特許 5706669 融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、ＬＡＢの測定方法、並びに、ＬＡＢ測定用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5706669

(24)【登録日】2015年3月6日

(45)【発行日】2015年4月22日

(54)【発明の名称】融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、ＬＡＢの測定方法、並びに、ＬＡＢ測定用キット

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150402BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150402BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150402BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150402BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150402BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20150402BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20150402BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150402BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150402BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150402BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C07K14/47

   C07K16/18

   C07K19/00

   G01N33/53 W

   !C12P21/08

【請求項の数】13

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2010-251701(P2010-251701)

(22)【出願日】2010年11月10日

(65)【公開番号】特開2012-100585(P2012-100585A)

(43)【公開日】2012年5月31日

【審査請求日】2013年10月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】510094724

【氏名又は名称】独立行政法人国立循環器病研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100100480

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100135839

【弁理士】

【氏名又は名称】大南 匡史

(73)【特許権者】

【識別番号】512132170

【氏名又は名称】ＮＫメディコ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100480

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 隆

(72)【発明者】

【氏名】岩元 真

(72)【発明者】

【氏名】沢村 達也

【審査官】 松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特開平９−９８７８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Clin. Chem.，２０１０年 ４月，56, 4，p.550-558

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質に、ＡｐｏＢの全長又は部分断片が連結されてなる融合タンパク質。

【請求項2】

ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質は、ＬＯＸ−１に対する抗体である請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

ＬＯＸ−１に対する抗体は、抗体の機能的断片である請求項２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

抗体の機能的断片は、Ｆｖ型抗体である請求項３に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

ＬＯＸ−１に対する抗体は、その可変領域について、下記（ａ）と（ｂ）のいずれか一方又は両方を満たすものである請求項２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有するものである、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するものである。

【請求項6】

ＡｐｏＢの部分断片は、ヒトＡｐｏＢ４８におけるアミノ酸番号２８−９７の領域、アミノ酸番号４３２−５６６の領域、及びアミノ酸番号１０４９−１０５８の領域からなる群より選ばれた少なくとも１つの領域を含むものである請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。

【請求項8】

請求項７に記載の核酸が導入されたベクター。

【請求項9】

請求項８に記載のベクターを含む細胞。

【請求項10】

ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対してＬＡＢが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をＬＡＢの標準品として用い、当該標準品との比較により試料中のＬＡＢを測定するＬＡＢの測定方法。

【請求項11】

ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体のいずれか一方は、支持体に固定化されている請求項１０に記載のＬＡＢの測定方法。

【請求項12】

請求項１０又は１１に記載のＬＡＢの測定方法に用いるためのキットであって、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質を含むＬＡＢ測定用キット。

【請求項13】

ＬＯＸ−１及び／又は抗ＡｐｏＢ抗体をさらに含む請求項１２に記載のＬＡＢ測定用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）の測定方法、並びに、ＬＡＢ測定用キットに関し、さらに詳細には、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質にＡｐｏＢの全長又は部分断片が連結されてなる融合タンパク質、当該融合タンパク質をコードする核酸、当該核酸が導入されたベクター、当該ベクターを含む細胞、当該融合タンパク質を用いたＬＡＢの測定方法、並びに、当該融合タンパク質を含むＬＡＢ測定用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は所謂悪玉コレステロールと呼ばれるものであり、動脈硬化の発症と密接に関連しているといわれている。ＬＤＬは、アポリポタンパク質Ｂ（以下「ＡｐｏＢ」と称する。）と種々の脂質から構成されている。

【0003】

また、動脈硬化の重要な危険因子（リスクファクター）である高ＬＤＬコレステロール血症においては、ＬＤＬそのものではなく、酸化ＬＤＬ（oxidized LDL）がその生物活性を担っているといわれている（非特許文献１）。

【0004】

酸化ＬＤＬ受容体の一種として、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，以下「ＬＯＸ−１」と称する。）が見出されており、その機能解析が急速に進められている（非特許文献１）。ＬＯＸ−１は細胞膜一回貫通型の膜タンパク質であり、その詳細な構造はすでに明らかにされ、遺伝子もクローニングされている（特許文献１、非特許文献１）。また、血液中に可溶性ＬＯＸ−１（soluble LOX-1、以下「ｓＬＯＸ−１」と称することがある。）が存在することが知られている。

【0005】

最近、酸化ＬＤＬに代表されるＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）の濃度とｓＬＯＸ−１濃度との積で表される新しい指標「ＬＯＸインデックス」（LOX-1 Index）が、心血管障害（cardiovascular disease; ＣＶＤ）の将来の発症リスクを反映していることが明らかとなり、注目されている（非特許文献２、参考文献[４]）。ＬＡＢとは、ＬＯＸ−１に結合する活性をもつ生体内物質であってＡｐｏＢをその分子内に含むものである。ＬＡＢの代表例は酸化ＬＤＬである。

【0006】

ＬＯＸ−１インデックスの値を得るためには、血清中のＬＡＢ濃度とｓＬＯＸ−１濃度を測定する必要があるが、いずれもサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定系が確立されている。例えば、ＬＡＢは、固相化ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定することができる（非特許文献１，２）。このサンドイッチＥＬＩＳＡの系は、人工的に酸化処理したＬＤＬを強く認識するが、酸化処理をしていないＬＤＬにはほとんど反応しない。
このように、生体にはＬＯＸ−１に結合しかつ抗ＡｐｏＢ抗体で認識される脂質、すなわちＬＡＢが存在し、人工的に酸化したＬＤＬはＬＡＢにかなり近い性質を持っているといえる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特開平９−９８７８７号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】日薬理誌，第１１９巻，ｐ１４５−１５４，２００２年

【非特許文献2】クリニカル・ケミストリー（Clinical Chemistry），第５６巻，第４号，ｐ５５０−５５８，２０１０年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

しかし、本発明者らは前記サンドイッチＥＬＩＳＡによる血中ＬＡＢの測定を重ねる過程で、新たな課題を見出した。すなわち、サンドイッチＥＬＩＳＡによって血中ＬＡＢを測定する場合には、検量線を引くための標準品（標準物質、標準タンパク質）が必要である。上記ＬＡＢ測定において従来から用いられている標準品は、血清から超遠心分離によって得られたＬＤＬを、銅イオンの触媒下で人工的に酸化することにより作製されていた（以下、「人工酸化ＬＤＬ」と称することがある。）。ところが、このようにして作製された標準品（人工酸化ＬＤＬ）は、血漿から調製した脂質であるがゆえに、安定性が悪く、長期保存が難しい。また、その性質上、凍結保存に適していない。さらに、原料となる新鮮血漿を同一人物から大量に得ることは難しく、同一ロットの人工酸化ＬＤＬを大量に確保することは難しい。加えて、銅イオン触媒下での酸化反応の条件管理が難しく、ロット間のバラツキがさらに生じやすい。そのため、ＬＡＢの測定に携わる研究者は、標準品（人工酸化ＬＤＬ）の安定性を考慮して、標準品の調製後のできるだけ短期間にＬＡＢの測定を行わなければならかった。さらに、標準品のロット間差を常に考慮して精度管理を行う必要があった。

【0010】

上記現状に鑑み、本発明は、精度管理が容易で、確実かつ簡便にＬＡＢを測定する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは上記課題を解決するための方策について、鋭意検討を重ねた。その結果、ＬＯＸ−１に対する抗体（抗ＬＯＸ−１抗体）等のＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質とＡｐｏＢとを融合させた融合タンパク質が、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対して人工酸化ＬＤＬと同様の特異的結合性を示すことを見出した。さらに、当該融合タンパク質が安定性に優れており、かつ従来の人工酸化ＬＤＬに代わる新たな標準品として使用できることを見出した。これらの新しい知見に基づいて完成された本発明は、以下のとおりである。

【0012】

請求項１に記載の発明は、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質に、ＡｐｏＢの全長又は部分断片が連結されてなる融合タンパク質である。

【0013】

本発明は融合タンパク質（キメラタンパク質ともいう）に係るものであり、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質に、ＡｐｏＢの全長又は部分断片が連結されてなるものである。本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１に対する特異的結合性と、抗ＡｐｏＢ抗体に対する特異的結合性の両方を有しており、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対する特異的結合性に関して人工酸化ＬＤＬと同等の機能を備えている。本発明の融合タンパク質は、例えば、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイによるＬＡＢ測定において、従来の標準品（人工酸化ＬＤＬ）に代わる安定性に優れた新たな標準品として使用することができる。また、組換えＤＮＡ技術による大量生産が可能であり、同一ロットのＬＡＢ標準品を大量に提供することができる。

