特許 5696592 質量分析データ解析方法及び解析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5696592

(24)【登録日】2015年2月20日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】質量分析データ解析方法及び解析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20060101AFI20150319BHJP

【ＦＩ】

   G01N27/62 D

【請求項の数】6

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2011-124792(P2011-124792)

(22)【出願日】2011年6月3日

(65)【公開番号】特開2012-251878(P2012-251878A)

(43)【公開日】2012年12月20日

【審査請求日】2013年10月18日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 平成２３年４月１５日、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｍｓ．ｏｒｇ／ｔａｂｉｄ／２２５／ｔｙｐｅ／ｓｅａｒｃｈｒｅｓｕｌｔｓ／Ｄｅｌａｕｌｔ．ａｓｐｘ

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】特許業務法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】森本 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】村瀬 雅樹

【審査官】 伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−１１７３７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２００８／０５９５６７（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−０３８６６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２００９／０８１４４６（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３９４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００４−２５７９２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２７８７１２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２７／６０−２７／７０

Ｈ０１Ｊ ４０／００−４９／４８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

同一被検試料に対するＭＳ^pスペクトルデータ（ｐ≧２である整数）とＭＳ^qスペクトルデータ（ｑ＞ｐである任意の一つの整数又は互いに異なる複数の整数）とを利用し、データベース検索により該被検試料中のペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
a)前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストを用い、データベースに登録されているペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を算出し、該指標値に基づいて候補ペプチドを選定する候補選定ステップと、
b)該候補選定ステップにより選定された候補ペプチドについて理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報を求め、その中で、対応するピークが前記ＭＳ^pスペクトルデータ中に存在せず前記ＭＳ^qスペクトルデータ中に存在するものを抽出する追加情報抽出ステップと、
c)該追加情報抽出ステップにおいて抽出されたピークを前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストに追加することにより該ピークリストを修正するピークリスト修正ステップと、
d)該ピークリスト修正ステップにおいて前記候補ペプチドに対応して修正されたピークリストに基づいて、該候補ペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を再計算する再計算ステップと、
を有し、再計算された指標値に基づいて前記候補ペプチドが正解ペプチドであることの信頼度を判定可能としたことを特徴とする質量分析データ解析方法。

【請求項2】

請求項１に記載の質量分析データ解析方法であって、
前記候補選定ステップでは、指標値が所定閾値以上である候補ペプチドを複数選定し、
その複数の候補ペプチドの全てについてそれぞれ、前記追加情報抽出ステップ、前記ピークリスト修正ステップ、及び前記再計算ステップ、による処理を実行し、
前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値を比較して最も指標値の高い候補ペプチドを正解ペプチドであるとして同定することを特徴とする質量分析データ解析方法。

【請求項3】

請求項２に記載の質量分析データ解析方法であって、
前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値の分布に基づいて、前記正解ペプチドであるとされた指標値に対応した期待値を算出してその同定の信頼度情報として提供することを特徴とする質量分析データ解析方法。

【請求項4】

同一被検試料に対するＭＳ^pスペクトルデータ（ｐ≧２である整数）とＭＳ^qスペクトルデータ（ｑ＞ｐである任意の一つの整数又は互いに異なる複数の整数）を利用し、データベース検索により該被検試料中のペプチドを同定する質量分析データ解析装置において、
a)前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストを用い、データベースに登録されているペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を算出し、該指標値に基づいて候補ペプチドを選定する候補選定手段と、
b)該候補選定手段により選定された候補ペプチドについて理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報を求め、その中で、対応するピークが前記ＭＳ^pスペクトルデータ中に存在せず前記ＭＳ^qスペクトルデータ中に存在するものを抽出する追加情報抽出手段と、
c)該追加情報抽出手段により抽出されたピークを前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストに追加することにより該ピークリストを修正するピークリスト修正手段と、
d)該ピークリスト修正手段により前記候補ペプチドに対応して修正されたピークリストに基づいて、該候補ペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を再計算する再計算手段と、
を備え、再計算された指標値に基づいて前記候補ペプチドが正解ペプチドであることの信頼度を判定可能としたことを特徴とする質量分析データ解析装置。

【請求項5】

請求項４に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記候補選定手段では、指標値が所定閾値以上である候補ペプチドを複数選定し、
その複数の候補ペプチドの全てについてそれぞれ、前記追加情報抽出手段、前記ピークリスト修正手段、及び前記再計算手段、による処理を実行し、
前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値を比較して最も指標値の高い候補ペプチドを正解ペプチドであるとして同定することを特徴とする質量分析データ解析装置。

【請求項6】

請求項５に記載の質量分析データ解析装置であって、
前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値の分布に基づいて、前記正解ペプチドであるとされた指標値に対応した期待値を算出してその同定の信頼度情報として提供することを特徴とする質量分析データ解析装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチド等の生体由来の高分子化合物に対してＭＳⁿ分析を実行して収集されたデータを解析処理し、上記高分子化合物を同定したりその構造を解析したりする質量分析データ解析方法及び解析装置に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、質量分析計を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップなどにおける特定イオンの捕捉と衝突誘起解離（ＣＩＤ）等のイオン開裂とを行う、いわゆるＭＳⁿ分析が威力を発揮している。

【0003】

ＭＳⁿ分析を利用してタンパク質を同定する一般的な手法としては、まず、タンパク質を化学的に又は酵素消化により分解してペプチド断片の混合物とし、このペプチド断片混合物を質量分析に供してマススペクトル（ＭＳ¹スペクトル）を取得する。続いて、ペプチド断片混合物のマススペクトルデータの中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンに対しＣＩＤを実施し、開裂により生じたフラグメントイオンの質量分析、つまりＭＳ²分析を実行する。ＣＩＤにより、特定のペプチドを構成するアミノ酸配列の様々な位置で結合が切れ、異なるアミノ酸残基を持つフラグメント（断片）が生じる。そのため、取得されるＭＳ²スペクトルは、特定のペプチドのアミノ酸配列を反映したものとなる。

