〜３０のアルキル基またはアルケニル基を表し、Ｒ⁸、Ｒ⁹は、同一または異なって、それぞれ水素原子、直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜３０のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜３０のアルケニル基を表す）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）ということがある）が挙げられる。化合物（ＩＩＩ）の具体例（製品）としては、例えばニッサンアミンＢＢ、ニッサンアミンＡＢ、３級ニッサンアミンＢＢ、３級ニッサンアミンＦＢ（いずれも日油株式会社）などが挙げられる。３級アミンおよび４級アンモニウム塩の使用量は、特に制限されるものではないが、反応液中の濃度が０．０００１〜１重量％であることが好ましく、０．００１〜０．１重量％がより好ましい。上記３級アミンおよび４級アンモニウム塩は、いずれか単独で用いても２種類以上を組み合わせて用いても良い。

【0038】

本発明方法を有利に実施するため、上述した本発明方法に使用する試薬をまとめて含むキットが提供されてもよい。したがって、別の実施形態において、本発明は、上記化合物（Ｉ）で示されるホスホニウム塩化合物、上記ポリアニオン、および上記コレステロール測定用酵素を含む、ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、上記化合物（Ｉ）で示されるホスホニウム塩化合物、上記ポリアニオン、および上記コレステロール測定用酵素を含む、ＨＤＬ−Ｃ測定に使用されるキットを提供する。該ＨＤＬ−Ｃ測定用試薬および該キットは、さらに、上述したペルオキシダーゼ、発色剤、補酵素、アルブミンなどの蛋白質類、界面活性剤、コレステロール測定用酵素以外の酵素や塩、ｐＨ調整のための緩衝剤、抗体、抗生物質、特定のリポ蛋白に親和性を有する物質、キレート剤、安定化剤、防腐剤、酵素の安定化に寄与する２価金属などの、ＨＤＬ−Ｃ測定に必要な他の試薬を含んでいてもよい。

【0039】

本発明のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬（二工程測定系用）の具体例を示せば次の通りである。
（第一試薬）
ポリアニオン
ホスホニウム塩化合物（化合物（Ｉ））
発色剤（例えば４−アミノアンチピリンもしくはトリンダー試薬）
（第二試薬）
コレステロール測定用酵素
コレステロールエステル加水分解酵素
コレステロール酸化酵素
ペルオキシダーゼ
発色剤（例えば４−アミノアンチピリンもしくはトリンダー試薬）
界面活性剤

【0040】

本発明のＨＤＬ−Ｃ測定用試薬（二工程測定系用）の別の具体例を示せば次の通りである。
（第一試薬）
ポリアニオン
ホスホニウム塩化合物（化合物（Ｉ））
補酵素（ＮＡＤ（Ｐ））
（第二試薬）
コレステロール測定用酵素
コレステロールエステル加水分解酵素
コレステロール脱水素酵素
補酵素（ＮＡＤ（Ｐ））
界面活性剤

【0041】

上記の二工程測定系に基づく説明は、本発明の方法の理解促進のために記載したものであって、特定の理論に拘る趣旨のものではない。したがって、上記の説明は、コレステロール測定用酵素とリポ蛋白が接触する前あるいは接触するのと並行して本発明の処理が実質的になされることを限度として、本発明の方法が一工程（一試薬）測定系や三工程（三試薬）測定系であることを排除することを意図していない。さらに本発明の方法が、溶液中で反応を行う液体反応系以外（例えば試薬を固定した試験片、乾式分析素子などを用いた固形反応系）であることを排除することも意図していない。当業者であれば、上記二工程測定系に基づく本発明方法の詳細な説明や、後述の実施例の記載を参酌し、本発明方法を一工程測定系やや三工程測定系、さらに試験片や乾式分析素子を用いた反応系に応用することや、それらの測定系、反応系における各試薬の適切な使用量を実験的に決定することができることはいうまでもない。

【0042】

例えば、上記に例示したＨＤＬ−Ｃ測定用試薬において、その性能を損なわないことを限度として、上記コレステロール測定用酵素、ペルオキシダーゼなどの酵素や発色剤、補酵素などを第一試薬のみに含有させるか、第二試薬のみに含有させるか、または双方に含有させるかを選ぶことができる。また、国際公開第０２／３８８００号パンフレット、特開２００７−３２５５８７号公報、特開２００９−１２５０４９号公報、特開２００９−２４７３１７号公報などを参照し、上記試薬を試験片、乾式分析素子などに適用することができる。なお、試験片、乾式分析素子などによるＨＤＬ−Ｃ測定に使用できるさらなる成分や技術を本発明方法において使用できる場合があることはいうまでもない。

