特許 5711968 高エイコサペンタエン酸を生成するためのヤロウィア・リポリティカ（ＹａｒｒｏｗｉａＬｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5711968

(24)【登録日】2015年3月13日

(45)【発行日】2015年5月7日

(54)【発明の名称】高エイコサペンタエン酸を生成するためのヤロウィア・リポリティカ（ＹａｒｒｏｗｉａＬｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/19 20060101AFI20150416BHJP

   C12P 7/64 20060101ALI20150416BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150416BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20150416BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20150416BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/19ZNA

   C12P7/64

   C12N15/00 A

   C12N9/02

   C12N9/88

【請求項の数】6

【全頁数】125

(21)【出願番号】特願2010-528141(P2010-528141)

(86)(22)【出願日】2008年10月3日

(65)【公表番号】特表2011-501661(P2011-501661A)

(43)【公表日】2011年1月13日

(86)【国際出願番号】US2008078642

(87)【国際公開番号】WO2009046231

(87)【国際公開日】20090409

【審査請求日】2011年9月28日

(31)【優先権主張番号】60/977,177

(32)【優先日】2007年10月3日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/977,174

(32)【優先日】2007年10月3日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-8614

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-8802

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】390023674

【氏名又は名称】イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】チーシオン・シュエ

(72)【発明者】

【氏名】ナレンドラ・エス・ヤダヴ

(72)【発明者】

【氏名】クイン・クン・ズュー

【審査官】 水野 浩之

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０５２８７０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０６１７４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１３８８６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０７３２７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１２４１９４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エイコサペンタエン酸を生産するための組換えヤロウィア属生産宿主細胞であって、
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するデルタ−９エロンガーゼをコードする遺伝子を少なくとも５コピー、
ｂ）配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するデルタ−８デサチュラーゼをコードする遺伝子を少なくとも５コピー、
ｃ）配列番号５５および５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するデルタ−１２デサチュラーゼをコードする遺伝子を少なくとも３コピー、
ｄ）配列番号４７、４９、５１および５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するデルタ−１７デサチュラーゼをコードする遺伝子を少なくとも３コピー、
ｅ）配列番号３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するデルタ−５デサチュラーゼをコードする遺伝子を少なくとも４コピー、
ｆ）配列番号５９および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣ_16/18エロンガーゼをコードする遺伝子を少なくとも２コピー、
ｇ）配列番号６９のアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子を少なくとも１コピー、ならびに
ｈ）その発現がダウンレギュレートされている、配列番号９７および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペルオキシソーム生合成因子タンパク質、
を含み、ここで上記ヤロウィア属生産宿主細胞は、該生産宿主細胞における総脂肪酸の質量パーセントとして測定された少なくとも４３.３質量パーセントのエイコサペンタエン酸を生産する、組換えヤロウィア属生産宿主細胞。

【請求項2】

デルタ−９エロンガーゼが、配列番号５のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組換えヤロウィア属生産宿主細胞。

【請求項3】

デルタ−１２デサチュラーゼが、配列番号５５のアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の組換えヤロウィア属生産宿主細胞。

【請求項4】

宿主細胞が、ヤロウィア・リポリティカである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えヤロウィア属生産宿主細胞。

【請求項5】

デルタ−８デサチュラーゼが配列番号２３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えヤロウィア属生産宿主細胞。

【請求項6】

エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産するための方法であって、
（ｉ）エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産させる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の生産宿主を培養するステップ；および
（ii）場合により、ステップ（ｉ）の微生物オイルを回収するステップ
を含む、上記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、米国仮特許出願第６０／９７７，１７４号明細書および第６０／９７７，１７７号明細書（双方とも２００７年１０月３日に出願）の優先権を主張するものであり、それら全体が参照により本明細書中に援用される。

【0002】

本発明はバイオテクノロジーの分野に含まれる。より詳細には、本発明は、高濃度でω−３多価不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸を効率的に生成可能な油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変株に関する。

【背景技術】

【0003】

エイコサペンタエン酸（「ＥＰＡ」；シス５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸；ω−３）は、生物活性のあるプロスタグランジンの生合成における重要な中間体である。さらに，ＥＰＡは、臨床的および薬学的価値を有するものとして理解されている。例えば、次のＥＰＡの薬理学的作用、すなわち１）血小板凝集阻害作用（血栓溶解作用）；２）血中中性脂肪低下作用；３）血中ＶＬＤＬ−コレステロールおよびＬＤＬ−コレステロールを低下させかつＨＤＬ−コレステロールを増加させる作用（抗動脈硬化作用）；４）血液粘度低下作用；５）血圧低下作用；６）抗炎症作用；および７）抗腫瘍作用、は知られている。したがって、ＥＰＡは血中コレステロールおよびトリグリセリドを低下させるための自然なアプローチを提供する。ＥＰＡの摂取の増加は、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性障害（例えば関節リウマチ）、肺および腎疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、クローン病、拒食症、やけど、骨関節炎、骨粗鬆症、注意欠陥／多動性障害、および結腸直腸癌の早期ステージにおいて有益であるかまたは陽性効果を有することが示されている。例えば、非特許文献１〜３を参照のこと。最近の知見では、精神障害、例えば統合失調症の治療におけるＥＰＡの使用についても確認されている（特許文献１、２）。最後に、ＥＰＡはまた、機能食品（栄養補助食品）、幼児栄養、バルク栄養、化粧品および動物健康に関する製品中に使用される。

【0004】

組換え手段を用いたＥＰＡの微生物生成は、天然微生物源（例えば、従属性の珪藻キクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）およびニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｓｐ．）；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）またはシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）種；ピシウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の糸状真菌；またはモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）、またはモルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ））からの生成、あるいは魚油および海洋プランクトンからの単離の全体にわたっていくつかの利点を有することが期待される。例えば、宿主の天然微生物脂肪酸特性が宿主における新しい生合成経路の導入および／または所望されない経路の抑制によって改変されうることから、オイル生成にとって好ましい特性を有する組換え微生物が使用されうる。これは、所望される多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］またはその複合形態の生成のレベルの上昇、および所望されないＰＵＦＡの生成の低下をもたらす。第２に、組換え微生物は、特定の用途を有しうる特別な形態でのＰＵＦＡを提供しうる。さらに、微生物オイルの生成は、培養条件を制御し、特に微生物によって発現された酵素における特定の基質源を提供することによるか、または所望されない生化学経路を抑制するための化合物の添加／遺伝子組換えによって操作されうる。したがって、例えば、そのようにして生成されるω−３対ω−６脂肪酸の比を修飾するか、または他の下流または上流のＰＵＦＡ産物の有意な蓄積を伴わずに特定のＰＵＦＡ（例えばＥＰＡ）の生成を改変することが可能である。組換え微生物におけるＥＰＡの生成はまた、除去するのが困難であり、法外な費用がかかる不快な風味および汚染物質を被りうる持続不可能な海洋源の使用を回避する。発酵された組換え微生物から単離され、得られるＥＰＡオイルは、これらの生体内蓄積性化合物を精製する必要性がない。

【0005】

文献では、ＥＰＡの生成に関与するω−３／ω−６ ＰＵＦＡ生合成経路の様々な部分が植物（例えば、非特許文献４）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（非油性酵母）（非特許文献５；特許文献３；非特許文献６）に導入されているという多数の最近の例が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第６，３３１，５６８号明細書

【特許文献2】米国特許第６，６２４，１９５号明細書

【特許文献3】米国特許第６，１３６，５７４号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】ＭｃＣｏｌｌ Ｊ．、ＮｕｔｒａＣｏｓ，２（４）：３５−４０頁（２００３年）

【非特許文献2】Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ａ．ら、「Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｆｕｌ Ｌｉｐｉｄｓ」；Ｃ．Ｃ．ＡｋｏｈおよびＯ．−Ｍ．Ｌａｉ編

【非特許文献3】ＡＯＣＳ：Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ，２００５年；第１６章の概説

【非特許文献4】Ｑｉ Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２２：７３９−７４５頁（２００４年）

【非特許文献5】Ｄｙｅｒ Ｊ．Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｉｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５９：２２４−２３０頁（２００２年）

【非特許文献6】Ｄｏｍｅｒｇｕｅ Ｆ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６９：４１０５−４１１３頁（２００２年）を参照

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、ＰＵＦＡの生成にとって特に有用なものとなる多数の特性を有する（例えば同一出願人が所有する米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照のこと）。油性酵母は、天然にオイル合成および蓄積の能力がある酵母として規定され、ここでオイル蓄積は細胞乾燥重量の少なくとも２５％である。ＥＰＡの商業的生産には、全脂肪酸の重量パーセントとして大量のＥＰＡを生成する株が必要となる。出願人は、全オイル画分中で５３．２％超のＥＰＡを生成可能なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の高度に最適化された株を改変することにより、上記の課題を解決している。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、微生物オイルにおいてＥＰＡを合成するための生成宿主を提供する。株は、ゲノム内部に多数の遺伝要素および修飾を取り込む組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）であり、ＥＰＡの生成故に非常に興味深いものとなる。

【0010】

したがって、本発明は、
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む、エイコサペンタエン酸を生成するための組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｓｐ．）生成宿主細胞を提供し、ここでヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）生成宿主細胞は、生成宿主細胞内で全脂肪酸の重量パーセントとして測定される、少なくとも約４３．３重量パーセントのエイコサペンタエン酸を提供する。

【0011】

別の実施形態では、本発明は、エイコサペンタエン酸を含有する微生物オイルを生成するための方法であって、
ａ）本発明の生成宿主を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸を含有する微生物オイルが生成されるステップと、
ｂ）場合により、ステップ（ａ）の微生物オイルを回収するステップと、
を含む、方法を提供する。

【0012】

別の実施形態では、本発明は、全脂肪酸の重量パーセントとして少なくとも約２５重量パーセントのエイコサペンタエン酸を含有するか、あるいは全脂肪酸の重量パーセントとして少なくとも約３０重量パーセントのエイコサペンタエン酸および約２５重量パーセント未満のリノール酸を含有するか、あるいは全脂肪酸の重量パーセントとして少なくとも約５０重量パーセントのω−３多価不飽和脂肪酸を含有する微生物オイル組成物を提供する。

【0013】

他の実施形態では、本発明は、全脂肪酸の重量パーセントとして次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）約４８〜約５５重量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約１．５〜約３．０重量パーセントのエイコサテトラエン酸、
ｃ）約０．１〜０．７重量パーセントのアラキドン酸、
ｄ）約１．０〜約２．５重量パーセントのジホモ−γ−リノレン酸、
ｅ）約２．０〜約３．５重量パーセントのエイコサジエン酸、
ｆ）約２．０〜約３．０重量パーセントのα−リノレン酸、
ｇ）約１７．０〜約２０．０重量パーセントのリノール酸（１８：２）、
ｈ）約３．５〜約６．５重量パーセントのオレイン酸（１８：１）、
ｉ）約１．０〜約２．０重量パーセントのステアリン酸（１８：０）、
ｊ）約０．５〜約３．５重量パーセントのパルミトレイン酸（１６：１）、および
ｋ）約２．５〜約４．５重量パーセントのパルミチン酸（１６：０）
を有する微生物オイルを提供する。

【0014】

別の実施形態では、本発明の微生物オイルは、全脂肪酸の重量パーセントとして次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）少なくとも約４３．３重量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約２３．６重量パーセント未満のリノール酸（１８：２）、および
ｃ）約９．４重量パーセント未満のオレイン酸（１８：１）
を有する。

