特許 5701064 フェロポーチン抗体およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5701064

(24)【登録日】2015年2月27日

(45)【発行日】2015年4月15日

(54)【発明の名称】フェロポーチン抗体およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150326BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20150326BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20150326BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150326BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150326BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150326BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150326BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150326BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150326BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20150326BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20150326BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20150326BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150326BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/28

   C07K16/46

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12P21/08

   G01N33/53 D

   G01N33/577 B

   G01N33/543 501A

   A61K39/395 N

   A61P7/06

   A61P3/10

   A61P29/00

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P35/00

   A61P37/02

   A61K37/24

   A61P43/00 121

   A61P9/04

   A61P13/12

【請求項の数】71

【全頁数】81

(21)【出願番号】特願2010-544443(P2010-544443)

(86)(22)【出願日】2009年1月23日

(65)【公表番号】特表2011-510629(P2011-510629A)

(43)【公表日】2011年4月7日

(86)【国際出願番号】US2009031851

(87)【国際公開番号】WO2009094551

(87)【国際公開日】20090730

【審査請求日】2010年11月12日

(31)【優先権主張番号】61/023,693

(32)【優先日】2008年1月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/121,729

(32)【優先日】2008年12月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】特許業務法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アーベツドソン，タラ

(72)【発明者】

【氏名】デイアス，グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】ロツトマン，ジエームズ

(72)【発明者】

【氏名】サス，バーブラ

【審査官】 木原 啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】 Gut，２００４年 １月，Vol.53, No.1，p.44-49

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フェロポーチン（配列番号１６）の細胞外ドメインに結合し、ヘプシジンの存在下でフェロポーチン活性を持続する単離されたモノクローナル抗体であって、フェロポーチンの細胞外ドメインが、配列番号１６のアミノ酸３９４−４４９および３９３−４４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、モノクローナル抗体。

【請求項2】

配列番号５〜１０を含むＣＤＲ、配列番号２９〜３４を含むＣＤＲ、配列番号６９〜７４を含むＣＤＲおよび配列番号１０９〜１１４を含むＣＤＲからなる群から選択されるＣＤＲを含む、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項3】

配列番号２または４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号５〜１０を含むＣＤＲを含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

配列番号２６または２８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号２９〜３４を含むＣＤＲを含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

配列番号６６または６８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号６９〜７４を含むＣＤＲを含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項6】

配列番号１０６または１０８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、配列番号１０９〜１１４を含むＣＤＲを含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。

【請求項7】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。

【請求項8】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号２８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体。

【請求項9】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号６８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号６６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。

【請求項10】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号１０８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０６と９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体。

【請求項11】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲが配列番号５〜１０のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。

【請求項12】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号２８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲが配列番号２９〜３４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体。

【請求項13】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号６８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号６６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲが配列番号６９〜７４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。

【請求項14】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号１０８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０６と９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲが配列番号１０９〜１１４のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体。

【請求項15】

重鎖および軽鎖を含む単離されたモノクローナル抗体であって、前記重鎖が、配列番号１４のアミノ酸１８〜４６６を含み、前記軽鎖が、配列番号１２のアミノ酸２１〜２３９を含む、抗体。

【請求項16】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のモノクローナル抗体。

【請求項17】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体。

【請求項18】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体。

【請求項19】

抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が配列番号１０８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１０６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のモノクローナル抗体。

【請求項20】

配列番号１６のアミノ酸３９３〜４４９内に位置するヒトフェロポーチンのフラグメントに結合するか、ヒトフェロポーチンのエピトープに結合する、請求項１から１９のうちの一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項21】

請求項１から２０のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体であって、アミノ酸ＳＩＴＰＴＫＩＰＥＩ（配列番号１６のアミノ酸４１７〜４２６）、アミノ酸ＩＴＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳ（配列番号１６のアミノ酸４２６〜４３８）およびアミノ酸ＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳＡ（配列番号１６のアミノ酸４２８〜４３９）からなる群から選択される前記ヒトフェロポーチンのフラグメントに結合する単離されたモノクローナル抗体。

【請求項22】

キメラ化、ヒト化、または完全なヒト抗体である、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離された抗体。

【請求項23】

キメラ化抗体である、請求項２２の単離された抗体。

【請求項24】

ヒト化抗体である、請求項２２の単離された抗体。

【請求項25】

単鎖Ｆｖ抗体フラグメントである、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項26】

Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）である、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項27】

完全なヒト抗体である、請求項２２の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項28】

ヒトコンセンサス抗体配列、ヒト生殖細胞系抗体配列、またはヒト生殖細胞系コンセンサス抗体配列である、フレームワークアミノ酸配列を含む、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項29】

ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭアイソタイプのものである、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項30】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項31】

ＩｇＧ抗体である、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項32】

２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、請求項３１の単離されたモノクローナル抗体。

【請求項33】

請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。

【請求項34】

請求項３３の核酸を含むベクター。

【請求項35】

請求項３４のベクターまたは請求項３３の核酸を含む宿主細胞。

【請求項36】

請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体を産生する方法であって、（ａ）非ヒト哺乳動物に、フェロポーチン（配列番号１６）をコードする核酸を投与するステップ、任意に（ｂ）前記哺乳動物に、フェロポーチン（配列番号１６）をコードする同一または異なる核酸を投与するステップ、任意に（ｃ）前記哺乳動物に、フェロポーチンを発現する細胞膜を含む組成物を投与するステップ、および（ｄ）前記哺乳動物から、抗体を発現する細胞を獲得するステップを含む、方法。

【請求項37】

核酸を発現させて、抗体を産生するように、請求項３５の宿主細胞を培養するステップを含む、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体を産生する方法。

【請求項38】

宿主細胞培養物から抗体を回収するステップをさらに含む、請求項３７の方法。

【請求項39】

請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。

【請求項40】

生体試料において、フェロポーチンの存在を検出するための方法であって、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載のモノクローナル抗体のうちの少なくとも１つとともに、フェロポーチンに前記モノクローナル抗体を結合させることが可能な条件下で、前記生体試料を温置するステップ、および前記結合モノクローナル抗体または前記結合フェロポーチンを検出するステップを含む、方法。

【請求項41】

モノクローナル抗体が、抗体３１Ａ５、３７Ａ２，３８Ａ４または３８Ｇ６と同一のエピトープに結合する、または、フェロポーチンへの結合に対して、抗体３１Ａ５、３７Ａ２，３８Ａ４または３８Ｇ６と７５％競合する、請求項４０の方法。

【請求項42】

フェロポーチンに結合するポリクローナル抗体とともに、前記試料を温置するステップをさらに含む、請求項４０の方法。

【請求項43】

モノクローナル抗体が、固体支持体上に固定化される、請求項４２の方法。

【請求項44】

ポリクローナル抗体が標識化される、請求項４２の方法。

【請求項45】

ポリクローナル抗体が、固体支持体上に固定化される、請求項４２の方法。

【請求項46】

モノクローナル抗体が標識化される、請求項４３の方法。

【請求項47】

抗体が、固体支持体上に固定化され、ならびに請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の第２の抗体と、フェロポーチンを接触させるステップをさらに含む、請求項４０の方法。

【請求項48】

生体試料がヒトから単離される、請求項４０の方法。

【請求項49】

生体試料が、組織、および血球からなる群から選択される、請求項４８の方法。

【請求項50】

第２の抗体が、固体支持体上に固定化される抗体によって認識されるものとは異なるエピトープを認識する、請求項４７の方法。

【請求項51】

第２の抗体が、標識化される、請求項４７の方法。

【請求項52】

抗体とともに、既知量の精製されたフェロポーチン標準物質を温置するステップを含む、請求項４７の方法。

【請求項53】

鉄ホメオスタシスの障害に罹患する対象を治療するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬組成物。

【請求項54】

鉄ホメオスタシスの障害が、貧血、敗血症、炎症性貧血、癌性貧血、化学療法誘導貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、末期腎疾患、慢性腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）、鉄欠乏性貧血、フェロポーチン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、血管炎、全身性エリテマトーデス、異常血色素症、および赤血球障害からなる群から選択される、請求項５３に記載の医薬組成物。

【請求項55】

前記対象に、赤血球生成刺激剤をさらに含む、請求項５３に記載の医薬組成物。

【請求項56】

赤血球生成刺激剤が、エリスロポエチン、エリスロポエチンの変異体およびエリスロポエチンに結合する抗体からなる群から選択される、請求項５５に記載の医薬組成物。

【請求項57】

鉄ホメオスタシスの障害の治療のための併用療法のための、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体および赤血球生成刺激剤を含む医薬組成物。

【請求項58】

抗体および赤血球生成刺激剤が、１つの組成物に製剤化される、請求項５７に記載の医薬組成物。

【請求項59】

抗体および赤血球生成刺激剤が、別個の組成物に製剤化される、請求項５７に記載の医薬組成物。

【請求項60】

鉄ホメオスタシスの障害の治療のための併用療法のための、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体および抗ヘプシジン抗体を含む医薬組成物。

【請求項61】

抗体および抗ヘプシジン抗体が、１つの組成物に製剤化される、請求項６０に記載の医薬組成物。

【請求項62】

抗体および抗ヘプシジン抗体が、別個の組成物に製剤化される、請求項６０に記載の医薬組成物。

【請求項63】

エリスロポエチン刺激剤による療法に対して低応答性である対象を治療するための、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。

【請求項64】

赤血球生成刺激剤をさらに含む、請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項65】

対象が、貧血、敗血症、炎症性貧血、癌性貧血、化学療法誘導貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、末期腎疾患、慢性腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）、鉄欠乏性貧血、フェロポーチン病、ヘモクロマトーシス、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、血管炎、全身性エリテマトーデス、異常血色素症、赤血球障害および腎不全からなる群から選択される病態に罹患している、請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項66】

対象が貧血に罹患している、請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項67】

対象がヒトである、請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項68】

赤血球生成刺激剤が、配列番号２１のヒトエリスロポエチンである、請求項６４に記載の医薬組成物。

【請求項69】

赤血球生成刺激剤が、配列番号２２のダルベポエチンアルファである、請求項６４に記載の医薬組成物。

【請求項70】

静脈切開と併用される、請求項６４に記載の医薬組成物。

【請求項71】

鉄過剰の治療のための併用療法のための医薬組成物であって、請求項１から２１のうちのいずれか一項に記載の抗体および鉄キレート剤を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連特許出願に対する相互参照）
本出願は、２００８年１２月１１日に出願された米国仮出願第６１／１２１，７２９号の優先権、および２００８年１月２５日に出願された米国仮出願第６１／０２３，６９３号の優先権を主張する。各優先出願の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、フェロポーチン抗体およびその使用に関する。

【背景技術】

【0003】

（背景）
鉄はすべての生命体の成長および発達のために必要となる、必須微量元素である。哺乳動物の鉄含有量は、鉄吸収、鉄循環、および鉄を貯蔵する細胞からの鉄放出を制御することによって、調節される。鉄放出は、血漿に鉄を放出することが可能な主細胞である、腸細胞、マクロファージおよび肝細胞の細胞表面上に位置する主要な鉄輸出タンパク質であるフェロポーチンによって制御される。ＭＴＰ１またはフェロポーチン−１としても知られているフェロポーチンは、細胞内鉄排出を媒介する複数回貫通型膜タンパク質である（Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：７７６−７８１，２０００、Ａｂｂｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１９９０６−１９９１２，２０００）。フェロポーチンは、十二指腸の腸細胞および細網内皮系のマクロファージに高度に発現し、食事からの鉄の輸送および老化赤血球からの循環利用にそれぞれ関与する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３９７８６−３９７９１，２００２）。フェロポーチンは、鉄調整ホルモンであるヘプシジンによって負に調整される。ヘプシジンは、フェロポーチンに結合し、フェロポーチンの内部移行および分解をもたらすことが示されている（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０７：３２８−３３３，２００６；Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−２０９３，２００４；ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，８：２５６９−２５７８，２００７）。この機序は、マクロファージ、肝細胞および腸細胞からの鉄の放出を遮断する（Ｋｎｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１３２４−１３２８，２００８、Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０７：３２８−３３３，２００６、Ｋｎｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０２：４１９１−４１９７，２００３）。

【0004】

フェロポーチンは、トランスジェニックマウスにおいて示されるように、鉄排出に重要である、つまり、フェロポーチンの喪失は、胎児期に致死的である一方で、条件付ノックアウトによるフェロポーチンの不活性化は、腸細胞、マクロファージおよび肝細胞において鉄貯蔵の増加をもたらす（Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｅｔａｂ．，１：１９１−２００，２００５）。Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｏａｔｅｓ，Ｇｕｔ，２００４；５３；４４−４９は、ラットフェロポーチンペプチド配列Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＡＫ７７８５８（膜貫通ドメイン３および４の間にあることが予測される）を用いて生成されるポリクローナル抗体が、細胞内の鉄取り込みを減少させたが、鉄放出に影響を及ぼさなかったことを報告した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｄｏｎｏｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：７７６−７８１，２０００

【非特許文献2】Ａｂｂｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１９９０６−１９９１２，２０００

【非特許文献3】Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３９７８６−３９７９１，２００２

【非特許文献4】Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０７：３２８−３３３，２００６

【非特許文献5】Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０６：２０９０−２０９３，２００４

【非特許文献6】ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，８：２５６９−２５７８，２００７

【非特許文献7】Ｋｎｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：１３２４−１３２８，２００８

【非特許文献8】Ｋｎｕｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０２：４１９１−４１９７，２００３

【発明の概要】

【0006】

（発明の要旨）
本発明の種々の実施形態は、以下に記載されるように、ヒトフェロポーチンに結合するモノクローナル抗体を含む抗体、かかる抗体を産生する方法、フェロポーチンを検出するためにかかる抗体を使用する方法、かかる抗体を含む医薬製剤、該医薬製剤を調製する方法、ならびに赤血球生成刺激剤および／または鉄キレート剤との併用療法を含む、該医薬製剤により患者を治療する方法を提供する。かかる抗体をコードする核酸、かかる核酸を含むベクターおよび組換え宿主細胞、ならびにかかる抗体を産生する方法も提供する。

【0007】

一態様において、該抗体は、例えば、所望の親和性を有する、フェロポーチン（配列番号１６）の細胞外ドメインに結合する単離されたモノクローナル抗体といった、抗体である。いくつかの実施形態において、フェロポーチンを発現する細胞に対する抗体の親和性の解離定数（ｋｄ）は、約１０^−６Ｍ以下、または約１０^−７Ｍ以下、または約１０^−８Ｍ以下、または約１０^−９Ｍ以下である。いくつかの実施形態において、フェロポーチンの細胞外ドメインは、配列番号１６のアミノ酸４６〜６０、１１６〜１２６、２０４〜２０５、３２５〜３４２、３９４〜４４９、５１３〜５１７、３５〜５７、１１６〜１２４、３３２〜３４０、３９３〜４４９および５１５〜５１８、ならびに少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２アミノ酸長さのそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、フェロポーチンの内部移行および／または分解を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、フェロポーチンのヘプシジン媒介による内部移行または分解を阻害する。一実施形態において、抗体は、約１０^−６Ｍ以下、または約１０^−７Ｍ以下、または約１０^−８Ｍ以下、または約１０^−９Ｍ以下のＥＣ_５０で、細胞内鉄濃度を低下させる、および／または血中鉄濃度を増加させる。他の実施形態において、抗体は、哺乳動物における、赤血球数（数値）またはヘモグロビンもしくはヘマトクリットレベルを増加させる、ならびに／または網状赤血球数、網状赤血球平均細胞体積および／もしくは網状赤血球ヘモグロビン含有量を正常化する特性を示す。

【0008】

種々の実施形態において、抗体は、配列番号１６のアミノ酸３９３〜４４９内に位置する少なくとも５つ、１０、１５もしくはそれ以上のアミノ酸を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、配列番号１６のアミノ酸４３９〜４４９内に位置する少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のアミノ酸を含むフェロポーチンのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＡＮＩＶＰＥＴＳＰＥＳ（配列番号１６のアミノ酸４３９〜４４９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。エピトープは、完全に該フラグメント内にあり得るか、または該フラグメントのエピトープは、フラグメント内の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つのアミノ酸およびフラグメント外の１つ以上のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＮＩＶＰＥＴＳＰＥＳ（配列番号１６のアミノ酸４４０〜４４９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＶＰＥＴＳＰＥＳＶ（配列番号１６のアミノ酸４４１〜４５０）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＶＰＥＴＳＰＥＳＶＰ（配列番号１６のアミノ酸４４２〜４５１）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＰＥＴＳＰＥＳＶＰＩ（配列番号１６のアミノ酸４４３〜４５２）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＴＳＰＥＳＶＰＩＩＳ（配列番号１６のアミノ酸４４５〜４５４）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＡＮＩＶＰＥＴＳＰ（配列番号１６のアミノ酸４３９〜４４７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＶＰＥＴＳＰＥＳ（配列番号１６のアミノ酸４４１〜４４９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＡＮＩＶＰＥＴＳ（配列番号１６のアミノ酸４３９〜４４６）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＶＰＥＴＳＰＥ（配列番号１６のアミノ酸４４１〜４４８）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＶＰＥＴＳＰ（配列番号１６のアミノ酸４４１〜４４７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＰＥＴＳＰＥＳ（配列番号１６のアミノ酸４４３〜４４９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＬＶＥＬＹＧＮＳＬＬ（配列番号１６のアミノ酸５０〜６９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＦＬＶＥＬＹＧＮＳＬ（配列番号１６のアミノ酸４９〜６８）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＶＥＬＹＧＮＳＬＬＬ（配列番号１６のアミノ酸５１〜７０）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＥＬＹＧＮＳＬＬＬＴ（配列番号１６のアミノ酸５２〜７１）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＬＹＧＮＳＬＬＬＴＡ（配列番号１６のアミノ酸５３〜７２）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＬＡＦＬＹＭＴＶＬＧ（配列番号１６のアミノ酸３１４〜３２３）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＡＦＬＹＭＴＶＬＧＦ（配列番号１６のアミノ酸３１５〜３２４）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＦＬＹＭＴＶＬＧＦＤ（配列番号１６のアミノ酸３１６〜３２５）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫＩＰＥＩＴ（配列番号１６のアミノ酸４１３〜４２７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫ（配列番号１６のアミノ酸４１３〜４２２）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＱＧＥＳＩＴＰＴＫＩ（配列番号１６のアミノ酸４１４〜４２３）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＧＥＳＩＴＰＴＫＩＰ（配列番号１６のアミノ酸４１５〜４２４）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＥＳＩＴＰＴＫＩＰＥ（配列番号１６のアミノ酸４１６〜４２５）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＳＩＴＰＴＫＩＰＥＩ（配列番号１６のアミノ酸４１７〜４２６）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＴＰＴＫＩＰＥＩＴ（配列番号１６のアミノ酸４１８〜４２７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＤＧＷＶＳＹＹＮＱＰ（配列番号１６のアミノ酸２９７〜３０６）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＴＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳ（配列番号１６のアミノ酸４２６〜４３８）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳＡ（配列番号１６のアミノ酸４２８〜４３９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＴＴＥＩＹＭＳＮＧ（配列番号１６のアミノ酸４２６〜４３５）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＴＴＥＩＹＭＳＮＧＳ（配列番号１６のアミノ酸４２７〜４３６）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮ（配列番号１６のアミノ酸４２８〜４３７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳ（配列番号１６のアミノ酸４２９〜４３８）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＹＭＳＮＧＳＮＳＡ（配列番号１６のアミノ酸４３０〜４３９）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＹＨＧＷＶＬＴＳＣＹ（配列番号１６のアミノ酸１２４〜１３３）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＲＤＧＷＶＳＹＹＮＱ（配列番号１６のアミノ酸２９６〜３０５）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＥＩＹＭＳＮＧ（配列番号１６のアミノ酸４２９〜４３５）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＹＭＳＮＧＳＮ（配列番号１６のアミノ酸４３０〜４３７）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、抗体は、アミノ酸ＩＴＰＴＫ（配列番号１６のアミノ酸４１８〜４２２）を含むフェロポーチンのフラグメント、または本フラグメント内の、もしくは本フラグメントのエピトープに結合する。

【0009】

種々の実施形態において、モノクローナル抗体は、抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６のうちのいずれか、またはかかる抗体のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つを保有する抗体を含み得、任意に、かかる単数もしくは複数のＣＤＲにおいて１つもしくは２つの変異体、またはかかる抗体のうちのいずれかの軽鎖もしくは重鎖可変領域を保有する抗体、またはかかる抗体のうちのいずれかのすべての重鎖ＣＤＲおよび／もしくはすべての軽鎖ＣＤＲを保有する抗体、または抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６と同一のヒトフェロポーチン上のエピトープに結合する、もしくは少なくとも７５％ヒトフェロポーチンに結合するためにかかる抗体と競合する抗体を含む。

【0010】

種々の実施形態はまた、本明細書に記載のモノクローナル抗体のうちのいずれかをコードする核酸、かかる核酸配列を含むベクター、およびかかる核酸またはベクターを含む宿主細胞も提供する。関連した態様において、抗体を産生するために核酸が発現されるように、前述の宿主細胞を培養するステップと、任意に、宿主細胞または培地から抗体を回収するステップを含む、かかるモノクローナル抗体の組換え産生のための方法を提供する。関連した実施形態において、前述の方法によって産生された単離される抗体または薬剤を提供する。かかる抗体は、任意に、追加の治療、細胞傷害性、または診断部分に共役される。

【0011】

いくつかの実施形態において、抗フェロポーチン抗体は、（ａ）哺乳動物に、フェロポーチン（配列番号１６）をコードする核酸を投与するステップと、任意に（ｂ）前記哺乳動物に、フェロポーチン（配列番号１６）をコードする同一または異なる核酸を投与するステップと、任意に（ｃ）前記哺乳動物に、フェロポーチンを発現する細胞膜を含む組成物を投与するステップと、（ｄ）前記哺乳動物から、抗体を発現する細胞を得るステップと、によって産生される。

【0012】

別の態様において、試料において、ヒトフェロポーチンを検出する方法を提供し、ヒトフェロポーチンに抗体を結合させることが可能な条件下で、前述の抗体のいずれかと、ヒトからの試料を接触させるステップと、結合抗体を検出するステップと、を含む。一実施形態において、フェロポーチンに対する第１の抗体は、捕捉試薬として、固体支持体上で固定化され、フェロポーチンに対する第２の抗体は、検出試薬として使用される。関連した態様において、試料におけるフェロポーチンの量は、結合抗体の量を測定することによって、定量化される。

【0013】

別の態様において、本明細書に記載の抗体のうちのいずれかの治療有効量、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。ヘプシジンレベルの上昇、ヘプシジン関連障害、または貧血が挙げられるが、これらに限定されない、鉄ホメオスタシスの障害に罹患するヒトの治療用の薬剤の調製における、かかる抗体の使用法も提供する。第２の治療剤と抗体の投与を含む同時投与方法は、本明細書に記載されるように、第２の治療剤との同時投与用の薬剤の調製における抗体の使用だけでなく、抗体との同時投与用の薬剤の調製における第２の治療剤の使用を包含することを理解されたい。

【0014】

種々の実施形態は、例えば、治療有効量のかかる抗体を投与することによって、鉄ホメオスタシスの障害、ヘプシジン関連障害に罹患する哺乳動物、または貧血に罹患する哺乳動物を治療するための、かかる抗体を使用する方法をさらに含む。例示的な実施形態において、該哺乳動物は、アフリカ型鉄過剰症、αサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌性貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症性貧血、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症（冠動脈疾患、脳血管疾患、または末梢閉塞性動脈疾患を含む）、失調症、鉄に関連した失調症、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠損症、化学療法誘導貧血、末期腎不全もしくは慢性腎疾患／腎不全を含む慢性腎疾患／腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）、肝臓の肝硬変、典型的なヘモクロマトーシス、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰（ヘプシジンの上昇）を伴う状態、先天性赤血球異形成貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄の生体内分布の障害、鉄ホメオスタシスの障害、鉄代謝の障害、フェロポーチン病、フェロポーチン突然変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、ｇｒａｃｉｌｅ症候群、ヘリコバクター・ピロリ感染もしくは他の細菌感染、ハレルフォルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２において突然変異から生じるヘモクロマトーシス、異常血色素症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶもしくは他のウイルス性疾患、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏障害、鉄過剰障害、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーチンもしくは鉄代謝の他の遺伝子の突然変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連した神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、変形性関節症、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリテマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸血後鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、ウィルソン病ならびに／または鉄過剰に関連した心疾患からなる群から選択される病態に罹患しているヒトである。

