特許 5696036 微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5696036

(24)【登録日】2015年2月13日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】微生物の培養方法、及び微生物による物質の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150319BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20150319BHJP

   C12N 1/16 20060101ALI20150319BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20150319BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150319BHJP

   C12P 7/62 20060101ALI20150319BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20150319BHJP

   C12R 1/19 20060101ALN20150319BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/00 F

   C12N1/00 A

   C12N1/00 P

   C12N1/16 A

   C12N1/16 E

   C12N1/20 A

   C12N1/21

   C12P7/62

   C12P7/62

   C12R1:01

   C12P7/62

   C12R1:19

【請求項の数】13

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2011-507028(P2011-507028)

(86)(22)【出願日】2010年3月31日

(86)【国際出願番号】JP2010002354

(87)【国際公開番号】WO2010113497

(87)【国際公開日】20101007

【審査請求日】2013年2月27日

(31)【優先権主張番号】特願2009-86736(P2009-86736)

(32)【優先日】2009年3月31日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(74)【代理人】

【識別番号】110000556

【氏名又は名称】特許業務法人 有古特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】藤木 哲也

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 俊輔

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００１−３４００７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０３３６７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００３／０５０２７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平１０−１０８６８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biotechnology Letters，２００５年，Volume 27，pp 1405-1410

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol., ，２００８年，Vol.78，pp.955-961

【文献】 日本化学会第89春季年会講演予稿集II，２００９年 ３月１３日，p.1242，4H2-18

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｐ ７／６２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記組成物のいずれかを含む炭素源の存在下で、微生物を培養する工程を含む、微生物の培養方法。
（１）ラウリン酸含有率３０〜７０重量％、ミリスチン酸含有率５〜３０重量％、パルミチン酸含有率５〜３０重量％、オレイン酸含有率１０〜３０重量％である脂肪酸組成物。
（２）ラウリン酸含有率３０〜７０重量％、ミリスチン酸含有率５〜３０重量％、パルミチン酸含有率５〜３０重量％、オレイン酸含有率１０〜３０重量％である脂肪酸（なお、各脂肪酸の含有率は油脂を除いた含有率である）、並びに、油脂を含み、前記脂肪酸の含有率が５０重量％以上である混合組成物。

【請求項2】

前記脂肪酸組成物又は前記混合組成物は、上昇融点が、培養温度＋１０℃以下である、請求項１記載の培養方法。

【請求項3】

前記微生物が、細菌である請求項１記載の培養方法。

【請求項4】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属又はＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である請求項３に記載の培養方法。

【請求項5】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物である請求項４に記載の培養方法。

【請求項6】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである請求項５に記載の培養方法。

【請求項7】

前記微生物が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、又は、
前記アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、
が組み込まれたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである請求項６に記載の培養方法。

【請求項8】

前記微生物が、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である請求項４に記載の培養方法。

【請求項9】

前記微生物が、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである請求項８に記載の培養方法。

【請求項10】

前記微生物が、酵母である請求項１記載の培養方法。

【請求項11】

下記組成物のいずれかを含む炭素源の存在下で、微生物を培養する工程、及び
培養された前記微生物が産生した代謝産物を回収する工程、を含む、微生物代謝産物の製造方法。
（１）ラウリン酸含有率３０〜７０重量％、ミリスチン酸含有率５〜３０重量％、パルミチン酸含有率５〜３０重量％、オレイン酸含有率１０〜３０重量％である脂肪酸組成物。
（２）ラウリン酸含有率３０〜７０重量％、ミリスチン酸含有率５〜３０重量％、パルミチン酸含有率５〜３０重量％、オレイン酸含有率１０〜３０重量％である脂肪酸（なお、各脂肪酸の含有率は油脂を除いた含有率である）、並びに、油脂を含み、前記脂肪酸の含有率が５０重量％以上である混合組成物。

【請求項12】

前記微生物代謝産物が、ポリヒドロキシアルカノエートである請求項１１に記載の製造方法。

【請求項13】

前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体である請求項１２に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、長鎖脂肪酸を、微生物が好適に資化できる炭素源として利用して、微生物の培養や微生物による物質の生産を工業的に効率よく行う方法に関する。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よく微生物にポリヒドロキシアルカノエート（以下ＰＨＡともいう）を産生させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物の培養や微生物による物質の製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっている。

【0003】

微生物の培養や微生物による物質の製造においては、微生物によって好適に資化される炭素源（培養、発酵などのための炭素源）が必要である。その炭素源の代表的なものとして、糖質、油脂、短鎖脂肪酸などが挙げられる。

