特許 5710001 ｍｉＲＮＡをターゲットとした神経変性疾患の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5710001

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年4月30日

(54)【発明の名称】ｍｉＲＮＡをターゲットとした神経変性疾患の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20150409BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150409BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20150409BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20150409BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20150409BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20150409BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150409BHJP

【ＦＩ】

   A61K48/00

   C12Q1/68 AZNA

   A61K31/7088

   A61P25/28

   A61P21/02

   A61K31/712

   G01N33/53 M

【請求項の数】2

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2013-529052(P2013-529052)

(86)(22)【出願日】2011年9月9日

(65)【公表番号】特表2013-542921(P2013-542921A)

(43)【公表日】2013年11月28日

(86)【国際出願番号】KR2011006718

(87)【国際公開番号】WO2012036433

(87)【国際公開日】20120322

【審査請求日】2013年4月24日

(31)【優先権主張番号】10-2010-0089651

(32)【優先日】2010年9月13日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】513061541

【氏名又は名称】エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】ノ・ジェギュ

(72)【発明者】

【氏名】イ・サン クン

(72)【発明者】

【氏名】キム・マン ホ

(72)【発明者】

【氏名】チュ・コン

(72)【発明者】

【氏名】チョン・グンファ

(72)【発明者】

【氏名】イ・スンテ

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０２６５７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０４４９３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１１７４１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１４７９７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５１９３３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Hugon,J. et al，Targeting miRNAs in Alzheimer’s disease，Expert Review of Neurotherapeutics，２００８年，Vol. 8, No. 11，pp. 1615-1616

【文献】 RAU CHENG-SHYUAN et al，Entrapment neuropathy results in different microRNA expression patterns from denervation injury in rats，BMC MUSCULOSKELETAL DISORDERS，２０１０年，vol. 11, no. 1，pp. 181(1-9)

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３１／７０８８−３１／７１３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、
（ｂ）薬剤的に許容される担体と、
を含み、
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−Ｃ_１−３アルキルリボヌクレオチドであることを特徴とするアルツハイマー疾患の予防又は治療用医薬組成物。

【請求項2】

ｍｉＲ−２０６のヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むことを特徴とするアルツハイマー疾患の診断用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特定ｍｉＲＮＡをターゲットとした神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。また、本発明は、神経変性疾患の診断用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー疾患（ＡＤ）は、進行性認知機能低下、神経変性、アミロイドの細胞外沈着（老人性斑）と細胞内封入（神経原繊維：ＮＦＴ）の増加で特徴付けられる、老人における認知症の最も一般的な形態である（非特許文献１〜２）。現在、ＡＤに対する治療方法はない。ＡＤの主要な分子メカニズムは、ミスフォルディングタンパク質、酸化性損傷、炎症性損傷及びエネルギー不全を含み、これは究極的にシナプス機能異常を招く（非特許文献２）。シナプスは、ＡＤ発病の初期ターゲットであり、シナプトフィシン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）の変化は、認知機能低下に関わっている（非特許文献３）。ＡＤの脳は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の低いレベルを示し、ＢＤＮＦは、シナプス柔軟性、シナプス生成及び神経生成の主要な調節子である（非特許文献４〜６）。そのため、ＢＤＮＦの調節を通じてＡＤを治療しようとする提案があるが（非特許文献７）、安全で効果的な治療方法は未だ開発されていない。

【0003】

ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡ）は、２１−乃至２３−ヌクレオチドの小さいＲＮＡ分子であり、ターゲットｍＲＮＡの分解又は解読段階における抑制により遺伝子発現を調節する（非特許文献８）。ｍｉＲＮＡは、多様な生理学的現象及び疾患に関与する（非特許文献８）。中枢神経系において、ｍｉＲＮＡ生成の主要な調節子であるＤｉｃｅｒが消失されると、神経変性が誘導されるが、これは、ｍｉＲＮＡの均衡ある発現が神経系で重要な役割をするということを示す（非特許文献９〜１０）。幾つかのｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−８、９／９^＊及び１３３ｂは、神経変性に関与することが知られている（非特許文献１１〜１３）。ＡＤ研究において、幾つかのｍｉｃｒｏＲＮＡ発現変化及びこれらのＡＤ関与も知られている（非特許文献１４〜１５）。このような研究は、ＡＤの病因に対する理解を広めるものの、ＡＤにおいて、ｍｉＲＮＡの直接的治療への適用は、まだ試みられたことがない。

【0004】

本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｂｒａａｋ ａｎｄ Ｂｒａａｋ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ Ｓｕｐｐｌ．１９９６；１６５：３−１２．

【非特許文献2】Ｑｕｅｒｆｕｒｔｈ ａｎｄ ＬａＦｅｒｌａ，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１０；３６２：３２９−４４．

【非特許文献3】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２；２９８：７８９−９１．

【非特許文献4】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ．１９９１；７：６９５−７０２．

【非特許文献5】Ｂｒａｍｈａｍ ａｎｄ Ｍｅｓｓａｏｕｄｉ，Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００５；７６：９９−１２５．

【非特許文献6】Ｅｒｎｆｏｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｍｈａｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００３；２６：１７１−３．

【非特許文献7】Ｎａｇａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９；１５：３３１−７．

【非特許文献8】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９；１０：１２６−３９．

【非特許文献9】Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００７；２０４：１５５３−８．

【非特許文献10】Ｃｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８；１０５：５６１４−９．

【非特許文献11】Ｋａｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００７；１３１：１３６−４５．

【非特許文献12】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７；３１７：１２２０−４．

【非特許文献13】Ｐａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８；２８：１４３４１−６．

【非特許文献14】Ｍａｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００９；１０：１５４−６８．

【非特許文献15】Ｈｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００９；３２：１９９−２０６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療できるターゲット分子を見出し、これをターゲットとする医薬を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ｍｉＲ−２０６が神経変性疾患の脳において特異的に高発現し、ｍｉＲ−２０６をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、シナプスを再生して記憶力を回復させるなど、神経変性疾患を治療することができることを実質的に確認することにより、本発明を完成した。

【0007】

本発明の目的は、神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。

【0008】

本発明の他の目的は、神経変性疾患の診断用キットを提供することにある。

【0009】

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明及び請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の２番目から７番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、（ｂ）薬剤的に許容される担体とを含む神経変性疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。

【0011】

本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列の２番目から７番目のヌクレオチド配列に相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬剤的有効量と、（ｂ）薬剤的に許容される担体とを含む医薬組成物を対象に投与する工程を含む神経変性疾患の予防又は治療方法を提供する。

