特許 5711276 粒子分析器におけるパルスパラメータの生成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5711276

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年4月30日

(54)【発明の名称】粒子分析器におけるパルスパラメータの生成

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20150409BHJP

【ＦＩ】

   G01N15/14 B

   G01N15/14 D

【請求項の数】24

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2012-557209(P2012-557209)

(86)(22)【出願日】2011年3月9日

(65)【公表番号】特表2013-522601(P2013-522601A)

(43)【公表日】2013年6月13日

(86)【国際出願番号】US2011027716

(87)【国際公開番号】WO2011112697

(87)【国際公開日】20110915

【審査請求日】2014年2月20日

(31)【優先権主張番号】61/312,616

(32)【優先日】2010年3月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512232713

【氏名又は名称】ベックマン コールター， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ロフストローム， クリストファー ディー．

(72)【発明者】

【氏名】フォックス， ダニエル エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】スラシャー， トーマス エル．

(72)【発明者】

【氏名】ネッケルズ， デイビッド シー．

【審査官】 田中 洋介

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−０９２０７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２２３２８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １５／００−１５／１４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

粒子分析器の中の粒子サンプルに対して測定パラメータを生成する方法であって、
（ａ）調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて該粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
（ｂ）該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスと、該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスとを備える、ことと、
（ｃ）該始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｄ）該一次パルス検出ウィンドウおよび該第１の粒子の速度を含む因子に基づいて、該二次パルスを見出すための検査間隔を決定することと、
（ｅ）該第１の粒子の調査に基づいて動的に、該第１の粒子の速度の変動に対して該検査間隔を調整することと、
（ｆ）該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
（ｇ）該二次パルスのピーク値を決定するように該二次パルスを処理することと
を含む、方法。

【請求項2】

（ｈ）前記二次パルスのパルス幅値を決定するように該二次パルスを処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記パルス幅値は、前記二次パルスの前記ピーク値の所定の割合である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記調整するステップ（ｅ）は、
前記第１の粒子の調査に基づいて、調整のサイズを決定することと、
該調整のサイズに比例して前記検査間隔を増加させることと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよび前記第１の粒子の速度を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記調整するステップ（ｅ）は、
該二次パルス検出ウィンドウの中の前記二次パルスの部分を識別することと、
該二次パルス検出ウィンドウの外側の該二次パルスの部分を含むように、該検査間隔を拡張することと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記二次パルス検出ウィンドウの継続時間は、前記一次パルス検出ウィンドウの継続時間に所定のウィンドウ拡張を加えたものに実質的に等しい、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記二次パルスを処理するステップ（ｇ）は、
（ｉ）前記二次パルス検出ウィンドウの内側の該二次パルスの部分に基づいて、該二次パルスに対する初期ピーク値を決定することと、
（ｉｉ）該初期ピーク値の所定の閾値において、該二次パルスを検出することと、
（ｉｉｉ）該二次パルスに対して検出される最高値を繰り返し記憶することと
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

検査間隔を決定するステップ（ｄ）は、
前記一次パルス検出ウィンドウの発生時間を決定することと、
前記始動調査器と前記二次調査器との間のレーザ遅延を決定することと、
該一次パルス検出ウィンドウの該発生時間および該レーザ遅延に基づいて、前記二次パルス検出ウィンドウの発生時間を計算することと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記レーザ遅延は、前記一次調査器から前記二次調査器までの分離距離、および前記第１の粒子の速度に基づいて決定される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記検査間隔を決定するステップ（ｄ）は、
前記一次パルス検出ウィンドウの継続時間を決定することと、
該一次パルス検出ウィンドウの該継続時間に基づいて、前記二次パルス検出ウィンドウの継続時間を設定することと
をさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記二次パルス検出ウィンドウの前記継続時間を設定することは、所定のウィンドウ拡張にさらに基づいている、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記距離は、前記一次パルス検出ウィンドウの中心から測定される、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

ステップ（ｃ）は、
所定のパルス閾値に対応する前記始動パルスにおける第１および第２の位置を検出することと、
該第１および第２の位置に基づいて、前記一次パルス検出ウィンドウを決定することと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよび前記第１の粒子の速度を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記調整するステップ（ｅ）は、
前記第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
該一次パルス検出ウィンドウおよび該摂動信号の特性を含む因子に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと
を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記摂動信号は、前記粒子サンプルが通過させられるノズルに印加され、該ノズルは、前記調査器の前に設置される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記特性は、前記信号が前記第１の粒子に印加されている間の前記摂動信号の位相を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記摂動信号は、正弦波である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

（ｉ）前記二次パルスの前記ピーク値を報告することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

粒子分析器の中の粒子サンプルの測定パラメータを生成する方法であって、
（ａ）調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて該粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
（ｂ）該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスおよび該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ことと、
（ｃ）該始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｄ）該一次パルス検出ウィンドウおよび該第１の粒子の速度を含む因子に基づいて、二次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｅ）該第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
（ｆ）該摂動信号の特性に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと、
（ｇ）調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
（ｈ）該二次パルスの測定パラメータを決定するように該二次パルスを処理することと
を含む、方法。

【請求項20】

少なくとも１つのプロセッサと、
該少なくとも１つのプロセッサに連結される粒子調査器であって、該粒子調査器は、
粒子流動の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスおよび該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ことと
を行うように構成される、粒子調査器と、
該少なくとも１つのプロセッサに連結されるパルス分析器であって、該パルス分析器は、
一次パルス検出ウィンドウ作成器であって、
該始動パルスに基づいて一次パルス検出ウィンドウを決定するように構成される一次パルス検出ウィンドウ作成器と、
二次パルス検出ウィンドウ作成器であって、
該一次パルス検出ウィンドウおよび該第１の粒子の速度を含む因子に基づいて、該二次パルスを見出すための検査間隔を決定することと、
該第１の粒子に基づいて動的に、該第１の粒子の速度の変動に対して該検査間隔を調整することと
を行うように構成される二次パルス検出ウィンドウ作成器と、
二次パルスパラメータ発生器であって、
該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
該二次パルスのピーク値を決定するために、該二次パルスを処理することと
を行うように構成される二次パルスパラメータ発生器と
を備える、パルス分析器と
を備える、粒子分析器。

【請求項21】

前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、前記パルス分析器からパラメータを受信するように構成されるデータ分析器と、
該少なくとも１つのプロセッサに連結されるディスプレイと
をさらに備える、請求項２０に記載の粒子分析器。

【請求項22】

前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよび前記第１の粒子の速度を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記二次パルス検出ウィンドウ作成器は、
該二次パルス検出ウィンドウの中の前記二次パルスの部分を識別することと、
該二次パルス検出ウィンドウの外側の該二次パルスの部分を含むように該検査間隔を拡張することと
を行うようにさらに構成される、請求項２０に記載の粒子分析器。

【請求項23】

前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよび前記第１の粒子の速度を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記二次パルス検出ウィンドウ作成器は、
前記第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
該一次パルス検出ウィンドウおよび該摂動信号の特性を含む因子に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと
を行うようにさらに構成される、請求項２０に記載の粒子分析器。

【請求項24】

調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて粒子サンプルのパラメータをコンピュータに生成させるためのプログラムを記録したコンピュータ可読記憶媒体であって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備え、該プログラムは、
始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定するステップと、
該一次パルス検出ウィンドウおよび第１の粒子の速度を含む因子に基づいて、二次パルスを見出すための検査間隔を決定するステップと、
該第１の粒子に基づいて動的に、該第１の粒子の速度の変動に対して該検査間隔を調整するステップと、
該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別するステップと、
該二次パルスのピーク値を決定するように該二次パルスを処理するステップと
を該コンピュータに実行させる、コンピュータ可読記憶媒体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本特許出願は、米国仮特許出願第６１／３１２，６１６号（２０１０年３月１０日出願）の米国特許法第１１９条第（ｅ）項の優先権の利益を主張し、この出願の開示は、その全体が参照することによって本明細書に援用される。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、粒子分析器を使用した粒子サンプルの分析に関する。