【0043】

本発明方法において、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールは主反応への関与を抑制されているため、ＨＤＬ−Ｃの測定後も反応液中に残存している。したがって、ＨＤＬ−Ｃ測定後にＨＤＬ−Ｃ以外のコレステロールの反応抑制を解除する手段（すべてのリポ蛋白を可溶化できる界面活性剤の添加など）をさらに施せば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロール（臨床における、いわゆるｎｏｎＨＤＬ−Ｃなど）を測定することが可能である。また、本発明方法において、コレステロール測定用酵素に代えて、当業者に周知のトリグリセリド測定用酵素群を使用すれば、ＨＤＬ中のトリグリセリドやＨＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを測定することも可能である。

【実施例】

【0044】

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はなんらこれらに制約されるものではない。なお、本実施例および比較例においては、下記メーカーの試薬および酵素を使用した。なお、界面活性剤の成分名は、各メーカーのカタログ記載名称を記載した。

【0045】

ＭＥＳ（株式会社同仁化学研究所）、水酸化ナトリウム（キシダ化学株式会社）、ＴＯＯＳ（株式会社同仁化学研究所）、４−アミノアンチピリン（和光純薬工業株式会社）、リンタングステン酸ナトリウム（キシダ化学株式会社）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量４０００）（東京化成工業株式会社）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量３６０００〜５万）（和光純薬株式会社）、デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万）（和光純薬工業株式会社）、塩化マグネシウム（キシダ化学株式会社）、トリブチル−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド（東京化成工業株式会社）、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド（東京化成工業株式会社）、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド（東京化成工業株式会社）、トリヘキシルテトラデシルホスホニウムブロミド（東京化成工業株式会社）、コレステロールエステラーゼ（旭化成株式会社）、コレステロールオキシダーゼ（オリエンタル酵母工業株式会社）、ペルオキシダーゼ（東洋紡株式会社）、エマルゲンＢ−６６（成分名 ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル；花王株式会社）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ−２０５（成分名 ポリオキシエチレンラウリルアミン；青木油脂工業株式会社）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｓ−２０７（成分名 ポリオキシエチレンステアリルアミン；青木油脂工業株式会社）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（東京化成工業株式会社）、３級ニッサンアミンＢＢ（成分名 ジメチルラウリルアミン；日油株式会社）、ペグノール００５（成分名 ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル；東邦化学工業株式会社）、エマルゲンＡ−６０（成分名 ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル；花王株式会社）、ニューコール６１０（成分名 ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤株式会社）、ニューコール２６００ＦＢ（成分名 ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル；日本乳化剤株式会社）、コール酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）、エナジコールＬ−３０ＡＮ（成分名 アラニネート；ライオン株式会社）、アンヒトール２４Ｂ（成分名 ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン；花王株式会社）、エナジコールＣ−４０Ｈ（成分名 イミダゾニウムベタイン；ライオン株式会社）。トリメチルヘキサデシルホスホニウムブロミド（ＣＡＳ番号［７１２２１−９６−０］）、トリエチルドデシルホスホニウムブロミド（ＣＡＳ番号［２１７４３−５３−３］）、トリエチルヘキサデシルホスホニウムクロリド（ＣＡＳ番号［５６１５５−０８−９］については、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ９ ２３５３−２３５８（２００７）記載の方法に倣って合成した。

【0046】

（比較例１）従来法の特性の比較評価
超遠心分離法により調製したＨＤＬ画分、ＶＬＤＬ画分であって、生理食塩水を用いて両画分中のコレステロール濃度が５０ｍｇ／ｄＬとなるよう希釈した試料（以下、該試料について、ＨＤＬ画分試料、ＶＬＤＬ画分試料ということがある）を用いて、従来法の特性を比較評価した。比較評価は、下記に示す第一試薬（以下、基礎第一試薬ということがある）に対して、ポリアニオンのみを添加した試薬（比較例１−１）、特許文献３に記載の化合物の組み合わせを添加した試薬（比較例１−２）、特許文献４に記載された化合物を添加した試薬（比較例１−３）、特許文献６に記載された化合物を添加した試薬（比較例１−４、比較例１−５）を用いて実施した。基礎第一試薬に添加した各成分名および濃度を表１に示した。第二試薬（以下、基礎第二試薬ということがある）は以下に示す組成の試薬を使用した。

