特許 5700460 細胞培養デバイス及び細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5700460

(24)【登録日】2015年2月27日

(45)【発行日】2015年4月15日

(54)【発明の名称】細胞培養デバイス及び細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20150326BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20150326BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 C

   C12N5/00 202A

【請求項の数】6

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2012-532811(P2012-532811)

(86)(22)【出願日】2010年9月10日

(86)【国際出願番号】JP2010065585

(87)【国際公開番号】WO2012032646

(87)【国際公開日】20120315

【審査請求日】2013年2月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001069

【氏名又は名称】特許業務法人京都国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】藤山 陽一

(72)【発明者】

【氏名】田川 陽一

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０９９０６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／１００５４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−０８０６０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／１２６１２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−２７００５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Harimoto, M. et al.，Novel approach for achieving double-layered cell sheets co-culture: overlaying endothelial cell sheets onto monolayer hepatocytes utilizing temperature-responsive culture dishes，Journal of Biomedical Materials Research，２００２年，Volume 62, Issue 3，Pages 464-470

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

a)多孔質膜から成り、細胞培養用の足場材によってコーティングされる中間層と、
b)デバイス内部の空間を前記中間層で仕切ることによって形成される第１培養室及び第２培養室と、
c)前記中間層の一方の面の一部を覆って該中間層が前記第１培養室内を流通する液体と接する領域を限定する第１限定層と、
d)前記中間層の他方の面の一部を覆って該中間層が前記第２培養室内を流通する液体と接する領域を限定する第２限定層と、
を有することを特徴とする細胞培養デバイス。

【請求項2】

前記第１限定層及び第２限定層が、前記各培養室内を流通する液体に対して前記中間層を露出させる複数の開口部を有するものであり、該開口部１つ当たりの開口面積が０．０１ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項3】

前記中間層が複数枚の多孔質膜を重ねて成るものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞培養デバイス。

【請求項4】

前記複数枚の多孔質膜の内、第１培養室側の多孔質膜と第２培養室側の多孔質膜がそれぞれ異なる足場材でコーティングされていることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養デバイス。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれかに係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養方法であって、
前記中間層の一方の面と他方の面に異なる種類の細胞を固定して培養することを特徴とする細胞培養方法。

【請求項6】

前記異なる細胞が肝実質細胞と内皮細胞であることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養デバイス、及びそれを用いた細胞培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞培養は、一般的にシャーレ等の容器に細胞及び液体状の培地を収容した状態で行われる。しかし、近年、半導体製造分野での微細加工技術の進歩に伴って医療やバイオテクノロジーの研究分野でも微細加工技術によって製造されたマイクロデバイスの応用が進められており、こうしたマイクロデバイスを用いた細胞培養が行われるようになっている（例えば、特許文献１を参照）。

【0003】

細胞培養用のマイクロデバイス（細胞培養デバイス）は、平板状基材の内部に培養室と微小流路を形成して成るものであり、該培養室に細胞及び培地を収容して細胞培養を行い、前記微小流路を利用して培地の交換を行うものとなっている。

【0004】

ところで、近年、人工臓器の開発に期待が寄せられており、その一環である人工肝臓の開発についても数多くの研究がなされている。しかし、肝臓は判明しているだけで５００種類以上の代謝反応を行っており、こうした肝臓の機能を人工的な装置のみで完全に補うことは極めて困難である。そこで、人工装置と生体の肝細胞とを組み合わせた、いわゆるハイブリッド型の人工肝臓が考案され、その開発が進められている。

【0005】

生体の肝臓においては、肝臓の７０−８０％を構成する肝実質細胞と、類洞内皮細胞などの非実質細胞とが規則正しく配置されており、これらの細胞間におけるシグナル伝達や体液の循環が、正常な肝機能を維持するために重要な役割を果たしている。