【0014】

ＬＡＢ（LOX-1 ligand containing ApoB）とは、ＬＯＸ−１に結合する活性をもつ生体内物質であってＡｐｏＢをその分子内に含むものを指す。ＬＡＢの代表例は酸化ＬＤＬであるが、結合活性があればそれに限定されない。ＬＡＢの詳細については、例えば、Kakutani M., et al., Biochem Biophys Res Commun. 2001 Mar 23;282(1):180-5.に記載されている。

【0015】

「ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質」の例としては、ＬＯＸ−１に対する抗体（抗ＬＯＸ−１抗体）、Ｃ反応性タンパク（C reactive protein；ＣＲＰ）、heat shock protein 70（ＨＳＰ７０）等が挙げられる。

【0016】

請求項１に記載の融合タンパク質において、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質は、ＬＯＸ−１に対する抗体である構成が好ましい（請求項２）。

【0017】

請求項３に記載の発明は、ＬＯＸ−１に対する抗体は、抗体の機能的断片である請求項２に記載の融合タンパク質である。

【0018】

本発明の融合タンパク質においては、ＬＯＸ−１に対する抗体が「抗体の機能的断片」であり、分子量が小さい。そのため、取扱いが容易であるとともに、組換えＤＮＡ技術による生産が容易である。

【0019】

請求項３に記載の融合タンパク質において、抗体の機能的断片はＦｖ型抗体であることが好ましい（請求項４）。

【0020】

請求項２〜４のいずれかに記載の融合タンパク質において、ＬＯＸ−１に対する抗体は、その可変領域について、下記（ａ）と（ｂ）のいずれか一方又は両方を満たす構成が好ましい（請求項５）。
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有するものである、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するものである。

【0021】

請求項６に記載の発明は、ＡｐｏＢの部分断片は、ヒトＡｐｏＢ４８におけるアミノ酸番号２８−９７の領域、アミノ酸番号４３２−５６６の領域、及びアミノ酸番号１０４９−１０５８の領域からなる群より選ばれた少なくとも１つの領域を含むものである請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質である。

【0022】

ヒトＡｐｏＢには２つのアイソフォームＡｐｏＢ４８とＡｐｏＢ１００がある。ヒトＡｐｏＢ４８は２１７９個のアミノ酸からなる。そして本発明の融合タンパク質は、ヒトＡｐｏＢ４８におけるアミノ酸番号２８−９７の領域、アミノ酸番号４３２−５６６の領域、及びアミノ酸番号１０４９−１０５８の領域からなる群より選ばれた少なくとも１つの領域を含むＡｐｏＢ部分断片を有している。本発明の融合タンパク質は、ＡｐｏＢの部分断片を有するものであるので、全体の分子量が小さい。そのため、取扱いが容易であるとともに、組換えＤＮＡ技術による生産が容易である。また、前記した３つの領域は、いずれも抗ＡｐｏＢ抗体のエピトープとして既に報告されており、かつ本発明者らがエピトープとしての機能を今回あらためて検証したものである。そのため、本発明の融合タンパク質は、抗ＡｐｏＢ抗体との結合性（反応性）を確実に発揮できる。

【0023】

請求項７に記載の発明は、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸である。

【0024】

請求項８に記載の発明は、請求項７に記載の核酸が導入されたベクターである。

【0025】

請求項９に記載の発明は、請求項８に記載のベクターを含む細胞である。

【0026】

本発明の核酸、ベクター、又は細胞を用いることにより、本発明の融合タンパク質を生産することができる。

【0027】

請求項１０に記載の発明は、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対してＬＡＢが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をＬＡＢの標準品として用い、当該標準品との比較により試料中のＬＡＢを測定するＬＡＢの測定方法である。

【0028】

本発明はＬＡＢの測定方法に係るものである。本発明のＬＡＢの測定方法は、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対してＬＡＢが有する特異的結合性を利用したものであり、本発明の融合タンパク質をＬＡＢの標準品として用い、当該標準品との比較により試料中のＬＡＢを測定する。すなわち、本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１に対する結合性と抗ＡｐｏＢ抗体に対する結合性を併せ持つので、人工酸化ＬＤＬの代替物質として使用可能である。さらに、本発明の融合タンパク質は、人工酸化ＬＤＬと比較して安定性に優れている。本発明のＬＡＢの測定方法は、人工酸化ＬＤＬを標準品として用いる従来の方法よりも精度管理が容易であり、ＬＡＢの測定を確実かつ容易に行うことができる。

【0029】

「ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対して酸化ＬＤＬが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法」の例としては、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたイムノアッセイ（サンドイッチ法、競合法など）が挙げられる。

【0030】

請求項１１に記載の発明は、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体のいずれか一方は、支持体に固定化されている請求項１０に記載の酸化ＬＤＬの測定方法である。

【0031】

かかる構成により、例えば、固相法によるイムノアッセイが可能となる。支持体の例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ等が挙げられる。

【0032】

請求項１２に記載の発明は、請求項１０又は１１に記載のＬＡＢの測定方法に用いるためのキットであって、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質を含む酸化ＬＤＬ測定用キットである。

【0033】

本発明はＬＡＢ測定用キットに係るものであり、本発明の融合タンパク質を含むものである。本発明のＬＡＢ測定用キットによれば、本発明の融合タンパク質をＬＡＢ標準品として使用することができるので、ＬＡＢ標準品を別途調製する必要がなく、簡便である。さらに、当該標準品たる融合タンパク質は安定性に優れているので、ＬＡＢ測定における精度管理が容易であり、ＬＡＢの測定を確実かつ容易に行うことができる。

【0034】

請求項１２に記載のＬＡＢ測定用キットにおいて、ＬＯＸ−１及び／又は抗ＡｐｏＢ抗体をさらに含む構成が好ましい（請求項１３）。

【発明の効果】

【0035】

本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイ等によるＬＡＢ測定において、従来の人工酸化ＬＤＬに代わる安定性に優れた新たな標準品として使用することができる。また、組換えＤＮＡ技術による大量生産が可能であり、同一ロットのＬＡＢ標準品を大量に提供することができる。

【0036】

本発明の核酸、ベクター、又は細胞を用いることにより、本発明の融合タンパク質を組換えＤＮＡ技術により生産することができる。

【0037】

本発明のＬＡＢの測定方法は、精度管理が容易であり、ＬＡＢの測定を確実かつ容易に行うことができる。

【0038】

本発明のＬＡＢ測定用キットによれば、ＬＡＢ測定の精度管理が容易であり、ＬＡＢの測定を確実かつ容易に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】抗ＬＯＸ−１抗体の可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３の位置を表す説明図であり、（ａ）は重鎖可変領域、（ｂ）は軽鎖可変領域を示す。

【図2】（ａ）と（ｂ）はいずれも本発明の融合タンパク質におけるＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢ部分との連結の一態様を示す説明図である。

【図3】ヒトＡｐｏＢ４８における４つのエピトープとそれらを含むＡｐｏＢ断片Ｂ１〜Ｂ４の関係を示す説明図である。

【図4】実施例で構築した発現ベクターと融合タンパク質の構造を示す説明図である。

【図5】融合タンパク質の構築過程の概要を示す説明図である。

【図6】マウス抗ＬＯＸ−１抗体のヒトＬＯＸ−１への反応性を調べたＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図7】Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体のヒトＬＯＸ−１への反応性を調べたＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図8】組換え細胞の培養上清に対するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図9】組換え細胞の細胞ライセートに対するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図10】ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体のＡｐｏＢ断片に対する反応性を調べたＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図11】融合タンパク質に対するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図12】融合タンパク質のヒトＬＯＸ−１に対する反応性を調べたＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図13】融合タンパク質のヒトＬＯＸ−１に対する反応性を調べたウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。

【図14】ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体の融合タンパク質に対する反応性を調べたＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図15】ヒトＬＯＸ−１とヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって融合タンパク質を測定した結果を示すグラフである。

【図16】人工酸化ＬＤＬのヒトＬＯＸ−１への反応性をロット間で比較したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図17】融合タンパク質のヒトＬＯＸ−１への反応性をロット間で比較したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0040】

本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質に、ＡｐｏＢの全長又は部分断片が連結されてなるものである。本発明の融合タンパク質は、「ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質」の部分（以下、「ＬＯＸ−１結合タンパク質部分」と称することがある。）と、「ＡｐｏＢの全長又は部分断片」の部分（以下、「ＡｐｏＢ部分」と称することがある。）を有する。