【0012】

本発明者らは、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療できるターゲット分子を見出し、これをターゲットとする医薬を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ｍｉＲ−２０６が神経変性疾患の脳において特異的に高発現し、ｍｉＲ−２０６をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、シナプスを再生して記憶力を回復させるなど、神経変性疾患を治療することができることを実質的に確認した。

【0013】

本明細書において、用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’は、ターゲットとするｍｉＲＮＡ、特にｍｉＲＮＡのシード（ｓｅｅｄ）配列に対する相補的な配列を有しており、ｍｉＲＮＡと二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成できる核酸に基づく分子を包括する。したがって、本明細書において、用語‘アンチセンスオリゴヌクレオチド’は、‘相補的核酸ベース抑制剤（ａ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）’と記載できる。

【0014】

配列番号１は、ｍｉＲ−２０６の成熟配列を示す。配列番号１において、２番目から７番目までのヌクレオチド配列は、ｍｉＲ−２０６のシード配列である。一般に、ｍｉＲＮＡのシード配列は、ターゲット認知に非常に重要な配列であって（Ｋｒｅｎｚ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４４：２３９０−２３９７（２００４）；Ｈ．Ｋｉｒｉａｚｉｓ、ｅｔ ａｌ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２：３２１（２０００））、多様な種に対して保存されている。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０６のシード配列である配列番号１の２番目から７番目までのヌクレオチド配列に相補的な配列を有し、この相補的な配列のみによってもｍｉＲ−２０６を抑制することができる。

【0015】

本明細書において、アンチセンスオリゴヌクレオチドを言及しながら使用される用語‘相補的’は、所定のハイブリッド形成又はアニーリング条件、好ましくは、生理的条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドがｍｉＲ−２０６ターゲットに選択的にハイブリッド形成する程度に十分相補的であることを意味し、実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）及び完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）であることを包括する意味を有し、好ましくは、完全に相補的であることを意味する。

【0016】

本発明の好ましい具現例によると、本発明で有効成分として利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列（即ち、ｍｉＲ−２０６の成熟配列）の１〜８番目や２〜８番目、又は２〜７番目ヌクレオチド配列に相補的な配列を有する。最も好ましくは、本発明で有効成分として利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列（即ち、ｍｉＲ−２０６の成熟配列）全体に相補的な配列を有する。

【0017】

本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多様な分子を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、より好ましくは、ＲＮＡ分子である。選択的に、本発明で利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）、２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート−バックボーンデオキシリボヌクレオチド、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又はＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）である。２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドは、好ましくは、２’−Ｏ−アルキルオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ_１−３アルキルオリゴヌクレオチドであって、最も好ましくは、２’−Ｏ−Ｃ_１−３メチルオリゴヌクレオチドである。

【0018】

上述のように、本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０６に相補的な配列を有する核酸ベース抑制剤を含む包括的な意味を有する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに含まれるものは、例えば、狭い意味のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）及び抑制ＲＮＡ分子を含む。

【0019】

用語‘アンタゴミア’は、一本鎖化学的修飾リボヌクレオチドであって、ｍｉＲ−２０６に少なくとも部分的に、好ましくは完全に相補的な配列を有する。アンタゴミアは、一つ又はそれ以上の修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル−糖修飾）を含む。ある具現例によると、アンタゴミアは、修飾ヌクレオチドのみを含む。アンタゴミアは、一つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合を含み、これに部分的に又は完全にホスホロチオエートバックボーンを有するようになる。インビボ運搬及び安定性を改善するために、アンタゴミアは、その３’−末端にコレステロール又は他の領域を結合させることができる。ｍｉＲ−２０６を抑制するために、アンタゴミアの長さは、７〜５０ヌクレオチド、好ましくは、１０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは、２０〜２５ヌクレオチドである。

【0020】

ｍｉＲ−２０６機能の抑制は、典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより達成できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの化学的修飾を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ以上のＬＮＡｓ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を含むことができる。ＬＮＡは、修飾リボヌクレオチドであって、リボース糖部位の２’乃至４’炭素間に追加的なブリッジを含み、Ｌｏｃｋｅｄ形態を有し、これにより、ＬＮＡのあるオリゴヌクレオチドは、改善された熱安定性を有するようになる。

【0021】

択一的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＡｓ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を含むことができ、これは、糖−ホスフェートバックボーンの代わりに、ペプチドベースバックボーンを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の化学的修飾を含むことができ、そのような他の化学的修飾としては、例えば、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−フルオロ及び４’−チオ修飾のような糖修飾；ホスホロチオエート、モルフォリノ又はホスホノカルボキシレート結合のようなバックボーン修飾（例えば、米国特許第６，６９３，１８７号及び第７，０６７，６４１号）を含む。

【0022】

他の具現例において、適合したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メトキシエチル‘ギャップマー’であり、これは、５’−末端及び３’−末端に２’−Ｏ−メトキシエチル−修飾リボヌクレオチドを含み、中央に少なくとも１０個のデオキシリボヌクレオチドを有する。この‘ギャップマー’は、ＲＮＡターゲットのＲＮａｓｅ Ｉ依存性分解メカニズムを誘発させることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、７〜５０ヌクレオチド、好ましくは、１０〜４０ヌクレオチド、より好ましくは、１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは、２０〜２５ヌクレオチドである。

【0023】

ｍｉＲ−２０６の機能を抑制する他のアプローチは、抑制ＲＮＡ分子を投与することであって、前記抑制ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−２０６の成熟配列に相補的な配列を含む。このような抑制ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びリボザイムを含む。

【0024】

本発明の医薬組成物により治療できる疾患は、多様な神経変性疾患を含み、好ましくは、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症であり、最も好ましくは、アルツハイマー疾患である。

【0025】

下記の実施例で立証されたように、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０６の機能を抑制し、ＢＤＮＦ及びＩＧＦ−１のレベルを大きく増加させ、シナプス再生を増加させ、その結果、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療する。

【0026】

本発明の医薬組成物に含まれる薬剤的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の医薬組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適した薬剤的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳細に記載されている。

【0027】

本発明の医薬組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、鼻腔内注入、局所注入、脳室内注入、脊髄腔注入、皮下注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与できる。

【0028】

本発明の医薬組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様であり、普通に熟練した医者は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によると、本発明の医薬組成物の一日投与量は、体重当たり、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。

【0029】

本発明の医薬組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、又は多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、油性又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

【0030】

ｍｉＲ−２０６の抑制剤として本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡをターゲットとした神経変性疾患の治療において、最初に成果を挙げたことを示唆する。

【0031】

本発明の他の様態によると、本発明は、ｍｉＲ−４２４^＊、ｍｉＲ−１８ｂ^＊、ｍｉＲ−１３５ａ^＊、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１２３８、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−６４０、ｍｉＲ−１２３７、ｍｉＲ−１９１^＊又はｍｉＲ−１３４のヌクレオチド配列、その相補的配列又は前記配列の断片を含む神経変性疾患の診断用キットを提供する。