【0047】

第一試薬（基礎第一試薬）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
第二試薬（基礎第二試薬）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ １ 単位／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ １ 単位／ｍＬ
ペルオキシダーゼ ５ 単位／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＢ−６６ １．０ 重量％

【0048】

【表1】

【0049】

測定は日立７１７０形自動分析機（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を使用して行った。ＨＤＬ画分試料またはＶＬＤＬ画分試料２．４μＬに各比較例の第一試薬２４０μＬを添加し、約５分後、基礎第二試薬８０μＬをさらに添加した。基礎第二試薬添加直前と添加後５分後の吸光度を測定し、その差を求めた（２ポイント法）。吸光度測定は、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで行った。

【0050】

比較例１−１の第一試薬を用いて測定したＨＤＬ画分試料の吸光度を１００とし、比較例１−２〜比較例１−５の第一試薬を用いて測定したＨＤＬ画分試料の相対吸光度（％）（各比較例のＨＤＬ画分試料の吸光度×１００／比較例１−１のＨＤＬ画分試料の吸光度）を求めた。さらに、それぞれの第一試薬での測定について、ＨＤＬ画分試料の吸光度に対するＶＬＤＬ画分試料の相対吸光度（％）（同一比較例中の、ＶＬＤＬ画分試料の吸光度×１００／ＨＤＬ画分試料の吸光度）を計算した。ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が大きく、かつＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が小さい条件が、本発明の課題達成に求められる条件、すなわち、コレステロール測定用酵素とＨＤＬ−Ｃとの反応性を維持したまま、コレステロール測定用酵素とＶＬＤＬ−Ｃとの反応性を低下せしめる条件である。結果を表２に示した。

【0051】

【表2】

【0052】

先ず、ＨＤＬ画分試料の相対吸光度（％）は、各比較例の第一試薬のＨＤＬ画分との反応性の相対的な強さを表す。従って数値が１００より小さい場合には、比較例１−１と比較してＨＤＬ画分に対する反応性が低下していることを示す。次に、ＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の相対吸光度（％）は、ＨＤＬ画分試料とＶＬＤＬ画分試料のコレステロール濃度が同一であることより、両画分に対する反応性の差を反映する。数値が１００であれば、ＨＤＬ画分とＶＬＤＬ画分に対する反応性が等しいことを示し、数値が小さいほどＶＬＤＬ画分との反応性が低いことを示す。比較例１−１のＨＤＬ画分試料に対するＶＬＤＬ画分試料の相対吸光度は１９．１％であり、ＨＤＬ画分に対してＶＬＤＬ画分の反応性を抑制可能な条件の一つであるといえる。比較例１−２（特許文献３）は、基礎第一試薬に２価金属塩をさらに共存させた試薬による試験条件であるが、比較例１−１に対してＨＤＬ画分に対する反応性を維持したまま、ＶＬＤＬ画分に対する反応性をさらに低下させることができる。しかし、２価金属塩（特にマグネシウム塩）は自動分析装置の流路洗浄剤であるアルカリ性洗浄液と混合されると、水難溶性の水酸化塩（水酸化マグネシウム）を形成して、流路のつまりをひきおこすなど、装置の保守管理の点で重大な問題を有しており、従来技術の課題としても認識されている。比較例１−３（特許文献４）では、ポリアニオンを単独で使用する比較例１−１と比較してＶＬＤＬ画分の反応性がやや低下しているが、マグネシウムイオンを使用した比較例１−２ほどには抑制できていない。また比較例１−４、１−５（特許文献６）では、ＶＬＤＬ画分の反応性を抑制できていない（特に比較例１−５）ばかりか、ＨＤＬ画分との反応性まで低下していることがわかる。

【0053】

（実施例１）課題解決に効果的な化合物のスクリーニング
超遠心分離法により調製したＨＤＬ画分、ＶＬＤＬ画分であって、生理食塩水を用いて両画分中のコレステロール濃度が５０ｍｇ／ｄＬとなるよう希釈した試料（以下、該試料について、ＨＤＬ画分試料、ＶＬＤＬ画分試料ということがある）を用いて、コレステロール測定用酵素とＶＬＤＬ画分との反応性を低下せしめる化合物のスクリーニングを実施した。スクリーニング用の試薬は、比較例１記載の基礎第一試薬に対して、ポリアニオン、各種ホスホニウム塩化合物、ＢＳＡを表３に示す濃度となるよう添加した試薬（実施例１−１〜実施例１−１６）を使用した。第二試薬は、比較例１記載の基礎第二試薬を使用した。