【0004】

このようなＭＳ²スペクトルを利用してペプチドのアミノ酸配列の推定、つまりペプチドの同定を行う際には、ＭＳ／ＭＳイオンサーチと呼ばれるデータベース検索手法が広く利用されている。ＭＳ／ＭＳイオンサーチは米国マトリクスサイエンス（Matrix Science）社が提供しているマスコット（MASCOT）と名付けられた検索エンジンソフトウエアに含まれるものがよく知られている（非特許文献１参照）。ＭＳ／ＭＳイオンサーチでは、得られた実測のＭＳ²スペクトルと、タンパク質データベースに登録されている全タンパク質を同じ酵素で消化して（又は化学的処理により）得られるペプチド断片に対してコンピュータ内で理論的なフラグメンテーションを計算して得られる仮想的なＭＳ²スペクトルとの一致度が統計的に判断され、同時にペプチドの分子量情報も考慮したスコア化がなされる。したがって、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ検索結果画面には、通常、分析対象であるペプチドに該当する可能性が高い複数の候補ペプチドがスコアで順位付けされて一覧表示される。

【0005】

また、特定のペプチドに対応したＭＳ²スペクトルからさらに適当なプリカーサイオンを選択し、これをＣＩＤにより開裂させて質量分析に供することによりＭＳ³スペクトルを得ることができる。この実測ＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索を実行することにより、ＭＳ²スペクトルのみを用いてペプチドを同定する場合と比べ、より信頼度の高い同定結果を得ようとする手法が従来開発されている。

【0006】

非特許文献２に開示されている検索結果マージ手法では、同一被検試料に対して取得したＭＳ²スペクトルとＭＳ³スペクトルとに基づくデータベース検索をそれぞれ独立に行い、各データベース検索により候補ペプチドとスコアとをそれぞれ取得する。そのあと、それぞれの候補ペプチドの信頼度の確率に基づいてそれら候補ペプチドが正解ペプチド（真のペプチド）である確率を計算し直して候補ペプチドと併せて出力する。

【0007】

また非特許文献３に開示されている階層的検索手法では、まずＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索を実行して候補ペプチドを絞り込んだ後に、その各候補ペプチドについてＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索を行って、複数の候補ペプチドの中の一つを正解ペプチドとして同定する。具体的には、ＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索で絞り込まれた候補ペプチドに対する理論ＭＳ³フラグメントの質量情報（ＭＳ³でのイオンのフラグメンテーションを理論的に予測して得られるＭＳ³フラグメントイオンの質量電荷比情報）と実測ＭＳ³スペクトル上のピークの質量電荷比との一致性が最良であるものを正解のペプチドであると断定する。

【0008】

簡単に言えば、検索結果マージ手法はＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索とＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索とを並列的に行う手法であり、階層的検索手法はＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索とＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索とを直列的に行う手法であると言うことができる。しかしながら、上記いずれの手法でも次のような問題があり、ペプチドの同定精度を上げる上でＭＳ³スペクトル（或いはそれ以上のＣＩＤを繰り返して取得するＭＳⁿスペクトル）を必ずしも有効に活用できていないという課題を有する。

【0009】

即ち、上記の検索結果マージ手法では、ＭＳ²スペクトル、ＭＳ³スペクトルのいずれに基づくデータベース検索においても、検索結果のスコアが最も高い候補ペプチド以外の候補は考慮されない。そのため、ＭＳ²スペクトルのみに基づくデータベース検索を行った場合と比較して高い信頼度で以てペプチドを同定できるのは、ＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索とＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索との両方で同じペプチドがスコア１位で同定できた場合のみである。実際にはこのようなケースは稀であることから、検索結果マージ手法は同定精度を上げる上であまり有効ではないと言える。また、検索結果マージ手法では信頼度の指標として生起確率を用いているが、そもそも独立ではない複数の生起確率を乗算して得られた値を最終的なペプチドの生起確率とみなしているため、信頼度を表す値として必ずしも妥当な値とはならないという問題もある。

【0010】

他方、上記の階層的検索手法では、候補ペプチドについてのＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索で一致性が最良にならないと正解ペプチドが正しく同定されないが、一般的に、正解ペプチドであってもＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索で一致性が最良になるとは限らない。特に、候補ペプチドの数が多い場合、ＭＳ³の段階において候補の中で正解ペプチドの一致性が最良になる確率はかなり低くなる。また、この手法では、同定されたペプチドの信頼度を示す期待値やスコアのような、定量的な或いは統計的な数値は算出されない。このため、得られた同定結果を分析者が正解と判断してよいか検証することが困難である。

【0011】

なお、非特許文献３においては、階層的検索手法がきわめて有効であることが示されているが、本願発明者の検討によれば、これは該文献において前提としている装置がフーリエ変換質量分析計（ＦＴ−ＭＳ）であるためであると考えられる。ＦＴ−ＭＳでは、プリカーサイオンの選択及びイオン開裂を繰り返す度に質量精度は悪化するものの、非常に高い感度でフラグメントイオンが検出されるという特性がある。このため、ＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索において候補ペプチドを十分に少ない数に絞り込むことが容易であり、その候補ペプチドに対してＭＳ³スペクトルを使用したデータベース検索を実行したときに結果が擬陽性（正解でないものを正確であると誤って判定する状態）となるケースが少なくて済む。しかしながら、現在、ペプチド同定等に広く使用されているマトリクス支援レーザ脱離イオン化イオントラップ質量分析計では、プリカーサイオンの選択及びＣＩＤによる開裂操作を繰り返す度にイオン量が減少するために感度は悪化するが、質量精度は向上していく。そのため、上記階層的検索手法を用いた場合、ＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索では候補ペプチドが多すぎて、ＭＳ³スペクトルに基づくデータベース検索を行ったときに結果が擬陽性となる可能性が比較的高い。そのため、ＭＳ³スペクトルを利用する意味があまりないと言える。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】“MS/MS Ions Search”、[online]、マトリクス・サイエンス社（Matrix Science Inc.）、［平成２３年５月１８日検索］、インターネット＜URL：http://www.matrixscience.com/help/mis_help.html＞

