特許 5710264 ヒト胚性幹細胞の分化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5710264

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年4月30日

(54)【発明の名称】ヒト胚性幹細胞の分化

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/073 20100101AFI20150409BHJP

   C12N 5/07 20100101ALI20150409BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/00 202B

   C12N5/00 202Z

【請求項の数】78

【全頁数】62

(21)【出願番号】特願2010-536133(P2010-536133)

(86)(22)【出願日】2008年11月25日

(65)【公表番号】特表2011-504753(P2011-504753A)

(43)【公表日】2011年2月17日

(86)【国際出願番号】US2008084705

(87)【国際公開番号】WO2009070592

(87)【国際公開日】20090604

【審査請求日】2011年10月17日

(31)【優先権主張番号】60/990,529

(32)【優先日】2007年11月27日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】596159500

【氏名又は名称】ライフスキャン・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｌｉｆｅｓｃａｎ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100088605

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 公延

(74)【代理人】

【識別番号】100130384

【弁理士】

【氏名又は名称】大島 孝文

(72)【発明者】

【氏名】レザニア・アリレザ

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５００００３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／１１６０７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 nature biotechnology，２００６年１１月，Vol. 24, No. 11，p. 1392-1401

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７３

Ｃ１２Ｎ ５／０７

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿上アクチビンＡおよびＷｎｔ−３ａを含む培地中、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．エキセンジン−４およびＤＡＰＴを含む培地中、前記細胞をネトリンで処理することによって、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．エキセンジン−４、ＩＧＦおよびＨＧＦを含む培地中、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。

【請求項2】

請求項１に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、およびＢＭＰを阻害可能な因子からなる群から選択される少なくとも１種類の更なる因子で処理することによって行われる、方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、およびＢＭＰを阻害可能な因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する、方法。

【請求項4】

請求項２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項5】

請求項４に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項6】

請求項４に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項7】

請求項２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項8】

請求項７に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項9】

請求項７に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項10】

請求項１または２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項11】

請求項１０に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項12】

請求項１０に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項13】

請求項２に記載の方法において、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される前記因子が、ＦＧＦ−７である、方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、方法。

【請求項15】

請求項１３に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、方法。

【請求項16】

請求項２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度のレチノイン酸で処理する、方法。

【請求項17】

請求項２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１μＭの濃度のレチノイン酸で処理する、方法。

【請求項18】

請求項２に記載の方法において、前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、方法。

【請求項19】

請求項１８に記載の方法において、シクロパミンを約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項20】

請求項１８に記載の方法において、シクロパミンを０．２５μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項21】

請求項２に記載の方法において、前記ＢＭＰを阻害可能な因子がＢＭＰ４阻害剤である、方法。

【請求項22】

請求項２１に記載の方法において、前記ＢＭＰ４阻害剤がノギンである、方法。

【請求項23】

請求項２１に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、方法。

【請求項24】

請求項２１に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、方法。

【請求項25】

請求項１または２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、方法。

【請求項26】

請求項１または２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、方法。

【請求項27】

請求項１または２に記載の方法において、前記ネトリンが、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される、方法。

【請求項28】

請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、方法。

【請求項29】

請求項２８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、方法。

【請求項30】

請求項２８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、方法。

【請求項31】

請求項２８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、方法。

【請求項32】

請求項２８に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、方法。

【請求項33】

請求項３２に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、方法。

【請求項34】

請求項３３に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項35】

請求項３３に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、方法。

【請求項36】

請求項３３に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、方法。

【請求項37】

請求項２８に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、方法。

【請求項38】

請求項１に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、方法。

【請求項39】

請求項３８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、方法。

【請求項40】

請求項３８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、方法。

【請求項41】

請求項３８に記載の方法において、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、方法。

【請求項42】

請求項３８に記載の方法において、前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、方法。

【請求項43】

請求項４２に記載の方法において、前記γ−セクレターゼ阻害剤がＬ−６８５，４５８である、方法。

【請求項44】

請求項２に記載の方法において、Ｌ−６８５，４５８を約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項45】

請求項３８に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、方法。

【請求項46】

請求項に４５記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、方法。

【請求項47】

請求項に４６記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項48】

請求項４６に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、方法。

【請求項49】

請求項４６に記載の方法において、前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、方法。

【請求項50】

請求項２８に記載の方法において、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、方法。

【請求項51】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成する方法において、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿上アクチビンＡおよびＷｎｔ−３ａを含む培地中、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．エキセンジン−４およびＤＡＰＴを含む培地中、前記細胞をネトリンで処理することにより、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。

【請求項52】

請求項５１に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、およびＢＭＰを阻害可能な因子からなる群から選択される少なくとも１種類の更なる因子で処理することによって行われる、方法。

【請求項53】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、およびＢＭＰを阻害可能な因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する、方法。

【請求項54】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、およびＢＭＰを阻害可能な因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約６日間処理する、方法。

【請求項55】

請求項５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項56】

請求項５５に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項57】

請求項５５に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項58】

請求項５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項59】

請求項５８に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項60】

請求項５８に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項61】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、方法。

【請求項62】

請求項６１に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、方法。

【請求項63】

請求項６１に記載の方法において、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ネトリン、または、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、方法。

【請求項64】

請求項５２に記載の方法において、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される前記因子が、ＦＧＦ−７である、方法。

【請求項65】

請求項６４に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、方法。

【請求項66】

請求項６４に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、方法。

【請求項67】

請求項５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度のレチノイン酸で処理する、方法。

【請求項68】

請求項５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１μＭの濃度のレチノイン酸で処理する、方法。

【請求項69】

請求項５２に記載の方法において、前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、方法。

【請求項70】

請求項６９に記載の方法において、シクロパミンを約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項71】

請求項６９に記載の方法において、シクロパミンを０．２５μＭの濃度で使用する、方法。

【請求項72】

請求項５２に記載の方法において、前記ＢＭＰを阻害可能な因子がＢＭＰ４阻害剤である、方法。

【請求項73】

請求項７２に記載の方法において、前記ＢＭＰ４阻害剤がノギンである、方法。

【請求項74】

請求項７２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、方法。

【請求項75】

請求項７２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、方法。

【請求項76】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、方法。

【請求項77】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、方法。

【請求項78】

請求項５１または５２に記載の方法において、前記ネトリンが、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される、方法。

【発明の詳細な説明】

【開示の内容】

【0001】

〔発明の分野〕
本発明は、多能性幹細胞の分化を促進するための方法、及びこうした方法に関連する、又はこうした方法で得られる生成物を提供する。より詳細には、本発明は、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞を形成するための改良された方法を提供する。本発明は更に、フィーダー細胞層を使用することなく多能性幹細胞の分化を促進する方法、及びこうした方法に関連する、又はこうした方法で得られる生成物を提供する。本発明は更に、多能性幹細胞から誘導されたインスリン産生細胞においてグルコース刺激インスリン分泌を促進する方法を提供する。

【0002】

〔背景技術〕
１型糖尿病の細胞置換療法における進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足のため、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。

【0003】

脊椎動物の胚発生では、多能性細胞は、原腸形成として知られる過程において３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞群を生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間段階（ステージ）を経て発生する。この過程における中間ステージは胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ４、Ｍｉｘｌ１、ＣＸＣＲ４及びＳｏｘ−１７などの多くのマーカーを発現する。

【0004】

多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーを発現し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は、通常、アルカリホスファターゼ活性を有し、この活性は、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories）、バーリンゲーム、カリフォルニア州）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現する。

【0005】

多能性幹細胞は、様々な方法で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で一般的に培養される。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。

【0006】

例えば、ルービノフら（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））及びトンプソンら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層（mouse embryonic fibroblast feeder cell layer）を用いてヒト胚盤胞からの多能性幹細胞系を培養することについて開示している。

【0007】

リチャードら（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒトの成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。リチャードらは、「成人の皮膚線維芽細胞フィーダー上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。

【0008】

米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、無フィーダー培養中で霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を更に開示している。

【0009】

別の例として、ワンら（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。

【0010】

別の例として、ストイコビッチら（Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。

【0011】

更なる別の例として、ミヤモトら（Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。

【0012】

アミットら（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒトの包皮由来のフィーダー細胞層を開示している。

【0013】

別の例として、インズンザら（Ｉｎｚｕｎｚａ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。

【0014】

米国特許第６６４２０４８号は、無フィーダー培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。

【0015】

別の例として、国際特許出願公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際特許出願公開第２００５０１４７９９号は、「本発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって調整される」と述べている。

【0016】

別の例として、スーら（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。

【0017】

別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。

【0018】

代替的な一培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、チェオンら（Ｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘発することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、無フィーダーかつ無血清の培養システムを開示している。

【0019】

別の例として、リーベンシュタインら（Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）は、ｂＦＧＦを添加した培地を用い、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下でヒト胚性幹細胞を長期にわたって培養するための方法を開示している。

【0020】

別の例として、米国特許出願公開２００５０１４８０７０号は、血清の非存在下及び線維芽フィーダー細胞の非存在下において合成培地中でヒト胚性幹細胞を培養する方法を開示している。この方法は、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種類のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１種類のインスリン又はインスリン代替物を含む培地中で幹細胞を培養することを含み、前記培地は、哺乳動物胎児血清を基本的に含まず、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌの、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化することが可能な線維芽細胞増殖因子を含み、該増殖因子は、線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給され、前記培地は、フィーダー細胞又は馴化培地の非存在下で未分化状態の幹細胞の増殖を支持するものである。

【0021】

別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液中では、培地は培養される幹細胞と比較してほぼ等張である。与えられた培養中、この特定の培地は基礎培地、並びに始原幹細胞の実質的に未分化状態での増殖を支持するうえで必要とされるｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸のそれぞれの所与の量を含む。

【0022】

別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態において、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基礎培地を含む、細胞培地を提供する。この基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するうえで効果的な栄養素血清、並びに、フィーダー細胞、及びフィーダー細胞から誘導される細胞外マトリクス成分からなる群から選択される基質と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びに、ヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。

【0023】

別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様において本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する。哺乳動物の胎児血清を基本的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも基本的に含まない）培養中で、単に線維芽細胞フィーダー層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で幹細胞を培養する。好ましい一形態では、充分な量の線維芽細胞増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽細胞フィーダー層の必要性がなくなる」と述べている。

【0024】

更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、基本的に無フィーダーかつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基礎培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のインスリン、及び、ｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持するうえで充分な量のアスコルビン酸を含む、培地を開示している。

【0025】

別の例として、国際特許出願公開第２００５０８６８４５号は、未分化の幹細胞を維持するための方法であって、幹細胞を未分化状態に維持するのに充分な量の形質転換増殖因子β（transforming growth factor：ＴＧＦβ）のタンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のタンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに充分な時間だけ、幹細胞を曝露することを含む、方法を開示している。