【0041】

ＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢの全長又は部分断片との連結様式としては、ペプチド結合を介した連結が代表的である。以下の説明では、ペプチド結合を介して連結された態様について説明する。なお、ペプチド結合以外の連結様式としては、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢの全長又は部分断片とを合成化学的手法により連結させたものが挙げられる。

【0042】

ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質としては、ＬＯＸ−１に対する抗体（抗ＬＯＸ−１抗体）が代表的である。すなわち、好ましい実施形態では、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質がＬＯＸ−１に対する抗体である。以下、本実施形態の融合タンパク質における「ＬＯＸ−１に対する抗体」の部分を「抗ＬＯＸ−１抗体部分」と称することがある。

【0043】

本実施形態におけるＬＯＸ−１に対する抗体（抗ＬＯＸ−１抗体）と抗ＬＯＸ−１抗体部分について説明する。なお、本発明において「抗体」という用語は、通常、「免疫グロブリン」に置き換えることができる。

【0044】

本実施形態の融合タンパク質における抗ＬＯＸ−１抗体部分を構成する抗体としては、ＬＯＸ−１に結合する抗体であれば特に限定はない。ここで、ＬＯＸ−１の由来としては特に限定はなく、ヒト、マウス、ウシなど全てのＬＯＸ−１が対象となり得る。また、抗ＬＯＸ−１抗体の由来としては特に限定はなく、所望のＬＯＸ−１に対して結合するものであれば全て対象となり得る。一例として、ヒトＬＯＸ−１に対して特異的に結合するマウス抗ＬＯＸ−１モノクローナル抗体＃１０−１（後述の実施例および参考文献［１］に記載）を挙げることができる。

【0045】

抗ＬＯＸ−１抗体部分を構成する抗体のクラス（アイソタイプ）も特に限定されない。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等、いずれのクラスであってもよい。さらに、抗体のサブクラスについても特に限定はなく、例えば、ＩｇＧであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等のいずれのサブクラスであってもよい。

【0046】

本実施形態において、「ＬＯＸ−１に対する抗体」には、全長の免疫グロブリンからなる抗体と、免疫グロブリン可変領域を含む「抗体の機能的断片」の両方が含まれる。ここで抗体の機能的断片とは、抗体の一部分であって抗体の抗原への作用を少なくとも１つ保持するものを指す。抗体の機能的断片の例としては、Ｖ_H、Ｖ_L、Ｆｖ（ｓｃＦｖ、Ｖ_H−Ｖ_Lと同義）、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ’）₂、等が挙げられる。さらに、これらの機能的断片と定常領域との連結体も、本発明における抗体の機能的断片として用いることができる。

【0047】

好ましい実施形態では、抗ＬＯＸ−１抗体部分がＦｖ型抗体である。Ｆｖ型抗体（ｓｃＦｖ、Ｖ_H−Ｖ_L）は重鎖可変領域（Ｖ_H）と軽鎖可変領域（Ｖ_L）とが連結されてなる抗体の機能的断片であり、分子量が比較的小さいため、取扱いが容易である。

【0048】

抗ＬＯＸ−１抗体の可変領域の遺伝子をクローニングすることにより、当該抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列、並びに、各鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定することができる。本実施形態の融合タンパク質における「抗ＬＯＸ−１抗体部分」を構成する抗体の、各可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲの例を、図１に示す。すなわち、本発明の融合タンパク質における１つの実施形態において、ＬＯＸ−１に対する抗体（抗ＬＯＸ−１抗体部分）は、その可変領域について、下記（ａ）と（ｂ）のいずれか一方又は両方を満たす。
（ａ）重鎖可変領域が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を有するものである、
（ｂ）軽鎖可変領域が、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を有するものである。

【0049】

上記した実施形態では「ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質」として抗ＬＯＸ−１抗体を採用しているが、本発明はこれに限定されるものではない。「ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するタンパク質」の他の例としては、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ＨＳＰ７０等が挙げられる。これらのタンパク質の場合も、ＬＯＸ−１に対して特異的に結合するものである限り、その全長のみならず部分断片であってもよく、アミノ酸置換等の変異が導入されたものであってもよい。

【0050】

次に、本発明の融合タンパク質における「ＡｐｏＢの全長又は部分断片」（ＡｐｏＢ部分）について説明する。

【0051】

ＡｐｏＢの由来としては特に限定はなく、ヒト、マウス、ウシなど全てのＡｐｏＢが対象となり得る。

【0052】

本発明の融合タンパク質におけるＡｐｏＢ部分は、「ＡｐｏＢの全長」と「ＡｐｏＢの部分断片」のいずれかで構成される。抗ＡｐｏＢ抗体に特異的に認識されるものである限り、いずれを用いてもよいが、取扱いの容易さの点では、分子量が小さいＡｐｏＢの部分断片が好ましく用いられる。

【0053】

ＡｐｏＢの部分断片としては、抗ＡｐｏＢ抗体に特異的に認識されるものであれば特に限定はない。１つの例として、ＡｐｏＢの既知のエピトープを含む部分断片を用いることができる。

【0054】

好ましい実施形態では、ＡｐｏＢ部分が、ヒトＡｐｏＢ４８におけるアミノ酸番号２８−９７の領域、アミノ酸番号４３２−５６６の領域、及びアミノ酸番号１０４９−１０５８の領域からなる群より選ばれた少なくとも１つの領域を含む。これらの領域は、ヒトＡｐｏＢ４８のエピトープとしてすでに報告されているものであり（参考文献［５］［６］）、かつ本発明者らが今回エピトープとしての機能を検証したものである。ＡｐｏＢ部分は、これらの領域の１つのみを含むものでもよいし、２つ以上を含むものでもよい。
ここで、ヒトＡｐｏＢ４８の遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列を、配列番号７と８に示す。さらに、アミノ酸番号２８−９７に相当する領域のアミノ酸配列を配列番号９に、アミノ酸番号４３２−５６６に相当する領域のアミノ酸配列を配列番号１０に、アミノ酸番号１０４９−１０５８に相当する領域のアミノ酸配列を配列番号１１に、それぞれ示す。

【0055】

本発明におけるＡｐｏＢには、ＡｐｏＢのアイソフォームが含まれる。例えば前述のとおり、ヒトＡｐｏＢにはＡｐｏＢ４８とＡｐｏＢ１００の２つのアイソフォームが知られている。本発明の融合タンパク質においては、ＡｐｏＢ部分として、ヒトＡｐｏＢ４８とヒトＡｐｏＢ１００の両方が採用可能である。

【0056】

本発明におけるＡｐｏＢには、天然に存在するＡｐｏＢ（ネイティブＡｐｏＢ）の他、アミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異が導入されているがネイティブＡｐｏＢと機能的に同等とみなせる変異型ＡｐｏＢも含まれる。すなわち、当該変異型ＡｐｏＢの全長と部分断片の両方が、本発明の融合タンパク質における「ＡｐｏＢ部分」を構成することができる。

【0057】

なお、本発明の融合タンパク質におけるＬＯＸ−１結合タンパク質部分（例えば、抗ＬＯＸ−１抗体部分）とＡｐｏＢ部分との連結の態様としては、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分のＣ末端とＡｐｏＢ部分のＮ末端とが連結された態様（図２（ａ））と、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分のＮ末端とＡｐｏＢ部分のＣ末端とが連結された態様（図２（ｂ））の両方が含まれる。また、スペーサー等の配列を介してＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢ部分とが間接的に連結されていてもよい。
さらに、本発明の融合タンパク質には、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢ部分以外のタンパク質やペプチドが含まれていてもよい。例えば、前記したスペーサーの様な介在配列の他、特定の機能等を持たせた配列をＮ末端やＣ末端に付加したり、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分とＡｐｏＢ部分の間に介在させてもよい。