【0015】

寄託
以下の生物学的材料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ） ２０１１０−２２０９に寄託されており、以下の名称、登録番号および寄託日を有する。

【0016】

【表1】

【0017】

上に列挙される生物学的材料は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの条項下で寄託された。列挙された寄託物は指定の国際寄託機関において少なくとも３０年間維持され、かつそれを開示する特許の交付時に一般に公開される。寄託物の可用性は、政府行為によって交付される特許権の失効において、本発明を実施するためのライセンスとならない。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、かつ下記のこの経路の記述を考慮する場合、共に参照されるべきである。

【図1B】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示し、かつ下記のこの経路の記述を考慮する場合、共に参照されるべきである。

【図2A】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０ｐのＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフ（すなわち配列番号１０４［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６］のアミノ酸３２７〜３６４）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ２ｐ（すなわち配列番号９６［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７］のアミノ酸２６６〜３２３）およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１２ｐ（すなわち配列番号１０５［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２］のアミノ酸３４２〜３９１）とアスターリスクで示される保存されたＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフのシステインおよびヒスチジン残基とのアラインメントを提供する。

【図2B】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０ｐ Ｃ_３ＨＣ_４フィンガーモチーフの様々なアミノ酸残基とそれらが結合する２つの亜鉛イオンとの間の提示される相互作用を概略的に図示する。

【図3】全脂質画分中で５３．２％超のＥＰＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５の作成を図示する。

【図4】全脂質画分中で５３．２％のＥＰＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５における脂肪酸特性を示すＧＣクロマトグラフである。

【図5A】ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕにおけるプラスミドマップを提供する。

【図5B】ｐＹ１１７におけるプラスミドマップを提供する。

【図6A】ｐＺＰ２−２９８８におけるプラスミドマップを提供する。

【図6B】ｐＺＫＵＥ３Ｓにおけるプラスミドマップを提供する。

【図7A】ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣにおけるプラスミドマップを提供する。

【図7B】ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃにおけるプラスミドマップを提供する。

【図8A】ｐＺＫＵＭにおけるプラスミドマップを提供する。

【図8B】ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２におけるプラスミドマップを提供する。

【図9A】ｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１におけるプラスミドマップを提供する。

【図9B】ｐＦＢＡＩＮ−ＰＥＸ１０におけるプラスミドマップを提供する。

【図10A】ｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１プラスミドマップを提供する。

【図10B】ｐＰＥＸ１０−１におけるプラスミドマップを提供する。

【図11A】全脂質画分中で３０．７％のＥＰＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４の作成を図示する。

【図11B】ｐＹＰＳ１６１におけるプラスミドマップを提供する。

【0019】

本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の配列記述からより十分に理解されうる。

【0020】

以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ」）に従い、Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ） Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（Ｒｕｌｅｓ ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）ならびにＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＳｅｃｔｉｏｎ ２０８およびＡｎｎｅｘ Ｃ）に合致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。

【0021】

配列番号１〜１３５、１５０、１５１、１５５〜１５８、１７３〜１８９および１９６〜２０１は、表１において同定された、プロモーター、ＯＲＦコード遺伝子またはタンパク質（またはその断片）またはプラスミドである。

【0022】

【表2】

【0023】

【表3】

【0024】

【表4】

【0025】

【表5】

【0026】

【表6】

【0027】

【表7】

【0028】

配列番号１３６〜１４３はそれぞれ、株Ｙ４１２８におけるｐＺＰ２−２９８８のゲノム組み込み部位を判定するためのゲノム歩行の実行に使用されるプライマーｐＺＰ−ＧＷ−５−１、ｐＺＰ−ＧＷ−５−２、ｐＺＰ−ＧＷ−５−３、ｐＺＰ−ＧＷ−５−４、ｐＺＰ−ＧＷ−３−１、ｐＺＰ−ＧＷ−３−２、ｐＺＰ−ＧＷ−３−３およびｐＺＰ−ＧＷ−３−４に対応する。

【0029】

配列番号１４４および１４５はそれぞれＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプターに対応する一方、配列番号１４６はネスト化アダプタープライマーに対応する。

【0030】

配列番号１４７および１４８はそれぞれ、ｐＺＰ２−２９８８のゲノム組み込み部位の５’末端を判定するのに使用されるプライマーＰｅｒ１０ Ｆ１およびＺＰＧＷ−５−５に対応する。

【0031】

配列番号１４９は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０遺伝子のコード領域を増幅するのに使用されるプライマーＰｅｒ１０Ｒに対応する。

【0032】

配列番号１５２〜１５４はそれぞれ、ｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２の作成に使用されるプライマーＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩ、ＰＥＸ１０−Ｆ１−ＳａｌＩおよびＰＥＸ１０−Ｆ２−ＳａｌＩに対応する。

【0033】

配列番号１５９および１６０はそれぞれ、Ｐｅｘ１０の欠失を有する細胞の同定に使用されるプライマーＰｅｘ−１０ｄｅｌ１３’．ＦｏｒｗａｒｄおよびＰｅｘ−１０ｄｅｌ
２５’．Ｒｅｖｅｒｓｅに対応する。

【0034】

配列番号１６１〜１６４はそれぞれ、株Ｙ４３０５におけるｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２のゲノム組み込み部位を判定するためのゲノム歩行の実行に使用されるプライマーＫＬ２−３−１、ＫＤ２−３−２、ＳＣＰ−５−２およびＫＤ２−５−３に対応する。

【0035】

配列番号１６５〜１６８はそれぞれ、株Ｙ４３０５におけるｐＺＰ３−ＰＡ７７７Ｕのゲノム組み込み部位を判定するためのゲノム歩行の実行に使用されるプライマー７９−５−ＰＯＸ−１、７９−５−ＰＯＸ−２、４３０５ＺＰ３−３−２および７９−３−ＰＯＸ−３に対応する。

【0036】

配列番号１６９〜１７２はそれぞれ、株Ｙ４３０５におけるｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのゲノム組み込み部位を判定するためのゲノム歩行の実行に使用されるプライマーＫＬ２−５−２、ＫＬ２−５−３、ＫＬ２−３−２およびＫＬ２−３−３に対応する。

【0037】

配列番号１９０〜１９５は、膜二鉄タンパク質のスーパーファミリーに属する膜結合脂肪酸デサチュラーゼ中で著しい特徴を示すＨｉｓリッチモチーフに対応する。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本明細書中で引用される次の特許、特許出願、および刊行物、すなわち米国特許出願第１１／２６５７６１号明細書（２００５年１１月２日に出願）、米国仮特許出願第６０／９７７，１７４号明細書（２００７年１０月３日に出願）および米国仮特許出願第６０／９７７，１７７号明細書（２００７年１０月３日に出願）はそれら全体が参照により援用される。

【0039】

２５％超のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；２０：５ω−３）を生成可能なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の生成宿主株が本明細書中に記載される。この特定の多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］の蓄積が、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼおよびＣ_{１６／１８}エロンガーゼ活性を有するタンパク質を含む機能的ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の導入によって行われ、それによりγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］が欠如したＥＰＡオイルの生成が可能になる。したがって、本開示は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変によってＥＰＡおよびその誘導体の商業的生産が可能であることを示す。生成の方法についても権利請求される。

【0040】

ＰＵＦＡまたはその誘導体は、経静脈栄養を受けている患者のためかまたは栄養失調を予防または治療するため、代用食品またはサプリメント、特に乳児用調乳（ｉｎｆａｎｔ
ｆｏｒｍｕｌａ）として用いられる。あるいは、精製ＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、常用でのレシピエントであれば栄養補助にとって望ましい量を受けることになるように調合された調理油、油脂、またはマーガリンに含有されうる。ＰＵＦＡはまた、乳児用調乳、栄養補給食品、または他の食品に含有され、抗炎症剤またはコレステロール低下剤としての用途が見出されうる。場合により、組成物は医薬用途（ヒトまたは獣医のいずれか）に用いられうる。

【0041】

ヒトまたは動物に組換え手段により生成されたＰＵＦＡを補助する結果、添加されたＰＵＦＡおよびその代謝子孫（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｇｅｎｙ）のレベルが上昇しうる。例えば、ＥＰＡでの治療の結果、ＥＰＡだけでなくエイコサノイド（すなわち、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン）、ドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］およびドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］などのＥＰＡの下流生成物のレベルが上昇しうる。複雑な調節機構により、個体内でかかる機構を阻止、制御または克服し、所望のレ
ベルの特定のＰＵＦＡを得るため、様々なＰＵＦＡを結合させるかまたはＰＵＦＡの異なる複合体を添加することが望ましくなりうる。

【0042】

あるいは、本明細書中に開示される方法によって製造されるＰＵＦＡまたはその誘導体は、動物および養殖飼料、例えば乾燥飼料、半湿飼料（ｓｅｍｉ−ｍｏｉｓｔ ｆｅｅｄ）および湿飼料（ｗｅｔ ｆｅｅｄ）の合成において、これら製剤が一般的にω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡとなる栄養組成物の少なくとも１〜２％を必要とすることから使用されうる。

【0043】

定義
本開示において、多数の用語および略語が用いられる。以下の定義が提供される。

【0044】

「オープンリーディングフレーム」は「ＯＲＦ」と略される。

【0045】

「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略される。

【0046】

「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は「ＡＴＣＣ」と略される。

【0047】

「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略される。

【0048】

「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」は「ＤＡＧ ＡＴ」または「ＤＧＡＴ」と略される。

【0049】

「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略される。

【0050】

「補酵素Ａ」は「ＣｏＡ」と略される。

【0051】

「全脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略される。

【0052】

「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略される。

【0053】

「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略される。

【0054】

本明細書で使用される用語「発明」または「本発明」は、本文中の特許請求の範囲および明細書に記載の本発明のすべての態様および実施形態を示すように意図され、任意の特定の実施形態または態様に限定されるように解釈されるべきではない。

【0055】

用語「食品」は、一般的にヒトの消費に適する任意の食品を示す。典型的な食品は、限定はされないが、肉製品、穀物製品、焼成食品、スナック食品、乳製品、飲料などを含む。用語「類似食品」、「機能食品」、「医療食品」および「医療用栄養食品」は米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書に定義されている。

【0056】

本明細書で使用される用語「医薬品」は、米国内で販売される場合、連邦食品薬品化粧品法（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ａｃｔ）のセクション５０３または５０５によって規制されることになる化合物または物質を意味する。

【0057】

用語「調製粉乳」は、ヒト母乳に対するその擬似性を理由に、特にヒト幼児による消費向けに設計された食品である。調製粉乳の典型的な市販例として、限定はされないが、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）およびＩｓｏｍｉｌ（登録商標）が挙げられる。

【0058】

用語「栄養補助食品」は、（ｉ）ダイエットを補助することが意図され、それにより食事またはダイエットの従来食または唯一の品目としての使用を示さず、（ｉｉ）（例えば、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、酵素および腺を含む）１種以上の食品成分またはそれらの構成成分を含有し、（ｉｉｉ）錠剤、カプセル、タブレットまたは液体としての経口摂取が意図され、また（ｉｖ）栄養補助食品であるものと称される製品を示す。

【0059】

用語「臨床症状」は、ヒトまたは動物の健康および幸福感を損なわせ、かつＰＵＦＡおよび特にω−３および／またはω−６脂肪酸の補給によって改善されうるヒトまたは動物における症状を意味することになる。臨床症状は、冠動脈心疾患などの十分に実証された病状または乏しい栄養調節によってもたらされる健康不安の一般的状態の形態をとりうる。