【0026】

多能性幹細胞は、細胞外マトリクスでコーティングされた組織培養基質上で培養及び分化させることができる。細胞外マトリクスは、組織培養基質にコーティングする前に希釈してもよい。細胞外マトリクスを希釈し、組織培養基質をコーティングするうえで適した方法の例を、クラインマンら（Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：３１２（１９８６））、及びハドレーら（Ｈａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：１５１１（１９８５））に見ることができる。

【0027】

膵臓は、胚体内胚葉が膵臓内胚葉へと分化することによって形成される。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子であるＰｄｘ１を発現する。Ｐｄｘ１の非存在下では、膵臓は腹側芽及び背側芽の形成以降は発生を停止してしまう。したがって、Ｐｄｘ１の発現は、膵臓の器官形成における重要な過程である。成熟した膵臓は、細胞型の中でも特に外分泌組織及び内分泌組織を含んでいる。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉が分化することによって生じる。

【0028】

膵島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、ルメルスキー（Lumelsky）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９，２００１）は、マウスの胚性幹細胞が膵島に類似したインスリン分泌構造に分化することを報告している。ソリア（Soria）ら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。

【0029】

一例において、ホリ（Hori）ら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。

【0030】

別の例として、ブリスズザック（Blyszczuk）ら（ＰＮＡＳ １００：９９８，２００３）は、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚性幹細胞からインスリン産生細胞が生成することを報告している。

【0031】

ミカレフ（Micallef）らは、レチノイン酸によって、Ｐｄｘ１陽性膵臓内胚葉を形成する胚性幹細胞の分化決定（commitment）を制御することが可能であることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終期に相当する期間において胚性幹細胞の分化の４日目に培養に加えると、Ｐｄｘ１の発現を最も効果的に誘導する（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１，２００５）。

【0032】

ミヤザキ（Miyazaki）らは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。ミヤザキらの結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞においてインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増大させることを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０，２００４）。

【0033】

スカウディ（Skoudy）らは、マウス胚幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン、及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。スカウディ（Ｓｋｏｕｄｙ）らはまた、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写産物のレベルが増大したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。

【0034】

シラキ（Shiraki）らは、胚性幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特異的に促進する増殖因子の効果を研究している。シラキらは、ＴＧＦβ２によってＰｄｘ１陽性細胞が高い比率で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６．）。

【0035】

ゴードン（Gordon）らは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下で、マウス胚性幹細胞からブラキュリ（brachyury）^＋／ＨＮＦ−３β^＋内胚葉細胞が誘導されることを示している（米国特許出願公開２００６／０００３４４６８（Ａ１）号）。

【0036】

ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐ １６８０６，２００６）らは、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ノーダル（nodal）／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。

【0037】

しかしながら胚性幹細胞の発生のマウスモデルは、例えばヒトなどのより高等な哺乳動物における発生プログラムを正確に模倣していない可能性がある。

【0038】

トムソン（Thomson）らはヒトの胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４，１９９８）。これと同時に、ギアハルト（Gearhart）及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。単純に白血病阻害因子（ＬＩＦ）と培養することによって分化を妨げることが可能なマウス胚性幹細胞と異なり、ヒト胚性幹細胞は極めて特殊な条件下で維持しなければならない（米国特許第６，２００，８０６号、国際特許出願公開第９９／２０７４１号、同第０１／５１６１６号）。

【0039】

ダムールら（D’Amour）は、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞をマウスの腎臓カプセル下に移植すると、ある内胚葉性臓器の特徴を有するより成熟した細胞に分化した。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞はＦＧＦ１０の添加後、更にＰｄｘ１陽性細胞に分化させることができる（米国特許出願第２００５／０２６６５５（Ａ１）号）。

【0040】

ダムールら（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞に転換させる分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆細胞に似た段階を経て、内分泌ホルモンを発現する細胞に細胞を誘導することによりインビボで膵臓の器官形成を模倣するものである。」と述べている。

【0041】

別の例として、フィスク（Fisk）らは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を作製するためのシステムを報告している（米国特許出願第２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つの段階に分けられている。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に細胞をノギンなどのＴＧＦβアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰｄｘ１陽性細胞を作製した。最終分化はニコチンアミドによって誘導した。

【0042】

１つの例において、ベンベニストリー（Benvenistry）らは、「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が膵臓に多く見られる遺伝子の発現を高めたことを結論付けるものである。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。

【0043】

別の例において、オドリコ（Odorico）らは、哺乳動物の多能性幹細胞を膵臓系統の細胞にインビトロで直接分化させる方法を報告している。この方法では、中内胚葉の方向へと分化を誘導するような有効量の骨形成タンパク質の存在下で幹細胞を培養することを伴う。これらの中内胚葉細胞を更に培養して、胚体内胚葉へと分化決定した細胞に富んだ胚様体（ＥＢ）を形成させる。胚体内胚葉へと分化決定した細胞は、所定の条件下で膵臓系統の細胞へと最終分化する（米国特許出願公開第２００７０２５９４２３号）。

【0044】

別の例では、ツラチャン（Tulachan）ら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３０５，２００７，ｐ ５０８〜５２１）は、「したがって、胚期におけるＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害により、膵臓上皮細胞が内分泌系統へと進むことが可能となる」と述べている。

【0045】

したがって、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞への分化能を維持しながら、グルコース濃度の変化に応じてインスリンを分泌する能力を有する、現在の臨床的要請に応えるように増殖させることが可能な多能性幹細胞株を樹立するための条件を開発することが現在でも強く求められている。本発明者らは、グルコース濃度の変化に応じてインスリンを分泌することが可能な膵臓内分泌細胞へのヒト胚性幹細胞の分化の効率を向上させるために、代替的アプローチをとったものである。

【0046】

〔概要〕
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。

【0047】

一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から誘導される膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞において、グルコース刺激インスリン分泌を促進するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。

【0048】

一実施形態では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の方法のいずれか１つによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞から分化させられる。その方法とは、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤で処理し、次いで線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で細胞を培養するか、
ｂ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で処理するか、
ｃ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、及び少なくとも１種類のＢＭＰを阻害可能な因子で処理するか、
ｄ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、及びネトリンで処理するか、
ｅ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、少なくとも１種類のＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンで処理するか、
ｆ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記１種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、及びレチノイン酸で処理するか、
ｇ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記１種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、及び少なくとも１種類のＢＭＰを阻害可能な因子で処理するか、
ｈ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記１種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、及びネトリンで処理するか、
ｉ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ阻害剤で処理し、次いで前記少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子及び前記ソニックヘッジホッグ阻害剤を除去した後、細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸、少なくとも１種類のＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンで処理する、ことである。

【0049】

一実施形態では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の方法のいずれか１つによって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を処理することによって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞から分化させられる。その方法とは、
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γ−セクレターゼ阻害剤及びＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養し、次いでγ−セクレターゼ阻害剤及びＧＬＰ−１アゴニストを含む培地を取り除いた後、細胞をＧＬＰ−１アゴニスト、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で培養するか、
ｂ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養し、次いでＧＬＰ−１アゴニストを含む培地を取り除いた後、細胞をＧＬＰ−１アゴニスト、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で培養するか、
ｃ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、γ−セクレターゼ阻害剤及びＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養するか、
ｄ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養するか、
ｅ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を阻害する因子で処理するか、
ｆ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理するか、
ｇ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理するか、
ｈ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭのグルコース及びＧＬＰ−１アゴニストを含む培地中で培養する、ことである。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】本発明で用いられる分化プロトコールの概要を示す。パネルａ）は、米国特許出願第１１／７３６，９０８号に報告される方法を示し、パネルｂ）及びｃ）は、本発明の方法である。

【図2】実施例２に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。膵臓内胚葉マーカー（ＰＤＸ−１、ＩＳＬ−１）及び内分泌マーカー（ニューロＤ、インスリン、及びグルカゴン）の発現がステージ３〜５（Ｓ３〜Ｓ５）に示されている。ステージ４〜５においてインスリン及びグルカゴンの発現が顕著に増大した。

【図3】実施例３に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。ステージ３〜５における膵臓内分泌マーカーとして、ａ）インスリン、ｂ）ＮＫＸ２、ｃ）グルカゴン、ｄ）ニューロＤ、及び膵臓内胚葉マーカーとして、ｅ）ＰＤＸ−１が示されている。異なるキナーゼ阻害剤の効果をステージ３、ステージ４、又はステージ３及び４のいずれかにおいて評価した（＋／＋は、特定の化合物がステージ３及び４の両方で存在することを示し、＋／−は、特定の化合物がステージ３で存在し、ステージ４で存在しないことを示し、−／＋は、特定の化合物がステージ４で存在し、ステージ３で存在しないことを示す）。

【図4】実施例４に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。膵臓マーカーとして、ステージ３〜５における、ａ）グルカゴン及びインスリン、ｂ）ＨＡＮＤ１及びニューロＤ、ｃ）ＨＮＦ４ａ及びＰＤＸ−１、ｄ）ＮＫＸ２．２及びＳｏｘ１７を示す。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの影響を、ステージ４、ステージ５、又はステージ４及び５のいずれかにおいて評価した（＋／＋は、阻害剤がステージ４及び５の両方で存在することを示し、＋／−は、阻害剤がステージ４で存在し、ステージ５で存在しないことを示し、−／＋は、阻害剤がステージ５で存在し、ステージ４で存在しないことを示す）。

【図5】実施例５に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。ステージ４〜５における、ａ）グルカゴン、ｂ）インスリン、ｃ）ＰＤＸ−１、ｄ）ニューロＤの発現に対する１〜１０μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩおよびＩＩの影響を示す。コントロール処理は、分化プロセスの間にＡＬＫ５阻害剤を含まなかった。

【図6】実施例６に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。ステージ３〜５における、ａ）アルブミン、ｂ）ＣＤＸ２、ｃ）インスリン、ｄ）グルカゴン、ｅ）ＰＤＸ−１、ｆ）ニューロＤ、及びｇ）ＮＫＸ２．２の発現に対する１μｍのＡＬＫ５阻害剤及び０〜５００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトノギンの複合的影響を示す。ＡＬＫ５阻害剤をステージ４及び５で加え、ノギンをステージ３で加えた。

【図7】実施例７に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。ステージ４及び５における、ａ）インスリン、ｂ）グルカゴン、ｃ）ｎｇｎ３、ｄ）ニューロＤ、ｅ）ＣＤＸ−２、及びｆ）ＰＤＸ−１の発現に対する１μｍのＡＬＫ５阻害剤及び１００ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトノギンの複合的影響を示す。ＡＬＫ５阻害剤をステージ４及び５で加え、ノギンをステージ３、４、又は３及び４で加えた。

