特許 5697788 乳酸菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】5697788

(24)【登録日】2015年2月20日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】乳酸菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20150319BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20150319BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12N1/20 A

   C12R1:01

【請求項の数】2

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2014-189564(P2014-189564)

(22)【出願日】2014年9月18日

【審査請求日】2014年9月18日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01919

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501195223

【氏名又は名称】株式会社日本バリアフリー

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】特許業務法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】江藤 忠士

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００６−２６５１８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０１０５９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１３６１５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００８−２６３８９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 British Journal of Nutrition，２００７年，97，p.522-527

【文献】 INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY MICROBIOLOGY，２０１１年，61，p.1894-1898

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０−１／２１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サケの腸内容物から単離された乳酸菌であって、標準菌であるラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＮＢＲＣ（登録商標）１００９３３に対し、胆汁耐性が胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲で５５〜７０倍、酸耐性がｐＨ４〜５の範囲で７倍以上、食塩耐性が食塩濃度４〜５質量％の範囲で１．３倍以上、活性酸素種の毒性に対する保護作用が２倍以上であり、豆乳に対する発酵能を備えるラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＢＦ３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９１９）に属することを特徴とする乳酸菌。

【請求項2】

請求項１記載の乳酸菌において、前記活性酸素種は過酸化水素から発生する活性酸素であることを特徴とする乳酸菌。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、サケの腸内容物から単離された新規な乳酸菌に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、発酵食品等から単離された乳酸菌が知られている（例えば、特許文献１参照）。

【0003】

特許文献１には、ラクトバチルス ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス プランタラム（Lactobacillus plantarum）又は、ラクトバチルス パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）の何れかに属し、死菌の乾燥菌体重量１ｍｇ当たり、６０容量％エタノール溶液において１．２μｇ以上のコレステロール吸着量を示し、且つリン酸緩衝液（ｐH６．８）において３３ｎｍｏｌ以上の胆汁酸吸着量を示す乳酸菌が記載されている。また、前記乳酸菌は、血中コレステロールの低減に有用であるとされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００７−１８９９７３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

ところで、乳酸菌は前記発酵食品以外にも各種の分離源があり、従来活用されていない分離源から新たな特性を備える乳酸菌を分離することが望まれる。

【0006】

本発明は、かかる事情に鑑み、サケの腸内容物から単離された新規な乳酸菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、サケの腸内容物から単離された乳酸菌について検討した結果、ラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＢＦ３（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９１９）と命名した乳酸菌が、標準菌に対して、胆汁耐性、酸耐性、食塩耐性、活性酸素種の毒性に対する保護作用に優れ、豆乳を発酵させて固化できることを見い出した。

【0008】

そこで、本発明は、サケの腸内容物から単離された乳酸菌であって、標準菌であるラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＮＢＲＣ（登録商標）１００９３３に対し、胆汁耐性が胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲で５５〜７０倍、酸耐性がｐＨ４〜５の範囲で７倍以上、食塩耐性が食塩濃度４〜５質量％の範囲で１．３倍以上、活性酸素種の毒性に対する保護作用が２倍以上であり、豆乳に対する発酵能を備えるラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＢＦ３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９１９）に属することを特徴とする。

【0010】

また、本発明において、前記活性酸素種は、例えば、過酸化水素から発生する活性酸素である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の乳酸菌の特性を示すグラフであり、（ａ）は胆汁耐性、（ｂ）は酸耐性、（ｃ）は食塩耐性を示すグラフ。

【図2】本発明の乳酸菌の過酸化酸素の毒性に対する保護作用を示すグラフ。

【図3】本発明の乳酸菌の過酸化酸素の毒性に対する保護作用の濃度依存性を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0012】

次に、添付の図面を参照しながら本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。

【0013】

本実施形態の乳酸菌は、北海道羅臼産の雄のシロザケの腸内容物から単離されたものである。前記腸内容物からの単離は次のようにして行った。

【0014】

まず、北海道羅臼産の雄のシロザケの腸内容物を無菌的に採取し、採取した腸内容物を培養液（ＧＡＭ液体培地、日水製薬株式会社製、嫌気性菌用）に１ｇずつ接種し、３０℃の温度で３日間浸漬培養後、濁りの有無を確認した。次に、濁りの認められた培養液を位相差顕微鏡で観察し、菌体の認められた培養液を寒天平板培地に１白金耳画線塗沫し、嫌気培養装置（三菱ガス化学株式会社製、商品名：アネロパック）内で、嫌気条件下、３０℃の温度に保持して３日間培養した。前記寒天平板培地は、前記ＧＡＭ液体培地に１．５％ｗ／ｖの寒天を添加して固めたものである。

【0015】

次に、前記培養後に出現したコロニーについて、グラム染色及びカタラーゼ試験を行い、グラム陽性であってカタラーゼ陰性である菌を簡易的に乳酸菌として分離した。次に、分離した菌体について、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子約５００塩基の塩基配列についてＢＬＡＳＴ検索を行うことにより、得られた菌体はラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）と同定された。

