特許 5703228 紫外線障害軽減経口組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5703228

(24)【登録日】2015年2月27日

(45)【発行日】2015年4月15日

(54)【発明の名称】紫外線障害軽減経口組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/198 20060101AFI20150326BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 27/12 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20150326BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150326BHJP

   A23L 1/305 20060101ALI20150326BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/198

   A61P17/16

   A61P17/00

   A61P27/12

   A61P17/04

   A61P35/00

   A23L1/305

【請求項の数】8

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2011-534100(P2011-534100)

(86)(22)【出願日】2010年3月31日

(86)【国際出願番号】JP2010055841

(87)【国際公開番号】WO2011040070

(87)【国際公開日】20110407

【審査請求日】2013年3月5日

(31)【優先権主張番号】特願2009-228267(P2009-228267)

(32)【優先日】2009年9月30日

(33)【優先権主張国】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000001959

【氏名又は名称】株式会社 資生堂

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】芦田 豊

(72)【発明者】

【氏名】東條 洋介

(72)【発明者】

【氏名】水本 智恵子

(72)【発明者】

【氏名】三田 真史

(72)【発明者】

【氏名】島田 正一郎

【審査官】 杉江 渉

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１１−２４６３９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２５２０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５３２４８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１３４５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−３２００３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２８４４３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−２２５４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２７９５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５０９９５５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／１９８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｄ−メチオニンと、その塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含むことを特徴とする、ＵＶ−Ａ障害軽減用経口組成物。

【請求項2】

シワ抑制剤であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

皮膚疾患用医薬品として用いられることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記皮膚疾患は、慢性光線皮膚症、Ｆａｖｒｅ−Ｒａｃｏｕｃｈｏｔ病、光線過敏症、光接触皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏性薬疹、多形日光疹、日光蕁麻疹、慢性光線過敏性皮膚炎、雀卵斑、肝斑、エリテマトーデスからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記皮膚疾患用医薬品は皮膚疾患用治療剤であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項6】

前記皮膚疾患用医薬品は皮膚疾患用予防剤であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の組成物。

【請求項7】

白内障用医薬品として用いられることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

前記白内障用医薬品は白内障用治療剤又は白内障用予防剤であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、紫外線障害軽減経口組成物と、メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を投与するステップを含む紫外線曝露による皮膚疾患及び皮膚の美容状態の改善方法と、前記化合物を投与するステップを含む白内障を治療及び／又は予防する方法とに関する。

【背景技術】

【0002】

紫外線は、約３２０ｎｍより長い長波長域紫外線（ＵＶ−Ａ）と、約３２０〜約２８０ｎｍの中波長域紫外線（ＵＶ−Ｂ）と、約２８０ｎｍより短い短波長域紫外線（ＵＶ−Ｃ）とに分類される。このうちＵＶ−Ｃはオゾン層に吸収されるので地上に達する太陽光には含まれない。ＵＶ−Ａはオゾン層に吸収されず、地上に達する紫外線の大部分を占める。また、ＵＶ−Ｂはオゾン層に一部が吸収されるが、ＵＶ−Ａの１０００分の１の光量で皮膚障害を起こす。したがって、ＵＶ−Ａ及びＵＶ−Ｂはともに皮膚障害の主な原因として重要である。非特許文献１によると、紫外線が関与する疾病には、シワ、紅斑、色素性乾皮症、慢性光線性皮膚炎、扁平上皮癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、Ｂｏｗｅｎ病、日光角化症、光線過敏症、種痘様水疱症及び光接触皮膚炎が、非特許文献２によると、日光皮膚炎、慢性光線皮膚症、光線角化症、光線口唇炎、Ｆａｖｒｅ−Ｒａｃｏｕｃｈｏｔ病、光線過敏症、光接触皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏性薬疹、多形日光疹、種痘様水泡症、日光蕁麻疹、慢性光線過敏性皮膚炎、色素性乾皮症、雀卵斑、ポルフィリン症、ペラグラ、Ｈａｒｔｎｕｐ病、日光角化症、皮膚筋炎、扁平苔癬、Ｄａｒｉｅｒ病、毛孔性紅色粃糠疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、肝斑、単純性疱疹及びエリテマトーデス等が挙げられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】皮膚疾患最新の治療 ２００５−２００６（南江堂）

【非特許文献2】標準皮膚科学 第７版（医学書院）

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従来の紫外線による皮膚障害の予防及び／又は治療剤は、紫外線の皮膚吸収を阻害する酸化チタンのような紫外線散乱剤やパラメトキシケイ皮酸２エチルヘキシルのような紫外線吸収剤か、紫外線によって発生した遊離ラジカルを除去する抗酸化剤かが知られている。しかし、紫外線散乱剤、紫外線吸収剤は屋外での日焼け止めには有効だが、日常的に使用するものではない。また、抗酸化剤は安定性及び安全性に問題がある。さらに、紫外線による皮膚障害に対する治療剤は対症療法剤しか知られていない。なお、皮膚外用剤では連続的に投与することが困難である。そこで、日常的に使用でき、経口摂取が可能で、安定かつ安全な紫外線障害軽減経口組成物と、シワ抑制剤と、皮膚疾患治療用及び／又は予防用医薬品組成物と、食品組成物と、白内障の予防又は治療用医薬品組成物とを開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、紫外線障害軽減経口組成物を提供する。