【0054】

【表3】

【0055】

但し、表中、ＰＴＡはリンタングステン酸ナトリウムを示し、０．０４重量％で使用した。ＤＳはデキストラン硫酸ナトリウムを示し、０．０５重量％で使用した。また、ホスホニウム塩化合物は、Ｐ_111（16）はトリメチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、Ｐ_222(12)はトリエチルドデシルホスホニウムブロミド、Ｐ_222(16)はトリエチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、Ｐ₄₄₄₈はトリブチル−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、Ｐ_444(12)はトリブチルドデシルホスホニウムブロミド、Ｐ_444(16)はトリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、Ｐ_666(14)はトリヘキシルテトラデシルホスホニウムブロミドを示す。濃度はいずれも第一試薬中の濃度を示す。

【0056】

測定および結果の解析は、比較例１と同様に実施した。すなわち、比較例１−１の第一試薬を使用して測定したＨＤＬ画分試料の吸光度を１００とし、各実施例の第一試薬を使用して測定したＨＤＬ画分試料の相対吸光度（％）を求めた。さらに、それぞれの第一試薬を使用する測定において、ＨＤＬ画分試料の吸光度に対するＶＬＤＬ画分試料の相対吸光度（％）を計算した。結果を表４に示した。

【0057】

【表4】

【0058】

表４より、本発明のホスホニウム塩化合物を含有する第一試薬は、表３に示した実施例１−１〜実施例１−１６のいずれにおいても、コレステロール測定用酵素とＨＤＬ画分との反応性を維持したまま、ＶＬＤＬ画分との反応性を抑制できていることがわかる。そして、その反応性抑制の程度は、比較例１−２のマグネシウムイオンを使用した場合と比較して、同程度以上である。本発明のホスホニウム塩化合物を含有する第一試薬は、自動分析装置のアルカリ性洗浄液と混合されても水難溶性の物質を生じないため、比較例１−２の第一試薬を使用する場合に対して、極めて有用な手段であるといえる。また、比較例１−３〜比較例１−５と比較しても、ＶＬＤＬ画分への反応性抑制は本発明のホスホニウム塩化合物を含有する第一試薬の方が優れていることがわかる。
このような効果は、トリメチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、トリエチルドデシルホスホニウムブロミド、トリエチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチル−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、トリヘキシルテトラデシルホスホニウムブロミドのいずれを用いた場合においても認められる。また、その効果は、併用されるポリアニオンの種類に依存するものではなく、リンタングステン酸ナトリウムであってもデキストラン硫酸であっても同様の効果を示す（実施例１−２と、実施例１−３、１−４、１−５とを比較、または実施例１−１０と、実施例１−１１、１−１２とを比較）。さらにデキストラン硫酸を使用する場合は、その分子量に因らず、目的の効果を得ることができる（実施例１−３〜１−５を比較）。またＢＳＡの有無に因っても効果は変動しない（実施例１−９と１−１０を比較）。

【0059】

（実施例２）本発明のホスホニウム塩化合物を添加した第一試薬による血清検体のＨＤＬコレステロール測定値と、簡易ＤＣＭによるＨＤＬコレステロール測定値の相関
ポリアニオンとしてリンタングステン酸ナトリウムを用い、本発明のホスホニウム塩化合物を含む第一試薬（試薬Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ）を、以下の通り調製した。

【0060】

第一試薬（試薬Ａ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量４０００） ０．０５ 重量％
トリメチルヘキサデシルホスホニウムブロミド ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0061】

第一試薬（試薬Ｂ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリエチルドデシルホスホニウムブロミド ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0062】

第一試薬（試薬Ｃ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量４０００） ０．０５ 重量％
トリエチルドデシルホスホニウムブロミド ０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0063】

第一試薬（試薬Ｄ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量４０００） ０．０５ 重量％
トリエチルヘキサデシルホスホニウムクロリド ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0064】

第一試薬（試薬Ｅ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリブチル−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド ０．８ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0065】

第一試薬（試薬Ｆ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリブチルドデシルホスホニウムブロミド ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0066】