【背景技術】

【0003】

粒子分析器は、粒子サンプルの迅速な分析が、サンプルの種々の特性を検出すること、および個別粒子の特性を検出することを可能にする。いくつかの粒子分析器はまた、１つ以上の検出された特性に従って粒子を分類する機能も含む。

【0004】

フローサイトメータおよび血液学分析器等の粒子分析器は、血液または組織等の生体細胞サンプルを分析するために頻繁に使用される。フローサイトメータにおいて、細胞サンプルは、サンプルの流路に沿った調査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）領域の中で調査を受ける。一般的には、シース流体の中の細胞は、１つずつフローセルを通過し、そこで、１つ以上の光線を含むプローブによって調査（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）される。例えば、１つ以上のレーザ光源を、細胞の流れの流路に沿ってフローセルの中に設置することができる。ジェットインエアフローサイトメータ等の他のフローサイトメータにおいて、シース流体の中の細胞は、フローセルの外側の１つ以上のプローブによって調査される。いくつかの測定が、各通過細胞について生成される。細胞が調査領域を通過するにつれて、光散乱、光損失、および蛍光等の結果として生じる光の特性が検出器によって測定される。測定された光の特性は、それぞれの調査された細胞に対応する電気パルスを生成するために使用される。電気パルスは、パルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等の細胞のパラメータを決定するように分析される。分類フローサイトメータは、例えば、異なる種類の細胞を容器の中へ分類することができる。

【0005】

調査される前に、特定の細胞種類を印付ける種々の蛍光色素および／または試薬を使用して、細胞サンプルを調製することができる。各蛍光色素および／または試薬は、異なる種類の細胞に結合することができる。細胞が調査領域を通過するにつれて、レーザ光源が蛍光色素および／または試薬を励起する。検出することができる異なる蛍光色素および／または試薬の数を増加させることによって、増加する一連の細胞種類の存在について細胞サンプルを分析することができる。しかしながら、各レーザ光源は、例えば、限定された波長範囲内の蛍光色素のみを励起することができる。したがって、より広い範囲の波長および周波数の検出を可能にするために複数のレーザ光源を使用することが望ましい。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、細胞の流れの流路に沿って設置される複数のレーザ光源は、光源間の距離が小さすぎる場合に、合致および副次影響の増加につながり得る。合致、すなわち、検出ウィンドウ内での１つより多い粒子の検出は、分析されたサンプルから影響を受けた粒子のアボーションにつながる。副次影響、すなわち、隣接する光源によって生成される光応答の検出は、副次影響効果を補う必要性によって非効率を引き起こす。したがって、合致および副次影響の増加を回避するために、レーザ光源は、相互の間に大幅な距離を伴って設置される。複数のレーザ光源間の距離を増加させることによって、粒子分析器の効率は、合致および副次影響を低減することによって向上させられることができる。光源間の増加した距離はまた、一連の粒子サイズの分析も可能にし、したがって、粒子分析器の有用性をさらに増大させる。しかしながら、レーザ光源間の距離を増加させることは、レーザ光源間の距離が増加させられたときに粒子について生成されたパラメータが、しばしば正確ではないという予想外の発見につながった。

【0007】

したがって、複数の光源を利用する粒子分析器において生成されるパラメータの精度を向上させることが所望される。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、粒子分析器データの分析を対象とする。一実施形態において、粒子分析器の中の粒子サンプルの測定パラメータを生成する方法は、それぞれ調査領域の長さに沿って設置された調査器（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｏｒ）を用いて粒子サンプルを調査するステップであって、調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ステップと、粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成するステップであって、パルスは、始動調査器に対応する始動パルスおよび二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ステップと、始動パルスに基づいて一次パルス検出ウィンドウを決定するステップと、一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて二次パルスを見出す検査間隔を決定するステップと、第１の粒子の調査に基づいてレーザ遅延変動に合わせて検査間隔を動的に調整するステップと、調整された検査間隔の中の二次パルスを識別するステップと、二次パルスのピーク値を決定するように二次パルスを処理するステップとを含む。

【0009】

別の実施形態において、粒子分析器の中の粒子サンプルの測定パラメータを生成する方法は、それぞれ調査領域の長さに沿って設置された調査器を用いて粒子サンプルを調査するステップであって、調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ステップと、粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成するステップであって、パルスは、始動調査器に対応する始動パルスおよび二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ステップと、始動パルスに基づいて一次パルス検出ウィンドウを決定するステップと、一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて二次パルス検出ウィンドウを決定するステップと、第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出するステップと、摂動信号の特性に基づいて二次パルス検出ウィンドウをシフトするステップと、調整された検査間隔の中の二次パルスを識別するステップと、二次パルスの測定パラメータを決定するように二次パルスを処理するステップとを含む。