【非特許文献2】ウリンツ（P. J. Ulintz）、ほか４名、「インベスティゲイティング・エムエス２／エムエス３・マッチング・スタティスティクス：ア・モデル・フォー・カップリング・コンセクティブ・ステージ・マス・スペクトロメトリー・データ・フォー・インクリーズド・ペプタイド・アイデンティフィケイション・コンフィデンス（Investigating MS2/MS3 matching statistics: a model for coupling consecutive stage mass spectrometry data for increased peptide identification confidence）」、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular Proteomics）、2008年、Vol.7、pp.71-87

【非特許文献3】シュー（Hua Xu）、ほか３名、「ア・ヒエラルヒカル・エムエス２／エムエス３・データベース・サーチ・アルゴリズム・フォー・オートメイテッド・アナリシス・オブ・フォスフォペプタイド・タンデム・マス・スペクトラ（A hierarchical MS2/MS3 database search algorithm for automated analysis of phosphopeptide tandem mass spectra）」、プロテオミクス（Proteomics）、2009年、Vol.9、pp.1763-1770

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その主な目的は、ＭＳ／ＭＳイオンサーチ等のデータベース検索を行ってペプチドを同定する際に、ＭＳ²スペクトルのほかにＭＳ³スペクトル又はｎが４以上であるＭＳⁿスペクトルを有効に利用してペプチドの同定精度を向上させるとともに、その同定結果を分析者が確認したり検証したりするために有用で定量的な情報を併せて得ることができる質量分析データ解析方法及び解析装置を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上記課題を解決するために成された第１発明は、同一被検試料に対するＭＳ^pスペクトルデータ（ｐ≧２である整数）とＭＳ^qスペクトルデータ（ｑ＞ｐである任意の一つの整数又は互いに異なる複数の整数）とを利用し、データベース検索により該被検試料中のペプチドを同定する質量分析データ解析方法であって、
a)前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストを用い、データベースに登録されているペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を算出し、該指標値に基づいて候補ペプチドを選定する候補選定ステップと、
b)該候補選定ステップにより選定された候補ペプチドについて理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報を求め、その中で、対応するピークが前記ＭＳ^pスペクトルデータ中に存在せず前記ＭＳ^qスペクトルデータ中に存在するものを抽出する追加情報抽出ステップと、
c)該追加情報抽出ステップにおいて抽出されたピークを前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストに追加することにより該ピークリストを修正するピークリスト修正ステップと、
d)該ピークリスト修正ステップにおいて前記候補ペプチドに対応して修正されたピークリストに基づいて、該候補ペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を再計算する再計算ステップと、
を有し、再計算された指標値に基づいて前記候補ペプチドが正解ペプチドであることの信頼度を判定可能としたことを特徴としている。

【0015】

また上記課題を解決するために成された第２発明は、第１発明に係る質量分析データ解析方法を具現化するための装置であって、同一被検試料に対するＭＳ^pスペクトルデータ（ｐ≧２である整数）とＭＳ^qスペクトルデータ（ｑ＞ｐである任意の一つの整数又は互いに異なる複数の整数）を利用し、データベース検索により該被検試料中のペプチドを同定する質量分析データ解析装置において、
a)前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストを用い、データベースに登録されているペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を算出し、該指標値に基づいて候補ペプチドを選定する候補選定手段と、
b)該候補選定手段により選定された候補ペプチドについて理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報を求め、その中で、対応するピークが前記ＭＳ^pスペクトルデータ中に存在せず前記ＭＳ^qスペクトルデータ中に存在するものを抽出する追加情報抽出手段と、
c)該追加情報抽出手段により抽出されたピークを前記ＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストに追加することにより該ピークリストを修正するピークリスト修正手段と、
d)該ピークリスト修正手段により前記候補ペプチドに対応して修正されたピークリストに基づいて、該候補ペプチドに対する理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性に基づく指標値を再計算する再計算手段と、
を備え、再計算された指標値に基づいて前記候補ペプチドが正解ペプチドであることの信頼度を判定可能としたことを特徴としている。

【0016】

第１及び第２発明において、例えばｐは２、ｑは３とすることができるが、ｐ、ｑはこれに限らない。また、ｑは一つのみでなく複数であってもよい。例えば、ｐが２のとき、ｑは３及び４としてもよい。即ち、ＭＳ^qスペクトルデータは異なる回数の開裂操作（例えばＣＩＤ）によりそれぞれ取得した質量分析データであってもよい。

【0017】

また第１及び第２発明において、「ペプチドの理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報」とは、当該ペプチドに対するＭＳ^p段階のフラグメンテーションの態様を理論的に予測することで得られるフラグメント（フラグメントイオンのほかニュートラルロス等の非電荷断片も含む）の質量（質量電荷比）のことである。また「理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報」とは、同様に、ＭＳ^q段階のフラグメンテーションの態様を理論的に予測することで得られるフラグメント（フラグメントイオンのほかニュートラルロス等の非電荷断片も含む）の質量（質量電荷比）のことである。

【0018】

第１発明に係る質量分析データ解析方法において、候補選定ステップでは、例えば被検試料に対するＭＳ^pスペクトルデータに対しピークピッキングを行って少なくともピークリスト（少なくとも各ピークの質量情報を含む）を作成し、これに基づき、例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチ等のデータベース検索エンジンソフトウエアを利用してデータベース検索を実行することで、目的とするペプチドである可能性がある候補ペプチドを選定する。通常、質量情報の一致性に基づく指標値が所定の閾値以上である複数の候補ペプチドが選定される。なお、候補選定ステップは、従来の一般的なデータベース検索法でも実施されている処理ステップである。

【0019】

次いで、追加情報抽出ステップでは、選定された一つの候補ペプチドについて実測のＭＳ^qスペクトルと同一のプリカーサイオンに対する理論ＭＳ^qフラグメントの質量情報を算出し、その質量の中で、対応するピークが実測のＭＳ^pスペクトルデータ中に存在せず、実測のＭＳ^qスペクトルデータ中に存在するものを抽出する。ＣＩＤ等の開裂操作ではその条件等によってアミノ酸配列の結合の切れる位置が変化するから、ＭＳ^q分析段階で存在するアミノ酸残基は、ＭＳ^p分析段階で存在するとみなしても何ら問題ない。即ち、理論ＭＳ^pフラグメントの質量が実測のＭＳ^pスペクトルデータ中に存在しなくても、理論ＭＳ^qフラグメントの質量が実測のＭＳ^qスペクトルデータ中に存在してさえいれば、該質量を持つフラグメントに対応したアミノ酸残基は被検試料中のペプチドの一部であると推測できる。そこで、追加情報抽出ステップにおいて抽出されたピークは候補ペプチドのＭＳ^pスペクトル上に存在しているものとみなし、該ピークをＭＳ^pスペクトルデータから求めたピークリストに追加する。即ち、これは、その候補ペプチドの信頼度を上げるのに寄与する情報を追加したことを意味する。

