特許 5709061 ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する抗体組成物を含む医薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5709061

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年4月30日

(54)【発明の名称】ヒトＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する抗体組成物を含む医薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20150409BHJP

   A61K 31/454 20060101ALI20150409BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150409BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20150409BHJP

   C07K 16/32 20060101ALN20150409BHJP

   C12N 15/02 20060101ALN20150409BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150409BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150409BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 TZNA

   A61K31/454

   A61P35/00

   C07K16/28

   !C07K16/32

   !C12N15/00 C

   !C12P21/08

   !C12N15/00 A

【請求項の数】17

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2011-530880(P2011-530880)

(86)(22)【出願日】2010年9月9日

(86)【国際出願番号】JP2010065566

(87)【国際公開番号】WO2011030841

(87)【国際公開日】20110317

【審査請求日】2013年8月26日

(31)【優先権主張番号】61/241,558

(32)【優先日】2009年9月11日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】特願2009-209218(P2009-209218)

(32)【優先日】2009年9月10日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001029

【氏名又は名称】協和発酵キリン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100105474

【弁理士】

【氏名又は名称】本多 弘徳

(74)【代理人】

【識別番号】100108589

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100129160

【弁理士】

【氏名又は名称】古館 久丹子

(72)【発明者】

【氏名】石井 俊彦

(72)【発明者】

【氏名】浅野 美代子

【審査官】 吉田 佳代子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００５／０５３７４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０３／０１８６３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０１９３７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０５８０２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 WU L, et al.，Lenalidomide Enhancement of NK Cell-MediatedAntibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) Is Mediated by GranzymeB and FasL and Is Associated with Modification of SHIP-1, PLC-g2 and pERKand Enhanced Chemokine Production，Blood (ASH Annual Meeting Abstracts)[online]，２００７年，Vol.110, No 11, Part 2，p.296B(Abstract 4885)，[retrieved on 2010.10.26] Retrieved from the Internet:<URL: http://abstracts.hematologylibrary.org/cgi/content/abstract/ashmtg;110/11/4885?maxtoshow=&hits=10&RESULTFORMAT=1&author1=Wu%2C+L&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&andorexactfulltext=and&searchid=1&FIRSTINDEX=0&sortspec=relevance&fdate=11/1/2007&tdate=11/30/2007&resourcetype=HWCIT>

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−４５／０８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＣケモカイン受容体４（以下、ＣＣＲ４とも称す）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体であって、配列番号５、６および７で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖可変領域の相補性決定領域（以下、ＣＤＲとも称す）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体と、レナリドマイドとを含むＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項2】

ヒトＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体であって、配列番号５、６および７で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖可変領域の相補性決定領域（以下、ＣＤＲとも称す）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む抗体と、レナリドマイドとを併用して投与するためのＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項3】

前記併用して投与するための医薬が、同時に又は逐次的に投与するための医薬である請求項２に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項4】

前記医薬が、抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項１に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項5】

前記医薬が、抗腫瘍剤であることを特徴とする請求項２または３に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項6】

前記Ｔ細胞リンパ腫がＣＣＲ４を発現している腫瘍である請求項４に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項7】

前記Ｔ細胞リンパ腫がＣＣＲ４を発現している腫瘍である請求項５に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項8】

前記Ｔ細胞リンパ腫が、成熟Ｔ細胞腫瘍、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、セザリー症候群、節外性ＮＫ／Ｔ細胞、リンパ腫（鼻型）、菌状息肉腫、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、腸炎型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫、血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（非特定）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＫ ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ＡＬＫ ｎｅｇａｔｉｖｅ）、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫から選ばれる少なくとも一つの腫瘍である請求項６に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項9】

前記Ｔ細胞リンパ腫が、成熟Ｔ細胞腫瘍、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、セザリー症候群、節外性ＮＫ／Ｔ細胞、リンパ腫（鼻型）、菌状息肉腫、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、腸炎型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫、血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（非特定）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＫ ｐｏｓｉｔｉｖｅ、ＡＬＫ ｎｅｇａｔｉｖｅ）、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫から選ばれる少なくとも一つの腫瘍である請求項７に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項10】

前記遺伝子組換え抗体が、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体である請求項１、４、６、８のいずれか１項に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項11】

前記遺伝子組換え抗体が、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体である請求項２、３、５、７、９のいずれか１項に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項12】

前記遺伝子組換え抗体がヒト化抗体である請求項１、４、６、８、１０のいずれか１項に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項13】

前記遺伝子組換え抗体がヒト化抗体である請求項２、３、５、７、９、１１のいずれか１項に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項14】

前記ヒト化抗体が抗体分子の重鎖可変領域が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含
み、かつ、抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト化
抗体である、請求項１２に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項15】

前記ヒト化抗体が抗体分子の重鎖可変領域が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含
み、かつ、抗体分子の軽鎖可変領域が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト化
抗体である、請求項１３に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項16】

前記ヒト化抗体と、改良型ＬＳＧ１５療法とを同時に又は逐次的に投与することを特徴
とする、請求項１４に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【請求項17】