【0010】

さらに別の実施形態は、少なくとも１つのプロセッサ、粒子調査器およびパルス分析器を含む粒子分析器である。粒子調査器は、調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて粒子サンプルを調査するように構成され、調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備え、粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいてそれぞれのパルスを生成するように構成され、パルスは、始動調査器に対応する始動パルスと、二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスとを備える。パルス分析器は、始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定するように構成される一次パルス検出ウィンドウ作成器と、一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて、該二次調査器のうちの１つに対応する検査間隔を決定するように構成される二次パルス検出ウィンドウ作成器と、二次パルスパラメータ発生器とを含む。二次パルス検出ウィンドウ作成器はまた、第１の粒子の調査に基づいて、レーザ遅延変動に合わせて検査間隔を動的に調整するように構成することもできる。二次パルスパラメータ発生器は、調整された検査間隔の中の二次パルスを識別し、二次パルスを処理して二次パルスのピーク値を決定するように構成される。
本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
粒子分析器の中の粒子サンプルに対して測定パラメータを生成する方法であって、
（ａ）調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて該粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
（ｂ）該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスと、該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスとを備える、ことと、
（ｃ）該始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｄ）該一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて、該二次パルスを見出すための検査間隔を決定することと、
（ｅ）該第１の粒子の調査に基づいて動的に、レーザ遅延変動に対して該検査間隔を調整することと、
（ｆ）該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
（ｇ）該二次パルスのピーク値を決定するように該二次パルスを処理することと
を含む、方法。
（項目２）
（ｈ）前記二次パルスのパルス幅値を決定するように該二次パルスを処理することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記パルス幅値は、前記二次パルスの前記ピーク値の所定の割合である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記調整するステップ（ｅ）は、
前記第１の粒子の調査に基づいて、調整のサイズを決定することと、
該調整のサイズに比例して前記検査間隔を増加させることと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記調整するステップ（ｅ）は、
該二次パルス検出ウィンドウの中の前記二次パルスの部分を識別することと、
該二次パルス検出ウィンドウの外側の該二次パルスの部分を含むように、該検査間隔を拡張することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記二次パルス検出ウィンドウの継続時間は、前記一次パルス検出ウィンドウの継続時間に所定のウィンドウ拡張を加えたものに実質的に等しい、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記二次パルスを処理するステップ（ｇ）は、
（ｉ）前記二次パルス検出ウィンドウの内側の該二次パルスの部分に基づいて、該二次パルスに対する初期ピーク値を決定することと、
（ｉｉ）該初期ピーク値の所定の閾値において、該二次パルスを検出することと、
（ｉｉｉ）該二次パルスに対して検出される最高値を繰り返し記憶することと
を含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｉｉ）−（ｉｉｉ）は、前記二次パルスの再処理中に行われる、項目７に記載の方法。
（項目９）
検査間隔を決定するステップ（ｄ）は、
前記一次パルス検出ウィンドウの発生時間を決定することと、
前記始動調査器と前記二次調査器との間の前記レーザ遅延を決定することと、
該一次パルス検出ウィンドウの該発生時間および該レーザ遅延に基づいて、前記二次パルス検出ウィンドウの発生時間を計算することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記レーザ遅延は、前記一次調査器から前記二次調査器までの分離距離、および前記第１の粒子の速度に基づいて決定される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記検査間隔を決定するステップ（ｄ）は、
前記一次パルス検出ウィンドウの継続時間を決定することと、
該一次パルス検出ウィンドウの該継続時間に基づいて、前記二次パルス検出ウィンドウの継続時間を設定することと
をさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記二次パルス検出ウィンドウの前記継続時間を設定することは、所定のウィンドウ拡張にさらに基づいている、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記距離は、前記一次パルス検出ウィンドウの中心から測定される、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
ステップ（ｃ）は、
所定のパルス閾値に対応する前記始動パルスにおける第１および第２の位置を検出することと、
該第１および第２の位置に基づいて、前記一次パルス検出ウィンドウを決定することと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記調整するステップ（ｅ）は、
前記第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
該一次パルス検出ウィンドウおよび該摂動信号の特性を含む因子に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記摂動信号は、前記粒子サンプルが通過させられるノズルに印加され、該ノズルは、前記調査器の前に設置される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記特性は、前記信号が前記第１の粒子に印加されている間の前記摂動信号の位相を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記摂動信号は、正弦波である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
（ｉ）前記二次パルスの前記ピーク値を報告することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
粒子分析器の中の粒子サンプルの測定パラメータを生成する方法であって、
（ａ）調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて該粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
（ｂ）該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスおよび該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ことと、
（ｃ）該始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｄ）該一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて、二次パルス検出ウィンドウを決定することと、
（ｅ）該第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
（ｆ）該摂動信号の特性に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと、
（ｇ）調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
（ｈ）該二次パルスの測定パラメータを決定するように該二次パルスを処理することと
を含む、方法。
（項目２１）
少なくとも１つのプロセッサと、
該少なくとも１つのプロセッサに連結される粒子調査器であって、該粒子調査器は、
流動粒子の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて粒子サンプルを調査することであって、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備える、ことと、
該粒子サンプルからの第１の粒子の調査に基づいて、それぞれのパルスを生成することであって、該パルスは、該始動調査器に対応する始動パルスおよび該二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを備える、ことと
を行うように構成される、粒子調査器と、
該少なくとも１つのプロセッサに連結されるパルス分析器であって、該パルス分析器は、
一次パルス検出ウィンドウ作成器であって、
該始動パルスに基づいて一次パルス検出ウィンドウを決定するように構成される一次パルス検出ウィンドウ作成器と、
二次パルス検出ウィンドウ作成器であって、
該一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて、該二次パルスを見出すための検査間隔を決定することと、
該第１の粒子に基づいて動的に、レーザ遅延変動に対して該検査間隔を調整することと
を行うように構成される二次パルス検出ウィンドウ作成器と、
二次パルスパラメータ発生器であって、
該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
該二次パルスのピーク値を決定するために、該二次パルスを処理することと
を行うように構成される二次パルスパラメータ発生器と
を備える、パルス分析器と
を備える、粒子分析器。
（項目２２）
前記少なくとも１つのプロセッサに連結され、前記パルス分析器からパラメータを受信するように構成されるデータ分析器と、
該少なくとも１つのプロセッサに連結されるディスプレイと
をさらに備える、項目２１に記載の装置。
（項目２３）
前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記二次パルス検出ウィンドウ作成器は、
該二次パルス検出ウィンドウの中の前記二次パルスの部分を識別することと、
該二次パルス検出ウィンドウの外側の該二次パルスの部分を含むように該検査間隔を拡張することと
を行うようにさらに構成される、項目２１に記載の装置。
（項目２４）
前記検査間隔は、前記一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて決定される二次パルス検出ウィンドウを備え、前記二次パルス検出ウィンドウ作成器は、
前記第１の粒子に印加される摂動信号の特性を検出することと、
該一次パルス検出ウィンドウおよび該摂動信号の特性を含む因子に基づいて、該二次パルス検出ウィンドウをシフトすることと
を行うようにさらに構成される、項目２１に記載の装置。
（項目２５）
コンピュータ使用可能媒体を備えるコンピュータプログラム製品であって、該媒体は、調査領域の長さに沿ってそれぞれ設置された調査器を用いて粒子サンプルのパラメータをコンピュータに生成させるための記憶された制御論理をその中に有し、該調査器は、始動調査器および１つ以上の二次調査器を備え、該制御論理は、
始動パルスに基づいて、一次パルス検出ウィンドウを決定することと、
該一次パルス検出ウィンドウおよびレーザ遅延を含む因子に基づいて、二次パルスを見出すための検査間隔を決定することと、
第１の粒子に基づいて動的に、レーザ遅延変動に対して該検査間隔を調整することと、
該調整された検査間隔の中の該二次パルスを識別することと、
該二次パルスのピーク値を決定するように該二次パルスを処理することと
を含む、製品。

【0011】

本発明のさらなる特性および利点、ならびにその種々の実施形態の構造および動作を、添付図面を参照して下記に詳細に説明する。本発明は、本明細書に説明する特定の実施形態に限定されないことに留意されたい。そのような実施形態は、図示目的のみのために本明細書に提示される。さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて当業者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、本発明の一実施形態による、例示的な粒子分析器である。

【図2】図２は、例示的なパルスおよびその対応する検出ウィンドウの説明図である。

【図3】図３は、粒子分析器の中で摂動信号を導入することの効果の説明図である。

【図4】図４は、細胞の流れに印加される摂動信号の特性に関するパルスの特性の説明図である。

【図5】図５は、本発明の一実施形態による、パルス分析器の説明図である。

【図6】図６は、本発明の一実施形態による、粒子分析器の中でパラメータを正確に生成する方法の説明図である。

【図7】図７は、本発明の一実施形態による、二次パルス検出ウィンドウを越えて検査間隔を拡張する方法の説明図である。

【図8】図８は、本発明の一実施形態による、パルスのピーク値を計算するための方法の説明図である。

【図9】図９は、本発明の一実施形態による、二次パルス検出ウィンドウを決定する方法の説明図である。

【図10】図１０は、流れに印加される摂動信号の位相と、対応するパルス検出ウィンドウに対するパルスの到着時間との間の関係の説明図である。

【図11】図１１は、本発明の一実施形態による、二次パルス検出ウィンドウを調整するための方法の説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の特性および利点は、図面と併用されると、下記に記載する発明を実施するための形態からより明らかになるであろう。図面において、同様の番号は、一般に、同一の、機能的に同様の、および／または構造的に同様の要素を示す。一般に、要素が最初に出現する図面は、対応する参照番号の最も左の桁によって示される。

【0014】

本発明は、粒子分析に関する。本発明は、特定の用途のための例示的実施形態を参照して本明細書において説明されるが、本発明はそれに限定されないことを理解されたい。本明細書の教示にアクセスできる当業者であれば、その範囲内の付加的な修正、用途、および実施形態、ならびに本発明が有意に有用となる付加的な分野を認識するであろう。

【0015】

上記の背景技術の項で説明されるように、レーザ源および検出器等の複数の光学調査器が、細胞サンプルを調査するために利用可能であることが所望される。複数のレーザ調査器であって、各レーザ調査器は、サンプルの流路の中の調査領域の長さに沿って設置され、周波数スペクトルの一部からの光を励起および検出することが可能であり、細胞サンプルに広範囲の波長および周波数にわたる調査を受けさせることができ、したがって、粒子分析器を通した細胞サンプルの１回の実行の有用性および有効性を増加させる。レーザの費用削減、増加する種々の蛍光色素の可用性、および増加した処理能力の可用性等の他の因子が、従来のデバイス上で利用可能であるよりも多数の光学調査器を有する粒子分析器の開発を促進する。しかしながら、発明者らは、光学調査器の数を増加させること、より具体的には、光学調査器間の距離を増加させることが、粒子の特性を表すパラメータの生成において、意図しない結果および不一致を招き得ることを発見した。調査領域を通って流れる細胞の流れが（例えば、滴下の形成を促進して分類を可能にするように）摂動される、分類フローサイトメータ等のいくつかの粒子分析器では、多数の光学調査器を有するデバイスにおいて従来の方法に従ってパラメータを生成することに関与する誤差は、多大となり得る。本発明の実施形態は、複数の光学調査器を有する粒子分析器の中で、パルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等の正確なパラメータの生成を可能にする。複数の光学調査器の使用を可能にすることによって、本発明の実施形態は、１回の実行で種々の粒子特性を検出する粒子分析器の能力を増加させる。正確なパラメータを依然として生成しながら、複数の光学調査器が相互から大幅な距離を置いて配置されることを可能にすることによって、本発明の実施形態は、合致および副次影響を低減または排除することによって、粒子分析器の効率性を増加させる。加えて、複数の光学調査器が相互から大幅な距離を置いて配置されることを可能にすることによって、本発明の実施形態は、例えば、異なるノイズ構成を使用することによって、種々のサイズの粒子の分析を可能にする。