【0015】

さらに別の態様において、（ａ）前述の抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤、および（ｂ）赤血球生成刺激剤を治療有効量で投与することによって、鉄ホメオスタシスの障害に罹患する哺乳動物を治療するための方法を提供する。例示的な赤血球生成刺激剤には、エリスロポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変異体、およびエリスロポエチン受容体に結合し、かつ活性化するペプチドまたは抗体が含まれる。赤血球生成刺激剤としては、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンゼータ、およびこれらの類似体、擬似ペプチド、擬似抗体およびＨＩＦ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許公開第２００５／００２０４８７号を参照されたく、この開示は、参照によりその全体が組み込まれる）。特に、エリスロポエチンとしては、以下の特許または特許出願に開示される、エリスロポエチン、ならびにエリスロポエチン分子もしくは変異体もしくはこれらの類似体が挙げられるが、これらに限定されず、それらの特許または特許出願は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４１，８６８号、第５，５４７，９３３号、第５，６１８，６９８号、第５，６２１，０８０号、第５，７５６，３４９号、第５，７６７，０７８号、第５，７７３，５６９号、第５，９５５，４２２号、第５，８３０，８５１号、第５，８５６，２９８号、第５，９８６，０４７号、第６，０３０，０８６号、第６，３１０，０７８号、第６，３９１，６３３号、第６，５８３，２７２号、第６，５８６，３９８号、第６，９００，２９２号、第６，７５０，３６９号、第７，０３０，２２６号、第７，０８４，２４５号、第７，２１７，６８９号、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９１／０５８６７、ＷＯ９５／０５４６５、ＷＯ９９／６６０５４、ＷＯ００／２４８９３、ＷＯ０１／８１４０５、ＷＯ００／６１６３７、ＷＯ０１／３６４８９、ＷＯ０２／０１４３５６、ＷＯ０２／１９９６３、ＷＯ０２／２００３４、ＷＯ０２／４９６７３、ＷＯ０２／０８５９４０、ＷＯ０３／０２９２９１、ＷＯ２００３／０５５５２６、ＷＯ２００３／０８４４７７、ＷＯ２００３／０９４８５８、ＷＯ２００４／００２４１７、ＷＯ２００４／００２４２４、ＷＯ２００４／００９６２７、ＷＯ２００４／０２４７６１、ＷＯ２００４／０３３６５１、ＷＯ２００４／０３５６０３、ＷＯ２００４／０４３３８２、ＷＯ２００４／１０１６００、ＷＯ２００４／１０１６０６、ＷＯ２００４／１０１６１１、ＷＯ２００４／１０６３７３、ＷＯ２００４／０１８６６７、ＷＯ２００５／００１０２５、ＷＯ２００５／００１１３６、ＷＯ２００５／０２１５７９、ＷＯ２００５／０２５６０６、ＷＯ２００５／０３２４６０、ＷＯ２００５／０５１３２７、ＷＯ２００５／０６３８０８、ＷＯ２００５／０６３８０９、ＷＯ２００５／０７０４５１、ＷＯ２００５／０８１６８７、ＷＯ２００５／０８４７１１、ＷＯ２００５／１０３０７６、ＷＯ２００５／１００４０３、ＷＯ２００５／０９２３６９、ＷＯ２００６／５０９５９、ＷＯ２００６／０２６４６、ＷＯ２００６／２９０９４号、ならびに米国公開番号第ＵＳ２００２／０１５５９９８、ＵＳ２００３／００７７７５３、ＵＳ２００３／００８２７４９、ＵＳ２００３／０１４３２０２、ＵＳ２００４／０００９９０２、ＵＳ２００４／００７１６９４、ＵＳ２００４／００９１９６１、ＵＳ２００４／０１４３８５７、ＵＳ２００４／０１５７２９３、ＵＳ２００４／０１７５３７９、ＵＳ２００４／０１７５８２４、ＵＳ２００４／０２２９３１８、ＵＳ２００４／０２４８８１５、ＵＳ２００４／０２６６６９０、ＵＳ２００５／００１９９１４、ＵＳ２００５／００２６８３４、ＵＳ２００５／００９６４６１、ＵＳ２００５／０１０７２９７、ＵＳ２００５／０１０７５９１、ＵＳ２００５／０１２４０４５、ＵＳ２００５／０１２４５６４、ＵＳ２００５／０１３７３２９、ＵＳ２００５／０１４２６４２、ＵＳ２００５／０１４３２９２、ＵＳ２００５／０１５３８７９、ＵＳ２００５／０１５８８２２、ＵＳ２００５／０１５８８３２、ＵＳ２００５／０１７０４５７、ＵＳ２００５／０１８１３５９、ＵＳ２００５／０１８１４８２、ＵＳ２００５／０１９２２１１、ＵＳ２００５／０２０２５３８、ＵＳ２００５／０２２７２８９、ＵＳ２００５／０２４４４０９、ＵＳ２００６／００８８９０６号、および第ＵＳ２００６／０１１１２７９号。ある例示的な実施形態において、赤血球生成刺激剤は、ヒトエリスロポエチン（配列番号２１）およびダーベポエチンアルファ（配列番号２２）からなる群から選択される。かかる方法に従って治療され得る貧血の例示的な形態には、炎症性貧血、癌性貧血、化学療法誘導貧血、鉄欠乏性貧血、鉄ホメオスタシスの障害、フェロポーチン病、または腎臓病によって起こる貧血が含まれる。赤血球生成刺激剤による療法に対して、低応答性、または抵抗性でもある、貧血に罹患する哺乳動物を治療する方法も提供し、それには、治療有効量の抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤を投与するステップを含む。

【0016】

別の関連した態様において、鉄ホメオスタシスの障害、またはヘプシジンレベルの上昇と関連した障害、またはヘプシジン関連障害、または鉄ホメオスタシスの障害、または貧血に罹患する哺乳動物を治療するためのキットも提供する。例示的な一実施形態において、該キットには、（ａ）抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤、および（ｂ）赤血球生成刺激剤、および任意に、鉄または鉄キレート剤が含まれる。別の例示的な実施形態において、該キットには、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤、容器に添付されているもしくは容器とともに包装されているラベルが含まれ、該ラベルは、赤血球生成刺激剤とともに、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤の使用を説明する。さらに別の例示的な実施形態において、該キットには、赤血球生成刺激剤および容器に添付されているもしくは容器とともに包装されているラベルが含まれ、該ラベルは、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤とともに、赤血球生成刺激剤の使用を説明する。赤血球生成刺激剤を伴う投与用の薬剤を調製する際の抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤の使用、ならびに抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤を伴う投与用の薬剤を調製する際の赤血球生成刺激剤の使用も提供する。これらのキットまたは使用のいずれにおいても、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および赤血球生成刺激剤は、別個のバイアル中に入れることができる、または単一の医薬組成物に一緒にして混合することができる。さらに別の実施形態において、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤、赤血球生成刺激剤、または双方は、単一の医薬組成物に鉄または鉄キレート剤と一緒にして混合することができる、または別個のバイアルに入れることができる。

【0017】

治療を必要とする対象のための治療計画を選択する方法も提供し、それには、（ａ）血中鉄レベルの減少またはヘプシジンレベルの上昇に対して対象をスクリーニングするステップと、（ｂ）前記対象に、前述の抗体のいずれかを処方するステップと、および任意に、前記対象に、赤血球生成刺激剤ならびに／または鉄および／もしくは鉄キレート剤を処方するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、該スクリーニングには、生体試料を得るステップと、前記試料における、鉄レベルを決定するステップと、を含む。

【0018】

種々の実施形態は、鉄ホメオスタシスの障害または鉄過剰の治療のための併用療法を提供する。いくつかの実施形態において、併用療法は、治療を必要とする対象に、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および赤血球生成刺激剤を治療有効量で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、治療を必要とする対象に、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および鉄を治療有効量で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、治療を必要とする、例えば、鉄過剰に罹患している対象に、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および鉄キレート剤を治療有効量で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、治療を必要とする対象に、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および抗ヘプシジン抗体を治療有効量で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、併用療法において、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および他の薬剤は、１つの組成物に製剤化される。いくつかの実施形態において、併用療法において、抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤および他の薬剤は、別個の組成物に製剤化される。

【0019】

前述の要旨は、本発明のすべての態様を定義することを意図せず、追加の態様は、詳細な説明等の他の項に記載される。全文書は、統合された開示として関連されるべきであることを意図するものであり、特性の組み合わせが、本文書の同一の文、または段落、または項において、一緒に見出されない場合でさえ、本明細書に記載される特性のすべての組み合わせは、企図されることを理解するべきである。

【0020】

前述に加えて、本発明は、追加の態様として、本明細書の特定の段落によって定義される変更例よりも何らかの点で範囲がさらに狭くなる、本発明のあらゆる実施形態を含むことができる。例えば、本発明のある態様は、一属として記載され、一属のすべての員は、単独で、本発明の一態様であり得る。また、一属として記載される、または一属の一員を選択する態様は、属の２つ以上の員の組み合わせを包含することを理解するべきである。

【0021】

本明細書において、種々の実施形態が、種々の状況下で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語を用いて示される一方、関連した実施形態はまた、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言語を用いても説明され得ることを理解するべきである。「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）という用語は、１つ以上のものを指し、例えば、「免疫グロブリン分子」が、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すように理解されることに留意されたい。したがって、１つの（「ａ」（または「ａｎ」））、「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書で同じ意味で用いられ得る。

【0022】

値の範囲を記載する際、記載される特性は、範囲内に見出される個々の値であり得ることも理解されるべきである。例えば、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５等に限定されないが、かかる値の間のあらゆる値であり得る。さらに、「約ｐＨ４〜約ｐＨ６のｐＨ」は、着目製剤のｐＨは、保存中、ｐＨ４〜ｐＨ６の範囲中、２ｐＨ単位変動することを意味すると解釈されるべきではなく、むしろ、溶液のｐＨに対するその範囲内で選ばれ得、ｐＨは、およそ、そのｐＨに緩衝されたままである。いくつかの実施形態において、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語を使用する際、その列挙された数字のプラスマイナス５％、１０％、１５％またはそれ以上を意味する。意図された実際の変動は、文脈から決定できる。出願者は、本明細書に記載の本発明の全範囲を考案したが、出願者は、他の先行技術に記載される主題を主張することを意図しない。したがって、特許請求の範囲内の法定の先行技術が、特許庁または他の団体もしくは個人によって、出願者に告知された場合には、出願者は、このような特許請求の範囲の主題を定義し直して、このような特許請求の範囲からこのような法定の先行技術または法定の先行技術の自明な変形を具体的に除外するために、準拠する特許法に基づいて補正を行う権利を留保するものとする。このような補正された特許請求の範囲によって定義される本発明の変形も、本発明の態様として意図される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】フェロポーチン膜貫通および細胞外ドメインの２つの概略図を示す。

【図1B】フェロポーチン膜貫通および細胞外ドメインの２つの概略図を示す。

【図2】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、フェロポーチンペプチド配列（ＡＮＩＶＰＥＴＳＰＥＳ、配列番号１６の残基４３９〜４４９）を認識することを示す。

【図3】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、対外鉄反応アッセイにおいて、フェロポーチン鉄輸出活性を持続することを示す。

【図4A】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、内部移行および分解からフェロポーチンを保護することを示す。

【図4B】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、内部移行および分解からフェロポーチ

【図5A】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、免疫組織化学によって、細胞上のフェロポーチン発現を検出することを示す。

【図5B】抗フェロポーチン抗体３１Ａ５が、免疫組織化学によって、細胞上のフェロポーチン発現を検出することを示す。

【図6】抗体３７Ａ２（配列番号３２〜３４）、３７Ｂ９（配列番号４２〜４４）、３７Ｃ８（配列番号５２〜５４）、３７Ｇ８（配列番号６２〜６４）、３８Ａ４（配列番号７２〜７４）、３８Ｃ８（配列番号８２〜８４）、３８Ｄ２（配列番号９２〜９４）、３８Ｅ３（配列番号１０２〜１０４）および３８Ｇ６（配列番号１１２〜１１４）に対する重鎖ＣＤＲを提供する。

【図7】抗体３７Ａ２（配列番号２９〜３１）、３７Ｂ９（配列番号３９〜４１）、３７Ｃ８（配列番号４９〜５１）、３７Ｇ８（配列番号５９〜６１）、３８Ａ４（配列番号６９〜７１）、３８Ｃ８（配列番号７９〜８１）、３８Ｄ２（配列番号８９〜９１）、３８Ｅ３（配列番号９９〜１０１）および３８Ｇ６（配列番号１０９〜１１１）に対する軽鎖ＣＤＲを提供する。

【図8A】抗体３８Ｇ６および３８Ｅ３の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。

【図8B】抗体３８Ｄ２および３８Ｃ８の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。

【図8C】抗体３８Ａ４および３７Ｇ８の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。

【図8D】抗体３７Ｃ８および３７Ｂ９の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。

【図8E】抗体３７Ａ２の重鎖および軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供する。

【図9】機能的および非機能的抗フェロポーチン抗体が、フェロポーチン上に類似のエピトープを認識することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

（詳細な説明）
フェロポーチン（配列番号１６）は、１０あるいは１２の膜貫通ドメインを有することが予測されるマルチ膜貫通タンパク質である。トポロジー図に基づいて、２０％未満の残基が、細胞外であることが予測され、最長細胞外ループは、わずか５７残基長さであることが予測される。図１は、フェロポーチン膜貫通および細胞外ドメインの２つの概略図を示す。図１Ａにおいて、細胞外ドメインは、配列番号１６のアミノ酸４６〜６０（ループ１）、１１６〜１２６（ループ２）、２０４〜２０５および３２５〜３４２（ループ３）、３９４〜４４９（ループ４）ならびに５１３〜５１７（ループ５）に対応する。図１Ｂにおいて、細胞外ドメインは、配列番号１６のアミノ酸３５〜５７（ループ１）、１１６〜１２４（ループ２）、３３２−３４０（ループ３）、３９３−４４９（ループ４）および５１５−５１８（ループ５）に対応する。

【0025】

本発明の実施形態は、フェロポーチン、または（図１Ａまたは１Ｂに示されるような）フェロポーチンのループ１、２、３および４、またはそのフラグメントに、高い親和性で結合する、モノクローナル抗体を提供する。本発明の他の実施形態は、正常な鉄ホメオスタシスを有する対象、あるいは、ヘプシジンレベルの上昇から起こる障害を含む、鉄ホメオスタシスの障害の危険性があるもしくは罹患している対象において、フェロポーチン活性を持続し、かつ血中鉄レベルを増加させることができる、モノクローナル抗体等の抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、フェロポーチン表面発現へのヘプシジンの効果を阻害する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される抗体は、フェロポーチンのヘプシジン媒介分解を含むフェロポーチンの内部移行および分解を防ぎ、それによって、鉄ホメオスタシスを維持する。

【0026】

Ｉ．抗フェロポーチン抗体および特異的結合剤
「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）を含む）に結合することができる抗体フラグメント、ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組換えペプチドを含む。化学的に誘導体化された抗体を含む、無傷分子および／またはフラグメントのマルチマーまたは会合体が、企図される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む、任意のアイソタイプクラスもしくはサブクラスの抗体、または任意のアロタイプの抗体が、企図される。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。

【0027】

いくつかの実施形態において、抗体は、Ｋ_Ｄ（平衡解離定数）によって測定して、ｌ×１０^−６Ｍ以下の範囲、または１０^−１６Ｍもしくはそれを下回る範囲までに及ぶ（例えば、約１０^−７、１０^−８、１０^−９、１０^−１０、１０^−１１、１０^−１２、１０^−１３、１０^−１４、１０−^１５、１０^−１６Ｍ以下）フェロポーチンに対する結合親和性等の所望の特性を示す。より高いまたはより良好な親和性は、より低いＫ_Ｄによって特徴付けられる。平衡解離定数の推定値は、抗体濃度の範囲にわたって、フェロポーチン発現細胞に結合する抗体を監視することによって決定され得る。親和性を結合する抗体を決定するために、ヒトフェロポーチンを誘導可能に発現するように改変されるＨＥＫ２９３細胞株を、９６ウェル黒壁の透明底ポリ−Ｄ−リシンコートされたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）の１ウェルあたり５０，０００細胞で播種し、クエン酸酸化鉄の存在下でフェロポーチンを発現するために、Ｔｅｔ誘導システムにおいて、１０μｇ／ｍＬの最終濃度のドキシサイクリンを用いて、誘発する。導入試薬を除去する際、次いで細胞の培地を冷ＤＭＥＭ １０％ ＦＢＳ１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中における漸増量の抗体で、交換し、４℃で３０分間温置する。この後、２００μＬ／ウェルの冷ＰＢＳで、細胞を４回軽く洗浄し、飽和濃度（５μｇ／ｍＬ）の抗マウスＨ＋Ｌ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８複合体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）で温置し、暗闇で、４℃で３０分間温置する。これが完了すると、次に２００μＬ／ウェルの冷ＰＢＳで細胞を４回洗浄し、１００μＬ／ウェルの冷ＰＢＳ中に放置し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）等の蛍光光度計上の相対的蛍光強度を直ちに読み出す。その後、蛍光強度データから、結合曲線が構築され、これらのＥＣ_５０は、次いで、おおよそのＫ_Ｄを示す。

【0028】

他の実施形態において、抗体は、フェロポーチンに対して特異性を示す。本明細書で使用する、抗体は、異なるファミリーにおける他の非関連たんぱく質と比較する際、ヒトフェロポーチンに対して有意により高い結合親和性を有し、したがって、識別可能である場合、「ヒトフェロポーチンに対して特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ）」または「ヒトフェロポーチンに特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」。いくつかの実施形態において、かかる抗体はまた、マウス、ラット、または霊長類のフェロポーチン等の他の種のフェロポーチンと交差反応し得る一方、他の実施形態において、該抗体は、ヒトまたは霊長類のフェロポーチンにのみ結合し、齧歯類のフェロポーチンに対しては有意には結合しない。

【0029】

さらに他の実施形態において、抗体は、フェロポーチン持続を促進することが可能である。本明細書で使用する、「フェロポーチン持続（Ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」または「フェロポーチン活性の持続（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、フェロポーチンによって調節される鉄排出を増加させるまたは維持する能力を指し、抗体の不在下での、鉄排出のレベルと比較して、フェロポーチン持続を促進する抗体の存在下で、鉄排出のレベルの相対的な増加として検出され得る。例えば、フェロポーチン持続を促進する抗体の存在下で、鉄排出は、増加し得、細胞内鉄レベルは、減少し得る、および／または血中鉄レベルは、増加し得る。いくつかの実施形態において、フェロポーチン持続は、正常細胞および正常な対象において生じ得る。他の実施形態において、フェロポーチン持続は、例えば、ヘプシジンのような、フェロポーチン持続がなければ、フェロポーチンによって調節される鉄排出を変化させ得るであろう分子の存在下で、生じ得る。いくつかの実施形態において、フェロポーチン持続は、１００％、または約９９％、または約９８％、または約９７％、または約９６％、または約９５％、または約９４％、または約９３％、または約９２％、または約９１％、または約９０％、または約８５％、または約８０％、または約約７５％もしくはそれ以下でフェロポーチンを分解するのに有効なヒトヘプシジンの量の存在下で、生じ得る。いくつかの実施形態において、フェロポーチン持続は、鉄ホメオスタシスの障害に罹患している細胞または対象において生じ得る。いくつかの実施形態において、抗体は、約１０^−６Ｍ以下、または約１０^−７Ｍ以下、または約１０^−８Ｍ以下、または約１０^−９Ｍ以下のＥＣ_５０で、細胞内鉄濃度を低下させる、および／または血中鉄濃度を増加させる。フェロポーチン活性を持続するおよび／または鉄排出を維持するための抗体の能力は、実施例３に記述しているもの等のアッセイによって検出することができる。種々の実施形態において、ヘプシジンの存在下で、抗体は、約１０^−６Ｍ以下、または約１０^−７Ｍ以下、または約１０^−８Ｍ以下、または約１０^−９Ｍ以下のＩＣ_５０で、細胞内鉄濃度を低下させる、および／または血中鉄濃度を増加させる。

【0030】

いくつかの実施形態において、体外で、および好ましくは生体内でも、ヘプシジン依存の内部移行および／または分解を含むフェロポーチンの内部移行および／または分解を阻害する（または中和させる）抗体を提供する。フェロポーチンの内部移行および／または分解を阻害するための抗体の能力は、実施例６に記述しているもの等のアッセイによって検出することができる。例示的な態様において、モノクローナル抗体は、高い鉄レベル（および／または炎症）に反応して生じるフェロポーチンの分解を阻害する（または中和させる）。いくつかの実施形態において、フェロポーチンへのヘプシジンの結合は、本明細書に開示されるフェロポーチンを持続する抗体によって阻害されない。

【0031】

フェロポーチン持続が可能な抗フェロポーチン抗体は、鉄ホメオスタシスの障害に治療的に有用であり、１つ以上のマーカー、例えば、フェリチン／鉄レベル、赤血球数、赤血球特性（ヘモグロビン含有量および／もしくは細胞体積）、早期赤血球特性（網状赤血球数、ヘモグロビン含有量もしくは細胞体積）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ；ｅｄｉｔｏｒ Ｍａｒｙ Ｌ．Ｔｕｒｇｅｏｎ，１９９９）、または鉄輸送を通して測定されるように、血清鉄レベルを増加させる、ならびに／または赤血球数もしくは特性を改善することが期待される。

【0032】

特定の例示的な実施形態において、本発明は、以下を企図する。
１）抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６の任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２もしくはＣＤＲＬ３を保有し、任意に、かかる単数または複数のＣＤＲにおける、１つまたは２つの変異体を含む、モノクローナル抗体、
２）抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６のすべてのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、または重鎖可変領域を保有し、任意に、かかる単数または複数のＣＤＲにおける、１つまたは２つの変異体を含む、モノクローナル抗体、
３）抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６のすべてのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、または軽鎖可変領域を保有し、任意に、かかる単数または複数のＣＤＲにおける、１つまたは２つの変異体を含む、モノクローナル抗体、
４）例えば、Ｘ線結晶学または重水素交換質量分析、アラニンスキャニングおよびペプチドフラグメントＥＬＩＳＡ等の他の生物物理学的もしくは生化学的技法を通して決定される、抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６と同一のフェロポーチンの線状もしくは立体的エピトープに結合するモノクローナル抗体、
５）フェロポーチン（配列番号１６）のアミノ酸残基３９３〜４４６からなるペプチドに結合し、いくつかの実施形態において、配列番号１６のアミノ酸残基７５〜９６、１５２〜１８３、３３０〜３３８または５４２〜５７１に結合しない、モノクローナル抗体、
６）フェロポーチン（配列番号１６）のアミノ酸残基４３９〜４４９からなるペプチドに結合するモノクローナル抗体、ならびに
７）約７５％以上、約８０％以上、または約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％以上でヒトフェロポーチンに結合するために、抗体３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６のうちのいずれか１つと競合するモノクローナル抗体。

【0033】

一実施形態において、抗体は、配列番号５〜１０（３１Ａ５ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２９〜３４（３７Ａ２ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３９〜４４（３７Ｂ９ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号４９〜５４（３７Ｃ８ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５９〜６４（３７Ｇ８ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号６９〜７４（３８Ａ４ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号７９〜８４（３８Ｃ８ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号８９〜９４（３８Ｄ２ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号９９〜１０４（３８Ｅ３ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１０９〜１１４（３８Ｇ６ ＣＤＲ）からなる群から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくはすべてのアミノ酸配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、抗体は、３本の軽鎖ＣＤＲすべて、３本の重鎖ＣＤＲすべて、または６本のＣＤＲすべてを含む。いくつかの例示的な実施形態において、１つの抗体からの２本の軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体からの第３の軽鎖ＣＤＲと組み合わされ得る。代替として、１つの抗体からのＣＤＲＬ１は、異なる抗体からのＣＤＲＬ２およびさらに別の抗体からのＣＤＲＬ３と組み合わされ得、特に、ここで、ＣＤＲは、高度の相同性を示す。同様に、１つの抗体からの２本の重鎖ＣＤＲは、異なる抗体からの第３の重鎖ＣＤＲと組み合わされ得る、または１つの抗体からのＣＤＲＨ１は、異なる抗体からのＣＤＲＨ２およびさらに別の抗体からのＣＤＲＨ３と組み合わされ得、特に、ここで、ＣＤＲは、高度の相同性を示す。図６は、抗体３７Ａ２（配列番号３２〜３４）、３７Ｂ９（配列番号４２〜４４）、３７Ｃ８（配列番号５２〜５４）、３７Ｇ８（配列番号６２〜６４）、３８Ａ４（配列番号７２〜７４）、３８Ｃ８（配列番号８２〜８４）、３８Ｄ２（配列番号９２〜９４）、３８Ｅ３（配列番号１０２〜１０４）および３８Ｇ６（配列番号１１２〜１１４）に対する重鎖ＣＤＲを提供する。図７は、抗体３７Ａ２（配列番号２９〜３１）、３７Ｂ９（配列番号３９〜４１）、３７Ｃ８（配列番号４９〜５１）、３７Ｇ８（配列番号５９〜６１）、３８Ａ４（配列番号６９〜７１）、３８Ｃ８（配列番号７９〜８１）、３８Ｄ２（配列番号８９〜９１）、３８Ｅ３（配列番号９９〜１０１）および３８Ｇ６（配列番号１０９〜１１１）に対する軽鎖ＣＤＲを提供する。

【0035】

コンセンサスＣＤＲも使用してもよい。一実施形態において、抗体は、配列番号４２（ＧＹＹＭＨ、抗体３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８および３８Ｅ３からの重鎖ＣＤＲ１）、配列番号１１５（ＧＹＸＭＨ、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８、および３８Ｅ３からの重鎖ＣＤＲ１コンセンサス）、配列番号１１６（ＧＹＹＸＨ、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８、３８Ｄ２および３８Ｅ３からの重鎖ＣＤＲ１コンセンサス）、配列番号１１７（ＷＩＮＰＨＴＧＧＫＮＹＸＱＸＦＱＧ、抗体３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８および３８Ｅ３からの重鎖ＣＤＲ２コンセンサス）、配列番号１１８（ＤＰＳＸＸＶＸＧＰＳＦＹＹＸＧＬＤＶ、抗体３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８および３８Ｅ３からの重鎖ＣＤＲ３コンセンサス）、配列番号１１９（ＫＩＳＮＲＸＳ、抗体３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８および３８Ｅ３からの軽鎖ＣＤＲ２コンセンサス）からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘは、いずれかのアミノ酸である。

