特許 5698741 １３ａ−（Ｓ）脱酸チロホリニンの塩、医薬組成物と用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5698741

(24)【登録日】2015年2月20日

(45)【発行日】2015年4月8日

(54)【発明の名称】１３ａ−（Ｓ）脱酸チロホリニンの塩、医薬組成物と用途

(51)【国際特許分類】

   C07D 471/04 20060101AFI20150319BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20150319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150319BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150319BHJP

【ＦＩ】

   C07D471/04 102

   C07D471/04CSP

   A61K31/437

   A61P35/00

   A61P29/00

【請求項の数】6

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2012-518745(P2012-518745)

(86)(22)【出願日】2010年7月9日

(65)【公表番号】特表2012-532150(P2012-532150A)

(43)【公表日】2012年12月13日

(86)【国際出願番号】CN2010075083

(87)【国際公開番号】WO2011003362

(87)【国際公開日】20110113

【審査請求日】2012年4月26日

(31)【優先権主張番号】200910089238.5

(32)【優先日】2009年7月9日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】591120284

【氏名又は名称】中国医学科学院葯物研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100096091

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 誠一

(72)【発明者】

【氏名】▲ゆい▼ 石山

(72)【発明者】

【氏名】陳 暁光

(72)【発明者】

【氏名】呂 海寧

(72)【発明者】

【氏名】李 燕

(72)【発明者】

【氏名】徐 嵩

(72)【発明者】

【氏名】馬 双剛

(72)【発明者】

【氏名】劉 振佳

(72)【発明者】

【氏名】張 翼

(72)【発明者】

【氏名】扈 金萍

【審査官】 東 裕子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１１８９９６８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０１０５８５７８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の公式（Ｉ）に示した、異なる酸と形成した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩。

【化1】

（式中のＨＸは、酒石酸、クエン酸、マレイン酸、リンゴ酸、アジピン酸、フマル酸、コハク酸から選択される）

【請求項2】

薬学上受け入れることができるキャリアーに、有効用量の請求項１記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。

【請求項3】

剤形が、錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放性製剤、放出制御製剤や微粒子投与システムから選択されることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

癌を予防および／または治療する医薬品を製造するための、請求項１の化合物の使用。

【請求項5】

前記癌が、ヒト大腸がん、ヒト胃がん、ヒト卵巣癌、子宮頸癌、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、リンパ腫及び神経膠腫から選択されることを特徴とする請求項４に記載の化合物の使用。

【請求項6】

炎症疾患を予防および／または治療する医薬品を製造するための、請求項１記載の化合物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の製造方法、それらを含む薬物の組成物、及びその種類の化合物が癌及び／または炎症性疾患の予防及び／または治療における薬物の製造への応用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

主にガガイモ科チロフォラ属に分布しているフェナントロインドーリジディンアルカロイドは、様々な薬理活性を持っていて、その中で抗腫瘍作用と抗炎症作用は特に注目されている。米国国立がん研究院（ＮＣＩ）における抗腫瘍スクリーニングにより、この種類のアルカロイドは６０種類の腫瘍細胞株に顕著に作用し、成長の半数阻害量（ＧＩ５０）は１０^−８Ｍのレベルであり、悪性腫瘍に重要な役割を果たし、例えば、メラノーマと肺がんの細胞に良好な選択性を持ち、薬剤耐性癌細胞株に対して有効であるうえに、他の抗がん剤に無交差耐性を持っていることが見出された。

【0003】

（＋）１３ａ−（Ｓ）脱酸チロホリニン（既に化合物の特許を申請。特許文献１参照）は、ガガイモ科チロフォラ属の植物Ｔｙｌｏｐｈｏｒａ ａｔｒｏｆｏｌｌｉｃｕｌａｔａ Ｍｅｔｃａｌｆから分離されたフェナントロインドーリジディンアルカロイドであり、強い抗腫瘍活性を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、この化合物のＫｅｔｒ３、ＨＣＴ−８、Ａ５４９、ＢＧＣ−８０３、Ｂｅｌ−７４０２、Ｂ１６ＢＬ６、ＫＢ、ＣａＳＥ−１７、ＨＬ−６０などの腫瘍細胞株に対するＩＣ５０は０．１―０．３μＭの間であることが示された。ｉｎ ｖｉｖｏで（＋）１３ａ−（Ｓ）脱酸チロホリニンが、マウス肝癌Ｈ２２とマウスのＬｅｗｉｓ肺癌の増殖に顕著な抑制作用を持つことが示された。また、ｉｎ ｖｉｖｏでも良好な抗腫瘍活性を持つことが示された。初期段階での毒性実験では、この化合物は毒性が低いもので、肝臓毒性と腎臓毒性は示されなかった。