【0020】

ペプチドのフラグメンテーションの態様は開裂手法によっても相違し、広く用いられているＣＩＤではＣ末端由来のｂ系列イオンとＮ末端由来のｙ系列イオンとが顕著に観測されるから、データベース検索等においてもこれら系列のイオンピークが用いられる。この場合、ＭＳ^qスペクトルでは、ＭＳ^q分析の際のプリカーサイオンがｂ系列イオンであるかｙ系列イオンであるかによって、ＭＳ^pスペクトルと質量電荷比が共通となるイオンの系列が相違する。そのため、例えばＭＳ²スペクトル上のｙ系列イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ³分析を行った場合には、ＭＳ²スペクトルとＭＳ³スペクトルとでｙ系列イオンの質量電荷比が共通になる一方、ｂ系列イオンの質量電荷比はＭＳ²のプリカーサイオン（解析対象である特定ペプチドのイオン）の質量電荷比とＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比との差の分だけ、ＭＳ²スペクトルよりもＭＳ³スペクトルにおいて小さくなる。一方、ＭＳ²スペクトル上のｂ系列イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ³分析を行った場合には、ＭＳ²スペクトルとＭＳ³スペクトルとでｂ系列イオンの質量電荷比が共通になる一方、ｙ系列イオンの質量電荷比は上記質量電荷比の差の分だけ、ＭＳ²スペクトルよりもＭＳ³スペクトルにおいて小さくなる。そこで、追加情報抽出ステップでは、ＭＳ³分析のプリカーサイオンがｙ系列イオン、ｂ系列イオンのいずれであるのかに従って、一方の系列イオンでは単純に理論ＭＳ³フラグメントの質量電荷比に対応したピークをＭＳ²のピークリストに追加し、他方の系列では理論ＭＳ³フラグメントの質量電荷比に上記質量電荷比の差を加算した質量電荷比に対応したピークをＭＳ²のピークリストに追加するとよい。

【0021】

上述したようにＭＳ^pのピークリストに追加されたピークはその候補ペプチドの理論ＭＳ^pフラグメントの質量と一致するから、これはデータベース検索の過程で求まる該候補ペプチドの指標値を高める筈である。そこで、再計算ステップでは、その候補ペプチドに対応して修正されたピークリストに基づいて該候補ペプチドについての指標値を計算し直す。これにより、実測ＭＳ^pスペクトルに基づいて挙げられた候補ペプチドの信頼度を示す指標値を、実測ＭＳ^qスペクトルの情報を利用することで、より正確な値に修正することができる。したがって、この再計算された指標値を利用すれば、候補ペプチドが正解ペプチドであるか否かを正確に判断することが可能となる。

【0022】

第１発明に係る質量分析データ解析方法において、好ましくは、前記候補選定ステップでは、指標値が所定閾値以上である候補ペプチドを複数選定し、その複数の候補ペプチドの全てについてそれぞれ、前記追加情報抽出ステップ、前記ピークリスト修正ステップ、及び前記再計算ステップ、による処理を実行し、前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値を比較して最も指標値の高い候補ペプチドを正解ペプチドであるとして同定するとよい。

【0023】

この質量分析データ解析方法によれば、実測のＭＳ^qスペクトルの情報を利用した、より正確性の高い指標値に基づいて複数の候補ペプチドの中から最も信頼性の高いペプチドを選出できるので、ペプチドの同定精度を向上させることができる。また、そのペプチド同定結果と併せて指標値を提供することができる。

【0024】

さらに好ましくは、前記複数の候補ペプチドの再計算された指標値の分布に基づいて、前記正解ペプチドであるとされた指標値に対応した期待値を算出して該期待値をその同定の信頼度情報として提供するとよい。指標値の分布から期待値を算出するアルゴリズム自体は、例えばＭＳ／ＭＳイオンサーチに搭載されている機能をそのまま利用することができる。これによれば、同定結果の信頼度や妥当性を分析者が判断する際により有用な情報を提供することができる。

【発明の効果】

【0025】

第１発明に係る質量分析データ解析方法及び第２発明に係る質量分析データ解析装置では、上述した検索結果マージ手法とは異なり、例えばＭＳ²スペクトルを用いたデータベース検索の段階で正解ペプチドのスコア（本発明における指標値）が低い場合であっても、ＭＳ³スペクトルに基づく情報を補って再スコアリングを行うことで、正解ペプチドのスコアが高くなる。したがって、第１及び第２発明によれば、正解ペプチドを同定結果として提供できる可能性が高まり、ペプチド同定の精度向上が図れる。

【0026】

また、第１及び第２発明では、ＭＳ^pスペクトルに基づく検索結果の信頼度が十分でなく候補ペプチドの数がかなり多くなるような場合であっても、候補ペプチド毎にＭＳ^qスペクトルの情報を有効に利用して信頼度を上げることができるので、上述した階層的検索手法に比べて擬陽性が生じる可能性が低くなり、ペプチド同定の精度向上が図れる。また、第１及び第２発明では、ＭＳ^qスペクトルの情報を補った状態で理論ＭＳ^pフラグメントの質量情報との一致性等に基づきスコアを再計算しているので、上述した検索結果マージ手法で採用されている計算方法に比較して統計的な妥当性が高く、より信頼性の高い情報を分析者に提供することができる。

【0027】

さらにまた、上記のような従来手法はＭＳ²、ＭＳ³といった２段階の開裂操作を伴う質量分析にしか利用できないが、第１及び第２発明によれば、ＭＳ^qスペクトルを利用したピークリストへのピークの選択追加はｎが４以上のＭＳⁿスペクトルからも可能である。したがって、特に３次元四重極型イオントラップのように多段階の開裂操作が可能なイオントラップを備える質量分析装置を用いて収集されたデータを有効に利用してペプチド同定精度を向上させるうえで有利である。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】本発明に係る質量分析データ解析装置を含むペプチド解析システムの一実施例の全体構成図。