【0060】

用語「動物飼料」は、特に、ペット、家畜などの家畜動物を含む動物による消費または食品の生成用に飼育された動物、例えば養魚業などを目的とした飼料を示す。用語「養殖飼料」、「アクアフィード（ａｑｕａｆｅｅｄ）」および「飼料栄養素」は、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書に定義されている。

【0061】

本明細書で使用される用語「バイオマス」は、詳細には、商業的に有意な量でのＥＰＡを生成する組換え生成宿主の発酵から得られる消費または使用される酵母細胞材料を示し、ここで好ましい生成宿主は油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株である。バイオマスは、全細胞、全細胞溶解液、均質化細胞、部分加水分解された細胞材料、および／または部分精製細胞材料（例えば、微生物によって生成されたオイル）の形態でありうる。

【0062】

用語「脂質」は、任意の脂肪溶解性（すなわち親油性）の天然分子を示す。脂質は、多数の主要な生物学的機能を有する多様な化合物群、例えば細胞膜の構造成分、エネルギー貯蔵源およびシグナル伝達経路における中間体である。脂質は、全体的または部分的にケトアシルまたはイソプレン基のいずれかに由来する疎水性または両親媒性小分子として広義に規定されうる。Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｓｔｒａｔｅｇｙ（ＬＩＰＩＤ ＭＡＰＳ）分類系（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））に基づく脂質の概要が下の表２に示される。

【0063】

【表8】

【0064】

本明細書中の細胞の用語「全脂質画分」は、細胞のすべてのエステル化脂肪酸を示す。全脂質画分内部での様々な置換物が単離されうる（トリアシルグリセロール［「オイル」］画分、ホスファチジルコリン画分およびホスファチジルエタノールアミン画分を含むが、これには決してすべての部分画分が含まれない）。

【0065】

「脂質体」は、リン脂質の単層および通常は特定のタンパク質によって結合される脂質滴を示す。これらのオルガネラは、大部分の生物が中性脂質を輸送／貯蔵する部位である。脂質体は、ＴＡＧ生合成酵素を有する小胞体のミクロドメインから生じると考えられる。その合成およびサイズは、特定のタンパク質成分によって制御されるように見られる。

【0066】

「中性脂質」は、貯蔵脂肪およびオイルとして脂質体中の細胞内に一般的に見出される脂質を示し、細胞ｐＨで脂質が荷電基を全く担持しないことからそのように称される。一般的に、それらは完全に非極性であると共に水に対する親和性を有しない。中性脂質は、一般的にグリセロールと脂肪酸のモノ−、ジ−、および／またはトリエステル（個別にモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはトリアシルグリセロールまたは総称的にアシルグリセロールとも称される）を示す。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するため、加水分解反応が生じる必要がある。

【0067】

用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］および「オイル」は同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基からなる中性脂質を示す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸とより長い鎖の飽和脂肪酸を有しうる。細胞のＴＡＧ画分は「オイル画分」とも称され、かつ「オイル生合成」は一般的に細胞内でのＴＡＧの合成を示す。オイルまたはＴＡＧ画分は全脂質画分の部分画分であるが、さらにそれは、油性生物中で、乾燥細胞重量のパーセントとして細胞内の全脂肪酸の重量として測定される［下記参照］全脂質含量の主要部分を構成する。オイル［「ＴＡＧ」］画分中の脂肪酸組成物および全脂質画分の脂肪酸組成物は一般的に類似している。したがって、全脂質画分中でのＰＵＦＡの濃度の増加または減少は、オイル［「ＴＡＧ」］画分中でのＰＵＦＡの濃度の増加または減少に対応することになり、また逆もいえる。

【0068】

用語「ホスファチジルコリン」または「ＰＣ」は、細胞膜の主要成分であるリン脂質を示す。ＰＣの化学構造は、一般的に以下のもの、すなわちコリン分子、リン酸基およびグリセロールを含むものとして記述可能であり、ここで脂肪酸アシル鎖は、グリセロール分子のｓｎ−１およびｓｎ−２位置上のＲ基として結合される。

【0069】

本明細書中の用語「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えば全脂質画分またはオイル画分でありうる所与の試料中で（当該技術分野で既知の）塩基エステル交換方法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化されうるすべての細胞脂肪酸の総体を示す。したがって、全脂肪酸は、ホスファチジルコリン画分、ホスファチジルエタノールアミン画分およびジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール［「ＴＡＧまたはオイル」］画分を含む、中性および極性脂質画分に由来する脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸を含まない。

【0070】

細胞の用語「全脂質含量」は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］のパーセントとしてのＴＦＡの尺度である。したがって、全脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの全脂肪酸のミリグラムに等しい。

【0071】

一般的に、脂肪酸の濃度は、本明細書中で、ＴＦＡの重量パーセント［「％ＴＦＡ」］、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所与の脂肪酸のミリグラムとして表される。本明細書中の開示では他に特に指定のない限り、全脂質に対する所与の脂肪酸のパーセントについては、％ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度に等しい（例えば全脂質の％ＥＰＡはＥＰＡ％ＴＦＡに等しい）。

【0072】

場合によっては、細胞内の所与の脂肪酸の含量を乾燥細胞重量のそのパーセント［「％ＤＣＷ」］として表すことは有用である。したがって、例えばエイコサペンタエン酸％ＤＣＷであれば、次の式、すなわち（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００に従って決定されることになる。

【0073】

用語「脂質特性」および「脂質組成物」は同義であり、特定の脂質画分中、例えば全脂質画分またはオイル［「ＴＡＧ」］画分に含有される個々の脂肪酸の量を示し、ここでその量はＴＦＡのパーセントとして表される。混合物中に存在する各個別の脂肪酸の合計は１００である必要がある。

【0074】

用語「脂肪酸」は、約Ｃ_１２〜Ｃ_２２の可変鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を示すが、鎖長が長い方の酸および鎖長が短い方の酸の双方は既知である。主要な鎖長はＣ_１６〜Ｃ_２２である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」（式中、Ｘは特定の脂肪酸における炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、かつＹは二重結合の数である）の簡易な表記法によって表される。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「モノ不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、および「ω−６脂肪酸」［「ω−６」または「ｎ−６」］対「ω−３脂肪酸」［「ω−３」または「ｎ−３」］の間の区別についてのさらなる詳細は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書（ここでは参照により本明細書中に援用される）中に提供される。

【0075】

本明細書中のＰＵＦＡを記述するのに使用される命名法は表３に与えられる。「簡便な
表記法」という表題の列では、ω参照系を使用し、炭素の数、二重結合の数およびω炭素に最も近い二重結合の位置が示される（この目的のため、１と番号付けしたω炭素から数える）。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆体の一般名、本明細書を通して使用されることになる略語、ならびに各化合物の化学名がまとめられている。

【0076】

【表9】

【0077】

用語「高レベルＥＰＡの生成」は、微生物宿主の全脂質中で少なくとも約２５％のＥＰＡ、好ましくは全脂質中で少なくとも約３０％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約３５％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４０％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４０〜４５％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４５〜５０％のＥＰＡ、より好ましくは少なくとも約５０〜６０％、および最も好ましくは全脂質中で少なくとも約６０〜７０％のＥＰＡの生成を示す。したがって、ＥＰＡの構造的形態は限定的ではなく、例えばＥＰＡは、遊離脂肪酸として全脂質において、またはアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質もしくは糖脂質などのエステル化形態で存在しうる。

【0078】

用語「ＧＬＡが欠如する」は、約０．１％までの検出可能なレベルを有する機器を使用するＧＣ分析によって測定される場合での、微生物宿主の全脂質における約１％未満の検
出可能なＧＬＡを示す。

【0079】

用語「任意のＤＨＡが欠如した」は、約０．１％までの検出可能なレベルを有する機器を使用するＧＣ分析によって測定される場合での、微生物宿主の全脂質における任意の検出可能なＤＨＡの欠如を示す。

【0080】

生化学的な意味での代謝経路または生合成経路は、細胞により使用または保存されるべき代謝生成物の形成あるいは別の代謝経路（ここではフラックス生成ステップと称される）の開始のいずれかが生じるという酵素により触媒されて細胞内で順次生じる一連の化学反応として見なされうる。これらの経路の多数は複雑であり、初期物質を段階的に修飾し、それを所望の正確な化学構造を有する生成物に形成するステップを含む。

【0081】

「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸、ならびにＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝プロセスを示す。このプロセスは文献において十分な記載がなされている（例えばＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照）。このプロセスは、小胞体膜内に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と呼ばれる一連の特定の伸長および脱飽和酵素を介する、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長および二重結合の付加による分子の脱飽和を含む。より詳細には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼ、Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ、Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼ、および／またはＣ_{２０／２２}エロンガーゼを含む、ＰＵＦＡの生合成に関連した酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを示す。

【0082】

「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現される場合、ω−３およびω−６脂肪酸の一方または両方の生成を触媒する酵素をコードする遺伝子セットを示す。典型的には、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子はＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。ミリスチン酸の様々な中間体を介したＤＨＡへの変換をもたらす代表的な経路が図１Ａおよび図１Ｂに図示され、それはω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の供給源からいかに生成されうるかを示す。経路は、一方の部分がω−３脂肪酸を生成しかつ他方の部分がω−６脂肪酸を生成することになる場合の２つの部分に必然的に分かれる。ω−３脂肪酸のみを生成する部分は本明細書中でω−３脂肪酸生合成経路と称される一方、ω−６脂肪酸のみを生成する部分は本明細書中でω−６脂肪酸生合成経路と称されることになる。

【0083】

ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路と関連して本明細書で用いられる「機能的」という用語は、経路内の遺伝子の一部（または全部）が活性酵素を発現し、インビボでの触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能的ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」が、多数の脂肪酸生成物がこの経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とすることから、上の段落中のＰＵＦＡ生合成経路遺伝子のすべてが必要とされることを示唆しないことは理解されるべきである。

【0084】

用語「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、少なくとも１つのΔ９エロンガーゼおよび少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを最小限に含むことで、ＬＡおよびＡＬＡに由来するＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの、中間体脂肪酸としてのそれぞれＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡとの生合成を可能にするＰＵＦＡ生合成経路を示すことになる。他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現と共に、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡもまた合成されうる。

【0085】

用語「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」は、少なくとも１つのΔ６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ_{１８／２０}エロンガーゼを最小限に含むことで、ＬＡおよびＡＬＡに由来するＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの、中間体脂肪酸としてのそれぞれＧＬＡおよび／またはＳＴＡとの生合成を可能にするＰＵＦＡ生合成経路を示すことになる。他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼの発現と共に、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡもまた合成されうる。

【0086】

「中間体脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路内で生成される、この経路において意図される生成物脂肪酸に他の代謝経路酵素の作用によりさらに変換可能な任意の脂肪酸を示す。例えば、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を用いてＥＰＡが生成される場合、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡおよびＡＲＡが生成可能であり、これらの脂肪酸は他の代謝経路酵素の作用を介してＥＰＡにさらに変換されうることから「中間体脂肪酸」と考えられる。