前記ヒト化抗体と、改良型ＬＳＧ１５療法とを同時に又は逐次的に投与することを特徴
とする、請求項１５に記載のＴ細胞リンパ腫の医薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトＣＣケモカイン受容体４（以下、ＣＣＲ４とも称す）に特異的に結合する抗体組成物と、少なくとも１種類の薬剤を含む医薬に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞性リンパ腫の予後は非常に悪く、十分な薬効を示す治療薬も存在しない。ヒトＣＣケモカイン受容体４は、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫などを含む、ある種のＴ細胞性リンパ腫に発現することが知られている（非特許文献１、２）。したがって、ＣＣＲ４に特異的に結合する抗体組成物を含む医薬は、ＣＣＲ４を発現するＴ細胞性腫瘍に対する有効な医薬となりうる（特許文献１、２、３）。

【0003】

レナリドマイドは多発性骨髄腫に対する標準治療薬であるが、適応拡大に向けてＴ細胞性リンパ腫を含む疾患で臨床試験が行われている（非特許文献３）。レナリドマイドは、免疫活性化能を有する、いわゆる免疫調整剤であり（非特許文献４）、実際にＮＫ細胞を活性化することにより抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体等の抗体医薬のＡＤＣＣを増強することが知られている（非特許文献５、６）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第０１／６４７５４号

【特許文献2】国際公開第０３／１８６３５号

【特許文献3】国際公開第２００５／０５７３４１号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ． ９， ｐ３６２５， ２００３

【非特許文献2】Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ｖｏｌ．１１９， ｐ１４０５， ２００２

【非特許文献3】Ｃｌｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｍｙｅｌｏｍａ． Ｓｕｐｐｌ ５， Ｓ１８７， ２００８

【非特許文献4】Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ｖｏｌ．２６， ｐ１５４４， ２００８

【非特許文献5】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ｖｏｌ． １１， ｐ５９８４， ２００５

【非特許文献6】Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． ｖｏｌ． １４４， ｐ８４８， ２００９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、ＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤を含む医薬、およびＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬を提供することである。しかし、臨床においては、レナリドマイドと抗体医薬との併用療法は未だ認可されていない。また、Ｔ細胞性リンパ腫における抗ＣＣＲ４抗体とレナリドマイドとの併用効果についての報告は無い。

【課題を解決するための手段】

【0007】

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１０）に関する。
（１） ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と、レナリドマイドを含む医薬。
（２） ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と、レナリドマイドを併用して投与するための医薬。
（３） 併用して投与するための医薬が、同時に又は逐次的に投与するための医薬である前記（２）に記載の医薬。
（４） 医薬が、抗腫瘍剤であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の医薬。
（５） 腫瘍がＣＣＲ４を発現している腫瘍である前記（４）に記載の医薬。
（６） ＣＣＲ４を発現している腫瘍がＴ細胞リンパ腫である前記（５）に記載の医薬。
（７） 遺伝子組換え抗体が、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗体である前記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の医薬。
（８） 遺伝子組換え抗体がヒト化抗体である前記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の医薬。
（９） ヒト化抗体がそれぞれ配列番号５、６および７で示されるアミノ酸配列からなる抗体分子重鎖（以下、Ｈ鎖とも称す）可変領域（以下、Ｖ領域とも称す）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲとも称す）１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、並びにそれぞれ配列番号８、９および１０で示されるアミノ酸配列からなる抗体軽鎖（以下、Ｌ鎖とも称す）Ｖ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記（８）に記載の医薬。
（１０） ヒト化抗体の抗体分子のＨ鎖Ｖ領域が、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体分子のＬ鎖Ｖ領域が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む前記（９）に記載の医薬。

【発明の効果】

【0008】

本発明により、ＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤とを組み合わせてなる医薬を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１はＳＣＩＤマウスに移植したＨＨ細胞に対するＣＣＲ４抗体とレナリドマイドとの併用効果を示す。縦軸はＶ／Ｖ０の値を表す。横軸は日数を表す。●は陰性対照群、□はＫＭ８７６０単独投与群、▲はレナリドマイド単独投与群、×はＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与群のＶ／Ｖ０の平均値をそれぞれ示す。

【図2】図２はＳＣＩＤマウスに移植したＨＨ細胞に対するＣＣＲ４抗体とレナリドマイドの併用効果を示す。縦軸はＶ／Ｖ０の値を、横軸は投与開始後からの日数を示す。○は陰性対照群（媒体投与）、▲はＫＭ８７６０単独投与群、■はレナリドマイド単独投与群、×はＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与群のＶ／Ｖ０の平均値をそれぞれ示す。

【図3A】図３Ａは、ｈＰＢＭＣをエフェクター細胞に、ＨＨ細胞をターゲット細胞にした時のＫＭ８７６０のＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞障害率（Ｌｙｓｉｓ％）を、横軸は抗体濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。○はレナリドマイド無処置、●は０．１μｍｏｌ／Ｌ、△は１μｍｏｌ／Ｌ、■は１０μｍｏｌ／Ｌのレナリドマイドでエフェクター細胞を１日間処理したときの細胞障害率の平均値（サンプル数Ｎ＝３）を示す。

