特許 5711887 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5711887

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年5月7日

(54)【発明の名称】短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150416BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150416BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】61

(21)【出願番号】特願2010-10739(P2010-10739)

(22)【出願日】2010年1月21日

(62)【分割の表示】特願2000-584113(P2000-584113)の分割

【原出願日】1999年11月24日

(65)【公開番号】特開2010-81944(P2010-81944A)

(43)【公開日】2010年4月15日

【審査請求日】2010年2月19日

【審判番号】不服2013-15097(P2013-15097/J1)

【審判請求日】2013年8月5日

(31)【優先権主張番号】09/199,542

(32)【優先日】1998年11月25日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593089149

【氏名又は名称】プロメガ コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100092093

【弁理士】

【氏名又は名称】辻居 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100082005

【弁理士】

【氏名又は名称】熊倉 禎男

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(72)【発明者】

【氏名】シャム ジェイムズ ダブリュー

(72)【発明者】

【氏名】スプレッチャー シンシア ジェイ

【合議体】

【審判長】 鈴木 恵理子

【審判官】 植原 克典

【審判官】 中島 庸子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第９７／３９１３８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-90

JSTPLUS

JMEDPLUS

JST7580

PUBMED

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１以上のヒトゲノムＤＮＡサンプルから、遺伝子座の一組に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、
（ａ）多重増幅反応で分析すべきヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１６個の遺伝子座の一組において遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、
（ｂ）前記混合物中の前記増幅された対立遺伝子を評価する工程であって、ヒトゲノムＤＮＡサンプルの、前記少なくとも１６個の遺伝子座の各々における対立遺伝子の存在を決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。

【請求項2】

前記多重増幅反応が、工程（ａ）で選択された１６個のプライマーの組における各遺伝子座をフランキングするプライマーの少なくとも１対を使用して行なわれる、請求項１記載の方法。

【請求項3】

１以上のヒトゲノムＤＮＡサンプルから、一組の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に特定する方法であって、
（ａ）多重増幅反応で、分析すべきヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１６個の遺伝子座の一組における遺伝子座を共増幅する工程であって、該遺伝子座の組は、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１を含み、反応生成物は、前記組の各共増幅された遺伝子座から共増幅された対立遺伝子の混合物である工程と、
（ｂ）該混合物中の増幅対立遺伝子を評価して、前記ヒトゲノムＤＮＡサンプルの少なくとも１６個の遺伝子座の各々に存在する対立遺伝子を決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。

【請求項4】

前記多重増幅反応は、工程（ａ）で選択された１６個のプライマーの組の各遺伝子座をフランキングする少なくとも１対のプライマーを使用して行なう、請求項３記載の方法。

【請求項5】

ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を同時に分析するキットであって、分析すべきゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記遺伝子座の組が、共増幅することができる少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座を含み、該プライマーは、１以上の容器にあり、前記ゲノムＤＮＡが、ヒトゲノムＤＮＡであり、共増幅できる少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座が、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含むことを特徴とするキット。

【請求項6】

ゲノムＤＮＡの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキットであって、各遺伝子座をフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、１以上の容器にあり、かつ少なくとも１６個の遺伝子座の一組を共増幅し、前記少なくとも１６個の遺伝子座の組が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９を含むことを特徴とするキット。

【請求項7】

ゲノムＤＮＡの遺伝子座の一組を同時に分析するためのキットであって、各遺伝子座をフランキングするオリゴヌクレオチドプライマーを含み、前記プライマーが、１以上の容器にあり、かつ少なくとも１６個の遺伝子座の一組を共増幅し、前記少なくとも１６個の遺伝子座の組が、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１を含むことを特徴とするキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
この出願は、１９９６年４月１５日に出願され現在米国特許第５８４３６６０号である、米国特許出願第０８／６３２５７５号の部分継続出願であり、この出願は、１９９８年１２月１日に発行され、１９９４年９月３０日に出願された米国特許出願第０８／３１６５４４号の部分継続である。これらの出願の全開示は、ここで参考として組み込む。
（連邦政府主催の研究開発に関する申告）
適用はない。

【0002】

本発明は、一般的に、ゲノム系におけるゲノムマーカーの検出に関する。本発明は、より詳細には、複数の（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）異なる多型遺伝子座の同時増幅に関し、１度の反応で、多重系（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍ）の中に含まれる各遺伝子座の対立遺伝子を決定する、ポリメラーゼ連鎖反応又は他の増幅システムを使用する。

【背景技術】

【0003】

ＤＮＡタイピングは、一般に、人間の子供の親であることを特定するのに使用され、またウマ、イヌ、他の動物及び農作物の系統を確認するのにも使用される。また、ＤＮＡタイピングは、一般に、人間の残留物の特定を要求する犯罪現場や他の現場で見つかった、血液、唾液、精液及び他の組織のソースを特定するのに使用される。また、ＤＮＡタイピングは、臨床的場面で使用され、骨髄移植の成功又は失敗及び特定の癌組織の存在を決定する。ＤＮＡタイピングは、一般に「マーカー」と呼ばれる、重要な特徴を持つゲノムＤＮＡの対立遺伝子の分析を含む。今日使用されている多くのタイピング方法は、集団の中で少なくとも２つの異なる形態を表すことが知られている１以上のＤＮＡマーカー領域の長さ及び/又は配列の違いを検出及び分析するように特別に設計されている。このような長さ及び/又は配列の変異は、「多型」と呼ばれる。このような変異が生ずるＤＮＡ領域（即ち、遺伝子座）は、「多型遺伝子座」と呼ばれる。本発明の方法と材料は、ＤＮＡの複数の遺伝子座の検出で使用するために設計され、ＤＮＡの複数の遺伝子座のいくつか又はすべては、多型遺伝子座である。

【0004】

長さ又は配列に関して十分な多型の遺伝子マーカーにおいて、親子鑑定や法医学的分析のために集められた組織サンプルの同定といった、同一性用途での使用が長く捜し求められていた。このようなマーカー及びマーカーを分析するための方法の発見と開発は、この数年に渡っていくつかの開発段階を経てきた。

【0005】

最初に特定されたＤＮＡ変異マーカーは、単一の塩基置換であり、即ち単一配列多型性であり、サザンハイブリダイゼーションアッセイによってしばしば検出された。制限酵素消化ＤＮＡを放射性プローブで分析するのに使用されるように設計されている、このようなマーカーの同定を記述する参考文献の例については、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．（１９７５）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８（３）：５０３−５０７；Ｓｃｈｕｍｍら（１９８８）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２：１４３−１５９；及びＷｙｍａｎ，Ａ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：６７５４−６７５８を参照されたい。

【0006】

次世代のマーカーは、サイズ変異体であり、即ち長さ多型（ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍであり、特に、「タンデム反復の変数」（ＶＮＴＲ）マーカー（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ．ら、（１９８７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１６１６−１６２２；及びＷｈｉｔｅらに発行された（１９９０）米国特許第４９６３６６３号明細書；Ｗｈｉｔｅらに発行された（１９９５）米国特許第４９６３６６３号の継続出願である米国特許５４１１８５９号明細書）、及び「ミニサテライト」マーカー（Ｊｅｆｆｒｅｙｓら（１９８５ａ）、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：６７−７３；Ｊｅｆｆｒｅｙｓら（１９８５ｂ）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７６−７９．、Ｊｅｆｆｒｅｙｓによる発明に対する米国特許第５１７５０８２号明細書）である。ＶＮＴＲ及びミニサテライトマーカーの両方とも、タンデム様式で繰り返されたほとんど同一の配列領域を含む。中心的な反復配列は、長さが１０〜７０塩基であり、「ミニサテライト」反復と呼ばれる短い中心的な反復配列と、ＶＮＴＲと呼ばれる長い反復とを持つ。人間集団の異なる個人には、異なる反復数が含まれる。ＶＮＴＲマーカーは、一般に、塩基置換多型性よりもはるかに高い多型であり、時々、単一の遺伝子座で４０以上までの対立遺伝子を示す。しかしながら、制限酵素消化の長たらしいプロセスと次のサザンハイブリダイゼーション分析は、いまなお、このようなマーカーの検出と分析が要求される。

【0007】

次の進歩は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．らによる米国特許第４６８３２０２号明細書）技術とＶＮＴＲ遺伝子座（Ｋａｓａｉ，Ｋ．ら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５（５）：１１９６−１２００）とを連結することを含む。サザントランスファーの必要なしで検出することができる、増幅され得るＶＮＴＲ遺伝子座が発見された。増幅生成物は、アガロース又はポリアクリルアミドゲルを通して分離され、増幅中の放射能混合によって、又は、銀又は臭化エチジウムの後染色によって検出される。しかしながら、ＰＣＲは、比較的小さいＤＮＡセグメントを確実に増幅するのに使用され、即ち長さ３０００塩基以下のＤＮＡセグメントを確実に増幅するだけである。Ｐｏｎｃｅ，ＭとＭｉｃｏｌ，Ｌ．（１９９２） ＮＡＲ ２０（３）：６２３；Ｄｅｃｏｒｔｅ Ｒ，ら（１９９０）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９（６）：４６１−４６９）を参照されたい。従って、ごくわずかにしか増幅され得るＶＮＴＲは開発されなかった。