【0004】

近年、炭素源として、環境問題などを背景に、再生可能な炭素源（特に非石油由来炭素源）、より好ましくは、食糧と競合しない炭素源（所謂、非可食の炭素源）が益々望まれてきている。

【0005】

この観点から、長鎖脂肪酸（例えば、植物由来の長鎖脂肪酸）は、好適な炭素源の候補の一つとして考えられている。長鎖脂肪酸は、例えば、やし、パーム（パーム核を含む）などから得ることができる。やし、パームなどの植物は、油脂中の構成脂肪酸として、長鎖脂肪酸を含むことが知られている。これらの植物に由来する代表的な長鎖脂肪酸としては、炭素数１２のラウリン酸、炭素数１４のミリスチン酸、炭素数１６のパルミチン酸などの長鎖飽和脂肪酸や、炭素数１８のオレイン酸などの長鎖不飽和脂肪酸が挙げられる。

【0006】

これら長鎖脂肪酸は、界面活性剤、石鹸、化粧品などの工業原料として利用されている。しかしながら、微生物を利用する産業では広範に利用されていない。特に、これらを微生物の培養及び微生物による物質の製造のための炭素源として利用する研究は充分には進んでいない。

【0007】

ラウリン酸又はオレイン酸を単独で炭素源として用いて、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａを培養し、ＰＨＡを生産した例（非特許文献１を参照）が報告されている。しかし、オレイン酸を単独で炭素源として用いたものが主に検討されており、ミリスチン酸及びパルミチン酸は検討されていない。

【0008】

また、ラウリン酸又はミリスチン酸を単独で炭素源として用いて、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを培養し、ＰＨＡを生産した例（特許文献１を参照）が報告されているが、ＰＨＡの生産量は１ｇ／L以下と極めて低い。また、パルミチン酸は利用されていない。

【0009】

さらに、ラウリン酸ナトリウムなどの塩を単独で炭素源として用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを培養し、ＰＨＡを生産した例（非特許文献２を参照）が報告されている。しかし、ミリスチン酸及びパルミチン酸は利用されていない。

【0010】

以上の研究は、培養スケールが数ｍｌ〜数Ｌという小規模での実施にとどまっていた。

【0011】

以上のように、種々の長鎖脂肪酸を、微生物の培養や微生物による物質の製造のための炭素源として工業的に好適に利用できる目処は得られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００２／００８６３７７号明細書

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｌｅｅ Ｓ．、ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、６７：２４０−２４４（２０００）

【非特許文献2】Ｒｅｇｉｎａ Ｖ．、ｅｔ．ａｌ．、ＦＥＭＳ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＬＥＴＴＥＲＳ、１１１−１１７（２０００）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、これまで必ずしも有効に産業利用されているとはいえない長鎖脂肪酸を有効に利用する方法を提供することを課題とする。具体的には、上記長鎖脂肪酸を、微生物が好適に資化できる炭素源として利用して、微生物の培養及び微生物による物質の製造を、工業的に効率よく行う方法を提供することを課題とする。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よくＰＨＡを製造する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者らは、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸のそれぞれを単独で炭素源として用いて大腸菌を培養することで、微生物による各脂肪酸の資化性を予備的に検討した。その結果、ミリスチン酸及びパルミチン酸各々の資化性は極めて低く、これらを炭素源として利用するのは極めて難しいと考えられた。また、ラウリン酸も必ずしも満足できる資化性を示さなかった。

【0016】

そこで本発明者らは、微生物による資化性が充分ではない長鎖脂肪酸であるラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸を微生物の培養や微生物による物質の製造で好適に利用するための検討を鋭意行った。

【0017】

その結果、複数の長鎖脂肪酸を含有する組成物、又は、長鎖脂肪酸と油脂との混合組成物が、微生物の培養及び微生物による物質の製造（例えば、ＰＨＡ製造）のための炭素源として極めて好適に利用できることを見出し、本発明を完成させた。

【0018】

すなわち本発明は、下記組成物のいずれかを含む炭素源の存在下で、微生物を培養する工程を含む、微生物の培養方法である。
（１）ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも２種の脂肪酸を含む脂肪酸組成物。
（２）ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸、並びに、油脂を含み、前記脂肪酸の含有率が１０重量％以上である混合組成物。

【0019】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなるより選択される少なくとも１種、並びに、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなるより選択される少なくとも１種、オレイン酸、並びに、油脂を含むことが好ましい。

【0020】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、及び、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、オレイン酸、及び、油脂を含むことが好ましい。

【0021】

前記脂肪酸組成物が、パルミチン酸、及び、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、パルミチン酸、オレイン酸、及び、油脂を含むことが好ましい。