【0036】

種々の実施形態において、抗体は、ＷＩＮＰＨＴＧＧＫＮＹＸ_１ＱＸ_２ＦＱＧ（配列番号１３６）を含み、式中、Ｘ_１およびＸ_２は、いずれかのアミノ酸である、またはＸ_１およびＸ_２は、Ａ、Ｇ、Ｋ、もしくはＲ、これらのいずれかの組み合わせ、またはこれらの同類置換である、またはＸ_１は、ＡもしくはＧ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_２は、いずれかのアミノ酸である、またはＸ_１は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_２は、ＫもしくはＲ、またはこれらの同類置換である、またはＸ_１は、ＡもしくはＧ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_２は、ＫもしくはＲまたはこれらの同類置換である。

【0037】

種々の他の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＷＩＮＰＨＴＧＧＫＮＹＸ_１ＱＸ_２ＦＱＧ（配列番号１３６）（式中、Ｘ_１およびＸ_２は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、これらのいずれかの組み合わせ、またはこれらの同類置換である）、およびアミノ酸配列ＤＰＳＸ_１Ｘ_２ＶＸ_３ＧＰＳＦＹＹＸ_４ＧＬＤＶ（配列番号１３７）（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、これらのいずれかの組み合わせ、またはこれらの同類置換である）を含む。

【0038】

種々の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＤＰＳＸ_１Ｘ_２ＶＸ_３ＧＰＳＦＹＹＸ_４ＧＬＤＶ（配列番号１３７）を含み、式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３およびＸ_４は、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、これらのいずれかの組み合わせ、もしくはこれらの同類置換である；またはＸ_１は、ＩもしくはＬまたはこれらの同類置換であり、かつＸ_２、Ｘ_３およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_２は、Ａ、Ｖ、もしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_１、Ｘ_３およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_１、Ｘ_２およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_１は、ＩもしくはＬ、またはこれらの同類置換であり、Ｘ_２は、Ａ、ＶもしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_３およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_１は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_２は、Ａ、ＶもしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、Ｘ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、いずれかのアミノ酸である；またはＸ_１およびＸ_２は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１、Ｘ_２およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である、またはＸ_１は、ＩもしくはＬ、またはこれらの同類置換であり、Ｘ_２は、Ａ、Ｖ、もしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、Ｘ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；Ｘ_２およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_１は、ＩもしくはＬ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１およびＸ_２は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_２は、Ａ、ＶもしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_２は、Ａ、ＶもしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１、Ｘ_２、およびＸ_３は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_４は、ＹもしくはＦ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１、Ｘ_２、およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１、Ｘ_３、およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_２は、Ａ、ＶもしくはＳ、またはこれらの同類置換であり、あるいはＸ_２、Ｘ_３、およびＸ_４は、いずれかのアミノ酸であり、かつＸ_１は、ＩもしくはＬ、またはこれらの同類置換である；またはＸ_１は、ＩもしくはＬ、またはこれらの同類置換であり、Ｘ_２は、いずれかのアミノ酸であり、Ｘ_３は、ＡもしくはＴ、またはこれらの同類置換であり、かつＸ_４は、いずれかのアミノ酸である。

【0039】

本明細書に開示されるコンセンサスＣＤＲのうちのいずれも、いずれの抗体の同一の鎖（例えば、重鎖または軽鎖）からの２つの他のＣＤＲとも組み合わされ、例えば、好適な重鎖または軽鎖可変領域を形成することができる。

【0040】

さらに別の実施形態において、抗体は、抗体３１Ａ５の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号４（３１Ａ５重鎖可変領域）、および／または配列番号２（３１Ａ５軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３７Ａ２の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号２８（３７Ａ２重鎖可変領域）および／または配列番号２６（３７Ａ２軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３７Ｂ９の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号３８（３７Ｂ９重鎖可変領域）および／または配列番号３６（３７Ｂ９軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３７Ｃ８の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号４８（３７Ｃ８重鎖可変領域）および／または配列番号４６（３７Ｃ８軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３７Ｇ８の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号５８（３７Ｇ８重鎖可変領域）および／または配列番号５６（３７Ｇ８軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３８Ａ４の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号６８（３８Ａ４重鎖可変領域）および／または配列番号６６（３８Ａ４軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３８Ｃ８の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号７８（３８Ｃ８重鎖可変領域）および／または配列番号７６（３８Ｃ８軽鎖可変領域）を含む。さらに別の実施形態において、抗体は、抗体３８Ｄ２の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号８８（３８Ｄ２重鎖可変領域）および／または配列番号８６（３８Ｄ２軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３８Ｅ３の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号９８（３８Ｅ３重鎖可変領域）および／または配列番号９６（３８Ｅ３軽鎖可変領域）を含む。別の実施形態において、抗体は、抗体３８Ｇ６の重鎖および／または軽鎖可変領域、例えば、配列番号１０８（３８Ｇ６重鎖可変領域）および／または配列番号１０６（３８Ｇ６軽鎖可変領域）を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、配列番号４（３１Ａ５重鎖可変領域）、２（３１Ａ５軽鎖可変領域、２８（３７Ａ２重鎖可変領域）、２６（３７Ａ２軽鎖可変領域）、３８（３７Ｂ９重鎖可変領域）、３６（３７Ｂ９軽鎖可変領域）、４８（３７Ｃ８重鎖可変領域）、４６（３７Ｃ８軽鎖可変領域）、５８（３７Ｇ８重鎖可変領域）、５６（３７Ｇ８軽鎖可変領域）、６８（３８Ａ４重鎖可変領域）、６６（３８Ａ４軽鎖可変領域）、７８（３８Ｃ８重鎖可変領域）、７６（３８Ｃ８軽鎖可変領域）、８８（３８Ｄ２重鎖可変領域）、８６（３８Ｄ２軽鎖可変領域）、９８（３８Ｅ３重鎖可変領域）、９６（３８Ｅ３軽鎖可変領域）、１０８（３８Ｇ６重鎖可変領域）および１０６（３８Ｇ６軽鎖可変領域）からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を提供し、該ポリペプチドは、配列番号５〜１０（３１Ａ５ＣＤＲ）、２９〜３４（３７Ａ２）、３９〜４４（３７Ｂ９）、４９〜５４（３７Ｃ８）、５９〜６４（３７Ｇ８）、６９〜７４（３８Ａ４）、７９〜８４（３８Ｃ８）、８９〜９４（３８Ｄ２）、９９〜１０４（３８Ｅ３）、および１０９〜１１４（３８Ｇ６）に記述されている少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域に対して百分率同一性を有するポリペプチドは、１つ、２つまたは３つの軽鎖ＣＤＲを含み得る。他の実施形態において、重鎖可変領域に対して百分率同一性を有するポリペプチドは、１つ、２つまたは３つの重鎖ＣＤＲを含み得る。前述の実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドは、配列番号５〜１０（３１Ａ５ ＣＤＲ）、２９〜３４（３７Ａ２）、３９〜４４（３７Ｂ９）、４９〜５４（３７Ｃ８）、５９〜６４（３７Ｇ８）、６９〜７４（３８Ａ４）、７９〜８４（３８Ｃ８）、８９〜９４（３８Ｄ２）、９９〜１０４（３８Ｅ３）、および１０９〜１１４（３８Ｇ６）に記述しているアミノ酸配列のいずれかに１つまたは２つの改変を含む配列を含むことができる。

【0042】

また、３４Ｇ３、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｄ６、３８Ｅ３および３８Ｇ６からなる群から選択される抗体の重鎖および軽鎖可変領域に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体も企図され、該ポリペプチドは、３１Ａ５ ＣＤＲ、３７Ａ２ ＣＤＲ、３７Ｂ９ ＣＤＲ、３７Ｃ８ ＣＤＲ、３７Ｇ８ ＣＤＲ、３８Ａ４ ＣＤＲ、３８Ｃ８ ＣＤＲ、３８Ｄ２ ＣＤＲ、３８Ｅ３ ＣＤＲおよび３８Ｇ６ ＣＤＲからなる群から選択される少なくとも１つ以上のＣＤＲをさらに含む。前述の実施形態のいずれにおいても、ポリペプチドは、３１Ａ５ ＣＤＲ、３７Ａ２ ＣＤＲ、３７Ｂ９ ＣＤＲ、３７Ｃ８ ＣＤＲ、３７Ｇ８ ＣＤＲ、３８Ａ４ ＣＤＲ、３８Ｃ８ ＣＤＲ、３８Ｄ２ ＣＤＲ、３８Ｅ３ ＣＤＲおよび３８Ｇ６ ＣＤＲからなる群から選択されるＣＤＲに対して１つまたは２つの修飾を含む配列を含む。

【0043】

抗体３１Ａ５の全長軽鎖および重鎖に対するｃＤＮＡおよびアミノ酸配列も提供する。定常領域を含む、抗体３１Ａ５の全長軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１１に記述されている。定常領域を含む、抗体３１Ａ５の全長軽鎖をコードするアミノ酸配列は、配列番号１２（このうちの残基１〜２０は、シグナルペプチドに対応し、残りは、成熟ポリペプチドである）に記述されている。定常領域を含む、抗体３１Ａ５の全長重鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、配列番号１３に記述されている。定常領域を含む、抗体３１Ａ５の全長重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４（このうちの残基１〜１７は、シグナルペプチドに対応し、残りは、成熟ポリペプチドである）に記述されている。

【0044】

別の実施形態において、抗体は、抗体３４Ｇ３、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６のいずれかの重鎖可変領域を含み、任意に、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１２０〜１２１）およびヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（配列番号１２２〜１２３）からなる群から選択される定常領域を含む。別の例示的な実施形態において、抗体は、抗体３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２および３８Ｅ３のいずれかの軽鎖可変領域を含み、任意に、ヒトカッパ軽鎖定常領域（配列番号１２４〜１２５）を含む。別の例示的な実施形態において、抗体は、抗体３７Ａ２および３８Ｇ６のいずれかの軽鎖可変領域を含み、任意に、ヒトラムダ軽鎖可変領域Ｃ１型（配列番号１２６〜１２７）、ヒトラムダ軽鎖可変領域Ｃ２型（配列番号１２８〜１２９）、ヒトラムダ軽鎖定常領域Ｃ３型（配列番号１３０〜１３１）、ヒトラムダ軽鎖定常領域Ｃ６型（配列番号１３２〜１３３）およびヒトラムダ軽鎖定常領域Ｃ７型（配列番号１３４〜１３５）からなる群から選択される定常領域を含む。

【0045】

本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、その用語が本明細書に定義される、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、即ち、集団を成す個々の抗体が、ハイブリドーマから産生されるか組換えＤＮＡ技法から産生されるかにかかわらず、少量で存在し得る、自然発生する可能な突然変異体または代替的な翻訳後の改変を除いては同一である。モノクローナル抗体の限定されない例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ化、ヒト化、もしくはヒト抗体、完全に組み立てられた抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、抗原（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）_２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディを含む）、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）に結合することができる抗体フラグメント、ならびにそれらが所望の生物活性を示す限り、前述のものを含む組換えペプチド、またはその変形体もしくは誘導体が含まれる。さらにヒトのようであるヒト化または改変抗体配列は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５ ９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４ １５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９ ４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３ ８３（１９９１）、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４（１９９４）に記載され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒトモノクローナル抗体を単離するための一方法は、ファージディスプレイの使用である。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９２／０１０４７、およびＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒトモノクローナル抗体を単離するための別の方法は、内因性免疫グロブリン産生を持たず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように改変されたトランスジェニック動物を使用することである。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、または米国特許出願公開第２００３０１９４４０４号、第２００３００３１６６７号、または第２００２０１９９２１３号を参照されたく、それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0046】

「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定されている、および分離されている、抗体（この用語は本名最初で定義されるとおりである）を指す。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断または治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様溶質が含まれ得る。ある実施形態において、抗体は、（１）抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％以上まで、（２）Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元あるいは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性が得られるまで、精製され得る。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された自然発生抗体には、組換え細胞内の原位置抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

【0047】

「免疫グロブリン」または「自然抗体」は、四量体糖タンパク質である。自然発生免疫グロブリンにおいて、各四量体は、同一の２組のポリペプチド鎖からなり、各組は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、定常領域を定義し、重鎖の定常領域は、エフェクター機能に主に関与する。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して異なるクラスに割り当てられ得る。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびエプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。これらのうちのいくつかは、サブクラスまたはアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるアイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１０またはそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む重鎖とともに、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合される。概論については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。

【0048】

アロタイプは、抗体配列における、しばしば、定常領域における、免疫原性であり得、ヒトにおける特異的対立遺伝子によりコードされる変異である。アロタイプは、ヒトＩＧＨＣ遺伝子の５つである、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２およびＩＧＨＥ遺伝子について同定されており、それぞれ、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ、およびＥｍアロタイプと命名される。少なくとも１８のＧｍアロタイプ：ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１、２、３、１７）またはＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）またはＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）またはＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）が知られている。２つのＡ２ｍアロタイプＡ２ｍ（１）およびＡ２ｍ（２）がある。

【0049】

抗体の構造および生成の詳細に関しては、Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄ Ｃｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを生成するためのプロセスは、主に、成長するＢ細胞内で起こる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントを再編成および接合する前に、Ｖ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、概して、単一の染色体上で相対的に近接近において見出される。Ｂ細胞の分化中、Ｖ、Ｄ、Ｊ（または、軽鎖遺伝子の場合、ＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントのそれぞれの適切なファミリーメンバーのうちの１つは、重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子の機能的に再編成された可変領域を形成するように再結合される。この遺伝子セグメント再編成プロセスは、順次的であると考えられる。第１に、重鎖Ｄ〜Ｊ接合が作られ、次いで、重鎖ＶからＤＪへの接合と軽鎖ＶからＪへの接合が成される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再編成に加えて、軽鎖内のＶおよびＪセグメントが接合され、かつ重鎖のＤおよびＪセグメントが接合される位置で、可変組換え（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）のために、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて生成される。軽鎖内のかかる変化は、一般的に、Ｖ遺伝子セグメントの最終コドンおよびＪセグメントの第１のコドン内で起こる。接合における同様の不正確性は、ＤセグメントとＪＨセグメントとの間の重鎖染色体で起こり、１０ヌクレオチドほどの大きさにわたって伸張し得る。さらに、ゲノムＤＮＡによってコードされない、いくつかのヌクレオチドは、ＤとＪＨとの間およびＶＨとＤ遺伝子セグメントの間に挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られる。かかる接合中、起こり得る、可変領域遺伝子セグメントおよび可変組換えにおけるこのような再編成の最終的な結果は、一次抗体のレパートリーの産生である。

【0050】

「超可変」領域という用語は、相補性決定領域またはＣＤＲ（即ち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されるように、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３））からのアミノ酸残基を指す。単一のＣＤＲでさえ、すべてのＣＤＲを含有する全抗原結合部位よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、結合し得る。

【0051】

超可変「ループ」からの残基の代替的な定義は、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）として、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載される。

【0052】

「フレームワーク」またはＦＲ残基は、超可変領域残基以外のこれらの可変領域残基である。

【0053】

「抗体フラグメント」は、無傷免疫グロブリンの一部分、好ましくは、無傷抗体の抗原結合または可変領域を含み、抗体フラグメントから形成される多重特異性（二重特異性、三重特異性等）抗体を含む。免疫グロブリンのフラグメントは、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素もしくは化学分解によって、産生され得る。

【0054】

抗体フラグメントの限定されない例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ（可変領域）、ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインを含有する）（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ、単一ポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメインを含有する）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３，１９８８、任意に、ポリペプチドリンカーを含む、および任意に、多特異性、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））、単鎖抗体フラグメント、ダイアボディ（別の鎖の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと組み合わせる単一ポリペプチド鎖上のＶＨおよびＶＬドメイン）（ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介してもしくはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合されるｓｃＦｖ）（Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３）、線状抗体（タンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ −ＣＨ１）（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、キレート組換え抗体（ｃｒＡｂ、同一の抗原上の２つの隣接エピトープに結合し得る）（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）、バイボディ（ｂｉｂｏｄｉｅｓ）（二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）またはトリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉｅｓ）（三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２））（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００、Ｗｉｌｌｅｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）、細胞内抗体（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ９：１０１−１０８， １９９０、Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０１：１７６１６−２１，２００４）（細胞内に抗体を保持するまたは誘導する細胞シグナル配列も含み得る（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５４２−５１，１９９５；Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５，２００３））、トランスボディ（ｔｒａｎｓｂｏｄｉｅｓ）（ｓｃＦｖに融合するタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含有する細胞透過性抗体）（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）、ナノボディ（約１５ｋＤａの重鎖可変ドメイン）（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６４：２８５３−５７，２００４）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）（ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開第２００３０１３３９３９号および米国特許公開第２００３０１１８５９２号）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体（ここで、ＶＨは、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する定常領域と再結合する）（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：２６２８５−９０，２００１、Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２、米国特許公開第２００５０１３６０４９号および第２００５００３７４２１号）、ＶＨＨ含有抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂｓ、構造Ｈ２Ｌ２を有する２つの重鎖のホモ二量体）、またはこれらの変異体もしくは誘導体、ならびに抗体が、所望の生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列等のポリペプチドに結合する特異性抗原を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。

【0055】

抗体に関連して使用される、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、変異体が、所望の結合親和性または生物学的活性を保持するという条件で、可変領域および可変領域に相当する部分内の少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を指す。加えて、本明細書に記載の抗体は、半減期もしくはクリアランス、ＡＤＣＣおよび／もしくはＣＤＣ活性を含む、抗体のエフェクター機能を修飾するために、定常領域内にアミノ酸修飾を有し得る。かかる修飾は、例えば、癌を治療する際に、薬物動態を強化するか、または抗体の有効性を強化することができる。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＩｇＧ１の場合、定常領域、特に、ヒンジまたはＣＨ２領域に対する修飾により、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含む、エフェクター機能を増加または低下させ得る。他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域を修飾して、抗体−抗原凝集体形成を減少させる。ＩｇＧ４の場合、定常領域、特に、ヒンジ領域に対する修飾により、半抗体の形成を減少させ得る。

【0056】

本明細書に記載の抗体またはポリペプチドに関連して使用される、「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、１つ以上のアミノ酸変化（置換、挿入または欠失を含む）、フェロポーチン結合活性を妨害しない化学修飾、治療用または診療用剤に活用することによる共有結合修飾、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素での）、ペグ化等の共有ポリマー結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の修飾ポリペプチド（抗体を含む）は、本発明の非修飾分子の結合特性を保持するであろう。

【0057】

本発明抗体またはポリペプチドに関連して使用される、「誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）」という用語は、治療用または診療用剤に活用することによる共有結合修飾、標識化（例えば、放射性核種または種々の酵素での）、ペグ化等の共有ポリマー結合（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換により共有結合的に修飾される抗体またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、本発明の誘導体は、本発明の非修飾分子の結合特性を保持するであろう。

【0058】

二重特異性または他の多重特異性抗体を作製するための方法は、当該技術分野において既知であり、これらには、化学的架橋、ロイシンジッパーの使用（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）、ダイアボディ技術（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８，１９９３）、ｓｃＦｖ二量体（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４）、線状抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２，１９９５）、およびキレート組換え抗体（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）が含まれる。

【0059】

したがって、抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１つ、２つ、および／または３つのＣＤＲを含む、種々の組成物は、当該技術分野において既知の技法によって生成され得る。

【0060】

Ａ．抗体の組換え産生
本明細書に記載のモノクローナル抗体をコードし、任意に、核酸を含む、宿主細胞、ベクターおよび宿主細胞によって認識される配列を制御するように作用可能に連結される、単離された核酸、ならびに抗体の産生のための組換え技法も提供し、これには、核酸を発現するように宿主細胞を培養することと、任意に、宿主細胞培養または培地から抗体を回収することを含み得る。

【0061】

対象の免疫グロブリンからの適切なアミノ酸配列は、直接タンパク質配列によって決定され得、好適なコード化ヌクレオチド配列は、汎用コドン表に従って設計することができる。代替として、モノクローナル抗体をコードするゲノムまたはｃＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、かかる抗体を産生する細胞から単離され、配列決定され得る。

【0062】

クローニングは、標準技法を用いて実行される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたく、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、ｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは、膜結合ｍＲＮＡ、およびヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングされたライブラリーの逆転写によって構成され得る。しかしながら、一実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、対象の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖または重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの一部）を増幅する。増幅された配列は、任意の好適なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター、またはファージディスプレイベクターに容易にクローン化することができる。対象の免疫グロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能である限り、使用される特定の方法が重要でないことが理解されよう。

【0063】

抗体核酸のための１つの供給源は、対象の抗原の免疫を持つ動物からＢ細胞を得て、このＢ細胞を不死化細胞に融合することにより生成されるハイブリドーマである。代替として、核酸は、免疫動物のＢ細胞（または全膵臓）から単離することができる。抗体をコードする核酸のさらに別の供給源は、例えば、ファージディスプレイを通して、生成されるかかる核酸のライブラリーである。対象のペプチド、例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、パニング等の標準技法により同定することができる。

【0064】

免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列が、決定され得るが、時には、可変領域の一部のみ、例えば、ＣＤＲコード部分を配列決定することで十分である。配列決定は、標準技法を用いて実行される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７を参照されたく、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列とクローン化した核酸の配列を比較することによって、当業者は、配列決定された領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖系セグメント使用法および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む、重鎖および軽鎖の可変領域の配列を容易に決定することができるであろう。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄである。

【0065】

本明細書で使用する、「単離された」核酸分子または「単離された」核酸配列は、（１）核酸の自然源に通常関連する少なくとも１つの汚染された核酸分子から同定および分離されるか、あるいは（２）対象の核酸の配列を決定することができるように、クローン化、増幅、標識化、または他の方法で、バックグラウンド核酸と区別されるかのいずれかである、核酸分子である。単離された核酸分子は、自然に見出される形態または設定以外のものである。しかしながら、単離された核酸分子には、例えば、核酸分子が、自然細胞のものとは異なる染色体位置にある、抗体を通常発現する細胞内に含有する核酸分子が含まれる。

【0066】

単離されると、ＤＮＡは、発現制御配列に作用可能に連結され得るか、または発現ベクターに設置され得、その後、それは、そうでなければ、免疫グロブリンタンパク質を産生しないであろう宿主細胞内に形質転換され、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を誘導する。抗体の組換え産生は、当該技術分野において公知である。

【0067】

発現制御配列とは、特定の宿主生物における作用可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適である制御配列は、例えば、プロモータ、任意に、オペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。

【0068】

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、作用可能に連結される。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡが、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、そのポリペプチドについてのＤＮＡに作用可能に連結されており、プロモータまたはエンハンサーがコード配列の転写に影響を及ぼす場合には、その配列に作用可能に連結されており、またはリボソーム結合部位が、それが翻訳を助長するように配置されている場合には、コード配列に作用可能に連結されている。一般に、作用可能に連結されるとは、結合されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合には隣接していると共に読み込み相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要がない。連結は、従来の制限酵素認識部位でのライゲーションによって達成される。そうした部位が存在しない場合には、従来の施行に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。

【0069】

多くのベクターが、当該技術分野において知られている。ベクター成分は、以下のうちの１つ以上を含み得る。シグナル配列（例えば、抗体の分泌を誘導し得る）、複製起点、１つ以上の選択的マーカー遺伝子（例えば、抗生物質または他の薬物耐性を付与する、補体栄養要求性欠損、または培地からは利用できない重要な栄養素を供給する）、エンヘンサー要素、プロモータ、および転写終結配列。これらのすべては、当該技術分野において公知である。

【0070】

細胞、細胞株、および細胞培養物は、しばしば、交換可能に使用され、本明細書のすべてのかかる意味は、後代を含む。形質転換体および形質転換細胞には、転写の数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物が含まれる。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一であるというわけではないことも理解されよう。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。

【0071】

例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母菌、または高等真核細胞（即ち、多細胞生物）が含まれる。原核生物の宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物等の真正細菌、例えば、エシェリキア属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルビニア菌属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ菌（ネズミチフス菌）、セラチア族（例えば、セラチア・マルセッセンス）、およびシゲラ族、ならびにバチルススプティーリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルスリケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス、シュードモナス菌、ならびにストレプトミセスのような腸内細菌科が挙げられる。糸状菌または酵母菌等の真核生物は、組換えポリペプチドまたは抗体の好適なクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレヴィシエ、すなわち一般のパン酵母が、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピチア属（例えば、ピチアパストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、シゾサッカロミセス・ポンベ；クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属；カンジダ属；トリコデルマリ−ゼイトリコデルマ・リ−ゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）；ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）等のシュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；および、糸状真菌（例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポタラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ））、ならびにアスペルギルス宿主（アスペルギルス・ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））のような、多くの他の属、種、および型が、一般的に入手可能であり、本明細書に有用である。