【0008】

近年、遺伝子マーカーとして多型の短いタンデム反復（ＳＴＲ）の発見と発達は、連鎖地図、同定と病気の遺伝子の特徴づけ、及びＤＮＡタイピングの単純化と精度の発達における進歩を刺激した。特に、ジヌクレオチド反復を含む多型マーカー（Ｌｉｔｔ及びＬｕｔｙ（１９８９）Ａｍ Ｊ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ３（４）：５９９−６０５；Ｔａｕｔｚ，Ｄ（１９８９）ＮＡＲ １７：６４６３−６４７１；Ｗｅｂｅｒ及びＭａｙ（１９８９） Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ４４：３８８−３９６；ドイツ特許第ＤＥ ３８ ３４ ６３６ Ｃ２号明細書、発明者Ｔａｕｔｚ，Ｄ；Ｗｅｂｅｒ，Ｌ．により出願された米国特許第５５８２９７９号明細書）、３つ又は４つのヌクレオチドの反復単位を持つＳＴＲ（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ａ．，ら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ４９：７４６−７５６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｈ．Ａ．，ら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５５：１７５−１８９；Ｆｒｅｇｅａｕ，Ｃ．Ｊ．；及びＦｏｕｒｎｅｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９３） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５（１）：１００−１１９．；Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊ．Ｗ．ら（１９９４）ｉｎ Ｔｈｅ Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９３、ｐｐ．１７７−１８７（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９４）；及びＣａｓｋｅｙらによる米国特許第５３６４７５９号明細書；Ｔａｕｔｚ，Ｄによるドイツ特許第ＤＥ ３８ ３４ ６３６ Ｃ２号明細書）、及び５〜７塩基反復単位を持つＳＴＲ（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４７９１；Ｃｈｅｎら（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５（３）：６２１−５；Ｈａｒａｄａら（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５５：１７５−１８９；Ｃｏｍｉｎｇｓら（１９９５）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２９（２）：３９０−６；及びＵｔａｈ Ｍａｒｋｅｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ（１９９５），Ａｍ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．５７：６１９−６２８；及びＪｕｒｋａ及びＰｅｔｈｉｙａｇｏｄａ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４０：１２０−１２６）参照のこと）の発見と発達で、以前の方法の不完全なものの多くが克服された。ＳＴＲマーカーは、一般的に、ＶＮＴＲマーカーよりも短く、たいていのＶＮＴＲマーカーよりも増幅におけるよりよい基質になる。

【0009】

ＳＴＲ遺伝子座は、増幅され得るＶＮＴＲ遺伝子座と同様であり、このような各遺伝子座で増幅された対立遺伝子は、長さの変異に基づいて区別される。一般的に、実証的なＳＴＲ遺伝子座は、ＶＮＴＲ遺伝子座よりも、個々の遺伝子座で多型が少ない。従って、単一の増幅反応及び分離において複数のＳＴＲ系を増幅及び検出して、同時にいくつかの遺伝子座に対する情報を得ることが望ましい。いくつかの遺伝子座を含む系は、多重系と呼ばれ、１１個までの別個のＳＴＲ遺伝子座を含む多くのこのような系が記述された。例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：Ａｍｅｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｅｂ．９−１４、１９９８）、Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊａｍｅｓ Ｗ．ら、Ｐ．５３、Ｂ８８；Ｉｄ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｓａｎｄｒａ Ｄ．ら、ｐ．５３，Ｂ８９；Ｉｄ．，Ｌａｚａｒｕｋ，Ｋａｔｈｅｒｉｎｅら、ｐ．５１，Ｂ８３；Ｓｐａｒｋｅｓ，Ｒ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｌｅｇａｌ Ｍｅｄ （１９９６）１０９：１８６−１９４；ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ^TM ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９７），ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，ｉ−ｖｉｉｉ及び１−１ ｔｏ １−１０；ＡｍｐＦｌＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ Ｐｌｕｓ^TM ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ‘ｓ Ｍａｎｕａｌ（１９９７）、ｐｕｂ．ｂｙ ＰｅｒｋｉＮ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．，ｉ ｖｉｉｉ及び１−１ ｔｏ １−１０；ＡｍｐＦｌＳＴＲ ＣＯｆｉｌｅｒ^TM ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（１９９８）、ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐ．ｉ−ｉｉｉ及び１−１ ｔｏ １−１０；９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ ７−１０，１９９８）、ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔａｕｂ，Ｒｉｃｋ Ｗ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ １５；Ｉｄ．，Ｗｉｌｌａｒｄ，Ｊｅａｎｎｅ Ｍ．ら、Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ７３；及びＩｄ．，Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓｅａｎら、Ｓｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｏｒ ８：５０ａｍ−９：２０ａｍ，Ｔｈｕｒｓｄａｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ８，１９９８を参照されたい。

【0010】

ＳＴＲ遺伝子座を伴う増幅プロトコルは、一般的に長さ６０〜５００塩基対（ｂｐ）の小さな生成物を生成するように設計でき、各遺伝子座からの対立遺伝子は、しばしば、１００ｂｐ未満の領域の中に含まれる。これによって、ＰＣＲプライマーの慎重な設計によって、同一ゲル又はキャピラリー電気泳動でいくつかの系の同時電気泳動分析ができるので、個々の系からのすべての潜在的増幅生成物は、他の系の対立遺伝子座の範囲と重複しない。これらの系の設計は、幾分、単一ゲル又はキャピラリーの複数の遺伝子座の分離における困難性によって制限される。これは、異なるサイズのフラグメントの特別の圧縮があるために発生し、特に、ゲル又はキャピラリー中の長いフラグメントは、即ち、従来技術によるＤＮＡフラグメントの分離に対する手段が一般に使用される。

【0011】

アメリカ連邦捜査局（ＦＢＩ）は、結合ＤＮＡインデックスシステム（「ＣＯＤＩＳ」）、即ちＤＮＡタイピング情報のデータベースを確立して維持する。地方の、州の、国の法律の施行機関は、ＣＯＤＩＳシステムを使用して、犯罪場面で集められた犯罪科学で用いるＤＮＡ証拠をデータベース中のＤＮＡ情報と合わせる。ＣＯＤＩＳ及び他の国のデータベースシステムは、これらの機関が、凶暴な犯罪を解決するのに使用するための有効な道具であることが立証された。（例えば、Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ，ｉｎ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＤＮＡ Ｆｒｅｎｓｉｃｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ（Ｎｏｖ．１７−１８、１９９８）、ｐｐ．１−２１．；Ｎｉｅｚｇｏｄａ、Ｓｔｅｐｈｅｎ ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｅｉｇｈｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｉｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９７、ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９９８）、ｐｐ ４８−４９；Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｒａｃｈｅｌ Ｒ．Ｅ．ら、Ｉｄ．，ｐｐ．５６−６０；Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓ．Ｊ．ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ＤＮＡ １（３）：１２−１３；Ｗｅｒｒｅｔｔ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｐａｒｋｅｓ，Ｒ．ｉｎ Ｓｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔ．７−１０，１９９８）ｐｐ．５−６を参照されたい。）

【0012】

最近まで、特定のＶＮＴＲ遺伝子座の分析から得られた制限酵素断片長多型（「ＲＦＬＰ」）データのみが、データベースの中心的要素と考えられていた。ＦＢＩは、最近、ＣＯＤＩＳデータベース中に含まれるべきものとして１３個の多型ＳＴＲ遺伝子座を特定した。１３個のＣＯＤＩＳ ＳＴＲ遺伝子座は、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１である。（Ｂｕｄｏｗｌｅ，Ｂｒｕｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ｔａｍｙｒａ ｉｎ Ｓｐｅａｋｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：９ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｉｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｏｃｔ．７−１０，１９９８）ｐｐ．７−８を参照されたい。） ＶＮＴＲ及びＳＴＲマーカーデータの両方とも、一般に、ＣＯＤＩＳデータベースに保存されている。（例えば、Ｎｉｅｚｇｏｄａ，Ｓｔｅｐｈｅｎ ｉｎ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＤＮＡ Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ，ｓｕｐｒａを参照されたい。）本発明がなされるまで、単一の反応で共増幅され、その後分析できる遺伝子座の数は、制限されていた。詳細には、１３個以上のＳＴＲ遺伝子座、ましてＣＯＤＩＳデータベースでの使用のために特定された１３個の多型ＳＴＲ遺伝子座の多重増幅での使用のための材料及び方法は、開発されていなかった。

【0013】

本発明の材料及び方法は、様々なタイプのＤＮＡの特定の多型遺伝子座の多重体分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｎａｌｙｓｉｓ）での使用のために設計され、ＤＮＡには、異なるソースの変異からの一本鎖及び２本鎖ＤＮＡが含まれる。本発明は、現在の技術を越える有意な改良を示し、識別、精度及び連鎖解析におけるＤＮＡプロファイリングへの処理量、刑事裁判、親子鑑定、及び他の法廷の、医学的な及び遺伝的な特定用途の増加した能力を導く。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

従って、本発明の目的は、遺伝子座の組の同時増幅における方法及び材料を提供することであり、遺伝子座は、複数の異なる多型の短いタンデム反復（ＳＴＲ）遺伝子座を含み、単一の多重反応で、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動又は他の分離方法及び検出方法と組み合わせてＰＣＲ又は他の増幅反応システムを使用し、多重反応で増幅された各遺伝子座の対立遺伝子の相対的な長さを分析し、比較する。ここで開示された遺伝子座の組の多重体分析は、従来技術においてまだ記述されていない。また、ここで以下に開示されるプライマーの多くの配列は、従前に記述されたことはなく、これらのプライマーの記述のすべては、開示された遺伝子座の組の多重増幅において有用であることが分る。