【0022】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも３種を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも３種、並びに、油脂を含むことが好ましい。

【0023】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなるより選択される少なくとも２種、並びに、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなるより選択される少なくとも２種、オレイン酸、並びに、油脂を含むことが好ましい。

【0024】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、パルミチン酸、及び、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及び、油脂を含むことが好ましい。

【0025】

前記脂肪酸組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、及び、オレイン酸を含み、
前記混合組成物が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及び、油脂を含むことが好ましい。

【0026】

前記脂肪酸組成物又は前記混合組成物に含まれる長鎖脂肪酸中の長鎖飽和脂肪酸の含有率が２０重量％以上であることが好ましい。

【0027】

前記脂肪酸組成物又は前記混合組成物に含まれる長鎖脂肪酸中のミリスチン酸及びパルミチン酸の合計含有率が５重量％以上であることが好ましい。

【0028】

前記脂肪酸組成物又は前記混合組成物は、上昇融点が、培養温度＋１０℃以下であることが好ましい。

【0029】

前記混合組成物中の脂肪酸の含有率が、４５重量％以上であることが好ましい。

【0030】

前記微生物が、細菌であることが好ましい。

【0031】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属又はＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物であることが好ましい。

【0032】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属に属する微生物であることが好ましい。

【0033】

前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒであることが好ましい。

【0034】

前記微生物が、
配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、又は、
前記アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、
が組み込まれたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒであることが好ましい。

【0035】

前記微生物が、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物であることが好ましい。

【0036】

前記微生物が、Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであることが好ましい。

【0037】

前記微生物が、酵母であることが好ましい。

【0038】

さらに本発明は、前記組成物のいずれかを含む炭素源の存在下で、微生物を培養する工程、及び
培養された前記微生物が産生した代謝産物を回収する工程、を含む、微生物代謝産物の製造方法にも関する。

【0039】

前記微生物代謝産物が、ポリヒドロキシアルカノエートであることが好ましい。

【0040】

前記ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であることが好ましい。

【発明の効果】

【0041】

本発明により、これまで必ずしも有効に産業利用されているとはいえない長鎖脂肪酸、特に長鎖飽和脂肪酸を有効に利用することが可能になる。具体的には、上記長鎖脂肪酸、特に上記長鎖飽和脂肪酸を、微生物が好適に資化できる炭素源として利用することにより、微生物の培養及び微生物による物質の製造を、工業的に効率よく行うことが可能になる。また、上記炭素源を用いて、工業的に効率よくＰＨＡを製造することが可能になる。

【発明を実施するための形態】

【0042】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0043】

微生物の培養及び微生物による物質の製造では、一般に、グルコースやシュークロースなどの糖質が炭素源として広く利用されている。これら糖質は水への溶解度が高いため、通常の培養条件において微生物が生育している培養液等の液中に溶解しており、炭素源としての利用効率が高い。一方、一般に、水への溶解度が低い炭素源は、微生物による利用効率（資化性）が低くなる。本発明者らは、水への溶解度が極めて低い長鎖脂肪酸、特に長鎖飽和脂肪酸（中でも、ミリスチン酸及びパルミチン酸）は、微生物による資化性が著しく低いことを確認した。

【0044】

加えて、ラウリン酸、ミリスチン酸又はパルミチン酸と油脂との混合物の資化性を検討したところ、混合物中の脂肪酸の含量が高くなるに従い資化性が低下することが認められた。

【0045】

しかしながら、本発明によれば、これらの脂肪酸を炭素源として極めて有効に利用できる。

【0046】

本発明における炭素源は、下記組成物のいずれかを含む。
（１）ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも２種の脂肪酸を含む脂肪酸組成物。
（２）ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪酸、並びに、油脂を含み、前記脂肪酸の含有率が１０重量％以上である脂肪酸−油脂混合組成物。

【0047】

本発明では、炭素源として資化性が低い各種脂肪酸や油脂を組み合わせて使用することで、資化性を改善することができ、しかも、これら脂肪酸の有効利用を可能とした点で極めて意義深い。

【0048】

前記脂肪酸−油脂混合組成物（２）で使用できる油脂は特に限定されないが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸又はオレイン酸を構成成分として含む油脂が好ましい。具体的には、例えば、パーム由来の油脂、やし由来の油脂、コーン由来の油脂、大豆由来の油脂、ナタネ由来の油脂、オリーブ由来の油脂、ヤトロファ由来の油脂等が挙げられる。