【0004】

この化合物の抗腫瘍活性メカニズムの研究で、細胞のＤＮＡとＲＮＡ、及びタンパク質合成への影響が示され（非特許文献１参照）、さらなる分子薬理学の研究では、そのメカニズムは臨床で使用された抗がん剤とは全く異なり、ＲＮＡの転写に影響を及ぼすようなＮＦ−κＢシグナル伝達経路に選択的に強力な抑制作用を有し、更に、この作用の強さは細胞毒性と対応するが（非特許文献２参照）、具体的に作用するターゲットの特定はまだ検討中である。

【0005】

これらの化合物の抗炎症作用もＮＦ−κＢシグナル伝達経路の抑制と関連し、この作用はＮＦ−κＢシグナル伝達経路上流のＭＥＫＫ１の作用と密接に関連するが（非特許文献３参照）、ターゲットの特定は依然として不明である。しかし、（＋）１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンは脂溶性が強く、水には不溶である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】中国特許出願第２００６１００７６２９８．Ｘ号（ＣＮ１０１０５８５７８Ａとして公開）

【特許文献2】中国特許出願第２００９１００７９１６３．２号

【非特許文献1】Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００６，１６： ４３００−４３０４．

【非特許文献2】Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００６，５（１０）：２４８４− ２４９３．

【非特許文献3】Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２００６，６９（３）：７４９−７５８．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決すべき技術的な問題点は、提供した公式（Ｉ）に示された１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、及びその薬力学上の許容出来る水和物またはプロドラッグを提供することである。

【0008】

本発明が解決すべきもう一つの技術的な問題点は、提供した公式（Ｉ）に示された１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、及びその薬力学上の許容出来る水和物またはプロドラッグの製造方法を提供することである。

【0009】

本発明が解決すべきもう一つの技術的な問題は一種の医薬組成物で、その中に、少なくとも提供した公式（Ｉ）に示された１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、及びその薬力学上許容出来る水和物またはプロドラッグ、及びその薬用キャリアー及び／または賦形剤を含む組成物を提供することである。

【0010】

本発明が解決すべきもう一つの技術的な問題は提供した公式（Ｉ）の１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、及びその薬力学上の許容出来る水和物またはプロドラッグが癌や炎症の予防及び／または治療に応用する時の製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0011】

これらの技術的な問題を解決するために、本発明に使用された技術的な方案は、以下のとおりである。
本発明は公式（Ｉ）のような化合物である。

【0012】

【化1】

公式（Ｉ）において、ＨＸは有機酸または無機酸を代表する。

【0013】

ＨＸは無機酸を代表するするとき、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸、硝酸を含むが、これらに限定されない。ＨＸは有機酸を代表するとき、酒石酸、クエン酸、マレイン酸、乳酸、サリチル酸、リンゴ酸、安息香酸、アジピン酸、フマル酸、コハク酸、スルホン酸、アルギン酸、アミノ酸、アセチル酸、葉酸、Ｎ−シクロヘキシル−アミノスルホン酸、ポリ−ガラクツロン酸、スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、クエン酸を含むが、これらに限定されない。好ましい有機酸は酒石酸、クエン酸、マレイン酸、乳酸、サリチル酸、リンゴ酸、安息香酸、アジピン酸、フマル酸、コハク酸から選択される。

【0014】

本発明によれば、公式（Ｉ）のように示された１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は含むが、公式（ＩＡ）に示された化合物に限定されない。

【0015】

【化2】

（ＩＡ）において、ＨＸは酒石酸、クエン酸、マレイン酸、乳酸から選択される。

【0016】

本発明により、優先的に選択される１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は、例えば以下式の化合物だが、これらに限定されない。

【0017】

【化3】

【発明の効果】

【0018】

（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンは高脂溶性で、水に不溶であり、光や空気中で芳香族になり、不純物が発生しやすくなる。それを塩にすることにより、水溶性が大幅に上がる。（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩について、その抗腫瘍活性は原型化合物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンに相当し、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は後期にて抗腫瘍活性が維持される。（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンが塩になったため、吸収速度は速くなり、ピーク時間が短く、平均滞留時間（ＭＲＴ）が延長され、生物学的利用能（ＡＵＣ）が上がるなど、薬物動態学的特性が最適化される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその塩がＨ２２移植腫瘍の成長への影響

【図2】（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその塩が腫瘍ＫＭマウス体重への影響

【図3】（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその塩がＨ２２移植腫瘍の成長への影響

【図4】（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマウス血漿の標準曲線

【図5】マウスに経口投与した三種類の（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩およびそのプロトタイプの薬物（６ｍｇ／ｋｇ）の血漿薬物濃度 − 時間曲線