【図8】実施例７に開示される方法に従って分化させた細胞の形態。ａ）ステージ５の６日目の細胞の位相差顕微鏡画像（４倍）、ｂ）ステージ５の６日目の細胞の位相差顕微鏡画像（１０倍）、ｃ）ステージ５の１２日目の細胞の位相差顕微鏡画像（４倍）、ｄ）ステージ５の１２日目の細胞の位相差顕微鏡画像（１０倍）。

【図9】実施例７に開示される方法に従って分化させた細胞の免疫蛍光画像。細胞はステージ５の１２日目のものである。ａ）１個の細胞塊のインスリン染色、及び、ｂ）ＤＡＰＩ核染色。

【図10】実施例７に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。

【図11】実施例８に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。データは、ａ）ｎｇｎ３、ｂ）ＰＤＸ−１、ｃ）ニューロＤ、ｄ）Ｐａｘ４、ｅ）インスリン、及びｆ）グルカゴンの発現に対する、ステージ３及び４で加えたノギン、並びにステージ４で加えたネトリン−４及び／又はＡＬＫ５阻害剤の複合的影響を示す。

【図12】実施例８に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。パネルａ）インスリン、ｂ）グルカゴン、ｃ）ｎｇｎ３、ｄ）ＮＫＸ２．２、ｅ）ニューロＤ、及びｆ）ＰＤＸ−１。

【図13】拡張したステージ５の培養のインビトロでのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。実施例９に開示される方法に従って調製したステージ５の細胞を、ステージ５の培養のａ）６日目、ｂ）１２日目、及びｃ）８〜２０日目にグルコースでチャレンジした。

【図14】内分泌マーカーの発現に対するネトリン−１又はネトリン−２の影響。実施例１０に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。

【図15】胚体内胚葉を誘導するための別法を用いた内分泌マーカーの誘導。実施例１１に開示される方法に従って分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞のリアルタイムＰＣＲ分析。パネルａ）インスリン、ｂ）グルカゴン、ｃ）ＮＫＸ２．２、ｄ）Ｐａｘ４、ｅ）ＰＤＸ−１、及びｆ）ニューロＤ。

【図16】図１ｃに概要を示す分化プロトコールの異なるステージにおける異なるマーカーの発現。パネルａ）は、ステージ１の３日目におけるＨ１細胞においてＦＡＣＳにより測定したＣＸＣＲ４の発現。パネルｂ）は、リアルタイムＰＣＲにより測定した、ステージ１の３日目における細胞における、胚体内胚葉系統及び胚体外系統に特徴的なマーカーの発現。パネルｃ）〜ｎ）は、リアルタイムＰＣＲによって判定した、ステージ２〜６の終わりに採取した細胞における異なる遺伝子の発現。

【図17】図１ｃに概要を示す分化プロトコールの異なるステージにおける細胞の数。

【図18】異なる刺激に応答した、図１ｃに概要を示す分化プロトコールのステージ６の終わりの細胞からのＣ−ペプチドの放出。

【図19】成人ヒト膵島と比較した、図１ｃに概要を示す分化プロトコールのステージ６の終わりの細胞のＣ−ペプチド及びプロインスリン含量。

【図20】図１ｃに概要を示す分化プロトコールのステージ６の終わりの細胞における、インスリン（パネルａ）、シナプトフィジン（パネルｂ）の発現、及びシナプトフィジン（Ｘ軸）とインスリン（Ｙ軸）（パネルｃ）の同時発現。

【図21】ステージ３〜４において、ノギンの代わりに１００ｎｇ／ｍｌのコーディンで処理した、図１ｃに概要を示す分化プロトコールのステージ６の終わりの細胞におけるシナプトフィジン（パネルａ及びｃ）、及びインスリン（パネルｂ及びｄ）の発現。

【図22】図１ｃに概要を示す分化プロトコールに従って処理したヒト胚性幹細胞系Ｈ９の細胞における異なるマーカーの発現。示したデータは、ステージ３〜６の終わりに採取した細胞においてリアルタイムＰＣＲによって判定した、ａ）ＨＮＦ４ａ、ｂ）ＨＮＦ６、ｃ）ＣＤＸ２、ｄ）ＰＤＸ−１、ｅ）ＮＫＸ６．１、ｆ）Ｐａｘ４、ｇ）ＮＫＸ２．２、ｈ）ニューロＤ、ｉ）ＮＧＮ３、ｊ）ＰＥＣＡＭ、ｋ）グルカゴン、及びｌ）インスリンの発現。

【図23】図１ｃに概要を示す分化プロトコールに従って処理したヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞における異なるマーカーの発現。ただし細胞はＢ２７又はＮ２のいずれかで処理した。示したデータは、ステージ３〜６の終わりに採取した細胞においてリアルタイムＰＣＲによって判定した、ａ）ＣＤＸ２、ｂ）グルカゴン、ｃ）インスリン、及びｄ）ＰＤＸ−１の発現。

【0051】

開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、本発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施形態、又は応用を説明又は図示した以下の小項目に分ける。

【0052】

＜用語の定義＞
幹細胞とは、１個の細胞レベルで自己再生し、かつ、自己再生性の前駆細胞、非自己再生性の前駆細胞、及び最終分化細胞のような後代細胞を生ずるように分化する能力によって定義される未分化細胞のことである。幹細胞はまた、複数の胚細胞層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から異なる細胞系の機能性細胞へとインビトロで分化する能力、並びに、移植後に複数の胚細胞層の組織を生ずる能力、及び胚盤胞への注入後にすべての組織とまではいかないにしても、ほぼ大部分の組織に分化する能力によっても特徴付けられる。

【0053】

幹細胞は、発生上の能力によって、（１）すべての胚性又は胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）すべての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系統のサブセットを生ずる能力を有するが、それらがすべて特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び、血液の通常の成分であるすべての細胞型及び要素（例えば、血小板）を生じうる）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系統（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単一性に分類される。

【0054】

分化とは、特化していない（「分化決定していない」）か又は完全には特化していない細胞が、例えば神経細胞や筋細胞のような特化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞、又は分化誘導された細胞とは、細胞のその系統内においてより特化した（「分化決定した」）位置を占めるものである。分化のプロセスについて用いられる場合、「分化決定した」なる用語は、通常の条件下で特定の細胞型又は細胞型のサブセットにまで分化し続けるが、通常の条件下では異なる細胞型には分化できず、より分化の未熟な細胞型にも戻ることができない点にまで分化経路を進んだ細胞のことを指して言う。脱分化とは、細胞が細胞の系統においてより特化（又は分化決定）していない位置にまで戻るプロセスのことを指して言う。本明細書で言うところの細胞の系統とは、その細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から生じたものであり、どのような細胞を生じうるか、ということを定義するものである。ある細胞の系統とは、発生及び分化の所定の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、分化決定していない細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。

【0055】

「β−細胞系統」は、転写因子ＰＤＸ−１、及び以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６のうち少なくとも１つについて遺伝子の発現が陽性である細胞を指す。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、β細胞が挙げられる。

【0056】

本明細書で言うところの「胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（Brachyury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。

【0057】

本明細書で言うところの「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ−１α、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、及び後部前腸細胞が挙げられる。

【0058】

本明細書で言うところの「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１αのうち少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系統の細胞が挙げられる。

【0059】

本明細書で言うところの「胚体内胚葉」とは、原腸胚形成時に胚盤葉上層から生ずる細胞の特徴を有し、消化管及びその派生器官を形成する細胞を指して言う。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー、すなわちＨＮＦ−３β、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、ケルベロス（Cerberus）、ＯＴＸ２、グースコイド（goosecoid）、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１を発現する。

【0060】

本明細書で言うところの「胚体外内胚葉」とは、以下のマーカー、すなわちＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣの内の少なくとも１つを発現する細胞の集団を指して言う。

【0061】

本明細書で言うところの「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。ここで言う差異的な発現とは、陽性のマーカーでは発現レベルの上昇を、陰性のマーカーでは発現レベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

【0062】

本明細書で言うところの「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３β、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

【0063】

本明細書で言うところの「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指して言う。

【0064】

本明細書で言うところの「膵臓内胚葉細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＮＧＮ−３、ニューロＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＡＸ−４、ＮＫＸ２．２の内の少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指して言う。

【0065】

本明細書で言うところの「膵臓ホルモン産生細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを産生することが可能な細胞を指して言う。

【0066】

本明細書で言うところの「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。

【0067】

本明細書で言うところの「後部前腸細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１、ＰＴＦ−１Ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ−９、ＰＲＯＸ−１の内の少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。

【0068】

本明細書で言うところの「前原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわちノーダル（Nodal）、又はＦＧＦ８の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

【0069】

本明細書で言うところの「原腸管細胞」とは、以下のマーカー、すなわちＨＮＦ−１、ＨＮＦ−４Ａの内の少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。

【0070】

本明細書で言うところの「原始線条細胞」とは、以下のマーカー、すなわちブラキュリ（Brachiury）、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４の内の少なくとも１つを発現する細胞を指して言う。

【0071】

＜多能性幹細胞の単離、増殖及び培養＞
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、発生段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及び４の１つ以上、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を用いて検出可能なマーカーを発現しうる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が消失し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が増大する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（ベクターラボラトリーズ社（Vector Laboratories）、カリフォルニア州バーリンゲーム（Burlingame）所在）によって述べられるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、一般にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現している。

【0072】

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３つの胚細胞層のすべての細胞に分化する能力である。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層からの細胞型の証拠について組織学的に調べることによって確認することができる。また、多能性は、胚様体を形成し、３つの胚細胞層に関連したマーカーの存在について胚様体を評価することによって調べることもできる。

【0073】

増殖させた多能性幹細胞系は、標準的なＧバンド法を用いて核型を決定し、対応する霊長類種の公表されている核型と比較することができる。「正常な核型」を有する細胞を得ることが望ましい。これは、細胞が、ヒトの染色体がすべて揃っていてかつ目立った変化のない正倍数体であることを意味する。

【0074】

多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が含まれる。非限定的な例としては、例えばヒト胚性幹細胞系Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の株化細胞系がある。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源組織から直接採取される１次多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から得られる細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ブレサジェン社（BresaGen）、ジョージア州アセンズ所在）などの変異型ヒト胚性幹細胞系も好適である。

【0075】

一実施形態では、ヒト胚性幹細胞をトムソン（Thomson）らによって述べられるように調製する（米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。

【0076】

多能性幹細胞の培養
一実施形態では、通常、多能性幹細胞を、様々な方法で多能性幹細胞を支持するフィーダー細胞の層上で培養する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を基本的に含まないにも関わらず、細胞を大きく分化させることなく多能性幹細胞の増殖を支持する培養システム中で培養する。分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、別の細胞型と予め培養することによって調整した培地を用いることで支持される。また、分化をともなわない無フィーダー培養中での多能性幹細胞の増殖は、合成培地を用いることによっても支持される。