【0072】

グリコシル化ポリペプチドまたは抗体の発現のための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。スポドプレラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫）、ネッタイシマカＡｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のような宿主からの多数のバクテリアウイルス株および変異体および対応する許容昆虫宿主細胞を特定されている。例えば、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５変異体のかかる細胞のトランスフェクションに関する種々のウイルス株が、公的に入手可能である。

【0073】

脊椎動物宿主細胞もまた、好適な宿主であり、かかる細胞からのポリペプチドまたは抗体の組換え産生は、常法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓系（２９３または懸濁培養での増殖用にサブクローンした２９３細胞、［Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞もしくはＦＳ４細胞；または哺乳動物骨髄腫細胞である。

【0074】

宿主細胞を、抗体産生のために上記の核酸もしくはベクターを形質転換または形質移入し、プロモータを導入するか、形質転換細胞を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の培養液で培養する。加えて、選択マーカーによって分離された転写単位の複数の転写を有する新規ベクターおよび形質移入された細胞株は、抗体の発現に特に有用である。

【0075】

本明細書に記載の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の商業的に入手可能な培地が、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、もしくは第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０１０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞の培地として使用され得る。これら培地のいずれをも、ホルモン類および／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子等）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド類（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（ゲンタマイシン（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）（商標）薬物等）、微量元素（ミクロモル範囲の最終濃度で通常存在する有機化合物として定義された）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源で必要に応じて補ってもよい。他の必要ないずれの補助物もまた、当業者が知っているであろう適当な濃度で含ませ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択される宿主細胞に関して以前に用いたものであり、当業者には明らかであろう。

【0076】

宿主細胞を培養すると、抗体が、ペリプラズムスペースにおいて、細胞内に産生されるか、培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、第１のステップとして、粒状破砕物、即ち、宿主細胞あるいは溶解フラグメントのいずれかを、例えば、遠心分離または超音波処理により除去する。

【0077】

親和性リガンドとして対象の抗原もしくはタンパク質Ａもしくはタンパク質を用いて、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、カチオンもしくはアニオン交換クロマトグラフィ、または好ましくは親和性クロマトグラフィを用いて、抗体を精製することができる。タンパク質Ａを用いて、ヒトγ１、γ２、もしくはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプ用およびヒトγ３用に推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが付着するマトリクスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリクスも利用可能である。調整穴あきガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのように機械的に安定なマトリクスは、アガロースを用いて達成し得るよりも速い流速と短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィ、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿のような他の技法も、回収しようとする抗体によっては利用できる。

【0078】

Ｂ．キメラ化およびヒト化抗体
キメラ化またはヒト化抗体は、親齧歯類モノクローナル抗体よりもヒトにおいて免疫原性が少ないため、それらは、過敏症の危険性がはるかに少ないヒトの治療のために使用することができる。したがって、これらの抗体は、ヒトへの生体内投与に関与する治療への適用に企図される。

【0079】

例えば、単独あるいは複合体として、ヒトにおいて生体内投与を反復されるマウス抗体は、受容者において免疫応答、いわゆる、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）応答を生じる。ＨＡＭＡ応答は、反復投与が必要とされる場合、医薬品の有効性を制限し得る。抗体の免疫原性は、ポリエチレングリコール等の親水性ポリマーを用いた抗体の化学修飾によって、または抗体結合構造をよりヒト様にするための遺伝子工学の方法を用いることによって、低下させ得る。

【0080】

本明細書で使用する「キメラ化抗体」という句は、一般的には、異なる種が起源である、２つの異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を指す。最も一般的には、キメラ化抗体は、ヒト定常Ｉｇドメインに融合される齧歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインを含む。かかる抗体は、当該技術分野において既知の標準手順を用いて生成することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１，６８４１−６８５５、およびＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６４３−６４６（１９８４）を参照のこと）。一部のキメラ化モノクローナル抗体は、ヒトにおいてより低い免疫原性を示すことが立証されているが、歯類可変Ｉｇドメインは、依然として、大幅なヒト抗−齧歯類反応を導き得る。

【0081】

「ヒト化抗体」という句は、非ヒト抗体、一般的には、齧歯類モノクローナル抗体に由来する抗体を指す。代替として、ヒト化抗体は、キメラ化抗体に由来し得る。

【0082】

ヒト化抗体は、例えば、（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク及び定常領域に移植すること（当該技術分野で「ヒト化する」と称される工程）、または代替的に、（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様表面で「偽装」すること（当該技術分野で「ベニアリング」と称される工程）を含む、種々の方法によって達成され得る。これらの方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２ ５２５（１９８６）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１ ６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９ ２１７（１９９４）、およびＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．４（７）：７７３−８３（１９９１）に開示され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0083】

ＣＤＲ移植は、ヒト可変Ｉｇドメインの適切なフレームワーク領域にマウス重鎖および軽鎖可変Ｉｇドメインから６つのＣＤＲのうちの１つ以上を導入するステップを含む。この技法（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３（１９８８））は、抗原との一次的接触であるＣＤＲループを支えるための足場として、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を利用する。ＣＤＲ移植の重大な難点は、しかしながら、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与し得ること、およびＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの結合に影響を及ぼし得るということが理由で、元のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体を生じ得ることである。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、ＣＤＲ移植技法は、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も密接に類似するヒトフレームワーク領域を選択することによって、および抗原結合部位のコンピュータモデリングの支援による、フレームワークまたはＣＤＲ内の単一アミノ酸部位指定突然変異誘発によって、改善できる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）。

【0084】

抗体をヒト化する１つの方法は、ヒト重鎖および軽鎖配列に対して非ヒト重鎖および軽鎖配列を整列させ、このようなアラインメントに基づいて非ヒトフレームワークを選択し、ヒトフレームワークで置き換え、ヒト化配列の立体配座を予測するために分子モデリングし、親抗体の立体配座と比較することを含む。この工程に続いて、ヒト化配列の予測された立体配座が、親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体配座に密接に近づくまで、ＣＤＲの構造を乱すＣＤＲ領域内の残基の復帰変異を反復する。かかるヒト化抗体は、アシュウェル受容体（Ａｓｈｗｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介して取り込みおよびクリアランスを助長するようにさらに誘導体化され得る（例えば、米国特許第 ５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号を参照のこと）。

【0085】

合理的設計によるマウスモノクローナル抗体の多くのヒト化が、報告されている（例えば、２００２年７月１１日に公開された第２００２００９１２４０号、ＷＯ９２／１１０１８および米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７６６，８６６号を参照のこと）。

【0086】

Ｃ．ヒト改変（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））抗体
「ヒト改変（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））抗体」という句は、非ヒト抗体、一般的に、齧歯類モノクローナル抗体またはあるいは、キメラ化抗体に由来する抗体を指す。抗体可変ドメインのヒト改変（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））は、抗体分子の結合活性を維持しながら、免疫原性を低下させる方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａによって記載されている（例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５−８１４，１９９４を参照のこと）。該方法によると、各可変領域アミノ酸は、置換の危険度が割り当てられる。アミノ酸置換は、３つの危険度カテゴリーの１つによって識別される：（１）低危険度変化は、免疫原性を低下させる最大の潜在的可能性を有し、抗原結合を妨げる可能性が最も低いものである、（２）中危険度変化は、免疫原性をさらに低下させるが、抗原結合またはタンパク質の折り畳みに影響を及ぼす可能性がより大きいものである、（３）高危険度残基は、抗体構造に結合するまたは抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合またはタンパク質の折り畳みが影響を受ける危険度が最も高いものである。プロリンの三次元構造上の役割のゆえに、プロリンにおける修飾は、その位置が一般的には低危険度位置である場合でも、一般に少なくとも中危険度変化とみなされる。

【0087】

齧歯類抗体の軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合またはタンパク質の折り畳みに有害な作用を及ぼす可能性が低いが、ヒト環境において免疫原性を低下させる可能性が高いと決定された位置で、ヒトアミノ酸を置換するために以下のようにヒト改変（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））され得る。個別のＶＨもしくはＶＬ配列、またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列、または個別の、もしくはコンセンサスヒト生殖細胞系配列を含む、いかなるヒト可変領域も使用できるが、一般に、齧歯類配列に対して最も高い同一性もしくは相同を有するヒト配列を使用して、多数の置換を最小化する。どのような数の低危険度位置、またはすべての低危険度位置のアミノ酸残基も変化させることができる。例えば、整列したネズミとヒトアミノ酸残基が異なる各々の低危険度位置で、齧歯類残基をヒト残基で置換するアミノ酸修飾を導入する。加えて、どのような数の、またはすべての中危険度位置のアミノ酸残基も変化させることができる。例示的な実施形態において、すべての低および中危険度位置は、齧歯類配列からヒト配列に変化する。

【0088】

修飾重鎖および／または軽鎖可変領域を含む合成遺伝子を構築し、ヒトγ重鎖および／またはκ軽鎖定常領域に連結する。任意のクラスまたはサブクラスの任意のヒト重鎖および軽鎖は、ヒト改変（Ｈｕｍａｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標））抗体可変領域と組み合わせて使用し得る。

【0089】

Ｄ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように改変されたトランスジェニック動物からの抗体
フェロポーチンに対する抗体はまた、内因性免疫グロブリンを産生せず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように改変されたトランスジェニック動物を用いて、産生することもできる。例えば、ＷＯ９８／２４８９３は、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示しており、該動物は、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座の不活性のために機能性内因性免疫グロブリンを産生しない。ＷＯ９１／７４１もまた、免疫原に対する免疫応答を開始させることができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示しており、該抗体は、霊長類定常および／または可変領域を有し、内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座は置換または不活性化されている。ＷＯ９６／３０４９８は、修飾抗体分子を形成するために定常または可変領域の全部または一部を置換することのような、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ＷＯ９４／０２６０２は、不活性化内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内因性重鎖を欠き、１つ以上の異種定常領域を含む外来性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。

【0090】

上述したトランスジェニック動物を用いて、選択抗原分子に対する免疫応答を産生することができ、抗体産生細胞を動物から取り出して、ヒト由来モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。免疫プロトコール、アジュバント等は当該技術分野において知られており、例えば、ＷＯ９６／３３７３５に記載されるように、トランスジェニックマウスの免疫において使用される。モノクローナル抗体、対応するタンパク質の生物学的活性または生理的作用を阻害するまたは中和する能力に関して試験することができる。

【0091】

Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）、および米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号、ならびに米国特許出願第２００２０１９９２１３号も参照のこと。米国特許出願第２００３００９２１２５号は、所望のエピトープに対する動物の免疫応答にバイアスをかけるための方法を記載している。ヒト抗体はまた、体外活性化Ｂ細胞によって生成され得る（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照のこと）。

【0092】

Ｅ．ファージディスプレイによって産生される抗体
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製するための技術の開発、および糸状バクテリオファージの表面上でのコードされる抗体フラグメントの提示は、ヒト由来抗体を生成するための別の手段を提供している。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ９２／０１０４７、およびＣａｔｏｎ ａｎｄ Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって産生される抗体は、通常、細菌において抗原結合フラグメント、例えば、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして産生され、したがって、エフェクター機能を欠く。エフェクター機能は、２つの戦略のいずれかによって導入することができる。すなわち、フラグメントを、哺乳動物細胞における発現のために完全抗体に改変するか、またはエフェクター機能誘発することが可能な第２の結合部位を備えた二重特異性抗体フラグメントに改変することができる。

【0093】

一般的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を、ＰＣＲによって別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいて無作為に組換えて、次にそれらを特定抗原への結合に関して選択することができる。抗体フラグメントは、ファージ表面上で発現され、抗原結合によるＦｖまたはＦａｂ（したがって、抗体フラグメントをコードするＤＮＡを含むファージ）の選択は、パニングと称される工程である、数回の抗原結合と再増幅によって達成される。抗原に特異的な抗体フラグメントを富化し、最終的に単離する。

【0094】

ファージディスプレイはまた、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにも使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，８９９−９０３（１９９４）を参照のこと）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントを、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示することができ、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを、抗原で選択してもよい。マウスＦｄフラグメントは、それによって、選択を導く（ガイドする）ための鋳型を提供する。その後、選択したヒト軽鎖を、ヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択は、完全なヒトＦａｂを産出する。

【0095】

ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導するための種々の手順が記述されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）、米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ １２，１７３−１８４（１９９４）を参照のこと）。特に、ファージディスプレイライブラリーに由来する抗体の体外選択と進化は、強力なツールとなっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．， ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）、およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）、米国特許出願第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７、２００３年１０月９日に公開された米国特許出願第２００３０１９０３１７号、ならびに米国特許第６，０５４，２８７号、米国特許第５，８７７，２９号を参照のこと）。

【0096】

Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｌｉｆｔ，” Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １７８：１８７−１９３、および２００３年３月６日に公開された米国特許出願公開第２００３００４４７７２号は、固体支持体への候補結合分子の固定化を含む方法である捕捉リフト（ｃａｐｔｕｒｅ ｌｉｆｔ）によって、ファージ発現された抗体ライブラリーまたは他の結合分子をスクリーニングするための方法を記載する。

【0097】

Ｆ．抗体フラグメント
上記のように、抗体フラグメントは、無傷全長抗体の一部分、好ましくは、無傷抗体の抗原結合もしくは可変領域を含み、抗体フラグメントから形成される線状抗体および多重特異性抗体を含む。抗体フラグメントの限定されない例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補的決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、線状抗体、キメラ化組換え抗体、トリボディもしくはバイボディ、細胞内抗体、ナノボディ、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはこれらの変異タンパク質もしくは誘導体、ならびに抗体が、所望の生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列等のポリペプチドに結合する特異性抗原を与えるのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。かかる抗原フラグメントは、全抗体の修正によって産生され得るか、または組換えＤＮＡ技法またはペプチド合成を用いて新たに合成され得る。

【0098】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上で２つのドメイン間の対を形成させるには非常に短すぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に更に詳細に記載されている。

【0099】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在し、および任意に、Ｆｖが、抗原結合に対して所望の構造を形成することが可能な、ＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含む（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３，１９８８）。Ｆｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。

【0100】

追加の抗体フラグメントには、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６，１９８９）を含む。

【0101】

「線状抗体」は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。

【0102】

ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介してまたはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合されるｓｃＦｖからなる「ミニボディ」は、Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３に記載されている。

【0103】

「マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合している二価のｓｃＦｖを指し、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７：９５−１０６（２００４）およびＰｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５１：１２３−１３５（２００１）を参照のこと。

【0104】

軽鎖を欠いている機能的重鎖抗体は、ある種の動物（テンジクザメ、アラフラオオセ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ ｓｈａｒｋ）、ならびにラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマ等））において、自然発生する。抗原結合部位は、これらの動物において、単一ドメインである、ＶＨＨドメインのみとなる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを用いて、抗原結合部位を形成する、即ち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂｓ」と称する）。ラクダ化ＶＨＨは、報告によれば、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ１ドメインを欠くＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域と再結合する。古典的なＶＨのみのフラグメントは、可溶性形態で産生することが難しいが、フレームワーク残基をよりＶＨＨ様に変化させると、溶解度の改善と特異的結合が得られ得る（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，２３１：２５−３８を参照のこと）。ラクダ化ＶＨＨドメインは、高親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性を有する（Ｅｗｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：３６２８−３６，２００２）ことが見出されている。ラクダ化重鎖を有する抗体を作製するための方法は、例えば、米国特許公開第２００５０１３６０４９号および第２００５００３７４２１号に記載されている。代替的な足場は、サメＶ−ＮＡＲ足場にさらに厳密に適合するヒト可変様ドメインから作製され得、長い貫通ループ構造のためにフレームワークを提供し得る。

【0105】

重鎖抗体の可変ドメインは、１５ｋＤａのみの分子量を有する最小の完全に機能する抗原結合フラグメントであるため、この実体は、ナノボディと称される（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリーは、Ｃｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５：２８０７−１２，２００１）に記載されているように免疫ヒトコブラクダから作製し得る（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，４５：２８０７−１２，２００１）。

【0106】

細胞内抗体は、細胞内発現を示し、細胞内タンパク質機能を操作することができる単鎖抗体である（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１０１−１０８，１９９０、Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞領域内に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含む、細胞内抗体は、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．（ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５４２−５１，１９９５）およびＷｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）に記載されているように産生され得る。トランスボディは、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）が単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）と融合している細胞透過性抗体である（Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．，６４：１１０５−８，２００５）。

【0107】

さらに、ＳＭＩＰまたは標的タンパク質に特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が企図される。これらの構築物は、抗体のエフェクター機能を実行するために必要な免疫グロブリンドメインに融合した抗原結合ドメインを含む単鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開第２００３０１３３９３９号および米国特許公開第２００３０１１８５９２号を参照のこと。

【0108】

Ｇ．多価抗体
いくつかの実施形態において、多価またはさらに多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性等）モノクローナル抗体を生成することが望ましいとされ得る。かかる抗体は、標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し得る、または代替として、２つの異なる分子、例えば、標的抗原および細胞表面タンパク質もしくは受容体に結合し得る。例えば、二重特異性抗体は、細胞防御機構を標的発現細胞に集中させるために、標的に結合する腕と、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）等の白血球上の引き金分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃγＲ）についてのＦｃ受容体に結合する別の腕を含み得る。別の例として、二重特異性抗体は、細胞傷害性薬を、標的抗原を発現する細胞に局在化させるために使用し得る。これらの抗体は、標的結合腕と、細胞傷害性薬（例えば、サポリン、抗インターフェロン６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合する腕を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る。

【0109】

さらに、本明細書に開示される抗フェロポーチン抗体はまた、多価形態に折り畳むように構築され得、それらは、結合親和性、特異性および／または血液中の半減期の増加を改善し得る。抗フェロポーチン抗体の多価形態は、当該技術分野において既知の技法によって調製することができる。

【0110】

二重特異性または多重特異性抗体には、架橋された抗体または「ヘテロ複合」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ複合体中の抗体の１つをアビジンに結合し、他方をビオチンに結合することができる。ヘテロ複合体は、何らかの好都合な架橋法を用いて作製し得る。好適な架橋剤は、当該技術分野において公知であり、米国特許第４，６７６，９８０号の中で数多くの架橋手法と共に開示されている。別の方法は、ｓｃＦｖのＣ末端でストレプトアビジンをコードする配列を加えることによって、四量体を作製するように設計される。ストレプトアビジンは、４つのサブユニットからなり、ｓｃＦｖストレプトアビジンが折り畳まれた際、４つのサブユニットは、四量体を形成するように会合する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６（３）：９３−１０１（１９９５）、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0111】

二重特異性抗体を作製するための別のアプローチに従うと、１組の抗体分子の間の界面を、改変して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化することができる。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換する。第２の抗体分子の界面では、大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置換することにより、大きな側鎖と同一または類似の大きさの補償的な「腔」が創製される。これは、ホモ二量体等の他の望ましくない最終産物を上回って、テロ二量体の収率を上昇させるための機構を提供する。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１を参照のこと。

【0112】

抗体フラグメントからの二重特異性または多重特異性抗体を生成するための技法も、文献に記載されている。例えば、二重特異性または多重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを生成するために無傷抗体をタンパク質分解によって切断する手順を記載している。これらのフラグメントを、近接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐためにジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元する。生成されたＦａｂ’フラグメントを、次いで、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元してＦａｂ’チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための試薬として使用することができる。Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）は、細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌を開示する（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）を参照のこと）。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、大腸菌から直接回収することができ、それを化学的に結合して、二重特異性抗体を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３−１６７（１９９２）、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。

【0113】

Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）_２分子の産生を記載している。各々のＦａｂ’フラグメントを、大腸菌から別々に分泌させ、体外で指向性化学結合に供して、二重特異性抗体を形成した。そのようにして形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘起することができた。

【0114】

組換え細胞培養物から直接二重特異性または多重特異性抗体フラグメントを作製し、単離するための種々の技法も記載されている。例えば、ＧＣＮ４等のロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体が産生されている（一般に、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３，１９９２を参照のこと）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体を、ヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体へテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体の産生のためにも利用することができる。

【0115】

上記のダイアボディは、二重特異性抗体の一例である。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。二価ダイアボディは、ジスルフィド連結によって安定化され得る。

【0116】

安定な単一特異性または二重特異性Ｆｖ四量体はまた、（ｓｃＦｖ２）_２配置で、またはビス−テトラボディとして、非共有結合性会合によって生成され得る。代替として、２つの異なるｓｃＦｖを、縦列に接合して、ビス−ｓｃＦｖを形成することができる。

【0117】

単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。１つのアプローチは、リンカーまたはジスルフィド結合で２つのｓｃＦｖ抗体を連結させている（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６１９９４、ＷＯ９４／１３８０６および米国特許第５，９８９，８３０号、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0118】

代替として、二重特異性抗体は、Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されるように生成される、「線状抗体」であり得る。簡潔に述べると、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。

【0119】

２つ以上の価数を有する抗体はまた、企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。

【0120】

「キレート組換え抗体」は、標的抗原の近接および非重複エピトープを認識する二重特異性抗体であり、両方のエピトープに同時に結合するのに十分なだけ柔軟である（Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。

【0121】

二重特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）および三重特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の産生は、Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：７０５０−５７，２０００）およびＷｉｌｌｅｍｓら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，７８６：１６１−７６，２００３）に記載されている。バイボディまたはトリボディに関しては、ｓｃＦｖ分子をＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の片方または両方に融合するが、例えば、バイボディにおいては、１つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する一方、トリボディを産生するためには、２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する。

【0122】

さらに別の方法において、二量体、三量体、および四量体は、遊離システインが、親タンパク質に導入された後、産生される。様々な数（２〜４）のマレイミド基を有するペプチド系架橋を使用して、該当するタンパク質を遊離システインに架橋させた（Ｃｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２（３）：２４１−５０（２０００）、これらの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）。

【0123】

ＩＩ．特異的結合剤
他のフェロポーチン特異的結合剤は、例えば、抗体からのＣＤＲに基づいて、またはヒトフェロポーチンについて所望の結合特性を示すペプチドもしくは化合物のために、種々のペプチドもしくは有機化学化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって、調製することができる。フェロポーチン特異的結合剤には、ヒト抗体３１Ａ５（配列番号５〜１０）、ヒト抗体３７Ａ２（配列番号２９〜３４）、ヒト抗体３７Ｂ９（配列番号３９〜４４）、ヒト抗体３７Ｃ８（配列番号４９〜５４）、ヒト抗体３７Ｇ８（配列番号５９〜６４）、ヒト抗体３８Ａ４（配列番号６９〜７４）、ヒト抗体３８Ｃ８（配列番号７９〜８４）、ヒト抗体３８Ｄ２（配列番号８９〜９４）、ヒト抗体３８Ｅ３（配列番号９９〜１０４）、またはヒト抗体３８Ｇ６（配列番号１０９〜１１４）のうちの１つ以上のＣＤＲに、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一である、ペプチド含有アミノ酸配列が含まれる。

【0124】

また、フェロポーチン特異性結合剤には、ペプチボディも含まれる。「ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、少なくとも１つのペプチドに付着された抗体Ｆｃドメインを含む分子を指す。ペプチボディの産生は、２０００年５月４日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ００／２４７８２に概説されている。これらのペプチドのいずれも、リンカーによるか、またはリンカーによらずに、縦列に（即ち、連続的に）連結され得る。システイニル残基を含有するペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋され得、これらのいずれか、またはその両方は、ビヒクルに連結され得る。１つ以上のＣｙｓ残基を有するいかなるペプチドも、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドのいずれも、誘導体化され得る、例えば、カルボキシル末端は、アミノ基でキャップされ得るか、システインは、アミノ酸残基以外の部分によって、キャップされ得るか、またはアミノ酸残基は、アミノ酸残基以外の部分によって、置換され得る（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）、およびＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体のための親和性成熟に類似する手法でペプチド配列を、最適化し得る、またはそうでなければ、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ）もしくはランダムもしくは定方向突然変異誘発によって変更し、次いで、最良の結合剤を特定するためにスクリーニングすることができる（Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２６：４０１−２４，１９９７）。種々の分子は、特異的結合剤の所望の活性を保持しながら、特異的結合剤構造、例えば、それ自体のペプチド部分内、または特異的結合剤のペプチドとビヒクル部分の間に挿入され得る。例えば、Ｆｃドメインもしくはそのフラグメント等の分子、ポリエチレングリコール、またはデキストラン、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小炭水化物、ペプチド、本明細書に記載されるような検出可能な部分（蛍光剤、放射性同位体等の放射標識を含む）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（もしくは他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモン、もしくは相当物等の他の関連した分子を容易に挿入することができる。このような方法において挿入のために好適な他の分子は、当業者により理解され、本発明の範囲内に包含される。これには、例えば、２つの連続したアミノ酸の間にある、任意に、好適なリンカーによって接合される、所望の分子の挿入が含まれる。

【0125】

フェロポーチンペプチボディの開発も企図される。タンパク質リガンドのその受容体との相互作用は、しばしば、相対的に大きな界面において起こる。しかしながら、ヒト成長ホルモンとその受容体で示されるように、界面におけるほんの少数の重要な残基が結合エネルギーの大部分に寄与している。（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６７：３８３−６，１９９５）。タンパク質リガンドの大半は、単に正しいトポロジーで結合エピトープを提示するか、もしくは結合には関係しない機能として働く。したがって、「ペプチド」の長さ（一般に、２〜４０個のアミノ酸）の分子だけが所与の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。かかるペプチドは、大タンパク質リガンドの生物活性を擬似するか（「ペプチド作動薬」）、または競合的結合を通して、大タンパク質リガンドの生物活性を阻害することができる（「ペプチド拮抗薬」）。