【0016】

（粒子分析器）
図１は、本発明の実施形態による粒子分析器１００の説明図である。粒子分析器１００は、例えば、分類フローサイトメータとなり得る。粒子分析器１００は、１つ以上のプロセッサ１０２と、メモリ１０３と、記憶装置１０４と、粒子調査器１０５と、パルス分析器１０６とを備える。いくつかの実施形態において、粒子分析器１００はまた、データ分析器１０７と、ディスプレイ１０８とを含むことができる。

【0017】

１つ以上のプロセッサ１０２は、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、または類似命令処理デバイスのうちの１つ以上を含む。メモリ１０３は、概して、データおよび処理命令の一時記憶用のランダムアクセスメモリ等の揮発性メモリを含む。記憶装置１０４は、概して、処理命令、構成データ、粒子データ、および処理の結果を記憶するための不揮発性記憶装置を含む。記憶装置１０４は、ハードディスク、フラッシュ記憶装置、光ディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および同等物等のコンピュータ可読媒体を含むことができる。粒子調査器１０５は、粒子サンプルが調査領域中の複数の光源による調査を受けることを可能にする。パルス分析器１０６は、粒子サンプルの中の個別の粒子に対応するパラメータを生成する機能を含む。例えば、パルス分析器１０６は、それぞれの粒子について粒子調査器１０５によって生成される電気パルスを入力として受け入れ、パルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等のパラメータを生成する。パルス分析器１０６は、図５に関して以下でさらに説明される。次いで、パルス分析器１０６において生成されるパラメータは、データ分析器１０７によって処理され、ディスプレイ１０８を使用して報告および／または表示される。通信インフラストラクチャ１０９は、粒子分析器１００の種々の構成要素を相互接続することができ、周辺構成要素相互接続（ＰＣＩ）バス、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、Ｆｉｒｅｗｉｒｅ、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、または類似デバイス等の接続デバイスを含むことができる。

【0018】

データ分析器１０７は、パルス分析器１０６によって生成されたパラメータを受信し、さらに、データを等級に分け、数え、分析することによって、データを報告および／または処理する。データ分析器１０７は、誤ったデータについて受信したデータをフィルタにかける機能性を含むことができる。本発明のいくつかの実施形態は、データ分析器１０７等のデータ分析器に提出されるパラメータの質を向上させる。データ分析器１０７および／またはディスプレイ１０８は、いくつかの実施形態において、粒子分析器１００の外部にあり得る。データ分析器１０７は、例えば、ネットワーク（図示せず）を介して粒子分析器１００に連結される別個のコンピュータ上に構成されることができる。実施形態において、データ分析器１０７は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＳＵＭＭＩＴ^ＴＭフローサイトメトリデータ分析ソフトウェア等の分析ソフトウェアを含むことができる。

【0019】

粒子調査器１０５は、粒子サンプル分注領域１１２と、サンプル注入ノズル１１３と、調査領域１１４と、複数の光源１１６と、複数の光検出器１１８と、電気パルス発生器１２０とを含む。粒子サンプル分注領域１１２は、粒子サンプル１２６およびシース流体１２８を保持することを提供する。粒子サンプルは、例えば、全血サンプル、または１つ以上の蛍光色素および／または試薬を添加することによって調製される全血サンプルとなり得る。

【0020】

ノズル１１３は、シース流体を含む粒子サンプルの注入が、調査領域１１４に注入されることを可能にする。ノズル１１３は、一般に、粒子１３０等の粒子が、次々に一列になって調査領域１１４を通って流れるように、流体力学的に集中した粒子サンプルを注入するように構成される。いくつかの実施形態において、ノズル１１３は、ノズルのサイズ（すなわち、ノズルの直径）およびシース流体圧力によって構成することができる。

【0021】

調査領域１１４の長さにわたって、複数の光源１１６および複数の対応する光検出器１１８が設置される。調査領域１１４は、いくつかの実施形態において、フローセルを備えることができる。ジェットインエアフローサイトメータ等のいくつかの実施形態において、調査領域は、フローセルの中ではなく、粒子サンプルの流路の中に領域を備えることができる。光源と対応する検出器とのペアは、調査器と呼ぶことができる。図示した実施形態において、７つの光源１１６および７つの対応する光検出器１１８が、調査領域の長さに沿って設置されて示されている。実施形態において、光源１１６は、異なる波長を有するレーザ光源を備えることができる。調査領域において、光源１１６のそれぞれは、各粒子がそれぞれの光源に対応する検出領域を通過するとき、それを照射し、光散乱および／または蛍光を含む、結果として生じる光信号は、対応する検出器１１８によって検出される。各検出器は、ピンホール（別々に示されていない）と、光散乱および／または蛍光を検出する光学検出器とを備えることができる。各検出器からの光信号は、電気パルス発生器１２０によって、電圧信号等のそれぞれの電気信号に変換される。調査器による単一の細胞の調査によって生成される光応答に対応する、結果として生じる電気信号は、パルスと呼ばれる。パルスは、粒子に対応する種々のパラメータを識別するために、およびパラメータをデータ分析器１０７に提供するために、パルス分析器１０６によって処理される。パルス分析器１０６はまた、識別されたパラメータに基づいて、ノズルを構成すること、光源および検出器を構成すること、および光学粒子分類器１２２を構成すること等の作業を行うために、例えば、制御モジュール（図示せず）を介して粒子調査器１０６の動作を制御することもできる。

【0022】

いくつかの実施形態において、粒子分類器１２２は、種々の特性に従って粒子を分類するために使用される。粒子分類器１２２と関連付けられるのは、粒子帯電デバイス１３６および摂動発生器１２４である。摂動発生器１２４は、調査領域に注入される粒子の流れの摂動を生成するように、ノズル１１３と関連付けることができる。実施形態において、摂動発生器１２４は、ノズル出口より上側において、ノズル１１３等のノズルアセンブリの中に位置する。例えば、正弦波に対応する圧力波を、摂動発生器によって生成することができる。圧力波は、理想的には各液滴が単一の粒子を含有して、粒子の流れが液滴形成領域１３２の中で確定的に液滴を形成することができるように構成される。実施形態において、摂動発生器１２４は、設定可能な発振周波数を有する圧電結晶発振器を備える。実施形態において、摂動の周波数、振幅、および位相は、設定可能である。液滴形成領域１３２は、調査領域中の粒子の流れの経路の中の光学調査器の後に発生する。電荷を、帯電デバイス１３６によって各液滴に印加することができる。実施形態において、帯電デバイス１３６は、液滴形成領域１３２の中に位置する。別の実施形態において、帯電デバイスは、調査領域の前に位置してもよい。例えば、調査領域より上側に位置する帯電デバイスは、シース流体を通して電荷を液滴形成領域１３２の中の液滴に運ぶことができる。液滴は、液滴に含有される粒子の特性に従って帯電させることができる。液滴が分類器に進入するときに、帯電板１３８が、液滴を容器１４０のうちの１つに方向付ける。粒子分類器１２２は、容器１４０のそれぞれに類似特性を有する粒子を収集させるように構成される。

【0023】

粒子サンプルの調査は、摂動の有無にかかわらず、調査領域の中へのサンプルの注入と、調査領域に沿ったプローブによる粒子の調査とを含む。前述のように、各調査器は、同じ粒子の同一または異なる側面を表すパルスを生成させる。パルス分析器１０６は、粒子調査器１０５から、生成されたパルスを含有する信号流を受信し、各粒子および調査器に対応するパルスを識別するように構成される。

【0024】

それぞれの光源１１６の間の空間的間隔は、光源の数、調査領域の長さ、粒子のサイズ、滴下形成を促すように生成することができる圧力波の振幅、光源の出力、細胞事象率、許容誤差のレベル、および同等物等の種々の基準に基づいて決定することができる。