【0032】

本発明のまた他の様態によると、本発明は、ヒト生物学的試料におけるｍｉＲ−４２４^＊、ｍｉＲ−１８ｂ^＊、ｍｉＲ−１３５ａ^＊、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−１２３８、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−５７５、ｍｉＲ−６４０、ｍｉＲ−１２３７、ｍｉＲ−１９１^＊又はｍｉＲ−１３４の発現を検出する工程を含み、これにより神経変性疾患の診断又は予後に必要な情報が提供される神経変性疾患マーカーを検出する方法を提供する。

【0033】

前記ｍｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋで確認することができる。

【0034】

最も好ましくは、前記ｍｉＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−２０６である。

【0035】

本発明の診断キットは、多様な神経変性疾患、好ましくは、アルツハイマー疾患、認知症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病又は筋萎縮性側索硬化症に利用でき、最も好ましくは、アルツハイマー疾患の診断に利用できる。

【0036】

本発明のキットは、上記の成分の外にも、他の成分を追加的に含むことができる。例えば、本発明のキットがＰＣＲ増幅過程に適用される場合は、本発明のキットは選択的に、ＰＣＲ増幅に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から収得した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子及びｄＮＴＰｓを含むことができる。本発明のキットは、上記の試薬成分を含む多数の別途パッケージング又はコンパートメントとして製作できる。

【0037】

本発明の好ましい具現例によると、本発明のキットは、マイクロアレイである。本発明の好ましい具現例によると、本発明のキットは、遺伝子増幅キットである。

【0038】

本発明のキットがマイクロアレイである場合は、マイクロアレイの固相表面にプローブが固定化されている。本発明のキットが遺伝子増幅キットである場合は、プライマーを含む。

【0039】

本発明の診断用キットで利用されるプローブ又はプライマーは、ＰＲＤＸ１ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有する。本明細書において用語‘相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）’は、ある特定なハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）又はアニーリング条件下で上述のヌクレオチド配列に選択的にハイブリッド形成できる程度の相補性を有することを意味する。したがって、用語‘相補的’は、用語‘完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）とは異なる意味を有し、本発明のプライマー又はプローブは、上述のヌクレオチド配列に選択的にハイブリッド形成できる程度であれば、一つ又はそれ以上のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基配列を有することができる。

【0040】

プライマー又はプローブ製作時に参照すべき本発明のｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋで確認することができ、この配列を参照してプライマー又はプローブをデザインすることができる。

【0041】

本発明のキット又は方法により分析された前記ｍｉＲＮＡの発現程度、例えば、ＲＴ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−ＰＣＲ又はリアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）−ＰＣＲ方法（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１））により測定された発現程度が、正常対照群と比較し、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、最も好ましくは、３倍以上の発現度を示す場合は、分析試料を採取した対象が神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を有しているか、発病危険度が高いと判定する。

【発明の効果】

【0042】

本発明の特徴及び利点を要約すると、以下の通りである：
（ａ）本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患に対する治療ターゲットとしてｍｉＲ−２０６を提供する。
（ｂ）本発明で見出されたｍｉＲ−２０６ターゲットは、アルツハイマー動物モデル及びヒト脳試料において共通的に高発現したものであって、実験的誤差（ａｒｔｉｆａｃｔ ｅｒｒｏｒｓ）無しに選択された、実質的な治療ターゲットである。
（ｃ）ｍｉＲ−２０６の抑制剤として本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡをターゲットとした神経変性疾患治療において最初に成果を挙げたことを示唆する。
（ｄ）本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０６の機能を抑制し、ＢＤＮＦ及びＩＧＦ−１のレベルを大きく増加させ、シナプス再生を増加させ、その結果、神経変性疾患、特にアルツハイマー疾患を治療する。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1a】アルツハイマー脳において、ｍｉＲ−２０６の上方調節を示す図である。（ａ）マイクロアレイにおいて、７月齢及び１２月齢の野生型及びＴｇ２５７６マウスは、互いに異なって調節されたｍｉＲＮＡを示す。緑色より赤色がさらに高い発現（Ｚ−ｓｃｏｒｅ）を示す。ｍｉＲＮＡが相対的発現量（Ｔｇ２５７６／ＷＴ）順に整列された。右側のヒートマップは、左側の長方形により表されるイメージの拡大図を示す（Ｍｍｕ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）。

【図1b】アルツハイマー脳において、ｍｉＲ−２０６の上方調節を示す図である。（ｂ）Ｒｅａ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ（グラフ）及びＲＴ−ＰＣＲ（ゲル）は、ｍｉＲ−２０６レベルが、１２月齢野生型マウスより１２月齢Ｔｇ２５７６マウスでさらに高いことを示す（グループ当たりｎ＝４）。ｓｎｏ２０２ ＲＮＡが内部コントロールとして用いた。

【図1c】アルツハイマー脳において、ｍｉＲ−２０６の上方調節を示す図である。（ｃ）ｍｉＲ−２０６のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、１２月齢Ｔｇ２５７６マウスでｍｉＲ−２０６の発現が増加することを示した（スケールバー、２５μｍ）。

【図1d】アルツハイマー脳において、ｍｉＲ−２０６の上方調節を示す図である。（ｄ）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ａβ４２ペプチドの細胞培養への添加が、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞のｍｉＲ−２０６レベルは増加させるが、ＨＵＶＥＣではそうではないことを示す。

【図1e】アルツハイマー脳において、ｍｉＲ−２０６の上方調節を示す図である。（ｅ）ヒト側頭皮質において、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、コントロール脳と比較し、アルツハイマー脳でｍｉＲ−２０６の上方調節を示す（グループ当たりｎ＝４）。^＊Ｐ＜０．０５及び^＊＊Ｐ＜０．０１。バーは、平均±標準平均誤差を示す。

【図2a】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ａ）ＢＤＮＦ ３’−ＵＴＲ（ＢＤＮＦ＃１、＃２、ａｎｄ＃３）の三ヶ所の位置がｍｉＲ−２０６のターゲットと予想された。ｍｉＲ−２０６のシード配列に下線表示した。

【図2b】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｂ）ＨｅＬａ細胞を利用したルシフェラーゼ試験において、ｍｉＲ−２０６のトランスフェクションは、ＢＤＮＦ＃３及びＢＤＮＦの全３’−ＵＴＲ（ｔＢＤＮＦ）を有するベクターのルシフェラーゼ活性を減少させる（ｎ＝６複製）。