【0015】

また、本発明の目的は、方法、キット及び詳細に示した遺伝子座を含む多重増幅に対して特異的なプライマーを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0016】

これら及び他の目的は、本発明によって取り組まれ、各多重体（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）の個々の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に分析し、決定するための方法及び材料に関する。一般に、本発明の方法は、（ａ）分析すべき少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡサンプルは、共増幅され得る、少なくとも１３個の遺伝子座を有する工程と、（ｂ）ＤＮＡサンプルの少なくとも１３個の遺伝子座を共増幅する工程と、（ｃ）使用される系の多型性を示す型で、増幅された材料を検出する工程とを含む。

【0017】

1つの態様において、本発明は、１以上のＤＮＡサンプルから一組の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に決定する方法であり、以下の工程を含む。
（ａ）分析すべき少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程
（ｂ）ＤＮＡサンプルの一組の対立遺伝子を選択する工程であって、共増幅できる、少なくとも１３個のタンデム反復遺伝子座を含む工程
（ｃ）多重増幅反応で組の中の遺伝子座を共増幅する工程であって、反応生成物が、組の中の共増幅された各遺伝子座から増幅された対立遺伝子の混合物である工程
（ｄ）混合物中の増幅された対立遺伝子を評価して、ＤＮＡサンプル中の、組の中の分析された各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する工程。
少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の少なくとも４個が、以下の遺伝子座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座であることが好ましい。
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１
本発明の別の態様において、方法の工程（ｂ）で選択された遺伝子座の組は、１３個のＣＯＤＩＳ ＳＴＲ 遺伝子座（即ち、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１）を含み、本発明の方法を使用して、遺伝子座自体又は追加の遺伝子座と共に、共増幅され、分析される。

【0018】

更なる特徴において、本発明は、ゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を同時に分析するためのキットであり、分析すべきゲノムＤＮＡの一組の遺伝子座を共増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、遺伝子座の組は、同一の多重反応で共増幅され得る少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子を含み、プライマーは、１以上の容器の中にある。更に好ましくは、キットは、ヒトゲノムＤＮＡの少なくとも１３個の遺伝子座の一組を共増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー対を含み、遺伝子座の組は、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む。

【0019】

更になる特徴において、本発明は、ヒトＤＮＡの特異的遺伝子座を増幅するためのプライマー配列とプライマー対である。ヒトＤＮＡの多重体分析に対する本発明のプライマーとプライマー対の使用は、ここで、以下に説明される。本発明のプライマーは、本発明の方法での使用に適合し、プライマーは、以下に示した、標識された形態で使用され、方法の評価工程を補助する。

【0020】

本発明の詳細に述べられるアプローチは、多重体の中に含まれる遺伝子座の分析における時間、仕事及び材料の節約を生む。本発明の方法により、分離チューブで又は小さい遺伝子座群で個々に各遺伝子座を増幅する代わりに、１３個以上、１６個以上もの遺伝子座を、単一の増幅反応を用いて１本のチューブで共増幅することができる。

【0021】

本発明は、犯罪科学分析、親子決定、骨髄移植モニタリング、連鎖地図及び遺伝病と癌の検出の分野において特有の用途を有する。本発明の１３個の方法によって、あるＤＮＡが同一人の異なるサンプルから調製されたＤＮＡとマッチすることができる確実性を有意に増加する。非常に少ないＤＮＡ量を含むサンプル間で正確にマッチする、又は区別する必要性は、特に、犯罪科学の用途で急がれ、ここでは、多くの有罪（及び無罪）は、ＤＮＡタイピング分析で変わる。

【0022】

科学者、特に犯罪科学者は、ＤＮＡの２つのサンプル間のマッチングが、統計的に有意であることを確実にするために、ＤＮＡの多重多型遺伝子座を分析する必要を長く理解していた。（Ｐｒｅｓｌｅｙ，Ｌ．Ａ．ら、ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９２，ｐｐ．２４５−２６９（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９３）；Ｂｅｖｅｒ， Ｒ．Ａ．，ら、ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９１、ｐｐ．１０３−１２８．（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９２）を参照されたい。）しかしながら、本発明がなされるまで、単一の反応で１３個以上のＳＴＲ遺伝子座を同時に分析できなかった。このような多重性能の重要性を理解することは、ＤＮＡタイピング分析の後のいくつかの数学的処理を理解するのを助ける。

【0023】

説明のため、各ＳＴＲ遺伝子座に、１０のうち１の頻度で遺伝子型（即ち、遺伝子座２個のパターン）を有すると想定する。換言すれば、２つの無作為に選択された個体が、１つのＳＴＲについてマッチする型を有する機会は、１／１０であると想定する。しかしながら、２つの異なるＳＴＲ遺伝子座を分析した場合、両方の系との無作為マッチングする機会は、１／１００である。３つのＳＴＲ遺伝子座を分析する場合、３つの系の各々の無作為マッチングする機会は、１／１０００等である。従って、分析されるＳＴＲ遺伝子座の数を増加すると、一般の個体群の中で無作為マッチングの見込みが減ることは簡単に分り、その機会を増加することによって、犯罪場面の証拠と個人の型を比較することで、犯罪現場での容疑者の存在を正確に特定することができる。同様の理由は、本発明の方法も、父系において被疑父親を正確に特定、骨髄組織の正しい適合、連鎖地図研究の有意な結果の展開、及び遺伝病と癌の検出等の可能性を見込みを増加させることを結論付けるのに使用できる。

【0024】

本発明の更なる目的、特徴及び利益は、本発明の実施における以下のベストモード及び図面から明らかである。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】実施例１でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ 遺伝子分析装置で検出された、ヒトゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１の同時増幅の生成物の３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図1B】増幅反応においてゲノムＤＮＡなしで、図１Ａと同じ方法で扱ったコントロールサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図2A】実施例２でＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ 遺伝子分析装置で検出された、ヒトゲノムＤＮＡのサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物の３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図2B】増幅反応においてゲノムＤＮＡ基質なしで、図２Ａと同じ方法で扱ったコントロールサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図3A】実施例３でＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡシークエンサーで検出されたヒトゲノムＤＮＡサンプルの遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物の３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図3B】増幅反応においてゲノムＤＮＡ基質なしで、図３Ａと同じ方法で扱ったコントロールサンプルの３色蛍光検出の出力のプロットである。

【図4A】実施例４で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントスキャナーのフルオレセインチャンネル（図４Ａ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【図4B】実施例４で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル（図４Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【図5A】実施例５で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントスキャナーのフルオレセインチャンネル（図５Ａ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【図5B】実施例５で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル（図５Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【図6A】実施例６で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ フルオレセントスキャナーのフルオレセインチャンネル（図６Ａ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｃ２２１、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【図6B】実施例６で記述された、日立ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル（図６Ｂ）を用いて検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｃ２２１、Ｓ１５９及びアメロゲニンの同時増幅の生成物のフルオレセント検出の結果のレーザープリント像である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

Ａ．定義
以下の定義は、以下の用語の範囲及び詳細の、明確な矛盾の無い理解を提供することにおいて補助するものであり、本発明を記述し、定義するのに使用される。
「対立遺伝子ラダー（ａｌｌｅｌｉｃ ｌａｄｄｅｒ）」；遺伝子座から増幅された対立遺伝子を含むスタンダードサイズマーカー。
「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」；ＤＮＡセグメントに関連する遺伝的変異であり、即ち、同じ遺伝子座を占有するＤＮＡ配列の２つ以上の別形態の１つ。
「生化学的命名法（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）」；標準生化学的命名法は、ここで使用され、ヌクレオチドの塩基は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）と呼ばれる。対応するヌクレオチドは、例えば、デオキシグアノシン−５’−トリフォスフェート（ｄＧＴＰ）である。

【0027】

「ＤＮＡ多型（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」；ＤＮＡ配列の２以上の異なるヌクレオチド配列が、同じ雑種群の中に共存する状態。
「座（ｌｏｃｕｓ）」又は「遺伝子座（ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ）」；染色体上の特異的な場所。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同じ位置に位置する。
「遺伝子座特異的プライマー（ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）」；少なくとも遺伝子座の１つの対立遺伝子に対して、示された遺伝子座又はその相補鎖の一部で特異的にハイブリダイズするプライマーで、かつ、増幅法を用いた状態の下で、他のＤＮＡ配列で有効にハイブリダイズしない。
「ペンタヌクレオチドタンデム反復（ｐｅｎｔａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）」；下記に定義されたＳＴＲ多型のサブクラス。別に詳述されていなければ、「ペンタヌクレオチドタンデム反復」の用語は、反復単位が５塩基配列である完全ＳＴＲ、及び少なくとも１つの反復単位が、５塩基反復である不完全ＳＴＲを含む。

【0028】

「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又は「ＰＣＲ」；変性、プライマーでのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼでの伸長のサイクルが、約１０⁶回以上目的のＤＮＡ配列のコピーの数を増幅するのに使用される技術。核酸増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応プロセスは、米国特許第４６８３１９５号及び第４６８３２０２号明細書によってカバーされており、プロセスの記述に対して、ここで参考として組み込む。