【0126】

ファージディスプレイ技術は、そのようなペプチド作動薬と拮抗薬を同定する強力な方法として出現している。例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６（１９９０）、Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４（１９９０）、１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５，２２３，４０９号、１９９８年３月３１日に発行された米国特許第５，７３３，７３１号、１９９６年３月１２日に発行された米国特許第５，４９８，５３０号、１９９５年７月１１日に発行された米国特許第５，４３２，０１８号、１９９４年８月１６日に発行された米国特許第５，３３８，６６５号、１９９９年７月１３日に発行された米国特許第５，９２２，５４５号、１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０９８７、および１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ９８／１５８３３を参照のこと（これらのそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる）。ペプチドファージディスプレイライブラリーにおいて、ランダムペプチド配列は、糸状ファージのコートタンパク質との融合によって提示され得る。提示されたペプチドを、必要に応じて、受容体の抗体固定化された細胞外ドメインに対して親和性溶出することができる。残留したファージは、親和性精製および再増殖を連続的に繰り返すことによって富化され得る。最良の結合ペプチドを配列決定して、ペプチドの１つ以上の構造的に関連するファミリー内の重要な残基を同定することができる。例えば、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：１６９６−９（１９９７）を参照のこと。、ここでは、２つの異なるファミリーが同定された。ペプチド配列はまた、どの残基がアラニンスキャニングによって、またはＤＮＡレベルでの変異誘発によって安全に置換できるかを示唆し得る。突然変異誘発ライブラリーを創造し、スクリーニングして、最良の結合剤の配列をさらに最適化してもよい。（Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，２６：４０１−２４，１９９７）。

【0127】

タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大タンパク質リガンドの結合活性を擬似するペプチドを示唆するために使用し得る。このような分析において、結晶構造は、ペプチドが設計され得る大タンパク質リガンドの決定的残基が何であるかの確認と相対的方向性を示唆し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：１２６６−７０（１９９７）を参照のこと。これらの分析法は、結合親和性を高めるためのペプチドのさらなる修飾を示唆し得る、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されたペプチド間の相互作用を検討するためにも使用してもよい。

【0128】

他の方法は、ペプチド研究においてファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーを、ｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合し、大腸菌において発現することができる。別の大腸菌に基づく方法は、ペプチドグリカン結合リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により細胞の外膜に発現させる。本文中以下では、これらおよび関連する方法を、集合的に「大腸菌ディスプレイ」と称する。別の方法において、ランダムＲＮＡの翻訳をリボソーム放出の前に停止させ、それらの関連ＲＮＡがまだ付着しているポリペプチドのライブラリーを生じさせる。本文中以下では、これおよび関連する方法を、集合的に「リボソームディスプレイ」と称する。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を採用する。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）を参照のこと。本文中以下では、これおよび関連する方法を、集合的に「ＲＮＡ−ぺプチドスクリーニング」と称する。ペプチドがポリエチレンロッドまたは溶媒透過性樹脂のような安定な非生物学的物質上に固定されている、化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発されている。別の化学的に誘導されたペプチドライブラリーは、写真平板印刷を用いてガラススライド上に固定されたペプチドを走査する。本文中以下では、これらおよび関連する方法を、集合的に「化学物質−ぺプチドスクリーニング」と称する。化学物質−ぺプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸および他の非天然類似体、ならびに非ペプチド要素を使用できるという点で有利であると考えられる。生物学的方法と化学的方法の両方が、Ｗｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）の中で考察されている。

【0129】

ペプチドライブラリーに対する他の細胞ディスプレイ技法は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母菌上の表面ディスプレイを含む（Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７，１９９７）。したがって、例えば、抗体は、α−凝集素酵母接着受容体への融合を介して、サッカロマイセス・セレヴィシエの表面上に提示することができ、それは、酵母細胞壁上に位置する。この方法は、フリーサイトメトリーによってレパートリーを選択する可能性を提供する。蛍光標識された抗原および抗エピトープタグ試薬によって細胞を染色することによって、酵母細胞を、細胞表面上で抗原結合のレベルに従って分類することができる。酵母ディスプレイプラットフォームはまた、ファージと組み合わせることができる（例えば、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５４６：２８８−２９４，２００３を参照のこと）。

【0130】

概念的には、ファージディスプレイおよび上述した他の方法を用いて、いかなるタンパク質のペプチド擬似も発見し得る。これらの方法は、エピトープマッピングのため、タンパク質−タンパク質相互作用における決定的アミノ酸の同定のため、そして新しい治療剤発見のための先導役（ｌｅａｄ）として使用されている。例えば、Ｃｏｒｔｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１（１９９６）を参照のこと。現在、ペプチドライブラリーは、エピトープマッピングのような免疫学的試験においてはペプチドライブラリーが最も多く用いられている。例えば、Ｋｒｅｅｇｅｒ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １０（１３）：１９−２０（１９９６）を参照のこと。

【0131】

フェロポーチンに結合する、またはフェロポーチンの活性を調整する（即ち、増加もしくは低下させる）ための能力についてスクリーニングされ得る化合物のための供給源には、（１）無機および有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー、ならびに（３）ランダムペプチドあるいは擬似ペプチドのいずれか、オリゴヌクレオチド、もしくは有機分子からなるコンビナトリアルライブラリーが含まれる。

【0132】

化学ライブラリーは、容易に合成されるか、または多くの商業的供給源から購入され得、公知の化合物、または天然産物スクリーニングを介して「ヒット（ｈｉｔ）」または「先導（ｌｅａｄ）」として同定される化合物の構造的類自体を含み得る。

【0133】

天然産物ライブラリーの供給源は、微生物（細菌および菌類を含む）、動物、植物または他の植生、または海洋生物、ならびにスクリーニングのための混合物のライブラリーは、以下により創製され得る。（１）土壌、植物または海洋微生物からの培養液の発酵および抽出、または（２）それら自体の生物の抽出。天然産物ライブラリーには、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびそれらの（非自然発生型）変異体が含まれる。概略に関しては、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：６３−６８（１９９８）を参照のこと。

【0134】

コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物からなり、伝統的自動合成法、ＰＣＲ、クローニングまたは独自の合成方法により、容易に調製され得る。特に興味深いのは、ペプチドコンビナトリアルライブラリーおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーである。対象となるさらなる他のライブラリーには、ペプチドライブラリー、タンパク質ライブラリー、ペプチド模倣物ライブラリー、多重並列合成コレクションライブラリー、リコンビナトリアルライブラリー、およびポリペプチドライブラリーが含まれる。コンビナトリアル化学およびそれから作製されるライブラリーの概略に関しては、Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７０１−７０７（１９９７）を参照のこと。ペプチド模倣物ライブラリーの概略および例に関しては、Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９（３）：２０５−２３（１９９８）、Ｈｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．，１（１）：１１４−１９（１９９７）、Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．，４（５）：７０９−１５（１９９６）（アルキル化ジペプチド）を参照のこと。

【0135】

フェロポーチン特異的結合剤はまた、Ｈａｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（１０）：５１４−５２２（２００５）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載される、足場タンパク質、ならびに、米国公開第２００６−０２８６６０３号および第２００６−０２２３１１４号（双方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）タンパク質技術も含まれる。

【0136】

ＩＩＩ．抗体変異体および誘導体の産生
本発明の抗フェロポーチン抗体は、当業者には公知の技法によって容易に修飾することができる。可能な変異には、１つ以上の残基の挿入、欠失、または置換が含まれる。挿入または欠失は、好ましくは、約１〜５個のアミノ酸の範囲、さらに好ましくは１〜３個、および最も好ましくは１〜２個のアミノ酸である。

【0137】

欠失変異体は、ポリペプチドであり、ここで、任意のアミノ酸配列のうちの少なくとも１個のアミノ酸残基が除去される。欠失は、タンパク質の一方もしくは双方の末端で、またはポリペプチド内（即ち、内部）で１つ以上の残基の除去を伴い、もたらされ得る。欠失変異体の調製のための方法は、当該技術分野において通例である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたく、この開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0138】

アミノ酸配列挿入は、１個の残基から１００個またはそれ以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに１個以上のアミノ酸の内部配列挿入を含む。本明細書に記載の異なる変異体形のいずれもと同様に、挿入変異体は、得られたポリペプチドが、同一の生物学的特性を保持するか、または、それが由来する親ポリペプチドに伴わない、新しい物理的、化学的および／もしくは生物学的特性を示すように、設計することができる。挿入変異体の調製のための方法はまた、当該技術分野において通例、かつ公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、上記を参照）。

【0139】

本明細書に開示される抗体（または本明細書に開示される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはすべてのＣＤＲ）を含む融合タンパク質、および異種ポリペプチドは、本発明によって企図される特定の挿入変異体である。該当するポリペプチドに融合され得る異種ポリペプチドの限定されない例には、例えば、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）、該当するポリペプチドの同定を可能にするマーカー配列、該当するポリペプチドの精製を助長する配列、および多重結合タンパク質の形成を促進する配列等に限定されない、長い循環半減期を有するタンパク質が含まれる。

【0140】

抗体融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号を参照されたく、この開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明のある実施形態において、可動性リンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）を含み得る、融合タンパク質を産生し、その可動性リンカーは、異種タンパク質部分にキメラ化ｓｃＦｖ抗体を接続する。適切なリンカー配列は、得られた融合タンパク質の認識される能力、およびタンパク質のＶドメインによって特異的に結合されるエピトープを結合する能力に影響を及ぼさないものである（例えば、国際公開第ＷＯ９８／２５９６５号を参照されたく、この開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0141】

置換変異体は、ポリペプチドアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されるものである。 ポリペプチドまたは抗体の生物学的特性の修正は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたは螺旋の立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持するその作用が有意に異なる置換を選択することによって、達成される。本発明のある実施形態において、置換変異体は、設計される、即ち、１つ以上の特異（ランダムとは対照的に）アミノ酸残基が、特異アミノ酸残基で置換される。これらの型の典型的な変化には、同類置換および／または天然および置換残基の類似の特性に基づいて別の残基に対する１つの残基の置換が含まれる。

【0142】

同類置換を表１に示す。最も同類の置換は、「好ましい置換」の項目名下に見出される。かかる置換が生物学的活性において変化を生じない場合、さらに大きな変化が導入され、産物がスクリーニングされる。

【0143】

【表1】

【0144】

共通側鎖特性を共有するアミノ酸残基は、しばしば、以下のように分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

【0145】

Ａ．抗体変異体
ある例において、抗体変異体は、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾する目的で、調製される。他の実施形態において、本明細書で論じられる目的のために、エピトープ結合に直接関与しない残基、またはいずれの方法でもエピトープ結合に関与しない残基の修飾が、望ましい。ＣＤＲ領域および／またはフレームワーク領域のいずれの内の突然変異も、企図される。

【0146】

どの抗体アミノ酸残基が、エピトープ認識および結合に重要であるかを決定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行い、置換変異体を産生することができる。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照されたく、この開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。この方法において、個々のアミノ酸残基は、一つずつ、アラニン残基と置換され、得られた抗フェロポーチン抗体は、未修飾抗体と比較してその特異的エピトープを結合するその能力に対してスクリーニングされる。結合能力を低下した修飾された抗体は、どの残基が変化するか決定するために配列決定され、結合または生物学的特性におけるその有意性を示す。

【0147】

抗体の置換変異体は、親和性成熟によって調製され得、ここでランダムアミノ酸変化が、親抗体配列に導入される。例えば、Ｏｕｗｅｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ７４（Ｓｕｐｐｌ ２）：２２３−２３２，１９９８、Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：８９１０−８９１５，１９９８、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：４４３−４５０，１９９８を参照されたく、これらの開示は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。親和性成熟は、抗フェロポーチン抗体またはその変異体を調製し、スクリーニングすること、ならびに得られた変異体から親抗フェロポーチン抗体と比較して増加した結合親和性のような生物学的特性を変更しているものを選択することを含む。置換変異体を生成するための便利な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟である。簡潔には、いくつかの超可変領域部位を突然変異させて、それぞれの部位で、すべての可能なアミノ置換を生成する。そのようにして生成された変異体は、それぞれの粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合体として糸状ファージ粒子の表面上で一価の形で表示される。次に、ファージディスプレイされた変異体が、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８、およびＷＯ９３／１９１７２を参照のこと。

【0148】

現在の抗体親和性成熟法は、以下の２つの突然変異誘発カテゴリー、すなわち推計論的方法および非推計論的方法に属する。エラープローン（Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、突然変異誘発細菌株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０，３５９−６８，１９９６）、および飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：１２８１３−２０，２０００、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７８，２６９−８５，２００２）は、推計論的突然変異誘発法である（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１０２：８４６６−７１，２００５）。非推計論的技法は、しばしば、アラニンスキャニングまたは部位特異的突然変異誘発法を使用し、特異的な突然変異タンパク質の限定された回収を生じる。いくつかの方法をさらに詳細に下記に記載する。

【0149】

パニング法による親和性成熟−組換え抗体の親和性成熟は、一般に、漸減する抗原量の存在下で、候補抗体の数回のパニングを通して行われる。ラウンドごとの抗原量の低下により、抗原への最高の親和性を有する抗体を選択し、それによって、出発物質の大きなプールから高親和性の抗体をもたらす。パニングによる親和性成熟は、当該技術分野において公知であり、例えば、（Ｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，５０：１６３−７１，２００１）に記載されている。ファージディスプレイ法を用いた親和性成熟の方法は、本明細書の他の場所に説明されており、当該技術分野において既知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９７：２０２９−３４，２０００を参照のこと）。

【0150】

ルックスルー型（Ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）変異誘発−ルックスルー型（Ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ）変異誘発（ＬＴＭ）（Ｒａｊｐａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，１０２：８４６６−７１，２００５）は、抗体結合部位を急速にマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭのために、２０個の天然アミノ酸によって提供される主要な側鎖化学を代表する、９個のアミノ酸が、抗体のすべての６つのＣＤＲにおけるすべての位置で、結合に寄与する機能的側鎖を分析するために選択される。ＬＴＭは、それぞれの「野生型」残基が、９個の選択されたアミノ酸のうちの１個により系統的に置換されるＣＤＲ内で一連の単一の位置変異を生成する。あらゆる変異タンパク質を定量的表示することが非常に大掛かりとなることなく、変異ＣＤＲを組み合わせて、複雑性および大きさを増加するコンビナトリアル単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成する。正の選択後、改善された結合を有するクローンは、配列決定され、良性変異は、マッピングされる。

【0151】

エラープローン（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ−エラープローン（Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲは、異なる選択ラウンド間の核酸のランダム化を含む。ランダム化は、使用されたポリメラーゼの固有のエラー速度による低速で生じるが、転写中、高い固有のエラー速度を有するポリメラーゼ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６，１９９２）を用いて、エラープローンＰＣＲによって強化され得る（Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３，１９９９）。突然変異サイクル後、抗原に対して改善された親和性を有するクローンは、当該技術分野における通例の方法を用いて選択される。

【0152】

また、遺伝子シャフリングおよび指向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を利用する技法を用いて、所望の活性に対する、抗フェロポーチン抗体またはその変異体を調製し、かつスクリーニングし得る。例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．，９８（１）：７５−８０（２００１）は、リポソームディスプレイに基づいて場合に応じた体外選択戦略が、ＤＮＡシャフリングによって体外多様化と組み合わせて、ｓｃＦｖのオフ率あるいは熱力学的安定性のいずれかへを発展させることを示し、Ｆｅｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊａｎ−Ａｐｒ；２５（１−２）：７−１３は、ＤＮＡシャフリングと組み合わせたファージディスプレイの使用が、親和性を１０００倍近くまで上昇することが報告された。Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００ Ｆｅｂ．２９；９７（５）：２０２９−２０３４は、（ｉ）機能的クローニングは、超変異ライブラリーにおいて予想外に高い頻度で起こる、（ｉｉ）機能獲得変異は、かかるライブラリーによく表される、および（ｉｉｉ）より高い親和性をもたらす大部分のｓｃＦｖ突然変異は、結合部位から離れた残基に対応することを報告した。

【0153】

代替として、または加えて、それは、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接点を同定する、またはコンピュータソフトウェアを使用して、かかる接点をモデル化することが有益であり得る。このような接触残基および隣接残基は、本明細書に詳細に述べられた技法に従う置換の候補である。このような変異体が発生すると、これらを本明細書に記載のスクリーニングに供し、そして１つ以上の関連のあるアッセイにおいて優れた性質を有する抗体を選択してさらに発展させ得る。

【0154】

Ｂ．修飾された炭水化物を有する抗体
親抗体と比較して修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体変異体を産生することもでき、例えば、特異的結合剤もしくは抗体に結合する１つ以上の炭水化物部分を付加もしくは欠失させる、および／または特異的結合剤もしくは抗体における１つ以上のグリコシル化を付加もしくは欠失させることにより行われる。

【0155】

抗体を含むポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型あるいはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列である、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘが、プロリンを除いた任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付着に対する認識配列である。ポリペプチドにこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的なグリコシル化部位が生成される。したがって、Ｎ結合型グリコシル化部位を、これらのトリペプチド配列の１つ以上を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって、特異的結合剤もしくは抗体に加えることができる。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはトレオニン）への付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた、使用され得る。Ｏ結合型グリコシル化部位を、元の特異的結合剤もしくは抗体の配列への、１つ以上のセリンもしくはトレオニン残基の挿入または置換によって特異的結合剤もしくは抗体に加えてもよい。

【0156】

Ｃ．変化したエフェクター機能
システイン残基は、抗体またはＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域において除去または導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を排除するか、または増加させる。そのようにして生成されたホモ二量体型特異的結合剤または抗体は、改善された内在化能力および／またはより高い補体媒介性細胞致死作用および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照のこと。ホモ二量体型特異的結合剤または抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製され得る。代替として、２つのＦｃ領域を有し、それゆえ高い補体融解およびＡＤＣＣ能力を有し得る特異的結合剤または抗体を作り出すことができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照のこと。

【0157】

ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘起し得ることが示されている。同類置換は、特異的結合剤または抗体に、結合活性は保持するが、望ましくないＴ細胞応答を誘起する能力を喪失させることができる。また、重鎖または軽鎖の１つ以上のＮ末端の２０個のアミノ酸が除去されることも企図される。

【0158】

いくつかの実施形態において、本発明はまた、抗体分子の産生を企図し、変化した炭水化物構造は、変化したエフェクター活性をもたらし、改善されたＡＤＣＣ活性を示す不在または低下したフコシル化を有する抗体を含む。種々の方法が、これを達成するために当該技術分野において既知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体に抗体分子を結合することによって、媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は、増加した親和性で、この受容体に結合し、かつ天然のフコシル化抗体よりもさらに効果的にＦｃγＲＩＩＩ媒介のエフェクター機能を誘起する。例えば、α−１，６−フルシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞中の非フコシル化抗体の組換え産生は、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００４ Ｓｅｐ ５；８７（５）：６１４−２２）。類似の効果は、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理を通して、フコシル化経路内のこの酵素または他の酵素の活性を低下させること、細胞株を改変して該酵素をノックアウトすること、または選択的グリコシル化阻害剤と共に培養することを通して達成できる（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９ Ｄｅｃ；２６（１２）：１１１３−２３）。一部の宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を自然に産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ｊｕｌ ２６；２７７（３０）：２６７３３−４０、Ｓｈｉｎｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３ Ｊａｎ ３１；２７８（５）：３４６６−７３。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することを通して、二分岐炭水化物のレベルの上昇もＡＤＣＣ活性を上昇させることが判定された。Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０。２個のフコース残基の１個だけの欠如が、ＡＤＣＣ活性を上昇させるのに十分であり得ると予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｄｅｃ ５）。

【0159】

Ｄ．他の共有結合修飾
抗体の共有結合修飾もまた、本発明の範囲内に含まれる。それらは、該当する場合、ポリペプチドもしくは抗体の化学合成によってまたは酵素もしくは化学分解によってなされ得る。共有結合修飾の他のタイプは、標的とされたアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応させることが可能な有機誘導体化剤と反応させることによって導入され得る。

【0160】

システイン残基は、最も一般的には、クロロ酢酸またはクロロアセトアミド等のα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。またシステイン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。

【0161】

ヒスチジル残基は、本薬剤が、比較的ヒスチジル側鎖に特異的であるため、ｐＨ５．５〜７．０で、ジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化される。臭化パラ−ブロモフェナシルも有用であり、この反応は、好ましくはｐＨ６．０で、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム中で行われる。

【0162】

リジニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤との誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬は、ピコリンイミド酸メチル等のイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロホウ水素化物、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼが触媒するグリオキシレートとの反応が含まれる。

【0163】

アルギニル残基は、１または数種の従来の試薬との反応によって修飾され、それらにはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−クロロヘキサンジオン、およびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基が高いｐＫａであるため、反応がアルカリ条件下で行なわれることを必要とする。さらに、これらの試薬は、アルギニンのイプシロン−アミノ基と共にリジンの基とも反応し得る。

【0164】

チロシル残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基に分光標識を導入するという特別な興味を持ってなされ得る。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成させる。^１２５Ｉまたは^１３１Ｉを用いて、チロシル残基をヨウ素化してラジオイモノアッセイで用いるために標識されたタンパク質を調製する。

【0165】

カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’（ここにＲとＲ’は異なるアルキル基を表す）との反応によって選択的に修飾される。さらにアスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基とグルタミニル残基に変換される。

【0166】

グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化されてそれぞれ対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基になる。中性または塩基性条件下で、これらの残基を脱アミド化する。これらの残基の脱アミド化の形態は、本発明の範囲に包含される。

【0167】

他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

【0168】

共有結合修飾の別のタイプは、グリコシドを特異的結合剤または抗体へ化学的にまたは酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、それらが、ＮもしくはＯ連結型グリコシル化のためにグリコシル化能力を有する宿主細胞におけるポリペプチドもしくは抗体の産生を必要としないという点において、有利である。使用する結合様式に依存して、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもののような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもののような芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合し得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載される。

【0169】

特異的結合剤または抗体上に存在する何らかの炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に実施され得る。化学的脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸化合物、または等価化合物への特異的結合剤または抗体の暴露を必要とする。この処理は、特異的結合剤または抗体を無傷のまま残しながら、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全部の糖の切断を生じさせる。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。特異的結合剤または抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）によって記載されているように、種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。

【0170】

本明細書に開示される、抗体または特異的結合剤の別のタイプの共有結合修飾は、特異的結合剤または抗体を種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストラン等の多糖ポリマーの１つに連結することを含む。かかる方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、第４，１７９，３３７号、第４，７６６，１０６号、第４，１７９，３３７号、第４，４９５，２８５号、第４，６０９，５４６号またはＥＰ３１５ ４５６を参照のこと。

【0171】

ＩＶ．抗体または特異的結合剤のためのスクリーニング方法
本明細書の例示的な抗体を交差遮断する、および／またはフェロポーチン活性を阻害する、フェロポーチンを結合する抗体を同定する方法も提供する。

【0172】

抗体は、当該技術分野において知られる方法によって、結合親和性に関してスクリーニングをし得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット法、放射標識競合アッセイ、クロマトグラフィによる共分画、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡ等を使用してもよく、これらは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載され、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0173】

最初に、標的抗原上で所望のエピトープに結合する抗体に関してスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）およびＨａｒｌｏｗ，Ｅｄｗａｒｄ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されるような常套的なクロスブロッキングアッセイを実施することができる。未知の抗体を、本発明の標的特異性抗体への標的の結合を阻害する能力によって特徴付けられる、常套的な競合結合アッセイも使用され得る。無傷抗原、細胞外ドメイン、または線状エピトープ等のそのフラグメントを使用することができる。エピトープマッピングは、Ｃｈａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載されている。

【0174】

体外結合アッセイの１つの変法において、（ａ）固定化したフェロポーチンを候補抗体と接触させるステップ、および（ｂ）フェロポーチンへの候補抗体の結合を検出するステップ、を含む方法を提供する。代替的な実施形態において、候補抗体は、固定化し、フェロポーチンの結合を検出する。固定化は、支持体、ビーズまたはクロマトグラフィ樹脂への共有結合、ならびに抗体結合等の非共有結合の高親和性相互作用、または固定化化合物がビオチン部分を含む、ストレプトアビジン／ビオチン結合の使用を含む、当該技術分野において公知の方法のいずれかを用いて達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を使用して、（ｉｉ）非固定化化合物の蛍光標識を使用して、（ｉｉｉ）非固定化化合物に免疫特異的な抗体を使用して、（ｉｖ）固定化化合物が結合している蛍光支持体を励起する非固定化化合物上の標識を使用して、ならびに当該技術分野において公知であり、常套的に実施される他の技法を用いて達成することができる。

【0175】

ヒトフェロポーチン活性を阻害するまたは中和する抗体は、フェロポーチンを抗体と接触させる、試験抗体の存在および不在下でフェロポーチン活性を比較する、ならびに抗体の存在が、フェロポーチンの活性を低下させるかどうかを決定することによって、同定され得る。特定の抗体、抗体の組み合わせの生物学的活性は、本明細書に記載されるもののいずれかを含む、好適な動物モデルを用いて、生体内で評価され得る。