【図2c】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｃ）ウェスタンブロッティング（左側）及びデンシトメトリー（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）（右側）の結果から分かるように、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞及びＨＵＶＥＣにおいて、ｍｉＲ−２０６のトランスフェクションは、ＢＤＮＦタンパク質レベルを減少させる。減少は、ＡＭ２０６（ｍｉＲ−２０６に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）とコトランスフェクションさせることにより一般化された。Ｓｃｒ、スクランブル配列。

【図2d】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｄ）Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞において、Ａβオリゴマー処理は、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの有意な減少無しにｍｉＲ−２０６のレベルを増加させた（グループ当たりｎ＝６）。

【図2e】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｅ）Ａβオリゴマーは、細胞において、ＢＤＮＦタンパク質レベルを減少させ、ＡＭ２０６のトランスフェクションは、ＢＤＮＦタンパク質レベルを回復する。Ｓｃｒ、スクランブル配列。

【図2f】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｆ）マウスプライマリー海馬ニューロンにおいて、Ａβオリゴマーは、樹状突起スパイン密度の減少を誘発し、これはＡＭ２０６処理により阻害された。スケールバー、１０μｍ。

【図2g】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｇ）１２月齢Ｔｇ２５７６マウスの第三脳室にＣｙ３ラベルされたＡＭ２０６を注入した。２４時間後、Ｃｙ３−ＡＭ２０６の蛍光が海馬及び周辺組織に分布した。スケールバー、１００μｍ。

【図2h】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｈ）ＭＡＰ２陽性神経、Ｕｌｅｘ−レクチン陽性内皮細胞及びＧＦＡＰ陽性グリア細胞でＣｙ３−ＡＭ２０６が検出された。スケールバー、２０μｍ。

【図2i】ｍｉＲ−２０６によるＢＤＮＦの調節を示す。（ｉ）ウェスタンブロッティング（左側）及びデンシトメトリー（右側）において、ＡＭ２０６を脳室内注入したＴｇ２５７６マウス（Ｔｇ２５７６−ＡＭ２０６）は、注入して１週後、コントロール（Ｔｇ２５７６−ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較し、全体脳ＢＤＮＦのレベルが明らかに増加したことを確認することができる（グループ当たりｎ＝４）。^＊Ｐ＜０．０５、及び^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ、有意差なし。バーは、平均±標準平均誤差を示す。

【図3a】ＡＭ２０６の治療効果を示す図である。（ａ）文脈的恐怖条件付けテストを１２ヶ月に行って、テスト１週前又は３週前にスクランブルアンチセンスオリゴヌクレオチドを注入したコントロールＴｇ２５７６マウス（Ｔｇ−ｃｔｒ−１ｗ及びＴｇ−ｃｔｒ−３ｗ）のフリージングタイムは、野生型マウスより低かった。Ｔｇ２５７６マウスのＡＭ２０６処理は、テスト１週前処理群（Ｔｇ−ＡＭ２０６−１ｗ）又は３週前処理群（Ｔｇ−ＡＭ２０６−３ｗ）において、両方ともフリージングタイムが増加し（グループ当たりｎ＝６、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ テストによるＫｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析）、これは、海馬の記憶機能が増加したことを示す。

【図3b】ＡＭ２０６の治療効果を示す図である。（ｂ）手がかり恐怖条件付けテストにおいて、グループ間には何の差も示さなかった（グループ当たりｎ＝６）。点線は、音響手がかりを示す。

【図3c】ＡＭ２０６の治療効果を示す図である。（ｃ）Ｙ−迷路テストにおいて、Ｔｇ−ＡＭ２０６−１ｗマウスは、Ｔｇ−ｃｔｒ−１ｗマウスよりさらによい循環行動を示す。Ｔｇ−ＡＭ２０６−３ｗマウスは、Ｔｇ−ｃｔｒ−３ｗマウスと類似した循環行動を示す（グループ当たりｎ＝５）。

【図3d】ＡＭ２０６の治療効果を示す図である。（ｄ）シナプトフィシン（Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）発現は、コントロールＴｇ２５７６マウスよりＴｇ−ＡＭ２０６−１ｗ及びＴｇ−ＡＭ２０６−３ｗマウスでさらに高く、このことは、ＡＭ２０６がシナプス密度を増加させることを示す（グループ当たりｎ＝６）。スケールバー、２００μｍ。

【図3e】ＡＭ２０６の治療効果を示す図である。（ｅ）歯状回の顆粒細胞下層におけるダブルコルチン（Ｄｃｘ）陽性細胞の数（矢印）も、Ｔｇ−ＡＭ２０６−１ｗ及びＴｇ−ＡＭ２０６−３ｗマウスがコントロールＴｇ２５７６マウスより高く、このことは、神経発生を増強させることを示す（グループ当たりｎ＝６）。スケールバー、５０μｍ。^＊Ｐ＜０．０５。^＊＊Ｐ＜０．０１。ｎｓ、有意差なし。バーは、平均±標準平均誤差を示す。

【図4a】アンタゴミアの鼻腔伝達を示す図である。（ａ）鼻腔を介した伝達を行って２４時間後、Ｃｙ３ラベルされたＡＭ２０６は、嗅球、皮質及び海馬に分散した。ビヒクルを投与したコントロール脳は、何のＣｙ３蛍光も発現しなかった。スケールバー、５０μｍ。

【図4b】アンタゴミアの鼻腔伝達を示す図である。（ｂ）ＡＭ２０６を鼻腔伝達したＴｇ２５７６マウス（Ｔｇ−ＩＮＤ−ＡＭ２０６）は、１週間後にウェスタンブロッティング（左側）及びデンシトメトリー（右側）に示されたように、ビヒクルを処理したＴｇ２５７６コントロール（Ｔｇ−ＩＮＤ−ｃｔｒ）と比較し、マウスの脳全体のＢＤＮＦレベルを増加させる。

【図4c】アンタゴミアの鼻腔伝達を示す図である。（ｃ）処理１週間後、文脈的恐怖条件付けテストを行い（グループ当たりｎ＝５）、Ｔｇ−ＩＮＤ−ｃｔｒよりＴｇ−ＩＮＤ−ＡＭ２０６でフリージングタイムがさらに長かった。

【図4d】アンタゴミアの鼻腔伝達を示す図である。（ｄ）手がかり条件付けテストでは、グループ間に何の差もなかった（グループ当たりｎ＝５）。点線は、音響手がかりを示す。

【図4e】アンタゴミアの鼻腔伝達を示す図である。（ｅ）Ｙ−迷路テストは、ＡＭ２０６の鼻腔伝達が、コントロールマウスと比較し、循環行動を増加させることを示した（グループ当たりｎ＝５）。^＊Ｐ＜０．０５。バーは、平均±標準平均誤差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0044】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