【0006】

前記の肝実質細胞と類洞内皮細胞は並列に並んでいるが、両者の間にはディッセ腔と呼ばれる細胞外マトリックスが存在しており、肝実質細胞の細胞列と類洞内皮細胞の細胞列とは直接接触していない。また、それぞれの細胞列の外側は、肝実質細胞側が胆管、類洞内皮細胞側が血管となっており、薬物や栄養物は血管側から供給されて胆管側に排出される。

【0007】

肝機能を有する人工肝臓システムを確立するためには、こうした細胞種の規則正しい配置と細胞外マトリックスの構築が重要である。しかし、肝細胞は長期間の培養が困難であり、その上、生体内の肝臓に近い組織を形成することは更に困難である。そのため、長期間に亘って安定な肝機能を維持できる人工システムは未だ構築されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開WO2009/099066号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

こうした人工肝臓システムの構築に関連して、本発明者らは、２種類の生体細胞を利用したバイオデバイスを提案している（特許文献１）。これは、細胞外マトリックスの代替物として多孔質膜を利用し、その膜の両側に異なる細胞を固定して培養することにより、多孔質膜を介して両側の細胞間で信号伝達や物質の交換又は移動を行わせるようにしたものである。

【0010】

このような培養デバイスは、１種類の細胞を単独で培養する場合に比べて生体内に近い構成を実現できる点で画期的であるが、細胞機能の長期維持の点で更なる改善の余地があった。

【0011】

本発明は上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは２種類の生体細胞を利用して安定した機能を長期間に亘って維持できる細胞培養デバイス及びそれを用いた細胞培養方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記課題を解決するために成された本発明に係る細胞培養デバイスは、
a)多孔質膜から成り、細胞培養用の足場材によってコーティングされる中間層と、
b)デバイス内部の空間を前記中間層で仕切ることによって形成される第１培養室及び第２培養室と、
c)前記中間層の一方の面の一部を覆って該中間層が前記第１培養室内を流通する液体と接する領域を限定する第１限定層と、
d)前記中間層の他方の面の一部を覆って該中間層が前記第２培養室内を流通する液体と接する領域を限定する第２限定層と、
を有することを特徴としている。

【0013】

上記本発明に係る細胞培養デバイスは、中間層で仕切られた２つの培養室を有し、各培養室において異種の細胞を同時に培養することができるものである。前記異種の細胞は、足場材でコーティングされた中間層の両側にそれぞれ固定され、該中間層を構成する多孔質膜を介して細胞間の信号伝達や物質の交換などを行うことができる。従来、こうした細胞培養デバイスの内部に細胞を導入する際には、培地に細胞を懸濁して該懸濁液をシリンジ等によって培養室に注入していた。しかしながら、この場合、注入した細胞が培養室の入口付近に偏って付着してしまい、細胞を培養室全体に行き渡らせるのが困難であった。特に、細胞の種類によっては周囲の細胞とタイトジャンクションを形成した状態でないと機能を発揮できないものがあり、培養室内に細胞密度が低い領域が多く存在すると、安定した機能を得ることができない場合があった。これに対し、上記構成から成る本発明の細胞培養デバイスによれば、前記第１限定層及び第２限定層を設けたことにより、デバイス内に細胞を導入する際に細胞懸濁液と中間層とが接触する領域を限定することができるため、培養室内で細胞が付着する領域を最適に設計することができる。これにより、生体内により近い環境を容易に実現することができ、安定した細胞機能を長期間に亘って得ることが可能となる。

【0014】

前記多孔質膜としては、ポリカーボネートから成るものを好適に用いることができるが、これに限らず、ポリテトラフルオロエチレン、混合セルロース、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、グラスファイバー、ポリエーテル、又はフッ素系樹脂から成るものや、セルロース系、ナイロン系、セラミック系の多孔質膜など、種々のものを用いることができる。また、前記多孔質膜は、細胞を通過させることなく且つ細胞間での物質交換や信号伝達の効率を妨げないものとする必要がある。そのため、該多孔質膜としては、厚さが１ｍｍ以下で、平均孔径が０．１μｍ〜１０μｍのものを用いることが望ましい。