【0077】

多能性幹細胞は、適当な培養基質上に播種してよい。一実施形態では、適当な培養基質は例えば、基底膜から誘導されるもの、又は接着分子の受容体／リガンド結合の一部を形成し得るもののような細胞外マトリクス成分である。一実施形態において、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン社（Becton Dickenson））である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。

【0078】

他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物も代替物として適している。増殖させられる細胞型に応じ、他の細胞外マトリクス成分及び成分混合物は、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、硫酸ヘパリンなどを、単独又は異なる組み合わせで含んでもよい。

【0079】

多能性幹細胞は、適当な分布で、かつ細胞の生存率、増殖、及び所望の特性の維持を促進する培地の存在下で基質上に播種することができる。これらの特性はいずれも、播種分布に充分な注意を払うことによって利するところがあるものであり、当業者が容易に決定することができるものである。

【0080】

好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ギブコ（Gibco）Ｎｏ．１１９６５−０９２、ノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、ギブコＮｏ．１０８２９−０１８、ハムＦ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭのＬ−グルタミン、ギブコＮｏ．１５０３９−０２７、非必須アミノ酸溶液、ギブコＮｏ．１１１４０−０５０、β−メルカプトエタノール、シグマ（Sigma）Ｎｏ．７５２２、ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ギブコＮｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。

【0081】

＜多能性幹細胞からの、グルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞の形成＞
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。

【0082】

一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から誘導された膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞において、グルコース刺激インスリン分泌を促進するための方法を提供し、この方法は、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。

【0083】

本発明における使用に適した多能性幹細胞としては例えば、ヒト胚性幹細胞系Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞系Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞系ＳＡ００２（セラーティス社（Cellartis）、スウェーデン）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわちＡＢＣＧ２、クリプト（cripto）、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグ（Nanog）、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１の内の少なくとも１つを発現する細胞も本発明における使用に適している。

【0084】

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３β、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、ブラキュリ、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。

【0085】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１β、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。

【0086】

膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１αからなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン、すなわちインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの内の少なくとも１つを発現することが可能である。膵臓内分泌系統に特徴的なこれらのマーカーの内の少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。また、膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。

【0087】

本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、並びに以下の転写因子、すなわちＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ニューロＤ（NeuroD）、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３β、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４及びＰａｘ６の内の少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

【0088】

＜胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成＞
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させてもよい。

【0089】

例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D’Amour）らにより開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５））。

【0090】

例えば、多能性幹細胞は、シノザキ（Shinozaki）らにより開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１〜１６６２（２００４））。

【0091】

例えば、多能性幹細胞は、マクレーン（McLean）らにより開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９〜３８（２００７））。

【0092】

例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D’Amour）らにより開示される方法に従って胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６））。

【0093】

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。

【0094】

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、ダムール（D’Amour）らによるネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）、２００５年に開示されている。

【0095】

例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。この方法の例は、ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

【0096】

例えば、多能性幹細胞は、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0097】

例えば、多能性幹細胞は、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0098】

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0099】

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第１１／０７６，９００号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0100】

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0101】

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って多能性幹細胞を処理することによって胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0102】

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、特定のプロトコールの前後に、マーカーの存在について試験することにより判定することができる。多能性幹細胞は、一般にこうしたマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がこうしたマーカーを発現し始める際に検出される。

【0103】

分化の効率は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する物質（例えば、抗体など）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。

【0104】

培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（オウスベル（Ausubel）ら編、２００１年度版補遺）、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Ｈarlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル（Using Antibodies:A Laboratory Manual）」ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）などの免疫アッセイが含まれる。

【0105】

多能性幹細胞の特徴は当業者には周知であり、更なる多能性幹細胞の特徴が引き続き同定されている。多能性幹細胞のマーカーとしては、例えば以下のものの内の１つ以上の発現が挙げられる。すなわち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１。

【0106】

多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（例えば、抗体など）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。

【0107】

＜膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成＞
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0108】

例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ダムール（D’Amour）らにより開示される方法に従って膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６））。

【0109】

例えば、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次いで線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地を取り除いた後、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地中で細胞を培養することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。

【0110】

本発明の一態様では、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。

【0111】

本発明の一態様では、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をレチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。

【0112】

一実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法を提供し、この方法は、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害物質、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で処理する工程と、を含む。

【0113】

一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約６日間処理する。

【0114】

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。

【0115】

代替的な一実施形態において、本発明は、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるための方法を提供し、この方法は、
ａ．胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を培養する工程と、
ｂ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で処理する工程と、
ｃ．レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される前記少なくとも１種類の因子を除去し、次いでソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で細胞を処理する工程と、を含む。

【0116】

一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する。一実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する。

【0117】

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。

【0118】

一実施形態では、本発明の方法によって生成される膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、肝臓及び腸組織に関連するマーカーの発現レベルが低いことを示す。一実施形態では、本発明の方法によって生成される膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、アルブミン及びＣＤＸ−２の発現レベルが低いことを示す。

【0119】

前記少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子は、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される。

【0120】

一実施形態では、ＢＭＰはＢＭＰ４である。一実施形態では、ＢＭＰ４を阻害可能な前記少なくとも１種類の因子はノギンである。

【0121】

ネトリンは、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される。

【0122】

レチノイン酸は、濃度約１ｎＭ〜約１ｍＭで使用することができる。一実施形態では、レチノイン酸は、濃度１μＭで使用される。

【0123】

ＦＧＦ−２は、濃度約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−２は、濃度５０ｎｇ／ｍｌで使用される。

【0124】

ＦＧＦ−４は、濃度約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−４は、濃度５０ｎｇ／ｍｌで使用される。

【0125】

ＦＧＦ−７は、濃度約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−７は、濃度５０ｎｇ／ｍｌで使用される。

【0126】

ＦＧＦ−１０は、濃度約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで使用することができる。一実施形態では、ＦＧＦ−１０は、濃度５０ｎｇ／ｍｌで使用される。

【0127】

ノギンは、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。

【0128】

ネトリン１は、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ネトリン１は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。

【0129】

ネトリン２は、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ネトリン２は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。

【0130】

ネトリン４は、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。一実施形態では、ネトリン４は１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。

【0131】

一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、以下の因子、すなわち、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、シクロパミン、ノギン、ネトリン１、ネトリン２、又はネトリン４の内の少なくとも１種類で処理する。

【0132】

一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、シクロパミン、及びノギンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−４、シクロパミン、及びノギンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−７、シクロパミン、及びノギンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−１０、シクロパミン、及びノギンで処理する。

【0133】

一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、シクロパミン、及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−４、シクロパミン、及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−７、シクロパミン、及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−１０、シクロパミン、及びネトリンで処理する。

【0134】

ネトリンは、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される。

【0135】

一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、シクロパミン、ノギン及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−４、シクロパミン、ノギン及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−７、シクロパミン、ノギン及びネトリンで処理する。代替的な一実施形態では、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−１０、シクロパミン、ノギン及びネトリンで処理する。

【0136】

ネトリンは、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される。

【0137】

胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を促進し得る少なくとも１種類の更なる他の因子で処理してもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法により形成された膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を高めるものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法により形成された膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の、他の細胞型を形成する能力、又は任意の他の更なる分化段階の効率を高める能力を高めるものであってもよい。

【0138】

この少なくとも１種類の更なる因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（insulin growth factor）（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及び−ＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（ｍｉｍｅｔｏｂｏｄｙ）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えばトリエチレンペンタミンなどの銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）などのステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってもよい。

【0139】

前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えばＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）などの膵臓細胞系、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）などの肝細胞系、及び例えば、ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）などの腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。

【0140】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内胚葉系統に特徴的な更なるマーカーも引き続き特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が、膵臓内胚葉系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内胚葉系統に特異的なマーカーとしては、例えば、Ｈｌｘｂ９、ＰＴＦ−１ａ、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−６、ＨＮＦ−１βなどの１以上の転写因子の発現が挙げられる。

【0141】

分化の効率は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することができる。

【0142】

培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（オウスベル（Ausubel）ら編、２００１年度版補遺）、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Harlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル（Using Antibodies:A Laboratory Manual）」ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）などの免疫アッセイが含まれる。

【0143】

＜膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成＞
膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、当該技術分野におけるいずれかの方法又は本発明において開示されるいずれかの方法によって膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる。

【0144】

例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ダムール（D’Amour）らにより開示される方法に従って膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させることができる（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６））。

【0145】

例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地を取り除いた後、エキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で細胞を培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。

【0146】

例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養し、次いでエキセンジン４を含む培地を取り除いた後、エキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地中で細胞を培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）らにより開示されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６）。

【0147】

例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞をＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地中で培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）らにより開示されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６）。

【0148】

例えば、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地中で培養することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。この方法の一例は、ダムール（D’Amour）らにより開示されている（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６）。

【0149】

本発明の一態様では、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。

【0150】

本発明の一態様では、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に記載された方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。

【0151】

本発明の一態様では、ライフスキャン社（LifeScan, Inc.）に譲渡された米国特許出願第６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子で処理することによって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。

【0152】

本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することにより、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に更に分化させる。ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子は、ＴＧＦ−β細胞外受容体−１のアンタゴニストであってもよい。また、この因子は、ＴＧＦ−βＲ−１受容体の生物学的活性を阻害するものであってもよい。また、この因子は、細胞内におけるＴＧＦ−βＲ−１信号伝達経路の特定の要素を阻害するか、又はそのアンタゴニストであってもよい。

【0153】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する。

【0154】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。

【0155】

一実施形態において、本発明は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化させるための方法を提供し、この方法は、
ａ．膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養する工程と、
ｂ．ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子で前記細胞を処理する工程と、を含む。

【0156】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する。あるいは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する。

【0157】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現するいずれの細胞も、この方法を用いて膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させるうえで適している。

【0158】

一実施形態では、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子は、γ−セクレターゼ阻害剤である。一実施形態では、γ−セクレターゼ阻害剤は、Ｌ−６８５，４５８としても知られる、１Ｓ−ベンジル−４Ｒ−［１−（１Ｓ−カルバモイル−２−フェネチルカルバモイル）−１Ｓ−３−メチルブチルカルバモイル］−２Ｒ−ヒドロキシ−５−フェネチルペンチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（1S-Benzyl-4R-[1-(1S-carbamoyl-2-phenethylcarbamoyl)-1S-3-methylbutylcarbamoyl]-2R-hydrozy-5-phenylpentyl] carbamic Acid tert-butyl Ester）である。

【0159】

Ｌ−６８５，４５８は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約９０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約８０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約７０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約６０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約５０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約４０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約３０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約２０μＭの濃度で使用される。一実施形態において、Ｌ−６８５，４５８は、約１０μＭの濃度で使用される。