【実施例】

【0045】

実験材料及び実験方法
ＡＤ（アルツハイマー疾患）モデル
本実験は、ＡＡＡＬＡＣ（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、国際実験動物管理公認協会）により認可されたソウル大学病院のＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の許可を得て実施した。スウェーデン二重変異（スウェーデン変異；Ｌｙｓ６７０→Ａｓｎ、Ｍｅｔ６７１→Ｌｅｕ）を含むヒトアミロイド前駆体タンパク質の６９５アミノ酸イソフォームをプリオンプロモーターの調節下で発現するＴｇ２５７６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）（Ｈｓｉａｏ ｅｔ ａｌ．、１９９６）をＡＤ形質転換モデルとして利用した。形質転換及び野生型マウスを、独立したケージ及び室温（２５℃）で飲水に自由に摂取できるようにしながら１２時間の明暗サイクル条件下で維持し、７ヶ月齢又は１２ヶ月齢でｍｉＲＮＡ分析に利用した。

【0046】

ｍｉＲＮＡマイクロアレイ
マウス又はヒト用ｍｉＲＮＡマイクロアレイキットを使用して行った（Ａｇｉｌｅｎｔ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ８×１５Ｋ ｋｉｔｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）。マウス脳から抽出したＲＮＡを二匹分ずつ一つに集めた。冷凍されたヒト側頭皮質（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）サンプルは、ボストン大学アルツハイマー病センター（Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の脳バンクから得た。本発明者らは、マウスサンプルを下記のＲＮＡクオリティー基準に適したものを利用した：２６０／２８０比率＞１．８、２６０／２３０比率＞２．０、２８Ｓ／１８Ｓ ｒＲＮＡ比率＞１．６、及びＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒ）＞８．０。ヒト剖検サンプルは、ＲＮＡの死後分解（ｐｏｓｔ−ｍｏｒｔｅｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を経るため、アルツハイマーとコントロールサンプルは、死後の期間を合わせた。

【0047】

Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ｍｉＲＮＡのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、ｍｉＲＮＡ検出キット（ｍｉｒＶａｎａ ｑＲＴ−ＰＣＲ ｍｉＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）及びプライマーセット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を利用して行った。内在性ｓｎｏＲＮＡ２０２検出キット（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｓｎｏＲＮＡ２０２ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ａｍｂｉｏｎ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してレベルを測定し、ｍｉＲＮＡレベルの規準化に使用した。ｍｉＲＮＡを、３５サイクルで増幅した後、１．０％アガーロスゲル電気泳動で可視化した。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現のためのＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、遺伝子発現キット（ＴａｑＭａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のプライマー及びプローブを使用して行った。

【0048】

ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション
ロックド核酸（ＬＮＡｓ）を利用して、ｍｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕにおける発現を分析した。前記ＬＮＡｓは、ｍｉＲＮＡ検出に必要な短いプローブに対してハイブリッド形成温度を大きく増加させ、強化された厳密条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）が利用されるようにするバイ−サイクリックＲＮＡ類似体である（Ｏｂｅｒｎｏｓｔｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００７）。ｍｉＲＮＡ検出に利用されるＬＮＡプローブは、Ｅｘｉｑｏｎで購入し、ＤＩＧ ３０ ｅｎｄラベリングキット（Ｒｏｃｈｅ）を利用して凍結切片化組織をラベリングした（Ｏｂｅｒｎｏｓｔｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００７）。

【0049】

ｍｉＲＮＡのターゲット遺伝子予測
ｍｉＲＮＡ成熟配列データベースをｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）から得た。マウス遺伝子３’−非解読部位（ＵＴＲ）にあるｍｉＲＮＡターゲット候補位置を見つけるために、３種のターゲット予測プログラムを利用した：ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）（Ｌｅｗｉｓ、２００５）；ＰｉｃＴａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ／）（Ｋｒｅｋ、２００５）、及びｍｉｃｒｏＴ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉａｎａ．ｃｓｌａｂ．ｅｃｅ．ｎｔｕａ．ｇｒ／ｍｉｃｒｏＴ／）（Ｋｉｒｉａｋｉｄｏｕ、２００４）。

【0050】

アルツハイマーマウスのアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）処理
マウスに１％ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ、３０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジンヒドロクロライド（４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射してマウスを麻酔した。３０ゲージハミルトン注射器を使用して、０．５ｎｍｏｌのアンタゴミアＡＭ２０６（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ−５’−ｃｃａ ｃａｃ ａｃｕ ｕｃｃ ｕｕａ ｃａｕ ｕｃｃ ａ−３’）又はスクランブル配列対照アンタゴミア（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ−５’−ａａｇ ｇｃａ ａｇｃ ｕｇａ ｃｃｃ ｕｇａ ａｇｕ ｕ−３’）（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を含む１μＬのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を、下記の座標で第三脳室に５分間注入した：ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）から前後方向（ａｎｔｅｒｏ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）、−１．０６ｍｍ；左右方向（ｍｅｄｉｏ−ｌａｔｅｒａｌ）、０．００ｍｍ；背腹方向（ｄｏｒｓｏ−ｖｅｎｔｒａｌ）、−２．４ｍｍ。注射針を、注入後さらに５分間座標に維持した後、穏やかに除去した。ＡＭ２０６の拡散を可視化するために、マウスに、ＡＭ２０６の代わりにＣｙ３ラベルされたＡＭ２０６（Ｃｙ３−２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ−５’−ｃｃａ ｃａｃ ａｃｕ ｕｃｃ ｕｕａ ｃａｕ ｕｃｃ ａ−３’、Ｂｉｏｎｅｅｒ）を注入した。ＡＭ２０６の鼻腔投与のために、マウスを麻酔して、仰臥位で頭部を直立姿勢（ｕｐｒｉｇｈｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）にした。ＡＭ２０６又はＣｙ３ラベルされたＡＭ２０６ ５ｎｍｏｌを含む０．１％ｖ／ｖジエチルピロカーボネートで処理された蒸留水２４μＬを２分毎に各外鼻孔にピペットで４μＬずつ落として投与した（計６分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ））。コントロールＴｇ２５７６マウスは、週齢を合わせて同量のビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）で処理した。