【0006】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物において、前記メチオニンはＤ−体の場合がある。

【0007】

前記紫外線障害軽減経口組成物は、シワ抑制剤の場合がある。

【0008】

前記紫外線障害軽減経口組成物は、皮膚疾患用医薬品として用いられる場合がある。

【0009】

前記皮膚疾患は、紅斑、日光皮膚炎、慢性光線皮膚症、光線角化症、光線口唇炎、Ｆａｖｒｅ−Ｒａｃｏｕｃｈｏｔ病、光線過敏症、光接触皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏性薬疹、多形日光疹、種痘様水泡症、日光蕁麻疹、慢性光線過敏性皮膚炎、色素性乾皮症、雀卵斑、ポルフィリン症、ペラグラ、Ｈａｒｔｎｕｐ病、日光角化症、皮膚筋炎、扁平苔癬、Ｄａｒｉｅｒ病、毛孔性紅色粃糠疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、肝斑、単純性疱疹、エリテマトーデス、扁平上皮癌、基底細胞癌及びＢｏｗｅｎ病からなるグループから選択される場合がある。

【0010】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物において、前記皮膚疾患用医薬品は皮膚疾患用治療剤の場合がある。

【0011】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物において、前記皮膚疾患用医薬品は皮膚疾患用予防剤の場合がある。

【0012】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物は、食品として用いられる場合がある。

【0013】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物は、白内障用医薬品として用いられる場合がある。

【0014】

本発明の紫外線障害軽減経口組成物において、前記白内障用医薬品は、白内障用治療剤又は白内障用予防剤の場合がある。

【0015】

前記白内障は老人性白内障の場合がある。

【0016】

本発明は、メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、紫外線障害軽減経口組成物を投与するステップを含む、紫外線曝露による皮膚疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。前記皮膚疾患は、紅斑、日光皮膚炎、慢性光線皮膚症、光線角化症、光線口唇炎、Ｆａｖｒｅ−Ｒａｃｏｕｃｈｏｔ病、光線過敏症、光接触皮膚炎、ベルロック皮膚炎、光線過敏性薬疹、多形日光疹、種痘様水泡症、日光蕁麻疹、慢性光線過敏性皮膚炎、色素性乾皮症、雀卵斑、ポルフィリン症、ペラグラ、Ｈａｒｔｎｕｐ病、日光角化症、皮膚筋炎、扁平苔癬、Ｄａｒｉｅｒ病、毛孔性紅色粃糠疹、酒さ、アトピー性皮膚炎、肝斑、単純性疱疹、エリテマトーデス、扁平上皮癌、基底細胞癌及びＢｏｗｅｎ病からなるグループから選択される場合がある。前記メチオニンはＤ−体の場合がある。

【0017】

本発明は、メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、紫外線障害軽減経口組成物を投与するステップを含む、皮膚の美容状態の改善方法を提供する。前記皮膚の美容状態の改善方法において、前記メチオニンと、その誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む、紫外線障害軽減経口組成物は食品組成物の場合がある。前記メチオニンはＤ−体の場合がある。

【0018】

本発明の皮膚の美容状態の改善方法において、皮膚の美容状態の改善とは、シワ抑制の場合があるが、これらに限定されない。

【0019】

本発明は、Ｌ−及びＤ−メチオニンと、それらの誘導体及び／又は塩とからなる群から選択される１種類又は２種類以上の化合物を含む組成物を投与するステップを含む、白内障を治療及び／又は予防する方法を提供する。

【0020】

本発明の白内障を治療及び／又は予防する方法において、前記白内障は老人性白内障の場合がある。

【0021】

本明細書においてメチオニンの「塩」とは、メチオニンの紫外線障害の軽減効果を損なわないことを条件として、金属塩、アミン塩等を含むいずれかの塩をいう。前記金属塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等を含む場合がある。前記アミン塩は、トリエチルアミン塩、ベンジルアミン塩等を含む場合がある。

【0022】

本明細書においてメチオニンの「誘導体」とは、メチオニンの紫外線障害の軽減効果を損なわないことを条件として、メチオニン分子が、アミノ基か、カルボキシル基か、側鎖かにおいて、いずれかの原子団と共有結合したものを指す。前記いずれかの原子団は、Ｎ−フェニルアセチル基、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基等のような保護基と、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、核酸等のような生体高分子と、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステル等のような合成高分子と、エステル基等のような官能基とを含むがこれらに限定されない。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。