第一試薬（試薬Ｇ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド ０．０５ mmol/L
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0067】

第一試薬（試薬Ｈ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド ０．０４５ mmol/L
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｓ−２０７（特許文献４） ０．０４５ mmol/L
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0068】

第一試薬（試薬Ｉ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド ０．０４５ mmol/L
３級ニッサンアミンＢＢ （特許文献６） ０．０４５ mmol/L
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0069】

試薬Ａ〜試薬Ｉの第一試薬および比較例１記載の基礎第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用試薬を用いて、ヒト血清９０検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。ヒト血清中のＨＤＬコレステロール濃度の真値は、ＤＣＭ（非特許文献３）を用いて測定した。ＤＣＭによる測定値をＸ、各実施例の値をＹとし、相関係数、回帰式を比較した。結果を表５に示した。なお、本実施例で使用したヒト血清９０検体の脂質項目の測定値分布は、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）４９〜２８９ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）１９〜１１２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）２４〜１９６ｍｇ／ｄＬ、遊離コレステロール（Ｆ−ＣＨＯ）１２〜８４ｍｇ／ｄＬ、トリグリセリド（ＴＧ）２０〜３５１ｍｇ／ｄＬであり、一部に参考基準値を外れる検体を含むものの、概ね正常な検体から構成される検体群といえる。なお、Ｔ−ＣＨＯはコレステスト（登録商標）ＣＨＯ、ＨＤＬ−Ｃはコレステスト（登録商標）Ｎ ＨＤＬ、ＬＤＬ−Ｃはコレステスト（登録商標）ＬＤＬ、Ｆ−ＣＨＯはピュアオート（登録商標）Ｓ Ｆ−ＣＨＯ−Ｎ、ＴＧはコレステスト（登録商標）ＴＧ（いずれも積水メディカル株式会社）を用いて測定した。またＴＧが２００ｍｇ／ｄＬ以上である検体は、生理食塩水で２倍希釈した上でＤＣＭに供した。

【0070】

上記ＤＣＭの具体的な手順は以下である。ＤＣＭ分画液には、以下の試薬を用いた。デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｌｉｐ５０、Ｓｉｇｍａ）、塩化マグネシウム６水和物（キシダ化学株式会社）、アジ化ナトリウム（キシダ化学株式会社）。測定手順を以下に記す。
（１）分画液の調製
試薬ａ
デキストラン硫酸ナトリウム ２０ ｇ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．５ ｇ／Ｌ
試薬ｂ
塩化マグネシウム ０．７ ｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．５ ｇ／Ｌ
を調製し、両者を等量ずつ混合した。
（２）血清試料と上記（１）で調製した分画液を、体積比１０：１で混合し、ボルテックスミキサーにより混合した。
（３）室温で１０〜３０分静置後、１５００Ｇ、４℃、３０分遠心した。
（４）上清を回収し、総コレステロール含量を、コレステスト（登録商標）ＣＨＯ（積水メディカル株式会社）を用いて測定した。血清試料は分画液により１．１倍に希釈されているため、得られた測定値を１．１倍して、血清試料中のＨＤＬコレステロール値とした。

【0071】

【表5】

【0072】

（比較例２）従来法の第一試薬による測定値と、ＤＣＭによる測定値の相関
従来法の第一試薬として、以下の第一試薬（試薬Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ）を調製した。

【0073】

第一試薬（試薬Ｊ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％

【0074】

第一試薬（試薬Ｋ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
塩化マグネシウム ８ ｍｍｏｌ／Ｌ

【0075】

第一試薬（試薬Ｌ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万） ０．１ 重量％
ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ−２０５ ０．００７ 重量％
ＢＳＡ ０．２ 重量％

【0076】

第一試薬（試薬Ｍ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
デキストラン硫酸ナトリウム（分子量５０万） ０．１ 重量％
セチルトリメチルアンモニウムブロミド ０．００２ 重量％
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0077】

第一試薬（試薬Ｎ）
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．７ ｍｍｏｌ／Ｌ
リンタングステン酸ナトリウム ０．０４ 重量％
セチルトリメチルアンモニウムブロミド ０．００２ 重量％
ＢＳＡ １．０ 重量％

【0078】

試薬Ｊ〜試薬Ｎの第一試薬および比較例１記載の基礎第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用試薬を用いて、実施例２と同一のヒト血清９０検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。ＤＣＭによる測定値をＸ、各実施例の値をＹとし、相関係数、回帰式を比較した。結果を表６に示した。