【0051】

文脈的及び手がかり的恐怖条件付け（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ａｎｄ ｃｕｅｄ ｆｅａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）
恐怖条件付けは、従来方法（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００８）にしたがって、恐怖条件付けショックチャンバシステム（Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｈｉｔｅｈａｌｌ、ＰＡ、米国）で実施した。条件付けのために、マウスを恐怖条件付け装置チャンバに５分間置いた後、２８−ｓアコースティック条件付け刺激を与えた後、非条件付け刺激として床グリッドに２秒間０．７ｍＡショックを印加した。前記過程を６０秒間隔で３回繰り返した。文脈的記憶を評価するために、条件付け２４時間後、マウスをアコースティック刺激無しに訓練装置に再び移した後、萎縮行動を５分間観察した。手がかり記憶を評価するために、条件付け２４時間後、異なる匂い、床及び視覚を有するチャンバにマウスを移して、その行動を５分間モニタリングした。前記試験の最終３分間、動物をアコースティック刺激に露出させた。呼吸運動を除いた運動の欠如を示すクラウチング位置で定義される萎縮行動の長さを測定し、恐怖反応を定量化した（Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００８）。

【0052】

Ｙ迷路試験
Ｙ−迷路試験を従来の方法に従って行った（Ｓａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８）。迷路を黒色プラスチックで、それぞれのアームを長さ３５ｃｍ、高さ１５ｃｍ、幅５ｃｍとして製作して、同一な角度に配置した。マウスの一つのアームの末端に配置して、迷路を通って５分間自由に移動するようにした。アーム進入のシリーズを視覚的に記録し、マウスの踵がアーム内に完全に位置した場合を、アーム進入に成功したと評価した。交差回数（Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）は、オーバーラッピングトリプレットセットの三つのアームへの連続的な進入で定義した。％交差回数は、実際：可能性（ａｃｔｕａｌ ｔｏ ｐｏｓｓｉｂｌｅ）の比で計算した。

【0053】

ウェスタンブロッティング
麻酔されたマウスを断頭で屠殺し、脳を直ちに摘出した。各脳のホモジネートに対して、従来の方法によって、ウェスタンブロッティングのために処理し（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、２００９）、この場合、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ、Ａｂｃａｍ）、ＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１、Ａｂｃａｍ）、Ｎｏｔｃｈ３（Ａｂｃａｍ）、ＭＥＯＸ２（Ａｂｃａｍ）又はβ−アクチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を利用した。増強化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）でブロットを現像し、デジタル的にスキャニングした（ＧＳ−７００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）。それぞれのバンドのβ−アクチンに対する相対的光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｔ^ＴＭソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を利用して測定した。脳ホモジネートにおいてＡβ４０及びＡβ４２のレベルは、Ａβ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して測定した。

【0054】

Ｔｇ２５７６マウスの組織学分析
マウスを麻酔して、心臓に１０ｍＬの冷たい塩水及び１０ｍＬの４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ ＰＢＳを灌流させた。２０μｍ厚の切片を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ハリエニシダ（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）Ｉレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）又はＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、シナプトフィシン又はダブルコルチン（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）に対する抗体で染色した。海馬に対するシナプトフィシン染色の光学的密度を求めるために、各マウスから三つの連続した冠状面組織切片（５００μｍ間隔、ブレグマから前後方向に約−１．５ｍｍから−２．５ｍｍ）を、Ｉｍａｇｅ−Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して分析した。値は、コントロールＴｇ２５７６マウスとの相対値で示した。隣り合う三つの海馬セクション（５００μｍ間隔）において、歯状回の顆粒下層でダブルコルチン免疫反応細胞の数を測定して、歯状回の長さ（１２００μｍ）により規準化した。

【0055】

二重ルシフェラーゼ試験（Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ）
可能なターゲット遺伝子の３’−ＵＴＲ位置に対するオリゴヌクレオチドを、５’−末端及び３’−末端にＳａｃＩ及びＸｂａＩの制限酵素サイトを含めてデザインした。その後、ｐｍｉｒＧＬＯ二重ルシフェラーゼｍｉＲＮＡターゲット発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でサブクローニングした。ＢＤＮＦの全体３’−ＵＴＲシーケンス（ＳｗｉｔｃｈＤＢ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を有するトランスフェクション用のルシフェラーゼレポーターコンストラクションを用いた。２４ウェルプレートにＨｅＬａ細胞（ウェル当たり５×１０^４細胞）を撒いて２４時間培養後、細胞を３０ｐｍｏｌのｍｉＲＮＡ−２０６二重鎖（又はスクランブルされたｍｉＲＮＡ二重鎖；Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｄａｅｊｏｎ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）及び５０ｎｇのルシフェラーゼ発現ベクターでリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を利用してトランスフェクションした。ホタル（Ｆｉｒｅｆｌｙ）及びウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ活性は、４８時間後、二重ルシフェラーゼレポーター１０００アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価し、規準化した値（ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性）を分析のために用いた。

【0056】

樹状突起スパイン（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｓｐｉｎｅ）密度の分析
Ｅ１７ Ｃ５７ＢＬ／６マウス胚芽からプライマリー海馬ニューロンを培養した。ニューロンを、ポリリジンコートされたカバースリップ上で、星状細胞フィーダー層上に懸濁することで培養し、Ｎ２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。Ａβオリゴマーを作製するために、５ｍＭ Ａβ４２ペプチド又はスクランブルＡβペプチド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を、冷たい培養培地を用いて１００μＭに希釈した後、１０分間超音波処理して、４℃で２４時間放置した。培養３週後、ニューロンを５μＭ Ａβオリゴマーで処理した。これと同時に、培養培地に５００ｎＭのＡＭ２０６又はスクランブルアンタゴミアを加えた。４８時間後、ニューロンを４０分間４％パラホルムアルデヒドで固定し、ローダミンラベルされたファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０ Ｍｅｔａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で樹状突起スパインを観察した。各グループで３０個の細胞から無作為に選別された１００個の樹状突起セグメントにおけるスパインの数をカウントした。密度は、１０μｍの樹状突起長さに対して算出した。

【0057】

データ分析及び統計
ｍｉＲＮＡ発現のためのヒートマップ（Ｈｅａｔ ｍａｐｓ）をＺ−スコアを利用して製作した。二つのグループ間の比較のためにＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ テストを用い、三つ以上のグループ間の比較のためにＫｒｕｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ変化分析を用いた。また、死後グループ間の比較のために、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ テストを用いた。全ての統計的分析は、ＳＰＳＳ（ｖｅｒｓｉｏｎ １７．０、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｓ、ＮＹ）を用いて行った。０．０５未満の両側検定ｐ値が統計的に有意であることを示す。

【0058】

実験結果
アルツハイマーモデルにおけるｍｉＲ−２０６の上方調節
アルツハイマーモデルにおいて変化したｍｉＲＮＡの一つがＢＤＮＦの調節に重要なｍｉＲＮＡであるという仮説に基づいて、本発明者らは、まずマイクロアレイを利用し、７月齢及び１２月齢の野生型（ＷＴ）及びアルツハイマーの形質転換モデルのＴｇ２５７６マウス間のｍｉＲＮＡを比較した（図１ａ）。Ｔｇ２５７６マウスにおいて、７月齢では増加したＡβ４２発現を示し、１２月齢では記憶に障害があることが確認された。７月齢及び１２月齢マウスにおいて最も上方調節されたｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０６であることを確認した。Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲにより１２月齢Ｔｇ２６７６マウスでｍｉＲ−２０６の上方調節が確認された（図１ｂ）。