【0023】

アミノ酸には光学異性体としてＬ−体とＤ−体とがあるが、天然のタンパク質はＬ−アミノ酸がペプチド結合したものであり、細菌の細胞壁などの例外を除きＬ−アミノ酸のみが利用されていることから、ヒトを始めとする哺乳類にはＬ−アミノ酸のみが存在し、Ｌ−アミノ酸のみを利用していると考えられてきた。（木野内忠稔ら、蛋白質 核酸 酵素、５０：４５３−４６０ （２００５）、レーニンジャーの新生化学［上］第２版 ｐｐ１３２−１４７ （１９９３） 廣川書店、ハーパー・生化学 原書２２版 ｐｐ２１−３０（１９９１） 丸善）したがって、従前より、学術的にも産業的にもアミノ酸としてはＬ−アミノ酸のみが専ら使用されてきた。

【0024】

例外的にＤ−アミノ酸が使用されるケースとしては、細菌に産生させる抗生物質の原料として使用する場合、およびアミノ酸を化学合成した際に等量得られるＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸混合物からＬ−アミノ酸のみを分取するコストを省くために、そのままＤＬ−アミノ酸混合物としてＤ−アミノ酸を使用している食品添加物の例がある。しかし、Ｌ−アミノ酸を含まないＤ−アミノ酸だけを生理活性物質として産業的に使用している例は従来なかった。

【0025】

Ｄ−セリンやＤ−アスパラギン酸はＤ−体の割合が高いことから比較的研究が進んでいる。Ｄ−セリンは大脳、海馬に局在し、脳内のＮＭＤＡ受容体の調節因子で明らかにされている。Ｄ−アスパラギン酸は精巣や松果体に局在が認められ、ホルモン分泌の制御に関与していることが示されている（特開２００５−３５５８号公報）。しかし皮膚、特に紫外線障害におけるＬ―及びＤ−メチオニンの生理作用は明らかにされていない。

【0026】

以下の実施例に示すとおり、Ｌ−体又はＤ−体か、その混合物かとしてのメチオニンについて紫外線障害を軽減する効果はこれまで知られていなかった。したがって本発明のＬ−及び／又はＤ−メチオニンを含む紫外線障害軽減経口組成物は新規発明である。

【0027】

近年、ｄｄＹマウスに１０ｍＭのＤ−アミノ酸水溶液を２週間自由摂取させた後、各器官でＤ−アミノ酸濃度を測定したところ、松果体では松果体１腺あたり３−１０００ｐｍｏｌであり、脳組織では湿重量１グラムあたり２−５００ｎｍｏｌであることが報告された（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ａ．ら、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，３２：１３−２０（２００７））。これに基づいて、以下に説明する本発明の組成物に含まれるＬ−及びＤ−メチオニンの一日摂取量の下限が算出された。

【0028】

本発明のメチオニンは、以下の実施例に示すとおり、培養ヒト線維芽細胞に対しては０．００１〜１００μＭか、マウスに対しては１０ｍＭかの濃度で紫外線障害を軽減する効果を有する。したがって、本発明の医薬品組成物と、シワ抑制剤及び食品組成物とに含まれるメチオニンの量は、この濃度範囲のメチオニンが生体皮膚組織の線維芽細胞に送達されることを条件として、いかなる含有量であってもかまわない。本発明の組成物が内服剤の場合におけるメチオニンの含有量は、０．０００００１重量％〜１００重量％の範囲であればよい。本発明の組成物が内服剤の場合におけるメチオニンの含有量は、０．０００００２重量％〜８０重量％が望ましく、０．００００２重量％〜６０重量％であることが最も望ましい。なお、本発明の組成物に含まれるＤ−メチオニンの一日摂取量の下限は、体重１ｋｇあたり０．０１ｎｇであればよく、０．１ｎｇが好ましく、１ｎｇがより好ましい。本発明の組成物に含まれるＬ−メチオニンの一日摂取量の下限は、臨床薬の投与量（体重１ｋｇあたり２ｍｇ以上）より少ない量であって、体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇであればよく、０．１ｍｇが好ましく、１ｍｇがより好ましい。

【0029】

本発明の医薬品組成物は、メチオニンの単体、メチオニンの塩及び／又は生体内で薬物代謝酵素その他によってメチオニンを放出できる誘導体に加えて、メチオニンの紫外線障害の軽減効果を損なわないことを条件として、さらに１種類又は２種類以上の薬学的に許容される添加物を含む場合がある。前記添加物は、希釈剤及び膨張剤と、結合剤及び接着剤と、滑剤と、流動促進剤と、可塑剤と、崩壊剤と、担体溶媒と、緩衝剤と、着色料と、香料と、甘味料と、防腐剤及び安定化剤と、吸着剤と、当業者に知られたその他の医薬品添加剤とを含むが、これらに限られない。

【0030】

本発明のシワ抑制剤は、有効成分として、メチオニン、メチオニンの塩及び／又は生体内で薬物代謝酵素その他によってメチオニンを放出できる誘導体のみを使用して調製することも可能であるが、通常本発明の効果を損なわない範囲で、医薬部外品を含む化粧品や医薬品等の皮膚外用剤等に用いられる他の成分を、必要に応じて適宜配合することができる。前記他の成分（任意配合成分）としては、例えば、油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等が挙げられる。