【0029】

「多型の短いタンデム反復遺伝子座（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｌｏｃｉ）」；下記に定義された、ＳＴＲ遺伝子座で、ゲノムＤＮＡの特別領域の繰り返し配列エレメントの数（及び配列の最終的な長さ）が、対立遺伝子から対立遺伝子、及び個体から個体に変異する。
「多型情報量（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ）」又は「ＰＩＣ」；遺伝子座に存在する多型の量の測定（Ｂｏｓｔｅｉｎら、１９８０）。ＰＩＣは、多型のより大きな程度を示すより高い値で、０〜１．０の範囲を評価する。この測定は、一般に、測定に通常使用される他のものよりも小さい値を表示し、即ち、
異型接合性；高い有益な（約７０％を超える異型接合性）マーカーに対して、異型接合性とＰＩＣとの違いは僅かである。

【0030】

「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」；プライマーの３’末端が、ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用する重合部位として作用するといった方法での、遺伝子座のＤＮＡ鎖でハイブリダイズする１本鎖オリゴヌクレオチド又はＤＮＡフラグメント。
「プライマー対（ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ）」；２つのプライマーを含み、プライマー１は、増幅すべきＤＮＡ配列の一方の端の１本鎖にハイブリダイズし、プライマー２は、増幅すべきＤＮＡ配列の相補鎖上のもう一方の端でハイブリダイズする。
「プライマー部位（ｐｒｉｍｅｒ ｓｉｔｅ）」；プライマーがハイブリダイズする目的ＤＮＡの領域。

【0031】

「短いタンデム反復遺伝子座（ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ｌｏｃｉ）」又は「ＳＴＲ遺伝子座（ＳＴＲ ｌｏｃｉ）」；長さが３〜７塩基対の短い、繰り返し配列エレメントを含むゲノムＤＮＡ領域。また、ＳＴＲという用語はゲノムＤＮＡの領域を含み、単一の３〜７塩基配列よりもタンデム又は介在塩基を伴って繰り返される。ＳＴＲで少なくとも１度繰り返された各配列は、ここで、「反復単位」と呼ばれる。

【0032】

本発明の材料と方法を使用して分析されたＳＴＲ遺伝子座の配列は、完全（ｐｅｒｆｅｃｔ）又は不完全（ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ）の、２つの一般的なカテゴリーに分けられる。「完全」ＳＴＲという用語は、ここで使用されるときは、少なくとも２度のタンデムで、繰り返される単一の３〜７塩基反復単位、例えば（ＡＡＡＡＴ）₂を含む２本鎖ＤＮＡの領域を意味する。「不完全」ＳＴＲという用語は、ここで使用されるときは、完全な反復単位の少なくとも２つのタンデム反復と、不完全な反復単位の少なくとも１つの反復を含むＤＮＡの領域をいい、ここで、不完全反復単位は、完全反復単位の配列における、１、２、３、又は４つの塩基の挿入、欠失、又は置換、例えば、（ＡＡＡＡＴ）₁₂（ＡＡＡＡＡＴ）₅ＡＡＴ（ＡＡＡＴＴ）₄を生じるＤＮＡ配列を含む。不完全ＳＴＲ配列毎には少なくとも１つの完全ＳＴＲ配列が含まれる。詳細には、各ＳＴＲ配列は、完全又は不完全のいかんにかかわらず、タンデムで少なくとも２度現れる少なくとも１つの反復単位配列、即ち以下の式（Ｉ）で表すことのできる反復単位配列を含む。

【0033】

（Ａ_wＧ_xＴ_yＣ_z）_n （Ｉ）
ここで、Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣは、どんな順でも存在するヌクレオチドを示し、ｗ、ｘ、ｙ及びｚは、配列の各ヌクレオチドの数を示し、０〜７の範囲で変化し、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３〜７の範囲であり、ｎは、タンデムで繰り返される配列回数の数を示し、少なくとも２である。

【0034】

Ｂ．多重反応成分の選択
本発明の方法は、複数の共増幅される遺伝子座から増幅された対立遺伝子を生ずるのに適切な、遺伝子座の組、プライマー及び増幅プロトコルを選択し、好ましくは共増幅される遺伝子座は、サイズで重複せず、より好ましくは、共増幅される遺伝子座は、サイズが重複する異なる遺伝子座の対立遺伝子間を識別することを可能にする方法で、ラベルされる。加えて、この方法は、単一の増幅プロトコルでの使用に融和性のある、短いタンデム反復遺伝子座を選択することを企図する。ここで説明される遺伝子座の特定の組合せは、この用途において唯一のものである。遺伝子座の組合せは、前述の２つの理由のどちらかによって、又はこれと組合せて、１以上の遺伝子座が、十分な生成物収量を生成せず又は真の対立遺伝子を表現しないフラグメントがこの反応で生成しない理由によって、却下されるかもしれない。

【0035】

ここで開示されたものの他に成功する組合せは、遺伝子座の組合せの試行錯誤、プライマー対の配列の選択、含まれるすべての遺伝子座が増幅できるような平衡を特定するプライマー濃度の調整によって、生じることができる。本発明の方法及び材料が一旦開示されれば、本発明の方法及びキットに使用する遺伝子座、プライマー対及び増幅技術の様々な方法が当業者に対して示唆されていると考えられる。すべてのこのような方法は、添付したクレームの範囲内にあることが企図される。

【0036】

本発明の方法の実施で特に重要なのは、多重増幅反応工程で共増幅される個々の遺伝子座から調製される、共増幅された対立遺伝子座のサイズ範囲である。現在技術によって分析を容易にするためには、５００塩基よりも小さいフラグメントの増幅によって検出できるシステムが、最も好ましい。

【0037】

本発明の方法の実施は、少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座を含む一組の遺伝子座の選択で始まり、遺伝子座は、単一の多重増幅反応で共増幅される。本発明の方法の多重増幅反応で遺伝子座を増幅するのに使用される遺伝子座とオリゴヌクレオチドプライマーとの選択は、これ以後に記述され、以下の実施例で説明される。

【0038】

Ｃ．３つより多い遺伝子座を使用して多重体を開発するための、３つの遺伝子座の多重体の使用
いずれの異なる技術も、本発明に使用する一組の遺伝子座を選択するのに使用することができる。この分析方法で使用する遺伝子座の有用な組を開発するための好ましい技術の１つが以下に記述される。３つのＳＴＲ遺伝子座を含む多重体が一旦開発されれば、３つより多い遺伝子座を含む多重体を作る核として使用できる。従って、３つより多い遺伝子座の新しい組合せは、始めの３つの遺伝子座を含んで作られる。例えば、遺伝子座Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８を含む核となる多重体を使って、以下の誘導多重体を生成した。

【0039】

Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ１５Ｓ８１８
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８
Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１

【0040】

Ｓ１５９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８
Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１
Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｇ４７５、Ｓ１５９及びアメロゲニン

【0041】

核となる遺伝子座の組は、本発明の方法を使用する多重体分析における、他の適切なＳＴＲ遺伝子座の組の誘導体を生成するのに使用されることを企図する。
本発明の方法を使用して分析される遺伝子座を選択するために使用されるどんな方法にもかかわらず、多重体分析のために選択された遺伝子座のすべては、以下の特徴を共有する。（１）遺伝子座は、評価できるだけの十分な増幅生成物を調製する。（２）遺伝子座は、多重増幅工程中の増幅された対立遺伝子座への塩基の付加（又は塩基の付加なし）による人工産物でさえ、ほとんど生成しない。（３）遺伝子座は、ポリメラーゼによる増幅反応の未熟終結による人工産物でさえ、ほとんど生成しない。（４）遺伝子座は、供給された真の増幅された対立遺伝子の下流の継続的な１塩基欠失から、より小さい分子量の「引きずった（ｔｒａｉｌｉｎｇ）」バンドをほとんど又はまったく生成しない。例えば、Ｓｃｈｕｍｍら、Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ １９９３、ｐｐ．１７７−１８７（ｐｕｂ．ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，１９９４）を参照されたい。

【0042】

上述した、少なくとも３つの遺伝子座の組を特定するのに使用される同じ技術は、本発明の分析方法の好ましい態様によれば、ヒトゲノムＤＮＡの１３個以上の遺伝子座の選択又は多重体分析に適用できる。上述の特定された遺伝子座のどんな組でも、本発明に従った多重体分析に適合し、提供された遺伝子座の組は、少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座を含む。より好ましくは、本発明に従って分析された少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座の少なくとも４つは、以下の遺伝子座及びこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択される。
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及びＨＵＭｖＷＦＡ３１
更により好ましくは、本発明に従って分析された遺伝子座の組は、１３個のＣＯＤＩＳ遺伝子座のすべて、即ち、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１８Ｓ５１、Ｄ２１Ｓ１１、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＴＰＯＸ、及びＨＵＭｖＷＦＡ３１を含む。

【0043】

好ましくは、本発明の多重反応の共増幅のために選択された遺伝子座の少なくとも１つは、長さが５〜７塩基又は塩基対の反復単位を持つＳＴＲ遺伝子座であり、より好ましくは、ペンタヌクレオチド反復を持つＳＴＲ遺伝子座である。米国特許出願第０９／０１８５８４号明細書で説明されているので、ここに参考として組み込み、このような中間の長さの反復を持つ遺伝子座は、人工産物について最小の発生率で増幅され、例えば、反復のずれによる。ペンタヌクレオチド反復を持つ３つのこのような遺伝子座、Ｇ４７５、Ｃ２２１及びＳ１５９は、直ちに上記で特定された遺伝子座の組に含まれる。「Ｇ４７５」、「Ｃ２２１」及び「Ｓ１５９」の用語は、ここで使われ、特定されたペンタヌクレオチド反復遺伝子に割り当てられた名前をいい、上に参考として組み込まれた、米国特許出願第０９／０１８５８４号明細書に記述される。それぞれの名前は、特定された各ペンタヌクレオチド遺伝子座からのクローンに一致する。Ｇ４７５クローンの配列は、配列ＩＤ番号３４として上記米国明細書に記述され、配列ＩＤ番号１０８として本明細書で特定される。Ｃ２２１クローンの配列は、配列ＩＤ番号２として上記米国明細書に記述され、配列ＩＤ番号１０９として本明細書で特定される。
Ｓ１５９クローンの配列は、配列ＩＤ番号２６として上記米国明細書で記述され、配列番号１１０として本明細書で特定される。また、Ｇ４７５、Ｃ２２１及びＳ１５９の増幅に使用する特定された個々のプライマーとプライマー対は、本発明に従って共増幅され分析される少なくとも１３個の遺伝子座の組の中の同じ遺伝子座を増幅するのに使用される。