【図6】マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）の脳組織内薬物含有量

【図7】マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマレイン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）の脳組織内薬物含有量

【図8】マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのクエン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）の脳組織内薬物含有量

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明の目的を完了するために、以下の反応式に示される手段をとった。

【0021】

【化4】

【0022】

具体的な操作は、次の手順を含む。同等の（＋）１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン（ＣＡＴ− １）と相当する酸ＨＸを無水エタノール中に懸濁し、５０℃で３０分間撹拌反応させ、反応液は透明になる。その反応液を室温まで冷やし、蒸発後、その塩の固体が得られる。得られた固体をエタノールで再結晶により精製する。

【0023】

本発明において、（＋）１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの製造は《右旋性脱酸チロホリニン、その製造法及びその医薬組成物と用途》（特許文献１）と《１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの誘導体，その製造法及びその医薬組成物と用途》（特許文献２）を参照する。

【0024】

本発明はまた、一種の有効薬物用量を含む公式（Ｉ）に述べたような１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩と薬学的に許容されるキャリアーからなる医薬組成物に関わる。

【0025】

本発明はまた、活性成分として、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩と常規薬物賦形剤または補助剤との医薬組成物に関わる。通常、本発明の医薬組成物は１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩を０．１〜９５重量％含でいる。１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は単位投与形態で０．１〜１００ｍｇ含まれ、優先的に選択された単位剤形では４〜５０ｍｇを含む。

【0026】

１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の医薬組成物は、本分野での公知の方法に従って作ることができる。この目的に使う時、必要に応じて、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は一つまたは多種の固体または液体薬物賦形剤及び／または助剤と組み合わせ、人の薬または獣薬に使用する適切なアプリケーションのフォームや剤形にする。

【0027】

１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩、またはそれを含む医薬組成物を単位用量形態で投薬することができる。投与経路は腸または非腸管であり、例えば経口、筋肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜、または直腸に投与することができる。１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩またはそれを含む医薬組成物の投与経路は注射で投薬できる。注射は静脈注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射と鍼注射などを含む。

【0028】

投薬製剤は、液体製剤、固形製剤にすることができる。例えば液体製剤として、真溶液類、コロイドタイプ、粒子製剤、エマルジョン製剤、懸濁製剤にすることができる。他の剤形として、例えば錠剤、カプセル剤、丸剤、エアゾール剤、錠剤、粉末、溶液、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、坐剤、注射用凍結乾燥粉末などにすることができる。

【0029】

１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は、普通の製剤、または徐放性製剤、徐放性製剤、標的薬物送達製剤及び様々な粒子投薬システムにすることができる。例えば、単位投薬用量を錠剤にするため、この領域内でよく知られている様々なキャリアーを使用することができる。キャリアーの例としては、希釈剤と吸収剤があり、例えば、デンプン、デキストリン、硫酸カルシウム、乳糖、マンニトール、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミなどである。

【0030】

湿潤剤と接着剤としては、例えば、水、グリセリン、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、澱粉、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、アラビアゴム、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック、などのメチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどである。

【0031】

崩壊剤としては、例えば、乾燥澱粉、アルギン酸塩、寒天、アルギン酸塩、澱粉、炭酸水素ナトリウムとクエン酸、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ドデシル硫酸ナトリウム、メチルセルロース等の、エチルセルロースなどである。

【0032】

崩壊抑制剤としては、例えば、砂糖、モノステアリン酸グリセリン、ココアバター、ヒマシ油などであり；吸収促進剤としては、四級アンモニウム、ラウリル硫酸ナトリウムなどである；滑沢剤としては、例えば、タルク、シリカ、コーンスターチ、ステアリン酸塩、ホウ酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどである。

【0033】

錠剤を更にカプセル剤にすることができ、例えば、糖被覆錠剤、フィルムコーティング錠、腸溶コーティング錠剤、または二層コーティング錠錠剤、多層コーティング錠剤にもすることができる。例えば、投薬単位を錠剤にするため、広く本領域内でよく知られる様々なキャリアーを使用することができる。キャリアーの例に関しては、例えば希釈剤と吸収剤は、グルコース、ラクトース、デンプン、カカオバター、植物油、ポリビニルピロリドン、グリセロールモノステアレート、カオリン、タルクなどであり、接着剤としては、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、エタノール、ハチミツ、液糖、米粉で作られた粘液、こう麦粉で作られた粘液などであり、崩壊剤としては、例えば、寒天粉、乾燥澱粉、アルギン酸、ドデシル硫酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなどである。

【0034】

例えば、投薬単位をカプセルにするため、有効成分である１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩を上記の様々なキャリアーと混合し、更に、得られた混合物を硬ゼラチンカプセル剤または軟カプセルに入れる。または、有効成分である１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩をマイクロカプセルにし、水性媒体中に懸濁された懸濁液を形成し、または、硬カプセル剤または注射剤などのアプリケーションにすることができる。