【図2】本実施例のペプチド解析システムにおいて実施されるデータ解析処理手順の一例を示すフローチャート。

【図3】図２中のステップＳ４の詳細な手順を示すフローチャート。

【図4】図２に示したデータ解析処理の概念図。

【図5】タンパク質（Ovalbumin）由来のペプチドに対して得られたＭＳ²スペクトルを用いたデータベース検索で取得される検索結果の一部を示す図。

【図6】図５に示したＭＳ²スペクトルからm/z1331をプリカーサイオンとして選択して得られたＭＳ³スペクトルを用いたデータベース検索で取得される検索結果の一部を示す図。

【図7】図５に示した検索結果のうち、アミノ酸配列［ＧＧＬＥＰＩＮＦＱＴＡＡＤＱＡＲ］のｙ／ｂ系列イオンと実測ＭＳ²スペクトルとの質量電荷比m/zの対応状態を示す図。

【図8】図６に示した検索結果のうち、アミノ酸配列［ＰＩＮＦＱＴＡＡＤＱＡＲ］のｙ／ｂ系列イオンと実測ＭＳ³スペクトルとの質量電荷比m/zの対応状態を示す図。

【図9】図７と図８との共通のｙ系列イオンと実測ＭＳ²／ＭＳ³スペクトルとの質量電荷比m/zの対応状態を示す図。

【図10】図７と図８との共通のｂ系列イオンと実測ＭＳ²／ＭＳ³スペクトルとの質量電荷比m/zの対応状態を示す図。

【図11】図９と図１０のマージ後の列において再スコアリングに反映するイオンを用いて修正されたピークリストを用いたデータベース検索結果を示す図。

【図12】本実施例によるデータ解析方法を適用した場合の評価例を示す図。

【図13】本実施例によるデータ解析方法を適用した場合の他の評価例を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0029】

以下、本発明に係る質量分析データ解析装置を含むペプチド解析システムの一実施例について、添付図面を参照して説明する。図１は本実施例のペプチド解析システムの全体構成図である。

【0030】

本実施例のペプチド解析システムは、大別して、質量分析部１と、コンピュータを中心に構成される制御・処理部２と、から成る。質量分析部１はマトリクス支援レーザ脱離イオン化四重極イオントラップ飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳ）であり、分析対象である試料中の分子や原子をイオン化するＭＡＬＤＩ法によるイオン化部１０と、発生したイオンを一時的に捕捉し、質量電荷比m/zに応じたイオンの選択とＣＩＤによるイオンのフラグメンテーションとを実行可能である３次元四重極型のイオントラップ１１と、イオントラップ１１から一斉に出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離して検出する飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１２と、を含む。飛行時間型質量分析器１２は、リフレクタにより発生する直流電場によりイオンを折返し飛行させるリフレクトロン型の飛行空間１３と、該飛行空間１３を飛行する間に質量電荷比に応じて時間的に分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４と、を含む。

【0031】

なお、ここではイオン化部１０はＭＡＬＤＩイオン源であるが、イオン化法はこれに限るものではなく、例えばＭＡＬＤＩ法以外のレーザ照射を利用したイオン化法や、ＥＳＩなどを用いてもよい。例えば質量分析部１の前段に液体クロマトグラフなどの成分分離器が接続される場合には、イオン源としてＥＳＩ等の大気圧イオン源が用いられる。また、飛行時間型質量分析器１２を設ける代わりに、イオントラップ１１自体の質量分離機能を利用してイオントラップ１１から質量電荷比の順にイオンを放出し、外部に設けたイオン検出器で検出する構成とすることもできる。

【0032】

制御・処理部２は、質量分析部１の各部を制御する分析制御部２０、イオン検出器１４から得られる検出信号をデジタル化して収集するデータ収集部２１、データからＭＳⁿスペクトルを作成するスペクトル解析部２２、データベース（ＤＢ）検索部２４を含みＭＳ²、ＭＳ³により得られたデータから被検試料中のペプチドを同定するペプチド同定解析部２３、及び、ペプチドのアミノ酸配列を推定するための同定用情報が予め登録された同定用データベース（ＤＢ）２５、を備え、さらに制御・処理部２には、ユーザが検索条件を入力設定したりスペクトル解析のために必要な各種操作を行ったりするための入力部３や、検索条件入力設定画面を表示したり同定結果を表示したりするための表示部４が接続されている。データベース検索部２４の機能は、例えば上述したMascotに含まれるＭＳ／ＭＳイオンサーチ等の既存の検索エンジンソフトウエアを利用することができる。

【0033】

本実施例のペプチド解析システムにおいてペプチドを同定するための特徴的なデータ解析処理について、図２〜図４を参照しつつ説明する。図２は本実施例のペプチド解析システムにおいて実施されるデータ解析処理手順の一例を示すフローチャート、図３は図２中のステップＳ４の詳細な手順を示すフローチャート、図４はデータ解析処理の概念図である。

【0034】

図２に示すデータ解析処理を実行する前提として、次のようにＭＳ²、ＭＳ³スペクトルデータを収集する。まず分析者は目的とするタンパク質を適宜の酵素（例えばトリプシン酵素）により消化し、ペプチド断片を含む被検試料を調製する。分析制御部２０の制御の下に、質量分析部１により上記被検試料に対するＭＳ¹分析が実行されると、データ収集部２１はＭＳ¹分析により得られたデータを収集し、スペクトル解析部２２は収集されたデータに基づいてＭＳ¹スペクトルを作成する。スペクトル解析部２２は、ＭＳ¹スペクトルから単一のペプチドに由来するイオンピークを見つけてＭＳ²プリカーサイオンとして選出する。