【0058】

本発明の融合タンパク質は、例えば、当該融合タンパク質をコードする核酸を発現させることにより製造することができる。例えば、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分（例えば、抗ＬＯＸ−１抗体部分）をコードするＤＮＡと、ＡｐｏＢの全長又は部分断片をコードするＤＮＡを取得する。これらのＤＮＡは、既知の塩基配列情報を基にして、ＰＣＲ等の手法により容易に取得できる。化学合成により取得してもよい。
次に、ＬＯＸ−１結合タンパク質部分をコードするＤＮＡとＡｐｏＢの全長又は部分断片をコードするＤＮＡとをフレームが一致するように連結し、キメラ遺伝子（キメラ核酸）を作製する。当該キメラ遺伝子は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子となる。
次に、得られたキメラ遺伝子を適宜のベクターに組み込み、組換えベクター（融合タンパク質発現ベクター）を作製する。さらに、当該組換えベクターを適宜の宿主細胞に導入し、組換え細胞（融合タンパク質発現細胞）を作製する。
そして、当該組換え細胞を培養し、培養物から所望の融合タンパク質を取得することができる。

【0059】

前記キメラ遺伝子を組み込むベクターとしては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。また前記組換えベクターを導入する宿主細胞としては、導入されたベクターが機能するものであれば特に限定はない。例としては、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、酵母、細菌（大腸菌等）、植物細胞、昆虫細胞、などが挙げられる。

【0060】

融合タンパク質を精製する方法としては、遠心分離、塩析、膜分離、各種クロマトグラフィー等の、タンパク質精製に通常用いられている手法をそのまま適用することができる。特に、本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１に対する結合性と抗ＡｐｏＢ抗体に対する結合性を併せ持つので、ＬＯＸ−１や抗ＡｐｏＢ抗体を固定化した担体によるアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。

【0061】

続いて、本発明のＬＡＢの測定方法について説明する。本発明のＬＡＢの測定方法は、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対してＬＡＢが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法であって、上記した本発明の融合タンパク質をＬＡＢの標準品として用い、当該標準品との比較により試料中のＬＡＢを測定するものである。

【0062】

本発明のＬＡＢの測定方法では、ＬＡＢの標準品として本発明の融合タンパク質を用いる。すなわち、本発明の融合タンパク質は、ＬＯＸ−１に対する結合性と抗ＡｐｏＢ抗体に対する結合性を併せ持つので、人工酸化ＬＤＬの代替品として使用できる。さらに、本発明の融合タンパク質は安定性に優れているので、人工酸化ＬＤＬを標準品として用いる従来の方法よりも、精度管理が容易であり、ＬＡＢの測定を確実かつ容易に行うことができる。

【0063】

「ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対して酸化ＬＤＬが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法」の代表例として、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイを挙げることができる。例えば、ＬＯＸ−１をマイクロタイタープレート等の支持体に固相化する。そして、固相化したＬＯＸ−１に測定試料を接触させて、試料中のＬＡＢをＬＯＸ−１上に捕捉する。次に、捕捉されたＬＡＢに標識された抗ＡｐｏＢ抗体を結合させる。そして、結合した抗ＡｐｏＢ抗体を指標として、試料中のＬＡＢを測定することができる。
前記標識の種類としては、酵素（エンザイムイムノアッセイ、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、蛍光物質（蛍光イムノアッセイ、ＦＩＡ）、放射性物質（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）などが挙げられる。抗ＡｐｏＢ抗体は、標識と未標識のいずれでもよい。未標識の場合には、抗ＡｐｏＢ抗体に結合する標識２次抗体をさらに用いればよい。抗ＡｐｏＢ抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。

【0064】

前記サンドイッチイムノアッセイにおいて、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を逆に用いてもよい。すなわち、抗ＡｐｏＢ抗体を固相化し、ＬＯＸ−１を標識等して用いてもよい。

【0065】

ＬＯＸ−１あるいは抗ＡｐｏＢ抗体を固相化する支持体の例としては、マイクロタイタープレート、ビーズ等が挙げられる。

【0066】

「ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体に対して酸化ＬＤＬが有する特異的結合性を利用したＬＡＢの測定方法」の他の例としては、競合法によるイムノアッセイが挙げられる。

【0067】

精製されたＬＯＸ−１は、例えば、組換えＤＮＡ技術により取得することができる（特許文献１、非特許文献１）。抗ＡｐｏＢ抗体は、例えば、市販のものをそのまま使用することができる。

【0068】

本発明のＬＡＢの測定方法では、本発明の融合タンパク質をＬＡＢの標準品として用い、当該標準品との比較により試料中のＬＡＢを測定する。例えば、段階希釈した当該融合タンパク質の溶液を調製し、これらを前記サンドイッチイムノアッセイ等に供する。これにより得られた値（例えば、吸光度）を元に、融合タンパク質相当値によるＬＡＢ標準曲線を作成することができる。血清等の試料中のＬＡＢは、同様のサンドイッチイムノアッセイ等を行った際に得られた値を前記標準曲線に当てはめ、融合タンパク質相当量（相対値）として得ることができる。調製後すぐの人工酸化ＬＤＬ（未劣化）と融合タンパク質との相関性を別途調べて換算式を作成することにより、試料中のＬＡＢを絶対値で得ることもできる。

【0069】

本発明で使用する測定試料としては特に限定はないが、例えば、ヒトから採取した血清や血漿を挙げることができる。

【0070】

本発明のＬＡＢ測定用キットは、本発明のＬＡＢの測定方法に用いるためのものであり、上記融合タンパク質を含むものである。すなわち、本発明のキットによれば、融合タンパク質を標準品として用いるＬＡＢの測定を簡便に行うことができる。
好ましい実施形態では、ＬＯＸ−１及び／又は抗ＡｐｏＢ抗体をさらに含む。かかる構成により、前記したサンドイッチイムノアッセイ等を簡便に行うことができる。

【0071】

本発明のキットの構成例を以下に挙げる。本キットには、さらに、プレートやビーズ等の支持体（固相）、標識２次抗体、発色基質、等をさらに含めてもよい。

【0072】

〔キットの構成例〕
（ａ）ＬＯＸ−１（固相用）
（ｂ）抗ＡｐｏＢ抗体（標識又は未標識）
（ｃ）融合タンパク質（ＬＡＢ標準品）
（ｄ）希釈用緩衝液

【0073】

上述のように、ＬＡＢの代表例は酸化ＬＤＬである。したがって、本発明のＬＡＢの測定方法は、酸化ＬＤＬの測定方法を包含する。同様に、本発明のＬＡＢ測定用キットは、酸化ＬＤＬ測定用キットを包含する。

【0074】

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0075】

まず、実験方法を以下の（１）〜（９）に述べる。

【0076】

（１）マウス抗ＬＯＸ−１モノクローナル抗体
参考文献［１］に記載のマウス抗ＬＯＸ−１モノクローナル抗体＃１０−１を使用した。簡単に説明すると、ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸６１−２７３番（６１−２７３ａａ）の部分に対応する組換えタンパク質（組換えヒトＬＯＸ−１タンパク質；６１−２７３ａａ）（参考文献［２］に記載）を免疫したＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓細胞をミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合させた。陽性クローンをＥＬＩＳＡ法により選抜し、＃１０−１のクローンを得た。
抗体のアイソタイプをmouse monoclonal antibody isotyping test kit（エービーディー（ＡｂＤ）社）を用いて、添付の使用説明書に従って決定した。

【0077】

（２）抗体可変領域遺伝子のクローニング
上記（１）でクローニングした＃１０−１抗体産生ハイブリドーマから、TRIzol Reagent（インビトロジェン社）１ｍＬを用いて、全ＲＮＡを回収した。逆転写反応によるｃＤＮＡの合成は、回収した１μｇの全ＲＮＡからRandom hexamer（インビトロジェン社）およびSuper Script III Reverse Transcriptase（インビトロジェン社）を用いて、添付の使用説明書に従って行った。抗体可変領域重鎖（Ｖ_H）および軽鎖（Ｖ_L）領域は、合成したｃＤＮＡ０．５μｇを鋳型にIgG Primer set（ノバジェン社）のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ２５ｐｍｏｌ、10xEx-taq buffer５０μＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ４．０μＬ、Ex-taq polymerase （タカラバイオ社）１．５Ｕ、蒸留水３４．８μＬを加え、全量を５０μＬに調整した反応液により増幅した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で３分、続く３５サイクルを（９４℃で１分，５５℃で１分，７２℃で２分）で行い、最後の伸長を７２℃で６分により行った。増幅したＤＮＡ断片について、TOPO TA Cloning Kit（インビトロジェン社）を用いてサブクローニングし、ABI PRISM Cycle sequencing kit（アプライド・バイオシステムズ社）を用いてＶ_H遺伝子およびＶ_L遺伝子の塩基配列を決定した。