【0035】

例えば、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩を注射用製剤にし、溶液剤、懸濁液溶液剤、乳剤、凍結乾燥粉末、そのような薬剤は水を含むまたは含まないことができ、一種及び／または多種の薬力学的に許容される様々なキャリアー、希釈剤、結合剤、潤滑剤、防腐剤、界面活性または分散剤を含む。例えば、希釈剤として、水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３―プロピレングリコール、ステアリルアルコールエトキシレート、複数の異なる酸化ステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、脂肪酸などから選択することができる。また、等張注射液を製造するために、注射剤に適当な量の塩化ナトリウム、グルコースまたはグリセロールを加えることができ、また、通常の助溶剤、緩衝液、ｐＨ調整剤などを追加することができる。これらの材料は、本領域内ではよく使用される。

【0036】

他に必要に応じて、医薬製剤に着色剤、防腐剤、香料、風味剤、甘味料、または他の材料を加えることができる。投薬の目的を達成し、治療の効果を向上させるために、本発明は薬剤または薬剤組成物にいずれかの公知られる投薬方法で投与することができる。

【0037】

１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の医薬組成物の投与量は数多くの要因に左右され、例えば、予防または治療する疾患の性質と重症度、患者または動物の性別、年齢、体重、性格及び個体反応、投与経路、投与頻度、治療目的に関連する。従って、本発明は、投与量の変化が広い範囲を持つことができる。一般的には、本発明の医薬組成物の使用量は本分野の技術スタッフによく知られている用量である。１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の組成物の最終的量に含まれた実際の薬物の用量により、適切に調整し、治療有効量の要求に達成し、本発明の予防または治療目的を実現する。１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の日用量の適切な範囲は、１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の量は０．００１〜１００ｍｇ／Ｋｇ体重で、好ましいのは０．１〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましいのは１〜３０ｍｇ／Ｋｇ体重、最適な量は２〜１５ｍｇ／Ｋｇ体重である。成人患者が服用する１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩は毎日１０〜５００ｍｇ で、好ましくは２０〜１００ｍｇで、一度に服用するか、または２―３回に分けて服用することができる；子供の用量はｋｇ当たり体重に、５〜３０ｍｇにし、好ましくは１０〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。

【0038】

上記の薬剤の用量は単回投与、または何回に分けて、例えばニ回、三回または四回に分けて投薬剤形にすることができるが、処方する医師の臨床経験及び治療手段の投薬方案に決められる。１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩または組成物は単独服用または他の治療薬物または対症薬物と合併して使用できる。

【0039】

また、本発明は１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩が癌及び／または炎症疾患の薬物の製造に応用できる。特にヒト大腸癌、ヒト胃癌、ヒト卵巣癌、子宮頸がん、肝臓、肺癌、膵臓癌、リンパ腫及び神経膠質腫瘍などの腫瘍に応用できる。

【実施例】

【0040】

以下の実施例は本発明をさらに説明するために使用されたもので、本発明に何の制限もない。

【0041】

（英語略語の説明）
下記の英語略語を使う。
ＣＴＸ：シクロホスファミド
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ：ＬＣ−ＭＳ
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＭＲＴ（０−∞）：平均滞留時間
ＡＵＣ（０−∞）：生物利用能
ｔ１／２ｚ：半減期
ＴＭＡＸ：ピーク到達時間
Ｃｍａｘ：ピーク濃度
＋ＣＡＴ：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン

【0042】

（初期化合物の製造）
本発明の実施例に使われた初期化合物は、本領域内の通常方法及び／または本領域の技術者によく知られる方法で製造することができるが、以下の製造例に従って製造することもできる。
製造例：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの製造