【0044】

更に好ましくは、本発明に従って共増幅と分析のために選択された遺伝子座の組は、少なくとも１３個のＳＴＲ遺伝子座に加えて少なくとも１つの遺伝子座を含む。好ましくは、この追加の遺伝子座は、配列多型を含み、又は１個体のＤＮＡを、個体群の他の個体のＤＮＡから分離する、別の特徴を含む。より好ましくは、追加の遺伝子座は、分析されるＤＮＡサンプルのソースの性を同定する遺伝子座である。ＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡの場合、アメロゲニン遺伝子座といった性同定遺伝子座が、本発明の方法に従って共増幅及び分析のために選択されることが好ましい。アメロゲニン遺伝子座は、ＨＵＭＡＭＥＬＹ（男性のＤＮＡに含まれるＹ染色体上の遺伝子座を同定するのに使用される場合）、又はＨＵＭＡＭＥＬＸ（男性又は女性のＤＮＡのＸ染色体上の遺伝子座を同定するのに使用される場合）としてＧｅｎＢａｎｋによって同定される。アメロゲニン遺伝子座は、少なくとも１３個の短いタンデム反復遺伝子座の組と同じ多重体増幅反応で共増幅される場合、多重体増幅反応でこの特定の遺伝子座を増幅するのに使用される少なくとも１つのプライマーの配列は、配列ＩＤ番号８６、１０５及び８７及びこれらの任意の組合せに係る配列を有することが好ましい。

【0045】

Ｄ．プライマーの選択
単一の多重反応での共増幅のための一組の遺伝子座が一旦特定されると、その組で共増幅する各遺伝子座に適合できるプライマーを決定することができる。多重反応で使用されるプライマーの配列の選択に注意すべきである。プライマーの不適切な選択は、増幅の不足、複数の部位での増幅、プライマーのダイマー形成、異なる遺伝子座のプライマー配列の望ましくない相互作用、別の遺伝子座の対立遺伝子と重複するある遺伝子座の対立遺伝子の生成、又は多重体に不適合な異なる遺伝子座に対する増幅の条件又はプロトコルの必要性といった、いくつかの望ましくない効果を生む。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマー又は本発明のキットに含まれるプライマーは、以下の選択プロセスに従って選択される。

【0046】

好ましくは、プライマーは、本発明の多重系での使用のために開発及び選択され、選択するプライマー配列の反復プロセスを使用すること、選択された遺伝子座の共増幅のプライマーを混合すること、遺伝子座を共増幅すること、次に共増幅された生成物を分離し検出することによって開発され選択される。当初、このプロセスは、しばしば、不均衡な型（即ち、他の遺伝子座の生成物収量よりもいくつかの遺伝子座の生成物収量が高い）で増幅された対立遺伝子を生じ、また、対立遺伝子自体を表現しない増幅生成物を生成する。これらの余分なフラグメントは、上述した原因のかなり多くのものから生ずる。

【0047】

多重系からこのような余分なフラグメントを除くために、組全体の個々のプライマーは、同じ又は他の遺伝子座のプライマーと一緒に使用して、余分なフラグメントの増幅に寄与するプライマーを特定する。１つ以上のフラグメントを生成する２つのプライマーが一旦特定されると、１対のみ又は多重系（又は多重系のサブセット）のどちらにおいても、一方又は両方の寄与物は、変更され再試験される。このプロセスは、余分なフラグメントのない又は多重系の余分なフラグメントの許容できるレベルの増幅された対立遺伝子座の生成物収量の評価まで繰り返される。

【0048】

時折、余分なフラグメントは、プライマー対の反対のプライマーを標識することによって除かれる。この変化は、検出工程での反対のプライマーの生成物を示す。この新たな標識されたプライマーは、真の対立遺伝子を生成する、先にラベルされたプライマーよりもさらに高い忠実度で真の対立遺伝子を増幅し、全増幅生成物のほとんどの割合を占める。

【0049】

プライマー濃度の決定は、最終のプライマー配列の選択前又は選択後のどちらかで行うが、好ましくは、その選択後に行う。一般的に、特定の遺伝子座に対するプライマー濃度の増加は、その遺伝子座に対して生じる生成物の量を増加する。しかしながら、これは、相互に反復するプロセスであり、１つの遺伝子座の収量を増加することによって、１つ以上の他の遺伝子座の収量が減少するからである。その上、プライマーは、直ちに他の遺伝子座の収量と相互に作用する。プライマー濃度の直線的な増加は、対応する遺伝子座における生成物収量の直線的増加を必ずしも生じない。

【0050】

また、遺伝子座と遺伝子座の平衡は、増幅プロトコルの多くのパラメータによって影響され、例えば使用された鋳型の量、増幅サイクルの数、温度サイクルプロトコルのアニーリング温度及びサイクルプロセスの終りでの余分な伸張工程の包含と排除といったパラメータに影響される。すべての対立遺伝子座及び遺伝子座に渡る平衡でさえ、一般的に、達成されない。

【0051】

また、多重系の開発のプロセスは、上述とは別の意味で、相互に反復するプロセスであってもよい。即ち、まず、少数の遺伝子座における多重系を開発することが可能であり、即ちこの系は、増幅の余分なフラグメントを逃れるか又はほとんど逃れる。この系のプライマーは、１つ以上の追加の遺伝子座のプライマーと結合してもよい。この拡張されたプライマーの組合せは、増幅の余分なフラグメントを生成するかも知れないし又は生成しないかもしれない。順番に、新しいプライマーは、導入されて評価されてもよい。

【0052】

上述の１つ以上の相互に反復する選択プロセスは、完全なプライマーの組が特定されるまで繰り返され、完全なプライマーの組は、上述したように、共増幅のために選択された少なくとも１３個の遺伝子座を共増幅するのに使用される。多くの異なるプライマーの組を、特定の遺伝子座の組を増幅するのに開発できることがわかる。

【0053】

本発明の方法で使用されるプライマーの合成は、当業者に公知のオリゴヌクレオチド合成の標準的な手順を用いて実施される。好ましくは、各遺伝子座に対する少なくとも１つのプライマーは、以下のセクションＦで述べるように、色素ラベルと共有結合される。

【0054】

以下の表１は、表中に挙げられた対応する多型ＳＴＲ遺伝子座の増幅に使用するのに適切であると決定されたプライマーの配列のリストを提供する。好ましくは、表１に挙げられた少なくとも１つのプライマーは、上述の、共増幅及び分析のために選択された少なくとも１つの遺伝子座を増幅するのに使用される。他のプライマーによって、プライマーが以下に挙げられた遺伝子座の同時増幅に適切であることを特定できることがわかる。

【表1】

【表2】

【0055】

Ｅ．ＤＮＡサンプルの調製
ゲノムＤＮＡサンプルは、本発明の方法に使用するために調製され、ＤＮＡの増幅に適合性のあるＤＮＡ調製方法を使用する。このような多くの方法は、当業者に公知である。この例として、フェノール抽出によるＤＮＡ精製（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．，ｐｐ．９．１４−９．１９）、及び塩析による部分的精製（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６:１２１５）又はチレックス（ｃｈｅｌｅｘ）（Ｗａｌｓｈら、（１９９１） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０：５０６−５１３，Ｃｏｍｅｙ，ら（１９９４）Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．３９：１２５４）及び未処理血液を使用する未精製材料の遊離（Ｂｕｒｃｋｈａｒｄｔ，Ｊ（１９９４） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ３：２３９−２４３，ＭｃＣａｂｅ，Ｅｄｗａｒｄ Ｒ．Ｂ．，（１９９１） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：９９−１０６，Ｍｏｒｄｖａｇ，Ｂｙｏｒｎ−Ｙｎｇｖａｒ（１９９２） Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２：４ ｐｐ．４９０−４９２）によるＤＮＡ精製が挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

本発明の方法を使用して分析された少なくとも１つのＤＮＡサンプルがヒトゲノムＤＮＡである場合、そのＤＮＡは、好ましくは、血液、精液、膣細胞、毛、唾液、尿、骨、口内サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水、絨毛膜絨毛、及び上記に挙げた組織の混合物又はこれらの任意の組合せに係る組合せから選択された組織から調製される。