【0160】

一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子は、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン）（(2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine)）である。別の実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾール（[3-(Pyridin-2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole）である。

【0161】

ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約９０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約８０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約７０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約６０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約５０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約４０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約３０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約２０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約１０μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約１μＭの濃度で使用される。一実施形態では、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼ阻害剤は、約０．１μＭの濃度で使用される。

【0162】

膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成を促進することが可能な少なくとも１種類の更なる他の因子で処理してもよい。また、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の増殖を促進するものであってもよい。更に、前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、本発明の方法によって形成される膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞が他の細胞型を形成する能力を促進するものであってもよく、あるいは他のいずれかの更なる分化の段階の効率を高めるものであってもよい。

【0163】

前記少なくとも１種類の更なる因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦβファミリーのメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及び−ＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体（ｍｉｍｅｔｏｂｏｄｙ）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、βメルカプトエタノール、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミンなどの銅キレート化剤、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起増殖因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）、Ｎ２及びＢ２７添加物（ギブコ社（Gibco）、カリフォルニア州）、例えばシクロパミン（ＥＭＤ社、カリフォルニア州）などのステロイドアルカロイド、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ脳下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、又はこれらの組み合わせであってよい。

【0164】

前記少なくとも１種類の更なる他の因子は、例えばＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＲＬ−１９９７）などの膵臓細胞系、例えばＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＨＴＢ−８０６５）などの肝細胞系、及び例えばＦＨｓ７４（ＡＴＣＣ Ｎｏ：ＣＣＬ−２４１）などの腸細胞系から得られる馴化培地によって供給することが可能である。

【0165】

膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の検出
膵臓内分泌系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、膵臓内分泌系統に特徴的な更なるマーカーも引き続き特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞が膵臓内分泌系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。膵臓内分泌系統に特異的なマーカーとしては、例えば、ＮＧＮ−３、ニューロＤ（NeuroD）、Ｉｓｌｅｔ−１などの１以上の転写因子の発現が挙げられる。

【0166】

β細胞系統の細胞に特徴的なマーカーは当業者にはよく知られたものであり、β細胞系統に特徴的な更なるマーカーも引き続き特定されている。これらのマーカーを用いて、本発明に基づいて処理を行った細胞がβ細胞系統に特徴的な性質を獲得するように分化したことを確認することが可能である。β細胞系統に特異的な特徴（β cell lineage specific characteristic）としては、例えば、特にＰｄｘ１（膵臓及び十二指腸ホメオボックス遺伝子−１）、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ニューロＤ（NeuroD）、Ｈｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３β、及びＭａｆＡなどの１以上の転写因子の発現が挙げられる。これらの転写因子は、当該技術分野では内分泌細胞を同定する目的でよく確立されている。例としてエドランド（Edlund）によるＮａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：５２４〜６３２（２００２）などを参照されたい。

【0167】

分化の効率は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することができる。また、分化の効率は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することによって決定することもできる。

【0168】

培養細胞又は単離細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価するための方法は、当該技術分野では標準的なものである。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」（オウスベル（Ausubel）ら編、２００１年度版補遺）、を参照）、並びに、切片化材料の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロッティング、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、ハーロー及びレーン（Harlow and Lane）著、「抗体の使用：実験マニュアル（Using Antibodies:A Laboratory Manual）」ニューヨーク州コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（１９９８年）を参照）などの免疫アッセイが含まれる。

【0169】

本発明の一態様では、分化の効率は、処理後の所定の細胞培養中のインスリン陽性細胞の比率を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約１００％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約９０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約８０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約７０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約６０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約５０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約４０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約３０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約２０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約１０％のインスリン陽性細胞を生成する。代替的な実施形態では、本発明の方法は、所定の培養中で約５％のインスリン陽性細胞を生成する。

【0170】

本発明の一態様では、分化の効率は、細胞が放出するＣ−ペプチドの量を測定することにより検出されるグルコース刺激インスリン分泌を測定することによって求められる。一実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ
１ｐｇ当たり約１０００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１００ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約９０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約８０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約７０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約６０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約５０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約４０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約３０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約２０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。代替的な実施形態では、本発明の方法により生成される細胞は、ＤＮＡ １ｐｇ当たり約１０ｎｇのＣ−ペプチドを産生する。

【0171】

＜治療法＞
一態様において、本発明は、１型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、その多能性幹細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。

【0172】

更に別の一態様において、本発明は、２型糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、そのβ細胞系統の細胞を患者に移植することを含む。

【0173】

必要に応じて、移植細胞の生存率及び機能を高める医薬薬剤又は生理活性物質で患者を更に治療することができる。こうした薬剤としては、例えば、特にインスリン、ＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどが挙げられる。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び米国特許出願公開第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。

【0174】

多能性幹細胞は、レシピエントへの移植に先立ってインスリン産生細胞へと分化させることができる。特定の実施形態では、多能性幹細胞をレシピエントへの移植に先立ってβ細胞に完全に分化させる。また、多能性幹細胞は未分化又は部分的に分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエントの体内で起こりうる。

【0175】

胚体内胚葉細胞、又は膵臓内胚葉細胞、又はβ細胞は、分散した細胞として移植するか、あるいは肝門脈に注入することが可能な細胞塊に形成することができる。また、細胞を、生体適合性分解性ポリマー支持体、多孔質の非分解性装置中で与えるか、あるいはカプセル化することによってホストの免疫反応から保護することもできる。細胞はレシピエントの適当な部位に移植することができる。移植部位としては、例えば、肝臓、天然膵臓、腎嚢下腔、網、腹膜、漿膜下腔、腸、胃、及び皮下ポケットなどが挙げられる。

【0176】

移植細胞の更なる分化、生存又は活性を促進する目的で、増殖因子等の更なる因子、抗酸化剤、又は抗炎症剤を、細胞の投与の前、同時、又は後に投与することができる。特定の実施形態では、増殖因子を用いて投与細胞をインビボで分化させる。これらの因子は、内因性の細胞によって分泌され、投与細胞にインサイチューで曝露されるものでよい。移植細胞は、当該技術分野で知られる内因性及び外因性の投与された増殖因子の任意の組み合わせによって分化を誘導することができる。

【0177】

移植に用いられる細胞の量は、患者の状態、及び治療に対する患者の応答などの多くの異なる因子に依存し、当業者が決定できるものである。

【0178】

一態様において本発明は、糖尿病を罹患しているかあるいは発症するリスクを有する患者を治療するための方法を提供する。この方法では、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をインビトロでβ細胞系統に分化させ、その細胞を３次元的な支持体に組み込むことを含む。細胞は、患者への移植に先立ってインビトロでこの支持体上に維持することができる。また、細胞を含んだ支持体を、更なるインビトロ培養を行うことなく患者に直接移植することも可能である。場合により、支持体に、移植細胞の生存率及び機能を高める少なくとも１種類の医薬薬剤を取り込ませてもよい。

【0179】

本発明の目的における使用に適した支持材料としては、組織修復に有用な組織テンプレート、導管、障壁、及びリザーバが挙げられる。特に、生物学的組織を再構築又は再生する目的で、及び組織の増殖を誘導するための走化性物質を送達する目的でインビトロ及びインビボで使用されてきた、発泡材、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物及び不織布構造の形態の合成及び天然の材料が、本発明の方法を実施するうえでの使用に適している。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同許第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３（Ａ１）号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。

【0180】

医薬薬剤を取り込んだ支持体を形成するには、支持体を形成するのに先立って医薬薬剤をポリマー溶液と混合することができる。また、医薬薬剤を、好ましくは医薬用担体の存在下で、製造された支持体上にコーティングしてもよい。医薬薬剤は、液体、微粉化した固体、又は他の任意の適当な物理的形態として存在してよい。また、支持体に賦形剤を添加することによって医薬薬剤の放出速度を変化させることもできる。代替的な一実施形態では、例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物のような抗炎症性化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に取り込ませる。

【0181】

例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示される化合物のような抗アポトーシス性化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に取り込ませてもよい。

【0182】

例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示される化合物のような線維症の阻害剤である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。

【0183】

例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号に開示される化合物のような血管新生を促進することが可能な化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。

【0184】

例えば米国特許出願公開第２００４／０１７６２３号に開示される化合物のような免疫抑制化合物である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。

【0185】

例えば、特にＴＧＦ−β１、２及び３などのＴＧＦ−βファミリー、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板濃縮血漿、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮細胞由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である少なくとも１種類の医薬化合物を支持体に更に取り込ませてもよい。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、低酸素症誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２模倣体、及びＩＩ、エキセンジン−４、ノーダル、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テナシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、ディフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着細胞外マトリクスタンパク質の細胞及びヘパリン結合ドメインを含む生物学的ペプチド、米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物などのＭＡＰＫ阻害剤が挙げられる。

【0186】

本発明の細胞は、足場上に細胞を単純に置くだけで足場中に取り込ませることができる。細胞は単純に拡散によって足場に入り込むことができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１ Ｐｔ ２）：３〜９（１９８８））。細胞の播種効率を高めるための他の幾つかの方法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸の足場上に播種するにはスピナーフラスコが使用される（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞を播種するための別の方法は遠心を使用することであり、これにより播種細胞へのストレスが最小に抑えられ、播種効率が高められる。例えば、ヤン（Yang）らは遠心細胞固定法（ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種法を開発している（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。

【0187】

本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

【0188】

〔実施例〕
（実施例１）
ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１、Ｈ７及びＨ９をウィセル・リサーチ・インスティテュート社（WiCell Research Institute, Inc.）（ウイスコンシン州マディソン所在）より入手し、当該供給元機関によって与えられる指示に従って培養した。簡単に述べると、２０％のノックアウト血清リプレースメント、１００ｎＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭのβメルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミンと４ｎｇ／ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてインビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO）より入手）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））からなるＥＳ細胞培地中、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー細胞上で細胞を培養した。ＭＥＦ細胞はＥ１３〜１３．５のマウス胚から得られたものをチャールズリバー社（Charles River）より購入した。ＭＥＦ細胞は、１０％のＦＢＳ（ハイクローン社（Hyclone））、２ｍＭのグルタミン、及び１００ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ培地で増殖させた。サブコンフルエンスに達したＭＥＦ細胞培養を、１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（シグマ社（Sigma）ミズーリ州セントルイス所在）で３時間処理して細胞分裂を停止させた後、トリプシン処理し、０．１％ウシゼラチンコートディッシュに２×１０^４／ｃｍ^２で播いた。継代数２〜４からのＭＥＦ細胞をフィーダー層として使用した。ＭＥＦ細胞のフィーダー層に播いたヒト胚性幹細胞を、加湿した組織培養インキュベーター内で、５％ＣＯ_２雰囲気中３７℃で培養した。コンフルエンスに達した時点（播種後約５〜７日後）で、ヒト胚性幹細胞を１ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（インビトロジェン／ギブコ社（Invitrogen/GIBCO））で５〜１０分間処理した後、５ｍｌピペットを用いて表面から静かに掻き取った。細胞を９００ｒｐｍで５分間遠心し、得られたペレットを再懸濁して新鮮な培地に１：３〜１：４の細胞比で再び播いた。