【0078】

（３）Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体の作製
＃１０−１抗体産生ハイブリドーマから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、Fv-H-Fプライマー（配列番号１７）とFv-H-Linker-Rプライマー（配列番号１８）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、＃１０−１抗体重鎖分泌シグナル配列を含むＶ_H遺伝子を増幅した。なお、Fv-H-Linker-Rプライマーはフレキシブルなリンカー配列(Gly₄-Ser)₃の一部を５’末端に含んでいる。同様に、＃１０−１抗体産生ハイブリドーマから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、Linker-Fv-L-Fプライマー（配列番号１９）とFv-L-Rプライマー（配列番号２０）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、Ｖ_L遺伝子を増幅した。
ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液は、各プライマーセットをそれぞれ１５ｐｍｏｌ用いて、ｃＤＮＡ ０．５ｎｇ、10×KOD plus buffer ver.2を５．０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３．０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５．０μＬ、KOD plus DNA polymerase（東洋紡社）を１．０Ｕ、蒸留水を３２．０μＬ加えて、全量を５０．０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３０サイクルを（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３０秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。

【0079】

続いて、増幅した各断片を、プライマーに挿入したリンカー配列を介してOverlap-extension PCRにより連結させて、Ｆｖ型抗体遺伝子を作製した。すなわち、Fv-H-Fプライマー（配列番号１７）とFv-L-Rプライマー（配列番号２０）のプライマーセットを用い、増幅したＶ_H遺伝子とＶ_L遺伝子をOverlap-extension PCRにより連結させた。ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液は、各プライマーセットをそれぞれ１５ｐｍｏｌ用いて、増幅したＶ_H遺伝子およびＶ_L遺伝子をそれぞれ０.２ｐｍｏｌ、10×KOD plus buffer ver.2を５.０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３.０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５.０μＬ、KOD plus DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３２.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３０サイクル（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で４５秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。
増幅したＦｖ型抗体遺伝子を、pcDNA Gateway Directional TOPO Expression kit（インビトロジェン社）を用いてpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vector（インビトロジェン社）にサブクローニングした。クローニング後、ABI PRISM Cycle sequencing kitを用いて塩基配列を確認した。

【0080】

その後、Ｆｖ型抗体遺伝子がサブクローニングされたpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vectorのMulti cloning site内に存在するNotIとXbaIの制限酵素サイトを用いて、Ｆｖ型抗体遺伝子を切り出した。切り出したＦｖ型抗体遺伝子を、pEF6/V5/His vector（インビトロジェン社）のMulti cloning site内の同一制限酵素サイトへＣ末端にV5および6xHistidin tag (His tag) が発現されるようにフレームをあわせてクローニングした。
Ｆｖ型抗体の発現は、FreeStyle 293 Expression system（インビトロジェン社）を用いて行った。Ｆｖ型抗体の精製は、TALON Metal Affinity Resins（タカラバイオ社）により行った。

【0081】

（４）ＡｐｏＢ４８遺伝子のクローニング
以下の手順により、ヒトＡｐｏＢ４８全長遺伝子（GenBank accession no. NM000384; 6,537 bp；配列番号７）を、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーよりＰＣＲ法により取得した。まず、ＡｐｏＢ４８全長遺伝子を４つの遺伝子断片Ｆ１〜Ｆ４（Ｆ１：１−１８６４ｂｐ、Ｆ２：１８０２−４００５ｂｐ、Ｆ３：３９７３−５２０７ｂｐ、Ｆ４：５１３７−６５３７ｂｐ）に分割するための、下記４組のプライマーセットを設計した。
Ｆ１用プライマーセット：ApoB-１-Fプライマー（配列番号２１）とApoB-1864-R（配列番号２２）、Ｆ２用プライマーセット：ApoB-1802-Fプライマー（配列番号２３）とApoB-４００５-Rプライマー（配列番号２４）、Ｆ３用プライマーセット：ApoB-3973-Fプライマー（配列番号２５）とApoB-5207-Rプライマー（配列番号２６）、Ｆ４用プライマーセット：ApoB-5137-Fプライマー（配列番号２７）とおよびApoB-6537-Rプライマー（配列番号２８）。
Human MTC Panel II（クロンテック社）の肝臓ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、各プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、Ｆ１〜Ｆ４の各遺伝子断片を得た。ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液はヒト肝臓ｃＤＮＡ ０.５μｇ、各プライマーセットをそれぞれ２５ｐｍｏｌ、10×KOD plus buffer ver.2を５.０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３.０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５.０μＬ、KOD plus DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３２.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３５サイクル（９４℃で１５秒、６２℃で３０秒、６８℃で９０秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。
次に、各遺伝子断片をpcDNA Gateway Directional TOPO Expression kitを用いてpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vectorにサブクローニングし、ABI PRISM Cycle sequencing kitにより塩基配列を確認した。

【0082】

続いて、pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vector内のNotIサイトおよびＡｐｏＢ遺伝子（配列番号７）塩基番号１８２１（１８２１ｂｐ）にあるEcoRVサイトを用いて、Ｆ１断片（１-１８６４ｂｐ）より１-１８２１ｂｐ領域を切り出し、同一酵素で処理したＦ２断片（１８０２-４００５ｂｐ）へ挿入し、ＡｐｏＢ遺伝子の１-４００５ｂｐ領域を作製した（１-４００５ｂｐ断片）。同様に、pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vector内のNotIサイトおよびＡｐｏＢ遺伝子５１６１ｂｐにあるSalIサイトを用いて、Ｆ３断片（３９７３-５２０７ｂｐ）より３９７３-５１６１ｂｐ領域を切り出し、同一酵素で処理したＦ４断片（５１３７-６５３７ｂｐ）へ挿入し、ＡｐｏＢ遺伝子の３９７３-６５３７ｂｐ領域を作製した（３９７３-６５３７ｂｐ断片）。最後に、pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vector内のNotIサイトおよびＡｐｏＢ遺伝子３９９５ｂｐにあるXhoIサイトを用いて、１-４００５ｂｐ断片と３９７３-６５３７ｂｐ断片を連結し、ヒトＡｐｏＢ４８全長遺伝子（１-６５３７ｂｐ）発現ベクターを作製した。最終産物について再度塩基配列を確認した。

【0083】

（５）ＡｐｏＢタンパク質断片の作製
ＡｐｏＢタンパク質断片Ｂ１〜Ｂ４をコードする遺伝子を増幅するために、下記４組のプライマーセットを設計した。なおＢ１〜Ｂ４の各領域は、ＡｐｏＢ４８タンパク質（全長）において抗ＡｐｏＢ抗体のエピトープとしてすでに報告がある４つの配列を含むよう選択したものである（図３、参考文献［５］［６］）。
Ｂ１遺伝子用プライマーセット：B１-Fプライマー（配列番号３８）およびB1-Rプライマー（配列番号３１）、Ｂ２遺伝子用プライマーセット：B2-Fプライマー（配列番号３９）およびB2-Rプライマー（配列番号３３）、Ｂ３遺伝子用プライマーセット：B3-Fプライマー（配列番号４０）およびB3-Rプライマー（配列番号３５）、Ｂ４遺伝子用プライマーセット：B4-Fプライマー（配列番号４１）およびB4-Rプライマー（配列番号３７）。
ＡｐｏＢ４８全長遺伝子発現ベクターを鋳型とし、各プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、Ｂ１〜Ｂ４をコードする各遺伝子を増幅した（図３）。ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液はＡｐｏＢ４８全長遺伝子発現ベクター５０ｎｇ、各プライマーセットをそれぞれ２５ｐｍｏｌ、10×Ex-taq bufferを５.０μＬ、２.５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ｍｉｘを４.０μＬ、Ex-taq DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３６.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３５サイクル（９４℃で１５秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒）で行い、最後の伸長を７２℃で７分により行った。
続いて、増幅した各遺伝子断片を、マウス抗体軽鎖分泌シグナル配列がＮ末端側に、Ｃ末端側にＶ５およびＨｉｓ ｔａｇが発現するようにフレームを合わせてpSecTag/FRT/V5-His-TOPO vector（インビトロジェン社）にTA cloningした。クローニング後、ABI PRISM Cycle sequencing kitを用いて塩基配列を確認した。
ＡｐｏＢタンパク質断片Ｂ１〜Ｂ４の発現はFreeStyle 293 Expression systemを用いて行った。培養９６時間後に上清および細胞ライセートを回収し、培養上清をTALON Metal Affinity Resinsにより精製し、ＡｐｏＢタンパク質断片Ｂ１〜Ｂ４を得た。Ｂ１〜Ｂ４は、ヒトＡｐｏＢ全長（配列番号８）における以下のアミノ酸番号に相当する領域である。Ｂ１：２８−２１７、Ｂ２：４２７−５９６、Ｂ３：９７７−１０６３、Ｂ４：１４６２−１５５２。