【0035】

分析制御部２０の制御の下に質量分析部１は、被検試料に対して上記プリカーサイオンについてのＭＳ²分析を実行する。より詳しく述べると、イオン化部１０において被検試料から生成された各種イオンは一旦イオントラップ１１に捕捉され、イオントラップ１１においてプリカーサイオンの質量電荷比を持つイオンのみが選別された後にＣＩＤによるフラグメンテーションがなされる。この際に、目的の単一ペプチドのアミノ酸配列の結合が様々な部位で切れ、各種アミノ酸残基がフラグメントイオンとしてイオントラップ１１に捕捉される。このフラグメントイオンはイオントラップ１１から一斉に出射されて飛行時間型質量分析器１２により質量分析され、データ収集部２１はＭＳ²分析により得られたデータを収集し、スペクトル解析部２２は収集されたデータに基づいてＭＳ²スペクトルを作成する。

【0036】

次いでスペクトル解析部２２は、取得したＭＳ²スペクトルから目的のペプチドに由来する各種フラグメントピークの中で特定のピーク、例えば強度が最大であるピークをＭＳ³プリカーサイオンとして選出する。分析制御部２０の制御の下に質量分析部１は、被検試料に対して上記プリカーサイオンについてのＭＳ³分析を実行し、データ収集部２１はＭＳ³分析により得られたＭＳ³スペクトルデータを収集する。なお、ＭＳ²スペクトルの中から複数のプリカーサイオンを選択してそれぞれＭＳ³分析を実施することにより、同一ペプチド由来のＭＳ³スペクトルを複数取得するようにしてもよい。

【0037】

以上により、被検試料に対するＭＳ²スペクトルデータ及びＭＳ³スペクトルデータが収集される。この状態でデータ解析処理が開始されると、ペプチド同定解析部２３はデータ収集部２１から解析対象であるＭＳ²スペクトルデータ、ＭＳ³スペクトルデータを取り込み（ステップＳ１）、まずＭＳ²スペクトルに対してピークピッキングを実行し、ピーク情報（少なくともピークの質量電荷比m/zを含む）を集めたピークリストを作成する。そして、データベース検索部２４はそのピークリストを元にデータベース検索を実行する。即ち、同定用データベース２５に登録されている様々なタンパク質（ペプチド）についてそれぞれ、理論的なフラグメンテーションの推定によって生成されるフラグメントイオンの質量電荷比、つまり理論ＭＳ²フラグメントの質量情報を求め、その理論ＭＳ²フラグメントの質量電荷比と実測ＭＳ²スペクトルに基づくピークリストの質量電荷比との一致の程度に基づいてスコアを算出する。そして、スコアが所定閾値以上となるペプチドを抽出して候補ペプチドとし、全部でｉ個の候補ペプチドをスコアの高い順にリストアップする（ステップＳ２）。

【0038】

一例として、タンパク質Ovalbumin由来のペプチドに対して得られた実測ＭＳ²スペクトルを用いたデータベース検索で取得される検索結果の一部を図５に示す。図５はスコア順で１位に冠された候補ペプチド［ＧＧＬＥＰＩＮＦＱＴＡＡＤＱＡＲ］のマッチング結果であり、図５の中央にはピークの一致／不一致を示すＭＳ²スペクトル、下部には各種フラグメントについてのマッチング結果が示されている。ここではイオン開裂にＣＩＤを用いており、アミノ酸配列の推定に有用であるのは専らｙ系列イオンとｂ系列イオンである。そこで、図５から抜き出した、アミノ酸配列のｙ／ｂ系列イオンの理論質量（質量電荷比m/z）と実測ＭＳ²スペクトルとのマッチング状態を図７に示す。

【0039】

図７中の数値は理論的に求まる各フラグメントイオンの質量電荷比であり、点線の矩形枠で囲んだ数値が実測ＭＳ²スペクトル中のピーク（つまり上記のＭＳ²ピークリストに含まれるピーク）と一致するピークである。一般的には、一致するピークの数が多いほど、候補ペプチドのスコアは高くなる。例えば上記アミノ酸配列中のアミノ酸Ｐの結合位置に対応するｂ₅イオンの理論質量はm/z454.2296、ｙ₁₂イオンの理論質量はm/z1331.6702であるが、これらはいずれも実測ＭＳ²スペクトルに現れているピーク、つまり実測と理論とが一致したピークである。

【0040】

ＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索により候補ペプチドがリストアップされたならば、繰り返し回数制限用の変数ｊを１にセットし（ステップＳ３）、ｊ番目の候補ペプチドについて、理論ＭＳ³フラグメントの質量情報を利用したピークの選択及びピークリストの修正処理を実施する（ステップＳ４）。図３に示すフローチャートを参照して詳しく説明する。

【0041】

即ち、まずＭＳ³分析の際のプリカーサイオンが、処理対象としているｊ番目の候補ペプチドの理論フラグメントのうちのｙ系列イオンに属するものであるか否かを判定する（ステップＳ４１）。ここでプリカーサイオンのイオン系列を調べる必要性については後述する。

【0042】

ステップＳ４１でＹｅｓと判定された場合、つまりＭＳ³プリカーサイオンがｙ系列イオンであれば、ＭＳ³スペクトルに現れるｙ系列イオンの質量電荷比はＭＳ²スペクトル上のそれと共通となる。一方、ＭＳ³スペクトル上でのｂ系列イオンの質量電荷比はＭＳ²スペクトル上のｂ系列イオンの質量電荷比に比べて、ＭＳ²プリカーサイオンの質量電荷比とＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比との差の分だけ小さくなる。これは、ＭＳ²スペクトルからプリカーサイオンとしてｙ系列イオンを選択したために、ＭＳ³スペクトル上に現れるｂ系列イオンはＣ末端側のアミノ酸が失われたものとなり、ＭＳ²スペクトル上とＭＳ³スペクトル上とで同一質量電荷比のイオンとして検出されないためである。

【0043】

そこで、ＭＳ³分析を実施した際と同じ質量電荷比のプリカーサイオンを設定したとの条件の下に候補ペプチドの理論ＭＳ³フラグメントイオンの質量電荷比を求める。そして、その理論ＭＳ³フラグメント質量情報の中で、プリカーサイオンと同系列であるｙ系列フラグメントイオンの質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ²スペクトルに存在せず実測のＭＳ³スペクトルに存在すれば、該ピークを追加すべきものとして選択し、ステップＳ２で求めたピークリストに追加する（ステップＳ４２）。