【0025】

相互の近くに光源を設置することは、隣接する空間周波数に対応する信号が、相互の検出範囲まで波及することを可能にすることによって、空間重複を増加させることができる。分析のための有効な信号を取得するために、付加的な補償が必要とされるので空間重複は望ましくない。しかしながら、光源がさらに離間している場合に、粒子が実際に検出器の検出領域を通過するとき、およびそれが検出領域の中にあることが期待されたときについて変動が発生し得る。摂動発生器１２４を使用すること等によって、粒子の流れの摂動が導入されると、粒子間の速度の変動が増加させられ、それは次に、パルスを検出することにおいて増加した誤差につながり得る。従来の粒子分析器は、発明者らの知る限りでは、調査器間の間隔、二次調査器におけるパルスの到着時間、および細胞の流れに印加される摂動信号の間の関係が認識されていなかった。本発明の実施形態は、そのような関係が存在するときに、生成されたパラメータの不正確さを克服する特徴を粒子分析器に組み込む。

【0026】

図２は、パルス、パルス検出ウィンドウ、およびパルス検出閾値の説明図である。パルス分析器１０６は、特定の調査器に対応するパルス検出ウィンドウを作成し、次いで、その検出ウィンドウに対するパルスを見出すことによって、粒子調査器からの入力信号流の中のパルスを検出する。パルス２０１は、例えば、パルス検出ウィンドウ２０３内に見られる。パルス２０１は、対応する信号がパルス検出閾値２０５に、またはそれ以上のままであるときに、パルスとして検出される。パルス検出閾値２０５は、事前設定することができる。始動調査器では、検出ウィンドウ幅は、閾値を上回るパルスの継続時間に基づいて決定される。始動調査器は、ユーザ選択可能となり得る。例えば、調査領域への入力に最も近い調査器は、始動調査器として選択することができる。始動調査器は、細胞サンプルの種類および／または所望される分析の種類に基づいて選択することができる。始動調査器に対応するパルスおよびパルス検出ウィンドウは、それぞれ、一次パルスおよび一次パルス検出ウィンドウと呼ばれることができる。非始動調査器、それに対応するパルス、およびそれに対応する検出ウィンドウは、それぞれ、二次調査器、二次パルス、および二次パルス検出ウィンドウと呼ばれる。レーザ遅延（ＬＤ）は、一次パルス検出ウィンドウと二次パルス検出ウィンドウとの間の時間における距離である。レーザ遅延は、それぞれの調査器の間の空間距離、およびそれぞれの粒子の速度に依存し得る。

【0027】

（レーザ遅延変動）
図３は、多大のレーザ遅延が調査器の間に存在するように、複数の光学調査器が調査領域に沿って設置されるときに、摂動を粒子の流れに導入することによって引き起こすことができる差の説明図である。上記で説明されたように、摂動は、粒子の流れに導入される圧力波であってもよい。摂動は、ノズル１１３の中に、またはノズル１１３に近接して設置される摂動発生器１２４を使用して導入することができる。グラフ３０１は、摂動がないときの始動調査器に対応するパルスに基づく、ＦＩＴＣ（一種の蛍光）および側方散乱の測定値を図示する。グラフ３０５は、摂動が導入されたときの第１の調査器に対応するパルスに基づく、同じサンプルの同じ測定値を図示する。グラフ３０１および３０５は、始動調査器に対応するパルスが、実質的に摂動の影響を受けない、すなわち、摂動があるにもかかわらず第１の調査器に対応するパルスを正確に決定できることを図示する。この実施例では、始動調査器は、７つの調査器のうちの第１、すなわち、ノズルに最も近いものとして構成される。

【0028】

しかしながら、グラフ３０２および３０６は、第１の調査器から最も遠くに位置する最後の調査器に対応するパルスに基づく蛍光測定を表す。グラフ３０２は、蛍光測定の狭い変動によって示されるように、摂動がないときに、第７の調査器でさえも、大幅な誤差を伴わずにパルスを測定できることを図示する。しかしながら、グラフ３０６は、蛍光測定の広い変動によって示されるように、摂動が粒子の流れの中に存在するときに、遠い調査器に対応する測定に大幅な分散があり得ることを図示する。

【0029】

図４は、対応するパルス検出ウィンドウに対するパルスの例示的な説明図である。パルス４０１および４０３はそれぞれ、いくらかの摂動（例えば、１５Ｖの摂動信号振幅）および比較的高いレベルの摂動（例えば４０Ｖの摂動信号振幅）の場合、始動調査器（すなわち、一次調査器）について検出されるパルスが、対応するパルス検出ウィンドウ内に正確に設置されることを示す。摂動信号振幅が１５Ｖであるときに、調査領域中の始動調査器に先行する調査器、および始動調査器の後に設置される調査器における対応するパルスをそれぞれ表す、パルス４０７および４０８は、対応するパルス検出ウィンドウの前または後に、パルスの大部分を有することができることを図示する。パルス４１０および４１１は、摂動信号振幅が増加させられるときに、対応するパルス検出ウィンドウに関するパルスの到着の差が増加することを図示する。例えば、期待到着時間は、パルス検出ウィンドウの中心に対して測定することができる。対応するパルス検出ウィンドウに基づく期待到着時間と比較したパルスの到着時間の差は、レーザ遅延変動（ＬＤＶ）と呼ばれる。したがって、レーザ遅延変動は、摂動振幅の増加とともに増加する。

【0030】

（パルス分析器）
図５は、パルス分析器１０６の説明図である。実施形態によれば、パルス分析器１０６は、一次パルス検出ウィンドウ作成器５０２と、一次パルスパラメータ発生器５０４と、二次パルス検出ウィンドウ作成器５０６と、二次パルスパラメータ発生器５０８とを備える。生成されたパラメータに基づいて粒子調査器１０５を制御する制御モジュール（図示せず）等の他の構成要素をパルス分析器１０６に含むことができると理解される。パルス分析器１０６は、ソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、またはそれらの任意の組み合わせで実装することができる。実施形態において、パルス分析器１０６は、ＦＰＧＡファームウェアに実装される。

【0031】

一次パルス検出ウィンドウ作成器５０２は、実施形態において、調査領域中に検出される各粒子に対する一次パルス検出ウィンドウを決定するように構成される。一次パルス検出ウィンドウの決定は、図６に関して以下で説明される。

【0032】

一次パルスパラメータ発生器５０４は、実施形態において、一次パルスに基づいてパルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等のパラメータを決定するように構成される。一次パルスパラメータの決定は、図６に関して以下で説明される。

【0033】

二次パルス検出ウィンドウ作成器５０６は、実施形態において、調査領域中に検出されるそれぞれの粒子に対する１つ以上の二次調査器に対応する検査間隔を決定するように構成される。二次パルス検出ウィンドウ作成器５０６はまた、レーザ遅延変動に基づいて検査間隔を調整する機能も含む。二次パルスの検査間隔の決定および調整は、図６に関して以下で説明される。

【0034】

二次パルスパラメータ発生器５０８は、実施形態において、一次パルスに基づいて、各粒子のパルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等のパラメータを決定するように構成される。二次パルスパラメータの決定は、図６に関して以下で説明される。

【0035】

（パラメータを生成する方法）
図６は、本発明の一実施形態による粒子分析器の中の粒子サンプルのパルスピーク、パルス幅、およびパルス面積等の測定パラメータを生成するための方法６００のフローチャートである。

【0036】

ステップ６０２において、細胞サンプルが、フローサイトメータ等の粒子分析器の中における分析のために調製される。サンプル調製は、蛍光によって細胞を印付けること（染色とも呼ばれる）を含むことができる。上述のように、蛍光は、特定の細胞種類に結合し、細胞サンプルが適切なレーザ光によって照射されたときに、これらの細胞種類を識別するために使用することができる。

【0037】

ステップ６０４において、細胞サンプルが、調査領域の中において調査される。粒子サンプルの調査は、摂動の有無にかかわらず、調査領域の中へのサンプルの注入と、調査領域に沿ったプローブによる粒子の調査とを含む。