【0087】

「副産物脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路内で生成される、経路で意図された脂肪酸生成物でも経路の「中間体脂肪酸」でもない任意の脂肪酸を示す。例えば、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を用いてＥＰＡが生成される場合、シアドン酸およびジュニペロン酸もまたΔ５デサチュラーゼのＥＤＡまたはＥｔｒＡのいずれかに対する作用によりそれぞれ生成されうる。それらは、いずれも他の代謝経路酵素の作用によりＥＰＡにさらに変換され得ないことから「副産物脂肪酸」と考えられる。

【0088】

用語「デサチュラーゼ」は、脱飽和し、すなわち１種以上の脂肪酸において二重結合を導入し、目的の脂肪酸または前駆体を生成しうるポリペプチドを示す。特定の脂肪酸を参照するのに本明細書を通してω参照系を用いるにもかかわらず、Δ系を用いて基質のカルボキシル末端から数えることによってデサチュラーゼの活性を示すことはより便利である。本明細書中では、１）ＥＤＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ；２）ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ；３）分子のカルボキシル末端から数えて１７番目および１８番目の炭素原子の間の脂肪酸を脱飽和し、例えばＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ；ならびに４）オレイン酸からＬＡの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼが特に興味深い。

【0089】

Δ−１７（Δ１７）デサチュラーゼとさらにΔ１５デサチュラーゼはまた、場合により、ω−６脂肪酸をそのω−３対応物に変換する（例えば、それぞれＬＡからＡＬＡまたはＤＧＬＡからＥＴＡおよびＡＲＡからＥＰＡの変換）その能力に基づき、「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」と称される。

【0090】

一部のデサチュラーゼは、２つ以上の基質に対して活性を有する。この能力に基づき、これらの酵素は、「単機能性」または「二機能性」のいずれかであるそれらのデサチュラーゼ活性に対してさらに分類されうる。脂肪酸デサチュラーゼの特異性を、適切な宿主を脂肪酸デサチュラーゼにおける遺伝子で形質転換し、かつ宿主の脂肪酸特性に対するその効果を測定することにより、経験的に判定することが望ましい場合がある。「酵素基質」とは、デサチュラーゼポリペプチドが活性部位で基質に結合し、ある反応様式でそれに作用することを意味する。

【0091】

用語「ＥｇＤ８」はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるΔ８デサチュラーゼ（配列番号１８および１９）であり、ＥｇＤ８は米国特許第７，２５６，０３３号明細書に記載される「Ｅｇ５」と称されるタンパク質に対して
１００％同一でかつ機能的に等価である。用語「ＥｇＤ８Ｓ」は、「ＥｇＤ８」として同定されるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼに由来する合成Δ８デサチュラーゼ（配列番号２０および２１）を示し、ここでＥｇＤ８Ｓは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された。ＥｇＤ８Ｓは、米国特許第７，２５６，０３３号明細書に記載される「Ｄ８ＳＦ」に対して１００％同一でかつ機能的に等価である。

【0092】

用語「ＥｇＤ８Ｍ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の合成Δ８デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ８Ｓ）に対して少なくとも１つの突然変異を有する突然変異体Δ８デサチュラーゼ（配列番号２２および２３）を示す。より詳細には、「変異」は任意の欠失、挿入および点突然変異（またはそれらの組み合わせ）を含みうるが、好ましい実施形態では、突然変異体ＥｇＤ８Ｍは突然変異体ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号２３）として記述される。詳細には、突然変異体ＥｇＤ８Ｓ−２３（米国特許出願公開第２００８−０１３８８６８Ａ１号明細書に記載）は、配列番号２１として示される合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ配列に対して次の２４個のアミノ酸変異、すなわち、４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、２９３ＬからＭ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡおよび４２２ＬからＱを含む。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））のデフォルトパラメータを使用する、配列番号２１の合成コドン最適化配列に対する突然変異体ＥｇＤ８Ｓ−２３アミノ酸配列（配列番号２３）のペアワイズアラインメントによると、４２２個のアミノ酸長にわたる２つのタンパク質の間での９４．３％の配列同一性および９７．９％のコンセンサスが示された。突然変異体ＥｇＤ８Ｓ−２３（配列番号２３）のΔ８デサチュラーゼ活性は、合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ（配列番号２１）のΔ８デサチュラーゼ活性に対して少なくともほぼ機能的に等価である。

【0093】

用語「ＥａＤ８」は、本明細書中で配列番号２４によってコードされる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３から単離されるΔ８デサチュラーゼ酵素（配列番号２５）を示す。同様に、用語「ＥａＤ８Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３に由来する合成Δ８デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号２６および２７）。ＥａＤ８およびＥａＤ８Ｓは米国特許出願第１２／０９９８１１号明細書（２００８年４月９日出願）に記載され、ＥａＤ８はその中で「ＥａＤ８Ｄｅｓ３」と称された。

【0094】

用語「ＥｇＤ５」は、本明細書中で配列番号３４によってコードされる、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号３５）を示す。同様に、用語「ＥｇＤ５Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ５デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号３６および３７）。ＥｇＤ５およびＥｇＤ５Ｓは、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６６７１号パンフレットに記載されている。

【0095】

本明細書における目的として、用語「ＲＤ５」は、本明細書中で配列番号３８によってコードされる、ペリディニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６から単離されるΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号３９）を示す。同様に、用語「ＲＤ５Ｓ」
は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ペリディニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６に由来する合成Δ５デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号４０および４１）。ＲＤ５およびＲＤ５Ｓは、米国特許出願第１１／７４８６３７号明細書（２００７年５月１５日出願）に記載されている。

【0096】

用語「ＥａＤ５」は、本明細書中で配列番号４２によってコードされる、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３から単離されるΔ５デサチュラーゼ酵素（配列番号４３）を示す。同様に、用語「ＥａＤ５Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３に由来する合成Δ５デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号４４および４５）。ＥａＤ５およびＥａＤ５Ｓは米国特許出願第１２／１１１２３７号明細書（２００８年４月２９日出願）に記載され、ＥａＤ５はその中で「ＥａＤ５Ｄｅｓ１」と称された。

【0097】

用語「突然変異体Δ５デサチュラーゼ」は、チトクロームｂ_５ドメインのＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＰＧＧ；配列番号１８２）モチーフ内部に少なくとも１つの突然変異を有する、本明細書中に記載のΔ５デサチュラーゼを示し、ここでは前記突然変異によってアミノ酸置換（保存的または非保存的のいずれか）がもたらされる。変異が任意のアミノ酸置換を含みうるが、突然変異体Δ５デサチュラーゼは好ましくは、Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１８２）およびＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘａａ（配列番号１８４）からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異体モチーフを含み、かつ突然変異体Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性は野生型Δ５デサチュラーゼのΔ５デサチュラーゼ活性に対して少なくともほぼ機能的に等価である。より好ましい突然変異体モチーフは、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＧＧＧ；配列番号１８５）、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＨＧＧ；配列番号１８６）、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＣＧＧ；配列番号１８８）、Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＨＷＧＧ；配列番号１８９）およびＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＨＰＧＳ；配列番号１８７）からなる群から選択され、例えば、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００および配列番号２０１として示されるΔ５デサチュラーゼを参照のこと。

【0098】

各「突然変異体Δ５デサチュラーゼ」は、「対応する野生型Δ５デサチュラーゼ」を有する。詳細には、突然変異体Δ５デサチュラーゼおよび対応する野生型Δ５デサチュラーゼは、（上記のように）野生型がチトクロームｂ_５ドメイン内部にＨＰＧＧ（配列番号１８２）モチーフを含むことになる一方、突然変異体がこのモチーフ内部に少なくとも１つの突然変異を含むことになる点を除いては同一のアミノ酸配列を共有する。

【0099】

突然変異体Δ５配列の酵素活性および特異的選択性が対応する野生型Δ５デサチュラーゼの場合と比較可能である（または活性が増大する）場合、突然変異体Δ５デサチュラーゼは対応する野生型Δ５デサチュラーゼに対して「少なくともほぼ機能的に等価で」ある。したがって、機能的に等価な突然変異体Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼの場合に対し、各酵素の「変換効率」が比較される場合、実質的に低下しないΔ５デサチュラーゼ活性を有することになる（すなわち、突然変異体Δ５デサチュラーゼは、野生型Δ５デサチュラーゼの酵素活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、および最も好ましくは少なくとも約９５％有することになる）。２つのポリペプチドのΔ５デサチュラーゼ活性は実質的に同一でありうる。好ましくは、突然変異体Δ５デサチュラーゼは、対応する野生型Δ５デサチュラーゼの場合と比較される場合、増大した酵素活性および特異的選択性を有する、すなわち野生型Δ５デサチュラーゼの酵素活性の少なくとも約１０１〜１０５％、より好ましくは少なくとも約１０６〜１１５％および最も好ましくは少なくとも約１１６〜１２５％を有することになる。

【0100】

用語「ＰａＤ１７」は、配列番号５０によってコードされるピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）から単離されるΔ１７デサチュラーゼ酵素（配列番号５１）を示す。同様に、用語「ＰａＤ１７Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来する合成Δ１７デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号５２および５３）。米国特許出願第１１／７７９９１５号明細書（２００７年７月１９日出願）に記載の分析に基づき、ＰａＤ１７およびＰａＤ１７Ｓは二機能性Δ１７デサチュラーゼとしてさらに分類される。詳細には、「二機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「二機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「一次Δ１７デサチュラーゼ活性」は、ＡＲＡをＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡをＥＴＡに優先的に変換するが、ＬＡをＡＬＡに変換する限られた能力をさらに有する（それ故、主にΔ１７デサチュラーゼ活性および限られたΔ１５デサチュラーゼ活性を示す）Δ１７デサチュラーゼを示す。それに対し、「単機能性Δ１７デサチュラーゼ」、「単機能性Δ１７デサチュラーゼ活性」または「排他的なΔ１７デサチュラーゼ活性」は、ＡＲＡをＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡをＥＴＡに変換できるがＬＡをＡＬＡに変換できないΔ１７デサチュラーゼを示す。

【0101】

用語「ＰｒＤ１７」は、配列番号４６によってコードされるフィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）から同定されるΔ１７デサチュラーゼ酵素（配列番号４７）を示す。それに対し、用語「ＰｒＤ１７Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）に由来する合成Δ１７デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号４８および４９）。ＰｒＤ１７およびＰｒＤ１７Ｓは二機能性Δ１７デサチュラーゼとして同定され、それらは米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書（２００７年４月１８日出願）および米国特許出願第１１／７７９９１５号明細書（２００７年７月１９日出願）に記載されている。

【0102】

用語「フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）」は、「フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）」と同義であり、また「イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）」と同義である。用語「ＦｍＤ１２」は、配列番号５４によってコードされるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離されるΔ１２デサチュラーゼ酵素（配列番号５５）を示す。ＦｍＤ１２は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ２７２５１５として記載されるイネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）Δ１２デサチュラーゼに一致する。同様に、用語「ＦｍＤ１２Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来する合成Δ１２デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号５６および５７）。ＦｍＤ１２は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレットに記載されている。

【0103】

本明細書中での特定の目的の他のデサチュラーゼは、１）ＬＡからＡＬＡおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、ならびに２）パルミチン酸塩からパルミトオレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼを含む。