【0084】

（６）Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体とＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）との融合タンパク質の作製
Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体のＣ末端側とＡｐｏＢ断片のＮ末端側とがリンカー配列を介して連結された融合タンパク質（４種）を、以下の手順により作製した（図４）。

【0085】

上記（２）で作製したＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体発現ベクターを鋳型とし、Fv-H-Fプライマー（配列番号１７）および５’末端にリンカー配列の一部を含むFv-L-Linker-Rプライマー（配列番号２９）をプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体遺伝子を再増幅した。ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。鋳型５０ｎｇ、プライマーセットをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、10×KOD plus buffer ver.2を５.０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３.０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５.０μＬ、KOD plus DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３２.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３０サイクル（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で４５秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。

【0086】

また、上記（５）で調製したＡｐｏＢ４８全長遺伝子を鋳型とし、リンカー配列の一部を５'末端に含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーの各プライマーセット（下記４組）を用いてＰＣＲを行い、ＡｐｏＢ４８断片Ｂ１〜Ｂ４をコードする各遺伝子を増幅した。
リンカー付きＢ１遺伝子用プライマーセット：Linker-B1-Fプライマー（配列番号３０）およびB1-Rプライマー（配列番号３１）、リンカー付きＢ２遺伝子用プライマーセット：Linker-B2-Fプライマー（配列番号３２）およびB2-Rプライマー（配列番号３３）、リンカー付きＢ３遺伝子用プライマーセット：Linker-B3-Fプライマー（配列番号３４）およびB3-Rプライマー（配列番号３５）、リンカー付きＢ４遺伝子用プライマーセット：Linker-B4-Fプライマー（配列番号３６）およびB4-Rプライマー（配列番号３７）。
ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液は、鋳型５０ｎｇ、プライマーセットをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、10×KOD plus buffer ver.2を５.０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３.０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５.０μＬ、KOD plus DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３２.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクルは、始め９４℃で２分、続く３０サイクル（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３０秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。

【0087】

増幅したＦｖ型抗体遺伝子と各ＡｐｏＢ断片遺伝子を、Overlap-extension PCRにより連結させた。すなわち、フォワードプライマーとしてFv-H-Fプライマー（配列番号１７）、リバースプライマーとして、B1-Rプライマー（配列番号３１）、B2-Rプライマー（配列番号３３）、B3-Rプライマー（配列番号３５）またはB4-Rプライマー（配列番号３７）を用い、Ｆｖ型抗体遺伝子と各ＡｐｏＢ断片遺伝子を鋳型としてOverlap-extension PCRを行った。ＰＣＲの条件は以下のとおりとした。反応液は、Ｆｖ型抗体遺伝子と各ＡｐｏＢ断片遺伝子をそれぞれ０.２ｐｍｏｌ、プライマーセットをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、10×KOD plus buffer ver.2を５.０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄を３.０μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓを５.０μＬ、KOD plus DNA polymeraseを１.０Ｕ、蒸留水を３２.０μＬ加えて全量を５０.０μＬに調整し、ＰＣＲのサイクルは始め９４℃で２分、続く３０サイクル（９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で９０秒）で行い、最後の伸長を６８℃で２分により行った。

【0088】

増幅した４種類の「Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体−ＡｐｏＢ断片融合タンパク質」遺伝子を、pcDNA Gateway Directional TOPO Expression kitを用いてpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vectorにサブクローニングした。クローニング後、ABI PRISM Cycle sequencing kitを用いて塩基配列を確認した。その後、融合タンパク質遺伝子を、pcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO vectorのMulti cloning site内に存在するNotIとXbaIの制限酵素サイトを用いて切り出し、pEF6/V5/His vectorのMulti cloning site内の同一制限酵素サイトへ、Ｃ末端にＶ５および６×Ｈｉｓ ｔａｇが発現されるようにフレームをあわせてクローニングした（融合タンパク質発現ベクター、図４）。
４種の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）の発現は、FreeStyle 293 Expression systemを用いて行った。各融合タンパク質の精製は、TALON Metal Affinity Resinsを用いて行った。

【0089】

上記融合タンパク質の構築過程の概要を図５にまとめた。

【0090】

（７）ＥＬＩＳＡによる検討
マウス抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１のＩｇＧ型、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体、および４種の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）について、ＬＯＸ−１への反応性をＥＬＩＳＡにより調べた。また、抗ＡｐｏＢ抗体の、各ＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）および４種の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）への反応性を、ＥＬＩＳＡにより調べた。
抗ＬＯＸ−１抗体および融合タンパク質用抗原として、組換えヒトＬＯＸ−１（６１−２７３ａａ）およびＢＳＡ（陰性対照、シグマ社）を用いた。また、抗ＡｐｏＢ抗体用抗原として、ＡｐｏＢ断片（Ｂ１、Ｂ２）、融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）、ＡｐｏＢタンパク質（陽性対照，シグマ社）およびＢＳＡ（陰性対照）を用いた。

【0091】

組換えヒトＬＯＸ−１（６１−２７３ａａ）またはＢＳＡを含有するＰＢＳ３０μＬを、３８４−ウェルプレート（グライナー社）に４℃で終夜固相化した（０．２５μg抗原／ウェル）。各ウェルをＰＢＳにて２回洗浄後、２０％ Immunoblock（ＤＳファーマ社）含有ＰＢＳを５０μＬ添加し、室温で１時間ブロッキングした。

【0092】

各ウェルをＰＢＳにて３回洗浄後、５％ Immunoblock含有ＰＢＳにより０．００１〜１００μｇ／ｍＬに希釈したマウス抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１のＩｇＧ型、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体、又は４種の融合タンパク質を３０μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。

【0093】

各ウェルをＰＢＳにて３回洗浄後、５％ Immunoblock含有ＰＢＳにより希釈した二次抗体を３０μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。二次抗体としては、マウス抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１のＩｇＧ型検出用としてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Horseradish peroxidase (HRP)-labeled sheep anti-Mouse IgG (1:2000)；ＧＥヘルスケア社）を、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体および融合タンパク質検出用としてＨＲＰ標識マウス抗Ｖ５タグ抗体（HRP-labeled mouse anti-V５ tag (1:2000)；ナカライテスク社）を、それぞれ使用した。

【0094】

ＡｐｏＢ断片（Ｂ１、Ｂ２）、融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）、またはＡｐｏＢタンパク質を固相化した別のプレートについては、ブロッキング及びＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＡｐｏＢポリクローナル抗体（HRP-labeled sheep anti-human ApoB polyclonal antibody (Sheep polyclonal anti-ApoB antibody；バインディングサイト社）を５％Immunoblock含有ＰＢＳにより１００−６.０×１０⁸倍に段階希釈したものを５０μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。

【0095】

各ウェルをＰＢＳにて５回洗浄し、3,3'5,5'-tetramethylbenzidine含基質溶液（TMB solution；バイオラッド社）を各ウェルに添加し、室温で反応させた。２．０Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ：４５０ｎｍ）を測定した。

【0096】

（８）ウェスタンブロッティングによる検討
Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体および４種の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）について、ＬＯＸ−１への反応性をウェスタンブロッティングにより調べた。また、抗ＡｐｏＢ抗体の、各ＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）および４種の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）への反応性を、ウェスタンブロッティングにより調べた。抗ＬＯＸ−１抗体および融合タンパク質用抗原として、組換えヒトＬＯＸ−１タンパク質（６１−２７３ａａ）およびＢＳＡ（陰性対照）を用いた。また、抗ＡｐｏＢ抗体用抗原として、ＡｐｏＢ断片発現ＨＥＫ２９３細胞の培養上清および細胞ライセート、融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）、Ｆｖ型抗体、およびＢＳＡ（陰性対照）を用いた。

【0097】

各抗原について１０−２０％グラジエントポリアクリルアミドゲル（10-20% gradient polyacrylamide gel；和光純薬工業社）にて非還元条件で分離し、iBolt Dry Blotting system（インビトロジェン社）を用いてＰＶＤＦ膜へ転写を行った。
続いて、融合タンパク質の反応性検討に使用するＰＶＤＦ膜は１００％ブロックエース（ＤＳファーマ社）にて、抗ＡｐｏＢ抗体反応性検討用のＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク（森永乳業社）、０.１％Tween 20（ナカライテスク社）含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）にて、それぞれ室温１時間でブロッキングした。