【0031】

本発明の食品組成物は、メチオニン、メチオニンの塩及び／又は生体内で薬物代謝酵素その他によってメチオニンを放出できる誘導体に加えて、メチオニンの紫外線障害の軽減効果を損なわないことを条件として、調味料、着色料、保存料その他の食品として許容される成分を含む場合がある。

【0032】

本発明の食品組成物は、例えば、清涼飲料、グミ、キャンディー、錠菓等、従来食品組成物に用いるものであればいずれでもよく、前記例示に限定されるものでない。

【0033】

紫外線曝露は皮膚疾患だけでなく眼疾患、特に、白内障の原因の１つであると考えられている。マウスでは長時間紫外線曝露が水晶体の前部皮質に白濁を生じさせ、実験的に白内障モデルを作製することができることが知られている（前里多佳美及び岩田修造、「水晶体 その生化学的機構」、３１８−３２３頁、岩田修造編、メディカル葵出版、東京（１９８６））。また、老人性白内障の原因の１つは紫外線である考えられており（藤永豊、「白内障 眼科ＭＯＯＫ Ｎｏ．１７」、１０頁、三島濟一ら編、金原出版、東京（１９８２））、Ｚｉｇｍａｎらは、マニラ、タンパ及びロチェスターでの疫学的調査によって、紫外線の照射量と、白内障の発生率とに相関があり、紫外線は白内障のリスク因子であることを示した（Ｚｉｇｍａｎ， Ｓ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉ．１８：４６２−４６７（１９７９））。したがって、これらの知見と、以下の実施例とによれば、紫外線障害を軽減する効果を有するＬ−及びＤ−メチオニンは、白内障の予防又は治療に有効である。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】正常ヒト真皮線維芽細胞での紫外線照射前のＬ−又はＤ−メチオニン添加の効果を示すグラフ。

【図2】正常ヒト真皮線維芽細胞での紫外線照射後のＤ−メチオニン添加の効果を示すグラフ。

【図3】紫外線照射マウスの皮膚厚増加におけるＤ−メチオニン投与の効果を示すグラフ。

【図4】紫外線照射マウスのシワ形成におけるＤ−メチオニン投与の効果を示すグラフ。

【図5】紫外線照射マウスのシワ形成におけるＬ−又はＤ−メチオニン投与の効果を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。

【0036】

以下の検討は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ））のガイドラインに従って資生堂リサーチセンターの倫理委員会によって承認された後に実施された。

【実施例1】

【0037】

培養細胞を用いた紫外線障害試験
紫外線照射及びメチオニン添加の方法
細胞は、市販のヒト新生児真皮線維芽細胞（Ｃｒｙｏ ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ、三光純薬）が用いられた。前記細胞は２ｘ１０^５個／ｍＬとなるように市販の３５ｍｍ径の培養ディッシュ（ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ ３５３００１、日本ベクトン・ディッキンソン）に播種され、市販の細胞培養用培地（Ｄ−ＭＥＭ（１ｇ／Ｌグルコース）、和光純薬）に牛胎児血清を１０％、抗生物質（１５２４０−０６２、ＧＩＢＣＯ）を１％添加した培地（以下、「通常培地」という。）を用いて培養された。前記細胞は、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２及び飽和水蒸気雰囲気下で約２４時間培養された。

【0038】

その後前記細胞を培養する培地は、グルタチオンの生合成阻害剤であるＢＳＯ（Ｌ−ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ−（Ｓ，Ｒ）−ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｎｅ、和光純薬）を１×１０^−３％添加したＢＳＯ培地１ｍＬに切り替えられ、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２及び飽和水蒸気雰囲気下で約２４時間培養された。前記ＢＳＯ培地は、０．２％ＢＳＯをエチルアルコールに溶解した保存用原液を前記通常培地に２００倍希釈して調製された。

【0039】

紫外線照射前のメチオニン添加
紫外線照射前のメチオニン添加（以下、「照射前添加」という。）の効果を検討する場合には、照射２４時間前に０．００１ないし１００μＭのＬ−又はＤ−メチオニンを添加したＢＳＯ培地に切り換えた。０．１μＭのＤ−プロリンを添加した培地に切り換えた後の紫外線照射を陽性対照とし、これらのアミノ酸を添加しない培地のままでの紫外線照射を陰性対照とした。

【0040】

紫外線照射用培地
塩化鉄（ＩＩ）を蒸留水に２×１０^−３％となるように溶解し、その溶解液を２００倍希釈（終濃度１×１０^−５％）となるようにカルシウムイオン、マグネシウムイオンを含んだリン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（＋）で希釈して作製した培地（以下、「紫外線照射用培地」という。）を３７°Ｃに予め加温して用いた。