【図3B】図３Ｂは、ｈＰＢＭＣをエフェクター細胞に、ＨＨ細胞をターゲット細胞にした時のＫＭ８７６０のＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞障害率（Ｌｙｓｉｓ％）を、横軸は抗体濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。○はレナリドマイド無処置、●は０．１μｍｏｌ／Ｌ、△は１μｍｏｌ／Ｌ、■は１０μｍｏｌ／Ｌのレナリドマイドでエフェクター細胞を３日間処理したときの細胞障害率の平均値（サンプル数Ｎ＝３）を示す。

【図3C】図３Ｃは、ｈＰＢＭＣをエフェクター細胞に、ＨＨ細胞をターゲット細胞にした時のＫＭ８７６０のＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞障害率（Ｌｙｓｉｓ％）を、横軸は抗体濃度（μｍｏｌ／Ｌ）を示す。○はレナリドマイド無処置、●は０．１μｍｏｌ／Ｌ、△は１μｍｏｌ／Ｌ、■は１０μｍｏｌ／Ｌのレナリドマイドでエフェクター細胞を５日間処理したときの細胞障害率の平均値（サンプル数Ｎ＝３）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明の医薬の形態としては、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤を含む医薬、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬が挙げられる。

【0011】

ここで、ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤を含む医薬、とは、それぞれの薬剤成分を混合させた合剤であってもよく、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と少なくとも１種類の薬剤とを別々に調製し、これらの薬剤を併用して同時にまたは逐次的に投与する医薬であってもよい。それぞれの薬剤成分を混合させた合剤には、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体に少なくとも１種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。

【0012】

ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬とは、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と少なくとも１種類の薬剤とを別々に調製し、これらの薬剤を併用して同時にまたは逐次的に投与する医薬であってもよく、それぞれの薬剤成分を混合させた合剤であってもよい。それぞれの薬剤成分を混合させた合剤には、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体に少なくとも１種類の薬剤を結合させた融合抗体なども包含する。

【0013】

また、それぞれの薬剤を含有する医薬キットを調製し、これらの薬剤を同時にまたは逐次的に患者に投与してもよいし、混合させた後に患者に投与してもよい。

【0014】

ＣＣＲ４に特異的に反応する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤とを逐次的に投与する場合、投与順序については制限されず、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体は少なくとも１種類の薬剤の前に、または後に投与することができる。逐次的とは、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体は少なくとも１種類の薬剤が、同じ時間枠内で治療的に作用することができるように、ある時間枠内に対象に対して次々に投与されることを意味する。

【0015】

本発明におけるＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体としては、例えば、ヒトＣＣＲ４の細胞外領域に特異的に反応する遺伝子組換え抗体が挙げられる。中でも、ヒト血小板に反応性を示さない遺伝子組換え抗体、高い抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性とも称す）を有する遺伝子組換え抗体などが好ましい。

【0016】

ここで抗体がヒト血小板に反応性を示さないとは、抗体がヒト血小板と実質的に反応しないことをいい、具体的には、フローサイトメーターによる測定で反応性を示さないことをいう。

【0017】

また、本発明における抗体としては、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜３９、９８〜１１２、１７６〜２０６または２７１〜２８４番目を含む領域、より好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の２〜２９番目（配列番号２）、さらに好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の１２〜２９番目（配列番号３）、特に好ましくは配列番号１に示されるアミノ酸配列の１３〜２５番目（配列番号４）に、特異的に反応する抗体が挙げられる。また、国際公開第２００５／０５３７４１号に記載のハイブリドーマＫＭ２１６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１００９０）が生産するＣＣＲ４に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープに特異的に反応する抗体などが挙げられる。

【0018】

また、本発明における抗体には、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１１８号、国際公開第０３／８５１０７号）で生産された抗体も包含される。

【0019】

本発明における遺伝子組換え抗体としては、例えば、ヒト化抗体およびヒト抗体等が挙げられる。

【0020】

ヒト化抗体としては、例えば、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体などが挙げられる。

【0021】

ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＨＶまたはＶＨとも称す）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＬＶまたはＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。

【0022】

本発明におけるヒト型キメラ抗体は、ＣＣＲ４に特異的に反応するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0023】

ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、更にＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、およびγ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。

【0024】

本発明におけるヒト型キメラ抗体としては、例えば、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号５、配列番号６および配列番号７、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、より具体的にはＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表されるアミノ酸配列であるヒト型キメラ抗体が挙げられる。

【0025】

本発明におけるヒト型キメラ抗体として、さらに具体的には、例えば、ＶＨのアミノ酸配列が配列番号１１、ＣＨがヒト抗体ＩｇＧ１サブクラスのアミノ酸配列、ＶＬが配列番号１２で表されるアミノ酸配列、ＣＬがヒト抗体κクラスのアミノ酸配列からなるヒト型キメラ抗体が挙げられる。例えば国際公開第０１／６４７５４号に開示された抗ＣＣＲ４ヒト型キメラ抗体ＫＭ２７６０などが挙げられる。

【0026】

ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。

【0027】

本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＣＣＲ４に特異的に結合するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲとも称す）に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0028】

ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択方法としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。選択方法としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、並びにヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ＵＳ Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などが挙げられる。

【0029】

本発明における抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、およびγ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。

【0030】

本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、例えば、それぞれ配列番号５、６、７で表されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体などが挙げられる。