【0049】

前記脂肪酸−油脂混合組成物（２）中の脂肪酸の含有率は、資化性を高めると共に、脂肪酸を有効利用する観点から、１０重量％以上である。好ましくは２０重量％以上であり、より好ましくは３０重量％以上であり、さらに好ましくは４０重量％であり、特に好ましくは４５重量％以上であり、最も好ましくは５０重量％以上である。前記含有率の上限は限定されず、１００重量％未満であればよい。ここで、脂肪酸の含有率とは、脂肪酸と油脂の合計量に対する脂肪酸（ここでの「脂肪酸」は、前記油脂を構成する脂肪酸を含まない概念である。）の重量比を指す。

【0050】

本発明の好適な一実施形態によると、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、オレイン酸を含み、かつ、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなる群より選択される少なくとも１種を含む。長鎖不飽和脂肪酸であるオレイン酸は、これ自体、微生物による資化性が高いだけではなく、長鎖飽和脂肪酸であるラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸の資化性を高める効果を有している。そのため、オレイン酸と前記長鎖飽和脂肪酸とを併用することにより、長鎖飽和脂肪酸の有効利用が可能となるだけではなく、相乗的に高い資化性を達成することができる。

【0051】

長鎖飽和脂肪酸の有効利用の観点から、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）中において、長鎖脂肪酸（長鎖飽和脂肪酸と長鎖不飽和脂肪酸の合計）に対し長鎖不飽和脂肪酸の含有率は、２０重量％以上が好ましく、３０重量％以上がより好ましく、４０重量％以上がさらに好ましく、５０重量％以上が特に好ましい。ここで、長鎖脂肪酸に対する長鎖不飽和脂肪酸の含有率とは、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）に使用した長鎖飽和脂肪酸と長鎖不飽和脂肪酸の合計量に対する長鎖飽和脂肪酸の重量比を指す。なお、前記含有率の算出に際し、前記油脂を構成する長鎖飽和脂肪酸及び長鎖不飽和脂肪酸は考慮しない。ここで、長鎖飽和脂肪酸とはラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸を指し、長鎖不飽和脂肪酸とはオレイン酸を指す。

【0052】

より好適には、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、オレイン酸を含み、かつ、ラウリン酸又はパルミチン酸を含む。

【0053】

本発明の好適な他の実施形態によると、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸及びオレイン酸からなる群より選択される少なくとも３種の脂肪酸を含む。より好適には、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、オレイン酸を含み、かつ、ラウリン酸、ミリスチン酸及びパルミチン酸からなる群より選択される少なくとも２種を含む。さらに好適には、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、ラウリン酸、パルミチン酸、及び、オレイン酸を含み、特に好適には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、及び、オレイン酸を含む。

【0054】

特に資化性が低いミリスチン酸及びパルミチン酸を有効利用する観点から、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）は、ミリスチン酸及び／又はパルミチン酸を含有することが好ましい。この場合、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）に含まれる長鎖脂肪酸中のミリスチン酸及びパルミチン酸の合計含有率が５重量％以上であることが好ましい。より好ましくは１０重量％以上であり、さらに好ましくは１５重量％以上である。前記合計含有率の上限は特に限定されず、資化性をより高くするため、７０重量％以下が好ましく、６５重量％以下がより好ましく、６０重量％以下がさらに好ましく、５５重量％以下が特に好ましい。

【0055】

本発明の好適なさらに別の実施形態によると、本発明の脂肪酸組成物（１）又は混合組成物（２）は、その上昇融点が、微生物の培養温度＋１０℃以下である。より好ましくは、微生物の培養温度＋９℃以下であり、さらに好ましくは、微生物の培養温度＋８℃以下であり、特に好ましくは、微生物の培養温度＋７℃以下である。工業的に利用される微生物の多くは、一般に生育適温が３７℃以下である。したがって、多くの場合、本発明の脂肪酸組成物（１）又は混合組成物（２）の上昇融点は４７℃以下であることが好ましい。より好ましくは４６℃以下であり、さらに好ましくは４５℃以下であり、特に好ましくは４４℃以下である。しかし、本発明に用いる組成物の上昇融点は上記に限定されない。微生物の培養温度に応じて適切に上昇融点を設定し、これを満たす組成物を選択し得る。上昇融点の下限は特に規定されない。

【0056】

本発明者らは、長鎖飽和脂肪酸の上昇融点が、ラウリン酸：約４３℃、ミリスチン酸：約５２℃、パルミチン酸：約６２℃であり、長鎖不飽和脂肪酸であるオレイン酸の上昇融点が約１２℃であることを明らかにした。本発明によれば、上記脂肪酸を複数含有することで、組成物の上昇融点を微生物の生育温度に合わせて適切に調節し、微生物による資化性を高めることができる。上昇融点の高いミリスチン酸やパルミチン酸の場合においても、本発明の効果が好適に発揮される。驚くべきことに、培養温度において固体状態である組成物であっても炭素源として有効に利用できる。