【0041】

紫外線照射
ＵＶ−Ａ照射前に培地は前記紫外線照射用培地１ｍＬに置換された。ＵＶ−Ａ照射は紫外光均一露光装置ＵＶＥ−５０２Ｓ＋ＥＬ−１６０（三永電機製作所）を用いて、培養ディッシュの蓋を除去した状態で該培養ディッシュのおよそ２０ｃｍ上部から３２０ｎｍないし４００ｎｍの紫外線を８又は９Ｊ／ｃｍ^２照射して実施された。紫外線量はＵＶ ＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ ＵＶＲ−３０３６／Ｓ（株式会社トプコン）を用いて測定された。

【0042】

紫外線照射後のメチオニン添加
紫外線照射後、前記通常培地に戻して４０時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２及び飽和水蒸気雰囲気下で培養された。紫外線照射後のメチオニン添加（以下、「照射後添加」という。）の効果を検討する場合には、この４０時間の培養の培地に０．００１ないし１００μＭのＬ−又はＤ−メチオニンを添加した。

【0043】

照射前添加及び照射後添加時の細胞障害の定量
その後、培地にａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度１０％となるように添加し、３時間後に、Ａｈｍｅｄ Ｓ．Ａ．ら、（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄ． １７０，２１１−２２４（１９９４））及び製造者の指示書に従って励起波長５４４ｎｍ、蛍光波長５９０ｎｍで上清の蛍光強度を測定した。

【0044】

照射前添加の結果
図１にＵＶ―Ａ ９Ｊ／ｃｍ^２の紫外線照射による線維芽細胞の障害に対するＬ−又はＤ−メチオニンの照射前添加の効果を調べた実験結果を示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で４回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。また、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定において、アステリスク（＊）はｐが５％未満、アステリスク（＊＊）はｐが１％未満、アステリスク（＊＊＊）はｐが０．１％未満であることを示す。

【0045】

ＵＶ−Ａ ９Ｊ／ｃｍ^２の照射前にアミノ酸非添加の場合（陰性対照）の生細胞率は２４％であった。０．１μＭのＤ−プロリン照射前添加の場合（陽性対照）の生細胞率は１００％であり、細胞障害が軽減された。０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ又は１００μＭのＤ−メチオニン照射前添加の場合の生細胞率は、それぞれ、１０２％、８１％、９７％、１１４％又は７６％であった。０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ又は１００μＭのＬ−メチオニン照射前添加の場合の生細胞率は、それぞれ、４０％、７２％、６７％、４５％、７３％又は６２％であった。以上の結果から、Ｌ−又はＤ−メチオニンを添加すると生細胞率が増大し、細胞死が軽減された。

【0046】

照射後添加の結果
図２にＵＶ―Ａ ８Ｊ／ｃｍ^２の紫外線照射による線維芽細胞の障害に対するＤ−メチオニンの照射後添加の効果を調べた実験結果を示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で４回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。また、アステリスク（＊＊＊）はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定でｐが０．１％未満であることを示す。

【0047】

ＵＶ−Ａ ８Ｊ／ｃｍ^２の照射後にアミノ酸非添加の場合（陰性対照）の生細胞率は６４％であった。０．１μＭのＤ−プロリンを添加した場合（陽性対照）の生細胞率は８２％に増大し、細胞死が軽減された。０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ又は１００μＭのＤ−メチオニン照射後添加の場合の生細胞率は、それぞれ、９３％、８４％、８２％、８１％又は８７％であった。以上の結果から、Ｄ−メチオニンを添加すると生細胞率が増大し、細胞死が軽減された。細胞死の軽減効果は、Ｄ−メチオニン添加を紫外線照射の前後いずれかに添加するかには関係がないことも明らかとなった。また、Ｌ−メチオニンも紫外線照射による細胞死を軽減する。したがって、Ｌ−メチオニンを紫外線照射の前後いずれかに添加するかには関係がないと示唆された。

【実施例2】

【0048】

ヘアレスマウスを用いた紫外線障害によるシワ生成抑制試験（１）
紫外線照射及びＤ−メチオニン投与の方法
雄性ヘアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１、６週齢、星野実験動物）を用い、シュワルツらの方法（Ｈａｒａｔａｋｅ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０８：７６９−７７５，１９９７．）を一部変更して、ＵＶ−Ｂを繰り返し照射する方法（Ｎａｇａｎｕｍａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．２５：２９−３５，２００１．Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｅ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９１：１５８−１６１，１９８８．）に準じてシワを形成させた。すなわち背部にＵＶ−Ｂ（光源；東芝エレクトリック製 東芝 ＦＬ−２０ ＳＥ蛍光ランプ）を週３回、１２週間照射した。開始後の照射量は３６ｍＪ／ｃｍ^２／回とし、２週目以降は徐々に増加させ、１２週目は２１６ｍＪ／ｃｍ^２／回とした。総照射量は４．４８２Ｊ／ｃｍ^２であった。紫外線量はＵＶＲＡＤＩＯＭＥＴＥＲ（ＵＶＲ−３０５／３６５Ｄ（ＩＩ）、トプコン）にて測定した値を用いた。また、ＵＶ−Ｂ照射期間中、１０ｍＭのＤ−メチオニンが給水瓶にて投与された。対照として、飲料水が同様の方法にて投与された。給水瓶は１週間に１度交換された。