【0031】

本発明におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、ＶＨが配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体が好ましく用いられる。

【0032】

ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体を意味するが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、および発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。

【0033】

ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より、該抗体を精製することができる。

【0034】

ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。

【0035】

前記ライブラリーはレパートリーを増やすために、人為的に変異を導入したライブラリーを用いることもできる。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有するファージを回収できる。該抗体断片は、さらに蛋白質工学的手法により、二本の完全なＨ鎖および二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することもできる。

【0036】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組み込まれた動物を意味する。ヒト抗体産生トランスジェニック動物としては、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚に移植後、発生させることにより作製されたヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどが挙げられる。

【0037】

ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常の細胞融合法によるハイブリドーマ作製方法により、ヒト抗体産生ハイブリドーマを得、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。

【0038】

トランスジェニック非ヒト動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、マウス、ラット、ニワトリ、サルおよびウサギ等が挙げられる。

【0039】

本発明において、高いＡＤＣＣ活性を有する遺伝子組換え抗体としては、例えば、Ｆｃ領域にＮ−グリコシド結合複合型糖鎖を有する抗体分子からなる組成物であって、かつ該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する遺伝子組換え抗体組成物が挙げられる。

【0040】

ここで高い抗体依存性細胞傷害活性とは、生体内で主として産生される抗体と比べ、ＡＤＣＣ活性が高いことをいう。

【0041】

なお、本発明において高いＡＤＣＣ活性を有する抗体を、以下、フコース非修飾抗体と称する。

【0042】

具体的には、例えば、ＣＣＲ４に特異的に結合するフコース非修飾抗体であって、ＶＨが配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬが配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、ＫＭ８７６０とも称す）が挙げられる。

【0043】

抗体分子に含まれるＦｃ領域には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖が結合する。従って、抗体１分子あたり２本の糖鎖が結合している。

【0044】

Ｎ−グリコシド結合糖鎖としては、例えば、コア構造の非還元末端側にガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）の側鎖を並行して１ないしは複数本有し、更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。

【0045】

本発明において、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖は、下記化学式で示される。

【0046】

【化1】

【0047】

本発明において、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子抗体は組成物として投与されてもよい。ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子抗体組成物のうち、Ｆｃ領域にＮ−グリコシド結合型糖鎖を有する抗体分子からなる遺伝子組換え抗体組成物は、上記の糖鎖構造を有していれば、単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。すなわち、本発明の遺伝子組換え抗体組成物とは、単一または複数の異なる糖鎖構造を有する遺伝子組換え抗体分子からなる組成物をいう。

【0048】

抗体の糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合としては、ＡＤＣＣ活性が増加すれば、いずれの割合の抗体も含まれるが、割合としては、例えば、２０％以上が好ましく、５１％−１００％がより好ましく、８０％−１００％がさらに好ましく、９０％−９９％が特に好ましく、１００％が最も好ましい。

【0049】

本発明において、フコースが結合していない糖鎖としては、上記で示された化学式中、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにはフコースが結合していなければ、非還元末端の糖鎖の構造はいかなるものであってもよい。

【0050】

本発明において、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないとは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していない抗体組成物とは、常法の糖鎖分析（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）において、フコースが実質的に検出できない程度の抗体組成物である場合をいう。

【0051】

実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。全ての糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない遺伝子組換え抗体組成物は、最も高いＡＤＣＣ活性を有する。

【0052】

Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物中に含まれる、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を有する抗体分子の割合は、以下の分析方法で決定することができる。

【0053】

分析方法としては、例えば、抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３―糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離する方法、また、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法［ジャーナル・オブ・リキッド・クロマトグラフィー（Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．）， ６， １５７７（１９８３）］などが挙げられる。

【0054】

本発明におけるＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物を生産する形質転換株は、抗体分子の可変領域および定常領域をコードするＤＮＡを挿入した遺伝子組換え抗体組成物発現ベクターを動物細胞へ導入することにより、取得することができる。

【0055】

遺伝子組換え抗体組成物発現ベクターは、以下のように構築する（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）。

【0056】

前述のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれ動物細胞での発現ベクターに挿入することにより、動物細胞用発現ベクターを作製する。

【0057】

動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、ｐＡＧＥ１０７（日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｍｉｙａｊｉ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３−１４０（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ． ａｎｄ Ｉｔｏｈ Ｓ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０１， １３０７−１３１０（１９８７））、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ２７， ２２３−２３２（１９８４））、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ７８， １５２７−１５３１（１９８１））、およびｐＳＧ１βｄ２−４（Ｍｉｙａｊｉ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４， １７３−１８０（１９９０））等が挙げられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｔ． ａｎｄ Ｉｔｏｈ Ｓ．， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０１， １３０７−１３１０（１９８７））、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４９， ９６０−９６８（１９８７））、および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｍａｓｏｎ Ｊ． Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ４１， ４７９−４８７（１９８５））とエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ Ｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ３３， ７１７−７２８（１９８３））等が挙げられる。