【0015】

前記第１限定層及び第２限定層は、前記各培養室内を流通する液体に対して前記中間層を露出させる複数の開口部を有するものであり、該開口部１つ当たりの開口面積が０．０１ｍｍ^２〜１０ｍｍ^２であるものとすることが望ましい。

【0016】

開口面積がこれより小さいと一つの開口部で中間層に固定できる細胞の数が少なくなり、これより大きいと接着領域の限定による効果が得られ難くなる。また、限定層の厚さは、１ｍｍ以下が適当である。これより大きいと、前記の開口部が深くなるために培養中における細胞周辺の液交換の効率が低下する。

【0017】

また、本発明に係る細胞培養デバイスは、前記中間層が複数枚の多孔質膜を重ねて成るものとすることが望ましい。

【0018】

これにより、第１培養室側の多孔質膜と第２培養室側の多孔質膜にそれぞれ培養細胞の種類に応じた異なる足場材をコーティングすることが可能となり、生体内に一層近い環境を実現することが可能となる。

【0019】

なお、前記足場材としては、Ｅ−ｃａｄ−Ｆｃ（Ｅ−カドヘリンの細胞外領域と、抗体ＩｇＧ分子のＦｃフラグメントの融合タンパク質）を好適に用いることができるが、この他、一般に足場材として用いられるコラーゲンやフィブロネクチン、ラミニン、ＰＶＬＡ（ポリ−Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトンアミド）等を含む高分子を用いることができる。

【0020】

また、本発明に係る細胞培養方法は、上記本発明に係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養方法であって、前記中間層の一方の面と他方の面に異なる種類の細胞を固定して培養することを特徴としている。

【0021】

ここで、前記異なる細胞とは、典型的には肝実質細胞と類洞内皮細胞であるが、本発明に係る細胞デバイスはこれらに限らず種々の細胞の培養に用いることができる。

【発明の効果】

【0022】

以上で説明したように、本発明に係る細胞培養デバイス及び細胞培養方法によれば、２種類の生体細胞を利用した細胞培養において生体内に近い環境を容易に実現することができ、安定した細胞機能を長期間に亘って得ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明の一実施例に係る細胞培養デバイスの平面図。

【図2】図１のＸ−Ｘ矢視断面図。

【図3】同実施例に係る細胞培養デバイスの分解斜視図。

【図4】同実施例の細胞培養デバイスを含む細胞培養システムの概略構成図。

【図5】実験例１における培養細胞のテストステロン水酸化能の評価結果を示すグラフ。

【図6】実験例１における培養細胞と肝ミクロソームの水酸化パターンを示すグラフ。

【図7】実験例２における培養細胞のテストステロン水酸化能の評価結果を示すグラフ。

【図8】実験例２における培養細胞の尿素合成能の評価結果を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明を実施するための形態について実施例を用いて説明する。図１は本実施例に係る細胞培養デバイスの平面図であり、図２は、図１のＸ−Ｘ矢視断面図、図３は本実施例に係る細胞培養デバイスの分解斜視図である。なお、図１では説明のため内部構造の一部を透過させて図示している。

【0025】

本実施例に係る細胞培養デバイス１０は、２枚の基板１１、２１の間に、各２枚の多孔質膜１４、２４、限定層１３、２３、及びシール層１２、２２を挟み込んだ構成となっている。なお、以下に述べる各部の寸法及び材質はあくまで一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。

【0026】

基板１１、２１は、ＰＤＭＳ（東レダウコーニング社製、ＳＩＬＰＯＴ１８４）から成る。基板１１の一方の面には、長さ１６ｍｍ、幅２ｍｍの長方形の凹部から成る第１培養室１１ａと、該第１培養室１１ａの両端部付近から延出する溝状の流路１１ｂ、１１ｃが形成されている。これらの第１培養室１１ａ及び、流路１１ｂ、１１ｃはいずれも０．１ｍｍの深さを有しており、型取りによって形成することができる。前記２本の流路１１ｂ、１１ｃの先端は、それぞれ基板１１の厚さ方向に延びる貫通孔から成る液導入口１１ｄ又は液排出口１１ｅに連通している。更に、基板２１にも同様にして第２培養室２１ａ、流路２１ｂ、２１ｃ、液導入口２１ｄ、及び液排出口２１ｅが形成される。