【0104】

用語「ＦｍＤ１５」は、配列番号６２によってコードされるフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）から単離されるΔ１５デサチュラーゼ酵素（配列番号６３）を示す。ＦｍＤ１５は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＤＱ２７２５１６として記載されるイネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）Δ１５デサチュラーゼに一致する。同様に、用語「ＦｍＤ１５Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来する合成Δ１５デサチュラーゼを示す（すなわち配列番号６４および６５）。ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載の分析に基づくと、ＦｍＤ１５は二機能性Δ１５デサチュラーゼとしてさらに分類され、ＦｍＤ１５Ｓは同様に機能することが想定される。詳細には、「二機能性Δ１５デサチュラーゼ」、「二機能性Δ１５デサチュラーゼ活性」または「一次Δ１５デサチュラーゼ活性」は、ＬＡをＡＬＡに選択的に変換するが、オレイン酸をＬＡに変換する限られた能力をさらに有する（それ故、主にΔ１５デサチュラーゼ活性および限られたΔ１２デサチュラーゼ活性を示す）Δ１５デサチュラーゼを示す。それに対し、「単機能性Δ１５デサチュラーゼ」、「単機能性Δ１５デサチュラーゼ活性」または「排他的Δ１５デサチュラーゼ活性」は、ＬＡをＡＬＡに変換できるがオレイン酸をＬＡに変換できないΔ１５デサチュラーゼを示す。

【0105】

用語「ＹｌＤ９」は、配列番号６６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１４９６も参照）によってコードされるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるΔ９デサチュラーゼ酵素（配列番号６７）を示す。

【0106】

他の有用なＰＵＦＡデサチュラーゼは、１）ＬＡからＧＬＡおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、ならびに２）ＤＰＡからＤＨＡおよび／またはＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換を触媒するΔ４デサチュラーゼを含む。

【0107】

用語「エロンガーゼ」は、脂肪酸炭素鎖を伸長し、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質より２炭素分長い酸を生成可能であるポリペプチドを示す。この伸長プロセスは、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載のように、脂肪酸シンターゼと関連して多段階機構で行われる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例が、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、ＡＲＡからＤＴＡおよびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般的に、エロンガーゼの基質選択性はやや広範であるが、鎖長ならびに不飽和の程度およびタイプの双方によって区別される。例えば、Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼはＣ_１４基質（例えばミリスチン酸）を使用し、Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼはＣ_１６基質（例えばパルミチン酸塩）を使用し、Ｃ_{１８／２０}エロンガーゼ（同義に使用可能であることからΔ６エロンガーゼとしても知られる）はＣ_１８基質（例えばＧＬＡ、ＳＴＡ）を使用し、またＣ_{２０／２２}エロンガーゼはＣ_２０基質（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ）を使用することになる。同様に、Δ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡのそれぞれＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換を触媒可能である。

【0108】

一部のエロンガーゼが広範な特異性を有し、それ故に単一の酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒（例えばそれからＣ_{１６／１８}エロンガーゼおよびＣ_{１８／２０}エロンガーゼの双方として作用）可能でありうることに着目することは重要である。適切な宿主を脂肪酸エロンガーゼにおける遺伝子で形質転換し、宿主の脂肪酸特性に対するその効果を測定することによって脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが望ましい場合がある。

【0109】

用語「ＥｇＤ９ｅ」は、配列番号４によってコードされるユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されるΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号５）を示す。それに対し、用語「ＥｇＤ９ｅＳ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来する合成Δ９エロンガーゼを示す（すなわち配列番号６および７）。ＥｇＤ９ｅおよびＥｇＤ９ｅＳはＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレットに記載されている。

【0110】

用語「Ｅ３８９Ｄ９ｅ」は、配列番号８によってコードされるユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９から単離されるΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号９）を示す。それに対し、用語「Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９に由来する合成Δ９エロンガーゼを示す（すなわち配列番号１０および１１）。Ｅ３８９Ｄ９ｅおよびＥ３８９Ｄ９ｅＳはＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレットに記載されている。

【0111】

用語「ＥａＤ９ｅ」は、配列番号１２によってコードされるユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３から単離されるΔ９エロンガーゼ酵素（配列番号１３）を示す。同様に、用語「ＥａＤ９ｅＳ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３に由来する合成Δ９エロンガーゼを示す（すなわち配列番号１４および１５）。ＥａＤ９ｅおよびＥａＤ９ｅＳは米国特許出願第１２／１０２８７９号明細書（２００８年４月１５日出願）に記載され、ＥａＤ９ｅはその中で「ＥａＤ９Ｅｌｏ１」と称された。

【0112】

用語「ＥＬＯ３」は、パルミチン酸塩（１６：０）からステアリン酸（１８：０）への変換を優先的に触媒するｅｌｏ３遺伝子（配列番号５８）によってコードされるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Ｃ_{１６／１８}脂肪酸エロンガーゼ酵素（配列番号５９）を示す。ＥＬＯ３はＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレットに記載されている。それに関連し、用語「ＭＥ３Ｓ」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）に由来する合成Ｃ_{１６／１８}脂肪酸エロンガーゼを示す（すなわち配列番号６０および６１）。

【0113】

用語「変換効率」および「パーセント基質変換」は、特定の酵素、例えばデサチュラーゼまたはエロンガーゼが基質を産物に変換しうる効率を示す。変換効率は、次の式、すなわち（［産物］／［基質＋産物］）＊１００（式中、「産物」はそれに由来する経路内での中間産物および全産物を含む）に従って測定される。

【0114】

用語「アシルトランスフェラーゼ」は、アミノ−アシル基以外の基の移動に関与する酵素（ＥＣ２．３．１．−）を示す。

【0115】

用語「ＤＡＧ ＡＴ」は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（アシル−ＣｏＡ−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼとしても知られる）（ＥＣ２．３．１．２０）を示す。この酵素は、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロールのＴＡＧおよびＣｏＡへの変換に関与し、それ故にＴＡＧ生合成の最終ステップに関与する。ＤＡＧ ＡＴ酵素の２つのファミリーＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２が存在する。前者のファミリーはアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ［「ＡＣＡＴ」］遺伝子ファミリーと相同性を共有する一方、後者のファミリーは関連性がない（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（４２）：３８８６２−３８８６９頁（２００１年））。

【0116】

用語「ＹｌＤＧＡＴ２」は、配列番号９３によってコードされるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるＤＧＡＴ２酵素（配列番号９４）を示す。ＹｌＤＧＡＴ２は米国特許第７，２６７，９７６号明細書に記載されている。ＹｌＤＧＡＴ２タンパク質が（配列番号９３のヌクレオチド＋２９１〜＋１８３５に対応する）５１４アミノ酸残基長であり、それ故に配列番号９３内部の２つの追加的なネスト化ＯＲＦが切断形態の完全タンパク質のみをコードすることが判定されている。

【0117】

用語「ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ」は、ＣＤＰ−コリン由来のホスファチジルコリンおよび１，２−ジアシルグリセロールの合成を触媒する酵素（ＥＣ２．７．８．２）を示す。この酵素はホスファチジルコリン［「ＰＣ」］生合成に関与するＣＤＰ−コリン経路の一部である。

【0118】

用語「ＹｌＣＰＴ１」は、配列番号６８によってコードされるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ酵素（配列番号６９）を示す。ＹｌＣＰＴ１はＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットにおいて記載されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１７０３（ＹＡＬＩ０Ｃ１０９８９ｇ）も参照）。

【0119】

用語「ペルオキシソーム」は、すべての真核細胞内に見出される遍在オルガネラを示す。それは、その内容物を細胞質ゾルから分離しかつ下記の機能に必須の様々な膜タンパク質を含有する単一の脂質二重層膜を有する。ペルオキシソームは、タンパク質を「拡張シャトル機構（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｈｕｔｔｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）」を介して選択的に取り込む。より詳細には、ペルオキシンと称される少なくとも３２の既知のペルオキシソームタンパク質が存在し、それらはペルオキシソーム膜を介したＡＴＰ加水分解によってタンパク質を取り込むプロセスに関与する。一部のペルオキシンは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに、ペルオキシソーム膜を介した取り込みが生じるというシグナルを送る、特定のタンパク質シグナルすなわちペルオキシソーム標的化シグナルすなわち「ＰＴＳ」を含む。一旦、細胞タンパク質がペルオキシソーム内に取り込まれると、それらは典型的にはいくつかの分解手段に従う。例えば、ペルオキシソームは、細胞に対して毒性がある物質の分解を可能にする酸化酵素、例えばカタラーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび尿酸オキシダーゼなどを有する。あるいは、ペルオキシソームは、β酸化と称されるプロセスにおいて、脂肪酸分子を分解し、細胞質ゾルに再び輸送されるアセチル−ＣｏＡの遊離分子を生成する。

【0120】

用語「ペルオキシソーム生合成因子タンパク質」、「ペルオキシン」および「Ｐｅｘタンパク質」は同義であり、ペルオキシソーム生合成に関与し、および／またはペルオキシソーム膜を介したＡＴＰ加水分解によって細胞タンパク質を取り込むプロセスに関与するタンパク質を示す。これらのタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の頭文字は「Ｐｅｘ遺伝子」である。命名法については、Ｄｉｓｔｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３５：１−３頁（１９９６年）による記載がなされている。少なくとも３２の異なるＰｅｘ遺伝子が、これまで様々な真核生物内で同定されている。多数のＰｅｘ遺伝子が、異常なペルオキシソーム機能または構造を示した突然変異体の分析から単離されている。１７の異なる真菌種のゲノム配列のインシリコ分析が行われたＫｉｅｌ Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら（Ｔｒａｆｆｉｃ、７：１２９１−１３０３頁（２００６年））による概説に基づくと、次のＰｅｘタンパク質、すなわちＰｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂｐ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様およびＰｅｘ２６ｐが同定された。まとめると、これらのタンパク質は、本明細書中で「Ｐｅｘ遺伝子」によってコードされる「Ｐｅｘタンパク質」と称されることになる。

【0121】

「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整列された配列に沿う特定の位置に保存されたアミノ酸セットを意味する。他の位置でのアミノ酸が相同タンパク質間で異なりうる一方、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性において必須のアミノ酸を示す。それらがタンパク質相同体のファミリーの整列された配列内でのそれらの高度な保存によって同定されることから、それらを識別子または「署名」として使用し、新しく決定された配列を有するタンパク質が予め同定されたタンパク質ファミリーに属するか否かが判定されうる。本明細書において関連性がある、Δ５デサチュラーゼ酵素（すなわち動物、植物および真菌）中で見出されるモチーフは、３つのヒスチジンボックス（すなわちＨ（Ｘ）_３−４Ｈ［配列番号１９０および１９１］、Ｈ（Ｘ）_２−３ＨＨ［配列番号１９２および１９３］およびＨ／Ｑ（Ｘ）_２−３ＨＨ［配列番号１９４および１９５］）、ならびにＮ末端で融合されたチトクロームｂ_５ドメイン内部のヘム結合モチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＰＧＧ；配列番号１８２）を含む。同様に、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ１０ｐおよびＰｅｘ１２ｐの全部が、Ｃ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフとして知られる、それらのカルボキシル末端近傍のシステインリッチモチーフを共有する。このモチーフは、タンパク質ドッキングおよびペルオキシソームへの転位置（Ｋｉｅｌ Ｊ．Ａ．Ｋ．Ｗ．ら、Ｔｒａｆｆｉｃ，７：１２９１−１３０３頁（２００６年））に関与するそれらの活性にとって必要とされるように見られる。