【0057】

本発明において、脂肪酸組成物（１）又は混合組成物（２）の上昇融点は以下の方法で測定する事ができる。
（１）両端が開いている毛細管（内径１ｍｍ、外径２ｍｍ以下、長さ５０〜８０ｍｍ）の一端を完全に融解した試料に浸し、約１０ｍｍの高さまで試料を満たし、速やかに氷片等で毛細管内部の試料を固化させる。
（２）固化した試料を含む毛細管を、１０℃以下で２４ｈ、又は氷上で１ｈ放置した後試験に供する。
（３）上昇融点測定器（ＥＬＥＸ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製 ＥＸ‐８７１Ａ）に毛細管をセットする。
（４）予想される融点よりも約２０℃低い温度の水を満たした容器に毛細管を浸し、温度計の下端を水面下３０ｍｍの深さに置く。
（５）容器内の水を適当な方法でかき混ぜながら、最初は２℃／ｍｉｎ．ずつ水温が上昇するように加熱する。
（６）予想される融点の１０℃下に達した後は０．５℃／ｍｉｎ．ずつ水温が上昇するように加熱する。
（７）試料が毛細管中で上昇を始める温度を上昇融点とする。

【0058】

本発明の脂肪酸組成物（１）及び混合組成物（２）の具体的な組成は、使用する微生物の種類、微生物が産生する物質の種類、培養の諸条件（培地成分、ｐＨ、培養温度など）などによって異なり、必ずしも一律に規定できない。しかしながら、いくつかの好適な組成を示すことができる。好適な組成の一つは、ラウリン酸含有率３０〜７０重量％、ミリスチン酸含有率５〜３０重量％、パルミチン酸含有率５〜３０重量％、オレイン酸含有率１０〜３０重量％である。好適な組成の一つは、ラウリン酸含有率１０〜４０重量％、ミリスチン酸０〜１０重量％、パルミチン酸２０〜４０重量％、オレイン酸３０〜５０重量％である。好適な組成の一つは、ラウリン酸含有率１５〜４５重量％、パルミチン酸含有率１５〜４５重量％、オレイン酸含有率２０〜５０重量％である。以上の含有率の数値は、組成物中に含まれる脂肪酸（ここでの「脂肪酸」は、前記油脂を構成する脂肪酸を含まない概念である。）の合計量に対する割合を示す。混合組成物（２）に関しては、油脂を除いた含有率である。

【0059】

しかしながら、上記組成はあくまで好適な組成の例であり、本発明は上記組成に限定されない。また、上記組成物には必要に応じて油脂を加えても良い。

【0060】

本発明の脂肪酸組成物（１）又は混合組成物（２）を含む炭素源は、さらに他の脂肪酸や、糖質、タンパク質、アミノ酸等を含んでもよい。

【0061】

本発明により微生物を培養して微生物に産生させる微生物代謝物質としては、例えば、エタノール、ブタノール、プロパノールなどのアルコール類、乳酸、酢酸、アミノ酸、核酸などの酸類、脂質類、油脂類やポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などが挙げられる。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生・蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生し蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。そのため、ＰＨＡは、本発明を用いて生産する物質の好例の一つである。

【0062】

ＰＨＡの種類としては、微生物が生産するＰＨＡであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１つのモノマーが重合して形成されるＰＨＡや、炭素数４〜１６の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーが共重合して形成される共重合ＰＨＡである。例えば、炭素数４の３−ヒドロキアルカン酸からなるポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、炭素数４と６の３−ヒドロキシアルカン酸からなるポリヒドロキシブチレートヘキサノエート（ＰＨＢＨ）、炭素数４と５の３−ヒドロキシアルカン酸からなるポリヒドロキシブチレートバレレート（ＰＨＢＶ）、炭素数４〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸からなるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）などが挙げられる。

【0063】

本発明の微生物の培養、及び、微生物による有用物質の製造に用いられる微生物としては特に限定はないが、天然から単離された微生物や、遺伝子操作された微生物等を好適に使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カピリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属等の細菌類や、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類を使用することが好ましい。勿論、前記微生物を人工的突然変異処理して得られる変異株、及び、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。

【0064】

ＰＨＡの製造に用いる微生物としては、例えばカピリアビダス・ネケータ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）等のカピリアビダス属、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｌａｔａｓ）等のアルカリゲネス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・レジノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）等のシュードモナス属、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等のバチルス属、アゾトバクター属、ノカルディア属、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｏ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）等のアエロモナス属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属などが挙げられる（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、４５０−４７２項、１９９０年）。遺伝子工学的な手法を用いて、ＰＨＡ合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＡを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。例えばエシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属等のグラム陰性の細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等のグラム陽性の細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等の酵母類、植物などの高等生物細胞も利用できるが、多量のＰＨＡを蓄積できる点で微生物を用いることが好ましい。