【0038】

調製した細胞サンプルは、シース流体とともに、粒子分析器に入力される。調査領域への入力は、ノズルサイズおよびシース圧力等の種々の特徴を設定することによって制御することができる。ノズルサイズは、例えば、種々の粒子種類に対応するように設定される。シース圧力は、粒子の流れが調査領域に注入される速度を決定することができる。したがって、シース圧力は、調査領域内の粒子の所望の平均速度に従って設定されることができる。

【0039】

いくつかの実施形態において、摂動信号を粒子の流れに印加することができる。例えば、摂動発生器は、ノズルから退出するとき、正弦波の形態の圧力を粒子の流れに導入することができる。摂動は、粒子が調査領域を通って流れるとき、粒子間の速度差を（摂動がない場合に対して）増加させることができる。

【0040】

調査領域の長さに沿って、すなわち、調査領域内の細胞サンプルの流路に沿って複数の光学調査器が設置される。実施形態において、光学調査器は、レーザダイオード等の７つのレーザ光源、および対応する光検出器である。レーザは、重複してもしなくてもよい波長範囲を有することができる。光検出器は、光散乱、蛍光、および他の光学特性を感知することが可能である。各粒子は、レーザ源によって照射される調査領域を通過し、対応する検出器は、結果として生じる光信号を収集する。このようにして、各動作中の光学調査器に対応する光信号が、各粒子について収集される。

【0041】

ステップ６０６において、調査に対応するパルスが生成される。次いで、各光検出器によって収集される光信号が、それぞれの電気パルスに変換される。実施形態において、電気信号への光信号の光電子変換は、フォトダイオード、光電子増倍管、または同等物等のデバイスによって達成することができる。実施形態において、ステップ６０４および６０６は、粒子調査器１０５によって行うことができる。

【0042】

ステップ６０８において、一次パルスが検出される。一次パルスは、それに対して同じ粒子の他のパルスが測定されるパルスである。一次パルスは、始動調査器、すなわち、それに対して全ての他の調査が測定される調査器と関連付けられる。実施形態において、始動光学調査器は、粒子流の経路の中の第１の調査器である。他の実施形態において、始動調査器は、他の調査器のうちの任意の１つとして選択することができる。上述のように、ユーザは、サンプルの種類および分析の種類に基づいて、異なる光学調査器を始動調査器として選択することができる。

【0043】

ステップ６１０において、一次パルス検出ウィンドウが決定される。一次パルス検出ウィンドウは、一次パルスによって画定される。一次パルス検出ウィンドウの２つの端は、一次パルスが所定のパルス検出閾値を超える点に、すなわち、それぞれ、上昇稜線（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｅｄｇｅ）および下降稜線（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｅｄｇｅ）に位置する。したがって、一次パルス検出ウィンドウの幅は、実施形態において、パルスがパルス検出閾値を超える点の間において測定される一次パルスの幅に等しい。

【0044】

ステップ６１２において、任意に、一次パルスに対応するパラメータが計算される。実施形態において、計算されるパラメータは、一次パルスのピーク、幅、および面積含む。実施形態において、一次パルス検出ウィンドウの中のパルスの最高値が、パルスピークとして決定される。例えば、ピークを決定するために、トラックアンドホールド回路を使用することができる。別の実施形態において、先入れ先出し（ＦＩＦＯ）バッファ等のメモリバッファは、一次パルス検出ウィンドウの開始時に空値に初期化されることができ、パルスが一次パルス検出ウィンドウの全体を通して横断させられるにつれて、バッファにおける現在の値よりも高い各連続値によって更新されることができる。

【0045】

一次パルス幅は、実施形態において、一次パルスの上昇稜線上の半ピーク点と下降稜線上の半ピーク点との間の距離（継続時間）として決定される。他の実施形態は、パルスの前後の稜線（所定のパルス検出閾値との交差点）の間の距離、またはパルスの上昇および下降稜線上のいくつかのピーク割合（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ−ｏｆ−ｐｅａｋ）点の間の距離を使用することができる。

【0046】

一次パルス面積は、ピーク値の所定の割合より上のパルスを積分することによって決定される。したがって、パルス面積は、ピーク値の所定の割合に対応する点の間の曲線の下の面積によって画定される。別の実施形態において、パルス面積は、所定のパルス検出閾値との交差点の間のパルスを積分することによって決定されることができる。

【0047】

一次パルスを始動した粒子に関して、パルスが生成される各調査器についてステップ６１４−６２０を繰り返すことができる。ステップ６１４において、二次調査器のうちの１つに対応する二次パルスを検出する検査間隔が決定される。検査間隔は、二次パルスが入力パルスの流れの中で検出可能となることが見込まれる継続時間を画定する。実施形態において、検査間隔は、一次パルス検出ウィンドウ、および始動調査器から選択された二次調査器までのレーザ遅延に基づいて決定することができる。例えば、検査間隔は、それぞれの始動と二次調査器との間のレーザ遅延に対応する一次パルス検出ウィンドウからある距離に中心に置くことができる。レーザ遅延は、各始動調査器と二次調査器とのペアに対してあらかじめ決めることができる。別の実施形態において、レーザ遅延は、始動調査器と二次調査器との間の空間距離、および調査領域の中の粒子の平均速度に基づいて決定することができる。粒子の速度は、注入ノズルやシース圧力の既知の仕様から決定することができ、または一次パルス検出ウィンドウの幅に基づいて推定することができる。さらに他の実施形態において、粒子の速度は、例えば、その間の距離が分かっている複数の調査器によって粒子が検出されるために経過した時間を測定すること等の、動的測定に基づいて決定することができる。また、図４に関して上記で説明されたように、印加された摂動の振幅は、もしあれば、粒子の速度に影響を及ぼすことができ、対応する二次調査器に到着する粒子と関連付けられる遅延に影響を及ぼすことができる。

【0048】

検査間隔の継続時間は、一次パルス検出ウィンドウの幅に等しくなるように設定されることができる。別の実施形態において、検査間隔の継続時間は、一次パルス検出ウィンドウに所定の拡張を加えたものに等しくなるように設定される。所定のウィンドウ拡張は、検査ウィンドウと一次パルス検出ウィンドウとの中心間の距離が維持されるように、検査間隔の両側に等しく追加することができる。別の実施形態において、検査間隔の継続時間は、所定の設定に従って設定されることができる。拡張は、ある程度、元の検出ウィンドウに対するパルスの到着の分散に適応するように導入される。拡張のサイズは、静的に設定することができ、対応する一次パルス検出ウィンドウのサイズに基づいて設定されることができ、または摂動の強度に従って決定されることができる。例えば、摂動のより大きい振幅に対して、より大きい拡張が設定されることができ、小さい振幅に対して、より小さい拡張が設定されことができる。

【0049】

実施形態において、二次パルス検出ウィンドウは、検査間隔に対応するように決定される。選択された調査器に対する二次パルス検出ウィンドウは、その間において、入力パルスの流れが、最初に対応する二次パルスの存在について試験される時間間隔である。合致および副次影響の検出は、例えば、一次および／または二次パルス検出ウィンドウに基づいている。パルス検出ウィンドウのサイズ決定（すなわち、継続時間の設定）は、ウィンドウを過度に大きくすることと、増加した合致事象を許可することとの間のトレードオフ、およびウィンドウを小さくすることと、パルスがウィンドウの外側になることを許容することとの間のトレードオフの均衡を保たなければならない。パルス検出ウィンドウを大きくすることはまた、１つのパルス検出ウィンドウが隣接する調査器のパルス検出ウィンドウと重複するという問題につながり得る。

【0050】

ステップ６１６において、検査間隔が、レーザ遅延変動に基づいて調整される。実施形態において、検査間隔は、最初に二次パルス検出ウィンドウに対応する。実施形態によれば、たとえ対応するパルスが、レーザ遅延変動によって二次パルス検出ウィンドウに対して早く、または遅く到着してもそれを検出することができるように、検査間隔は、二次パルス検出ウィンドウの前および／または後の継続時間を含むように拡張される。図７は、二次パルス検出ウィンドウを越えて拡張することによって検査間隔が調整される実施形態の説明図である。別の実施形態において、二次パルス検出ウィンドウは、拡張された継続時間を含む。拡張された継続時間は、例えば、粒子がノズルから退出するときの摂動の状態または振幅に基づいて決定されることができる。