【0098】

１次抗体としてＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体または融合タンパク質を用いる場合は、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1（東洋紡社）にて５μｇ／ｍＬに希釈した１次抗体液にＰＶＤＦ膜を浸漬させ、室温で１時間反応させた。続いて、Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2（東洋紡社）にて２０００倍希釈したHRP-labeled mouse anti-V5 tagからなる２次抗体液に浸漬し、室温で１時間反応させた。
１次抗体としてＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＡｐｏＢポリクローナル抗体を用いる場合は、５％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔにて５０００倍希釈し、室温で１時間反応させた。
融合タンパク質発現確認用抗体HRP-labeled mouse anti-V5 tagを用いる場合（陽性対照）は、５％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔにより２０００倍希釈して、室温で１時間反応させた。

【0099】

バンドの検出は、化学発光基質Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ミリポア社）を用いて添付の説明書に従って行い、LAS-4000 mini（ＧＥヘルスケア社）を用いてシグナルを現像した。

【0100】

（９）ＬＤＬ及び人工酸化ＬＤＬの作製
ＬＤＬおよび人工酸化ＬＤＬの作製は、参考文献［３］の方法に従って行った。すなわち、新鮮血漿（ｄ＝１.００６）を、健常者よりＥＤＴＡ採血した血液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心することで得た。次に、新鮮血漿にＫＢｒ（和光純薬工業社）を密度１.０１９となるように添加し、５８，０００ｒｐｍで２０時間超遠心した後に下層を回収した。さらに、回収した分画にＫＢｒを密度１.０６３となるように添加し、５８，０００ｒｐｍで２０時間超遠心した後に上層を回収し、１００００倍量のＰＢＳに対して透析を行い、ＬＤＬを得た。ＬＤＬの酸化修飾は、３ｍｇ／ｍＬに調整したＬＤＬに最終濃度７.５μＭ ＣｕＳＯ₄を加え３７℃ で１６時間反応させた後、１００００倍量のLDL buffer（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０.２４ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７.４）に対して透析することで作製した（人工酸化ＬＤＬ）。酸化の程度は、チオバルビツール酸反応産生物の量およびアガロースゲルの移動度を測定することによって測定した。使用するまで４℃で保存した。

【0101】

（１０）サンドイッチＥＬＩＳＡ
ＬＯＸ−１および抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡは、参考文献［２］と［４］に記載の方法にて行った。まず、組換えヒトＬＯＸ−１（６１−２７３ａａ）含有ＰＢＳ５０μＬを、３８４−ウェルプレート（グライナー社）に４℃で終夜固相化した（０.２５μg／ウェル）。ＰＢＳで２回洗浄した後、３％ＢＳＡ含有ＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７.４）８０μＬを添加し、室温で２時間ブロッキングした。
ＰＢＳで３回洗浄後、測定試料（または標準品）４０μＬを添加し、室温で２時間インキュベートした。測定試料（または標準品）としては、２ｍＭ ＥＤＴＡ，５％ＢＳＡ含有ＨＥＰＥＳバッファーにて希釈した４種類の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）、人工酸化ＬＤＬ（上記（８）で調製）、又はＬＤＬ（上記（８）で調製）を用いた。

【0102】

ＰＢＳで３回洗浄した後、２ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＢＳＡ含有ＨＥＰＥＳバッファーにて５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体を５０μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。
抗体反応後ＰＢＳで５回洗浄し、TMB solutionをプレートに添加し室温で反応させた。２Ｍ硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0103】

実験結果を以下の（１０）〜（１９）に述べる。

【0104】

（１１）マウス抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１のＬＯＸ−１への反応性
上記（７）において、組換えヒトＬＯＸ−１（６１−２７３ａａ）あるいはＢＳＡを固相化したＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。図中、●はＬＯＸ−１を、○はＢＳＡを固相化した場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。すなわち、抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１は、組換えヒトＬＯＸ−１に対して抗体濃度１５ｎｇ／ｍＬ〜３３μｇ／ｍＬの範囲で用量依存的（dose-dependent）に反応性を示した。一方、抗体濃度２ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲では、陰性対照のＢＳＡへの反応性を示さなかった。
また、マウス抗ＬＯＸ−１抗体＃１０−１のアイソタイプは、ＩｇＧ₁，κであった。

【0105】

（１２）可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲの特定
＃１０−１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３を図１（ａ）に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列とＣＤＲ１〜３を図１（ｂ）に、それぞれ示す。さらに、＃１０−１抗体の重鎖可変領域のｃＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１３と配列番号１４に、重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号１に、重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号２に、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３に、それぞれ示す。さらに、＃１０−１抗体の軽鎖可変領域のｃＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１５と配列番号１６に、軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号４に、軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号５に、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号６に、それぞれ示す。

【0106】

（１３）Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体のＬＯＸ−１への反応性
上記（３）で構築したＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体を用いた場合の、組換えヒトＬＯＸ−１（６１−２７３ａａ）あるいはＢＳＡを固相化したＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。図中、●はＬＯＸ−１を、○はＢＳＡを固相化した場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。すなわち、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体は、組換えヒトＬＯＸ−１に対して抗体濃度４６ｎｇ／ｍＬ〜３３μｇ／ｍＬの範囲で用量依存的に反応性を示した。一方、抗体濃度２ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲では、陰性対照のＢＳＡへの反応性を示さなかった。
以上より、当該Ｆｖ型抗体がＬＯＸ−１結合タンパクとして利用可能であると考えられた。

【0107】

（１４）ＡｐｏＢ断片の作製
上記（４）、（５）のように、抗ＡｐｏＢ抗体結合タンパクを作製することを目的として、４つのＡｐｏＢタンパク断片（Ｂ１−Ｂ４）に相当するｃＤＮＡをクローニングし（図３）、Ｂ１−Ｂ４の各断片を組換えタンパクとして作製した。各断片はＨＥＫ２９３細胞で発現させ、回収した培養上清及び細胞ライセート中の組換えタンパクの発現を、抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロッティング（上記（８））により検討した。
その結果、Ｂ１断片の約３５ｋＤａのバンドとＢ２断片の約２３ｋＤａのバンドが、培養上清（図８下段）および細胞ライセート（図９下段）ともに確認された。一方、Ｂ３断片の約１８ｋＤａのバンドとＢ４断片の約１８ｋＤａのバンドは、いずれも細胞ライセートに確認されたが（図９下段）、培養上清中には見られなかった（図８下段）。

【0108】

（１５）抗ＡｐｏＢ抗体のＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）への反応性
ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体のＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）への反応性を、ウェスタンブロッティングとＥＬＩＳＡにより検討した。
ウェスタンブロッティングの結果、培養上清中のＢ２断片および細胞ライセート中のＢ２断片およびＢ３断片に反応性を示した（図８上段、図９上段）。

【0109】

ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示す。図中、●はＢ１断片を、▲はＢ２断片、○は全長ＡｐｏＢ（陽性対照）、△はＢＳＡ（陰性対照）の場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。
Ｈｉｓ−ｔａｇにより培養上清から精製したＢ１断片およびＢ２断片を用いてＥＬＩＳＡを行うと、ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体は、Ｂ２断片に対して抗体希釈倍率１．０×１０²〜８．１×１０³倍の範囲において、Ｂ１断片に対して抗体希釈倍率１．０×１０²〜９．０×１０²倍の範囲において、陽性対照の全長ＡｐｏＢには抗体希釈倍率１．０×１０²〜７．３×１０⁴倍の範囲においてそれぞれ用量依存的に反応性を示した。一方、陰性対照のＢＳＡには抗体希釈倍率１．０×１０²〜５．９×１０⁶倍の範囲では反応性を示さなかった。

【0110】

以上より、抗ＡｐｏＢ抗体結合タンパク質として使用可能なＡｐｏＢタンパク断片を作製できた。

【0111】

（１６）Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体とＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）との融合タンパク質の作製
上記（６）のように、ＬＯＸ−１リガンド測定系における人工酸化ＬＤＬ標準品（ヒト血漿から調製）の代替品の取得を目的として、Ｆｖ型抗ＬＯＸ−１抗体とＡｐｏＢ断片（Ｂ１〜Ｂ４）との融合タンパク質を作製した（図５）。作製した４種類の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）の発現を、抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検討した。その結果、作製した融合タンパク質のうちＦｖ−Ｂ１は約６３ｋＤａ付近、Ｆｖ−Ｂ２は約６０ｋＤａ付近、Ｆｖ−Ｂ３は約６６ｋＤａ付近、Ｆｖ−Ｂ５は約６０ｋＤａ付近に、バンドが確認された（図１１）。