【0059】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションも、１２月齢Ｔｇ２５７６マウスの脳でｍｉＲ−２０６の拡散した発現が増加することを示した（図１ｃ）。これと同様に、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウスの神経芽細胞腫細胞においてＡβ４２がｍｉＲ−２０６のレベルを増加させるが、ＨＵＶＥＣ（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）ではそうではないことを示した（図１ｄ）。このような知見がヒトアルツハイマー疾病に関連があるかどうかを評価するため、アルツハイマー患者（Ｂｒａａｋ ｓｔａｇｅ Ｖ、ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｒａｔｉｎｇ［ＣＤＲ］３）及びほぼ同じ年齢と性別の四人の非アルツハイマーコントロール群（Ｂｒａａｋ ｓｔａｇｅ Ｉ、ＣＤＲ０）からのヒト上側頭皮質（ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ）サンプルでｍｉＲ−２０６のレベルを測定した。我々の脳バンクにおいて、略３時間〜３．５時間の死後期間は、剖検でヒト脳組織を得る最も短い実際的な時間である。ヒト剖試料は、ＲＮＡの死後分解を経るため、２８Ｓ／１８Ｓ ｒＲＮＡ比率及びＲＮＡ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒは、マウスの場合、死後２時間後に減少する。アルツハイマー及びコントロールサンプルは、死後間隔を揃えて比較されて、このような条件でｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを通じて、アルツハイマー脳においてｍｉＲ−２０６が上方調節されたことを確認した（図１ｅ）。

【0060】

ＡＤモデルにおけるアンタゴミア−２０６の治療学的応用
アルツハイマーモデルにおけるｍｉＲ−２０６の持続的な上方調節は、これを利用したターゲット遺伝子探索を可能にし、実際、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ及びｍｉｃｒｏＴは、マウス及びヒト３’−ＵＴＲｓ部位でＢＤＮＦをコーディングする三つの推定ｍｉＲＮＡ−２０６のターゲットを発見した（図２ａ）。本発明者らは、Ｔｇ２５７６マウスの月齢によってｍｉＲ−２０６のレベル増加及びＢＤＮＦのタンパク質レベルが減少することを見出し、これを裏付けた。

【0061】

さらに試験するために、マウスＢＤＮＦ ｍＲＮＡの推定結合部位（ＢＤＮＦ＃１、＃２、＃３）及びＢＤＮＦ ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲを含む、ターゲットとなり得る位置を有するｍｉＲ−２０６及びルシフェラーゼベクターでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションさせた。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡの全３’−ＵＴＲ及びＢＤＮＦ＃３を有するベクターを含む細胞において、ｍｉＲ−２０６のトランスフェクションは、ルシフェラーゼ活性を減少させ、このことは、ｍｉＲ−２０６が３’−ＵＴＲへの結合を介して直接的にＢＤＮＦ ｍＲＮＡの翻訳を抑制することを示す（図２ｂ）。また本発明者らは、ｍｉＲ−２０６を中和するアンタゴミアＡＭ２０６でコトランスフェクションしたＮｅｕｒｏ−２ａ細胞及びＨＵＶＥＣにおいて、ＢＤＮＦのタンパク質レベルが減少するということを見出した（図２ｃ）。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞においてＡβオリゴマーの処理は、ｍｉＲ−２０６を増加させ、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡレベルの減少無しにＢＤＮＦタンパク質レベルを減少させ、このことは、ＢＤＮＦの翻訳抑制を示す（図２ｄ）。ＡβオリゴマーによるＢＤＮＦタンパク質レベルの減少は、細胞をＡＭ２０６処理することにより回復した（図２ｅ）。プライマリーマウス海馬ニューロンにおいてＡβオリゴマーは、ＡＭ２０６処理を通じて回復された樹上突起の密度を減少させた（図２ｆ）。

【0062】

このような結果は、ｍｉＲ−２０６によりＢＤＮＦ発現が下方調節され得、したがって、アルツハイマーが進行する可能性を示唆する。インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でｍｉＲ−２０６の機能を調べるために、Ｃｙ３ラベルされたＡＭ２０６（Ｃｙ３−ＡＭ２０６）を１２月齢Ｔｇ２５７６マウスの第三脳室に注入して、Ｃｙ３−ＡＭ２０６は、一日後、海馬及び周辺組織に拡散したことが観察された（図２ｇ）。Ｕｌｅｘ−レクチン陽性内皮細胞、ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）陽性グリア細胞及びＭＡＰ２陽性神経細胞によりＣｙ３−ＡＭ２０６が検出された（図２ｈ）。実際、スクランブルアンタゴミアと比較し、ＡＭ２０６を脳室内に注入した１２月齢Ｔｇ２５７６マウスは、１週後にＢＤＮＦの脳レベルが非常に増加した（図２ｉ）。さらに、Ｔｇ２５７６マウスのＡＭ２０６注入は、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ）を活性化させ、ｃ−ＪＮＫ（Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ）及びＧＳＫ−３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β）を非活性化させた。これは、ＢＤＮＦシグナリングが増加することを示す。

【0063】

アンタゴミア−２０６は、ＡＤマウスにおいて記憶力及びシナプス再生を増加させた
次いで、本発明者らは、ＢＤＮＦ増強の治療効果を、１２ヶ月目の記憶テストの各１週前又は３週前にＴｇ２５７６マウスの第三脳室にＡＭ２０６を注入することによって確認することを探求した。文脈的恐怖条件付けテストにおいて、Ｔｇ２５７６コントロールマウスのためのフリージングタイムが野生型マウスに比べてさらに低く、このことは、Ｔｇ２５７６マウスの海馬記憶に障害があることを示す（図３ａ）。注入後、１週及び３週目のフリージングタイムは、両方ともコントロールＴｇ２５７６マウスよりＡＭ２０６処理したＴｇ２５７６マウスの方がさらに高く、このことは、少なくとも３週間ＡＭ２０６が海馬記憶機能を増加させることを示す。扁桃体が重要な役割をする手がかり条件付け試験においては、グループ間に差はなかった（図３ｂ）。Ｙ−迷路テストにおいて、注入１週後にＡＭ２０６で処理されたＴｇ２５７６マウスは、Ｔｇ２５７６コントロールマウスよりさらに良好な行動を示した（図３ｃ）。その反面、ＡＭ２０６は、皮質又は海馬の全体プラーク面積には何の影響もないことを、チオフラビンＳ染色により確認し、またＡβ４０又はＡβ４２の脳レベルには影響を及ぼさないことを、ＥＬＩＳＡで測定して確認した。したがって、ＡＭ２０６マウスによる記憶向上は、Ａβレベルの変化によるものというより、メカニズムによるものであることが分かる。