【0122】

用語「Ｃ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフ」または「Ｃ_３ＨＣ_４モチーフ」は、一般的に、式Ｉ、すなわち
式Ｉ：ＣＸ_２ＣＸ_９−２７ＣＸ_１−３ＨＸ_２ＣＸ_２ＣＸ_４−４８ＣＸ_２Ｃ
に示されるアミノ酸の配列の存在によって同定される、２個の亜鉛イオンに結合する保存されたシステインリッチモチーフを示す。ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質（すなわちＹｌＰｅｘ１０ｐ）をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子内部のＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフは、配列番号１０４のアミノ酸３２７〜３６４の間に位置し、ＣＸ_２ＣＸ_１１ＣＸ_１ＨＸ_２ＣＸ_２ＣＸ_１０ＣＸ_２Ｃモチーフ（配列番号１１９）によって規定される。ペルオキシソーム生合成因子２タンパク質（すなわちＹｌＰｅｘ２ｐ）をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子内部のＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフは、配列番号９６のアミノ酸２６６〜３２３の間に位置する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ペルオキシソーム生合成因子１２タンパク質（すなわちＹｌＰｅｘ１２ｐ）は、配列番号１０５のアミノ酸３４２〜３９１の間に位置する不完全なＣ_３ＨＣ_４リングフィンガーモチーフを有する。ＹｌＰｅｘ１０、ＹｌＰｅｘ２およびＹｌＰｅｘ１２のＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフに対応するタンパク質配列は図２Ａ中に整列され、アスターリスクはモチーフの保存されたシステインまたはヒスチジン残基に対応する。

【0123】

ＹｌＰｅｘ１０、ＹｌＰｅｘ２およびＹｌＰｅｘ１２は、タンパク質−タンパク質相互作用によってリングフィンガー複合体を形成すると考えられる。２個の亜鉛残基を有するＹｌＰｅｘ１０ｐ Ｃ_３ＨＣ_４フィンガーモチーフのシスチンおよびヒスチジン残基の間での提示される相互作用が図２Ｂ中に略図化される。

【0124】

用語「Ｐｅｘ１０」は、ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質またはペルオキシソームアセンブリタンパク質Ｐｅｒｏｘｉｎ１０をコードする遺伝子を示し、ここでペルオキシンタンパク質は以降「Ｐｅｘ１０ｐ」と称されることになる。Ｐｅｘ１０ｐの機能は明確に解明されていないが、他の生物における研究によると、Ｐｅｘ１０産物がペルオキシソーム膜内に局在化され、オルガネラの正常な機能に不可欠であることが示されている。Ｃ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフは、Ｐｅｘ１０ｐのＣ末端領域内に保存されるように見られ（Ｋａｌｉｓｈ Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１５：６４０６−６４１９頁（１９９５年）；Ｔａｎ Ｘ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２８：３０７−３１９頁（１９９５年）；Ｗａｒｒｅｎ Ｄ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６３：３４７−３５９頁（１９９８年））、酵素活性にとって必要とされる。

【0125】

用語「ＹｌＰｅｘ１０」は、ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を示し、ここで同タンパク質は以降「ＹｌＰｅｘ１０ｐ」と称されることになる。この特定のペルオキシンは最近Ｓｕｍｉｔａらによって研究された（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２１４：３１−３８頁（２００２年））。ＹｌＰｅｘ１０のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６（配列番号１０４）、ＡＢ０３６７７０（配列番号１１４、１１５および１１６）およびＡＪ０１２０８４（配列番号１１７および１１８）を含む複数の登録番号の下でＧｅｎＢａｎｋに登録された。配列番号１１８に示されるＹｌＰｅｘ１０ｐ配列は３５４アミノ酸長である。それに対し、１００％相同な配列が（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２０８４（配列番号１１８）で同定された開始コドンとは異なるものに対応する）タンパク質のＮ末端に追加的な２３個のアミノ酸を有することから、配列番号１０４および配列番号１１６に示されるＹｌＰｅｘ１０ｐ配列はそれぞれ３７７アミノ酸長である。

【0126】

天然Ｐｅｘ遺伝子におけるまたはそれに関連した用語「破壊」は、遺伝子の一部の内部での挿入、欠失、または標的化突然変異を示し、その結果、遺伝子がゲノムから欠失されかつタンパク質が全く翻訳されないような完全遺伝子ノックアウトか、あるいは挿入、欠失、アミノ酸置換または他の標的化突然変異を有する翻訳されたＰｅｘタンパク質が生じる。タンパク質における破壊の位置は、例えばタンパク質のＮ末端部分の内部またはタンパク質のＣ末端部分の内部でありうる。破壊されたＰｅｘタンパク質は、破壊されなかったＰｅｘタンパク質に対して低下した活性を有することになり、非機能的でありうる。Ｐｅｘタンパク質をコードする天然遺伝子における破壊はまた、Ｐｅｘタンパク質の発現の低下または欠如をもたらす代替手段を含む例えばそれは調節配列、転写および翻訳因子、および／またはシグナル形質導入経路の操作を介してかあるいはセンス、アンチセンスまたはＲＮＡｉ技術などの使用によって生じうる。

【0127】

用語「油性である」は、エネルギー源をオイルの形態で保存する傾向がある生物を示す（Ｗｅｅｔｅ「Ｉｎ：Ｆｕｎｇａｌ Ｌｉｐｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。用語「油性酵母」は、オイルすなわちＴＡＧを生成しうる酵母として分類される微生物を示す。一般的に、油性微生物の細胞のオイルまたはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、ここで脂質の濃度は、後期対数または早期静止成長期で最大に達するまで増加し、次いで後期静止および死滅期の間に漸減する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：４１９−２５頁（１９９１年））。油性微生物においては、オイルとしてその乾燥細胞重量の約２５％超で蓄積することはまれではない。油性酵母の例として、決して限定されないが、次の属、すなわちヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。

【0128】

用語「発酵性炭素源」は、微生物が代謝によってエネルギーを生じさせることになる炭素源を意味する。典型的な炭素源は、限定はされないが、単糖類、オリゴ糖、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、
二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩および炭素含有アミンを含む。

【0129】

本明細書で使用される用語「単離核酸断片」、「単離核酸分子」および「遺伝子コンストラクト」は、同義に使用され、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを示すことになる。ＤＮＡのポリマーの形態での単離核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含みうる。

【0130】

アミノ酸またはヌクレオチド配列の「大部分」は、当業者による配列のマニュアル評価またはＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用するコンピュータによる自動化された配列比較および同定のいずれかによってポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するためのポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を十分に含む部分である。一般的に、１０以上の隣接アミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列はポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子に対して相同なものとして推定的に同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブが、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離、例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーションの配列に依存した方法で使用されうる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドが、プライマーを含む特定の核酸断片を得るためのＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用されうる。したがって、ヌクレオチド配列の「大部分」は、同配列を含む核酸断片の特異的同定および／または単離を行うのに十分な配列を含む。

【0131】

用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに対して相補的であり、かつシトシンはグアニンに対して相補的である。

【0132】

「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列をもたらすことなくヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンを使用する場合での特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現を意図して遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。

【0133】

「合成遺伝子」は、当業者に既知の方法を用いて化学合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから構築されうる。これらのオリゴヌクレオチドビルディングブロックはアニールされ、次いでライゲートされ、遺伝子セグメントが形成され、次いでそれは酵素的に構築され、全遺伝子が作成される。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスに反映させるためのヌクレオチド配列の最適化に基づく最適な遺伝子発現に対して適合されうる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれるコドンに向けてバイアスされる場合、遺伝子発現が奏功する可能性を理解している。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能な場合、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づきうる。例えば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるコドン使用特性は米国特許第７，１２５，６７２号明細書中に提供される。

【0134】

「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸断片を示し、コード領域単独を示すか、またはコード配列の上流の調節配列（５’非コード配列）および下流の調節配列（３’非コード配列）を含みうる。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然に見出されない調節およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来の調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが天然に見出される場合とは異なる様式で配列された調節配列およびコード配列を含みうる。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内の天然の位置に存在する天然遺伝子を示す。「外来」遺伝子は、遺伝子導入により宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物に導入される天然遺伝子、天然宿主内の新たな位置に導入される天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム内に導入されている遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度を再現するように設計されたコドン使用の頻度を有する遺伝子である。

【0135】

「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、かつ転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を示す。調節配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’未翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位および翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。

【0136】

「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来しうるか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なる因子からなり得るか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含みうる。異なるプロモーターが、異なる組織内もしくは細胞種内で、または発生の異なるステージで、または異なる環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を誘導しうることは当業者により理解されている。。ほぼ常に大部分の細胞種内で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。たいていの場合、調節配列の正確な境界が完全に画定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうることがさらに理解される。

【0137】

用語「ＧＰＤプロモーター」または「ＧＰＤプロモーター領域」は、ｇｐｄ遺伝子によってコードされるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．１．２．１．１２）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤプロモーター領域の例が米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されている。

【0138】

用語「ＧＰＤＩＮプロモーター」または「ＧＰＤＩＮプロモーター領域」は、ｇｐｄ遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域＋ｇｐｄ遺伝子のイントロンを有する５’コード領域の一部を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤＩＮプロモーター領域の例が米国特許出願公開第２００６／００１９２９７−Ａ１号明細書に記載されている。

【0139】

用語「ＧＰＭプロモーター」または「ＧＰＭプロモーター領域」は、ｇｐｍ遺伝子によってコードされるホスホグリセレートムターゼ酵素（ＥＣ５．４．２．１）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＭプロモーター領域の例が米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されている。

【0140】

用語「ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮプロモーター」または「ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮプロモーター領
域」は、「ＧＰＭプロモーター」およびＦＢＡＩＮプロモーター（下記）内部に含まれるイントロンの融合体を含むキメラプロモーターを示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮプロモーター領域の例が米国特許第７，２０２，３５６号明細書に記載されている。

【0141】

用語「ＦＢＡプロモーター」または「ＦＢＡプロモーター領域」は、ｆｂａ１遺伝子によってコードされるフルクトース二リン酸アルドラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２．１３）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡプロモーター領域の例が米国特許第７，２０２，３５６号明細書に記載されている。

【0142】

用語「ＦＢＡＩＮプロモーター」または「ＦＢＡＩＮプロモーター領域」は、ｆｂａ１遺伝子の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域＋ｆｂａ１遺伝子のイントロンを有する５’コード領域の一部を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮプロモーター領域の例が米国特許第７，２０２，３５６号明細書に記載されている。

【0143】

用語「ＦＢＡＩＮｍプロモーター」または「ＦＢＡＩＮｍプロモーター領域」は、ＦＢＡＩＮプロモーターの改良バージョンを示し、ここでＦＢＡＩＮｍはＦＢＡＩＮプロモーターのＡＴＧ翻訳開始コドンとイントロンの間に５２ｂｐの欠失（それによりＮ末端の２２個のみのアミノ酸を含む）およびイントロンの後に新しい翻訳コンセンサスモチーフを有する。さらに、ＦＢＡＩＮプロモーターが発現されるべき遺伝子のコード領域と融合される場合に融合タンパク質を生成する一方、ＦＢＡＩＮｍプロモーターはかかる融合タンパク質を生成しない。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーター領域の例が米国特許第７，２０２，３５６号明細書に記載されている。

【0144】

用語「ＧＰＡＴプロモーター」または「ＧＰＡＴプロモーター領域」は、ｇｐａｔ遺伝子によってコードされるグリセロール−３−リン酸−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１５）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＡＴプロモーター領域の例が米国特許第７，２６４，９４９号明細書に記載されている。