【0027】

限定層１３、２３は、厚さ０．１ｍｍのＳＵＳ製のメタルマスクから成り、その中央部には、それぞれ前記第１培養室１１ａ又は第２培養室２１ａに対応する領域内に直径０．５ｍｍの貫通孔１３ａ、２３ａが３０個形成されている。この貫通孔１３ａ、２３ａが本発明における開口部に相当する。開口部の形状や数は上記に限らず、培養対象とする細胞の種類や培養の目的に応じて種々のものとすることができる。なお、限定層１３、２３としては、培養対象とする細胞が付着しにくい素材（少なくとも足場材をコーティングした多孔質膜１４、２４よりも細胞の付着性が低いもの）から成るものを用いることが望ましい。このような素材としては、上記ＳＵＳ等の金属のほか、各種樹脂等を用いることができる。

【0028】

シール層１２、２２は、厚さ０．１ｍｍのシリコンゴムから成り、長さ及び幅は基板１１、２１とほぼ同一である。シール層１２、２２の中央には、限定層１３、２３とほぼ同一の長さ及び幅を有する長方形の孔が形成されており、この長方形の孔に限定層１３又は限定層２３が嵌め込まれる。

【0029】

多孔質膜１４、２４は、幅２ｍｍ、長さ１４ｍｍの長方形に打ち抜かれている。本実施例では、多孔質膜１４、２４としてポリカーボネートメンブレンフィルター（ミリポア社製、Isopore HTTP04700、フィルタ孔径０．４μｍ、厚さ７−２２μｍ）を使用した。なお、これらの多孔質膜１４、２４を重ね合わせたものが本発明における中間層に相当する。

【0030】

前記の多孔質膜１４、２４には、それぞれ培養しようとする細胞の種類に応じた足場材がコーティングされる。本実施例では、第１培養室１１ａ側の多孔質膜１４をＥ−ｃａｄ−Ｆｃでコーティングし、第２培養室２１ａ側の多孔質膜２４をＩ型コラーゲンでコーティングした。足場材のコーティング方法は特に限定しないが、例えば、液状化した足場材に多孔質膜１４、２４を浸漬して取り出した後、該多孔質膜１４、２４に付着した足場材を固化させるといった方法が考えられる。なお、こうした足場材によるコーティングは、細胞培養デバイスの製造段階で行ってもよく、細胞培養デバイスを購入したユーザが行うようにしてもよい。

【0031】

本実施例の細胞培養デバイス１０を組み立てる際には、上記各層を滅菌処理し、多孔質膜１４、２４に足場材をコーティングした後に、基板２１、シール層２２、限定層２３、多孔質膜２４、多孔質膜１４、限定層１３、シール層１２、及び基板１１をこの順に重ね合わせる。このとき、基板１１、２１は、第１培養室１１ａが形成された面と第２培養室２１ａが形成された面とが対向するようにする。なお、上述のように、限定層１３、２３はシール層１２、２２の中央部の孔に嵌め込まれるため、シール層１２と限定層１３、及びシール層２２と限定層２３それぞれ細胞培養デバイス１０の厚さ方向の同一位置に配置されることとなる。

【0032】

以上のようにして各層を重ね合わせると、シール層１２、２２を構成するシリコンゴムの自己吸着性によって基板１１とシール層１２、基板２１とシール層２２、及びシール層１２、２２同士が吸着される。そのため、多孔質膜１４、２４及び限定層１３、２３を挟み込んだ状態で基板１１と基板２１を互いに固定することができる。