【0176】

例示的な実施形態において、本発明は、標的抗原の生物学的活性と相互作用するまたは生物学的活性を阻害する（即ち、リン酸化、二量化、リガンドによる受容体活性化、または細胞内シグナル伝達等を阻害する）抗体を同定するためのハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを含む。ＨＴＳアッセイは、多数の化合物を効率的な方法で、スクリーニングすることを可能にする。細胞ベースのＨＴＳシステムは、標的抗原とその結合パートナーの間の相互作用を検討するために企図される。ＨＴＳアッセイは、それらから所望の特性を改善するための修飾を設計することができる、所望の特性を有する「ヒット」または「先導化合物」を同定するように設計される。

【0177】

本発明の別の実施形態において、標的抗原ポリペプチドへの好適な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸への１つ、２つ、３つまたはそれ以上の修飾を有する抗体フラグメントまたはＣＤＲに関してハイスループット・スクリーニングを採用する。

【0178】

Ｖ．フェロポーチンの検出
フェロポーチンを検出するための方法も提供する。試料における、フェロポーチンの存在または不在を決定するために、患者からの生体試料は、免疫複合体を形成させるのに十分な条件下および時間で、本明細書に開示される１つ以上の抗フェロポーチン抗体と接触させる。その後、生体試料内の抗フェロポーチン抗体とフェロポーチンとの間に形成された免疫複合体を検出する。試料内のフェロポーチンの量は、抗体とフェロポーチンとの間に形成された免疫複合体の量を測定することによって定量化される。

【0179】

放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫放射定量測定法、ゲル内沈降反応、免疫拡散法、（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を用いた）原位置免疫測定法、ウェスタンブロット解析、沈降反応法、凝集アッセイ法（例えば、ゲル凝集アッセイ法、赤血球凝集アッセイ法）、補体結合アッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、タンパク質Ａアッセイ法、および免疫電気泳動アッセイ法等の技法を用いた、競合および非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野に既知の種々の免疫測定法を使用することができる。一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、該一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体を標識する。免疫測定法において結合を検出するための多くの手段が当該技術分野において既知であり、これらは、本発明の範囲内である。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）ｂｙ Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ ｏｒ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄｗａｒｄ，ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ。Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９９、さらに最新版；Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｇｏｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．（ｅｄ．）（２００１）もしくはさらに最新版；および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）は、定期的に更新される。このようなアッセイの例には、通常、表面またはマトリクスに付着される抗体、上記のフェロポーチンを含有することが予想される生体試料を加え、複合体を形成するようにある時間放置し、非結合複合体を除去するための好適な洗浄手順、次いで、複合体の検出を可能にするための第２の抗体の付加（サンドイッチＥＬＩＳＡ）、あるいは抗体表面上の遊離フェロポーチン結合部位を検出するためのフェロポーチンの検出可能なバージョン（競合ＥＬＩＳＡ）を含む。

【0180】

他の方法において、患者から得られた生体試料は、フェロポーチンのレベルの検査を受ける。生体試料は、免疫複合体を形成させるのに十分な条件下および時間で、本明細書に開示される１つ以上の抗フェロポーチンの抗体で温置される。その後、フェロポーチンに特異的に結合する生体試料において、フェロポーチンと抗体との間に形成される免疫複合体を検出する。このような方法で用いる生体試料は、フェロポーチンを含有することが予想される患者から得られた任意の試料であり得る。好適な生体試料には、血球、他の細胞、生検組織試料、例えば、肝臓、脾臓または十二指腸が含まれる。好適な抗体には、ヒト細胞、齧歯類、ウサギ、ヤギ、ラクダ、または任意の他の種からの抗体が挙げられる。

【0181】

フェロポーチンと、フェロポーチンに対して免疫特異的である抗体との間で免疫複合体の形成を可能にするのに十分な条件下および時間で、反応混合物中の抗体とともに、生体試料を温置する。例えば、４℃で２４〜４８時間、生体試料および１つ以上の抗フェロポーチン抗体を温置し得る。

【0182】

温置後、反応混合物を、免疫複合体の存在について試験する。抗フェロポーチン抗体と、生体試料中に存在するフェロポーチンとの間に形成された免疫複合体の検出は、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の種々の既知の技法によって達成され得る。好適なアッセイは、当該技術分野において公知であり、科学および特許文献に十分に記載されている（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８）。使用され得るアッセイとしては、二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫測定法（米国特許第４，３７６，１１０号）、モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０）、「ウェスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）、標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０）；酵素免疫測定法（Ｒａｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，１９８２）、蛍光色素（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９８０）の使用を含む、免疫細胞化学法、および活性の中和法（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）が挙げられるが、これらに限定されない。他の免疫測定法としては、米国特許第３，８１７，８２７号、第３，８５０，７５２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、および第４，０９８，８７６号に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0183】

検出のために、抗フェロポーチン抗体は、標識あるいは非標識のいずれかであり得る。非標識抗体は、凝集アッセイ法において、または免疫複合体に結合する標識化された検出試薬（例えば、抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａもしくはレクチンおよび二次抗体、またはその抗原結合フラグメント、フェロポーチンに特異的に結合する抗体に結合可能）と組み合わせて、使用され得る。抗フェロポーチン抗体が標識化される場合、レポーター基は、放射性同位元素、蛍光基（例えば、フルオレセインまたはローダミン）、発光基、酵素、ビオチンおよび染料粒子を含む、当該技術分野において既知の任意の好適なレポーター基であり得る。それら自体直接検出可能な標識には、蛍光もしくは発光染料、金属もしくは金属器レート、電気化学的標識、放射性核種（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、または１３１Ｉ）、磁気標識もしくはビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、常磁性標識、または比色標識（例えば、コロイド金、色ガラスまたはプラスチック製ビーズ）が含まれる。このような検出可能な標識は、抗フェロポーチン抗体または検出試薬に直接接合し得るか、または抗フェロポーチン抗体または検出試薬に付着されるビーズまたは粒子と会合し得る。標識化特異的結合パートナーの結合を通して検出可能な標識には、ビオチン、ジオキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＤＮＡが含まれる。検出可能な反応産物のそれらの産生によって間接的に検出することができる間接標識には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、キサンチン酸化酵素、ブドウ糖酸化酵素もしくは他のサッカリドオキシダーゼ、またはルシフェラーゼ等の当該技術分野において公知の種々の酵素が含まれ、これらは、着色もしくは蛍光反応産物を形成するのに適切な基質を切断する。

【0184】

あるアッセイにおいて、非標識化抗フェロポーチン抗体は、生体試料内でフェロポーチンを捕捉する「捕捉剤」（または試薬）として用いるために、固体支持体上で固定化される。固体支持体は、抗体が付着され得る当業者には既知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおけるテストウェルまたはニトロセルロースまたは他の好適な細胞膜であり得る。代替として、支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンあるいはポリ塩化ビニル等のプラスチック材料、もしくは多孔質マトリクスのような管、ビーズ、粒子またはディスクであり得る。他の材料には、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、セファデックス、セルロースまたは多糖類が含まれる。支持体はまた、例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるもの等の磁性粒子または光ファイバーセンサーであり得る。固定化抗フェロポーチン抗体は、ポリクローナル抗体、または本明細書に記載されるもの等の１つ以上のモノクローナル抗体、またはポリクローナルと１つ以上のモノクローナル抗体の組み合わせであり得る。該抗体は、当業者に既知の種々の技法を用いて、固体支持体上に固定化され得、これらは、特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の文脈において、「固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、吸着等の非共有会合と、共有結合（支持体上の抗原と官能基の間の直接連結であり得るか、または架橋剤を介しての連結であり得る）の両方を指す。マイクロタイタープレートのウェルまたは細胞膜への吸着による固定化が、企図される。このような場合には、吸着は、好適な緩衝液において、好適な時間、固体支持体と抗フェロポーチン抗体を接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって異なるが、一般には、約１時間から約１日までである。一般に、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲のペプチド量に、プラスチック製のマイクロタイタープレート（ポリスチレンまたはポリ塩化ビニルを含む）のウェルを接触させれば、ペプチドの十分な量を固定化するのに十分である。

【0185】

固定化した後、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、一般的にはブロックされる。ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、加熱不活性化したヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯ（保存料、塩、および消泡剤も含有する無脂肪粉ミルクの緩衝液）を含む、当業者には既知の任意の好適なブロッキング剤を使用することができる。その後、フェロポーチンを含有すると考えられる生体試料とともに、支持体を温置する。試料を無希釈で適用することができ、またはさらに多くの場合、通常ＢＳＡ，ＮＧＳ、またはＢＬＯＴＴＯのような、少量（０．１重量％〜５．０重量％）のタンパク質を含有する緩衝液中で、希釈することができる。一般に、適切な接触時間（即ち、温置時間）は、試料を含有するフェロポーチン内でフェロポーチンに免疫特異的である抗体または抗原結合フラグメントの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、接触時間は、結合抗体もしくは抗体フラグメントと非結合抗体もしくは抗体フラグメントの間の平衡を達成したもののうちの少なくとも約９５％であるという結合のレベルを達成するのに十分なものである。当業者は、平衡を達成するのに必要な時間が、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを認識するであろう。室温で、約３０分間の温置時間が、通常、十分である。

【0186】

非結合試料は、その後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０を含有するＰＢＳ等の適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することによって除去され得る。その後、免疫複合体中にフェロポーチンに結合する検出試薬（試料からの捕捉剤およびフェロポーチンの結合によって形成された）を、添加することができる。このような検出試薬は、ポリクローナル抗体、または本明細書に記載のもの等の１つ以上のモノクローナル抗体、またはポリクローナルと、本明細書に記載のもの等の１つ以上のモノクローナル抗体もしくは任意の抗体の抗原結合フラグメントとの組み合わせであってもよい。検出試薬は、直接標識化され得、即ち、その際、少なくとも第１の検出可能な標識または「レポーター」分子を含む。代替として、検出試薬は、標識されていない抗フェロポーチン抗体であり得る。この非標識抗フェロポーチン（一次）抗体は、その後、一次抗体への標識化二次抗体または試薬の結合によって検出される。例えば、一次抗体が、ネズミ免疫グロブリンである場合、二次抗体は、標識された抗ネズミ免疫グロブリン抗体であり得る。同様に、一次抗体が、ウサギ免疫グロブリンである場合、二次抗体は、標識された抗ウサギ免疫グロブリン抗体であり得る。

【0187】

結合抗体またはその抗原結合フラグメントを検出するのに十分な時間、免疫複合体とともに、検出試薬を温置する。適切な時間は、概して、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。その後、非結合標識または検出試薬を除去し、好適なアッセイまたは分析機器を用いて、結合標識または検出試薬を検出する。レポーター基を検出するために採用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性標識に関しては、シンチレーション測定またはオートラジオグラフィー法が、概して、適切である。分光法を使用して、染料、発光または化学発光部分および種々の色原体、蛍光標識等を検出してもよい。ビオチンは、異なるレポーター基（一般には、放射性基もしくは蛍光基または酵素）に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびブドウ糖酸化酵素を含む）は、概して、基質の添加（概して、特定の期間）、次いで、その反応産物の分光光度学的分析または他の分析によって検出され得る。採用される特定の方法にかかわらず、バックグラウンド（即ち、正常レベルのフェロポーチンを有する個人から得られた生体試料に対して観察されたレベル）よりも少なくとも２倍大きい結合検出試薬のレベルは、フェロポーチンの発現に関連した障害の存在を示す。

【0188】

代替的な実施形態において、試料および検出試薬は、逐次的に添加されるのではなく、捕捉剤と同時に接触され得る。さらに別の代替において、試料および検出試薬は、ともにあらかじめ温置され、次いで、捕捉剤に添加され得る。他の変法は、当業者には容易に明らかである。

【0189】

別の実施形態において、試料中に存在するフェロポーチンの量は、競合結合アッセイによって決定される。競合結合アッセイは、標識化標準物質（例えば、フェロポーチンポリペプチド、またはその免疫学的に反応部分）の、限定された量の抗フェロポーチン抗体との結合において、試験試料検体（フェロポーチンポリペプチド）と競合する能力に依存する。遊離フェロポーチンと結合フェロポーチンを分離した後、フェロポーチンは、既知の標準物質に対する結合／非結合フェロポーチンの比を関連させることによって、定量化される。試験試料中のフェロポーチンポリペプチドの量は、抗体に結合される標準物質の量に反比例する。結合される標準物質の量を決定するのを助長するために、一般的に、抗体は、抗体に結合される標準物質および検体が、非結合のままの標準物質および検体から適宜分離され得るように、固体支持体上で固定化される。したがって、このような実施形態において、本発明は、標識化フェロポーチン（またはフェロポーチンの抗原性を保持するその標識化フラグメント）およびフェロポーチンに結合する抗体と、生体試料を接触させるステップと、形成された抗体標識化フェロポーチン複合体の量を検出するステップと、を企図する。

【0190】

固体支持体または検出可能な標識に接合する調製は、しばしば、化学架橋剤の使用を含む。架橋試薬は、少なくとも２つの反応基を含み、概して、同種官能性架橋剤（同一の反応基を含む）および異種官能性架橋剤（非同一の反応基を含む）に分けられる。アミン、スルフヒドリルを通して連結するか、または非特異的に反応する同種二官能性架橋剤は、多くの商業的供給源から入手可能である。マレイミド、アルキルおよびハロゲン化アリール、αハロアシルならびにピリジルジスルフィドは、チオール反応基である。マレイミド、アルキルおよびハロゲン化アリール、ならびにαハロアシルは、スルフヒドリルと反応し、チオールエーテル結合を形成する一方、ピリジルジスルフィドは、スルフヒドリルと反応し、混合したジスルフィドを産生する。ピリジルジスルフィド産物は、開裂可能である。イミドエステルはまた、タンパク質−タンパク質架橋に非常に有用である。

【0191】

異種二官能性架橋剤は、タンパク質の特定の基との逐次接合を可能にする２つ以上の異なる反応基を所有し、望ましくない重合または自己接合を最小化する。異種二官能性試薬はまた、アミンの修飾が問題である場合、使用される。アミンは、時折、高分子の活性部位で見いだされ得、これらの修飾は、活性の欠失をもたらし得る。スルフヒドリル、カルボキシル、フェノールおよび炭水化物のような他の部分は、さらに適切な標的であり得る。２ステップの戦略は、他の入手しやすい基を有するタンパク質にそのアミンの修飾を許容することができるタンパク質の連結を可能にする。種々の異種二官能性架橋剤（それぞれは、成功した接合に対して異なる特性を組み合わせる）は、商業的に入手可能である。一端でアミン反応があり、他端でスルフヒドリル反応がある架橋剤は、多く用いられる。異種二官能性架橋剤試薬を使用する場合、ほとんどの不安定の基を、まず、一般的には、反応させ、効果的な架橋を確保し、望ましくない重合を回避する。

【0192】

検出または監視方法が有用であり得る鉄ホメオスタシスの障害には、アフリカ型鉄過剰、αサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌性貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症性貧血、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症（冠動脈疾患、脳血管疾患、または末梢閉塞性動脈疾患を含む）、失調症、鉄に関連した失調症、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠損症、化学療法誘導貧血、末期腎不全もしくは慢性腎疾患／腎不全を含む慢性腎疾患／腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）、肝臓の肝硬変、典型的なヘモクロマトーシス、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰（ヘプシジンの上昇）を伴う状態、先天性赤血球異形成貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄の生体内分布の障害、鉄ホメオスタシスの障害、鉄代謝の障害、フェロポーチン病、フェロポーチン突然変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、ｇｒａｃｉｌｅ症候群、ヘリコバクター・ピロリ感染もしくは他の細菌感染、ハレルフォルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２において突然変異から生じるヘモクロマトーシス、異常血色素症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶもしくは他のウイルス性疾患、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏障害、鉄過剰障害、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーチンもしくは鉄代謝の他の遺伝子の突然変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連した神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、変形性関節症、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリテマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸血後鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、ウィルソン病ならびに／または鉄過剰に関連した心疾患が含まれる。

【0193】

抗フェロポーチン抗体による治療中、例えば、血球もしくは他の細胞の試料中、または生検組織試料中の対象からの細胞上のフェロポーチンのレベルは、監視され得る。任意に、試料は、療法前、治療の開始後、および／または定期的に治療中、採取され得る。

【0194】

ＶＩ．抗フェロポーチン抗体の治療的使用
フェロポーチンに結合する本明細書に記載の抗体を、それを必要とする対象を治療するために使用することも提供する。例示的な実施形態において、該対象は、鉄ホメオスタシスの障害、ヘプシジンレベルの上昇、ヘプシジン関連障害、アテローム性動脈硬化症または貧血を起こす危険性がある、または罹患している場合がある。

【0195】

本明細書で使用する「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、疾患または障害の危険性がある、または疾患または障害になりやすい傾向を有する対象の予防的治療、および疾患または障害に罹患している対象の治療的使用の両方を指す。

【0196】

予防方法における治療剤の投与は、疾患または障害を予防するか、代替として、その進行において遅延するように、望ましくない疾患または障害の症状の兆候の前に行うことができる。したがって、予防方法と併せて使用する場合、「治療上有効な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」という用語は、治療後、（平均して）より少数の対象が、望ましくない疾患もしくは障害を発症する、または重度の症状が進行することを意味する。

【0197】

疾患または障害の症状が対象に現れた後、治療剤の投与を含む治療方法と併せて使用する場合、「治療上有効な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」という用語は、治療後、疾患または障害の１つ以上の兆候または症状が、改善されるか、または解消されることを意味する。

【0198】

治療のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜用および農場用動物、およびイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の動物園、スポーツ、またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される、任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。

【0199】

本明細書で使用する「ヘプシジン関連障害」とは、鉄ホメオスタシスを崩壊させるヘプシジンの異常レベル（例えば、貯蔵された鉄の程度に関連してヘプシジン過剰またはヘプシジン欠乏）によって生じるか、または関連する病態を指す。鉄ホメオスタシスの崩壊は、貧血またはアテローム性動脈硬化症等の第２の疾患をもたらす場合がある。

【0200】

本明細書で使用する「鉄ホメオスタシスの疾患（または障害）」という句は、対象の鉄レベルを調節する必要がある病態を指す。それには、フェロポーチン病および遺伝性ヘモクロマトーシスＩＶ型等のフェロポーチン関連障害；フェロポーチン持続からの恩恵をそれでもなお受けるフェロポーチンレベルの低下に関連しない病態であるヘプシジン関連障害；ヘプシジン活性の阻害またはフェロポーチン活性の持続からの恩恵をそれでもなお受けるヘプシジンレベルの上昇に関連しない病態である、ヘプシジンによって引き起こされない鉄ホメオスタシスの崩壊等；異常な鉄吸収、鉄循環、鉄代謝あるいは鉄排出が、正常な鉄血液レベルもしくは組織分布の崩壊を引き起こす疾患；鉄異常調節が、炎症、癌もしくは化学療法等の別の疾患または病態の結果である疾患；異常鉄血液レベルもしくは組織分布から生じる疾患または障害；ならびに鉄レベルもしくは分布を調節することによって治療され得る疾患または障害が含まれる。検出または監視方法が有用であり得る鉄ホメオスタシスのこのような疾患または障害、ヘプシジンをもたらし得るヘプシジン関連障害および炎症病態の限定されない例には、アフリカ型鉄過剰、αサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌性貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症性貧血、動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症（冠動脈疾患、脳血管疾患、または末梢閉塞性動脈疾患を含む）、失調症、鉄に関連した失調症、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠損症、化学療法誘導貧血、末期腎不全もしくは慢性腎疾患／腎不全を含む慢性腎疾患／腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ）、肝臓の肝硬変、典型的なヘモクロマトーシス、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰（ヘプシジンの上昇）を伴う状態、先天性赤血球異形成貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄の生体内分布の障害、鉄ホメオスタシスの障害、鉄代謝の障害、フェロポーチン病、フェロポーチン突然変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、ｇｒａｃｉｌｅ症候群、ヘリコバクター・ピロリ感染もしくは他の細菌感染、ハレルフォルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２において突然変異から生じるヘモクロマトーシス、異常血色素症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶもしくは他のウイルス性疾患、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏障害、鉄過剰障害、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーチンもしくは鉄代謝の他の遺伝子の突然変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連した神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、変形性関節症、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリテマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸血後鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、ウィルソン病ならびに／または鉄過剰に関連した心疾患が含まれる。

【0201】

鉄調節の崩壊に関与する非炎症病態としては、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、索性脊髄症、偽脳炎、パーキンソン病（Ｆａｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，９６：９０９（２００６）およびＫａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｅｉｎｇ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３：３２７（２００４））、アルツハイマー病、冠状動脈性心臓病、骨減少症および骨粗鬆症（Ｇｕｇｇｅｎｂｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．，１６：１８０９（２００５））、異常血色素症および赤血球代謝の他の障害（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：４１０３（２００５））、ならびに末梢閉塞性動脈疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0202】

種々の他の鉄指数およびそれらの濃度の正常範囲を表２に列挙する。

【0203】

【表2】

【0204】

表２に列挙された正常範囲外の患者の鉄指数レベルは、患者が、抗フェロポーチン抗体による治療から恩恵を受け得ることを示す。フェロポーチンは、鉄ホメオスタシスで重要な役割を果たすヘプシジンに対する受容体であるため、本発明のいくつかの実施形態において、ヘプシジンレベルおよび活性は、鉄ホメオスタシスの崩壊および／または鉄指数と相関するであろう。いくつかの実施形態において、ヘプシジンレベルの上昇は、表２に示される正常範囲を下回る血清鉄レベル、低ヘモグロビン、およびヘマトクリット、低下したもしくは正常Ｔｓａｔ、ならびに高いもしくは正常フェリチン値、ならびにＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の上昇または炎症の他のマーカーによって測定される、炎症病態の上昇と相関する。

【0205】

本明細書で使用する抗フェロポーチン抗体の「治療有効量」という句は、所望の治療効果をもたらす（即ち、「治療効力（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ）」を提供する）量を指す。例示的な治療効果には、血中鉄レベルの増加もしくは鉄有効性の増加、赤血球数の増加、赤血球平均細胞体積の増加、赤血球ヘモグロビン含有量の増加、ヘモグロビンの増加（例えば、≧０．５ｇ／ｄＬまで増加）、ヘマトクリットの増加、Ｔｓａｔの増加、網状赤血球数の増加、網状赤血球平均細胞体積の増加もしくは正常化、網状赤血球ヘモグロビン含有量の増加、または上記のパラメータのいずれかの正常化が含まれる。その正常範囲へのこのようなパラメータの再生は、治療効力には必要とされない、例えば、正常な方向における測定可能な変化（上昇または低下）は、臨床医によって所望の治療効果であると考えられ得る。単独投与される個別の有効成分に適用される際、該用語（治療有効量）は、その成分のみに言及する。組み合わせに適用される場合、その用語は、組み合わせて投与されようと、逐次もしくは同時に投与されようと、有効成分の組み合わせた量に言及する。例えば、抗フェロポーチン抗体が赤血球生成刺激剤と併せて投与される態様において、治療有効量は、上記のパラメータのいずれかを増加または正常化する組み合わせた量を指すことを意味する。

【0206】

本明細書に記載される治療のための組成物または本明細書に記載される治療方法は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて使用される１つ以上の抗フェロポーチン抗体を利用し、所望の効果を達成し得る。

【0207】

いくつかの実施形態において、鉄ホメオスタシスの障害の治療のための潜在的な患者集団は、まず、生体試料中のヘプシジンレベルを評価することによって特定される。ヘプシジンレベルの上昇を有するとして特定される患者は、本明細書に開示される抗フェロポーチン抗体による治療のための候補者として考えられ得る。例示的な実施形態において、生体試料は、患者から単離され、１つ以上の抗ヘプシジン抗体とともに温置される。標準集団に対する一般的な閾値を超える抗体−ヘプシジン複合体のレベルは、ヘプシジンレベルの上昇と見なされる。この方法で用いるのに好適なヘプシジン抗体は、共同米国暫定特許出願第６０／８８８，０５９号および第６１／０１５，１３８号に開示され、これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。他の例示的な実施形態において、ヘプシジンレベルは、共同米国暫定特許出願第１１／８８０，３１３号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１６４７７号に記載される質量分析法によって決定され、これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。このような質量分析法を使用する際、生体試料中のヘプシジンレベルの増加は、概して、１０ｎｇ／ｍｌよりも多いが、アッセイに依存して、かつ試験された集団のサブセットに依存して異なり得る。

【0208】

いくつかの実施形態において、抗フェロポーチン抗体による療法は、ヒト患者等の対象におけるヘプシジンレベルの変化を監視することを含み得る。ヘプシジンレベルを監視する方法は、（ａ）１つ以上の抗ヘプシジン抗体またはその抗原結合フラグメントによる抗フェロポーチン抗体療法の前に、患者から得られる、第１の生体試料を温置するステップであって、温置は、免疫複合体を形成させるのに十分な条件下および時間で、実施される、ステップと、（ｂ）生体試料中のヘプシジンと、抗体またはその抗体結合フラグメントとの間に形成される免疫複合体を検出するステップと、任意に、（ｃ）後で、例えば、１つ以上の抗フェロポーチン抗体による療法の後に、患者から採取される第２の生体試料を用いてステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、（ｄ）第１および第２の生体試料中に検出された免疫複合体数を比較するステップと、を含み得る。第１の試料と比較して第２の試料における免疫複合体数の増加は、ヘプシジンレベルの増加を示す。このような監視方法で用いる生体試料は、ヘプシジンを含有することが予想される患者から得られた任意の試料であり得る。例示的な生体試料としては、血液、血漿、血清、尿および骨髄が挙げられる。第１の生体試料は、治療レジメンを通して、療法または方法の一部を開始する前に得られ得る。第２の生体試料は、類似の手段で得られるが、追加の療法後、得られるべきである。第２の生体試料は、少なくとも一部の療法が、第１と第２の生体試料の単離の間で行われるという条件で、療法の完了時、または療法の途中で得られ得る。双方の試料のための温置および検出手順は、共同米国暫定特許出願第６０／８８８，０５９号および第６１／０１５，１３８号に開示され、これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0209】