【0189】

（実施例２）
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした組織培養基質上で培養されたヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化
継代数４５のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加し、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に３日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。

【0190】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）中で更に３日間インキュベートした。この手順の概要を図１ａに示す。分化の異なるステージで培養からＲＮＡ試料を採取した。図２は、ステージ３〜５で採取した細胞から得られたリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ステージ４及び５の細胞では、インスリン及びグルカゴンなどの内分泌マーカーの発現の顕著な増大とともにニューロＤの発現の増大が認められた。

【0191】

（実施例３）
図１ａに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対する異なる化合物の影響。
継代数５１のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。

【0192】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）中で更に３日間インキュベートした。培養の一部のものを、１μｍの下記の化合物によって、ステージ３、ステージ４、又はステージ３＋４のいずれかにおいて処理した。すなわち、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ阻害剤（２’−アミノ−３’−メトキシフラボン（2′-Amino-3′-methoxyflavone））（ＰＤ９８０５９、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、ＲＡＦキナーゼ阻害剤（５−ヨード−３−［（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２−インドリノン（5-Iodo-3-[(3,5-dibromo-4-hydroxyphenyl)methylene]-2-indolinone））（＃５５３００８、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、ＳＭＡＤ３阻害剤（６，７−ジメチル−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン（6,7-Dimethyl-2-((2E)-3-(1-methyl-2-phenyl-1Hpyrrolo[2,3-b]pyridin-3-yl-prop-2-enoyl))-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline））（＃５６６４０５、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、ＡＫＴ阻害剤（１Ｌ６−ヒドロキシメチル−キロイノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート（1L6-Hydroxymethyl-chiroinositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate））（＃１２４００５、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、ＭＥＫ阻害剤（＃４４４９３７、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、及びＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）（アクチビン受容体様キナーゼ５を阻害、＃６１６４５２、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）。

【0193】

図３ａ〜ｅは、図に示した条件で処理し、ステージ３〜５の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）をステージ４で細胞に、又はステージ３及び４で細胞に加えることにより、インスリン、グルカゴン、ニューロＤ、及びＮＫＸ２．２の発現が顕著に増大したのに対して、ステージ５の終わりにおけるＰＤＸ−１の発現にはわずかな影響しか認められなかった点に留意されたい。ＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）をステージ３の細胞にのみ加えると、ステージ５の終わりにおいて細胞の内分泌マーカーの発現にわずかな上昇が認められた。

【0194】

（実施例４）
図１ａに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するＴＧＦ−β受容体Ｉキナーゼ阻害剤の添加の影響。
継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。

【0195】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）中で更に３日間インキュベートした。培養の一部のものを、１μｍのＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）（アクチビン受容体様キナーゼ５の阻害剤、＃６１６４５２、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）により、ステージ４、ステージ５、又はステージ４及び５において処理した。

【0196】

図４ａ〜ｅは、ステージ４〜５でキナーゼ阻害剤を加えるかあるいは加えずに、ステージ３〜５の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）をステージ４で、又はステージ４及び５で細胞に加えることにより、インスリン、グルカゴン、ニューロＤ、及びＮＫＸ２．２の発現が顕著に増大したのに対して、ステージ５の終わりにおけるＰＤＸ−１の発現にはわずかな影響しか認められなかった点に留意されたい。ＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）をステージ５においてのみ加えると、ステージ５の終わりにおいて細胞の内分泌マーカーの発現にわずかな上昇が認められた。

【0197】

（実施例５）
図１ａに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対する異なるＴＧＦ−β受容体Ｉキナーゼ阻害剤の影響。
継代数４１のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。

【0198】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）中で更に３日間インキュベートした。培養の一部のものを、１〜１０μｍのＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉキナーゼ阻害剤（ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ）（２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフジチリジン）（アクチビン受容体様キナーゼ５の阻害剤、＃６１６４５２、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）、又はＴＧＦ−Ｂ受容体Ｉ阻害剤Ｉ（ＡＬＫ５阻害剤Ｉ）（［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾール）（＃６１６４５１、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）により、ステージ４及び５において処理した。

【0199】

図５ａ〜ｅは、ＡＬＫ阻害剤Ｉ又はＩＩを加えるか、あるいは加えずに、ステージ４〜５の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ステージ４及び５に１〜１０μｍのＡＬＫ阻害剤Ｉ又はＩＩを加えることによって、ステージ４〜５の終わりにおけるインスリン、グルカゴン、ＰＤＸ−１及びニューロＤの発現がコントロール（標準処理）と比較して顕著に増大したことに留意されたい。すべての試料は３重とした。

【0200】

（実施例６）
図１ａに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するノギン及びＡＬＫ５阻害剤の影響。
継代数４１のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州）＋０〜５００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州）中で４日間インキュベートした。

【0201】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ中で更に３日間インキュベートした。

【0202】

図６ａ〜ｇは、０〜１００ｎｇ／ｍｌのノギンを加えるか、あるいは加えずに、ステージ３〜５の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。１００ｎｇ／ｍｌのノギンをステージ３で加えることによりステージ４の終わりにおけるインスリン及びグルカゴンの発現がわずかに増大したのに対し、アルブミン及びＣＤＸ２の発現は非処理の試料と比較して大幅に抑制された。５００ｎｇ／ｍｌのノギンを加えることによってＰＤＸ−１の発現は影響されなかったが、内分泌マーマー、並びにアルブミン及びＣＤＸ２の発現は顕著に減少した。アルブミンは肝臓の前駆細胞のマーカーであり、ＣＤＸ２は腸細胞のマーカーである。

【0203】

（実施例７）
図１に概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するステージ３におけるノギンの添加及びステージ４及び５におけるＡＬＫ５阻害剤の添加の影響。
継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州）中で４日間インキュベートした。

【0204】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋／−１００ｎｇ／ｍｌのノギン中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ中で更に３日間インキュベートした。

【0205】

図７ａ〜ｆは、１００ｎｇ／ｍｌのノギンを加えるかあるいは加えずに、ステージ４〜５の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ステージ３及び４で１００ｎｇ／ｍｌのノギンを加え、更にＡＬＫ５阻害剤ＩＩを加えることにより、ステージ４〜５におけるインスリン及びグルカゴンの発現が劇的に増大した。詳細には、ステージ３及び４の両方でノギンを添加することによって、内分泌前駆細胞マーカーであるＮＧＮ３の発現が顕著に増大したのに対して、非処理の試料と比較してアルブミン及びＣＤＸ２の発現は顕著に抑制された。

【0206】

図８ａ〜ｄは、上記のプロトコールに基づいた培養の位相差顕微鏡画像を示す。これらの培養の一部のものでは、ステージ５が３日間から２１日間に延びた。ステージ５の培養中での培養１０〜１２日目までに、培養皿全体に存在するヒト小島に似た個別の細胞塊が形成された。パネルａ及びｂは、ステージ５の６日目の培養の画像を示し、パネルｃ〜ｄは、ステージ５の１２日目の培養の画像を示す。一部の細胞塊を手で除去し、１：３０のＭＡＴＲＩＧＥＬコーティングされた培養皿上でステージ５の培地中に播いた。２日間のインキュベーション後、細胞塊をインスリン及びグルカゴンについて染色した。図９ａ〜ｂに示されるように、細胞塊中の細胞の大部分はヒトインスリンについて陽性であった。ＢＭＰ阻害剤であるノギンの用量を更に最適化するため、ステージ２〜４の培養を０、１０、５０、又は１００ｎｇ／ｍｌのノギンで処理した。図１０は、ステージ２〜４において異なる用量のノギンで処理した培養の、ステージ４におけるＮＧＮ３の発現を示す。５０〜１００ｎｇ／ｍｌのノギンにより、ステージ４におけるＮＧＮ３の発現が最大となるものと考えられる。

【0207】

（実施例８）
図１に概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するステージ３〜４におけるノギン、ステージ４におけるネトリン、及びステージ４におけるＡＬＫ５阻害剤の添加の影響。
継代数４８のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、２％の脂肪酸ＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州）中で４日間インキュベートした。

【0208】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋／−１００ｎｇ／ｍｌのノギン＋１００ｎｇ／ｍｌのネトリン−４中で３日間培養、インキュベートした。

【0209】

図１１ａ〜ｆは、ステージ４において１００ｎｇ／ｍｌのネトリン−４を加えるかあるいは加えずに、ステージ４の終わりに採取した細胞から得たリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ステージ３及び４において１００ｎｇ／ｍｌのノギンを、更にステージ４においてＡＬＫ阻害剤ＩＩ及び１００ｎｇ／ｍｌのネトリン−４を加えることにより、ステージ５の終わりに採取した細胞におけるＮＧＮ３、ニューロＤ、及びＰａｘ４の発現が劇的に増大した。

【0210】

ステージ４の培養の一部のもので、ノギンを省略し、ネトリン−４及びＡＬＫ５阻害剤を加えた。図１２ａ〜ｄは、ステージ４においてノギンを省略することにより、ステージ５の終わりに採取した細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２及びニューロＤの発現が顕著に低減したのに対して、インスリン及びグルカゴンの発現に対する影響は穏やかであったことを示している。

【0211】

（実施例９）
図１ｂに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞による、インビトロでのグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。
継代数４８のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、２％の脂肪酸ＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州）＋１００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州）中で４日間インキュベートした。

【0212】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋／−１００ｎｇ／ｍｌのノギン＋１００ｎｇ／ｍｌのネトリン−４中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ中で更に３〜２１日間インキュベートした。

【0213】

６、８、１２及び２０日目のステージ５の培養を、ＫＲＥＢＳ緩衝液（クレブス−リンゲル液：０．１％のＢＳＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１２９ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２、１．２ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４、５ｍＭのＮａＨＣＯ_３）中、３７℃で１時間洗浄した後、２ｍＭのＤ−グルコースを加えたＫＲＥＢＳ緩衝液中で１時間インキュベートし、２０ｍＭのＤ−グルコースを加えたＫＲＥＢＳ緩衝液中で更に１時間インキュベートすることによってＧＳＩＳについて試験した。各インキュベーション後に、上清を除去して更なる分析を行うために−２０℃で凍結した。分泌されたＣ−ペプチドの濃度を超高感度Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡ（アルプコ・ダイアグノスティックス社（Alpco Diagnostics）、スウェーデン）を使用してアッセイした。図１３ａ〜ｃは、インビトロでのグルコースチャレンジに応答して分泌されたヒトＣ−ペプチドの濃度を示す。ステージ５における初期及び中間のインキュベーション期間は、顕著な刺激指数（低グルコースで分泌されたＣ−ペプチドに対する高グルコースで分泌されたＣ−ペプチドの比）を示さなかったのに対して、ステージ５の培地で２０日間インキュベートした試料は、グルコースに応答して強い刺激を示した。このことは、ステージ５の培地に対する長期の曝露によって細胞塊は成熟しないことを示すものであり、ＧＳＩＳの証拠を示すものである。