【0043】

【化5】

【0044】

《右旋性脱酸チロホリニン，その製造法及びその医薬組成物と用途》（特許文献１）と《１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの誘導体，その製造法及びその医薬組成物と用途》（特許文献２）を参照する。比旋光：［α］^２０_Ｄ （ｃ＝０．２５，ＣＨＣｌ_３）＝＋１０２°，ｅｅ＝９９．１％ ［キラルＡＤ−Ｈカラム、移動相：イソプロパノール：ヘキサン（１５：８５）、０．１％トリエチルアミン；λ＝２５４ｎｍ；ｔ（ｍａｊｏｒ）＝１８．７９ｍｉｎ， ｔ（ｍｉｎｏｒ）＝２６．０９ｍｉｎ］，ＥＳＩ−ＭＳ：３６４．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋，^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）： ７．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，Ｈ−１）， ７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈｚ，Ｈ−２）， ７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，Ｈ−４）， ７．９０（１Ｈ，ｓ，Ｈ−５）， ７．１２（１Ｈ，ｓ，Ｈ−８）， ４．００（３Ｈ，ｓ，ＭｅＯ），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＭｅＯ）， ４．０９（３Ｈ，ｓ，ＭｅＯ）， ４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，Ｈ−９）， ３．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，Ｈ−９）， ３．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０）， ３．３９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０）， ２．９８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１４）， ２．５７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１３ａ）， ２．５３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０）， ２．２４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２）， ２．０４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１１）， １．９３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１１）， １．７８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１２）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）： １２５．１１（Ｃ−１）， １１４．８３（Ｃ−２），１５７．６１（Ｃ−３）， １０４．５５（Ｃ−４）， １０３．９２（Ｃ−５）， １４９．４２（Ｃ−６）， １４８．３０（Ｃ−７）， １０３．０２（Ｃ−８），５３．４６（Ｃ−９）， ５４．９１（Ｃ−１０）， ２１．５３（Ｃ−１１）， ３１．０３（Ｃ−１２）， ６０．１５（Ｃ１３ａ）， ３３．０３（Ｃ−１４），５５．４８（Ｃ３−ＯＭｅ）， ５５．９６（Ｃ６−ＯＭｅ）， ５５．９０（Ｃ７−ＯＭｅ）及びＢ環の炭素：１２３．３４， １２５．４１，１２５．４２， １２６．７８， １３０．３９（一つの炭素シグナルを重なる）。ＨＲＭＳ （ＥＳＩ） ｃａｌｃｄ ｆｏｒ ［Ｍ］^＋ Ｃ_２３Ｈ_２６ＮＯ_３
３６３．１８３４， ｆｏｕｎｄ ３６３．１８５２。

【0045】

（実施例１）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン２０ｍｇとＬ−酒石酸塩（ＣＡＴ−１酒石酸塩）の合成

【0046】

【化6】

【0047】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン２０ｍｇとＬ−酒石酸８．２６ｍｇを５ｍＬのエタノールに入れ、反応溶液を還流まで加熱し、１０分間攪拌し、室温まで冷却させ、反応液を２ｍｌまで濃縮させ、放置することにより、白っぽい沈殿物が析出し、濾過後を２２ｍｇの固体を得られ、ｍｐ：２１６〜２１８℃で、産物は水に溶解できた。

【0048】

（実施例２）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマレイン酸塩（ＣＡＴ−１マレイン酸）の合成

【0049】

【化7】

【0050】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン５０ｍｇとマレイン酸１６ｍｇを１０ｍＬのエタノールに加え、反応溶液を還流まで加熱し、１０分間攪拌し、溶液が透明になり、室温まで冷却させ、反応液を５ｍｌまで濃縮させ、放置することにより、淡い黄色の沈殿物が析出し、濾過後を４５ｍｇの固体を得られ、ｍｐ：２１６〜２１８℃、産物は水に溶解できた。

【0051】

（実施例３）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのクエン酸（ＣＡＴ−１クエン酸塩）の合成

【0052】

【化8】

【0053】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン５０ｍｇとクエン酸２９ｍｇを１０ｍＬのエタノールに加え、反応溶液を還流まで加熱し、１０分間攪拌し、溶液が透明になり、室温まで冷却させ、反応液を５ｍｌまで濃縮させ、放置することにより、淡い黄色の沈殿物が析出し、濾過後を６０ｍｇの固体を得られ、ｍｐ：１４２〜１４４℃で、産物は水に溶解できた。

【0054】

（実施例４）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの寧乳酸（ＣＡＴ−１乳酸）の合成

【0055】

【化9】

【0056】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン５０ｍｇと乳酸１４ｍｇを１０ｍＬのエタノールに加え、反応溶液を還流まで加熱し、１０分間攪拌し、溶液が透明になり、室温まで冷却させ、反応液を５ｍｌまで濃縮させ、放置することにより、淡い黄色の沈殿物が析出し、濾過後を４５ｍｇの固体を得られ、ｍｐ：１１５〜１１７℃で、産物は水に溶解できた。

【0057】

（実施例５）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩酸塩（ＣＡＴ−１塩酸塩）の合成

【0058】

【化10】

【0059】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン２０ｍｇを５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、撹拌しながら、乾燥したＨＣｌガスを溶液内に通過させ、溶液が淡い黄色になり、持続してＨＣｌガスを溶液内に通過させ、３０分間反応した後、反応液を乾燥させ、白い固体を２０ｍｇ得られ、ｍｐ：２２５〜２２７℃であった。