ＶＩＩ．併用療法
（同一または異なる標的抗原に結合する）２つ以上の抗体とともに混合する、または第２の治療剤と本明細書に記載される抗体と併用して、さらに改善された効力を提供し得ことは、さらに有利である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、２つ以上の抗フェロポーチン抗体の投与を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、１つ以上の抗フェロポーチン抗体の投与、および任意に、１つ以上の抗ヘプシジン抗体の投与を含む。抗ヘプシジンモノクローナル抗体は、２００７年２月２日に出願された米国暫定公開第６０／８８８，０５９号および２００７年１２月１９日に出願された第６１／０１５，１３８号にそれぞれ記載されており、これらの開示は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0210】

２つの治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果に影響を及ぼす期間中、重複する限り、同時または同一の経路によって、薬剤を投与することを必要としない。同時または逐次投与が企図され、同様に異なる日または週での投与も企図される。

【0211】

例示的な実施形態において、本発明の方法は、単一抗体、ならびに異なる抗体の組み合わせ、または「カクテル」の投与を含む。かかる抗体カクテルは、異なるエフェクター機序に影響を及ぼす抗体を含有するためにある利点を有し得る。組み合わせにおけるかかる抗体は、相乗的治療効果を示し得る。

【0212】

抗フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤を用いた併用療法が、特に企図される。種々の実施形態において、抗フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤を使用して、貧血に罹患している患者の治療を改善することができる。特に、エリスロポエチンまたはその類似体（エポエチンアルファ、エポエチンベータ、ダーベポエチンアルファ）のような赤血球生成刺激剤療法に対して低応答性である（応答しないものを含む）患者は、とりわけ、抗フェロポーチン抗体による同時治療から恩恵を受けるであろう。一実施形態において、併用療法は、ヒトフェロポーチンに結合する少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの赤血球生成刺激剤による治療を含む。別の実施形態において、併用療法は、ヒトフェロポーチンに結合する少なくとも１つの抗体、ヒトヘプシジンに結合する少なくとも１つの抗体、および少なくとも１つの赤血球生成刺激剤による治療を含む。

【0213】

体内に貯蔵する鉄を再配分または低下させるために、抗フェロポーチン抗体および鉄キレート剤を用いた併用療法も、企図される。鉄キレート剤は、鉄と結合し、かつ組織からもしくは循環から鉄を除去することが可能な薬剤である。例には、デフェロキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ（登録商標））およびデフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ（登録商標））、およびデフェリプロン（１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン）が含まれる。いくつかの実施形態において、フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤を使用して、輸血依存性鉄過剰症に続発する鉄負荷障害に罹患している、またはフリードライヒ失調症等の鉄不均衡配分障害に罹患している、患者の治療を改善することができる。

【0214】

また、抗フェロポーチン抗体を用いた併用療法および静脈切開術も、企図される。かかる併用療法を使用して、ヘモクロマトーシス等の鉄過剰障害に罹患している患者の治療を改善することができる。

【0215】

本明細書で使用する「赤血球生成刺激剤」とは、例えば、受容体に結合し、かつ受容体の立体配座の変化を引き起こすことによって、または内因性エリスロポエチン発現を刺激することによって、エリスロポエチン受容体の活性化を直接的または間接的に引き起こす化合物を意味する。赤血球生成刺激剤には、エリスロポエチンおよび変異体、類似体、あるいはエリスロポエチン受容体に結合し、かつ活性化するその誘導体；エリスロポエチン受容体に結合し、かつ活性化する抗体；またはエリスロポエチン受容体に結合し、かつ活性化するペプチド；またはエリスロポエチン受容体に結合し、かつ活性化する、有機小化合物（任意に、約１０００ダルトン未満の分子量）が含まれる。赤血球生成刺激剤としては、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンゼータ、およびこれらの類似体、ペグ化されたエリスロポチエン、カルバミル化されたエリスロポチエン、擬似ペプチド（ＥＭＰ１／ヘマチドを含む）、擬似抗体およびＨＩＦ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許公開第２００５／００２０４８７号を参照されたく、この開示は、参照によりその全体が組み込まれる）。例示的な赤血球生成刺激剤には、エリスロポエチン、ダーベポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変異体、およびエリスロポエチン受容体を結合し、かつ活性化するペプチドまたは抗体（および米国特許出願公開第２００３／０２１５４４４号および第２００６／００４０８５８号が含まれ、これらの開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、ならびに以下の特許もしくは特許公開に開示される、エリスロポエチン分子もしくはその変異体あるいは類似体が含まれ、これらは、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４１，８６８号、第５，５４７，９３３号、第５，６１８，６９８号、第５，６２１，０８０号、第５，７５６，３４９号、第５，７６７，０７８号、第５，７７３，５６９号、第５，９５５，４２２号、第５，８３０，８５１号、第５，８５６，２９８号、第５，９８６，０４７号、第６，０３０，０８６号、第６，３１０，０７８号、第６，３９１，６３３号、第６，５８３，２７２号、第６，５８６，３９８号、第６，９００，２９２号、第６，７５０，３６９号、第７，０３０，２２６号、第７，０８４，２４５号、第７，２１７，６８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５８６７、ＷＯ９５／０５４６５、ＷＯ９９／６６０５４、ＷＯ００／２４８９３、ＷＯ０１／８１４０５、ＷＯ００／６１６３７、ＷＯ０１／３６４８９、ＷＯ０２／０１４３５６、ＷＯ０２／１９９６３、ＷＯ０２／２００３４、ＷＯ０２／４９６７３、ＷＯ０２／０８５９４０、ＷＯ０３／０２９２９１、ＷＯ２００３／０５５５２６、ＷＯ２００３／０８４４７７、ＷＯ２００３／０９４８５８、ＷＯ２００４／００２４１７、ＷＯ２００４／００２４２４、ＷＯ２００４／００９６２７、ＷＯ２００４／０２４７６１、ＷＯ２００４／０３３６５１、ＷＯ２００４／０３５６０３、ＷＯ２００４／０４３３８２、ＷＯ２００４／１０１６００、ＷＯ２００４／１０１６０６、ＷＯ２００４／１０１６１１、ＷＯ２００４／１０６３７３、ＷＯ２００４／０１８６６７、ＷＯ２００５／００１０２５、ＷＯ２００５／００１１３６、ＷＯ２００５／０２１５７９、ＷＯ２００５／０２５６０６、ＷＯ２００５／０３２４６０、ＷＯ２００５／０５１３２７、ＷＯ２００５／０６３８０８、ＷＯ２００５／０６３８０９、ＷＯ２００５／０７０４５１、ＷＯ２００５／０８１６８７、ＷＯ２００５／０８４７１１、ＷＯ２００５／１０３０７６、ＷＯ２００５／１００４０３、ＷＯ２００５／０９２３６９、ＷＯ２００６／５０９５９、ＷＯ２００６／０２６４６、ＷＯ２００６／２９０９４号、および米国公開番号第ＵＳ２００２／０１５５９９８、ＵＳ２００３／００７７７５３、ＵＳ２００３／００８２７４９、ＵＳ２００３／０１４３２０２、ＵＳ２００４／０００９９０２、ＵＳ２００４／００７１６９４、ＵＳ２００４／００９１９６１、ＵＳ２００４／０１４３８５７、ＵＳ２００４／０１５７２９３、ＵＳ２００４／０１７５３７９、ＵＳ２００４／０１７５８２４、ＵＳ２００４／０２２９３１８、ＵＳ２００４／０２４８８１５、ＵＳ２００４／０２６６６９０、ＵＳ２００５／００１９９１４、ＵＳ２００５／００２６８３４、ＵＳ２００５／００９６４６１、ＵＳ２００５／０１０７２９７、ＵＳ２００５／０１０７５９１、ＵＳ２００５／０１２４０４５、ＵＳ２００５／０１２４５６４、ＵＳ２００５／０１３７３２９、ＵＳ２００５／０１４２６４２、ＵＳ２００５／０１４３２９２、ＵＳ２００５／０１５３８７９、ＵＳ２００５／０１５８８２２、ＵＳ２００５／０１５８８３２、ＵＳ２００５／０１７０４５７、ＵＳ２００５／０１８１３５９、ＵＳ２００５／０１８１４８２、ＵＳ２００５／０１９２２１１、ＵＳ２００５／０２０２５３８、ＵＳ２００５／０２２７２８９、ＵＳ２００５／０２４４４０９、ＵＳ２００６／００８８９０６号、および第ＵＳ２００６／０１１１２７９号。

【0216】

エリスロポエチンとしては、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号２１のアミノ酸１〜１６５は、エポエチン、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、エポエチンイオタ、エポエチンガンマ、エポエチンゼータ等とする任意の分子の成熟タンパク質を構成する。さらに、エポエチンにはまた、例えば、１つ以上の水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＥＰＯ−ベータを含む）等）で化学的に修飾される前述のエポエチンのいずれかが含まれる。また、赤血球生成活性をさらに保有する配列番号２１と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、エリスロポエチンの類似体も企図される。

【0217】

組換えヒトエリスロポエチンの例示的な配列、製造、精製および使用は、Ｌｉｎの米国特許第４，７０３，００８号およびＬａｉらの米国特許第４，６６７，０１６号が含まれるが、これらに限定されない、多くの特許公開に記載されており、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。ダーベポエチンは、２つのさらなる炭水化物鎖を提供するｒＨｕＥＰＯのアミノ酸配列における５つの変化を有する高度にグリコシル化されたエリスロポエチン類似体である。さらに具体的には、ダーベポエチンアルファは、配列番号２１のアミノ酸残基３０および８８で、２つのさらなるＮ連結型炭水化物鎖を含有する。ダーベポエチンアルファおよび他のエリスロポエチン類似体の例示的な配列、製造、精製および使用は、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの９１／０５８６７、ＥｌｌｉｏｔｔらのＷＯ９５／０５４６５、ＥｇｒｉｅらのＷＯ００／２４８９３、およびＥｇｒｉｅらのＷＯ０１／８１４０５を含む、多くの特許公開に記載されており、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。自然発生的な誘導体または類似ポリペプチドには、水溶性ポリマー（例えば、ペグ化）、放射性核種、または他の診断もしくは標的もしくは治療部分に付着するために、化学的に修飾されているものが含まれる。

【0218】

「赤血球生成活性（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とは、例えば、低酸素症でない赤血球増加症マウス（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ ｍｏｕｓｅ）アッセイ等の生体内アッセイに示される、赤血球生成を刺激する活性を意味する（例えば、Ｃｏｔｅｓ ａｎｄ Ｂａｎｇｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ １９１：１０６５，１９６１を参照のこと）。

【0219】

ＶＩＩＩ．医薬製剤の投与および調製
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法の施行に使用されるフェロポーチン抗体は、所望の送達方法に好適な担体を含む医薬組成物に製剤化され得る。好適な担体には、フェロポーチン抗体と組み合わせる際、フェロポーチンの高親和性結合を保持し、対象の免疫系と反応しない、任意の材料が含まれる。例には、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水等の多くの標準医薬担体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。種々の水溶性担体は、例えば、水、緩衝用水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等が使用され得、かつ低刺激の化学修飾等に供されるアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の強化された安定性のために他のタンパク質を含み得る。

【0220】

製剤における例示的な抗体濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１８０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、または代替として、約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗体の水性製剤は、例えば、約４．５〜約６．５、または約４．８〜約５．５、または代替として、約５．０の範囲に及ぶｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製され得る。この範囲内でｐＨが好適な緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸エステル（コハク酸ナトリウム等）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝濃度は、例えば、緩衝液および製剤の所望の等張性に依存して、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。

【0221】

抗体を安定化し得る等張化剤も、製剤中に含まれ得る。例示的な等張化剤には、マンニトール、スクロースまたはトレハロース等のポリオールが含まれる。高張液または低張液が好適であり得るが、好ましくは、水性製剤は、等張である。製剤中の例示的なポリオールの濃度は、約１％〜約１５％ ｗ／ｖの範囲であり得る。

【0222】

また、界面活性剤を抗体製剤に添加し、製剤化された抗体の凝集を低下させる、および／または製剤中の微粒子の形成を最小化する、および／または吸収を低下させ得る。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、あるいはポリソルベート８０）またはポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）等の非イオン系界面活性剤が含まれる。例示的な界面活性剤の濃度は、約０．００１％〜約０．５％、または約０．００５％〜約０．２％、または代替として、約０．００４％〜約０．０１％ ｗ／ｖの範囲であり得る。

【0223】

一実施形態において、製剤は、上記の特定された薬剤（即ち、抗体、緩衝液、ポリオールおよび界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノールおよびベンゼトニウムＣｌ等の１つ以上の保存料を本質的に含まない。別の実施形態において、保存料は、例えば、約０．１％〜約２％、または代替として、約０．５％〜約１％の範囲に及ぶ濃度で、製剤中に含まれ得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されるもの等の１つ以上の他の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を、それらが製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないという条件で、製剤中に含めることができる。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度で受容者に対して非毒性であり、追加の緩衝剤；共溶媒；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ポリエステル等の生分解性ポリマー；および／またはナトリウム等の塩形成対イオンを含む。

【0224】

フェロポーチン抗体の治療製剤は、凍結乾燥された製剤または水性溶液の形態において、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤と混合することによって保存のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、採用される用量および濃度で受容者に対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤等が含まれる。

【0225】

一実施形態において、好適な製剤は、等張化および安定化させるポリオール、ソルビトール、スクロースまたは塩化ナトリウム等の等張化剤と組み合わせて、リン酸塩、酢酸塩、またはＴＲＩＳ緩衝剤等の等張緩衝剤を含有する。このような等張化剤の一例は、５％ソルビトールまたはスクロースである。加えて、製剤は、任意に、０．０１〜０．０２重量％／ｖｏｌで、凝集を防ぐため、および安定化のために界面活性剤を含み得る。製剤のｐＨは、４．５〜６．５または４．５〜５．５の範囲であり得る。他の例示的な抗体についての医薬製剤の詳細は、ＵＳ２００３／０１１３３１６および米国特許第６，１７１，５８６号に見出され得、それぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0226】

本明細書の製剤はまた、治療される特定の兆候に対する必要に応じて、１つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものも含有し得る。例えば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましい場合がある。このような分子は、意図される目的に有効である量と併せて好適に存在する。

【0227】

有効成分はまた、コアセルベーション法または界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのそれぞれ）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてよい。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示される。

【0228】

抗体の懸濁および結晶形態も企図される。懸濁および結晶形態を作製するための方法は、当業者には既知である。

【0229】

生体内投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、従来の公知の滅菌技法によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過によって容易に達成される。得られた溶液は、使用のためにパッケージ化されるか、または無機条件下で濾過され、かつ凍結乾燥され得、凍結乾燥され調製物は、投与前に、滅菌溶液と組み合わせる。

【0230】

特に、ポリペプチドが、液体組成物中で比較的に不安定である場合、凍結乾燥の工程を、しばしば、採用して、長期貯蔵用のポリペプチドを安定化させる。凍結乾燥サイクルは、通常、３つのステップ、すなわち凍結、１次乾燥、および２次乾燥からなる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ３８，Ｎｕｍｂｅｒ ２，ｐａｇｅｓ ４８−５９（１９８４））。凍結ステップにおいて、溶液が十分に凍結するまで、溶液を冷却する。溶液中のバルク水は、この段階で氷を形成する。氷は、１次乾燥段階において昇華し、それは、真空機を用いて、チャンバ内の圧力を氷の蒸気圧を下回るまで減圧することによって実行される。最後に、吸着または結合水は、減圧されたチャンバ内の圧力下および上昇した棚温度で、２次乾燥段階で除去される。該工程により、凍結乾燥ケーキとして知られる材料を生産する。その後、ケーキは、使用前に再構成することができる。

【0231】

凍結乾燥材料のための標準的な再構成の方法は、純水の体積（一般的には、凍結乾燥中、除去された体積に相当する）を再追加するが、抗菌剤の希釈液が、時々、非経口投与用の医薬品の製造に使用される。Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｎｕｍｂｅｒｓ １１ ａｎｄ １２，ｐａｇｅｓ １３１１−１３５４（１９９２）。

【0232】

賦形剤は、場合によっては、凍結乾燥された産物のための安定剤としての役割を果たすことが示されている。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ７４，ｐａｇｅｓ ２２５−２３９（１９９１）。例えば、既知の賦形剤には、ポリオール（マンニトール、ソリビトールおよびグリセロールを含む）、糖（グルコースおよびスクロースを含む）、およびアミノ酸（アラニン、グリシンおよびグルタミン酸を含む）が含まれる。

【0233】

加えて、ポリオールおよび糖も、しばしば、使用して、乾燥状態で貯蔵中、凍結および乾燥によって引き起こされる損傷からポリペプチドを保護し、安定性を強化する。一般に、糖、特に二糖類は、凍結乾燥工程と貯蔵中の両方において、効果的である。ＰＶＰ等の単糖類および二糖類およびポリマーを含む、他のクラスの分子もまた、凍結乾燥された産物の安定剤として報告されている。

【0234】

注射用としては、医薬製剤および／または薬剤は、上に記載されるように、適切な溶液を用いた再構成に好適な粉末であり得る。これらの例としては、凍結乾燥、回転乾燥もしくはスプレー乾燥した粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿、または微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。注射用としては、製剤は、任意に、安定剤、ｐＨ調製剤、界面活性剤、生体利用度調節剤、およびこれらの組み合わせを含み得る。

【0235】

持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスには、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形体である。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とｙエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、Ｌｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ（商標）等の分解性乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸等のポリマーが、１００日を超えて、分子の放出を可能する一方、あるヒドロゲルは、より短期間、タンパク質を放出する。カプセル化された抗体は、長期間体内に残存すると、３７℃で湿度に晒される結果として、変性する、または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。合理的戦略が、関連する機序に応じて、安定化のために考案できる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見いだされた場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適当な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリクス組成物の開発によって達成され得る。

【0236】

いくつかの実施形態において、本発明の製剤は、本明細書に記載されるように、短時間作用性、急速放出性、長時間作用性、または持続放出性になるように設計され得る。したがって、医薬製剤はまた、制御放出または徐放用に製剤化され得る。

【0237】

組成物の治療有効量は、治療される対象の疾患の重症度および体重および全般的な健康状態に応じて異なるが、概して、約１．０μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、または１適用あたり約１０μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、あるいは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与は、疾患または病態に対する応答および対象の療法の耐性に応じて必要な場合、毎日、隔日、毎週、１ヶ月に２回、毎月またはそれ以上もしくはそれ以下の頻度であり得る。４、５、６、７、８、１０または１２週間もしくはそれ以上のようなより長時間にわたる維持用量は、疾患の症状の所望の鎮静が生じるまで必要とされ得、用量は、必要に応じて調整され得る。この療法の経過は、従来の技法およびアッセイによって容易に監視される。

【0238】

具体的な用量は、対象の疾患の病態、年齢、体重、健康状態全般、性別あるいは食習慣、投与間隔、投与経路、排泄速度、および薬物の組み合わせに依存して調整され得る。有効量を含有する上記の用量形態のいずれも、十分に日常実験の範囲内であり、したがって、十分に本発明の範囲内である。

【0239】

抗フェロポーチン抗体または特異的結合剤は、任意の好適な手段によって、例えば、非経口、皮下、腹腔内、肺内、および鼻腔内を介して、ならびに局所治療が望ましい場合、病巣内投与を含む、全身的あるいは局所的のいずれかによって投与される。非経口経路には、静脈内、腹腔内、硬膜外、髄腔内投与が含まれる。加えて、特異的結合剤または抗体は、パルス注入によって、特に、特異的結合剤または抗体の用量を漸減しながら、好適に投与される。好ましくは、投薬は、注射によって、最も好ましくは、投与が短時間のものか、慢性的なものかに幾分依存して、静脈または皮下注射によって行われる。局所、特に、経皮、経粘膜、直腸、経口または、例えば、所望部位の近くに設置されたカテーテルを通しての、局所投与を含む、他の投与方法も企図される。いくつかの実施形態において、毎日から毎週、毎月の範囲に及ぶ頻度で（例えば、毎日、隔日、３日ごと、または１週間に２、３、４、５、もしくは６回）、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ用量で、好ましくは、１週間に２もしくは３回の頻度で、０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇあるいは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ用量で、または１ヶ月に１回、最高４５ｍｇ／ｋｇまで、生理溶液中の本発明の特異的結合剤または抗体を、静脈内に投与する。

【0240】

ＩＸ．検出キットおよび治療キット
便宜上、本明細書に開示される抗体または特異的結合剤は、キット、即ち、診断または検出圧制を実施するための説明書とともに、パッケージ化された既定の量の試薬の組み合わせに提供される。抗体が酵素で標識化される場合、キットは、酵素によって必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する、基質の前駆物質）を含む。さらに、安定剤、緩衝剤（例えば、ブロック緩衝剤または溶解緩衝剤）等の、他の添加剤も含まれ得る。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように、広範に変動し得る。特に、試薬は、溶解の際、適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常、凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。

【0241】

また、診断または検出試薬、および例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型、または競合形式）等の免疫測定法を含む、種々の検出アッセイにおいて使用するための、１つ以上のかかる試薬を含むキットも提供する。キットの構成要素は、固体支持体に予め取り付けられてもよく、または、キットを使用する際に、固体支持体の表面に適用されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナル生成手段が、本発明の抗体に予め伴っていてもよく、または使用前に、１つ以上の構成要素、例えば、緩衝剤、抗体／酵素共役体、酵素基質等の組み合わせを必要とし得る。キットはまた、追加の試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質等も含み得る。固相表面は、管、ビーズ、マイクロタイタープレート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドを固定化するのに好適な他の材料の形態であり得る。好ましくは、化学発光もしくは発色性生成物の形成、または化学発光もしくは発色性基質の低減を触媒する酵素が、シグナル生成手段の構成要素である。かかる酵素は、当該技術分野で公知である。キットは、本明細書に記載の捕捉剤および検出試薬のうちのいずれをも含み得る。任意に、キットはまた、本発明の方法を実施するための説明書も含み得る。

【0242】

バイアルまたは瓶等の容器にパッケージ化された抗フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤を含み、該容器に添付されるか、またはパッケージ化されるラベルをさらに含むキットもまた提供され、該ラベルは、容器の内容物を説明し、本明細書に説明する、１つ以上の疾患状態を治療するための、該容器の内容物の使用に関する、表示および／または説明を提供する。

【0243】

一態様において、キットは、鉄ホメオスタシスの障害を治療するためのものであり、抗フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤を含む。キットは、任意に、経口または非経口、例えば、静脈内投与のための鉄をさらに含み得る。別の態様において、キットは、抗フェロポーチン抗体と、赤血球生成刺激剤との抗フェロポーチン抗体の使用を説明する、容器に添付されるか、またはパッケージ化されるラベルとを含む。さらに別の態様において、キットは、赤血球生成刺激剤と、抗フェロポーチン抗体との赤血球生成刺激剤の使用を説明する、容器に添付されるか、またはパッケージ化されるラベルとを含む。ある実施形態において、抗フェロポーチン抗体および赤血球生成刺激剤、ならびに任意に鉄は、別個のバイアルにあるか、または同一の医薬組成物に一緒に組み合わされる。さらに別の態様において、抗フェロポーチン抗体は、単一の医薬組成物において、鉄と組み合わされる。さらに別の実施形態において、赤血球生成刺激剤は、単一の医薬組成物において、鉄と組み合わされる。

【0244】

併用療法の項で上述したとおり、２つの治療剤の併用投与は、薬剤がそれらの治療効果を与える期間において重複がある限り、薬剤を同時に、または同一の経路で投与することは必要ではない。異なる日または週の投与のように、同時または連続投与が企図される。

【0245】

本明細書に開示される抗体、ペプチド、抗原結合フラグメント、またはポリヌクレオチド、ならびに検出試薬もしくは治療剤として組成物を使用するための説明書のうちの少なくとも１つを含む、本明細書に開示される治療および検出キットもまた調製され得る。かかるキットで使用するための容器は、典型的に、検出および／または治療組成物（複数を含む）のうちの１つ以上が、定置され、好ましくは好適に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の好適な容器を含み得る。第２の治療剤も提供される場合、キットはまた、この第２の検出および／または治療組成物が定置され得る、第２の異なる容器を含有し得る。代替として、複数の化合物が、単一の医薬組成物において調製され得、バイアル、フラスコ、注射器、瓶、または他の好適な単一容器等の、単一の容器手段にパッケージ化され得る。本発明のキットはまた、典型的に、所望のバイアル（複数を含む）が保持される、例えば、射出もしくはブロー成形されたプラスチック容器等の、市販のために厳重に管理されたバイアル（複数を含む）を含有するための手段を含む。放射性標識、発色、蛍光発生的、もしくは他の種類の検出可能なラベルまたは検出手段がキット内に含まれる場合、標識剤は、検出または治療組成物自体と同一の容器に提供され得るか、または代替として、第２の組成物が定置され、好適に等分され得る、この第２の異なる容器手段に定置され得る。代替として、検出試薬およびラベルは、単一の容器手段内に調製され得、ほとんどの場合、キットは、典型的に、市販および／または好都合なパッケージおよび配送のために厳重に管理されたバイアル（複数を含む）を含有するための手段も含む。