【0058】

遺伝子組換え抗体組成物発現用ベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプおよび同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができる。遺伝子組換え抗体組成物発現ベクターの構築のしやすさ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスがとれる等の点でタンデム型の遺伝子組換え抗体組成物発現用ベクターの方が好ましい（Ｓｈｉｔａｒａ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８（１９９４））。タンデム型の遺伝子組換え抗体組成物発現用ベクターとしては、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、およびｐＥＥ１８（Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｋ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７（１９９８））等が挙げられる。

【0059】

構築された遺伝子組換え抗体組成物発現用ベクターのＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、各種抗原に対する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることにより、遺伝子組換え抗体組成物発現ベクターを構築することができる。

【0060】

宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法（日本国特開平２−２５７８９１号公報； Ｍｉｙａｊｉ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０（１９９０））等が挙げられる。

【0061】

本発明の遺伝子組換え抗体組成物を生産する宿主細胞としては、動物細胞、植物細胞、および微生物など、組換え蛋白質生産に一般に用いられる宿主細胞であればいかなるものも包含される。

【0062】

本発明の遺伝子組換え抗体組成物を生産する宿主細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞、ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞、マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞、ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞、ミエローマ細胞と任意のＢ細胞とを用いて製造されたハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞または受精卵細胞を用いることにより製造されたヒト以外のトランスジェニック動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞と任意のミエローマ細胞とを用いて製造されたハイブリドーマ細胞、および上記ミエローマ細胞と胚性幹細胞または受精卵細胞を用いることにより製造されたヒト以外のトランスジェニック動物に抗原を免疫して取得されたＢ細胞とを用いて製造されたハイブリドーマ細胞などが挙げられる。

【0063】

ＡＤＣＣ活性の高い遺伝子組換え抗体組成物を発現させる宿主細胞としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する宿主細胞、例えば、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖をＦｃ領域に有する抗体分子からなる組成物であって、該組成物中に含まれるＦｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である抗体組成物を生産する能力を有する宿主細胞、例えば、以下、（ａ）〜（ｃ）に挙げる少なくとも１つの蛋白質の活性が低下または失活した細胞などが挙げられる。
（ａ） 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素；
（ｂ） Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素；
（ｃ） 細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）。

【0064】

上記宿主細胞としては、宿主細胞内のα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた宿主細胞が好適に挙げられる（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）。

【0065】

細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。

【0066】

細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素としては、例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素などが挙げられる。

【0067】

細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースは、ｄｅ ｎｏｖｏの合成経路またはＳａｌｖａｇｅ合成経路により供給されている。したがって、当該合成経路に関与する酵素はすべて細胞内ＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素に包含される。

【0068】

細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｄｅ ｎｏｖｏの合成経路に関与する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ；以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ ３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ， ４，６−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＧＤＰ−ケト−デオキシマンノース ３，５−エピメラーゼ， ４，６−リダクターゼ；以下、Ｆｘと表記する）などが挙げられる。

【0069】

細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのｓａｌｖａｇｅ合成経路に関与する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−ｂｅｔａ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ；以下、ＧＦＰＰと表記する）、Ｆｕｃｏｋｉｎａｓｅ（フコキナーゼ）などが挙げられる。

【0070】

細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に影響を与える酵素としては、上述の細胞内の糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響を与える酵素、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。

【0071】

Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素としては、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素であればいかなる酵素も包含される。

【0072】

Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素としては、例えば、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素であればいかなる酵素も包含される。具体的には、例えば、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼやα−Ｌ−フコシダーゼなどが挙げられる。

【0073】

また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合する反応に影響を与える酵素としては、上述のＮ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与える酵素、該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。

【0074】

細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質であればいかなる蛋白質も包含される。

【0075】

細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質としては、具体的には、例えば、ＧＤＰ−フコーストランスポーターなどが挙げられる。

【0076】

また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響を与える蛋白質としては、上述の細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性や発現に影響を与える蛋白質も包含される。

【0077】

上述の酵素活性が低下または欠失した細胞を取得する方法としては、目的とする酵素活性を低下または欠失させることができる手法であれば、いずれの手法でも用いることができる。具体的には、例えば、以下の（ａ）から（ｅ）の手法などが挙げられる（国際公開第０２／３１１４０号、国際公開第０３／８５１０７号）。
（ａ）酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；
（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；
（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法。

【0078】

Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、該糖鎖構造を認識できるレクチンであれば、いずれのレクチンでも用いることができる。その具体的な例としては、例えば、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、および、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）等を挙げることができる。

【0079】

レクチンに耐性な細胞とは、レクチンを有効濃度与えたときにも、生育が阻害されない細胞を言う。有効濃度とは、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞（以下、親株とも称す）が正常に生育できない濃度以上である。有効濃度としては、ゲノム遺伝子が改変される以前の細胞が成育できない濃度と同濃度であることが好ましく、２〜５倍であることがより好ましく、１０倍であることがさらに好ましく、２０倍以上であるであることが最も好ましい。

【0080】

生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、細胞株に応じて適宜定めればよく、通常のレクチンの有効濃度は１０μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。

【0081】

本発明の医薬おいて、少なくとも１種類の薬剤としては、例えば、免疫調整剤であるレナリドマイド、およびアクチミドが挙げられる。

【0082】

上記薬剤は、単独で高用量を生体内に投与した場合には、副作用を生じることが懸念される。しかしながら、本発明においては、ＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と上記薬剤を組み合わせることにより、上記薬剤を低用量で用いることができる。