【0049】

紫外線障害によって肥厚した皮膚の測定方法
紫外線照射の終了後に、皮膚厚をシックネスゲージ（Ｍｉｔｓｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＫ−１０１２ＳＵ）を用いて測定した。皮膚厚の測定値は、シックネスゲージで皮膚を挟み込んで測定したため、「皮膚厚×２」として記載した。

【0050】

シワ生成の判定方法
マウスへの上記紫外線照射終了後に、マウス背部の写真を撮影し、ビセットらの方法（Ｂｉｓｓｅｔｔ ＤＬ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ ４６：３６７−３７８，１９８７．）を一部変えた方法でシワの生成の度合いを下記の表１に示す判定基準に従って評価した。シワの評価作業は４名の測定者が個別に行い、その後合議によって、シワの生成の度合いについての評点（以下、単に「評点」という。）を決定した。

【0051】

皮膚厚の測定結果
図３に総照射量４．４８２Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ−Ｂ照射によって生じる皮膚の肥厚に対するＤ−メチオニンの効果を調べた実験の結果を示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で６ないし７回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。また、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ検定において、アステリスク（＊＊）はｐが１％未満、アステリスク（＊＊＊）はｐが０．１％未満であることを示す。ＵＶ−Ｂ照射後の皮膚厚の測定値は、ＵＶ−Ｂ非照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（−）／Ｈ_２０）で０．８１ｍｍ、ＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（＋）／Ｈ_２０）で１．２５ｍｍ及びＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン投与群（ＵＶ（＋）／Ｄ−Ｍｅｔ）で１．００であった。以上の結果から、ＵＶ−Ｂ照射による紫外線障害によって皮膚は顕著に肥厚するが、Ｄ−メチオニンはこの皮膚の肥厚を統計的に有意に軽減することが示された。

【0052】

【表1】

【0053】

シワ形成の評価結果
図４に総照射量４．４８２Ｊ／ｃｍ^２のＵＶ−Ｂ照射によって生じるシワに対するＤ−メチオニンの効果を調べた実験の結果を示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で６ないし７回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。また、アステリスク（＊）はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定でｐが１．８％であることを示す。ＵＶ−Ｂ照射後の各評点の個体数は、ＵＶ−Ｂ非照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（−）ｃｏｎｔｒｏｌ）では評点１が６匹であった。ＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ）の各評点の個体数は、評点４が２匹、評点５が２匹、評点６が１匹及び評点７が１匹であった。ＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン投与群（ＵＶ（＋）Ｄ−Ｍｅｔ）の各評点の個体数は、評点３が４匹、評点４が２匹及び評点５が１匹であった。以上の結果から、ＵＶ−Ｂ照射による紫外線障害によってシワ形成は顕著に増大するが、Ｄ−メチオニンはこのシワ形成を統計的に有意に軽減することが示された。

【実施例3】

【0054】

ヘアレスマウスを用いた紫外線障害によるシワ生成抑制試験（２）
方法
ＵＶ−Ｂ照射期間中、１０ｍＭのＬ−又はＤ−メチオニンが給水瓶にて投与された。紫外線照射及びシワ生成の判定は、実施例２で説明された方法で行なわれた。

【0055】

結果
図５に実施例２に準じる量のＵＶ−Ｂ照射によって生じるシワに対するＬ−及びＤ−メチオニンの効果を調べた実験の結果を示す。各実験条件の誤差棒は同一条件で６ないし８回繰り返した実験結果の測定値の標準偏差を示す。また、アステリスク（＊）はＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定でｐが０．５５％であることを示す。

【0056】

ＵＶ−Ｂ照射後の各評点の個体数は、ＵＶ−Ｂ非照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（−）ｃｏｎｔｒｏｌ）では評点２が６匹であった。ＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン非投与群（ＵＶ（＋）ｃｏｎｔｒｏｌ）の各評点の個体数は、評点５が１匹、評点６が２匹、評点７が２匹及び評点８が３匹であった。ＵＶ−Ｂ照射かつＤ−メチオニン投与群（ＵＶ（＋）Ｄ−Ｍｅｔ）の各評点の個体数は、評点５が６匹及び評点６が２匹であった。ＵＶ−Ｂ照射かつＬ−メチオニン投与群（ＵＶ（＋）Ｌ−Ｍｅｔ）の各評点の個体数は、評点４が１匹、評点５が２匹、評点６が２匹及び評点７が２匹であった。以上の結果から、ＵＶ−Ｂ照射による紫外線障害によってシワ形成は顕著に増大するが、Ｄ−メチオニンはこのシワ形成を統計的に有意に軽減することが示された。Ｌ−メチオニンは実施例１で示したようにＵＶ−Ａ照射による細胞死を軽減するが、ＵＶ−Ｂ照射によるシワ形成をＤ−メチオニンほど軽減しないことも示された。