【0246】

本明細書に記載の検出または監視方法を実施するためのデバイスまたは装置も提供する。かかる装置は、試料を入れることができるチャンバまたは管と、デバイスを通る試料の流れを方向付けるための弁もしくはポンプ、任意に血液からの血漿もしくは血清を分離するためのフィルタ、捕捉剤もしくは検出試薬の添加のための混合チャンバ、および任意に捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための検出デバイスを任意に含む、流体処理システムと、を含み得る。試料の流れは、受動的（例えば、一度試料が適用されたら、デバイスのさらなる操作を必要としない、毛細血管、静水学的、もしくは他の力によって）、または能動的（例えば、機械的ポンプ、電気ポンプ、遠心力、または空気圧の増加を介して生成される力の印加によって）であり得る。

【0247】

関連した実施形態において、プロセッサ、コンピュータ可読メモリ、および該コンピュータ可読メモリに格納され、本明細書に記載の方法のいずれをも実施するように、該プロセッサ上で実行されるように適合されるルーチンもまた提供する。好適なコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例としては、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ハンドヘルドまたはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサに基づくシステム、セットトップボックス、プログラム可能な消費家電製品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記のシステムもしくはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境、または当該技術分野で既知の任意の他のシステムが挙げられる。

【0248】

Ｘ．フェロポーチン抗体の非治療的使用
本明細書に開示される抗体は、標的抗原のための親和性精製剤として、または、例えば、特定の細胞（例えば、血球）もしくは組織において、その発現を検出する、標的抗原のための診断アッセイにおいて使用され得る。該抗体は、生体内診断アッセイのためも使用され得る。一般的に、これらの目的上、該抗体は、免疫シンチオグラフィーを使用して、部位を局所化することができるように、放射性核種（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐまたは^３５Ｓ等）で標識化される。

【0249】

本明細書に開示される抗体は、競合的結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ等の直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ等の、任意の既知のアッセイ方法において採用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｚｏｌａ，Ｈｅｄｄｙ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｏｘｆｏｒｄ：ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５、およびＺｏｌａ，Ｈｅｄｄｙ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＢＩＯＳ，２０００。該抗体はまた、当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞試料を標識するための、免疫組織化学に対しても使用され得る。

【実施例】

【0250】

ＸＩ．実施例
実施例１−遺伝子免疫法による抗フェロポーチンモノクローナル抗体の産生
ヒトフェロポーチン（ｈＦｐｎ）の発現のためのウイルスベクターを、その終止コドンを欠失した後、ヒトフェロポーチンｃＤＮＡ（配列番号１５）の３’末端までのフレームで、ＰＡＤＲＥペプチドであるＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号２４）をコードするＤＮＡを融合することによって、構築した。ｈＦｐｎ−ＰＡＤＲＥ融合をコードする得られたＤＮＡを、ＬＲ再結合反応によって、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴゲートウェイアデノウイルスベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｖ４９３−２０，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。アデノウイルスベクターは、２９３Ｔ細胞中で増幅され、ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって精製され、Ａｄｅｎｏ−Ｘ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｃａｔ Ｎｏ ６３１０２８，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ）によって力価測定された。

【0251】

ｈＦｐｎ−ＰＡＤＲＥ融合をコードするＤＮＡフラグメントも、ｐｈＣＭＶ１（Ｐ００３１００，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に挿入し、得られたプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションを介したＤＮＡブースティングのために使用した。マウス免疫付与のためのプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いることによって、精製した。

【0252】

ヒトフェロポーチン−ＰＡＤＲＥを発現する２９３Ｅ６細胞からの膜調製物は、標準的なトランスフェクション技法を用いて、ヒトフェロポーチン−ＰＡＤＲＥ ＤＮＡを、１．１×１０７ ２９３Ｅ６細胞に導入することによって生成した。細胞を４８時間後にペレットし、低張緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）にプロテアーゼ阻害剤の存在下、再懸濁した。細胞を機械的に溶解し、膜を、ショ糖勾配を使用して、残存する細胞残屑から分離した。

【0253】

５〜６週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより購入した。組換えアデノウイルスｒＡｄ／ＣＭＶ−ｈＦｐｎ−ＰＡＤＲＥ注入に関して、マウスにＩｓｏｆｌｕｒａｎｅ（Ａｂｂｏｔｔ，ＩＬ）で麻酔し、５０μｌの２×１０９ｉ．ｆ．ｕ．（感染単位）で単一部位に皮内注射した。マウスを、プラスミドＤＮＡエレクトロポレーションで、３回追加免疫した。ＤＮＡエレクトロポレーションに関して、マウスにＩｓｏｆｌｕｒａｎｅで麻酔し、保護し、５０μｌの５０μｇの食塩水中のｐｈＣＭＶ−ｈＦｐｎ−ＰＡＤＲＥを注射し、その後、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ８３０（ＢＴＸ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびツイーザートロード（ｔｗｅｅｚｅｒｔｒｏｄｅ）を使用することによって行った。４つの不連続パルス（各２００ミリ秒）を受け、ツイーザートロードを反対にし、もう１組パルスを与えた。各免疫付与は、３週間ごとに行った。融合の５日前、マウスに、２００μｇのｈＦｐｎ−ＰＡＤＲＥ膜調製物で最後の追加免疫を行った。

【0254】

２匹のマウスからの脾臓を採取し、得られたハイブリドーマ上清を、最初にフェロポーチン発現細胞（実施例３）を使用してフェロポーチン結合に関し、次に、鉄反応アッセイ（実施例５）を使用して機能（フェロポーチン鉄排出活性の持続）に関してスクリーニングした。約４０００の上清をスクリーニングし、これらのうちの３３の抗体のみが、フェロポーチンに結合し、これらのうちの３１Ａ５、１つのみが、ヘプシジンの存在下で、フェロポーチン持続を提供することが分かった。

【0255】

実施例２−他の抗フェロポーチン抗体の産生
追加の抗フェロポーチン抗体は、以下のように生成した。Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ＩｇＧ２κλおよびＩｇＧ４κλマウスを、フェロポーチン発現細胞、またはフェロポーチン発現細胞からの膜のいずれかで免疫付与した。簡潔に述べると、ＩｇＧ４κλおよびＩｇＧ２κλマウスは、フェロポーチンを一時的に発現する２９３Ｔ細胞、またはフェロポーチンを発現する２９３Ｅ６細胞からの膜調製物で免疫付与した。抗原を、皮下または腹腔を介して送達した。マウスは、抗フェロポーチン抗体が血清において検出可能となるまで、一定分量の初期抗原を使用して、追加免疫した。最高の抗フェロポーチン力価を有するマウスから細胞採取し、ハイブリドーマを、最初にフェロポーチン発現細胞（実施例４）を使用して、フェロポーチン結合に関し、次いで、鉄反応アッセイ（実施例５）を使用して、機能（フェロポーチン鉄排出活性の持続）に関してスクリーニングした。

【0256】

種々の抗体キャンペーンのまとめを、表３に記載する。フェロポーチン保護を提供する抗体の生成は、すべてのフェロポーチン抗体によって共有される特性ではないことが明らかである。Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅの従来の免疫付与によって産生された抗体には、３７Ａ２（図８Ｅおよび配列番号２５〜３４）、３７Ｂ９（図８Ｄおよび配列番号３５〜４４）、３７Ｃ８（図８Ｄおよび配列番号４５〜５４）、３７Ｇ８（図８Ｃおよび配列番号５５〜６４）、３８Ａ４（図８Ｃおよび配列番号６５〜７４）、３８Ｃ８（図８Ｂおよび配列番号７５〜８４）、３８Ｄ２（図８Ｂおよび配列番号８５〜９４）、３８Ｅ３（図８Ａおよび配列番号９５〜１０４）、ならびに３８Ｇ６（図８Ａおよび配列番号１０５〜１１４）が含まれた。

【0257】

【表3】

【0258】

実施例３−抗フェロポーチンモノクローナル抗体の特性分析
フェロポーチンに対する３１Ａ５の特異性を確認するために、フェロポーチン発現細胞からの膜調製物を使用して、ウェスタン分析を実施した。

【0259】

フェロポーチン発現２９３Ｔまたは野生型２９３Ｔ細胞のいずれかからの約５μｇの粗膜調製物を、ゲル電気泳動に供し、ニトロセルロース膜に移し、５００ｎｇ／ｍＬの３１Ａ５、または２μｇ／ｍＬのウサギ抗フェロポーチンペプチドポリクローナル抗体のいずれかで、その後、それぞれ抗マウスもしくは抗ウサギ２次抗体でプローブした。ポリクローナル抗血清は、配列番号１６の残基２４７〜２６５にまたがるフェロポーチンペプチドで免疫付与することによって生成され、同一のペプチドで精製された。

【0260】

３１Ａ５は、約６３ｋＤａの予想された分子量のフェロポーチンで移動し、フェロポーチンペプチドに対して上昇された陽性対照の抗血清によって検出されるものに類似する、帯を認識した。３１Ａ５によって認識される両方の顕著な帯は、フェロポーチンであると予想され、これは、しばしば、二重項として現れる（ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：８９５５−８９６０，２００５）。確認された他の３１の抗フェロポーチン抗体のうち、１０未満が、ウェスタン部ロット分析によってフェロポーチンを認識し、それらの１０のうち、ヘプシジンの存在下、フェロポーチン鉄排出活性を持続したものはなかった。

【0261】

次いで、３１Ａ５を、ペプチド部分がフェロポーチン配列の異なる、非重複領域に由来する、フェロポーチンペプチドＦｃ共役体のパネルを認識するその能力について、ウェスタン分析によって試験した。５００ｎｇのフェロポーチンペプチドＦｃ共役体１〜５（ペプチド１：ＬＧＡＩＩＧＤＷＶＤＫＮＡＲＬＫＶＡＱＴＳＬ、配列番号１６のアミノ酸７５〜９６、ペプチド２：ＩＴＩＱＲＤＷＩＶＶＶＡＧＥＤＲＳＫＬＡＮＭＮＡＴＩＲＲＩＤＱＬ、配列番号１６のアミノ酸１５２〜１８３、ペプチド３：ＧＹＡＹＴＱＧＬＳ、配列番号１６のアミノ酸３３０〜３３８、ペプチド４：ＭＰＧＳＰＬＤＬＳＶＳＰＦＥＤＩＲＳＲＦＩＱＧＥＳＩＴＰＴＫＩＰＥＩＴＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳＡＮＩＶＰＥＴＳ、配列番号１６のアミノ酸３９３〜４４６、およびペプチド５：ＡＱＮＴＬＧＮＫＬＦＡＣＧＰＤＡＫＥＶＲＫＥＮＱＡＮＴＳＶＶ、アミノ酸：配列番号１６の５４２〜５７１）を、ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ゲルに流し、ニトロセルロース膜に移し、２００ｍｇ／ｍＬ ３１Ａ５、その後、抗マウス二次抗体を使用して、プローブした。

【0262】

３１Ａ５は、試験された５つのペプチドのうちの１つ、配列番号１６のフェロポーチン残基３９３〜４４６を含むペプチド４のみに有意な結合を示した。他のフェロポーチン結合抗体で、このペプチドにはっきりと結合したものはなかった。３１Ａ５エピトープの位置を、セルロースに固定化された７から１０のアミノ酸の範囲のフェロポーチンペプチドへの結合を検出することによってさらに狭めた。これらの結合試験から、３１Ａ５エピトープは、ペプチド配列：ＡＮＩＶＰＥＴＰＥＳ（配列番号１６のフェロポーチン残基４３９〜４４９）（図２）内であると判断された。残基システイン３２６は、最近、ヘプシジン結合部位の構成要素であることが示されている（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＩｒｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｏｏｋ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２００７：ｐ．２８ ａｎｄ ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．，８：１４６−１５６，２００８）。配列番号１６のシステイン残基３２６は、３１Ａ５エピトープを含有するループ（即ち、図１Ａのループ３）とは異なる細胞外ループに位置する。

【0263】

実施例４−ヒト抗フェロポーチン抗体の特性分析
以下の実施例は、ヒト抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６についての、エピトープマッピングを説明する。

【0264】

ＰｅｐＳｐｏｔ技術（Ｈｅｉｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６２：３２１−３３２，１９９９）を使用して、ヒト抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６に対する、フェロポーチンの結合エピトープを特定した。簡潔に述べると、重複する１０−ｍｅｒペプチドのアレイを、固相ペプチド合成スポッティング法によって、セルロース膜上で合成した。これらのペプチド配列は、配列番号１６のアミノ酸１〜５７１に由来した。次いでアレイを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に浸漬し、ＰＢＳ−Ｔ中の５％ ＢＳＡで３時間、室温で遮断し、その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、調製されたアレイを、９０分間、室温で、５％無脂肪粉乳中の抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３または３８Ｇ６の１μｇ／ｍＬ溶液とともに温置した。結合後、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、その後、１時間、室温で、５％無脂肪粉乳中、１：５０，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼに共役したヤギ抗ヒト軽鎖抗体とともに温置した。次いで、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、いずれの結合も、Ｘ線フィルム上の化学蛍光検出を使用して測定した。

【0265】

抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６は、図１Ａに記載のフェロポーチン配列のループ１、２、３および４内、それらに重複した、またはそれらの近傍のエピトープに結合した。特に、３７Ａ２は、アミノ酸ＳＩＴＰＴＫＩＰＥＩ（配列番号１６のアミノ酸４１７〜４２６）を含むフェロポーチンのフラグメントを認識し、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ｃ８および３８Ｅ３のすべてが、アミノ酸ＡＦＬＹＭＴＶＬＧＦ（配列番号１６のアミノ酸３１５〜３２４）を含むフェロポーチンのフラグメントを認識し、３８Ａ４は、アミノ酸ＩＴＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳ（配列番号１６のアミノ酸４２６〜４３８）を含むフェロポーチンのフラグメントを認識し、３８Ｇ６は、アミノ酸ＴＥＩＹＭＳＮＧＳＮＳＡ（配列番号１６のアミノ酸４２８〜４３９）を含むフェロポーチンのフラグメントを認識し、３８Ｄ２は、アミノ酸ＹＨＧＷＶＬＴＳＣＹ（配列番号１６のアミノ酸１２４〜１３３）、およびアミノ酸ＲＤＧＷＶＳＹＹＮＱ（配列番号１６のアミノ酸２９６〜３０５）を含むフェロポーチンのフラグメントを認識した。配列番号１６の残基システイン３２６は、最近、ヘプシジン結合部位の構成要素であることが示されている（Ｎｅｍｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢｉｏＩｒｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｂｏｏｋ ａｎｄ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２００７：ｐ．２８、ｄｅ Ｄｏｍｅｎｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：８９５５−８９６０，２００５）。配列番号１６のシステイン残基３２６は、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６エピトープを含有するループと比較して、異なる細胞外ループである、ループ３に位置する。

【0266】

図９は、本明細書に開示される種々の抗フェロポーチン抗体によって認識されるエピトープを示す。

【0267】

実施例５−抗フェロポーチン抗体は、生体外鉄反応アッセイにおいて、フェロポーチン鉄排出活性を持続する
このアッセイは、フェリチン鉄反応要素に融合したベータラクタマーゼレポータ遺伝子の活性を監視することにより、細胞内鉄レベルの検出を可能にする。フェロポーチン発現細胞における低レベルの細胞内鉄は、活性フェロポーチンを示す一方、高レベルの細胞内鉄は、フェロポーチン活性の低減を示す。ヘプシジンは、フェロポーチンを内在化させ、細胞表面から除去し、したがって、鉄の放出を阻害し、細胞内鉄濃度を上昇させる。この鉄隔離に対する抗ヒトフェロポーチン抗体の効果は、生体外で評価した。

【0268】

ドキシサイクリン誘導性フェロポーチン（Ｆｐｎ）発現構築物、ならびにｍＲＮＡ翻訳を調節する、以下のヌクレオチド配列（ｔｃｇｇｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｇａｔｔｇｇｃｃｇｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｇａｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃａｃｃａｔａａａａｇａａｇｃｃｇｃｃｃｔａｇｃｃａｃｇｔｃｃｃｃｔｃｇｃａｇｔｔｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｇｃｇｇｇｔｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇｃｔｔｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｇｇａｃｇｇａａｃａｇａｔｃｃｇｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｔｃｃｇａｃｃｇｃｃｃｔｃｃｇａｔｔｔｃｃｔｃｔｃｃｇｃｔｔｇｃａａｃｃｔｃｃｇｇｇａｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｇｇｃｃａｔｃｔｃｃｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇａｃｃｔｇｃｃａｇｃａｃｃｇｔｔｔｔｔｇｔｇｇｔｔａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｇｃｃａａｃｃ）（配列番号２３）を有するフェリチンからの５’鉄反応要素（ＩＲＥ）の１つのコピーを含有するベータラクタマーゼ（ＢＬＡ）発現構築物を含有する２９３細胞株を構築した。７０〜８０％コンフルエントな培養物から採ったこれらの２９３／Ｆｐｎ／ＢＬＡ細胞を、ＢｉｏＣｏａｔ ポリ−Ｄリジン被覆プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔ＃３５−６６４０）の９０μＬ／ウェル（２５，０００細胞／ウェル）に、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１１９６５）、５％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１００９９−１４１）、およびＰＳＱ（（ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１０３７８−０１６）中２．８×０５細胞／ｍＬで定置し、５％ ＣＯ２とともに３７℃で温置した。同日の最後に、１００μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含む、アッセイ媒体の溶液（ＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ、ＰＳＱ）を作製し、そのうちの１０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを終夜、もしくは少なくとも２０時間温置した。翌日、媒体をウェルから除去し、ＤＭＥＭ ５％ ＦＢＳ ＰＳＱ、２．５μｇ／ｍＬクエン酸酸化鉄、３６ｎＭ合成ヒトヘプシジン、および抗体の段階希釈物（２．７：マウス抗ヒトヘプシジン抗体、３１Ａ５：マウス抗ヒトフェロポーチン抗体）およびマウスＩｇＧ２対照抗体）（すべて、アッセイプレートへの添加直前に、９６ウェルポリプロピレンディープウェルブロックプレートで調製）の予め作製された混合物で置き換えた。混合物を１００μＬ／ウェルで添加し、細胞培養物インキュベータで３７℃、５％ ＣＯ２で終夜温置した。次いで、プレートをインキュベータから取出し、２０μＬ／ウェルの調製されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ ＣＣＦ４ Ａ／Ｍ現像試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｋｉｔ＃Ｋ１０８５）の添加、および暗所での９０分間の温置の前に、１０分間室温で平衡化した。現像試薬は、１００μＬのアッセイ媒体（ＤＭＥＭ ５％ＦＢＳ ＰＳＱ）を含む細胞を含まない対照アッセイプレートの１６のウェルにも添加し、同じ時間温置した。次いで、青および緑の蛍光シグナルを、４０９ｎｍで励起し、４４７ｎｍ（青）および５２０ｎｍ（緑）で発光を読み取ることによって、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ．）上で読み取った。結果を図３に示す。２．７および３１Ａ５は、それぞれ１４ｎＭおよび３０ｎＭのＩＣ_５０で細胞内鉄濃度を減少させたことが判定された。抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、３８Ｅ３および３８Ｇ６は、それぞれ４．５ｎＭ、３．６ｎＭ、０．８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．４ｎＭ、０．９ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭおよび４．３ｎＭのＩＣ_５０で、細胞内鉄濃度を減少させた。

【0269】

実施例６−抗フェロポーチン抗体は、フェロポーチンを、ヘプシジンによる内部移行および分解から保護する
Ｖ５エピトープタグをコードするＣ末端配列を有する、ドキシサイクリン誘導性フェロポーチン（Ｆｐｎ）発現構築物を含有する２９３細胞株を構築した。７０〜８０％コンフルエントな培養物から採ったこれらの２９３／Ｆｐｎ−Ｖ５細胞を、Ｐｏｌｙ−Ｄリジン被覆プレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃａｔ＃３５−６６４０）内の、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１１９６５）、１０％ ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１００９９−１４１）、ＰＳＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃１０３７８−０１６）、１００μｇ／ｍＬドキシサイクリン、２．５μｇ／ｍＬクエン酸酸化鉄、１００μＬ／ウェル（５０，０００細胞）に、５．０×１０５細胞／ｍＬでプレートし、終夜もしくは少なくとも２０時間、３７℃で５％ ＣＯ２とともに温置した。翌日、媒体をウェルから除去し、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、ＰＳＱ、２．５μｇ／ｍＬクエン酸酸化鉄、３７ｎＭ組換えヒトヘプシジン、ならびに抗体（２．７、３１Ａ５、３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、および３８Ｇ６、ならびにｍＩｇＧ２対照抗体）の段階希釈物（すべて、アッセイプレートへの添加直前に、９６ウェルポリプロピレンディープウェルブロックプレートで調製）の予め作製された混合物で置き換えた。混合物を１００μＬ／ウェルで添加し、細胞培養物インキュベータで３７℃、５％ ＣＯ２で終夜温置した。

【0270】

フェロポーチンＶ５発現細胞を、３７ｎＭヘプシジンならびに抗体（マウス抗体２．７（抗ヘプシジン抗体）、ヒト抗体３１Ａ５およびｍＩｇＧ２対照抗体）の段階希釈物で終夜試験した。細胞を固定し、透過処理し、フェロポーチンＶ５をＦＩＴＣ共役抗Ｖ５抗体を使用して検出した。フェロポーチン表面発現は、共焦点蛍光顕微鏡を使用して検出され、結果は図４Ａに記載する。全蛍光は、蛍光光度計を使用して検出され、結果は、図４Ｂに記載する。結果は、モノクローナル３１Ａ５が、フェロポーチンの内部移行および分解を阻止することにより、フェロポーチン活性を持続したことを確認した。抗体３７Ａ２、３７Ｂ９、３７Ｃ８、３７Ｇ８、３８Ａ４、３８Ｃ８、３８Ｄ２、および３８Ｇ６は、それぞれ２．５ｎＭ、０．２ｎＭ、０．２ｎＭ、０．８ｎＭ、２．８ｎＭ、０．３ｎＭ、５．４ｎＭ、および１．９ｎＭのＩＣ_５０でフェロポーチン活性を持続した。

【0271】

実施例７−免疫組織化学による、フェロポーチンの検出
哺乳類フェロポーチン発現は、十二指腸細胞の側底膜上、および細網内皮系のマクロファージ内で検出されている（Ｃａｎｏｎｎｅ−Ｈｅｒｇａｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２９０（１）：ｐ．Ｇ１５６−６３，２００６、Ｄｏｎｏｖａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，１（３）：ｐ．１９１−２００，２００５）。３１Ａ５を使用して、この発現プロファイルは、ＩＨＣによってヒト組織内で確認された（図５Ａおよび５Ｂ）。

【0272】

フェロポーチンに対する免疫組織化学（ＩＨＣ）は、ビオチンを含まない免疫ペルオキシダーゼ染色法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４ｔｈ ｅｄ，ＤＡＫＯ，２００６．）を使用して実施され、３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）をクロマゲンとして使用した。簡潔に述べると、スライドをキシレン中で脱パラフィンし、アルコールから水への上り勾配において水和し、抗原回収緩衝液中で過熱した。一連の遮断ステップを使用して、内因性ＦＣ受容体および内因性ペルオキシダーゼを排除した。次いで、スライドをマウス一次抗体とともに温置した。次いで、ＨＲＰ共役二次抗体ポリマーを添加し、茶色のクロマゲンであるＤＡＢ中で呈色させた。スライドをＨｅｍａｔｏｘｌｉｎで対比染色し、青に染色し、脱水し、きれいにし、カバースリップを載せた。

【0273】

フェロポーチンが、哺乳類の胎盤およびＣＮＳの領域で発現することを示唆する、追加データが公開されている（Ｄｏｎａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，上記参照、Ｂａｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１３４：５３２−５４３，２００６）が、モノクローナル抗体を使用したヒトにおけるフェロポーチン発現の完全な特性分析は、まだ報告されていない。３１Ａ５およびＡｓｔｅｒａｎｄヒト多組織アレイを使用した予備研究は、フェロポーチンが、いくつかの異なる組織で発現することを示唆する（表３）。

【0274】

表３：３１Ａ５およびＡｓｔｅｒａｎｄ多組織アレイを使用したＩＨＣにより評価されたフェロポーチン発現

【0275】

【表4】

＊間質単核細胞は、単球、マクロファージ、または樹枝状細胞であり得る。

【0276】

本実施例は、モノクローナル抗体を使用して、フェロポーチンに対して実施された、第１の発現分析を提示する。

【0277】

開示の完全性のため、本明細書に引用されるすべての特許文書および文献は、参照することにより、その全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【0278】

前述の説明および実施例は、本発明を説明するために記載されているに過ぎず、制限することを意図しない。本発明の精神および本質を組み込む、説明される実施形態の修正が、当業者によって行われ得るため、本発明は、添付の請求項の範囲およびその同等物内ですべての変形例を含むように、広義に解釈するべきである。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]