【0083】

したがって、十分な治療効果に加えて、副作用を軽減することができる。また、上記の薬剤のみで病態が完治することは稀であり、多くの患者は再発を経験する。本発明においてはＣＣＲ４に特異的に結合する遺伝子組換え抗体と上記薬剤を組み合わせることにより、より強い薬効を期待できる。

【0084】

本発明の医薬は、以下に挙げる他の薬剤または方法と併用することもできる。

【0085】

上記他の薬剤または方法としては、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンを組み合わせたＣＨＯＰ療法、ドキソルビシンの代わりにピラルビシンを組み合わせたＴＨＰ−ＣＯＰ療法等のＣＨＯＰ様療法、ＣＨＯＰ療法にエトポシドを追加したＥＰＯＣＨ療法、エトポシド、シスプラチン、メチルプレドニゾロン、およびシタラビンを組み合わせたＥＳＨＡＰ療法、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾロン、ラニムスチン、ビンデシン、エトポシド、およびカルボプラチンを組み合わせたＬＳＧ１５療法、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾロン、ラニムスチン、ビンデシン、エトポシド、カルボプラチン、シタラビン、およびメトトレキサートを組み合わせた改良型ＬＳＧ１５療法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＬＳＧ１５療法、ｍＬＳＧ１５療法とも称す）、並びにドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジンを組み合わせたＡＢＶＤ療法などの多剤化学療法剤および分子標的薬剤などが挙げられる。

【0086】

分子標的薬剤としては、例えば、核酸アナログ、モノクローナル抗体、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）、葉酸アナログ、シグナル阻害剤、およびプロテアソーム阻害剤などが挙げられる。

【0087】

葉酸アナログとしては、例えば、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、ペントスタチン（Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、フォロデシン（Ｆｏｒｏｄｅｓｉｎｅ）、およびプララトレキセート（Ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）などが挙げられる。

【0088】

モノクローナル抗体としては、例えば、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ＳＧＮ−３０、Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ、ザノリブマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、シブリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、およびデニリューキン ジフティトクス（Ｄｅｎｉｌｅｕｋｉｎ ｄｉｆｔｉｔｏｘ）などが挙げられる。

【0089】

ＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、およびロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）などが挙げられる。

【0090】

シグナル阻害剤としては、例えば、エンザスタウリン（Ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）などが挙げられる。

【0091】

プロテアソーム阻害剤としては、例えば、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）などが挙げられる。

【0092】

本発明の医薬において、少なくとも一種の薬剤としては、例えば、ゲムシタビン、クラドリビン、フルダラビン、ペントスタチン、フォロデシン、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ＳＧＮ−３０、Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ、ザノリブマブ、シブリズマブ、デニリューキン ジフティトクス、ボリノスタット、ベリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、プララトレキセート、エンザスタウリン、およびボルテゾミブ、並びにこれらの薬剤の組み合わせが挙げられる。

【0093】

本発明の医薬は、ＣＣＲ４を発現している腫瘍であれば、癌種を問わず用いることができる。腫瘍の具体例としては、例えば、造血器腫瘍が挙げられる。

【0094】

造血器腫瘍としては、例えば、急性白血病、慢性白血病、非ホジキン病、ホジキン病（またはホジキンリンパ腫）などが挙げられる。

【0095】

急性白血病としては、例えば、急性リンパ性白血病などが挙げられる。

【0096】

慢性白血病としては、例えば、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。

【0097】

非ホジキン病としては、例えば、前駆Ｔリンパ芽球型白血病／リンパ腫、成熟Ｔ細胞腫瘍およびＮＫ細胞腫瘍などが挙げられる。

【0098】

成熟Ｔ細胞腫瘍およびＮＫ細胞腫瘍としては、例えば、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、セザリー症候群、ＮＫ細胞性白血病、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（鼻型）、菌状息肉腫、原発性皮膚未分化大細胞型リンパ腫、皮下蜂窩織炎様Ｔ細胞リンパ腫、腸炎型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾γδＴ細胞リンパ腫、血管免疫芽球型Ｔ細胞リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（非特定）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＫ ｐｏｓｉｔｉｖｅ、 ＡＬＫ ｎｅｇａｔｉｖｅ）、および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫などが挙げられる。

【0099】

ホジキンリンパ腫としては、例えば、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、および古典的ホジキンリンパ腫などが挙げられる。古典的ホジキンリンパ腫としては、例えば、結節硬化型、リンパ球豊富型、混合型、およびリンパ球減少型などが挙げられる。

【0100】

本発明の医薬の投与と併用することができる療法としては、例えば、手術、輸血、免疫療法、生物学的療法、および放射線療法、並びにその他の非薬剤的療法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0101】

本発明の医薬の効果は、動物モデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を測定することによって調べることができる。

【0102】

動物モデルとしては、例えば、ヒト癌組織由来の培養細胞株をマウスに移植した異種移植モデルが挙げられる。異種移植モデルはスキッドマウス等の免疫不全マウスの皮下、皮内、腹腔内、および静脈内等様々な部位にヒト癌細胞株を移植することにより作製することができる。