【0145】

用語「ＹＡＴ１プロモーター」または「ＹＡＴ１プロモーター領域」は、ｙａｔ１遺伝子によってコードされるアンモニウムトランスポーター酵素（ＴＣ２．Ａ．４９；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０４４５７）の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＹＡＴ１プロモーター領域の例が米国特許出願公開第２００６／００９４１０２−Ａ１号明細書に記載されている。

【0146】

用語「ＥＸＰ１プロモーター」または「ＥＸＰ１プロモーター領域」は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）「ＹＡＬＩ０Ｃ１２０３４ｇ」遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１７４５）によってコードされるタンパク質の「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前の、発現にとって必要な５’上流未翻訳領域を示す。「ＹＡＬＩ０Ｃ１２０３４ｇ」のｓｐ｜Ｑ１２２０７サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）非古典的輸送タンパク質２（その機能は切断可能なシグナル配列のないタンパク質の輸送の新規経路に関与する）に対する有意な相同性に基づき、この遺伝子は本明細書中でＥＸＰ１と称されるタンパク質をコードするｅｘｐ１遺伝子と称される。適切なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＥＸＰ１プロモーター領域の例がＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。

【0147】

「イントロン」は、大部分の真核生物において（コード領域、５’非コード領域、または３’非コード領域のいずれかにおける）遺伝子配列内に見出される非コードＤＮＡの配列である。それらの全機能は未知であるが、一部のエンハンサーがイントロン内に位置する（Ｇｉａｃｏｐｅｌｌｉ Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．、１１：９５−１０４頁（２００３年））。これらのイントロン配列は転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前にプレｍＲＮＡ転写産物内部から除去される。このイントロン除去のプロセスは、イントロンのいずれかの側上の配列、すなわちエクソンの自己スプライシングによって生じる。

【0148】

用語「エンハンサー」は、隣接真核プロモーターからの転写のレベルを上昇させ、それにより遺伝子の転写を高めうるシス調節配列を示す。エンハンサーは、数十キロベースものＤＮＡにわたってプロモーターに作用し、それらが調節するプロモーターに対する５’または３’側でありうる。エンハンサーはまた、イントロン内部に位置しうる。

【0149】

「３’非コード配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を示す。これは、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に作用可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸経路のｍＲＮＡ前駆体の３’末端への付加に作用することにより特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えうる。

【0150】

「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を示す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写産物と称されるか、またはそれは一次転写産物の転写後プロセシングから誘導されるＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロン内部に存在しかつ細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡを示す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに対して相補的でありかつそれから誘導される二本鎖ＤＮＡを示す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むことから細胞によってタンパク質に翻訳されうるＲＮＡ転写産物を示す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部に対して相補的でありかつ標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物を示す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の部分で、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列で生じうる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されなくても細胞プロセスに対して効果を有する他のＲＮＡを示す。

【0151】

「作動可能に連結される」という用語は、単一の核酸断片上での核酸配列の、一方の機能が他方から作用を受けるような結合を示す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に作用可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結されうる。

【0152】

本明細書で使用される用語「発現」は、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示しうる。

【0153】

「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングを受けたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物中に存在する任意のプレまたはプロペプチドが除去されているものを示す。「前駆体」タンパク質はｍＲＮＡの翻訳の一次産物を示す、すなわちそこではプレおよびプロペプチドが依然として存在する。プレおよびプロペプチドは、限定はされないが細胞内局在化シグナルでありうる。

【0154】

用語「リコンビナーゼ」は、部位特異的組換えを行い、ＤＮＡ構造を改変する酵素を示し、トランスポーゼース、ラムダ組み込み／切断酵素、ならびに部位特異的リコンビナーゼを含む。

【0155】

「リコンビナーゼ部位」または「部位特異的リコンビナーゼ配列」は、リコンビナーゼが認識しかつ結合することになるＤＮＡ配列を意味する。機能性が維持され、かつリコンビナーゼ酵素がさらにリコンビナーゼ部位を認識し、ＤＮＡ配列に結合し、また２つの隣接リコンビナーゼ部位の間の組換えを触媒しうる限り、これが野生型または突然変異体のリコンビナーゼ部位でありうることは理解されるであろう。

【0156】

「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝的形質をもたらす、核酸分子の宿主生物への移動を示す。核酸分子は例えば自己複製するプラスミドであり得るか、または宿主生物のゲノムに組み込まれうる。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と称される。

【0157】

「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を運ぶことが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態をとる余分な染色体因子を示す。かかる因子は、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ、あるいは任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの線状または環状のヌクレオチド配列であり得、ここでは、多数のヌクレオチド配列に対し、発現カセットを細胞に導入可能な固有の作成物への連結または組換えが施されている。

【0158】

用語「発現カセット」は、選択される遺伝子のコード配列ならびに選択される遺伝子産物の発現に必要とされるコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含むＤＮＡの断片を示す。したがって、発現カセットは、典型的には１）プロモーター配列、２）コード配列（すなわちＯＲＦ）、および３）真核生物においては通常ポリアデニル化部位を有する３’未翻訳領域（すなわちターミネーター）で構成される。発現カセットは通常ベクター内部に含まれ、クローニングおよび形質転換を促進する。異なる発現カセットは、細菌、酵母、植物および哺乳類細胞を含む異なる生物に、正確な調節配列が各宿主に対して使用される限り、形質転換されうる。

【0159】

用語「相同組換え」は、（クロスオーバーの間での）２つのＤＮＡ分子間でのＤＮＡ断片の交換を示す。交換される断片は、２つのＤＮＡ分子間での同一のヌクレオチド配列の部位（すなわち「相同性の領域」）に隣接される。用語「相同性の領域」は、相互に相同性を有する、相同組換えに関与する核酸断片に対するヌクレオチド配列のストレッチを示す。有効な相同組換えは、一般的には、これらの相同性の領域が少なくとも約１０ｂｐ長である場合、少なくとも約５０ｂｐ長が好ましい場合に生じることになる。典型的には、組換えが意図される断片は、標的化される遺伝子破壊または置換が所望される場合、少なくとも２つの相同性の領域を有する。

【0160】

用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列分析ソフトウェア」は市販されるかまたは独立に開発される場合がある。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定はされないが、１）一連のＧＣＧプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））；および５）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを内蔵したＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０頁．Ｅｄｉｔｏｒ：Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含むことになる。本願との関連の中で、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、他に規定がなければ、分析の結果が参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることが理解されるであろう。本明細書で使用される「デフォルト値」は、最初に初期化される場合、ソフトウェアに最初に読み込まれる任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。

【0161】

本明細書で用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以降「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）発行（１９８７年）「Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ：Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｏｆ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌｓ」によって記載されている。

【0162】

一般に、油性微生物内での脂質蓄積が、成長培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応答して誘発される。油性微生物内での遊離パルミチン酸塩（１６：０）のデノボ合成をもたらすこのプロセスは、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に詳細に記載されている。パルミチン酸塩は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆体である（図１Ａおよび図１Ｂ）。

【0163】

ＴＡＧ（脂肪酸の主要な蓄積単位（ｓｔｏｒａｇｅ ｕｎｉｔ））は、１）リゾホスファチジン酸を生成するための、アシルトランスフェラーゼを介した１分子のアシル−ＣｏＡからグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化；２）（一般にホスファチジン酸として同定される）１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩を生成するための、アシルトランスフェラーゼを介した第２の分子のアシル−ＣｏＡのエステル化；３）１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］を生成するための、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去；および４）ＴＡＧを形成するための、アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加、を含む一連の反応により形成される。

【0164】

広域スペクトルの脂肪酸が、飽和および不飽和脂肪酸ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含むＴＡＧに取り込まれうる。アシルトランスフェラーゼによってＴＡＧに取り込まれうる脂肪酸のいくつかの非限定例として、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、バクセン酸（１８：１）、ＬＡ、エレオステアリン酸（１８：３）、ＡＬＡ、ＧＬＡ、アラキン酸（２０：０）、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ベヘン酸（２２：０）、ＤＰＡ、ＤＨＡ、リグノセリン酸（２４：０）、ネルボン酸（２４：１）、セロチン酸（２６：０）およびモンタン酸（２８：０）の脂肪酸が挙げられる。本明細書中に記載の方法および宿主細胞においては、ＥＰＡのＴＡＧへの取り込みが最も望ましい。

【0165】

大部分のＰＵＦＡが中性脂質としてＴＡＧに取り込まれ、脂質体中に貯蔵されるが、油性生物内部での全ＰＵＦＡの測定にはホスファチジルコリン画分、ホスファチジル−エタノールアミン画分、および（ＴＡＧまたはオイルとしても知られる）トリアシルグリセロール画分中に位置するＰＵＦＡが含まれる必要があることに注目することは重要である。

【0166】

ＥＰＡ、ω−３脂肪酸の最適化された生合成
オレイン酸がＥＰＡに変換される代謝過程は、炭素原子の付加を介した炭素鎖の伸長および二重結合の付加を介した分子の脱飽和を含む。これは小胞体膜内に存在する一連の特別な脱飽和および伸長酵素を必要とする。しかし、図１Ａおよび図１Ｂならびに下記に見られるように、ＥＰＡの生成においては複数の代替経路が存在する。

【0167】

詳細には、図１Ａおよび図１Ｂは下記の経路を示す。すべての経路が、Δ１２デサチュラーゼによるオレイン酸からω−６脂肪酸の最初のリノール酸［「ＬＡ」］への初期変換を必要とする。次いで、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用し、長鎖ω−６脂肪酸が次のようにして形成される。すなわち、１）ＬＡはΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換され、２）ＥＤＡはΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換され、３）ＤＧＬＡはΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換され、４）ＡＲＡはＣ_{２０／２２}エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換され、また５）ＤＴＡはΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。

【0168】

「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を使用し、次のようにして長鎖ω−３脂肪酸を生成しうる。すなわち、１）ＬＡはΔ１５デサチュラーゼによってω−３脂肪酸の最初のＡＬＡに変換され、２）ＡＬＡはΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換され、３）ＥＴｒＡはΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換され、４）ＥＴＡはΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換され、５）ＥＰＡはＣ_{２０／２２}エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換され、また６）ＤＰＡはΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。場合により、ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に変換されうる。例えば、ＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性により、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成される。本明細書における目的として有利には、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、有意な量のγ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］が欠如したＥＰＡオイルの生成を可能にする。

【0169】

ω−３／ω−６脂肪酸の生合成のための代替経路として、Δ６デサチュラーゼおよびＣ_{１８／２０}エロンガーゼ、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」が使用される。より詳細には、ＬＡおよびＡＬＡは、Δ６デサチュラーゼにより、それぞれＧＬＡおよびステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換可能であり、次いでＣ_{１８／２０}エロンガーゼはＧＬＡをＤＧＬＡおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。

【0170】

ＥＰＡの生成にとって好ましい微生物宿主：ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
ＥＰＡの生成を意図してヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙ
ｔｉｃａ）への導入が必要とされる特定の機能性が、宿主細胞およびその天然ＰＵＦＡ特性および／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼ特性、基質の可用性、ならびに所望される最終産物に依存することになると考えられる。天然宿主細胞については、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が１８：２脂肪酸を天然に生成可能であり、それ故に天然Δ１２デサチュラーゼ（配列番号１および２；米国特許第７，２１４，４９１号明細書を参照）を有することが知られている。

