特許 5698672 ボログルコン酸カルシウム錯体を含む培養培地を利用してアクチノバシラス・プルロニューモニエ毒素ＡｐｘＩを産生させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5698672

(24)【登録日】2015年2月20日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】ボログルコン酸カルシウム錯体を含む培養培地を利用してアクチノバシラス・プルロニューモニエ毒素ＡｐｘＩを産生させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20150319BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20150319BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20150319BHJP

【ＦＩ】

   C12P21/02 A

   C12N1/00 B

   C12N1/00 C

   C12N1/00 G

   C12N1/20 A

【請求項の数】7

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2011-537959(P2011-537959)

(86)(22)【出願日】2009年11月25日

(65)【公表番号】特表2012-509682(P2012-509682A)

(43)【公表日】2012年4月26日

(86)【国際出願番号】EP2009065798

(87)【国際公開番号】WO2010060917

(87)【国際公開日】20100603

【審査請求日】2012年11月22日

(31)【優先権主張番号】08105881.0

(32)【優先日】2008年11月27日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/118,770

(32)【優先日】2008年12月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】230105223

【弁護士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】スラフマン，シメン−ヤン

(72)【発明者】

【氏名】スミツツ，クリスチヤン・テオドール・ヘラルドウス

(72)【発明者】

【氏名】ブルト，バイラム

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０４−２２５９２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Microbes Infect.，２００２年，vol.4, no.2，pp.225-235

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０２

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アクチノバシラス・プルロニューモニエ細菌を、該細菌の増殖を支持する培養培地中で培養することにより、ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩを産生させるにあたり、培地にカルシウム塩を添加して培地中でカルシウムイオンを形成させる方法であって、該培養培地がボログルコン酸塩を含有し、該培地中でボログルコン酸カルシウム錯体を形成させることを特徴とする方法。

【請求項2】

前記ボログルコン酸塩の濃度が６０ｍｍｏｌ／ｌ未満であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記濃度が、２５から４５ｍｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記濃度が、４０ｍｍｏｌ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記カルシウム塩がボログルコン酸カルシウムであることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

培養の間に空気を液体培地に導通させ、空気は、大気レベルを超える二酸化炭素を含有することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記空気が、５ｖ／ｖ％の二酸化炭素を含有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を液体培養培地中で培養することにより、ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩまたはＡｐｘＩＩＩを産生させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ブタの主要な呼吸器疾患であるブタ胸膜肺炎は、世界中で蔓延しており、超急性死亡、急性疾患ブタの治療および慢性感染動物の市場売買の遅延に起因して、ブタ産業に対して深刻な経済的損失を惹起する。病因学的作用物質は、アクチノバシラス・プルロニューモニエである。この作用物質は、主として動物間の直接的な接触により伝染し、もたらされた感染は超急性から慢性まで変動する臨床経過をたどる。疾患は、主として、高熱、重篤な呼吸困難、咳および食欲不振の臨床徴候を有する気道の感染である。疾患の発症は急速であり、罹患率および致死率が高い。アクチノバシラス・プルロニューモニエ（以下、「ＡＰＰ」とも呼ぶ。）感染を防除する手段の１つは、ワクチン接種プログラムである。過去に、このようなプログラムにおいてはバクテリンが使用されてきたが、バクテリンの重い副作用が知られている。近年は、ＡＰＰの毒素をベースとするサブユニットワクチンが一般に使用されている。

【0003】

ＡＰＰは、いわゆるＲＴＸ毒素（ＲＴＸは、毒素内反復（ｒｅｐｅａｔ−ｉｎ−ｔｏｘｉｎ）を意味する。）を産生する。このバクテリア細菌の病理学的特徴に高度に寄与するのは、これらのＲＴＸ毒素の存在である。過去に、ＲＴＸ毒素は集中的に研究され、文献に記載されてきた。一般に知られている通り、全てのＡＰＰ血清型が全てのＲＴＸ毒素を産生するわけではない。例えば、血清型１、５、９および１１は、ＡｐｘＩおよびＡｐｘＩＩを産生する。血清型２、３、４、６および８は、ＡｐｘＩＩおよびＡｐｘＩＩＩを産生する。血清型１０は、ＡｐｘＩのみを産生し、血清型７および１２は、ＡｐｘＩＩのみを産生する。現在市販されているＡＰＰに対するワクチンは、毒素ＡｐｘＩ、ＡｐｘＩＩおよびＡｐｘＩＩＩをベースとする。かなり最近になって、全てのＡＰＰ血清型が目下ＡｐｘＩＶと呼ばれる第４のＲＴＸ毒素を産生することが見出された（ＥＰ０８７５５７４を参照のこと）。