【0057】

任意に、ＤＮＡ濃度は、本発明の方法を用いる前に測定され、当業者に公知のＤＮＡ定量の標準的な方法を使用する。このような場合、好ましくは、ＤＮＡ濃度は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９），ｓｕｐｒａ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｅ．５によって記述された分光光度計測定によって決定するか、又は例えばＢｒｕｎｋ Ｃ．Ｆ．，ら（１９７９），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ９２：４９７−５００によって記述された測定技術を使用して蛍光定量的に決定される。より好ましくは、ＤＮＡ濃度は、ヒト特異的プローブでＤＮＡスタンダードのハイブリダイゼーションの量を比較することによって測定され、例えばＷａｙｅ，Ｊ．Ｓ．ら（１９９１）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （ＤＮＡ） ｉｎ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ：ｃａｓｅｗｏｒｋ ｅｘａｍｐｌｅｓ”，Ｊ．Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ．，３６：１１９８−１２０３に記述されている。
増幅反応における非常に多量の鋳型ＤＮＡの使用は、真の対立遺伝子を表さない過剰なバンドとして示される人工産物を生成する。

【0058】

Ｆ． ＤＮＡの増幅
ゲノムＤＮＡのサンプが一旦調製されると、目的にされた遺伝子座は、本発明の多重増幅工程で共増幅される。多くの異なる増幅方法の一つは、遺伝子座を増幅するのに使用され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０−１３５４）、増幅の基礎を形成する転写（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．及びＫｗｏｈ，Ｔ．Ｊ．（１９９０），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９９０）及び鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｔ．，ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、ＤＮＡサンプルは、組の各遺伝子座に特異的なプライマー対を使用してＰＣＲ増幅にかけられる。参考に、以下の実施例で使用されるプライマー配列の詳細において、本明細書の最後に配列一覧表にし、プライマー配列のいくつかは、本発明の別の態様である。

【0059】

好ましくは、各遺伝子座における少なくとも１つのプライマーは、色素ラベルと共有結合し、蛍光色素ラベルが更に好ましい。プライマー及びプライマーに結合された色素は、好ましくは、多重増幅反応のために選択され、例えば、好ましくは、対立遺伝子がゲルまたはキャピラリー電気泳動で分離される場合、１色で標識された各遺伝子座のプライマーを使用して増幅された対立遺伝子は、同じ色で標識されたプライマーを使用して共増幅された組の他の遺伝子座の対立遺伝子と重複しないことが好ましい。

【0060】

本発明の方法の特にこのましい態様において、多重反応で共増幅された各遺伝子座のための少なくとも１つのプライマーは、反応で使用されるよりも先に、蛍光ラベルで標識される。本発明で使用するプライマーへの結合に適切な蛍光ラベルは、市販で入手できる。例えば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓのフルオレセインラベル及びカルボキシテトラメチルローダミンラベル及びこれらの化学的誘導体を参照されたい。最も好ましくは、少なくとも３つの異なるラベルが、多重増幅反応に使用される異なるプライマーを標識するのに使用される。サイズマーカーが多重反応を評価するために含まれる場合、サイズマーカーを調製するのに使用されるプライマーは、反応で重要な遺伝子座を増幅するのに使用されるプライマーと異なるラベルで標識されることが好ましい。

【0061】

本発明の方法で使用する最も好ましい遺伝子座の各組合せにおける、最も好ましい増幅プロトコルの詳細は、以下の実施例で与えられる。また、各多重体に関する特別の手順の付加的な詳細については、実施例を参照されたい。実施例で使用される遺伝子座特異的プライマーの配列は、多くのヌクレオチドを含み、ヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションで使用される条件下で、増幅され且つ他の遺伝子座の対立遺伝子の増幅の本質的にない遺伝子座の対立遺伝子とハイブリダイズするのに十分である。Ｓｉｍｏｎｓの米国特許第５１９２６５９号明細書が参考になり、明細書の教示を、遺伝子座特異的プライマーのより詳細な開示における参考として、ここで組み込む。

【0062】

Ｇ． ＤＮＡフラグメントの分離及び検出
一組の増幅された対立遺伝子が本発明の多重増幅工程から一旦調製されると、増幅された対立遺伝子が評価される。この方法の評価工程は、多くの異なる方法によって行われるが、最も好ましい方法は、以下に記述される。

【0063】

好ましくは、電気泳動は、多重増幅反応の生成物を分離するのに使用され、更に好ましくは、キャピラリー電気泳動（例えば、Ｂｕｅｌ，Ｅｒｉｃら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；４３：（１）ｐｐ．１６４−１７０を参照されたい）又は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１３．４５−１３．５７を参照されたい）である。本発明の方法の評価工程での使用に適切なゲル調製及び電気泳動手順と条件は、以下の実施例で説明される。変性ポリアクリルアミドゲル及びキャピラリー電気泳動でのＤＮＡフラグメントの分離は、第１にフラグメントサイズに基づいて起こる。

【0064】

増幅された遺伝子座が一旦分離されると、次に、ゲル又はキャピラリー中の対立遺伝子及び他のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡサイズマーカー又は対立遺伝子ラダー）は、視覚化され、分析される。ゲル中のＤＮＡの視覚化は、多くの従来技術のいずれか一つを使用して行われ、例えば、銀染色や、ラジオアイソトープ、蛍光剤、化学発光剤及び検出可能な基質と組み合わせた酵素といったレポーターを含む。しかしながら、１３個又はそれ以上の遺伝子座を含む多重体の検出に好ましい方法は、蛍光であり（例えば、上記Ｓｃｈｕｍｍ，Ｊ．Ｗ．ら Ｐｒｏｃｃｅｄｉｎｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｉｇｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（ｐｕｂ．１９９８ ｂｙ Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ｐｐ．７８−８４；Ｂｕｅｌ，Ｅｒｉｃら（１９９８），を参照されたい）、多重反応の各遺伝子座のプライマーは、蛍光検出器を使用する標識生成物の検出によって追跡される。遺伝子座を視覚化する従来技術の方法を記述する、上記に引用された参考文献を、ここに参考として組み込む。

【0065】

好ましくは、ＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子は、ＤＮＡマーカーや遺伝子座特異的対立遺伝子ラダーといったサイズスタンダードとの比較によって決定され、サンプル中の各遺伝子座に存在する対立遺伝子を決定する。２つ以上の多重ＳＴＲ遺伝子座を含む多重増幅の評価における最も好ましいサイズマーカーは、評価される各遺伝子座の対立遺伝子ラダーの組合せを含む。例えば、Ｐｕｅｒｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈら（１９９３）Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．５３：９５３−９５８，Ｐｕｅｒｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ，ら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２３：２６０−２６４を参照されたい。また、ＳＴＲ遺伝子座の検出の使用に適切な対立遺伝子ラダーの開示、及びそれに開示されたラダー作製の方法において、米国特許第５５９９６６６号、同第５６７４６８６号及び同第５７８３４０６号明細書を参照されたい。

【0066】

個々の遺伝子座の対立遺伝子ラダーの作製に続いて、増幅されたサンプルの装入が起こると同時に、これらの対立遺伝子ラダーを混合し、ゲル電気泳動において装入してもよい。各対立遺伝子ラダーは、対応する遺伝子座のサンプルの対立遺伝子と一緒に移動する。

【0067】

本発明の多重反応の生成物は、インターナルレーンスタンダード、即ちポリアクリルアミドゲルの同じレーン又は同じキャピラリーで進むように設定されたサイズマーカーの特定タイプを使用して評価される。このインターナルレーンスタンダードは、好ましくは、既知の長さの一連のフラグメントを含む。更に好ましくは、インターナルレーンスタンダードは、増幅反応で他の色素と区別できる蛍光色素で標識される。

【0068】

インターナルレーンスタンダードの作製に続いて、このスタンダードもまた、増幅されたサンプル又は対立遺伝子ラダーと混合され、ゲル電気泳動の異なるレーンでの移動の比較、又はキャピラリー電気泳動の異なるキャピラリーでの移動の比較のための電気泳動に装入される。インターナルレーンスタンダードの移動の変化は、分離媒体の性能の変化を示す。対立遺伝子ラダーでこの差と相関を定量化することよって、未知のサンプルの対立遺伝子のサイズ決定の訂正ができる。

【0069】

Ｈ．好ましい検出技術：蛍光検出
本発明の方法の最も好ましい態様の一つ、蛍光検出は、多重増幅反応によって生成された混合物の中の増幅対立遺伝子を評価するのに使用される。以下は、好ましい検出方法が実施される方法の概要である。

【0070】

自動化蛍光イメージングの出現で、多重増幅生成物のより早い検出と分析が行なわれる。蛍光分析において、１つの蛍光標識プライマーは、各遺伝子座の増幅に含まれる。好ましくは、本発明の使用に適合する蛍光標識プライマーは、例えば、以下の実施例で説明されるように、フルオレセイン標識（ＦＬ−）、カルボキシテトラメチルローダミン標識（ＴＭＲ−）、及び５，６−カルボキシローダミン６Ｇ標識（Ｒ６Ｇ）プライマーを含む。このように標識されたプライマーを使用する増幅フラグメント生成物の分離は、好ましくは、スラブゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動で行われる。分離フラグメントの結果は、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、又はＨｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉａ，Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）といった蛍光検出装置を使用して分析される。

【0071】

概要中、本発明の方法は、最も好ましくは、検出工程として蛍光検出を用いて実施される。この好ましい検出方法において、多重増幅反応で使用される各プライマー対の一方または両方は、プライマー対に結合された蛍光ラベルを有し、その結果、増幅反応から生成された増幅対立遺伝子は、蛍光標識される。本発明の最も好ましいこの態様において、増幅された対立遺伝子は、キャピラリー電気泳動で同時に分離され、分離された対立遺伝子は、蛍光イメージアナライザーを使用して視覚化され、分析される。