【0112】

（１７）各融合タンパク質のＬＯＸ−１への反応性
４種類の融合タンパク質（Ｆｖ−Ｂ１、Ｆｖ−Ｂ２、Ｆｖ−Ｂ３、Ｆｖ−Ｂ４）のＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体部分がＬＯＸ−１への結合活性を保持しているかを調べるために、ＬＯＸ−１および抗Ｖ５抗体を用いたＥＬＩＳＡとウェスタンブロッティングを行った。

【0113】

ＥＬＩＳＡの結果を図１２に示す。図中、●はＦｖ−Ｂ１，▲はＦｖ−Ｂ２、○はＦｖ−Ｂ３、△はＦｖ−Ｂ４、□はＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体（Ｆｖ型抗体と略す）の場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。
すなわち、Ｆｖ−Ｂ１およびＦｖ−Ｂ３では、融合タンパク質添加量４５ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲においてＦｖ型抗ＬＯＸ−１抗体とほぼ同等の用量反応曲線が得られた。一方、Ｆｖ−Ｂ２およびＦｖ−Ｂ４では、融合タンパク質添加濃度１．２μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲においてＬＯＸ−１に対して用量依存的に反応性を示したが、４パラメーターロジスティック解析により得られた変曲点に対応するタンパク濃度は、Ｆｖ−Ｂ２は８０．９μｇ／ｍＬ、Ｆｖ−Ｂ４は２０．６μｇ／ｍＬであり、Ｆｖ型抗体（２．９１μｇ／ｍＬ）と比較してそれぞれ約２７倍、約７倍高かった。このＦｖ−Ｂ２およびＦｖ−Ｂ４のＬＯＸ−１結合能の低下は、融合させたＡｐｏＢ断片の立体障害により、Ｆｖ型抗体部分のＬＯＸ−１への結合を一部抑制している可能性が考えられる。
また、Ｆｖ型抗体および４種類の融合タンパク質は、陰性対照のＢＳＡには抗体添加濃度１．６ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲において反応性を示さなかった。

【0114】

ウェスタンブロッティングの結果では、ＥＬＩＳＡの結果と対応してＦｖ−Ｂ１およびＦｖ−Ｂ３がＦｖ型抗体と同等の反応性を示し、Ｆｖ−Ｂ２およびＦｖ−Ｂ４ではＦｖ型抗体と比較して弱い反応性であった（図１３）。

【0115】

（１８）抗ＡｐｏＢ抗体の各融合タンパク質への反応性
本実施例で使用した抗ＡｐｏＢ抗体が、ＡｐｏＢ断片単体と同様に融合タンパク質を認識するか否かについて、ウェスタンブロッティングとＥＬＩＳＡにより検討した。

【0116】

ウェスタンブロッティングの結果、ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体は、Ｆｖ−Ｂ２およびＦｖ−Ｂ３に強く反応性を示し、Ｆｖ−Ｂ１には弱く反応性を示し、Ｆｖ−Ｂ４、Ｆｖ型抗体およびＢＳＡには反応性を示さなかった （図１１上段）。図１１下段は陽性対照である。

【0117】

ＥＬＩＳＡの結果を図１４に示す。図中、●はＦｖ−Ｂ１、▲はＦｖ−Ｂ２、○はＦｖ−Ｂ３、△はＦｖ−Ｂ４、□はＢＳＡ（陰性対照）を固相化した場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。
すなわち、ヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体は、Ｆｖ−Ｂ３に対して抗体希釈倍率１．０×１０²〜７．３×１０⁴倍の範囲において、Ｆｖ−Ｂ１およびＦｖ−Ｂ２に対して１．０×１０²〜８．１×１０³倍において、１．０×１０²〜２．７×１０³倍の範囲においてそれぞれ用量依存的に反応性を示し、陰性対照のＢＳＡには反応性を示さなかった。
以上の結果より、本実施例で作製した融合タンパク質は、抗ＡｐｏＢ抗体により検出可能であると考えられた。

【0118】

（１９）各融合タンパク質に対するＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ
ＬＯＸ−１リガンド測定系の標準タンパク質としての、本実施例で作製した融合タンパク質の適用可能性について、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（上記（１０））により検討した。
結果を図１５に示す。図中、●はＦｖ−Ｂ１、▲はＦｖ−Ｂ２，○はＦｖ−Ｂ３、△はＦｖ−Ｂ４の場合をそれぞれ示す。値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。
すなわち、Ｆｖ−Ｂ２の添加濃度１．２３μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、Ｆｖ−Ｂ３の添加濃度０．１４μｇ／ｍＬ〜３３．３μｇ／ｍＬにおいてそれぞれ用量依存的に検出可能であった。一方、Ｆｖ−Ｂ１に対しても添加濃度１．２３μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬにおいて用量依存的に検出したが、Ｆｖ−Ｂ２と比較して最大反応はＯＤ４５０で約３倍低かった。またＦｖ−Ｂ４の添加濃度１５ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの範囲においては反応性を示さなかった。
抗ＡｐｏＢ抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングによる融合タンパク質への反応性検討の結果と一致していることから（図１２，図１４）、ＬＯＸ−１に結合している融合タンパク質は、抗ＡｐｏＢ抗体によって特異的に検出可能であり、人工酸化ＬＤＬの代わりとしてＬＯＸ−１リガンド測定系（ＬＡＢ測定）の標準タンパク（標準品）として利用できると考えられた。

【0119】

（２０）ロット間のバラツキ評価（融合タンパク質、酸化ＬＤＬ）
ヒト血漿より人工的に調製した酸化ＬＤＬ（人工酸化ＬＤＬ）について、ロットの違いにより標準曲線がどの程度変化し、それにより測定値にどの程度影響するかを、ＬＯＸ−１と抗ＡｐｏＢ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（上記（１０））により検討した。また、本実施例で作製した融合タンパク質Ｆｖ−Ｂ３におけるロット間のバラツキを比較することで、融合タンパク質の有用性を検証した。

【0120】

結果を図１６と図１７に示す。図中の値は三つの独立した実験の平均とＳＥＭを示す。
すなわち、組換えＬＯＸ−１およびヒツジ抗ＡｐｏＢポリクローナル抗体の組合せによる検出系において、人工酸化ＬＤＬ（ＯｘＬＤＬ）は図１６に示すように４つの異なるロットにおいてＬＯＸ−１への反応性に差が見られた。この結果をもとに４パラメーターロジスティック解析を行い得られた変曲点に対応するタンパク濃度は、人工酸化ＬＤＬのロット１では３８．６μｇ／ｍＬ、ロット２では１７．７μｇ／ｍＬ、ロット３では８．８１μｇ／ｍＬ、８．３４μｇ／ｍＬであり、最大４．６倍の差があった。
一方、融合タンパク質Ｆｖ−Ｂ３では図１７に示すように異なるロット間において、４パラメーターロジスティック解析により得られた変曲点に対応するタンパク濃度は、ロット１では２．１７μｇ／ｍＬであり、ロット２では１．９８μｇ／ｍＬであり、約１．１倍の差に収まった。

【0121】

〔参考文献〕
［１］Sugimoto, K., et al., LOX-1-MT1-MMP axis is crucial for RhoA and Rac1 activation induced by oxidized low-density lipoprotein in endothelial cells. Cardiovasc Res, 2009.
［２］Sato, Y., et al., Determination of LOX-1-ligand activity in mouse plasma with a chicken monoclonal antibody for ApoB. Atherosclerosis, 2008. 200(2): p. 303-9.
［３］Sawamura, T., et al., An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein. Nature, 1997. 386(6620): p. 73-7.
［４］Inoue, N., et al., LOX Index, a Novel Predictive Biochemical Marker for Coronary Heart Disease and Stroke. Clin Chem, 2010.（非特許文献２）
［５］Segrest, J.P., et al., Structure of apolipoprotein B-100 in low density lipoproteins. J Lipid Res, 2001. 42(9): p. 1346-67.
［６］Pease, R.J., et al., Use of bacterial expression cloning to localize the epitopes for a series of monoclonal antibodies against apolipoprotein B100. J Biol Chem, 1990. 265(1): p. 553-68.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図10】

【図12】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図8】

【図9】

【図11】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]