【0004】

カルシウム塩（即ち、酸の水素イオンの全部または一部を１個以上のカルシウムイオンにより置き換えることにより形成された、酸をベースとする化合物）を添加した培養培地中でアクチノバシラス・プルロニューモニエを培養することにより、ＲＴＸ毒素ＡｐｘＩを産生させる方法が一般に知られている。特に、ＥＰ０４５３０２４は、このような方法を既に記載している（「Ｅｘａｍｐｌｅ ２」、第２パラグラフ「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ」、下位パラグラフ「Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照のこと）。使用されるＡｐｘＩは「ＨＬＹ」と称されることに留意されたい（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ「Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３ Ａｕｇ；１３９（８）：１７２３−８」を参照のこと）。このＥＰ特許から、カルシウム化合物（ＣａＣｌ_２）を培地に添加することが知られている。実際、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ３７（２００４）２９−３３において、ＡｐｘＩオペロンの転写活性は増殖培地へのカルシウムの添加により高められることが記述されている。こうして、高レベルのＡｐｘＩを提供することができる。培地は、ＡＰＰ細菌の増殖を支持しなければならない。細菌の増殖を支持する培地を構成する方法が一般に知られている。古典的な培養培地は、１９５０年代および６０年代にＥａｇｌｅ、Ｈａｍらにより最初に開発された。Ｅａｇｌｅ、Ｈａｍらは、増殖のための基本的な要求を満たす培地は、無機塩、窒素源（例えば、窒素含有化合物の形態、例えば、ペプチドまたはタンパク質）、炭素源およびビタミンを含むべきであることを見出した。培地は、有利には、培地が酸性過多やアルカリ性過多のいずれかになるのを防止するために緩衝化される。この基本的なレシピの範囲内で、多くの異なる構成が利用可能である。例えば、アミノ酸を提供するために動物由来成分を選ぶことができるが、化学的に規定されたアミノ酸を選択することもできる。他の化合物につき、多数のバリエーションも考えられる。実際、細菌の増殖を支持する培地を構成することは、比較的簡単である。しかしながら、増殖および／または代謝産生の最適化には、特に血清または他の動物由来成分を含まない培地が好ましい場合、いくぶんの開発の時間を要し得る。しかしながら、発酵培地性能を改善するための方針は、当該分野において一般に知られており、文献に詳述されている（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｋｒｏｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）２３，４５６−４７５による総説記事を参照のこと）。このような最適化は、発酵実験室内での定型的な実験の一部を形成する。ＡＰＰを培養する場合、本来、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）が培地の一部を形成する。それというのも、ＡＰＰはＮＡＤ依存性であるからである。ＮＡＤが存在しなければ、培地はアクチノバシラス・プルロニューモニエ細菌の増殖を支持せず、従って、本出願および添付の特許請求の範囲の意味におけるＡＰＰの増殖を支持するための液体培地とみなすことができない。細菌の増殖を支持するための培地、またはこのような培地を構成するための成分は、種々の会社、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｏｘｏｉｄ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＶＧＤ Ｉｎｃ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍａｒｃｏｒ、Ｉｒｖｉｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃなどから市販されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】欧州特許出願公開第０８７５５７４号明細書

【特許文献2】欧州特許第０４５３０２４号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．ｉｎ「Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３ Ａｕｇ；１３９（８）：１７２３−８」

【非特許文献2】Ｋｅｎｎｅｄｙ ａｎｄ Ｋｒｏｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９９）２３，４５６−４７５による総説記事

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

従来技術の方法は、ＡｐｘＩ毒素の経済的に関連する収量を得るのに十分であるが、本出願人は、改善の可能性が存在し得ることを認識した。即ち、発酵の間、培地は不透明になる。この培地の不透明化を１種（以上）のカルシウム塩の沈殿に起因し得ると解したことが本出願人の功績であった。即ち、ＡＰＰは、二酸化炭素を産生し、この二酸化炭素が培地中で炭酸塩イオンをもたらす。炭酸カルシウムは、特に低い溶解度を有する塩である。結果として、幾つかの問題が生じ得る。第１に、沈殿により、関与するカルシウムイオンがＡＰＰ細菌に到達しなくなることが考えられる。第２に、沈殿したカルシウム塩は、下流処理における問題を生じさせる。特に、フィルターが沈積物により塞がれる傾向にある。従って、本出願人は、種々の錯形成剤を培地に添加し、これらの錯形成剤が塩の沈殿を防止することができるかどうか確かめた。実際、例えば、ＥＤＴＡを添加することにより、培地は、いくぶん透明のままであり得る。しかしながら、ＡｐｘＩの産生収量は、このような錯形成剤を使用することにより悪影響を受ける。従って、劣悪または不十分であり得ることが推測される。依然として、ＡｐｘＩの産生を改善することが継続的に望まれている。