【0214】

（実施例１０）
図１ｂに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞における、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現に対するネトリン−１又はネトリン−２の添加の影響。
継代数４４のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２日間曝露した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。

【0215】

次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で６日間培養した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ（ペプロテック社（Peprotech）、ニュージャージー州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）中で更に３日間インキュベートした。これらの培養の一部のものに、５０ｎｇ／ｍｌのネトリン−１又はネトリン−２（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）をステージ２〜５において加えた。図１４は、ステージ２〜５において５０ｎｇ／ｍｌのネトリン−１又はネトリン−２を加えるか、あるいは加えずに、ステージ５において採取された細胞から得られたリアルタイムＰＣＲのデータを示す。ネトリン−１又はネトリン−２のいずれかを加えることにより、ステージ５の終わりにおいて採取された細胞におけるグルカゴン及びインスリンの発現が顕著に上昇した。

【0216】

（実施例１１）
胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーの発現を誘導するための別法。
継代数４８のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、下記のいずれかによって胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させた。
ａ．１％のＢ２７サプリメント（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）及び５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に１ｍＭの酪酸ナトリウム（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）を添加したＲＰＭＩ培地で１日間培養した後、１％のＢ２７サプリメント（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）及び５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に０．５ｍＭの酪酸ナトリウム（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）を添加したＲＰＭＩ培地で更に３日間処理するか、
ｂ．０．５％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間培養した後、２％のＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（ＡＡ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で更に２日間処理する。

【0217】

次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＦＢＳ＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で３日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μｍのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）中で４日間インキュベートした。次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのエキセンジン−４（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１μｍのＤＡＰＴ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で３日間インキュベートした。

【0218】

上記の別法ａ）を用いた胚体内胚葉の誘導による、ＦＡＣＳによって測定されるＣＸＣＲ４の発現が７８％であったのに対して、上記別法ｂ）によるＣＸＣＲ４の発現は５６％であった。ＣＸＣＲ４は、胚体内胚葉細胞のマーカーと考えられている。

【0219】

図１５ａ〜ｆは、別法ａ）又はｂ）のいずれかを用い、ステージ５の終わりに採取した細胞から得られたリアルタイムＰＣＲのデータを示す。別法ａ）を用いることで膵臓内胚葉及び内分泌マーカーの発現を誘導することもできるものと考えられる。

【0220】

（実施例１２）
血清の非存在下、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした組織培養基質上で培養したヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化。
継代数５２のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、２％のＢＳＡ（カタログ番号１５２４０１、ＭＰバイオメディカル社（MP Biomedical）オハイオ州）及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に２０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ−３ａ（カタログ番号：１３２４−ＷＮ−００２、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）、更に８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（カタログ番号１００−１８Ｂ、ペプロテック社（PeproTech）、ニュージャージー州）を添加したＲＰＭＩ培地に１日間曝露した後、２％のＢＳＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、更に８ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間処理した。次に培養を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％のＢＳＡ＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）で２日間処理した後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７＋０．２５μｍのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（シグマ社（Sigma）、ミズーリ州）＋１００ｎｇ／ｍｌのノギン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）、ミネソタ州）中で４日間インキュベートした。次に細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋１００ｎｇ／ｍｌのノギン＋１μｍのＤＡＰＴ（カタログ番号５６５７８４、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤（カタログ番号６１６４５２、カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）＋１００ｎｇ／ｍｌのネトリン−４（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&Dsystems）、ミネソタ州）中で３日間インキュベートした後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋１μｍのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カルバイオケム社（Calbiochem）、カリフォルニア州）中で更に７日間インキュベートした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１％のＢ２７（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）中での７日間の処理からなる、最後のステージを追加することによって内分泌細胞の培養を更に成熟させた。最後のステージを除き、他のすべてのステージでは毎日培地を交換した。この手順の概要を図１ｃに示す。各ステージにおいて血球計数器を用いて細胞数を計算し、ＰＣＲ分析用にＲＮＡを採取した。試料はすべて３重に採取した。

【0221】

図１６ａ〜ｂは、ステージ１の３日目のＦＡＣＳにより測定したＣＸＣＲ４の発現及びリアルタイムＰＣＲデータを示す。未分化のＨ１ ＥＳ細胞に対する発現の倍数変化が示されている。図１６ｃ〜ｎは、ステージ２〜６の終わりに採取した細胞の主要な膵臓及び内分泌マーカーについてリアルタイムＰＣＲのデータを示す。図１７は、ステージ１〜６の終わりの細胞数を示す。

【0222】

（実施例１３）
図１ｃに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞中のＣ−ペプチド及びプロインスリンの含量。
継代数４２のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、上記実施例１２で述べたような、図１ｃに概要を示すプロトコールに従って分化させた。

【0223】

細胞をクレブス／リンゲル緩衝液（１２９ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４、２．５ＭＭのＣａＣｌ_２、５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．３％（重量／体積）のＢＳＡ）中で洗浄し、クレブス緩衝液と１５分間インキュベートした後、２ｍＭのＤ−グルコースを加えたクレブス緩衝液中、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％空気中で４５分インキュベートした。０．５ｍｌの上清を回収し、残りの培地を吸引し、以下の刺激物質のうち１つを加えたクレブス緩衝液で３７℃、５％ ＣＯ_２、９５％空気中で４５分間置換した。その刺激物質は、２０ｍＭのＤ−グルコース（ＨＧ）、３０ｍＭのＫＣｌ、１００μＭのトルブタミド（ｔｏｌ）、１００ｍｌのＩＢＭＸ、２μＭのＢＡＹ Ｋ８６４４、又は１０ｍＭのケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）である。０．５ｍｌの上清を回収し、残りの培地を捨てた。Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１、アルプコ・ダイアグノスティクス社（Alpco Diagnostics）、ニューハンプシャー州）を使用して上清をヒトＣ−ペプチド含量について分析した。試料は、キットにより提供されるスタンダードの線形範囲に含まれるように規定通りに５〜１０倍に希釈する必要があった。

【0224】

図１８は、異なる刺激物質による刺激後のＣ−ペプチドの放出を示す。各物質の刺激指数（刺激上清中のＣ−ペプチド濃度／２ｍＭのグルコースを含む基底上清中のＣ−ペプチド濃度）もグラフ上に示してある。

【0225】

ステージ６の培養のＣ−ペプチド、プロインスリン、及びＤＮＡ含量を測定するため、ステージ６の培養が入れられた６穴プレートを、ウェル毎に５００μｌの細胞溶解バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で処理し、３０秒間超音波処理した。Ｃ−ペプチド含量及びプロインスリン含量は、それぞれ、Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡキット（カタログ番号８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１、アルプコ・ダイアグノスティクス社（Alpco Diagnostics）、ニューハンプシャー州）及びプロインスリンＥＬＩＳＡキット（カタログ番号１１−１１１８−０１、アルプコ・ダイアグノスティクス社（Alpco Diagnostics）、ニューハンプシャー州）を使用して測定された。溶解物のＤＮＡ含量は、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ（商標）ＤＮＡキット（カタログ番号Ｐ７５８９、インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）を使用して定量化された。試料は、キットにより提供されるスタンダードの線形範囲に含まれるように規定通りに５００〜１０００倍に希釈する必要があった。図１９は、ステージ６の培養が入れられた６穴プレートの３つの異なるウェルについて、ＤＮＡに対して正規化したＣ−ペプチド含量及びプロインスリン含量を示す。比較として、３体の成人献体の小島試料のＣ−ペプチド及びプロインスリン含量も測定した。データは、培養全体のインスリン含量を反映したものであり、培養中に存在する細胞塊のみのインスリン含量を反映したものではない点は注意を要する。

【0226】

（実施例１４）
図１ｃに概要を示す分化プロトコールに従って処理した多能性幹細胞中のＦＡＣＳ分析。
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、上記実施例１２で述べたような、図１ｃに概要を示すプロトコールに従って分化させた。ＴｒｙｐＬＥ ＥＸＰＲＥＳＳ（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州カールスバッド）を使用して細胞を単層培養から単一の細胞に分離し、冷たいＰＢＳ中で洗浄した。固定のため、細胞を２００〜３００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ５５４７２２、ＢＤ社、カリフォルニア州）中に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１ｍｌのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ５５４７２３）で２回洗浄し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中、２％正常ヤギ血清を含む１００μｌの染色／ブロッキング溶液に再懸濁した。フローサイトメトリー分析のため、細胞を以下の一次抗体で染色した：抗インスリン（ウサギｍＡｂ、セルシグナリング社（Cell Signaling）Ｎｏ．Ｃ２７Ｃ９；希釈率１：１００）、抗グルカゴン（マウスＭａｂ、シグマ社（Sigma）Ｎｏ．Ｇ２６５４、１：１００）；抗シナプトフィジン（ウサギポリクローナル抗体、ダコ・サイトメーション社（DakoCytomation）Ｎｏ Ａ００１０、１：５０）。細胞を４℃で３０分間インキュベートした後、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で２回洗浄し、以下の適当な二次抗体中で更に３０分間インキュベートした：ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ ６４７（インビトロジェン社（Invitrogen）Ｎｏ．Ａ２１２４６）又はヤギ抗マウス６４７（インビトロジェン社（Invitrogen）Ｎｏ．Ａ２１２３５）；ヤギ抗ウサギＲ−ＰＥ（バイオソース社（BioSource）、Ｎｏ．ＡＬＩ４４０７）。二次抗体はすべて１：２００の希釈率で使用した。細胞は、少なくとも１回Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中で洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳアレイを使用して分析した。少なくとも１００００事象を分析のために取得した。コントロールとして、未分化のＨ１細胞及びｂ−ＴＣ（ＡＴＣＣ、バージニア州）細胞株を使用した。図２０ａ〜ｃは、ステージ６の培養におけるインスリン陽性及びシナプトフィジン陽性細胞の比率を示す。