【0079】

【表6】

【0080】

実施例２から、本発明品のホスホニウム塩とポリアニオンとを含有する第一試薬を用いた測定では、ＤＣＭとの良好な相関関係が認められることがわかった。試薬Ａ〜試薬Ｉのいずれの第一試薬においても、相関は、ホスホニウム塩を含まない試薬Ｊと比べると明らかに有意であり、特許文献３記載の２価金属を用いる方法（試薬Ｋ）、特許文献４記載のポリオキシエチレンラウリルアミンを用いる方法（試薬Ｌ）、特許文献６記載のセチルトリメチルアンモニウムブロミドを用いる方法（試薬Ｍおよび試薬Ｎ）と比べても、概ね正常である検体群を測定した場合のＤＣＭとの相関は、同等もしくは改善していることがわかった。

【0081】

（実施例３）異常検体の測定
試薬Ｅ〜試薬Ｉの第一試薬および比較例１記載の第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用試薬を用いて、表７に示すヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。なお、表７に示された各検体の脂質濃度は、実施例２記載の各脂質測定用試薬を用いて測定した。ＨＤＬコレステロール値は、以下のように算出した。まず血清１．０ｍＬに対し、密度１．００６の食塩水を重層し、２６０００Ｇで３０分遠心した。続いて重層した食塩水と同体積量を上層より除去し、浮上したカイロミクロン層を除去した。このようにして得られたサンプルに対し、ＤＣＭを適応して測定した。ＤＣＭによる測定値、ならびに各試薬を用いた場合の測定値を表８に示した。

【0082】

【表7】

【0083】

【表8】

【0084】

（比較例３）
試薬Ｊ〜試薬Ｎの第一試薬および比較例１記載の基礎第二試薬からなるＨＤＬコレステロール測定用試薬を用いて、表７に示すヒト血清検体中のＨＤＬコレステロール濃度を測定した。ＤＣＭによる測定値、ならびに各試薬を用いた場合の測定値を表９に示した。

【0085】

【表9】

【0086】

表７に示す、トリグリセリドが異常高値であって、総コレステロール、およびＬＤＬコレステロールが概ね正常値であるＩＶ型高脂血症様の検体を比較例に示した試薬Ｊ〜試薬Ｎを用いて測定した場合、表９に示すように、ＤＣＭ値に対して大きく乖離した。一方、本発明のホスホニウム塩およびポリアニオンを含有する試薬Ｅ〜試薬Ｉを用いて表７に示す検体を測定した場合においては、ＤＣＭ値に対して良く一致する値を示した。これは、総コレステロール、およびＬＤＬコレステロールが概ね正常値であり、カイロミクロンやＶＬＤＬが多く含まれる検体において、従来の方法では、カイロミクロンやＶＬＤＬを適切に処理させることができなかったのに対し、本発明のホスホニウム塩をポリアニオンと併用した場合には、カイロミクロンやＶＬＤＬをより確実に処理することができたため、測定精度が向上したと考えられる。

【0087】

（実施例４）界面活性剤との組み合わせ
界面活性剤の種類について試験した。
超遠心分離法により調製したＨＤＬ画分、ＶＬＤＬ画分であって、生理食塩水を用いて両画分中のコレステロール濃度が５０ｍｇ／ｄＬとなるよう希釈した試料（以下、該試料について、ＨＤＬ画分試料、ＶＬＤＬ画分試料ということがある）を用いて、第二試薬中に添加する界面活性剤の種類を変動させた際の影響を検証した。第二試薬は、比較例１に記載した基礎第二試薬において、エマルゲンＢ−６６を添加する替わりに、表１０に示す界面活性剤を添加した試薬を使用した。第一試薬は、従来法として比較例２の試薬Ｊを、基準となる本発明のホスホニウム塩化合物を添加した試薬として、トリブチルドデシルホスホニウムブロミドを含む実施例２の試薬Ｆを使用した。

【0088】

第二試薬
ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ １ 単位／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ １ 単位／ｍＬ
ペルオキシダーゼ ５ 単位／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ
各種界面活性剤 表１０に示す濃度