【0016】

本出願人は、前記菌体をラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＢＦ３株（以下、ＢＦ３と略記する）と命名した。ＢＦ３株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−０１９１９として、２０１４年８月２１日付けで寄託されている。

【0017】

ＢＦ３株の菌学的性質を表１、表２に示す。

【0018】

【表1】

【0019】

【表2】

【0020】

次に、ＢＦ３株の特性について説明する。

【0021】

〔胆汁耐性〕
まず、ＢＦ３株をＢＨＩ（Brain heart infusion）液体培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）で３７℃の温度に保持して一晩培養し、ＢＦ３株培養液を調製した。

【0022】

次に、胆汁粉末（和光純薬工業株式会社製）を０〜２．５％ｗ／ｖの範囲で添加したＢＨＩ液体培地４ｍｌに、ＢＦ３株培養液０．０４ｍｌ（１％ｖ／ｖ）を接種し、３７℃の温度に保持して一晩培養後、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。

【0023】

次に、標準菌としてラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＮＢＲＣ（登録商標）１００９３３を用いた以外は、ＢＦ３株と全く同一にして、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。結果を図１（ａ）にＯＤ６００として示す。

【0024】

図１（ａ）から、ＢＦ３株は前記標準菌に対して、胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲で、５５〜７０倍の胆汁耐性を備えていることが明らかである。また、図１（ａ）から、前記標準株は胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲では殆ど増殖できないが、ＢＦ３株は胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲でも増殖できることが明らかである。

【0025】

〔酸耐性〕
まず、ＢＦ３株をＢＨＩ液体培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）で３７℃の温度に保持して一晩培養し、ＢＦ３株培養液を調製した。

【0026】

次に、ｐＨ３．０〜９．０の範囲に調整したＢＨＩ液体培地４ｍｌに、ＢＦ３株培養液０．０４ｍｌ（１％ｖ／ｖ）を接種し、３７℃の温度に保持して一晩培養後、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。

【0027】

次に、前記標準菌を用いた以外は、ＢＦ３株と全く同一にして、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。結果を図１（ｂ）にＯＤ６００として示す。

【0028】

図１（ｂ）から、ＢＦ３株は前記標準菌に対して、ｐＨ４〜５の範囲で、７倍以上の酸耐性を備えていることが明らかである。また、図１（ｂ）から、前記標準菌はｐＨ４以下では増殖できないが、ＢＦ３株はｐＨ４以下でも増殖できることが明らかである。

【0029】

〔食塩耐性〕
まず、ＢＦ３株をＢＨＩ液体培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）で３７℃の温度に保持して一晩培養し、ＢＦ３株培養液を調製した。

【0030】

次に、食塩（ＮａＣｌ）の濃度を０〜５質量％の範囲に調整したＢＨＩ液体培地４ｍｌに、ＢＦ３株培養液０．０４ｍｌ（１％ｖ／ｖ）を接種し、３７℃の温度に保持して一晩培養後、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。

【0031】

次に、前記標準菌を用いた以外は、ＢＦ３株と全く同一にして、培養液の濁度を分光光度計により波長６００ｎｍで測定した。結果を図１（ｃ）にＯＤ６００として示す。

【0032】

図１（ｃ）から、ＢＦ３株は前記標準菌に対して、食塩濃度４〜５質量％の範囲で、１．３倍以上の食塩耐性を備えていることが明らかである。また、図１（ｃ）から、前記標準菌は食塩濃度５質量％では増殖できないが、ＢＦ３株は食塩濃度５質量％でも増殖できることが明らかである。

【0033】

〔活性酸素種の毒性に対する保護作用〕
まず、ＭＲＳブイヨン（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）で一晩培養し、分光光度計により波長６６０ｎｍで測定した濁度（ＯＤ６６０）が２．０になるように調整したＢＦ３株の死菌液に、ＧＹＰ培地で３０℃の温度に保持して４日間培養した酵母（Saccharomyces cerevisiae）の培養液をそれぞれ１％ｖ／ｖになるように接種し、３０℃の温度に保持して１２０ｒｐｍで１時間振盪培養を行った。

【0034】

次に、前記振盪培養後、培養液に最終濃度が３ｍＭとなるように過酸化水素を添加し、再び３０℃の温度に保持して１２０ｒｐｍで１時間振盪した。

【0035】

次に、前記振盪後、各培養液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により５０倍に希釈し、０．０１質量％のクロラムフェニコールを添加したポテトデキストロース寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗沫し、３０℃の温度に保持して３日間培養した。培養後、前記ポテトデキストロース寒天培地に形成されたコロニー数を計測し、酵母の生存数を測定した。