【0065】

ＰＨＡの１種である３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体（ＰＨＢＨ）を生産するには、例えばＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅやＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａなど元来ＰＨＢＨを生産する微生物を用いたり、元来ＰＨＢＨを生産しない微生物に遺伝子工学的な手法を用いて、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子等を導入することにより、人為的にＰＨＢＨを生産させる改変を施した生物細胞を用いることもできる。遺伝子を導入するホスト微生物としては、たとえばＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを好適に用いることができる。また、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子としてはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ又はＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子や、それらの改変体などを用いることができる。改変体としては、天然のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素においてアミノ酸基が欠失、付加、挿入、若しくは置換されたポリヒドロキシアルカノエート合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、又は、前記アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、が組み込まれたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒを用いることができる。

【0066】

本発明により微生物を培養するには、培地に炭素源を添加する方法を用いる。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や培養温度、培養時間については、培養する微生物の種類に応じて適宜決定すればよく、特に限定されない。連続的又は間欠的に培地に炭素源を添加することが好ましい。本発明における炭素源は、培地に添加する際にすでに混合物であっても良いし、各構成成分を別々に添加して培地内で混合しても良い。

【0067】

本発明のＰＨＡ等の微生物代謝産物の製造方法は、上述した培養方法によって微生物内に微生物代謝産物を蓄積させ、その後、周知の方法を用いて菌体から微生物代謝産物を回収すれば良い。微生物代謝産物がＰＨＡである場合、例えば、次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水及びメタノール等の有機溶剤により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、ＰＨＡを乾燥させて回収することができる。

【0068】

本発明者らは、本発明が２．５Ｌ規模の培養で好適に実施でき、更に１６０００Ｌ以上の規模でも好適に再現できることを確認した。この５０００倍以上のスケールアップの達成は、より大きな工業的規模での製造において、本発明の効果が好適に、かつ、最大限に発揮されることを意味する。

【0069】

本発明において、前記脂肪酸組成物（１）又は前記混合組成物（２）を炭素源として使用することによる資化性向上とは、資化しにくい長鎖飽和脂肪酸（ラウリン酸、ミリスチン酸又はパルミチン酸）を複数種類含有すること、あるいは、資化しにくい前記長鎖飽和脂肪酸と資化しやすい長鎖不飽和脂肪酸（オレイン酸）とを含有することによって、資化しにくい前記長鎖飽和脂肪酸の資化性がそれらを単独で使用する場合よりも向上することを意味する。あるいは、資化しにくい前記長鎖飽和脂肪酸と油脂とを含有することによって、資化しにくい前記長鎖飽和脂肪酸の資化性がそれらを単独で使用する場合よりも向上することを意味する。また、本発明において、資化性の向上とは、時間当たりの炭素源の消費量が増加し、その結果、微生物菌体の生産量や微生物が産生する物質の生産量が増加することを意味する。

【0070】

微生物菌体の生産量は、吸光度法、乾燥菌体重量測定法などの公知の方法で測定できる。微生物が産生する物質の生産量は、ＧＣ法、ＨＰＬＣ法などの公知の方法で測定できる。細胞中に蓄積されたＰＨＡの含量は、加藤らの方法（Ａｐｐｌ．ＭｉｃｒｏＢｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．,４５巻、３６３頁、（１９９６）；Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．,６９巻、５１５頁（１９９６））に従い、培養細胞からクロロホルムなどの有機溶媒を用いて抽出し、乾燥することで測定できる。

【実施例】

【0071】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。

【0072】

各組成物の上昇融点は上述した方法により算出した。

【0073】

（実施例１）大腸菌の培養
種々の炭素源を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株（タカラバイオ社製）を培養した。前培地としてはＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）を用いた。生育試験にはＭ９培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、３ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ₄Ｃｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．００１ｗ／ｖ％ Ｔｈｉａｍｉｎｅ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ₂）を用いた。

【0074】

Ｅ．ｃｏｌｉのグリセロールストックを前培地に接種して３７℃にて１２時間培養し、前培養を行なった。その後、前培養液を、５０ｍｌのＭ９培地を入れた５００ｍｌ用の坂口フラスコに２ｖ／ｖ％で接種した。次に、炭素源として、表１に示した各種脂肪酸組成物を０．２５ｗ／ｖ％の濃度にて坂口フラスコに入れ、３７℃で９６時間振とう培養した。炭素源は坂口フラスコ内に一括添加した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表１に示した。