【0060】

（実施例６）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの硫酸（ＣＡＴ−１硫酸塩）の合成

【0061】

【化11】

【0062】

反応物（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン１ｇを５ｍＬのエタノールに加え、撹拌しながら、この溶液内に２０％（Ｖ／Ｖ）の硫酸を含むエタノール溶液を３ｍｌ加え、反応溶液を還流まで加熱し、溶液が透明になり、室温まで冷却させ、淡い白っぽい沈殿物が析出し、濾過後、１．１ｇの固体を得られた。ｍｐは１７５〜１７７℃である。
各サンプルの溶解度（水）を以下の表１に示す。

【0063】

【表1】

【0064】

（薬理実験）
（実験例１）：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性の測定（ＭＴＴ法）
１．実験手順
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍活性を測定するために、本発明の実施例では、製造した化合物について測定し、その実験手順は以下のようである。
手順１：正常に成長する腫瘍細胞を培養し、１×１０^４細胞／ｍＬの程度で９６ウェルプレート（各ウェル１００μＬ）に接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに２４時間培養する。
手順２：それぞれの被験化合物を添加し、５％ＣＯ２、完全に湿度インキュベーターに５日間培養する。
手順３：培養液を廃棄し、穴毎に０．０４％ＭＴＴを１００μＬ加え、同じ条件下で培養する。
手順４：培養液を廃棄し、ＤＭＳＯを（穴毎に１５０μＬ）加え、混合後、検出波長５７０ｎｍ及び参照波長４５０ｎｍでの発色記録光の吸収度を測定し、化合物が腫瘍細胞の増殖阻害率で計算する。

【0065】

２．結果
実験結果を表２に示す。

【0066】

【表2】

【0067】

３．結論
以上の結果から（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの有機塩は（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンと同じく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意な抗腫瘍活性を持っていることがわかった。

【0068】

（実験例２）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその有機酸塩のｉｎ ｖｉｖｏでの薬効果学実験
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその有機酸塩の薬効果学の特徴を測定するため、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及び三種類の有機酸塩がＨ２２マウスでの腫瘍の成長への影響を観察した。

【0069】

１．実験動物
ＫＭ種のクリーンレベルのマウス、雄、体重１８〜２２ｇ、中国人民解放軍軍事医学科学院実験動物センターから購入し、動物合格証明書番号：ＳＣＸＫ−（軍）２００７―００４。各実験組に動物を６匹にし、合計１０グループで、６０匹である。

【0070】

２．薬物と用量
（１）被験サンプル
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン（＋ＣＡＴ）、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩（Ｔａｒｔｒａｔｅ）、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマレイン酸塩（Ｍａｌａｔｅ）及び（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのクエン酸塩（Ｃｉｔｒａｔｅ）、すべて中国医学科学院研究所植化室のユイ石山研究者の研究グループにより提供され。陽性対照のシクロホスファミド（ＣＴＸ）は、北京友好病院から購入した。
各サンプルの分子量は以下のとおりである。

【0071】

（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン（＋ＣＡＴ）ＭＷ：３６３．４５
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩（Ｔａｒｔｒａｔｅ）ＭＷ：５１３．５４
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマレイン酸塩（Ｍａｌａｔｅ）ＭＷ：４７９．５２
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのクエン酸塩（Ｃｉｔｒａｔｅ）ＭＷ：５７３．５９

【0072】

（２）投薬用量
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンを高用量の５ｍｇ／ｋｇと低用量の２．５ｍｇ／ｋｇ与え、三種類の（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩を５ｍｇ／ｋｇと２．５ｍｇ／ｋｇである（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンと同じモル数に換算して与える。（酒石酸塩（Ｔａｒｔｒａｔｅ）は：７．０５ｍｇ／ｋｇと３．５３ｍｇ／ｋｇで。マレイン酸塩は６．６０ｍｇ／ｋｇ及び３．３０ｍｇ／ｋｇで、クエン酸クエン酸は７．９０ｍｇ／ｋｇ及び３．９５ｍｇ／ｋｇである。）Ｈ２２に接種してから２４時間後、経口投薬し、毎日に一度与え、合計７回である。ＣＴＸを１００ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射し、Ｈ２２に接種してから２４時間後、一回のみ与える。

【0073】

３．方法
実験動物はＳＰＦレベルの環境で飼育し、２４時間観察後、異状なしを認められてから実験に入ることとなる。予めＫＭマウス腹腔から蘇生したＨ２２腫瘍腹水を、滅菌生理食塩水で１：３の比例で希釈する。希釈腫瘍液を実験マウスの左前肢に皮下接種し、それぞれのマウスに希釈腫瘍液を０．２ｍｌ注入する。すべての動物は注射後に実験の要求に応じてランダムに１２グループに分けられ、グループ毎に６匹である。
接種２４時間後から投与し、４種試薬を毎日１回、胃に注入する。陽性対照薬ＣＴＸは腹腔注射され、一度。毎日動物体重を記録する。