【0036】

次に、ブランクとして、過酸化水素を全く添加しなかった以外は前記と全く同一にして、酵母の生存数を測定した。

【0037】

次に、前記ブランクにおける酵母の生存数の平均値を１００％として、該平均値に対する過酸化酸素を添加した場合の酵母の生存数から生残率を算出した。

【0038】

次に、コントロールとして、ＢＦ３株を全く添加しなかった以外は前記と全く同一にして、酵母の生存数を測定し、前記ブランクにおける酵母の生存数の平均値に対する生残率を算出した。

【0039】

また、ＢＦ３株に代えて前記標準株を用いた以外は前記と全く同一にして、酵母の生存数を測定し、前記ブランクにおける酵母の生存数の平均値に対する生残率を算出した。結果を図２に示す。

【0040】

過酸化酸素は活性酸素を発生させ、該活性酸素が前記酵母に対して毒性を示す。ＢＦ３及び前記標準菌はいずれも前記毒性に対する保護作用を示し、該毒性を軽減することができるが、図２から、ＢＦ３株は前記標準菌に対して、最終濃度３ｍＭの過酸化水素で２倍以上の保護作用を備えていることが明らかである。

【0041】

次に、分光光度計により波長６６０ｎｍで測定した濁度（ＯＤ６６０）が０．２５〜２．０になるように調整したＢＦ３株の死菌液を用いた以外は、前記と全く同一にして酵母の生存数を測定し、前記ブランクにおける酵母の生存数の平均値に対する生残率を算出した。結果を図３に示す。

【0042】

図３から、ＢＦ３株の過酸化水素から発生する活性酸素の毒性に対する保護作用は濃度依存性を備えており、ＢＦ３株の濃度（ＯＤ６６０）が大になるほど該保護作用も大になることがあきらかである。

【0043】

〔豆乳に対する発酵能〕
まず、ＢＦ３株をＭＲＳブイヨン（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社（Thermo Fisher Scientific Inc.）製）で３７℃の温度に保持して一晩培養し、ＢＦ３株培養液を調製した。

【0044】

次に、固形分９質量％を含む豆乳（ｐＨ６．４±０．０）に、ＢＦ３株培養液をそれぞれ２％ｖ／ｖになるように接種し、３７℃の温度に保持して４８時間発酵させた。

【0045】

前記発酵後、豆乳のｐＨを測定した。また、豆乳のカードの生成の有無により固化を確認した。

【0046】

次に、ＢＦ３株に代えて前記標準菌を用いた以外は前記と全く同一にして豆乳の発酵を行い、前記発酵後、豆乳のｐＨを測定した。また、豆乳のカードの生成の有無により固化を確認した。

【0047】

この結果、ＢＦ３株は前記豆乳のｐＨを４．４±０．１まで下げ、該豆乳を固化することができたが、前記標準株は該豆乳のｐＨを５．４±０．０までしか下げることができず、該豆乳を固化させることができなかった。従って、ＢＦ３株は前記豆乳に対する発酵能を備えているが、前記標準株は該豆乳に対する発酵能を備えていないことが明らかである。

【0048】

次に、前記特性に基づくＢＦ３株の利用可能性について説明する。

【0049】

ＢＦ３株は、前述のように、胆汁耐性、酸耐性及び食塩耐性に優れているため、経口摂取した場合に、胃酸や胆汁等に犯されることなく、腸内まで達することができ、腸内環境を整備することができる。

【0050】

また、ＢＦ３株は、前述のように食塩耐性に優れているため、醤油、味噌等の食塩を多く含む食品の発酵に用いることができる。

【0051】

また、ＢＦ３株は、前述のように過酸化酸素等の活性酸素の毒性に対する保護作用に優れているため、人体内に取り込まれた酸素の一部が活性酸素に変化することにより生じるがん、生活習慣病、老化、皮膚の変性（しみ、しわ等）等を防止する食品、健康食品、化粧品、医薬品、医薬部外品等として利用することができる。

【0052】

また、ＢＦ３株は、前述のように豆乳に対する発酵能を備えているため、豆乳を用いたチーズ（ＳＯＹチーズ）の製造、凝固剤を使わない豆腐の製造に利用することができる。

【符号の説明】

【0053】

符号なし。

【要約】

【課題】サケの腸内容物から単離された新規な乳酸菌を提供する。
【解決手段】サケの腸内容物から単離された乳酸菌であって、標準菌に対し、胆汁耐性が胆汁濃度０．２５〜２．５％（ｗ／ｖ）の範囲で５５〜７０倍、酸耐性がｐＨ４〜５の範囲で７倍以上、食塩耐性が食塩濃度４〜５質量％の範囲で１．３倍以上、活性酸素種の毒性に対する保護作用が２倍以上であり、豆乳に対する発酵能を備えるラクトコッカス ラクティス サブスピーシーズ ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）ＢＦ３株（ＮＩＴＥ Ｐ−０１９１９）に属する。
【選択図】 図１

【図1】

【図2】

【図3】