【0033】

上記の細胞培養デバイス１０によって細胞培養を行う際には、液導入口１１ｄから第１培養室１１ａに肝実質細胞を、液導入口２１ｄから第２培養室２１ａに類洞内皮細胞を導入して各細胞をそれぞれ多孔質膜１４、２４の表面に固定する。具体的には、まず第１培養室１１ａ側が上に来るような向きに細胞培養デバイス１０を置き、肝実質細胞を培地に懸濁してその懸濁液をシリンジ等で第１培養室１１ａに注入する。注入された細胞は重力により沈んで多孔質膜１４に接着される。その後、第２培養室２１ａ側が上になるように細胞培養デバイス１０を置き、同様にして類洞内皮細胞を第２培養室２１ａに注入し、多孔質膜２４に接着させる。

【0034】

なお、多孔質膜１４、２４は、その一部が限定層１３、２３によってマスクされ、貫通孔１３ａ、２３ａの部分でのみ第１培養室１１ａ又は第２培養室２１ａ内の液体と接触できるようになっている。このため、上記のように液導入口１１ｄ、２１ｄから培地と共に導入された細胞は、その一部が培養室の上流付近の貫通孔１３ａ、２３ａに入って多孔質膜１４、２４に接着するが、残りの細胞は培地中を浮遊するか限定層１３、２３の表面に落ちることとなる。限定層１３、２３は多孔質膜１４、２４に比べて細胞が接着され難いため、これらの細胞は培地の流れに乗って各培養室１１ａ、２１ａの下流側へ流れて行く。そして、その過程でいずれかの貫通孔１３ａ、２３ａに入り、そこで多孔質膜１４、２４に接着する。このように、本実施例に係る培養デバイスでは、細胞が多孔質膜１４、２４と接触できる部分が限定層１３、２３によって限定されているため、従来のようにデバイス内に注入した細胞が培養室の入口付近に偏って接着されるのを防ぎ、培養室全体に細胞を行き渡らせることができる。また、細胞が貫通孔１３ａ、２３ａの内部に集まるため、周囲の細胞とタイトジャンクションを形成するような細胞を培養する場合にも安定した細胞機能を発揮させることができる。

【0035】

図４に本実施例に係る細胞培養デバイス１０を用いた細胞培養システムの概略を示す。これは、上記の細胞培養デバイス１０と、該細胞培養デバイス１０に培地を連続送液する送液機構を組み合わせたものである。該送液機構は、培地貯留部３１、４１、培地供給管３２、４２、培地排出管３３、４３、廃液収容部３４、４４、送液ポンプ３５、４５、及び送液ポンプ３５、４５の動作を制御する制御部５０を備えている。培地供給管３２、４２の一端はそれぞれ培地貯留部３１、４１に挿入され、他端はそれぞれ細胞培養デバイス１０の液導入口１１ｄ、２１ｄに挿入される。培地排出管３３、４３の一端はそれぞれ細胞培養デバイス１０の液排出口１１ｅ、２１ｅに挿入され、他端はそれぞれ廃液収容部３４、４４に挿入される。

【0036】

培地貯留部３１には肝実質細胞の培養に適した培地が貯留され、培地貯留部４１には類洞内皮細胞の培養に適した培地が貯留されている。培地貯留部３１に貯留された培地は、送液ポンプ３５によって吸引され、培地供給管３２を通って細胞培養デバイス１０に送られる。細胞培養デバイス１０に供給された培地は、第１培養室１１ａを通過し、液排出口１１ｅに接続された培地排出管３３を介して廃液収容部３４に排出される。同様に培地貯留部４１に貯留された培地は、送液ポンプ４５によって吸引され、培地供給管４２を経て、第２培養室２１ａを通過し、培地排出管４３を通って廃液収容部４４に排出される。

【0037】

なお、第１培養室１１ａ及び第２培養室２１ａは、自己吸着性を有するシール層１２、２２によってシールされるため、液導入口１１ｄ、２１ｄ又は液排出口１１ｅ、２１ｅ以外から培地が外部に漏れ出すことはないが、より確実に液漏れを防止するためには、適当なジグによって細胞培養デバイス１０を上下から挟み込むようにして固定することが望ましい。