【0075】

【表1】

【0076】

（比較例１）
各種脂肪酸組成物の代わりに、炭素源として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、又は、オレイン酸を用いた以外は実施例１と同じ条件にて、大腸菌を培養し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表１に示した。

【0077】

（実施例２）Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４株の培養
種々の炭素源を用いて、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４株（ＤＳＭ５４１、ＤＳＭＺより入手）を培養した。この株はＰＨＡを合成しない株である。

【0078】

前培地の組成は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄とし、ｐＨは６．８とした。

【0079】

生育試験培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）とした。

【0080】

Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４株のグリセロールストックを前培地に接種して３０℃にて１２時間培養し、前培養を行なった。その後、前培養液を、５０ｍｌの生育試験培地を入れた５００ｍｌ用の坂口フラスコに２ｖ／ｖ％で接種した。次に、炭素源として、表２に示した各種脂肪酸組成物を１．０ｗ／ｖ％の濃度にて坂口フラスコに入れ、３０℃で２４時間振とう培養した。炭素源は坂口フラスコ内に一括添加した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表２に示した。

【0081】

【表2】

【0082】

（比較例２）
各種脂肪酸組成物の代わりに、炭素源として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、又は、オレイン酸を用いた以外は実施例２と同じ条件にて、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ ＰＨＢ−４株を培養し、乾燥菌体重量を測定した。結果を表２に示した。

【0083】

（実施例３）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓの培養によるＰＨＡ生産
種々の炭素源を用いて微生物を培養することで、ＰＨＡの生産を行なった。

【0084】

微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１４２３５株（ＡＴＣＣより入手）を用いた。

【0085】

種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄とし、ｐＨは６．８とした。

【0086】

前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２９ ｗ／ｖ％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）とした。前培養培地での炭素源であるパームオレインオイルは１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

【0087】

ＰＨＡ生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。

【0088】

まず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１４２３５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、種母培養を行なった。その後、種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７〜６．８の間でコントロールしながら２４時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0089】

次に、前培養液を、６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度６５０ｒｐｍ、通気量８．１Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。使用した炭素源を表３に示した。油脂としてはパームオレインオイルを使用した。培養は４８時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

【0090】

得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌの酢酸エチルを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮した後、約１００ｍｌのメタノールを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置してＰＨＡを析出させた。析出したＰＨＡをメタノール及び酢酸エチルから分離し、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のＰＨＡ含量を算出した。乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を表３に示した。

【0091】

【表3】

【0092】

生産されたＰＨＡのモノマー組成は以下のようにガスクロマトグラフィーによって分析した。乾燥ＰＨＡの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＡ分解物のモノマー組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａを用い、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度を１００℃とし、１００℃から２００℃までは８℃／分の速度で昇温し、さらに２００℃から２９０℃までは３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、実施例３で生産されたＰＨＡが、炭素数４〜１４の３−ヒドロキシアルカン酸モノマーから構成されるＰＨＡであることを確認した。

【0093】

（比較例３）
各種脂肪酸組成物又は混合組成物の代わりに、炭素源として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、又は、パームオレインオイルを単独で用いた以外は実施例３と同じ条件にて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ ＡＴＣＣ１４２３５株を培養し、乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を測定した。結果を表３に示した。

【0094】

（実施例４）Ｃ．ｍａｌｔｏｓａの培養によるＰＨＡ生産
種々の炭素源を用いて微生物を培養することで、ＰＨＡの生産を行なった。

【0095】

微生物として、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ ＡＨＵ−７１ ｐＡＲＲ−１４９／１７１ＮＳｘ２−ｐｈｂＢ株（国際公開第２００５／０８５４１５号公報を参照）を用いた。

【0096】

前培地にはＹＮＢ培地（０．６７ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２ｗ／ｖ％ Ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いた。ＰＨＡ生産培地には、Ｍ２培地（１２．７５ｇ／Ｌ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．５６ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．３３ｇ／Ｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄・３Ｈ₂Ｏ、０．０８ｇ／Ｌ ＫＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．４１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ_２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ Ｃａ（ＮＯ₃）₂・４Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ₃・４Ｈ₂Ｏ）に、０．４５ｍｌ／Ｌの微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１ｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、８ｇ／ｍＬ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、６．４ｇ／ｍＬ ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、０．８ｇ／ｍＬ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）を添加した培地を用いた。