【0072】

蛍光検出は、放射性標識の方法及び検出以上に好ましく、放射性材料の使用を要求されず、及びこのような材料の使用に付随する規制の問題及び安全性の問題のすべてを要求されないからである。

【0073】

また、標識プライマーを使用する蛍光検出は、他の非放射性の、例えば、銀染色といった検出方法以上に好ましく、一般的に、蛍光の検出方法は、銀染色より増幅人工産物を示さないからである。人工産物が少ないのは、一部分には、結合標識を持つＤＮＡの増幅鎖だけが蛍光検出で検出され、一方、多重増幅反応から生成されたＤＮＡの各増幅対立遺伝子の両方の鎖が、銀染色の検出方法を使用して染色され、検出されることによる。

【0074】

Ｉ．キット
また、本発明は、上述のプロセスを利用するキットに関する。基本的なキットは、１以上の遺伝子座特異的プライマーを有する容器を含む。任意で使用説明書を含んでもよい。

【0075】

他の任意のキット構成物は、特定の各遺伝子座に関する対立遺伝子ラダー、増幅のための十分な量の酵素、増幅を促進する増幅緩衝液、電気泳動用の増幅された材料を分離するための添加液、鋳型コントロールとしてのゲノムＤＮＡ、分離媒体中で先行して材料が移動することを保証するサイズマーカー、及び使用者を教育し、使用中の失敗を防ぐためのプロトコルとマニュアルを含んでもよい。また、キットの様々な試薬の量は、多くの要因、例えば工程の最適感度といった要因によって変化する。手動で使用するためのテストキットや自動検出又は分析で使用するためのテストキットを提供することは、本発明の範囲内である。

【実施例】

【0076】

以下の実施例において、本発明の利点を説明し、及び当業者が本発明を製造及び使用において補助するために提示される。実施例は、例示として意図され、特許によって認められる本発明の範囲を何ら制限するものではない。

【0077】

以下の実施例でアッセイされたヒトゲノムＤＮＡサンプルは、血液又は組織培養細胞から調製され、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｄｙｋｅｓ ｉｎ （Ｍｉｌｌｅｒ，Ｓ．ら（１９９８）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１２１５）によって記述された標準的な手順を用いた。ここで記述された単離及び定量方法は、一般に、当業者に公知であり、好ましくは、本発明の適用において、要求されない。

【0078】

以下の各実施例は、本発明の方法を用いた例であり、ヒトゲノムＤＮＡの１つ以上のＤＮＡサンプルから、少なくとも１３個の遺伝子座に存在する対立遺伝子を同時に決定する。以下の共増幅された遺伝子座の各組は、ＣＯＤＩＳシステムにおける使用のために特定された１３個の短いタンデム反復遺伝子座（即ち、Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ）を含む。また、以下の共増幅された遺伝子座のいくつかの組は、１つ以上の追加の短いタンデム反復遺伝子座、例えば、ペンタヌクレオチド反復を持つ遺伝子座（例えば、Ｇ４７５、Ｓ１５９、又はＣ２２１）及び非ＳＴＲ遺伝子座、すなわちアメロゲニンを含む。

【0079】

表２は、遺伝子座の組が、以下の各実施例で記述される多重増幅反応で共増幅されたことを要約する。また、この表は、プライマー対が、このような各多重反応でこのような各遺伝子座を増幅するのに使用されることを示す。表２に挙げられた各プライマー対の１つのプライマーは、多重増幅反応で使用される前に、蛍光標識される。いくつかの場合では、異なるラベルが、異なる遺伝子座に対するプライマーを標識するのに使用され、異なるプライマーを使用して生成された対立遺伝子は、レーザー活性蛍光検出装置で検出される場合に、別の対立遺伝子から区別できる。

【0080】

３種の異なる蛍光ラベルは、以下の実施例で使用され、フルオレセイン標識を示す「ＦＬ」、カルボキシテトラメチルローダミン標識を示す「ＴＭＲ」、５，６−カルボキシローダミン６Ｇを示す「Ｒ６Ｇ」として、以下に、表２に記述される。また、表２は、多重増幅反応で使用されるプライマーの各対のプライマーが、各実施例で標識されたことを示す（例えば、「ＦＬ−６９」は、配列ＩＤ番号６９を有するプライマーが、多重増幅反応で使用される前にフルオレセインで５’末端に標識されたことを意味する）。しかしながら、各実施例の本文において、ラベルの略語は、本文に記載された増幅反応で使用される標識プライマーの配列ＩＤ番号の直前に配置される（例えば、「ＦＬ−２」の代わりに「ＦＬ−配列ＩＤ番号２」）。

【表3】

【表4】

【表5】

【実施例1】

【0081】

ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３１０ Ｇｅｎｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯの多重増幅の蛍光検出
この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、単一の反応容器で、個々の遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯで同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ^*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ 及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中で実施し、１ｎｇの鋳型及び３．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、３０秒で９０℃、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２０サイクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行なった。

【0082】

２６個の増幅プライマーを、組み合わせて使用し、そのなかに、０．１２μＭの各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６９］、０．０８μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、０．３μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．２μＭの各Ｄ１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号６３］、１．１μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．８μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７５］、０．６μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．４μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０．２μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８５］、０．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号８２］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８３］、０．２μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、０．１５μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７９］、０．２μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７８］を含む。

【0083】

増幅した生成物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して分離した。ＤＮＡサンプルを、２４μｌの添加液（脱イオンホルムアミド）と１．０μｌのインターナルレーンサイズスタンダードと一緒に混合し、９５℃で３分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、４７ｃｍ×５０μｍキャピラリーで、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ４（ＰＯＰ−４）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行なった。製造業者のＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ランモジュールＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（ｌｄ．）（１ｍｌ）を使用した。電気泳動の条件は、５秒の注入、注入ｋＶは１５．０、泳動ｋＶは１５．０、泳動温度は６０℃、泳動時間は２８分、及び仮フィルターＡを使用、であった。

【0084】

図１Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキャニングした結果のプリントアウトである。図１Ａは、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９及びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯにおける同時に共増幅されたＤＮＡサンプルの増幅生成物を示す。パネルＡに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネルＢに示されるピークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネルＣに示されるピークは、５、６カルボキシローダミン６Ｇで標識される。

【0085】

図１Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図１Ａでスキャンされたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。

【実施例2】

【0086】

ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出
この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、単一反応容器で、個々の遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９で同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ^*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でＰＨ８．３）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）で行ない、１ｎｇの鋳型、及び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０秒、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２０サイクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行なった。

【0087】

３２個の増幅プライマーを、組み合わせて使用し、そのなかに、０．１２μＭの各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６９］、０．０８μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、０．３μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．２μＭの各Ｄ１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３］、０．２４μＭの各Ｇ４７５プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８８］及び２［配列ＩＤ番号８９］、０．６μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、１．１μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．８μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７５］、０．６μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．４μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０．２μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８５］、０．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号８２］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８３］、０．２μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、０．１５μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７９］、０．２μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号７８］、０．１μＭの各Ｓ１５９プライマー１［配列ＩＤ番号９０］及び２［Ｒ６Ｇ−配列ＩＤ番号９１］を含む。

【0088】

増幅された生成物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して分離した。ＤＮＡサンプルを、２４μｌの添加液（脱イオンホルムアミド）と１．０μｌのインターナルレーンサイズスタンダードを混合し、９５℃で３分間変性させ、注入の前に氷で冷却した。分離は、４７ｃｍ×５０μｍキャピラリーで、Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ ４（ＰＯＰ−４）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行なった。製造業者のＧｅｎｅＳｃａｎランモジュールＧＳ ＳＴＲ ＰＯＰ４（ｌｄ．）（１ｍｌ）Ａを使用した。電気泳動の条件は、５秒の注入、注入ｋＶは１５．０、泳動ｋＶは１５．０、泳動温度は６０℃、泳動時間は２８分、及び仮フィルターＡを使用、であった。

【0089】

図２Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキャニングした結果のプリントアウトである。図２Ａは、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅されたＤＮＡサンプルの増幅生成物を示す。パネルＡに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネルＢに示されるピークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネルＣに示されるピークは、５、６カルボキシローダミン６Ｇで標識される。

【0090】

図２Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図２Ａでスキャンされたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。

【実施例3】

【0091】

ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出
この実施例において、ＤＮＡ鋳型を、実施例２と同様に増幅した。増幅生成物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して分離した。これを、０．２ｍｍ厚さの、５％Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（商標出願中）Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）、７Ｍのウレアゲルを使用して実施した。ＤＮＡサンプルを、１．５μｌの添加液（８８．２５％ホルムアミド、４．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン）及び０．５μｌのインターナルレーンサイズスタンダードと混合し、９５℃で２分間変性させ、装入する前に氷で冷却した。電気泳動を、Ｐｒｅｒｕｎ（ＰＲ ＧＳ ３６Ａ−２４００）及びＲｕｎ（ＧＳ ３６Ａ−２４００）用の、製造業者のＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）モジュールを使用して行なった。泳動時間は３時間で、仮フィルターＡを用いた。

【0092】

図３Ａは、上述のように、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで分離され検出された各遺伝子座の増幅されたフラグメントをスキャニングした結果のプリントアウトである。図３Ａは、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅されたＤＮＡサンプルの増幅生成物を示す。パネルＡに示されたピークは、フルオレセインで標識され、パネルＢに示されるピークは、カルボキシテトラメチルローダミンで標識され、パネルＣに示されるピークは、５、６カルボキシローダミン６Ｇで標識される。