【0044】

また、上記理論ＭＳ³フラグメント質量情報の中で、プリカーサイオンと異系列であるｂ系列フラグメントイオンの質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ³スペクトルに存在すれば、その質量電荷比にＭＳ²プリカーサイオンの質量電荷比とＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比との差を加算する。そして、その加算後の質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ²スペクトルに存在しなければ、該ピークを追加すべきものとして選択し、上記ピークリストにさらに追加する（ステップＳ４３）。即ち、上述したように、この場合、ｂ系列イオンはＭＳ²スペクトル上とＭＳ³スペクトル上とで同一質量電荷比のイオンとして検出されないため、プリカーサイオン選択時に失われたＣ末端側のアミノ酸の質量電荷比、つまりＭＳ²プリカーサイオンとＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比の差を補うことで質量電荷比が一致すれば、ＭＳ²スペクトルにおけるｂ系列イオンがＭＳ³スペクトル上でも現れたものと判定する。

【0045】

他方、ステップＳ４１でＮｏと判定された場合、つまりＭＳ³プリカーサイオンがｂ系列イオンであれば、ＭＳ³スペクトルに現れるｂ系列イオンの質量電荷比はＭＳ²スペクトル上のそれと共通となる。また、ｂ系列イオンをＭＳ³プリカーサイオンとして選択した場合には、Ｃ末端側の水酸基（ＯＨ）がなく、さらにプロトン（Ｈ）も１個分少ない状態であるので、ＭＳ³スペクトル上でのｙ系列イオンの質量電荷比は、ＭＳ²スペクトル上のｂ系列イオンの質量電荷比に比べて、ＭＳ²プリカーサイオンの質量電荷比とＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比との差及び水分子１個分の質量電荷比の分だけ小さくなる。

【0046】

そこで、ステップＳ４２と同様に、ＭＳ³分析を実施した際と同じ質量電荷比のプリカーサイオンを設定したとの条件の下に候補ペプチドの理論ＭＳ³フラグメントイオンの質量電荷比を求める。そして、その理論ＭＳ³フラグメント質量情報の中で、プリカーサイオンと同系列であるｂ系列フラグメントイオンの質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ²スペクトルに存在せず実測のＭＳ³スペクトルに存在すれば、該ピークを追加すべきものとして選択し、ステップＳ２で求めたピークリストに追加する（ステップＳ４４）。また、上記理論ＭＳ³フラグメント質量情報の中で、プリカーサイオンと異系列であるｙ系列フラグメントイオンの質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ³スペクトルに存在すれば、その質量電荷比にＭＳ²プリカーサイオンの質量電荷比とＭＳ³プリカーサイオンの質量電荷比との差及び水分子１個分の質量電荷比を加算する。そして、その加算後の質量電荷比に対するピークが実測のＭＳ²スペクトルに存在しなければ、該ピークを追加すべきものとして選択し、上記ピークリストにさらに追加する（ステップＳ４５）。

【0047】

実例として、図５に示したＭＳ²スペクトルからm/z1331をプリカーサイオンとして選択して得られたＭＳ³スペクトルを用いたデータベース検索で取得される検索結果の一部を図６に示す。また、図６から抜き出した、上記のアミノ酸配列［ＧＧＬＥＰＩＮＦＱＴＡＡＤＱＡＲ］の一部である［ＰＩＮＦＱＴＡＡＤＱＡＲ］のｙ／ｂ系列イオンの理論質量と実測ＭＳ³スペクトルとのマッチング状態を図８に示す。図７と同様に、図８中の数値は理論的に求まる各フラグメントイオンの質量電荷比であり、点線の矩形枠で囲んだ数値が実測ＭＳ³スペクトル中のピークと一致するピークである。ただし、図６に示した結果が得られるデータベース検索は本実施例の実際のデータ解析処理の上では実施されるものではなく、ここでは、対応するｙ／ｂ系列イオンが検出されることを例示するために敢えて示している。

【0048】

図９は、図７と図８との共通のｙ系列イオンと実測ＭＳ²／ＭＳ³スペクトルとのマッチング状態を示す図である。また、図１０は、図７と図８との共通のｂ系列イオンと実測ＭＳ²／ＭＳ³スペクトルとのマッチング状態を示す図である。ただし、ここではＭＳ³プリカーサイオンがｙ系列イオンであるため、ＭＳ³のｂ系列フラグメントイオンの質量電荷比に、ＭＳ²プリカーサイオンとＭＳ³プリカーサイオンとの質量電荷比差（diff）を加算した値を、図１０中のＭＳ³ｂ系列イオンの欄に括弧で示している。この括弧内の値がＭＳ²スペクトル上で対応し得る質量電荷比である。この場合には、ＭＳ³スペクトルの情報を利用することで、１個だけピークが追加されている。

【0049】

例えば図９に示したｙ系列イオンでみると、アミノ酸Ｑに対応したm/z374.2146のピークは実測のＭＳ²スペクトルには存在しないが実測のＭＳ³スペクトルには存在している。そこで、このm/z374.2146のピークがピークリストに追加される。図９中でマージ後の列で点線の矩形枠で囲まれた数値が、ＭＳ²、ＭＳ³において理論質量と一致したとしてピークリストに掲載されるイオンの質量電荷比である。他方、図１０に示したｂ系列イオンでみると、アミノ酸Ｆに対応したm/z472.2554に上記質量電荷比差を加算したm/z828.4254に対応したピークは実測のＭＳ²スペクトルには存在しないが、m/z472.2554に対応したピークは実測のＭＳ³スペクトルに存在している。そこで、このm/z828.4254のピークがピークリストに追加される。図１０中でも図９と同様に、マージ後の列で点線の矩形枠で囲まれた数値が、ＭＳ²、ＭＳ³において理論質量と一致したとしてピークリストに掲載されるイオンの質量電荷比である。この場合には、ＭＳ³スペクトルの情報を利用することで、３個ピークが追加されている。