【0103】

上記動物モデルを用いて抗体の単独投与、薬剤の単独投与の効果と、本発明の医薬の効果とを比較することにより、本発明の医薬の効果を評価することができる。

【0104】

本発明の医薬は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。

【0105】

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましい。投与経路としては、例えば、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与を挙げることができる。蛋白質製剤の場合、静脈内投与が好ましい。

【0106】

投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、およびテープ剤等が挙げられる。

【0107】

経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、および顆粒剤等が挙げられる。

【0108】

乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、および果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、および大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、並びにストロベリーフレーバー、およびペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。

【0109】

カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、およびマンニトール等の賦形剤、デンプン、およびアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、およびタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、およびゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、並びにグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

【0110】

非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤、および噴霧剤等が挙げられる。

【0111】

注射剤は、例えば、塩溶液、またはブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。

【0112】

座剤は、例えば、カカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。

【0113】

また、噴霧剤は該医薬そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該医薬を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。

【0114】

担体として具体的には、例えば、乳糖、およびグリセリン等が挙げられる。該医薬および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

【0115】

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１回当たり抗体量として０．０１〜５ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。抗体と併用する薬剤は、単独で臨床に用いられる場合の投与量と同用量またはそれより少ない用量であることが好ましい。

【実施例1】

【0116】

抗ＣＣＲ４抗体とレナリドマイド併用投与による抗腫瘍効果（１）
ＨＨ細胞（ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２１０５）を１×１０^７個／ｍＬでＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＰＢＳ，インビトロジェン社製）に懸濁し、ＳＣＩＤマウス（日本クレア社より入手、雄）の腹側部皮内に１００μＬ移植した。細胞移植後７日目にノギスによって腫瘍径を測定し、次式より腫瘍体積を算出した。

【0117】

（式）腫瘍体積＝短径×短径×長径×０．５

【0118】

腫瘍体積が４１から９３ｍｍ^３の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定した。群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ． 陰性対照群：媒体投与
Ｂ． ＫＭ８７６０単独投与群：Ｄａｙ０、７、および１４に２０ｍｇ／ｋｇ投与
Ｃ． レナリドマイド単独投与群：Ｄａｙ０から１３に１ｍｇ／ｋｇで毎日投与
Ｄ． ＫＭ８７６０＋レナリドマイド併用投与群：各単独投与群と同じスケジュール、用量で投与

【0119】

実験は各群８匹で行った。ＫＭ８７６０は生理食塩水（大塚製薬社製）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。０．５％のメチルセルロースを溶解した生理食塩水にレナリドマイドを懸濁し、腹腔内に投与した。経日的に腫瘍体積を測定した。抗腫瘍効果の判定は、各測定日の腫瘍体積をＤａｙ０における腫瘍体積で除した値（Ｖ／Ｖ０）の平均値の比較により行った。

【0120】

各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的変化を図１に示す。図１に示すように、ＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与は、レナリドマイド単独あるいは抗体単独よりも高い増殖抑制効果を示した。

【0121】

表１に陰性対照群に対する有意差検定（Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）の結果を示す。また、Ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとし、表中＊で示した。

【0122】

【表1】

【0123】

表１に示すように、Ｄａｙ１０においては、単剤投与群と陰性対照群の間に有意差は無いが、併用投与群と陰性対照群の間には有意差を認めた。

【0124】

各群のＶ／Ｖ０を陰性対照群のＶ／Ｖ０で除した値（Ｔ／Ｃ）を表２に示す。表中、＊はＴ／Ｃの実測値が理論値よりも小さい場合を示す。

【0125】

【表2】

【0126】

表２に示すように、ＫＭ８７６０の薬効と、レナリドマイドの薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各単独投与群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用投与群のＴ／Ｃは、Ｄａｙ４、１０、１４、１７、および２１において小さい値を示した。

【0127】

以上より、ＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与は、それぞれの単独投与より、高い抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。

【実施例2】

【0128】

抗ＣＣＲ４抗体とレナリドマイド併用投与による抗腫瘍効果（２）
ＨＨ細胞（ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２１０５）を２×１０^８個／ｍＬでＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＰＢＳ，インビトロジェン社製）に懸濁し、ＳＣＩＤマウス（日本クレア社より入手、雄）の腹側部皮内に１００μＬ移植した。細胞移植後７日目にノギスによって腫瘍径を測定し、次式より腫瘍体積を算出した。

【0129】

（式）腫瘍体積＝短径×短径×長径×０．５

【0130】

腫瘍体積が５１から７９ｍｍ^３の範囲内の個体を選抜し、平均腫瘍体積が均一になるように群分けした後に下記のＡ〜Ｄの投与群を設定した。群分けした日をＤａｙ０とした。
Ａ． 陰性対照群：媒体投与
Ｂ． ＫＭ８７６０単独投与群：Ｄａｙ０、７、１４、および２１に２０ｍｇ／ｋｇ投与
Ｃ． レナリドマイド単独投与群：Ｄａｙ０から１３に１ｍｇ／ｋｇで毎日投与
Ｄ． ＫＭ８７６０＋レナリドマイド併用投与群：各単独投与群と同じスケジュール、用量で投与