【0093】

図３Ｂは、増幅反応にＤＮＡ鋳型を使用しないことを除けば、図３Ａでスキャンされたサンプルと同じ方法で調製されたサンプルをスキャニングした結果のプリントアウトである。この図のピークは、色素コンジュゲーション及び精製の手順から生ずる、及び不確定な原因から生ずる、バックグラウンド生成物である。

【実施例4】

【0094】

Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出
この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９又はこれらの任意の組合せに係る遺伝子座から選択された３つの異なる遺伝子座の各々で同時に各々増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅において、単一の反応容器に５ｎｇの鋳型を含め、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ^*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でＰＨ８．３）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含めた。

【0095】

ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０秒、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０°にし、４５秒保持を２２サイクル、続いて、６０℃で３０分を１サイクル行なった。

【0096】

３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．２２５μＭの各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６９］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、１．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、１．０μＭの各Ｄ１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３］、２．８μＭの各Ｇ４７５プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８８］及び２［配列ＩＤ番号８９］、０．２μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、０．３μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７５］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．０μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号８２］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８３］、１．７μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、３．３μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７９］、０．５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７８］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１［配列ＩＤ番号９０］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９１］を含んでいた。

【0097】

第１の遺伝子座の組合せにおいて、各鋳型を、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ ポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。第２の遺伝子座の組合せにおいて、上に記述された濃度で、３２個のすべてのプライマー及び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｇ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを、単一の反応容器中の１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９でＤＮＡ鋳型を増幅するのに使用した。第３の組合せにおいて、各鋳型を、１．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。

【0098】

増幅生成物を、７Ｍ尿素を含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９））０．４ｍｍ厚さの４％変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミドとビスアクリルアミドの割合が１９：１）を通る電気泳動で分離し、このゲルは、２枚のガラスプレートに化学的に架橋していた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．（１９８８）、ＢＲＬ Ｆｏｃｕｓ １０：７３−７４）。ＤＮＡサンプルを、３．５μｌの添加液（１０ｍＭ ＮａＯＨ、９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルー）及び０．５μｌのインターナルレーンサイズスタンダードと混合して、９５℃で２分間変性し、装入する前に氷で冷却した。分離した生成物は、Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ ＩＩ フルオレセントスキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｌｔｄ．Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して蛍光シグナルの検出によって視覚化した。それぞれ５０５ｎｍ及び５８５ｎｍでのバンドパスフィルターを、フルオレセイン標識遺伝子座及びカルボキシテトラメチルローダミン標識遺伝子座のそれぞれの検出に使用した。６５０ｎｍのバンドパスフィルターを、インターナルレーンスタンダードの検出に使用した（サイズスタンダードデータは示さなかった）。

【0099】

各増幅反応から生じるフラグメントを表示する、図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。図４Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン（フルオレセインチャンネル）の結果を、図４Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各ＤＮＡ鋳型において、レーン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。

【実施例5】

【0100】

Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９の多重増幅の蛍光検出
この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された２つの異なる遺伝子座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反応容器に５ｎｇの鋳型を含み、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ^*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含めた。

【0101】

ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０秒、６０秒で５８℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２２サイクル、次に６０℃で３０分を１サイクル行なった。

【0102】

３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．２２５μＭの各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号６８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６９］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６６］及び２［配列ＩＤ番号６７］、１．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、１．０μＭの各Ｄ１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号６２］及び２［配列ＩＤ番号６３］、２．８μＭの各Ｇ４７５プライマー１［配列ＩＤ番号８８］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９４］、０．２μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号８６］及び２［配列ＩＤ番号８７］、０．３μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［配列ＩＤ番号７４］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７５］、０．２μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［配列ＩＤ番号７２］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７３］、２．０μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号７１］、０．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号８２］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８３］、１．７μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、３．３μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［配列ＩＤ番号２９］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７９］、０．５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号７８］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１［配列ＩＤ番号９５］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９６］を含む。

【0103】

最初の遺伝子座の組合せにおいて、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^TM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。２番目の遺伝子座の組合せにおいて、上に記述した濃度で、３２個のすべてのプライマー及び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^TM ＤＮＡポリメラーゼを使用して、単一の反応容器に入っている１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９でＤＮＡ鋳型を増幅した。

【0104】

増幅された生成物の分離及び視覚化は、実施例４に記述したものと同じである。

【0105】

各増幅反応で生じるフラグメントを表示する、図５Ａ及び図５Ｂを参照されたい。図５Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン（フルオレセインチャンネル）の結果を、図５Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各鋳型において、レーン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示し、レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＢＩＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＳ１５９における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。

【実施例6】

【0106】

Ｈｉｔａｃｈｉ ＦＭＢＩＯ（登録商標）ＩＩ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒで検出された、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１の多重増幅の蛍光検出
この実施例において、２つのＤＮＡ鋳型を、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１又はこれらの任意の組合せの遺伝子座から選択された３つの異なる遺伝子座の各組合せで各々同時に増幅した。各遺伝子座の組合せの増幅には、単一の反応容器に１０ｎｇの鋳型を含め、反応容器に、２５μｌの１×Ｇｏｌｄ ＳＴ^*Ｒ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を含めた。

【0107】

ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、以下の増幅プロトコルで使用した。９６℃で１２分、次に、９４℃で３０秒、６８秒で６０℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を１０サイクル、続いて、９０℃で３０秒、６０秒で６０℃にし、３０秒保持、５０秒で７０℃にし、４５秒保持を２０サイクル、次に６０℃で３０分を１サイクル行なう。

【0108】

３２個の増幅プライマーを、以下の濃度で使用し、その中に、０．７５μＭの各Ｄ３Ｓ１３５８プライマー１［配列ＩＤ番号１０６］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６９］、０．３μＭの各ＨＵＭＴＨ０１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号３８］及び２［配列ＩＤ番号１０３］、２．０μＭの各Ｄ２１Ｓ１１プライマー１［配列ＩＤ番号６４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号６５］、０．３μＭの各Ｄ１８Ｓ５１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号１０１］及び２［配列ＩＤ番号１０２］、２．０μＭの各Ｓ１５９プライマー１［配列ＩＤ番号９２］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９３］、０．１５μＭの各アメロゲニンプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号１０５］及び２［配列ＩＤ番号８７］、１．０μＭの各ＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１［配列ＩＤ番号７６］及び２［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号４０］、１．２５μＭの各Ｄ８Ｓ１１７９プライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号１０４］及び２［配列ＩＤ番号７５］、０．７５μＭの各ＨＵＭＴＰＯＸプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７２］及び２［配列ＩＤ番号７３］、１．５μＭの各ＨＵＭＦＩＢＲＡプライマー１［ＴＭＲ−配列ＩＤ番号７０］及び２［配列ＩＤ番号１０７］、０．５５μＭの各Ｄ５Ｓ８１８プライマー１［配列ＩＤ番号８４］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号８５］、１．１μＭの各Ｄ１３Ｓ３１７プライマー１［配列ＩＤ番号３］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号４］、１．７μＭの各Ｄ７Ｓ８２０プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号８０］及び２［配列ＩＤ番号８１］、３．３μＭの各Ｄ１６Ｓ５３９プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号２９］及び２［配列ＩＤ番号９７］、０．２５μＭの各ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯプライマー１［配列ＩＤ番号７７］及び２［ＦＬ−配列ＩＤ番号９８］、１．０μＭの各Ｃ２２１プライマー１［ＦＬ−配列ＩＤ番号９９］及び２［配列ＩＤ番号１００］を含んでいた。

【0109】

１番目の遺伝子座の組合せにおいて、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^TM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して各鋳型を増幅した。２番目の遺伝子座の組合せにおいて、上に記述した濃度で、３２個のすべてのプライマー及び４ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^TM ＤＮＡポリメラーゼを使用して、単一の反応容器に入っている１６個のすべての遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＩＢＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１でＤＮＡ鋳型を増幅した。３番目の組合せにおいて、各鋳型を、１．５ＵのＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ^TM ＤＮＡポリメラーゼ及び遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１における上述の濃度で使用される各遺伝子座のプライマーを使用して増幅した。

【0110】

増幅生成物は、増幅生成物の各サンプルを１倍のＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）で１：４に希釈した以外は、実施例４で上述したのと同様に分離し、検出した。希釈した増幅生成物（２．５μｌ）を、２．５μｌの添加液（１０ｍＭ ＮａＯＨ、９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルー）と混合し、インターナルレーンスタンダードなしで、９５℃で２分間変性し、装入する前に氷で冷却した。

【0111】

各増幅反応で生じるフラグメントを表示する、図６Ａ及び図６Ｂを参照されたい。図６Ａは、ポリアクリルアミドゲルの同じレーンの、５０５ｎｍスキャン（フルオレセインチャンネル）の結果を、図６Ｂは、５８５ｎｍスキャン（カルボキシテトラメチルローダミンチャンネル）の結果を示す。各ＤＮＡ鋳型において、レーン１は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｓ１５９、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＦＩＢＲＡにおける同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示し、レーン２は、遺伝子座Ｄ３Ｓ１３５８、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ２１Ｓ１１、Ｄ１８Ｓ５１、Ｇ４７５、アメロゲニン、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、Ｄ８Ｓ１１７９、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＦＢＩＲＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。レーン３は、遺伝子座Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１６Ｓ５３９、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及びＣ２２１における同時に共増幅したＤＮＡサンプルの結果を示す。




〔配列表〕

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】