【0064】

ＡＭ２０６がＢＤＮＦ発現を増加させるため、海馬シナプトフィシンレベル及びダブルコルチン陽性細胞の数への影響を測定した。Ｔｇ２５７６コントロールマウスでは、野生型マウスに比べシナプトフィシンレベルが低かった（図３ｄ）。テスト１週前又は３週前のＴｇ２５７６マウスへのＡＭ２０６注入は、Ｔｇ２５７６コントロールマウスと比較し、シナプトフィシン発現を増加させ、このことは、シナプス密度を増加させることを示す。さらに、Ｔｇ２５７６コントロールマウスにおいて、海馬歯状回においてダブルコルチン陽性細胞が野生型マウスより少数であるにもかかわらず、染色１週前又は３週前にＡＭ２０６を注入したマウスは、Ｔｇ２５７６コントロールマウスよりさらに多いダブルコルチン陽性細胞を示した（図３ｅ）。このことは、海馬の神経発生が増加することを示す。

【0065】

アンタゴミアの鼻腔投与効果
治療上の鼻腔投与は、嗅覚神経経路に沿って鼻腔から血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）を介して直接的に脳に伝達することにより、薬物を迅速に脳にアクセスさせることが容易であるため、薬物伝達方法のうち、この便利な非侵襲性方法は、アルツハイマー患者に効果的である。本発明者らは、アンタゴミアが同様にこのルートを経由して伝達されるかどうかを評価した。実際に、鼻腔伝達されたＣｙ３ラベルＡＭ２０６は、２４時間後、マウスの嗅球、皮質及び海馬から検出された（図４ａ）。多数のＭＡＰ２陽性神経細胞、Ｕｌｅｘ−レクチン陽性内皮細胞及び少数のＧＦＡＰ陽性グリア細胞がＣｙ３−ＡＭ２０６でラベルされた。鼻腔投与されたＡＭ２０６は、ビヒクル投与から１週後のＴｇ２５７６マウスと比較して、ＢＤＮＦの脳レベルを増加させた（図４ｂ）。さらに、１週後のＹ−迷路テスト（図４ｅ）及び恐怖条件付けテスト（図４ｃ及び４ｄ）による測定結果によると、ＡＭ２０６の鼻腔伝達は、マウスの記憶能力を増加させた。これらの結果は、鼻腔を介したアンタゴミアの脳への伝達が実現可能であることを示す。

【0066】

考察
アルツハイマー疾患におけるｍｉＲＮＡの役割及び変化についての以前の研究では、ＢＡＣＥ１／β−セクレターゼの発現又はＮＦ−κＢ誘導炎症を調節するｍｉＲ−２９ａ／ｂ−１、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２９８及びｍｉＲ−３２８などの多様なｍｉＲＮＡを同定した。ｍｉＲ−２０６は、通常、筋肉組織で発現し、筋形成及び神経筋接合部の再生に関与する。ｍｉＲ−２０６のレベルは、正常の脳では非常に低いが、アルツハイマーでは異常に高く発現する。実験的に、脳におけるｍｉＲ−２０６の上方調節は、脳虚血及び神経毒性への露出後に観察される。ヒト場合、筋萎縮性側索硬化症患者の前頭皮質でｍｉＲ−２０６発現が増加し、統合失調症患者では、ｍｉＲ−２０６の遺伝的変異が観察された。さらに、本発明の結果は、ｍｉＲ−２０６がＢＤＮＦレベルを抑制することにより、アルツハイマーの発病にも関与するということを示す。したがって、本発明は、アルツハイマーの治療にｍｉＲ−２０６調節因子を利用してアプローチしなければならない明白な理由を提供する。

【0067】

アルツハイマーモデルにおいて、レンチウイルスベクターを介するか、タンパク質注入ポンプ又は神経幹細胞を利用する場合、ＢＤＮＦを大脳に伝達することができ、記憶能力及びシナプス密度を向上させる。しかし、神経栄養因子を脳に伝達することは、侵襲的な施術が必要であり、中和抗体の発生により、苦痛を受けるようになる。本発明は、ＡＭ２０６の鼻腔伝達が脳内ＢＤＮＦを向上させるための実現可能な代替方法であることを示し、アンタゴミアを利用した同様のアプローチを通じて、他の脳疾患にも応用可能性を提示する。

【0068】

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Ｗａｎｇ ＷＸ，Ｒａｊｅｅｖ ＢＷ，Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ ＡＪ，Ｒｅｎ Ｎ，Ｔａｎｇ Ｇ，Ｈｕａｎｇ Ｑ，Ｒｉｇｏｕｔｓｏｓ Ｉ，Ｎｅｌｓｏｎ ＰＴ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ−１０７ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｅａｒｌｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｌｅａｖｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ １．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８；２８：１２１３−２３．
Ｗａｎｇ Ｘ，Ｌｉｕ Ｐ，Ｚｈｕ Ｈ，Ｘｕ Ｙ，Ｍａ Ｃ，Ｄａｉ Ｘ，Ｈｕａｎｇ Ｌ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｑｉｎ Ｃ．ｍｉＲ−３４ａ，ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ａ ｄｏｕｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｃｌ２ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２００９；８０：２６８−７３．
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Ｗｕ Ｚ，Ｇｕｏ Ｈ，Ｃｈｏｗ Ｎ，Ｓａｌｌｓｔｒｏｍ Ｊ，Ｂｅｌｌ ＲＤ，Ｄｅａｎｅ Ｒ，Ｂｒｏｏｋｓ ＡＩ，Ｋａｎａｇａｌａ Ｓ，Ｒｕｂｉｏ Ａ，Ｓａｇａｒｅ Ａ，Ｌｉｕ Ｄ，Ｌｉ Ｆ，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ Ｄ，Ｇａｓｉｅｗｉｃｚ Ｔ，Ｚｉｄｏｖｅｔｚｋｉ Ｒ，Ｓｏｎｇ Ｘ，Ｈｏｆｍａｎ Ｆ，Ｚｌｏｋｏｖｉｃ ＢＶ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＭＥＯＸ２ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５；１１：９５９−６５．

【0069】

本発明の好ましい実施例について記述したが、本発明の精神の範囲内にあるそれらの変形及び修正が、当業者にとって明白であることは理解されるであろう。また、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲及びそれらの均等物によって決定されることは理解されるであろう。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]