【0057】

本発明にもとづいてメチオニンを含む、錠剤、ソフトカプセル、顆粒、ドリンク、キャンディー、クッキー、味噌、フレンチドレッシング、マヨネーズ、フランスパン、醤油、ふりかけ、ヨーグルト、調味料・納豆のたれ、納豆及びもろみ黒酢の配合例を以下に示す。以下の配合例におけるメチオニンは、Ｄ−体及び／又はＬ−体である。これらの配合例は例示を目的として列挙されるものであって本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。

【0058】

配合例１（錠剤）
（組成物） 配合量（ｍｇ／１錠中）
メチオニン ３６０．５
乳糖 １０２．４
カルボキシメチルセルロースカルシウム ２９．９
ヒドロキシプロピルセルロース ６．８
ステアリン酸マグネシウム ５．２
結晶セルロース １０．２

５１５．０

【0059】

配合例２（錠剤）
（組成物） 配合量（ｍｇ／１錠中）
ショ糖エステル ７０
結晶セルロース ７４
メチルセルロース ３６
グリセリン ２５
メチオニン ４７５
Ｎ−アセチルグルコサミン ２００
ヒアルロン酸 １５０
ビタミンＥ ３０
ビタミンＢ６ ２０
ビタミンＢ２ １０
α−リポ酸 ２０
コエンザイムＱ１０ ４０
セラミド（コンニャク抽出物） ５０
Ｌ−プロリン ３００

１５００

【0060】

配合例３（ソフトカプセル）
（組成物） 配合量（ｍｇ／１カプセル中）
食用大豆油 ５３０
トチュウエキス ５０
ニンジンエキス ５０
メチオニン １００
ローヤルゼリー ５０
マカ ３０
ＧＡＢＡ ３０
ミツロウ ６０
ゼラチン ３７５
グリセリン １２０
グリセリン脂肪酸エステル １０５

１５００

【0061】

配合例４（ソフトカプセル）
（組成物） 配合量（ｍｇ／１カプセル中）
玄米胚芽油 ６５９
メチオニン ５００
レスベラトロール １
ハス胚芽エキス １００
エラスチン １８０
ＤＮＡ ３０
葉酸 ３０

１５００

【0062】

配合例５（顆粒）
（組成物） 配合量（ｍｇ／１包中）
メチオニン ４００
ビタミンＣ １００
大豆イソフラボン ２５０
還元乳糖 ３００
大豆オリゴ糖 ３６
エリスリトール ３６
デキストリン ３０
香料 ２４
クエン酸 ２４

１２００

【0063】

配合例６（ドリンク）
（組成物） 配合量（ｇ／６０ｍＬ中）
トチュウエキス １．６
ニンジンエキス １．６
メチオニン １．６
還元麦芽糖水飴 ２８
エリスリトール ８
クエン酸 ２
香料 １．３
Ｎ−アセチルグルコサミン １
ヒアルロン酸Ｎａ ０．５
ビタミンＥ ０．３
ビタミンＢ６ ０．２
ビタミンＢ２ ０．１
α−リポ酸 ０．２
コエンザイムＱ１０ １．２
セラミド（コンニャク抽出物） ０．４
Ｌ−プロリン ２
精製水 残余

６０

【0064】

配合例７（キャンディー）
（組成物） 配合量（重量％）
砂糖 ５０
水飴 ４８
メチオニン １
香料 １

１００

【0065】

配合例８（クッキー）
（組成物） 配合量（重量％）
薄力粉 ４５．０
バター １７．５
グラニュー糖 ２０．０
メチオニン ４．０
卵 １２．５
香料 １．０

１００．０

【0066】

配合例８（クッキー）の製造方法
バターを撹拌しながらグラニュー糖を徐々に添加し、卵、メチオニン及び香料を添加して撹拌した。十分に混合した後、均一に振るった薄力粉を加えて低速で撹拌し、塊状で冷蔵庫で寝かせた。その後、成型し１７０°Ｃ１５分間焼成しクッキーとした。

【0067】

配合例９（味噌）
（組成物） 配合量（ｇ）
大豆 １０００
米麹 １０００
塩 ４２０
メチオニン １５８
水 残余

４０００

【0068】

配合例９（味噌）の製造方法
米こうじと塩とをよく混ぜ合わせる。洗浄した大豆を３倍量の水に一晩つけた後に水を切り、新しい水を加えながら煮込み、ざるにあける。煮汁（種水）を集め、メチオニンを１０％ｗ／ｖとなるように溶解する。煮あがった豆を直ちにすりつぶし、塩を混ぜた米麹を加えて、上記のメチオニンを溶解した種水を足しながら粘土程の固さになるまでむらなく混ぜ合わせる。団子状に丸めたものを桶に隙間のない様に隅々まで、しっかりと詰め込み、表面を平らにしてラップで覆い密封する。３箇月後に容器を移し変え、表面を平らにしてラップで覆う。なお、メチオニンを種水に加える代わりに、メチオニンを多く産生する米麹を用いてもよい。前記米麹を得るには、特開２００８−１８５５５８に記載の方法でメチオニンを定量することにより選抜することができる。また、市販の味噌にメチオニンまたはその塩を加えてもよい。