【0131】

実験は各群１２匹で行った。ＫＭ８７６０は生理食塩水（大塚製薬社製）で希釈調製し、尾静脈内より投与した。０．５％のメチルセルロースを溶解した生理食塩水にレナリドマイドを懸濁し、腹腔内に投与した。経日的に腫瘍体積を測定し、抗腫瘍効果の判定は、各測定日の腫瘍体積をＤａｙ０における腫瘍体積で除した値（Ｖ／Ｖ０）の平均値の比較により行った。

【0132】

各群のＶ／Ｖ０の平均値の経日的変化を図２に示す。図２に示したように、ＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与群は、レナリドマイド単独投与群あるいは抗体単独投与群よりも高い増殖抑制効果を示した。

【0133】

表３に各単独投与群と併用投与群の有意差検定（Ｓｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ検定）の結果を示す。表中、ｎａは該当なし（ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）であることを示す。また、Ｐ＜０．０５の場合を有意差ありとし、表中＊で示した。

【0134】

【表3】

【0135】

表３に示すように、レナリドマイド単独投与群と併用投与群の間には、すべての時点で有意差を認めた。ＫＭ８７６０単独投与群と併用投与群の間には、Ｄａｙ１９、Ｄａｙ２１の時点が有意差を認められた。

【0136】

各群のＶ／Ｖ０を陰性対照群のＶ／Ｖ０で除した値（Ｔ／Ｃ）を表４に示す。表中、＊はＴ／Ｃの実測値が理論値よりも小さい場合を示す。

【0137】

【表4】

【0138】

表４に示すように、ＫＭ８７６０の薬効と、レナリドマイドの薬効が単純に加算された時のＴ／Ｃの理論値、すなわち各単独投与群のＴ／Ｃを掛け合わせた値と比べると、実際の併用投与群のＴ／Ｃは、Ｄａｙ１４を除くすべての時点において小さい値を示した。

【0139】

以上より、ＫＭ８７６０とレナリドマイドの併用投与は、それぞれの単独投与より、高い抗腫瘍効果を示すことが明らかになった。

【実施例3】

【0140】

レナリドマイドと抗ＣＣＲ４抗体の併用処置による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性増強

【0141】

健常人末梢血からＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア社製）を用いた密度勾配遠心により単核球（ｈＰＢＭＣ）を取得した。ｈＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以後、単に培地と記載する）に懸濁し、レナリドマイドを最終濃度が０．１、１、１０μＭになるように添加した。１、３または５日間３７℃にてインキュベートし、その後ｈＰＢＭＣを培地で１回洗浄し、培地で約５×１０^６個／ｍＬに調整し、これをエフェクター細胞とした。

【0142】

約１００μＬの培地に懸濁した１×１０^６個のＨＨ細胞と、２０μＬの^５１Ｃｒ溶液（ＮＥＺ０３０、パーキンエルマー社製）を混合し、３７℃で２から４時間程度インキュベートすることでＨＨ細胞を放射ラベルした。放射ラベルしたＨＨ細胞を培地で３回洗浄後、約２×１０^５個／ｍＬに調整し、これをターゲット細胞とした。

【0143】

ＫＭ８７６０を、培地で０．０３、０．３、３μｇ／ｍＬの濃度に調整しこれを抗体溶液とした。

【0144】

エフェクター細胞、ターゲット細胞、抗体溶液をそれぞれ５０μＬずつ、９６穴丸底プレート上で混合し（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝２５：１、抗体最終濃度＝０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）、３７℃で４時間インキュベートした。プレートを遠心し、上清５０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（パーキンエルマー社製）に移して乾燥させ、マイクロプレート用液体シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社製）でＣＭＰを測定した。ここで、ＣＰＭとは、１分当たりのカウント数である。細胞障害率（Ｌｙｓｉｓ％）は以下の式で求めた。

【0145】

Ｌｙｓｉｓ％＝（サンプルのＣＰＭ−自然遊離のＣＰＭ）／（最大遊離のＣＰＭ−自然遊離のＣＰＭ）×１００

【0146】

なお、自然遊離のＣＰＭは、エフェクター細胞および抗体非存在下でのＣＰＭ、最大遊離のＣＰＭは、抗体非存在下、エフェクター細胞の変わりに１％ＮＰ−４０を混合したときのＣＰＭである。

【0147】

結果を図３に示す。図３に示すように、レナリドマイドで処理することによりＫＭ８７６０のＡＤＣＣ活性は明らかに増強した。

【0148】

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。
なお、本出願は、２００９年９月１０日付けで出願された日本特許出願（特願２００９−２０９２１８）および２００９年９月１１日付けで出願された米国仮特許出願（６１／２４１，５５８）に基づいており、その全体が引用により援用される。
また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

【産業上の利用可能性】

【0149】

本発明により、ＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体と、少なくとも１種類の薬剤を含む医薬、およびＣＣＲ４に対する遺伝子組換え抗体を、少なくとも１種類の薬剤とを併用して投与するための医薬を提供することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0150】

配列番号４−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号６−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号７−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号８−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号９−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１０−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号１２−人工配列の説明：合成ペプチド

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]