【0074】

４．結果
結果を表３に示す。

【0075】

【表3】

【0076】

５．結論
以上の結果から以下のことがわかった。（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの有機酸塩は高用量投薬の時に、実験動物の腫瘍増殖抑制率は原型薬と比較して、相当するか、またはやや高く、低用量投薬の時に、実験動物の腫瘍増殖抑制率は原型薬と比較して、やや低いが、全て対照薬シクロホスファミド（ＣＴＸ）より高い。これが示唆したのは（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンが相応の有機酸と塩になり、その抗腫瘍活性を保つことができた。

【0077】

（実験例３）：（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその硫酸塩の体内での薬効学実験
１．目的
脱酸チロホリニンの硫酸塩（Ｓｕｌｆａｔｅ）がＨ２２腫瘍マウスの腫瘍生長への影響を観察した。

【0078】

２．実験動物
ＫＭ種のクリーンレベルのマウス、雄、体重１８〜２２ｇ、中国人民解放軍軍事医学科学院実験動物センターから購入し、動物合格証明書番号：ＳＣＸＫ−（軍）２００７―００４。

【0079】

３．薬物と用量
（１）被験サンプル
被験サンプルはすべて中国医学科学院研究所植化室のユイ石山研究者の研究グループにより提供され。陽性対照のシクロホスファミド（ＣＴＸ）は、北京友好病院から購入した。
（２）投薬用量及び投与方法
すべてのサンプルは経口投与の方法を採用し、毎日一回、投与体積は０．２ｍｌ／１０ｇである。
脱酸チロホリニンの硫酸塩（Ｓｕｌｆａｔｅ）は五つ違う用量グループにし：３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇと８ｍｇ／ｋｇである。

【0080】

４．実験方法
実験動物はＳＰＦレベルの環境で飼育し、２４時間観察後、異状なしを認められてから実験に入ることとなる。予めＫＭマウス腹腔から蘇生したＨ２２腫瘍腹水を、滅菌生理食塩水で１：３の比例で希釈する。希釈腫瘍液を実験マウスの左前肢に皮下接種し、それぞれのマウスに希釈腫瘍液を０．２ｍｌ注入する。すべての動物は注射後に実験の要求に応じてランダムに１３グループに分けられる。節酒２４時間後投薬を始める。

【0081】

５．結果
結果を表４に示す。

【0082】

【表4】

【0083】

ＣＡＴの硫酸塩を８ｍｇ／ｋｇの用量で経口投薬六日目に３匹死亡し、７日目に３匹死亡し、投薬を中止した。本組腫瘍の重量と抑制率は投与７日目に剖解して、取得した腫瘍の重量のデータである。

【0084】

（実験例４）： （＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその有機酸塩の後血漿薬物動態学及び脳組織での薬物分布研究実験
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及び有機酸塩の薬物動態学の特徴を観察するために、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン及びその三種類の有機酸塩の後血漿薬物動態学及び脳組織での薬物分布特性を研究した。

【0085】

１．実験動物
オスＩＣＲマウス、体重は２０〜２２ｇであり、北京維通利華実験動物技術有限会社が提供した。動物許可証明書番号：ＳＣＸＫ（京都）２００７−０００１。

【0086】

２．薬物と用量
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのマレイン酸塩、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのクエン酸塩は中国医学科学院薬物研究所ユイ石山研究グループが提供し、実験時に、ダブル二回蒸留した蒸留水で濃度を０．６ｍｇ／ｍｌの溶液に調整する。

【0087】

３．実験方法
マウス７２匹を３組に分けられ、一組に２４匹である。実験前に１６ｈ断食させ、自由に飲水出来る。マウスに違う脱酸チロホリニンの塩（６ｍｇ／ｋｇ）を経口投与後、それぞれ５、１５、３０ｍｉｎ、１、２、３、４、６ｈで採血し、血漿を遠心分離する。また、マウスに違う脱酸チロホリニンの塩を経口投与後、それぞれ５、１５、２ｈで脳の組織を取り出し、生理食塩水を加え、２５％の組織ホモジナイズを作る。組織ホモジナイズと血漿サンプルく２００μｌを同体積のアセトニトリルでタンパクを沈澱させ、上澄み液を５μｌ取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に使う。