【0069】

配合例１０（フレンチドレッシング）
（組成物） 配合量（ｇ）
サラダ油 ２７．０
酢 ３０．０
塩化ナトリウム ０．９
メチオニン １．１
胡椒 １．０

６０．０

【0070】

配合例１０（フレンチドレッシング）の製造方法
酢に塩化ナトリウム及びメチオニンを加えた後に、よく攪拌して溶解する。サラダ油を加えて、よく攪拌し胡椒を加える。

【0071】

配合例１１（マヨネーズ）
（組成物） 配合量（ｇ）
サラダ油 １３４．０
酢 ５
塩化ナトリウム ０．９
メチオニン １
卵黄 １８
砂糖 ０．２
胡椒 ０．９

１６０．０

【0072】

配合例１１（マヨネーズ）の製造方法
卵黄（室温）に酢、塩化ナトリウム、メチオニン及び胡椒を加えて、泡立て器で十分に攪拌する。サラダ油を少しずつ加えながら攪拌を継続してエマルジョンにする。最後に砂糖を加えて攪拌する。

【0073】

配合例１２（フランスパン）
（組成物） 配合量（ｇ）
強力粉 １４０
薄力粉 ６０
塩化ナトリウム ３
砂糖 ６
メチオニン ２
ドライイースト ４
ぬるま湯 １２８

３４３

【0074】

配合例１２（フランスパン）の製造方法
ぬるま湯に砂糖１ｇ及びドライイーストを入れて予備発酵させる。強力粉、薄力粉、塩化ナトリウム、砂糖５ｇ及びメチオニンをボウルに入れ、その中に予備発酵させたイーストを入れる。十分捏ねた後に球状にして３０°Ｃで一次発酵させる。生地を再度捏ねてから休ませた後に適当な形に整形して電子発酵機を用いて最終発酵させる。クープを入れて２２０°Ｃのオーブンで３０分間焼く。

【0075】

配合例１３（醤油）
（組成物） 配合量（ｇ）
市販の醤油 ９８０
メチオニン ２０

１０００

【0076】

配合例１３（醤油）の製造方法
市販の醤油にメチオニンを加えてよく攪拌する。また、メチオニンやその塩を加える代わりに、メチオニンを多く産生する麹を用いて醤油を醸造してもよい。前記米麹を得るには、特開２００８−１８５５５８に記載の方法でメチオニンを定量することにより選抜することができる。また、市販の醤油にメチオニンまたはその塩を加えてもよい。

【0077】

配合例１４（ヨーグルト）
（組成物） 配合量（ｇ）
牛乳 ８８０
Ｌ．ブルガリカス菌 ５０
Ｓ．サーモフィルス菌 ５０
メチオニン ２０

１０００

【0078】

配合例１４（ヨーグルト）の製造方法
４０°Ｃ〜４５°Ｃで発酵させる。他の市販の種菌を用いてもよく、市販のヨーグルトにメチオニンを加えてもよい。また、メチオニンやその塩を加える代わりに、メチオニンを多く産生する菌を用いてもよい。前記菌を得るには、特開２００８−１８５５５８に記載の方法でメチオニンを定量することにより選抜することができる。また、市販のヨーグルトにメチオニンまたはその塩を加えてもよい。

【0079】

配合例１５（ふりかけ）
（組成物） 配合量（ｇ）
メチオニン ５０
のり １５
Ｌ−グルタミン酸Ｎａ １０
塩化ナトリウム ２
煎りごま １０
さば削り節 １０
砂糖 １
醤油 ２

１００

【0080】

配合例１６（調味料・納豆のたれ）
（組成物） 配合量（ｇ）
市販の納豆のたれ ９
メチオニン １

１０

【0081】

配合例１７（納豆）
（組成物） 配合量（ｇ）
市販の納豆 １９．９
メチオニン ０．１

２０

【0082】

配合例１７（納豆）の製造方法
メチオニン又はその塩を加える代わりに、メチオニンを多く産生する菌を用いて納豆を作ってもよい。前記菌を得るには、特開２００８−１８５５５８に記載の方法でメチオニンを定量することにより選抜することができる。また、市販の納豆にメチオニンまたはその塩を加えてもよい。

【0083】

配合例１８（もろみ黒酢）
（組成物） 配合量（ｇ）
市販のもろみ黒酢 ９００
メチオニン １００

１０００

【0084】

配合例１８（もろみ黒酢）の製造方法
メチオニン又はその塩を加える代わりに、メチオニンを多く産生する菌を用いて酢、黒酢、もろみを作ってもよい。前記菌を得るには、特開２００８−１８５５５８に記載の方法でメチオニンを定量することにより選抜することができる。また、市販のもろみ黒酢にメチオニンまたはその塩を加えてもよい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】