【0089】

【表10】

【0090】

第一試薬として試薬Ｊを用いて測定したＨＤＬ画分試料の吸光度を１００とし、第一試薬として本発明のホスホニウム塩化合物が添加された試薬Ｆを用いて測定したＨＤＬ画分試料の相対吸光度（％）を、実施例３−１から実施例３−８のそれぞれの第二試薬を使用した試験について算出した。さらに、それぞれの測定において、ＨＤＬ画分試料の吸光度に対するＶＬＤＬ画分試料の相対吸光度（％）を計算した。ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が大きく、かつＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が小さい条件が、課題達成に求められる条件、すなわち、コレステロール測定用酵素とＨＤＬとの反応性を維持したまま、コレステロール測定用酵素とＶＬＤＬとの反応性を低下せしめる条件である。結果を表１１に示した。

【0091】

【表11】

【0092】

同一の界面活性剤を添加した第二試薬どうしで、第一試薬における本発明のホスホニウム塩化合物の添加効果を比較した。非イオン性界面活性剤である、ペグノール００５（実施例３−１）、エマルゲンＡ−６０（実施例３−２）、ニューコール６１０（実施例３−３）、ニューコール２６００ＦＢ（実施例３−４）を含む第二試薬を用いた場合、エマルゲンＢ−６６を使用した場合（実施例２）と同様に、本発明のホスホニウム塩化合物をポリアニオンと共に第一試薬に添加することで、コレステロール測定用酵素のＨＤＬ画分への反応性を概ね維持したまま、ＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が低下する、すなわちコレステロール測定用酵素のＶＬＤＬ画分への反応性を抑制する、目的の反応が認められた。陰イオン性界面活性剤であるエナジコールＬ−３０ＡＮ（実施例３−５）、コール酸ナトリウム（実施例３−６）を使用した場合、第一試薬を試薬ＪとしてＨＤＬ画分試料を測定したところ、所定の反応時間内に吸光度の増加が飽和せず発色反応が終了しなかった（データ示さず）。しかし、第一試薬を本発明の試薬Ｆとした場合、ＨＤＬ画分との反応性が改善され、試薬Ｆ／試薬ＪのＨＤＬ画分の吸光度比は１００％を超えた値となった。また、第一試薬として試薬Ｊを用いた場合のコレステロール測定用酵素とＶＬＤＬ画分との反応性は、エナジコールＬ−３０ＡＮを用いた場合はＨＤＬ画分と同程度（１０８．２％）、コール酸ナトリウムを用いた場合のＶＬＤＬ画分との反応性はＨＤＬ画分の６倍（６３５．５％）も高いものであった。しかし、本発明の試薬Ｆを第一試薬として用いた場合、いずれの界面活性剤においてもＶＬＤＬ画分の反応性は大幅に抑制され、ＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の吸光度比は小さく（１２．５％、３．４％）なった。
両イオン性界面活性剤であるアンヒトール２４Ｂ（実施例３−７）、エナジコールＣ−４０Ｈ（実施例３−８）を使用した場合においても、陰イオン界面活性剤を使用した場合と同様の現象が認められた。すなわち、本発明のホスホニウム塩化合物をポリアニオンと共に第一試薬に添加することで、ＨＤＬ画分への反応性を概ね維持（１０８．７％、１０５．０％）したまま、ＶＬＤＬ画分試料／ＨＤＬ画分試料の相対吸光度が低下した（１０２％→４５．９％、１７１．７％→７．１％）。
以上より、本発明のホスホニウム塩化合物とポリアニオンをリポ蛋白と共存させてＬＤＬおよびＶＬＤＬを処理する方法におけるコレステロール測定用酵素とＶＬＤＬの反応性を抑制する効果は、ＨＤＬを可溶化するために使用されるいずれの界面活性剤の共存下でもその効果を得られることが実証された。

【要約】

脂質異常症のような特殊な病態の検体を測定試料とする場合であっても、ＤＣＭなどの基準測定法の測定値との一致性を向上させることが可能なＨＤＬ−Ｃ測定方法を提供すること。測定試料と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、またはコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、下記一般式（Ｉ）：
【化１】

（式中、Ｒ¹は、直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数８〜２２のアルケニル基を表し、Ｒ²、Ｒ³およびＲ⁴は同一または異なって直鎖もしくは分枝状の炭素数１〜６のアルキル基、または直鎖もしくは分枝状の炭素数２〜６のアルケニル基を表し、Ｘ^-は陰イオンを表す）で表される化合物、およびポリアニオンの存在下で反応させ、ＨＤＬ−Ｃを測定する。