【0051】

いくつかの実施形態、例えば、検査間隔が二次パルス検出ウィンドウおよび拡張された継続時間を備える実施形態、および検査間隔が拡張された二次パルス検出ウィンドウに対応する実施形態によれば、検査間隔は、隣接するウィンドウの間の衝突を回避するために動的に修正されることができる。例えば、拡張された検査間隔の衝突を検出すると、衝突検査間隔を重複させないように、検査間隔を切り詰めるか、または調整することができる。

【0052】

別の実施形態において、検査間隔は、二次パルス検出ウィンドウに対応し、検査間隔は、その最初の位置に対して、時間において前方または後方に発生するようにシフトまたは移動させることによって調整される。検査間隔は、期待されるレーザ遅延変動が、最初の位置の前または後に到着するパルスをもたらすか否かに基づいて移動させられる。図１１は、検査間隔および／または対応する二次パルス検出ウィンドウが、期待されるレーザ遅延変動に基づいて、その最初の位置に対して移動させられる実施形態の説明図である。

【0053】

ステップ６１８において、対応する二次パルスが、調整された検査間隔に関して検出される。実施形態において、二次パルス検出ウィンドウに対応するパルスは、対応するパルス検出ウィンドウの中に、それの大部分を有するパルスとして決定される。実施形態において、１つより多くのパルスが、少なくとも部分的にウィンドウの中にあると分かった場合、それより多くがウィンドウの中にあるパルスは、それぞれのウィンドウに対応するパルスと見なされる。別の実施形態において、より高いピーク値を有するパルスが考慮される。他の実施形態において、それぞれのウィンドウは、１つだけのパルスを含むように調整することができる。

【0054】

ステップ６２０において、二次パルスに対応するパラメータが決定される。実施形態において、ステップ６１８において対応する二次パルスを見出した後、閾値パルス検出値を上回るか、および／またはピーク値の所定の割合を上回るパルスによって画定されるようなパルスは、そのような部分の全体が二次調査ウィンドウの中に位置するか否かにかかわらず考慮される。例えば、実施形態において、拡張された検査間隔の中に検出されるパルスの部分は、対応する二次パルス検出ウィンドウの中の部分とともに考慮される。例えば、パルス検出ウィンドウが期待されるレーザ遅延に応じて移動させられた別の実施形態において、二次パルスは、実質的に二次パルス検出ウィンドウの中にあるパルスの部分に基づいて検出されることができる。

【0055】

二次パルスは、パルス検出閾値を上回るパルス全体に基づいて、パルスピーク値を決定するように処理される。実施形態において、パルスのピークを決定するために、トラックアンドホールド回路を採用することができる。例えば、パルスは、対応する二次パルス検出ウィンドウが作成されたときに決定されたピーク値等の、同じパルスのピークの任意の以前に決定された値から開始し、より高い値について追跡することができる。別の実施形態において、ＦＩＦＯバッファ等のメモリバッファは、二次パルスがパルス検出閾値を超える点において空値に初期化されることができ、パルスが横断させられるとき、バッファにおける現在の値よりも高い各連続値によって更新されることができる。さらに別の実施形態において、ＦＩＦＯバッファは、二次パルス検出ウィンドウ作成時に決定されたピーク値等の、同じパルスの任意の以前のピーク決定の値によって初期化されることができ、パルスが横断させられるとき、バッファにおける現在の値よりも高い各連続値よって更新されることができる。

【0056】

二次パルスはまた、パルス幅を決定するように処理されることもできる。二次パルス幅は、実施形態において、一次パルスの上昇稜線上の半ピーク点と下降稜線上の半ピーク点との間の距離（継続時間）として決定される。他の実施形態は、パルスの前後の稜線（所定のパルス検出閾値との交差点）の間の距離、またはパルスの上昇稜線および下降稜線上のいくつかのピーク割合点の間の距離を使用することができる。

【0057】

二次パルス面積は、ピーク値の所定の割合を上回るパルスを積分することによって決定される。したがって、パルス面積は、ピーク値の所定の割合に対応する点の間の曲線の下の面積によって画定される。別の実施形態において、パルス面積は、所定のパルス検出閾値との交差点の間のパルスを積分することによって決定されることができる。

【0058】

それぞれのパルス検出ウィンドウの外側に移動させることによって、二次パルスに対してパルスパラメータを計算することは、これらのパラメータの精度の大幅な向上をもたらす。例えば、従来、二次パルスのピークは、それぞれのパルス検出ウィンドウの中の最高値として決定され、したがって、実際のピークがウィンドウの外側（例えば、ウィンドウ拡張を含むウィンドウの外側）にあった場合に、パルスの実際のピークを返すことができない。本発明の実施形態において、二次パルスを追跡するように検出ウィンドウを越えて移動させることによって、パラメータは、パルスの大部分が検出ウィンドウの外側に位置するときでさえ、正確に決定されることができる。

【0059】

（パルス検出ウィンドウの外側のパルスを検出すること）
図７は、対応するパルス検出ウィンドウを越えて拡張する検査間隔を作成する方法７００の説明図である。実施形態において、方法７００は、上記で説明された調整するステップ６１６についての処理ステップを実行する。

【0060】

ステップ７０２において、対応する二次パルス検出ウィンドウの中の二次パルスの部分が検出される。二次パルス検出ウィンドウは、例えば、上記で説明されたようなステップ６１４において作成されることができる。実施形態において、二次パルス検出ウィンドウは、調査されている粒子に対する最初の検査間隔に対応して画定される。

【0061】

上述のように、レーザ遅延変動に起因して、調査中の粒子に対応するパルスは、二次パルス検出ウィンドウの前または後に到着するそれの部分を有することができる。ステップ７０２において、二次パルス検出ウィンドウの中にあるパルスの部分が決定される。

【0062】

ステップ７０４において、検査間隔が、対応する二次パルス検出ウィンドウの前および／または後の領域を含むように作成される。例えば、パルスがウィンドウの中心に対して早く到着したことを、二次パルス検出ウィンドウの中のパルスの部分が示す場合、二次パルス検出ウィンドウの前の時間間隔を含むように拡張することによって、検査ウィンドウが調整される。パルスがウィンドウの中心に対して遅く到着したことを、二次パルス検出ウィンドウの中のパルスの部分が示す場合、二次パルス検出ウィンドウの後の時間間隔を含むように拡張することによって検査ウィンドウが調整される。別の実施形態において、パルスが前後両方において二次パルス検出ウィンドウを超えたと決定された場合、二次パルス検出ウィンドウの前後両方の時間間隔を含むように拡張されることによって検査ウィンドウが調整される。調整された検査ウィンドウは、例えば、上記で説明されたステップ６１８−６２０のように、二次パルスのパラメータを決定するために使用される。

【0063】

（二次パルスのピークを決定すること）
図８は、本発明の一実施形態によれば、二次パルスのピーク値を決定する方法８００である。実施形態において、方法８００は、ステップ６２０において実行することができる。

【0064】

ステップ８０２において、パルスピーク値が検出ウィンドウの中の対応するパルスの最高値に初期化される。

【0065】

ステップ８０４において、パルス検出の閾値が決定される。実施形態において、閾値は、現在のピーク値の所定の割合として決定される。別の実施形態において、閾値は、一次パルスのピーク値の所定の割合として決定される。さらに別の実施形態において、閾値は、絶対値、またはノイズ閾値を上回る公称値となり得る。

【0066】

ステップ８０６において、検出ウィンドウの外側のパルスの部分を含むパルスが、実際のピーク値を決定するように処理される。例えば、実施形態において、パルス検出ウィンドウの外側にあるが検査間隔の中にあるパルスが、検出閾値を超える点から始まって処理される。実施形態において、パルスの処理中に、その点まで検出されたパルスの最高値が、メモリバッファに繰り返し記憶される。パルスの処理の完了時にバッファの中に残っている値は、二次パルスのピーク値と見なされる。