【0038】

上記本実施例に係る細胞培養デバイス１０によれば、多孔質膜１４、２４が細胞外マトリックスの代わりとなって細胞の規則正しい配列を実現することができ、且つ細胞間の信号伝達や物質交換も確保できる。更に、第１培養室１１ａ及び第２培養室２１ａ内の培地は、それぞれ胆汁及び血液と似た役割を果たし、代謝や薬物の取り込み排出といった生体内に近い機能を発揮させることができる。

【0039】

また、上記の通り、本実施例に係る細胞培養デバイス１０によれば、限定層１３、２３によって細胞が接着できる領域を制限したことにより、培養室１１ａ、２１ａの入口付近に細胞が偏って接着されるのを防ぎ、細胞をその機能発現に適した所望のパターンで培養室１１ａ、２１ａ内に接着させることができる。また更に、多孔質膜１４、２４を２枚設けたことにより、第１培養室１１ａと第２培養室２１ａとで培養する細胞の種類に応じた異なる足場材を使用することが可能となる。これにより、生体内により近い環境をデバイス内部に構築することができ、長期間に亘って肝機能の発現を維持した状態で細胞培養を行うことが可能となる。

【0040】

以上、実施例を用いて本発明を実施するための形態について説明を行ったが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。例えば、上記の例ではシール層１２、２２によって基板１１、２１を互いに固定する構成としたが、このようなシール層１２、２２を設けず、基板１１、２１を構成するＰＤＭＳの自己吸着性によって基板１１、２１同士を互いに固定させるようにしてもよい。なお、この場合、より強固な接着性を得るために、基板１１、２１の接合面を酸素プラズマや紫外線により活性化して接合させることが望ましい。

【0041】

なお、本発明に係る細胞培養デバイスは、上述のハイブリッド型人工肝臓のような人工臓器として利用することができるほか、細胞による薬物代謝試験などを行う際の反応容器としても利用することもできる。また、上記の例では肝実質細胞と類洞内皮細胞の共培養を行う場合を説明したが、本発明の細胞培養デバイスは、その他の細胞の培養に使用することもできる。

【0042】

以下、本発明に係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養実験について説明する。

【0043】

［実験例１］
図１〜３のような細胞培養デバイス１０において、多孔質膜１４、２４の材質を変えて細胞培養を行い、肝機能の差を評価した。多孔質膜１４、２４としては、それぞれ、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、又は混合セルロースから成る３種類の多孔質膜を使用し、いずれもＩ型コラーゲンでコーティングした上で実験に使用した。

【0044】

本実験例では、ＣＹＰ（シトクロムＰ４５０）によるテストステロンの水酸化能を調べることにより、培養１日目における肝機能を評価した。具体的には、まず、第１培養室に肝実質細胞を３×１０^３個程度播種し、第２培養室には類洞内皮細胞を３×１０^３個程度播種した。そして、第１培養室にテストステロンを０．２５ｍＭの濃度で含む培地を流し、第２培養室にテストステロンを含まない培地を流して培養を行い、第１培養室から排出された培地（廃液）に含まれる水酸化テストステロンの濃度をＨＰＬＣによって測定した。なお、前記の各培地はそれぞれ４０μＬ／ｈｒの流速で各培養室に連続送液した。

【0045】

その結果、図５に示すように、多孔質膜１４、２４としてポリカーボネートから成る多孔質膜を用いた場合に最も高いテストステロン水酸化能が得られることが分かった。

【0046】

更に、上記３種類の多孔質膜を用いた場合における水酸化パターン（即ち、前記廃液中における各種水酸化テストステロンの存在比）を肝ミクロソームによる水酸化パターンと比較した。なお、肝ミクロソームによる水酸化パターンは、肝ミクロソーム画分に第１培養室に導入したものと同じ培地を添加し、２４時間インキュベートした後、上清を回収してＨＰＬＣで各種水酸化物の含有量を測定することによって求めた。