【0050】

図２に戻ると、上述したようにｙ系列イオン、ｂ系列イオンそれぞれについてマージ後、つまりピークの追加によりピークリストが修正されたならば、修正されたピークリストを元に、対象としている候補ペプチドについてデータペース検索を実施することにより、該候補ペプチドに対するスコアを再計算する（ステップＳ５）。ピークリストにピークが追加されれば、再計算によってスコアは再計算前よりも高くなる。図１１は、図９と図１０のマージ後の列において再スコアリングに反映するイオンを用いて修正されたピークリストを用いてデータベース検索を実行した結果を示す図である。なお、複数のＭＳ³プリカーサイオンに対してそれぞれＭＳ³スペクトルが取得されている場合には、それぞれのＭＳ³スペクトルについて同様の手法で追加可能なピークを選択することができる。

【0051】

一つの候補ペプチドに対するステップＳ４（Ｓ４１〜Ｓ４５）、Ｓ５の処理が終了したならば、変数ｊが候補ペプチド総数ｉに達したか否かを判定し（ステップＳ６）、達していなければ変数ｊをインクリメントして（ステップＳ７）ステップＳ４へと戻る。したがって、ステップＳ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓ７の繰り返しによって、上述したＭＳ³を利用したピーク選択追加処理を、リストアップされているｉ個の候補ペプチド全てに適用し、各候補ペプチドのスコアを計算し直す。

【0052】

そして、全ての候補ペプチドに対する処理が終了するとステップＳ６でＹｅｓと判定され、全ての候補ペプチドの再計算されたスコアを比較し、そのスコアが最も高い候補ペプチドを正解であると判断してペプチドを同定する（ステップＳ８）。さらに、全ての候補ペプチドの再計算されたスコアの分布に基づいて、スコアが最も高い候補ペプチドに対する期待値（Expect）を計算する（ステップＳ９）。

【0053】

ここで計算される期待値は、実際には離散的な値ではないものの個数である。或るペプチドがスコアｘを持つとき、その期待値Ｅ[ｘ]は、ペプチドデータベース中で、ランダムマッチングによって同じスコアを持つペプチドの個数を表す。例えば、スコア１０のペプチドの期待値が５であるならば、これはそのペプチド以外にランダムマッチングで同程度のスコアを持つペプチドが５個あることを意味するから、スコア１０ではペプチドを同定できたとは言い難い。この計算方法では、１位のスコアを持つペプチドが２位以下のペプチドと比較して十分に高いスコアを持つときに期待値は０になる。したがって、期待値が小さいほど同定信頼度が高く、一般的には０．０１を同定の基準とする場合が多い。具体的には、スコアに基づく期待値の計算は、例えばMASCOTのＭＳ／ＭＳイオンサーチにより求めることができる。そして、最終的に、その同定結果を再計算後のスコア及び期待値とともに表示部４に出力して処理を終了する（ステップＳ１０）。

【0054】

以上のように、本実施例のペプチド解析システムでは、ＭＳ³スペクトルの情報を有効に利用してＭＳ²スペクトルに基づくデータベース検索により挙げられた候補ペプチドのスコアの正確性を向上させ、それによってペプチドの同定の精度を上げることができる。また、同定したペプチドの信頼度を示す精度の高い指標として、スコアや期待値を提供することができる。

【0055】

続いて、上述した特徴的なデータ解析方法によるペプチド同定の効果を確認するために行った評価について説明する。図１２及び図１３は幾つかの異なるペプチドに対し、上記手法を適用した場合の評価例を示す図である。

【0056】

具体的には、上記手法をオープンソースデータベース検索ソフトウエアである「X! tandem」（“X! サーチ・エンジン・デベロップメント（X! Search Engine Development）”、[online]、ザ・グローバル・プロテオーム・マシーン・オーガニゼイション（The Global Proteome Machine Organization）、［平成２３年５月１８日検索］、インターネット＜http://www.thegpm.org/tandem/＞参照）に実装し、ペプチドを含む試料を測定して取得したデータに対し処理を実行した。図中のスコア（Score）及び期待値（Expect）は「X! tandem」のネイティブ・スコアリング（native scoring）の機能により得られたものである。また、y-ion、b-ionは理論フラグメントと一致する実際のピークの個数である。

【0057】

図１２は３つのペプチドに対する評価例であり、図中、MS2+3が本実施例による手法を用いた結果である。本実施例の手法ではＭＳ²スペクトルのみを用いたデータベース検索に対し、ペプチドの期待値が、2.60E-04、2.4E-01、1.10E-02から、6.10E-08、6.70E-02、3.80E-05にそれぞれ改善されていることが確認できる。即ち、ペプチドによって程度に差はあるものの、いずれのペプチドに対しても同定精度が向上していると言える。

【0058】

図１３はいずれも、標品であるタンパク質をカルバミドメチル（Carbamidomethyl）標識化し、トリプシンで酵素消化したサンプルを島津製作所のAXIMA-QITで測定して得られたデータに対する評価例である。図中、expect(y/b)は本実施例の手法を適用する前の期待値とスペクトル中の有効イオンの個数、merged expect(y/b)が本実施例の手法を適用した後の期待値と有効イオン個数である。これらの評価例でも、本実施例の手法ではＭＳ²スペクトルのみを用いたデータベース検索に対し、ペプチドの期待値が改善されていることが確認できる。

【0059】

なお、上記実施例では、ＭＳ³スペクトルの情報に基づいてピークの選択追加を実施していたが、ＭＳ⁴スペクトルやそれ以上のＣＩＤの繰り返しにより得られるＭＳⁿスペクトルの情報に基づいてピークの選択追加を実施してもよい。ただし、３次元四重極型イオントラップの場合、プリカーサイオン選択とＣＩＤとを繰り返す度に感度が下がるため、実質的に利用可能であるのはＭＳ⁵スペクトル程度までである。また、ＭＳ³スペクトルとＭＳ⁴スペクトル、というように複数のスペクトルからの情報を利用してピークの選択追加を実施してもよい。

【0060】

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

【符号の説明】

【0061】

１…質量分析部
１０…イオン化部
１１…イオントラップ
１２…飛行時間型質量分析器
１３…飛行空間
１４…イオン検出器
２…制御・処理部
２０…分析制御部
２１…データ収集部
２２…スペクトル解析部
２３…ペプチド同定解析部
２４…データベース（ＤＢ）検索部
２５…同定用データベース（ＤＢ）
３…入力部
４…表示部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】