【0067】

実施形態において、ステップ８０２は、パルスの処理の第１の反復で実装され、ステップ８０４および８０６は、パルスの処理の第２の反復で実装される。例えば、粒子調査器からの入力パルス信号の処理の第１の反復において、パルス分析器は、一次および二次調査器のウィンドウを作成することができる。一次調査器のパラメータはまた、処理の第１の反復中に決定することもできる。また、各二次パルスについて、処理の第１の反復中に初期ピーク値を決定することができる（例えば、上記のステップ８０２のように）。パルス信号の再処理と呼ばれることもある、処理の第２の反復において、以前に決定された二次ウィンドウに対する二次パルスの決定、およびウィンドウの境界を越えて移動させることによる二次パルスの処理を実装することができる。

【0068】

実施形態において、パルスの再処理は、パルス分析器の中で受信され、デジタル化される順番で、パルスまたはそれの部分をＦＩＦＯに記憶することによって実装される。ＦＩＦＯの中のバッファは、処理の第１の反復において処理することができる。関連検出ウィンドウに対応するバッファの位置に基づいて、関連バッファがＦＩＦＯにおいて依然として利用可能である場合、検出ウィンドウに対応するバッファの前後のバッファは、処理の第２の反復において処理されることができる。

【0069】

（二次パルス検出ウィンドウを感知すること）
図９は、本発明の一実施形態による、検査間隔および／または二次パルス検出ウィンドウを作成するための方法９００を図示する。実施形態において、方法９００は、検査間隔および／または二次パルス検出ウィンドウを作成するために上記で説明されたステップ６１４の処理に含まれることができる。

【0070】

ステップ９０２において、一次パルス検出ウィンドウが発生した時間が決定される。実施形態において、時間は、ウィンドウが開始される時間として決定される。別の実施形態において、時間は、ウィンドウの中間点における時間として決定される。

【0071】

ステップ９０４において、一次パルス検出ウィンドウの継続時間が決定される。一次パルス検出ウィンドウの継続時間（ウィンドウの幅とも呼ばれる）は、一次パルスがパルス検出閾値以上にとどまる継続時間によって決定される。

【0072】

ステップ９０６において、一次調査器と対象二次調査器との間の距離が決定される。実施形態において、この距離は、構成情報に基づいて決定することができる。

【0073】

ステップ９０８において、粒子の速度が決定される。実施形態において、粒子の平均速度は、シース圧力設定またはノズル構成に基づいて決定される。実施形態において、粒子の速度は、一次パルスの幅に基づいて決定されることができる。別の実施形態において、粒子の速度は、それを通して細胞サンプルが調査領域に注入されるノズルの構成に基づいて決定されることができる。例えば、ノズルは、所定の流速で細胞の流れを注入するように構成されることができる。

【0074】

ステップ９１０において、二次ウィンドウの発生時間が決定される。実施形態において、二次ウィンドウの発生時間は、一次パルス検出ウィンドウの発生時間、一次調査器から二次調査器までの距離、および粒子の速度に基づいて計算される。実施形態において、発生時間は、ウィンドウの前の稜線が発生する時間として決定される。別の実施形態において、発生時間は、ウィンドウの中間点における時間である。発生時間は、一次パルスの発生時間が決定される方式と一致するように測定される。それぞれのウィンドウの中心に基づいて一次と二次パルス検出ウィンドウとの間の距離を測定することは、パルス検出閾値の変化によって導入される分散を排除する。例えば、パルスが閾値に達する点に基づいてウィンドウの前の稜線の場所が変化するので、距離がウィンドウの前の稜線から測定された場合、パルス検出閾値を変化させることは、一次パルス検出ウィンドウの発生時間を変化させる。

【0075】

ステップ９１２において、二次パルス検出ウィンドウの幅が構成される。実施形態において、二次パルス検出ウィンドウの幅は、一次パルス検出ウィンドウの幅にウィンドウ拡張を加えたものとして決定される。ウィンドウ拡張の継続時間は、事前設定されるか、または対応するレーザ遅延および細胞の流れに印加される摂動振幅等の因子に基づいて動的に決定されることができる。上記で説明されたように、二次パルス検出ウィンドウの幅を動的に決定するときに、それぞれのウィンドウの幅は、隣接するウィンドウとの衝突または重複を回避するように調整されることができる。

【0076】

（予測ウィンドウ調整）
図１０は、細胞の流れに導入された、摂動発生器１２４によって粒子の流れに印加される摂動信号等の摂動信号の位相が、それぞれの調査器における粒子の到着にどのように影響を与えるかについての説明図１０００である。示された実施例において、始動調査器が、第１の調査器（すなわち、ノズルに最も近い調査器）になるように構成された。グラフ１００２、１００４、１００６、および１００８はそれぞれ、始動調査器までの距離が増加するように位置する調査器２、４、５、および７についてのレーザ遅延分散の変化を示す。同様に、グラフ１０１０、１０１２、１０１４、および１０１６は、細胞の流れに印加される摂動信号の位相の関数として、それぞれ、調査器２、４、５、および７において見られるレーザ遅延分散の対応を示す。グラフは、一次調査器からの距離が増加させられるにつれて、レーザ遅延の分散、すなわち、到着時間の分散が増加することを図示する。グラフはまた、レーザ遅延、例えば、二次ウィンドウにおける粒子の到着時間が、摂動信号の位相に関係することも図示する。例えば、グラフ１０１０−１０１６は、摂動信号の事象位相の関数として、各二次ウィンドウにおけるレーザ遅延を表す波形を図示する。摂動信号は、正弦波の形状の波形となり得る。例えば、摂動波の振幅の変動は、正弦波となり得る。グラフ１０１０−１０１６は、摂動信号を細胞の流れに導入する摂動発生器において生成される正弦波に対応する正弦波を示す。グラフ１０１８は、静的に設定されたウィンドウ１０２０の中間点の前に到着した粒子１０２１、および後に到着した粒子１０２２を図示する。集団１０２１および１０２２は、それぞれ、グラフ１０１０−１０１６に示される正弦波の一番上および下におけるカラーゲート値の集約に対応する。したがって、二次調査器における静的に設定されたウィンドウに対する到着は、摂動信号、またはより具体的には摂動信号の位相の関数として見なされることができることが観察される。

【0077】

図１１は、本発明の一実施形態による、二次パルス検出ウィンドウを予測的に決定する方法１１００である。実施形態において、方法１１００は、検査間隔および／または対応する二次パルス検出ウィンドウを調整するように上記で説明される調整するステップ６１６において実行することができる。

【0078】

ステップ１１０２において、摂動信号の位相が、粒子に対して決定される。例えば、摂動信号の位相、例えば、それが正弦波の正の位相または負の位相の中にあるかどうかが決定される。これは、摂動波の位相を追跡し、それを第１の調査器における粒子に関係させることによって決定することができる。実施形態において、第１の調査器において見られる粒子は、所定の遅延を受ける摂動信号の位相に関係する。

【0079】

ステップ１１０４において、本発明の一実施例に従って、二次パルス検出ウィンドウが決定される。実施形態において、静的に設定または動的に決定された二次パルス検出ウィンドウが、粒子に対する摂動信号の位相に基づいて移動させられる。例えば、粒子が摂動信号を表す正弦波の正の部分に関係する場合、検出ウィンドウは、その現在の位置から前進させることができ、粒子が摂動信号を表す正弦波の負の部分に関係する場合、検出ウィンドウは、その現在の位置に対して遅延させることができる。さらに、実施形態において、検出ウィンドウのウィンドウ幅は、粒子に関係する位置における正弦波の振幅に基づいて調整することができる。例えば、ウィンドウは、より大きい振幅についてはより広く、より小さい振幅についてはより狭くすることができる。

【0080】

本発明のこれまでの説明は、図示および説明目的で提示されている。本発明を開示する正確な形態に網羅されるか、または限定されることを意図せず、他の修正および変化が上記の教示を考慮して可能であり得る。実施形態は、本発明の目的およびその実践的適用を最もよく説明し、それによって、当業者が意図する特定の使用に適するとして種々の実施形態および種々の修正に最もよく使用することを可能にするように、本発明を選択し、説明した。添付の請求項は、先行技術によって制限される範囲を除く、本発明の他のさらなる実施形態を含むように構成されることを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】