【0047】

上記水酸化パターンの比較結果を図６に示す。なお、図中の１６β−ＯＨＴ、２α−ＯＨＴ、１６α−ＯＨＴ、６β−ＯＨＴ、７α−ＯＨＴは、それぞれ１６β、２α、１６α、６β、７α位が水酸化されたテストステロンを意味している。同図から明らかなように、ポリカーボネートから成る多孔質膜を用いた場合に、最も肝ミクロソームに近い水酸化パターンが得られることが分かった。

【0048】

［実験例２］
別途行った予備実験により、類洞内皮細胞を培養するための足場材としてはＩ型コラーゲンが適していることが分かったため、肝実質細胞側の足場材のみを変えて細胞培養を行い、その際の肝機能を評価した。

【0049】

本実施例で使用した細胞培養デバイスは、多孔質膜１４、２４としてポリカーボネート多孔質膜を使用し、肝実質細胞側（即ち第１培養室１１ａ側）の多孔質膜１４にコーティングする足場材を変えた点以外は、実施例１と同様である。前記肝実質細胞側のコーティングとしては、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＰＶＬＡ、及びＥ−ｃａｄ−Ｆｃの６種類を使用した。

【0050】

実験例１と同様に、第１培養室側に肝実質細胞を、第２培養室側に類洞内皮細胞をそれぞれ３×１０^３個程度播種して細胞培養を行い、培養１日目におけるテストステロン水酸化能、並びに培養１日目、４日目、及び７日目における尿素合成能（アンモニアを分解して尿素を合成する能力）を評価した。

【0051】

テストステロン水酸化能は、上記実験例１と同様に、第１培養室にテストステロンを含む培地を、第２培養室にテストステロンを含まない培地を流して培養を行い、第１培養室から排出された培地に含まれる水酸化テストステロンの濃度をＨＰＬＣで測定することにより評価した。尿素合成能は、第１培養室にＮＨ_４Ｃｌを２．０ｍＭの濃度で含む培地を、第２培養室にはＮＨ_４Ｃｌを含まない培地を流し、培養１日目、４日目、及び７日目において第１培養室から排出された培地中の尿素濃度をＨＰＬＣで測定することによって評価した。なお、いずれの場合も各培地は４０μＬ／ｈｒの流速で各培養室に連続送液した。

【0052】

以上によるテストステロン水酸化能の評価結果を図７に、尿素合成能の評価結果を図８に示す。図７に示すように、肝実質細胞側の多孔質膜をＰＶＬＡでコーティングした場合とＥ−ｃａｄ−Ｆｃでコーティングした場合において、Ｉ型コラーゲンでコーティングした場合（即ち、類洞内皮細胞側と同一のコーティングを施した場合）よりも高いテストステロン水酸化能が得られた。

【0053】

また、図８に示すように、肝実質細胞側の多孔質膜をＩ型コラーゲンでコーティングした場合よりも、該多孔質膜をＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＰＶＬＡ、又はＥ−ｃａｄ−Ｆｃでコーティングした場合に、より長期間に亘って尿素合成能が維持される（即ち培養７日目の尿素合成能が高くなる）ことが確認された。

【0054】

このように、テストステロン水酸化能及び尿素合成能の両方について、コーティングの種類により異なった結果が得られた。このことは、各培養室において細胞の種類に応じた適当な足場材をコーティングすることの有効性を示している。

【符号の説明】

【0055】

１０…細胞培養デバイス
１１、２１…基板
１１ａ…第１培養室
２１ａ…第２培養室
１１ｄ、２１ｄ…液導入口
１１ｅ、２１ｅ…液排出口
１２、２２…シール層
１３、２３…限定層
１３ａ、２３ａ…貫通孔
１４、２４…多孔質膜
３１、４１…培地貯留部
３２、４２…培地供給管
３３、４３…培地排出管
３４、４４…廃液収容部
３５、４５…送液ポンプ
５０…制御部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】