【0008】

驚くべきことに、ボログルコン酸塩（例えば、２，３−ジヒドロキシ−３−［２−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）−１，３，２−ジオキサボロラン−４−イル］プロパノアートの形態；Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｔａｙｌｏｒ ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｓｔｅｗａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｒｅｄｕｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ；「Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｏｒｏｇｌｕｃｏｎａｔｅ」，ｒｅｃｅｉｖｅｄ １６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９３７も参照のこと）を使用してカルシウムイオンを錯形成させた場合、（添加される）錯形成剤を使用せず、または他の錯形成剤に依存する従来技術の方法と比較して高レベルのＡｐｘＩを産生させることができることを見出した。培地が錯体ボログルコン酸カルシウム（例えば、Ｄ−グルコン酸のホウ酸との環式４，５−エステルのカルシウム塩（２：１）として利用可能）を含有するように、この特定の錯形成剤を使用することにより、他の陰イオンとのカルシウムイオンの実質的な沈殿を防止することができる一方、同時にカルシウムイオンは、アクチノバシラス・プルロニューモニエのＡｐｘＩオペロンの転写活性を高めるために依然として利用可能であると考えられる。カルシウムイオンが塩錯体中にトラップされたままであると考えられ、「トラップ」結合は、一方で、カルシウムイオンが例えば炭酸塩イオンまたは他の陰イオンと沈殿物を形成するのを防止するのに十分強力であるが、他方で、これらのカルシウムイオンが遊離溶解状態である（即ち、水分子のみと錯形成している）かのように、バクテリア細菌自体がカルシウムイオンを使用するのを防止しない。ボログルコン酸塩は、ＡＰＰによるＡｐｘＩの産生に要求される重大なバランスを厳密に満たすことが考えられる。

【0009】

一実施形態において、ボログルコン酸塩濃度は、６０ｍｍｏｌ／ｌ未満である。この濃度を超えると、ＡｐｘＩの産生が低いレベルまで低下することが考えられる。依然として使用可能であるが、濃度はこの数値未満のままであることが好ましい。濃度が２５から４５ｍｍｏｌ／ｌ、特に、幾つかの培地に最適であると考えられる４０ｍｍｏｌ／ｌであることがさらにいっそう好ましい。

【0010】

本発明につき必須ではないが、培地は、動物成分を含まなくてよい。多くの従来技術の方法の欠点は、従来技術が動物由来成分、例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａブロスを含有する培地の使用に依存するということである。従来技術に挙げられる他の動物由来成分は、例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｒｏｔｈ ＭｏｄｉｆｉｅｄまたはＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎブロスである。一般に知られている通り、動物成分の使用は、幾つかの深刻な欠点を有する。第１に、化学組成が、製造ロット間で大幅に変動し得る。さらに、動物起源の補給物質は、感染性作用物質により汚染され得る。主要な懸念は、ヒトまたは動物においてＴＳＥを惹起するプリオンの存在である。単純に、動物成分を含まない培地（「ＡＣＦ」培地と称されることが多い。）を選ぶことができる。この意味における「動物成分」は、動物中でこのままで存在する任意の成分（例えば、血液またはタンパク質）またはこのような成分に由来する任意の成分（例えば、血液に由来する修飾血清、またはタンパク質に由来するアミノ酸）を意味する。しかしなら、本出願人は、ＡｐｘＩの産生効率が、このようなＡＣＦ培地を使用する場合、動物由来成分を含有する培地と比較すると、カルシウム濃度が十分なレベルである場合でさえ、かなり低いことを見出した。理論に拘束されるものではないが、血清を使用すると、カルシウム塩沈殿による問題は、カルシウムイオンの可溶性錯体を形成する作用物質の存在に起因して、それほど深刻ではないと思われる。いずれの場合も、ボログルコン酸塩を使用してカルシウムイオンを錯形成させた場合、これらの培地中でも顕著なＡｐｘＩの収量増加を得ることができる。