【0088】

４．結果
（１）．血漿標準曲線
（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンをＤＭＳＯで溶解した後に更にメタノールで希釈し、濃度はそれぞれ１０、５０、１００、５００、１０００、２５００ｎｇ／ｍｌである。ネガコン血漿２００μｌの中に順次に異なる濃度の（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン標準溶液を１０μｌ加え、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの最終濃度をそれぞれ０．５、２．５、５、２５、５０、１２５ｎｇ／ｍｌにし、１９０μｌのアセトニトリルを加え、タンパクを沈澱させ、上澄み液を５μｌ取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に使う。各サンプルマップにより、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのピーク面積を縦軸にし、その濃度（ｎｇ／ｍｌ）を横座標にし、線形回帰をする。結果を表５に示す。０．５−１２５ｎｇ／ｍｌ濃度の範囲内で、血漿サンプルの中のチロホリニン濃度と譜表ピーク面積線形の関係は良好で、相関係数は０．９９９である。

【0089】

【表5】

【0090】

（２）マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの三種の塩（６ｍｇ／ｇ）について後血漿薬物動態
マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩及びクエン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）の後血漿薬物濃度−時間データは、表６〜８を見る。マウスに（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの三種の塩を経口投与した後、吸収が比較的速く、投与後５ｍｉｎに血中で原型薬を測ることができ、酒石酸塩が１５ｍｉｎでピークに到達し、ピーク濃度は３４．２±３．１ｎｇ／ｍｌであり、マレイン酸塩は５ｍｉｎでピークに到達し、ピーク濃度は３５．４±３．５ｎｇ／ｍｌであり、クエン酸塩１５ｍｉｎでピークに到達し、ピーク濃度は２０．１±１２．２ｎｇ／ｍｌである。薬物はマウス体内で比較的速く消去し、投与後６ｈに血中濃度は検出最低限界に近い。マウスに経口投与した（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩の薬時曲線は、ＤＡＳプログラムを応用し、非房室モデルを使い、薬物動態パラメータは表９に示す。（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの三種の塩のマウス体内でのＭＲＴ（０−∞）は１．６３〜２．２９ｈで、明らかに原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン（０．８ｈ）より長い。酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩のＡＵＣ（０−∞）はそれぞれ３７．８５、４９．９１と３３．０８ｕｇ／Ｌ＊ｈであり、原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのＡＵＣ（０−∞）は３３．６７ｕｇ／Ｌ＊ｈである。マレイン酸塩のＡＵＣ（０−∞）は明らかに他の３種類の塩と原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンより高い。酒石酸塩とクエン酸塩のＡＵＣ（０−∞）は原型薬に近い。

【0091】

【表6】

【0092】

【表7】

【0093】

【表8】

【0094】

【表9】

【0095】

（３）．マウスに経口投与した三種類の（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩（６ｍｇ／ｋｇ）の後薬物の脳組織での分布研究
マウスに経口投与した三種類の（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩及びクエン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）の後薬物の脳組織での薬物濃度−時間表データは表１０〜１２し示す。その結果、マウスに（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの塩を経口投与した後、薬物が脳組織に比較的に入りやすくなる。投与後５ｍｉｎに、脳組織の中で原型薬が測れる。投与後１５ｍｉｎに、脳組織で分布ピークが現れる。投与２ｈ後、脳組織の中である程度の薬物が維持している。チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩は三つの時間ポイントで、薬物の含有量は原型薬より高いが、クエン酸塩の含有量は原型薬より低い。

【0096】

【表10】

【0097】

【表11】

【0098】

【表12】

【0099】

５．結論
マウスに（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩とクエン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後、吸収が比較的速く、ピークに到達する時間は５〜３０ｍｉｎであり、ピーク濃度は１８．０〜３５．４ｎｇ／ｍｌであり、（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの三種の塩のマウス体内でのＭＲＴ（０−∞）は１．６３〜２．２９ｈで、明らかに原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニン（０．８ｈ）より長い。酒石酸塩、マレイン酸塩とクエン酸塩のＡＵＣ（０−∞）はそれぞれ３７．８５，４９．９１と３３．０８ｕｇ／Ｌ＊ｈで、原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンのＡＵＣ（０−∞）は３３．６７ｕｇ／Ｌ＊ｈであり、そのうち、マレイン酸塩のＡＵＣ（０−∞）は明らかに他の２種類の塩及び原型薬（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンより高く、酒石酸塩とクエン酸塩のＡＵＣ（０−∞）は原型薬に近い。

【0100】

マウスに（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩及びクエン酸塩（６ｍｇ／ｋｇ）を経口投与後５ｍｉｎで、脳組織の中で原型薬が測れる。投与後１５ｍｉｎで、脳組織内での分布がピークに至る。投与２ｈ後、脳組織の中ではまだいっていの薬ぶつレベルを維持する。（＋）−１３ａ−（Ｓ）−脱酸チロホリニンの酒石酸塩、マレイン酸塩は三つの時間点での薬物の含有量は原型薬より高いが、クエン酸塩は原型薬より下回る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】