【0227】

（実施例１５）
図１ｃに概要を示す分化プロトコールのステージ３及び４においてコーディンを添加することにより、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーの発現が上昇する。
継代数５２のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、ステージ３〜４にノギンの代わりに５０〜１００ｎｇ／ｍｌのコーディン（Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D systems）、ミネソタ州）を加えた以外は図１ｃに概要を示すプロトコールに従って分化させた。ノギンと同様、コーディンもＢＭＰシグナル伝達の阻害剤として知られている。ＦＡＣＳ（図２１ａ〜ｂ）によるステージ６の培養の分析により、ステージ３〜４でノギンを加えた場合に見られたものと極めてよく似たインスリン及びシナプトフィジンの発現が示された。

【0228】

（実施例１６）
血清の非存在下、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした組織培養基質上で培養したヒト胚性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化。
継代数３９のヒト胚性幹細胞系Ｈ９の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、上記実施例１２で述べたような、図１ｃに概要を示すプロトコールに従って分化させた。ＲＮＡをステージ１〜６の終わりに採取した。図２２ａ〜ｌは、ステージ３〜６の終わりに採取した細胞の主要な膵臓及び内分泌マーカーについてリアルタイムＰＣＲのデータを示す。Ｈ１系で観察された結果と同様、Ｈ９細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する能力を有していた。

【0229】

（実施例１７）
多能性幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化能に対する培地サプリメントの影響。
継代数３９のヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングした培養皿（希釈率１：３０）上で培養し、一部の培養において、ＤＭＥＦ／Ｆ１２基礎培地に０．２５〜１％のＢ２７又は１％のＮ２（インビトロジェン社（Invitrogen）、カリフォルニア州）＋２％のＢＳＡを添加した以外は図１ｃに概要を示すプロトコールに従って分化させた。分化プロトコールの他のすべての要素は、実施例１２に概要を示したとおりとした。ステージ３、５及び６の終わりに試料を３重に採取し、リアルタイムＰＣＲにより分析した。図２３ａ〜ｄは、ステージ３、５及び６の終わりに採取した細胞の主要な膵臓及び内分泌マーカーについてリアルタイムＰＣＲのデータを示す。Ｂ２７の代わりにＮ２／ＢＳＡを使用することによって、主要な膵臓内分泌マーカーの極めてよく似た発現が認められた。更に、主要な膵臓内分泌マーカーの発現に大きな影響を及ぼすことなく、Ｂ２７の濃度を０．２５％にまで低下させることができた。

【0230】

本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、参照によりその全容を本明細書に組み込むものである。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。

【0231】

〔実施の態様〕
（１） 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（２） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で処理することによって行われる、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する、実施態様２に記載の方法。
（４） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約６日間処理する、実施態様２に記載の方法。
（５） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様２に記載の方法。
（６） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様５に記載の方法。
（７） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様５に記載の方法。
（８） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様２に記載の方法。
（９） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様８に記載の方法。
（１０） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様８に記載の方法。

【0232】

（１１） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様２に記載の方法。
（１２） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様１１に記載の方法。
（１３） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様１１に記載の方法。
（１４） ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される前記因子が、ＦＧＦ−７である、実施態様２に記載の方法。
（１５） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様１４に記載の方法。
（１６） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様１４に記載の方法。
（１７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様２に記載の方法。
（１８） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１μＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様２に記載の方法。
（１９） 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、実施態様２に記載の方法。
（２０） シクロパミンを約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用する、実施態様１９に記載の方法。

【0233】

（２１） シクロパミンを０．２５μＭの濃度で使用する、実施態様１９に記載の方法。
（２２） 前記ＢＭＰを阻害可能な因子がＢＭＰ４阻害剤である、実施態様２に記載の方法。
（２３） 前記ＢＭＰ４阻害剤がノギンである、実施態様２２に記載の方法。
（２４） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様２２に記載の方法。
（２５） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様２２に記載の方法。
（２６） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様２に記載の方法。
（２７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様２に記載の方法。
（２８） 前記ネトリンが、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される、実施態様２に記載の方法。
（２９） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様１に記載の方法。
（３０） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、実施態様２９に記載の方法。

【0234】

（３１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、実施態様２９に記載の方法。
（３２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、実施態様２９に記載の方法。
（３３） 前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様２９に記載の方法。
（３４） 前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様３３に記載の方法。
（３５） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様３４に記載の方法。
（３６） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、実施態様３４に記載の方法。
（３７） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、実施態様３４に記載の方法。
（３８） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、実施態様２９に記載の方法。
（３９） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様１に記載の方法。
（４０） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、実施態様３９に記載の方法。

【0235】

（４１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、実施態様３９に記載の方法。
（４２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、実施態様３９に記載の方法。
（４３） 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、実施態様３９に記載の方法。
（４４） 前記γ−セクレターゼ阻害剤がＬ−６８５，４５８である、実施態様４３に記載の方法。
（４５） Ｌ−６８５，４５８を約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様４３に記載の方法。
（４６） 前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様３９に記載の方法。
（４７） 前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様４６に記載の方法。
（４８） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様４７に記載の方法。
（４９） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、実施態様４７に記載の方法。
（５０） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、実施態様４７に記載の方法。

【0236】

（５１） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、実施態様２９に記載の方法。
（５２） 多能性幹細胞からグルコース刺激インスリン分泌能を有する細胞を生成するための方法において、
ａ．前記多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｄ．前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（５３） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で処理することによって行われる、実施態様５２に記載の方法。
（５４） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する、実施態様５３に記載の方法。
（５５） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約６日間処理する、実施態様５３に記載の方法。
（５６） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様５３に記載の方法。
（５７） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様５６に記載の方法。
（５８） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様５６に記載の方法。
（５９） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様５３に記載の方法。
（６０） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様５９に記載の方法。

【0237】

（６１） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様５９に記載の方法。
（６２） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様５３に記載の方法。
（６３） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様６２に記載の方法。
（６４） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様６２に記載の方法。
（６５） ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される前記因子が、ＦＧＦ−７である、実施態様５３に記載の方法。
（６６） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様６５に記載の方法。
（６７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様６５に記載の方法。
（６８） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様５３に記載の方法。
（６９） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１μＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様５３に記載の方法。
（７０） 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、実施態様５３に記載の方法。

【0238】

（７１） シクロパミンを約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用する、実施態様７０に記載の方法。
（７２） シクロパミンを０．２５μＭの濃度で使用する、実施態様７０に記載の方法。
（７３） 前記ＢＭＰを阻害可能な因子がＢＭＰ４阻害剤である、実施態様５３に記載の方法。
（７４） 前記ＢＭＰ４阻害剤がノギンである、実施態様７３に記載の方法。
（７５） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様７３に記載の方法。
（７６） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様７３に記載の方法。
（７７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様５３に記載の方法。
（７８） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様５３に記載の方法。
（７９） 前記ネトリンが、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される、実施態様５３に記載の方法。
（８０） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様５２に記載の方法。

【0239】

（８１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、実施態様８０に記載の方法。
（８２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、実施態様８０に記載の方法。
（８３） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、実施態様８０に記載の方法。
（８４） 前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様８０に記載の方法。
（８５） 前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様８４に記載の方法。
（８６） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様８５に記載の方法。
（８７） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、実施態様８５に記載の方法。
（８８） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、実施態様８５に記載の方法。
（８９） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、実施態様８０に記載の方法。
（９０） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子、及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で処理することによって行われる、実施態様５２に記載の方法。

【0240】

（９１） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１〜約１２日間処理する、実施態様９０に記載の方法。
（９２） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約５〜約１２日間処理する、実施態様９０に記載の方法。
（９３） 前記膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子及びＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子で約１２日間処理する、実施態様９０に記載の方法。
（９４） 前記ノッチシグナル伝達経路を阻害する因子が、γ−セクレターゼ阻害剤である、実施態様９０に記載の方法。
（９５） 前記γ−セクレターゼ阻害剤がＬ−６８５，４５８である、実施態様９４に記載の方法。
（９６） Ｌ−６８５，４５８を約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様９４に記載の方法。
（９７） 前記ＴＧＦ−βＲ−１経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様９０に記載の方法。
（９８） 前記ＴＧＦ−βＲ−１シグナル伝達経路を阻害する因子が、ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤である、実施態様９７に記載の方法。
（９９） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼを、約０．１μＭ〜約１００μＭの濃度で使用する、実施態様９８に記載の方法。
（１００） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジンである、実施態様９８に記載の方法。

【0241】

（１０１） 前記ＴＧＦ−βＲ−１キナーゼの阻害剤が、［３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾールである、実施態様９８に記載の方法。
（１０２） 前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ＢＭＰを阻害可能な因子及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で更に処理する、実施態様９０に記載の方法。
（１０３） 膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を生成する方法において、
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ．前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、前記膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む、方法。
（１０４） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化させる前記工程が、前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で処理することによって行われる、実施態様１０３に記載の方法。
（１０５） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約６日間処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１０６） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−１０、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、及びネトリンからなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約６日間処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１０７） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びにＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１０８） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様１０７に記載の方法。
（１０９） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様１０７に記載の方法。
（１１０） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様１０４に記載の方法。

【0242】

（１１１） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様１１０に記載の方法。
（１１２） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様１１０に記載の方法。
（１１３） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約３日間処理した後、前記細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約１〜約４日間処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１１４） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約３日間処理する、実施態様１１３に記載の方法。
（１１５） 前記胚体内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞を、ソニックヘッジホッグ阻害剤、ＢＭＰを阻害可能な因子、ネトリン、レチノイン酸、並びに、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される少なくとも１種類の因子で約４日間処理する、実施態様１１３に記載の方法。
（１１６） ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、及びＦＧＦ−１０からなる群から選択される前記因子が、ＦＧＦ−７である、実施態様１０４に記載の方法。
（１１７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５０ｐｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様１１６に記載の方法。
（１１８） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦ−７で処理する、実施態様１１６に記載の方法。
（１１９） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約１ｎＭ〜約１ｍＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１２０） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１μＭの濃度のレチノイン酸で処理する、実施態様１０４に記載の方法。

【0243】

（１２１） 前記ソニックヘッジホッグ阻害剤がシクロパミンである、実施態様１０４に記載の方法。
（１２２） シクロパミンを約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用する、実施態様１２１に記載の方法。
（１２３） シクロパミンを０．２５μＭの濃度で使用する、実施態様１２１に記載の方法。
（１２４） 前記ＢＭＰを阻害可能な因子がＢＭＰ４阻害剤である、実施態様１０４に記載の方法。
（１２５） 前記ＢＭＰ４阻害剤がノギンである、実施態様１２４に記載の方法。
（１２６） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様１２４に記載の方法。
（１２７） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度のノギンで処理する、実施態様１２４に記載の方法。
（１２８） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を、約５００ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１２９） 前記胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を１００ｎｇ／ｍｌの濃度のネトリンで処理する、実施態様１０４に記載の方法。
（１３０） 前記ネトリンが、ネトリン１、ネトリン２、及びネトリン４からなる群から選択される、実施態様１０４に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】