【0011】

別の実施形態において、カルシウム塩は、ボログルコン酸カルシウムである。例えば、カルシウム源として塩化カルシウムを依然として使用し、ボログルコン酸塩を添加してカルシウムイオンを錯形成させることができるが、カルシウムをボログルコン酸塩として添加することが好ましい。こうして、培地中で生じる種々の物理的反応（沈殿、溶解、錯体分解、錯体形成）の間の平衡を待つことを要しない。このことは、時間を節約し、従って経済的に好ましい。

【0012】

さらに別の実施形態において、培養の間に空気を液体培地に導通させ、この空気は、大気レベルを超える二酸化炭素を含有する。驚くべきことに、二酸化炭素がＡｐｘＩの産生率をよりいっそう改善することがわかった。プレート上で細菌のコロニーを培養する間に、増加した二酸化炭素レベルを使用することは一般に知られていることに留意されたい（例えば、ＵＳ６，０１９，９８４：ＥＸＡＭＰＬＥＳ「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」を参照のこと）。しかしながら、この増加した二酸化炭素レベルの使用は、細菌のコロニーを培養し、次いで細菌を発酵槽への接種に使用することに関する。この段階において、ＲＴＸ毒素の産生は関連しない。一般に、最大のＡｐｘ産生は発酵槽中で高い細胞密度において、従って、指数増殖期の終了時に生じることが、よりいっそう強く理解されている（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ３７（２００４）２９−３３を参照のこと）。この段階において、二酸化炭素は、刺激因子としては、もはや関連しないと解されている。従って、増加した二酸化炭素レベルを使用することによりＡｐｘの産生を増加させることはこれまで試みられていない。特に、本出願人は、空気が５ｖ／ｖ％の二酸化炭素（不純物を有しない空気の体積に対する純粋な二酸化炭素の体積）を含有する場合、ＡｐｘＩの産生が極めて高いレベルであることを認識した。通常、空気泡状物を培地中のある場所（即ち、培地の表面下）へ逃がす装置を介して空気を培地に導通させることを可能にする、多くの技術をこの実施形態において使用することができることに留意されたい。本発明の範囲の「空気」は、大気空気中に通常存在する１種以上のガス状成分、例えば、酸素、窒素、二酸化炭素、ヘリウム、ネオン、アルゴン、キセノン、ラドンなどを含むガス状媒体を意味する。

【0013】

本発明を、以下の非限定的な実施例を使用することにより、さらに説明する。

【0014】

材料および方法
菌株および培地
本調査は、ＡｐｘＩ産生アクチノバシラス・プルロニューモニエ株、血清型１０（以下、ＡＰＰ１０と呼ぶ）を使用して実施した。全ての場合において、これの株のワーキングシードを、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ ＢＡＳＥ（ＢＡＢ）プレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＵＳＡから入手可能）を使用して再構成した。使用液体培地は、ＮａＯＨおよび酢酸を使用してｐＨを７．３に保持したＣｏｌｕｍｂｉａブロス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＵＳＡから入手可能）と動物成分不含培地（「ＡＣＦ培地」と呼ぶ）のいずれかであった。動物成分不含培地は、ＭｇＳＯ_４（０．７５ｇ／ｌ）、システイン．ＨＣｌ（０．１ｇ／ｌ）、ＦｅＣｌ_３（０．１ｇ／ｌ）、ＮａＮＯ_３（０．１ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．１ｇ／ｌ）、トレーサー元素（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｏｎａｌｄ Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００４に挙げられている溶液ＳＬ−１０ ２．５ｍｌ）、５０％のグルコース溶液（１０ｍｌ）および１０ｍＭのアミノ酸溶液（トリプトファンを除き、全２０種のアミノ酸を含有）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（６ｇ／ｌ；例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）ならびに酵母エキス（１０ｇ／ｌ；例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）を含有する。

【0015】

これらの培地を、予備培養および発酵において使用した。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（０．０１％）およびカルシウム（種々の濃度）を予備培養および発酵において使用した。全ての培地を、０．２２μｍの濾過により滅菌した。培地を発酵において利用する前、８５℃において１分間加熱した。

【0016】

培養
ＡＰＰ１０株のワーキングシードを、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＢＡＢプレート上にプレートアウトし、３７℃において約２４時間温置した。幾つかのコロニーを拾い、７５ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａブロスを含有する５００ｍＬの瓶に接種した。瓶を撹拌しながら３７℃において約６時間温置して予備培養物を形成させた。これらの予備培養物を用いて、幾つかの発酵を実施した。これらの発酵の幾つかを、５００ｍｌの瓶中で行った。その場合、７５ｍｌの培地に１ｍＬの予備培養物を接種した。瓶を撹拌下で３７℃において温置した。または、培養を、約４００ｍＬの培養培地を含有するＳＩＸＦＯＲＳ発酵槽（Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で行い、この培養培地に２０ｍＬの予備培養物を接種源として添加した。培養温度も３７℃である。