【0097】

Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ ＡＨＵ−７１ ｐＡＲＲ−１４９／１７１ＮＳｘ２−ｐｈｂＢ株のグリセロールストックを、５０ｍｌの前培地を入れた５００ｍｌ用の坂口フラスコに５００μｌ接種した。これを培養温度３０℃で２０時間培養した。得られた培養液を、３００ｍｌのＰＨＡ生産培地を入れた２Ｌ用の坂口フラスコに１０ｖ／ｖ％で接種した。さらに、炭素源として、表４に示した各種脂肪酸組成物又は混合組成物を２ｗ／ｖ％の濃度にて坂口フラスコに入れ、３０℃で４８時間振とう培養した。炭素源は坂口フラスコ内に一括添加した。培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

【0098】

得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮し、その後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置してＰＨＡを析出させた。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のＰＨＡ含量を算出した。乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を表４に示した。

【0099】

【表4】

【0100】

生産されたＰＨＡのモノマー組成を実施例３と同様の方法にて分析した。その結果、実施例４で生産されたＰＨＡが、炭素数４の３−ヒドロキシ酪酸と炭素数６の３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体（ＰＨＢＨ）であることを確認した。

【0101】

（比較例４）
各種脂肪酸組成物又は混合組成物の代わりに、炭素源として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、又は、パームオレインオイルを用いた以外は実施例４と同じ条件にて、Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ ＡＨＵ−７１ ｐＡＲＲ−１４９／１７１ＮＳｘ２−ｐｈｂＢ株を培養し、乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を測定した。結果を表４に示した。

【0102】

（実施例５）ＫＮＫ−００５株の培養によるＰＨＡ生産
微生物として、ＫＮＫ−００５株（米国特許第７３８４７６６号明細書を参照）を用いた。

【0103】

種母培地の組成は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄とし、ｐＨは６．８とした。

【0104】

前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）とした。前培養培地での炭素源であるパームオレインオイルは１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

【0105】

ＰＨＡ生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。

【0106】

まず、ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0107】

次に、前培養液を、２．５Ｌの生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。使用した炭素源を表５に示した。油脂としてはパームオレインオイルを使用した。培養は６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

【0108】

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮した後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置してＰＨＡを析出させた。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のＰＨＡ含量を算出した。乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を表５に示した。

【0109】

生産されたＰＨＡのモノマー組成を実施例３と同様の方法にて分析した。その結果、実施例５で生産されたＰＨＡが、炭素数４の３−ヒドロキシ酪酸と炭素数６の３−ヒドロキシヘキサン酸の共重合体（ＰＨＢＨ）であることを確認した。

【0110】

【表5】

【0111】

（比較例５）
各種脂肪酸組成物又は混合組成物の代わりに、炭素源として、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及びパームオレインオイルを用いた以外は実施例５と同じ条件にて、ＫＮＫ−００５株を培養し、乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を測定した。結果を表５に示した。

【0112】

（実施例６）実施例５における炭素源１９、２３、２４及び２５を用いたスケールアップの検証
実施例５にて、長鎖飽和脂肪酸単独の使用と比較して微生物の生育量及びＰＨＡの生産量が向上した、複数の長鎖脂肪酸と油脂とを含有する炭素源（炭素源１９、２３、２４及び２５）を用い、スケールアップの検証を行なった。

【0113】

微生物としては、実施例５と同様、ＫＮＫ−００５株を用いた。

【0114】

種母培地（第1世代、第2世代）の組成は、１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄とし、ｐＨは６．８とした。

【0115】

前培養培地の組成は、１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）とした。前培養培地での炭素源であるパームオレインオイルは１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。

【0116】

ＰＨＡ生産培地の組成は、０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏを溶かしたもの）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。

【0117】

第１世代培養として、まず、ＫＮＫ−００５株のグリセロールストックを、５０ｍｌの種母培地を入れた５００ｍｌ用の坂口フラスコに５００μｌ接種した。これを培養温度３０℃で２０時間培養した。次に第２世代培養として、第１世代培養液を、５００ｍｌの種母培地を入れた２Ｌ用の坂口フラスコに１０ｖ／ｖ％で接種し、培養温度３０℃で２４時間培養した。次に種母培養として、第２世代培養液を、４００Ｌの前培養培地を入れた容量１０００Ｌの培養槽に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度２７０ｒｐｍ、通気量２００Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７〜６．８の間でコントロールしながら２４時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

【0118】

次に、本培養として、前培養液を、１６０００ＬのＰＨＡ生産培地を入れた容量４０００００Ｌの培養槽に２．５ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度８６ｒｐｍ、通気量５０００Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨを６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。培養は６５時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄した後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

【0119】

得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮した後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置してＰＨＡを析出させた。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、菌体内のＰＨＡ含量を算出した。乾燥菌体重量、ＰＨＡ含量、及びＰＨＡ生産量を表６に示した。

【0120】

【表6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]