【0017】

分析
細胞増殖を、６６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより求めた。ＡｐｘＩ抗原濃度を、定型的なＥＬＩＳＡ測定により測定した。

【0018】

結果
第１の実験は、カルシウムが、ボログルコン酸塩と錯形成しているにもかかわらず、ＡＰＰ細菌に依然として利用可能であるかどうかを決定するために実施した。本実験は、上記瓶中で実施した。以下、結果を表１に示す。

【0019】

【表1】

【0020】

表１のデータが示す通り、カルシウムイオンをボログルコン酸塩と錯形成させた場合、良好なＡｐｘＩの収量を提供することができる。この錯形成の重要な利点は、カルシウム塩の沈殿が、下流処理に顕著な影響をもはや与えないことである。

【0021】

第２の実験は、動物成分不含培地中のボログルコン酸塩の効果が何であるか確かめるために実施した。この目的のため、本出願人は、２０ｍＭのＣａＣｌ_２の添加と、２０ｍＭのボログルコン酸Ｃａの添加とを比較した。結果を表２に示す。

【0022】

【表2】

【0023】

２つの結果が得られる。第１に、塩化カリウムを使用した場合、通常のカルシウムレベルを作出した場合でさえ、ＡＣＦ培地中で十分な量のＡｐｘＩを得ることは困難であることが明確である。カルシウムをボログルコン酸塩と錯体化させた場合、高いＡｐｘＩ収量を得ることができる。同様の結果を他の培地中で得ることができる。本出願人は、このような実験を、塩化鉄も硫酸マグネシウムも含有しないが、他の点では上記ＡＣＦ培地と同一である培地（「ＡＣＦ−ａｌｔ」）中で実施した。やはり、カルシウムをボログルコン酸塩と錯形成させた場合、顕著に増加したレベルが得られた。

【0024】

第３の実験は、ボログルコン酸塩濃度の影響を調査するために実施した。本出願人は、３種の異なる濃度、即ち、２０、４０および６０ｍＭのボログルコン酸カルシウムを使用した。結果を表３に示す。

【0025】

【表3】

【0026】

表３から明確になる通り、約４０ｍＭの濃度が理想的であると考えられる。

【0027】

第４の実験において、本出願人は、ＡｐｘＩ産生収量に対する増加した二酸化炭素レベルの効果を調査した。このため、本出願人は、上記ＡＣＦ−ａｌｔ培地を使用し、硝酸ナトリウムレベルを０．５ｇ／ｌに増加させた。ボログルコン酸塩濃度は、４０、５０および７０ｍＭの間で変えた。ＣＯ_２のより高い濃度は、９５／５（ｖ／ｖ）の空気／ＣＯ_２混合物について１ｖｖｍ（＝１分当たりの培地体積当たりのガス体積）の発酵槽中の一定気流を維持することにより達成した。実験は、上記ＳＩＸＦＯＲＳ発酵槽中で実施した。結果を表４に示す。

【0028】

【表4】

【0029】

結果から、二酸化炭素は、ＡｐｘＩ産生収量に対して正の影響を有すると結論付けることができ：７０ｍＭのボログルコン酸カルシウムの濃度においてさえ、許容されるレベルのＡｐｘＩを産生させることができる。やはり、４０ｍＭが最適な濃度であると考えられる。

【0030】

結論
本出願人は、ＡＰＰ細菌の増殖を支持する液体培養培地中で、ボログルコン酸塩は、一方で、陰性に荷電したイオンとのカルシウムイオンの沈殿の防止と、他方で、アクチノバシラス・プルロニューモニエのＡｐｘＩ産生を刺激するのに利用可能なカルシウムイオンの保持との重大なバランスを提供することができることを見出した。このことは、有利には、カルシウムイオンとの沈殿物を形成する陰イオンを含有する任意のアクチノバシラス・プルロニューモニエ培養培地において使用することができる。実際、選択培地およびこの構成成分の最適化に応じて、ＡＰＰ細菌自体は、より高いレベルまたはより低いレベルのＡｐｘＩを産生する。しかし、ボログルコン酸塩の作用を保護することは、細菌自体の実際の産生速度とは独立して機能するので、この溶液は、全ての培地に首尾良く適用することができる。それというのも、特に、全ての培地は、本来、カルシウムイオンとの沈殿物を形成し得るイオンである炭酸塩イオンを含有するからである。