【0171】

ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載のように、ＧＬＡの同時合成を伴わずに高濃度のＥＰＡを生成可能な組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の生成には、最低限、次の遺伝子、すなわちΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよびΔ１７デサチュラーゼまたはΔ１５デサチュラーゼの片方（または双方）の発現が必要とされ、ここでは次の遺伝子、すなわちΔ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ_{１４／１６}エロンガーゼおよびＣ_{１６／１８}エロンガーゼの中の少なくとも１つが場合によってさらに発現されうる。デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択するためのその中に提示される検討事項は、１）ポリペプチドの基質特異性、２）ポリペプチドまたはその成分が律速酵素であるか否か、３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望されるＰＵＦＡの合成にとって必須であるか否か、４）ポリペプチドによって必要とされる共同因子、５）ポリペプチドがその生成後に例えばキナーゼまたはプレニルトランスフェラーゼによって修飾されるか否か、および／または６）特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を含んだ。

【0172】

全脂質画分中で例えば１４％〜５３．２％超のＥＰＡを生成する能力を有する最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株が生成される本出願では、株は最低限、次のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子、すなわち
ａ）Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｃ）Δ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｄ）Δ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｅ）Δ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および
ｆ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子
を含む。

【0173】

より好ましい組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ１）をコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含む。より好ましい組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、Δ１５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、および／またはΔ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含む。高レベルでＥＰＡを生成可能な最適化されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株において必要とされる要素のさらなる態様が下記に詳述され、ここで最適化された株は、組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）宿主細胞の、全脂質中で少なくとも約２５％のＥＰＡ、好ましくは全脂質中で少なくとも約３０％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約３５％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４０％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４０〜４５％のＥＰＡ、より好ましくは全脂質中で少なくとも約４５〜５０％のＥＰＡ、より好ましくは少なくとも約５０〜６０％、および最も好ましくは少なくとも約６０〜７０％のＥＰＡを生成することになる。

【0174】

他の実施形態では、本明細書中に記載の最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、全脂質中で少なくとも約２５％のＥＰＡを含有し、かつ全脂質中で約１％未満のＧＬＡを含有し、かつＤＨＡを全く含有しない微生物オイルを生成することになる。

【0175】

別の実施形態では、本明細書中に記載の最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、全脂質中で少なくとも約３０％のＥＰＡを含有し、かつ全脂質中で約２５％未満のＬＡを含有する微生物オイルを生成することになる。

【0176】

好ましい一実施形態では、本明細書中に記載の最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、乾燥細胞重量に対して少なくとも約１２％の微生物オイルを生成することになる。

【0177】

別の好ましい実施形態では、本明細書中に記載の最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、全脂肪酸のパーセントとしての少なくとも約５０％のω−３ ＰＵＦＡを生成することになる。

【0178】

最適化されたＥＰＡ生合成における好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子
出願人は、様々なΔ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼおよびＣ_{１６／１８}エロンガーゼの徹底した分析を行い、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現される場合に最適な基質特異性および／または基質選択性を有する酵素を判定している。これらの分析に基づき、表４中に記載のそれに由来する遺伝子およびコドン最適化遺伝子は、本明細書中で、高レベルのＥＰＡ生合成を可能にするω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の作成におけるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にとって好ましいものとして同定されている。各遺伝子に関するさらなる詳細は後に詳述される。

【0179】

下の表４に示されるように、記述される多数の好ましいＥＰＡ生合成遺伝子は、米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載のように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化されている。当業者に周知のように、異種遺伝子の発現は、選択される宿主微生物内での最適な遺伝子発現を目的とする場合、天然遺伝子におけるコドンの置換によるコードされるｍＲＮＡの翻訳効率の向上によって促進されうる。さらに、効率的な酵母翻訳開始配列を含めることで最適な遺伝子発現を得るため、合成コドン最適化遺伝子の翻訳開始コドン「ＡＴＧ」周囲のヌクレオチド配列は、「ＡＴＧ」開始コドンの周囲に次の共通配列、すなわち「ＭＡＭＭＡＴＧＮＨＳ」（配列番号３）を含むように改変されることが多く、ここで使用される核酸縮重コードは次の通りである。Ｍ＝Ａ／Ｃ；Ｓ＝Ｃ／Ｇ；Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ；およびＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ。

【0180】

【表10】

【0181】

【表11】

【0182】

【表12】

【0183】

ＬＡからＥＤＡおよび／またはＡＬＡからＥＴｒＡへの変換のためのΔ９エロンガーゼ
をコードする少なくとも１つの遺伝子：ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ９エロンガーゼが米国特許出願公開第２００７−０１１７１９０Ａ１号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレットにおいて単離され、特徴づけられた。その中でＥｇＤ９ｅと称されたコード領域は７７７ｂｐ長であり（配列番号４）、２５８個のアミノ酸（配列番号５）のタンパク質をコードする。引用された刊行物に記載のように、ＥｇＤ９ｅのΔ９エロンガーゼ活性は、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）由来の合成Δ９エロンガーゼ遺伝子［「ＩｇＤ９ｅＳ」］と比較され（ＩｇＤ９ｅ；ＮＣＢＩ登録番号ＡＡＬ３７６２６［ＧＩ１７２２６１２３］、遺伝子座ＡＡＬ３７６２６、ＣＤＳ ＡＦ３９０１７４；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３９０１７４）（ＣＤＳ＝ヌクレオチド２〜７９３））、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された。ＥｇＤ９ｅは、ＬＡからＥＤＡへの変換時、ＩｇＤ９ｅＳより高い基質変換効率で機能した（１０．０％対６．９％）。

【0184】

ＥｇＤ９ｅのコドン最適化の結果、ＥｇＤ９ｅＳ（配列番号６）が得られた。翻訳開始部位の修飾に加え、７７７ｂｐの中の１１７ｂｐのコード領域が修飾され（１５．１％）、１０６のコドンが最適化された（しかし、コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列［すなわち配列番号７］は野生型タンパク質配列［すなわち配列番号５］の場合に一致する）。ＥｇＤ９ｅＳは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現される場合、ＬＡをＥＤＡに伸長するのに野生型ＥｇＤ９ｅより約１６．２％効率的であった。

【0185】

ユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９Δ９エロンガーゼの単離および特徴づけについても米国特許出願公開第２００７−０１１７１９０Ａ１号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレットに記載されている。Ｅ３８９Ｄ９ｅコード領域は７９２ｂｐ長であり（配列番号８）、２６３個のアミノ酸（配列番号９）のタンパク質をコードする。Ｅ３８９Ｄ９ｅおよびＥｇＤ９ｅタンパク質配列は、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ）＝５およびギャップ長ペナルティ＝１０）を有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｖ分析法（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ Ｐ．Ｍ．、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９−１９１頁（１９９２年））を用いると、６５．１％の同一性を共有する。Ｅ３８９Ｄ９ｅは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現される場合、約１１％のＬＡをＥＤＡに変換した。

【0186】

Ｅ３８９Ｄ９ｅのコドン最適化の結果、７９２ｂｐの中の１２８ｂｐのコード領域が修飾され（１６．２％）、１１３のコドンが最適化された。これにより、ＧＣ含量がＥ３８９Ｄ９ｅ内部の４５．７％からＥ３８９Ｄ９ｅＳ（配列番号１０）内部の５０．１％に増加した。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号１１）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号９）の場合に一致する。Ｅ３８９Ｄ９ｅＳは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で発現される場合、１２％ＬＡをＥＤＡに伸長させた。

【0187】

最近では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３Δ９エロンガーゼ（ＥａＤ９ｅ）の単離および特徴づけについては米国特許出願第１２／１０２８７９号明細書に記載された（またその中でＥａＤ９Ｅｌｏ１と称された）。ＥａＤ９ｅコード領域は７７４ｂｐであり（配列番号１２）、２５８個のアミノ酸（配列番号１３）のタンパク質をコードする。ＥａＤ９ｅは、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（上記）を有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を使用するＣｌｕｓｔａｌＶ分析法（上記）によると、ＩｇＤ９ｅと３２．９％の配列同一性およびＥｇＤ９ｅと７７．１％の配列同一性を共有する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥａＤ９ｅの発現時、２２．７％Δ９伸長の平均が、次の式、すなわち（［ＥＤＡ］／［ＬＡ＋ＥＤＡ］）＊１００に基づいて報告された。その後、出願人の実験室において他のクローニングベクター内でヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥａＤ９ｅの発現を行った結果、１２％Δ９伸長が得られた。

【0188】

ＥａＤ９ｅＳ（配列番号１４）の合成の間、翻訳開始部位の修飾に加え、７７４ｂｐの中の１０６ｂｐのＥａＤ９ｅコード領域が修飾され（１３．７％）、９８のコドンが最適化された（３８．０％）。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号１５）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号１３）の場合に一致する。ＥａＤ９ｅＳは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現される場合、１３％ＬＡをＥＤＡに伸長させた。

【0189】

ＥＤＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換のためのΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離され、誘導されるいくつかのΔ８デサチュラーゼは本明細書において好ましい。米国特許第７，２５６，０３３号明細書は、ＥＤＡおよびＥｔｒＡ（その中で「Ｅｇ５」と称される）を脱飽和可能なユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼについて開示している。野生型ユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼは、Ｅｇ５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と１００％同一でかつ機能的に等価であるが、本明細書中で「ＥｇＤ８」と称されることになる。ＥｇＤ８コード領域は１２６３ｂｐ長（すなわち配列番号１８のヌクレオチド４〜１２６９）であり、４２１個のアミノ酸（配列番号１９）のタンパク質をコードする。

【0190】

米国特許第７，２５６，０３３号明細書はまた、ＥｇＤ８に由来しかつヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された合成Δ８デサチュラーゼを開示している（その中で「Ｄ８ＳＦ」と称される）。コドン最適化されたユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼは、Ｄ８ＳＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と１００％同一でかつ機能的に等価であるが、本明細書中で「ＥｇＤ８Ｓ」と称されることになる（配列番号２０および２１）。詳細には、１２６３ｂｐの中の２０７ｂｐ（１６．４％）のＥｇＤ８のコード領域は修飾され、それは１９２のコドンのコドン最適化に対応した。さらに、ＥｇＤ８Ｓは野生型ＥｇＤ８のアミノ酸残基１および２の間に挿入された１個の追加的なバリンアミノ酸を有し、それ故、ＥｇＤ８Ｓの全長は４２２個のアミノ酸である（配列番号２１）。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥｇＤ８Ｓの発現は、ＥｇＤ８より効率的なＥＤＡからＤＧＬＡへの脱飽和を示した。

【0191】

ＥｇＤ８およびＥｇＤ８Ｓが有用であるにもかかわらず、本明細書中でＥｇＤ８Ｍとして同定された合成的に改変された突然変異体Δ８デサチュラーゼ（配列番号２２および２３）は、本明細書中に記載のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の改変株において優先的に使用される。米国特許出願公開第２００８−０１３８８６８Ａ１号明細書中で詳述されるように、（その中で「ＥｇＤ８Ｓ−２３」として同定された）ＥｇＤ８Ｍは、ＥｇＤ８Ｓ内部で複数回の標的化変異を行うことによって生成された。得られた突然変異体のΔ８デサチュラーゼ活性に対する各突然変異の効果はスクリーニングされ、ＥｇＤ８Ｓ（配列番号２１）のΔ８デサチュラーゼ活性との機能的等価性が確認された。この操作の結果として、突然変異体ＥｇＤ８Ｍ（配列番号２３）は、配列番号２１として示される合成コドン最適化ＥｇＤ８Ｓ配列に対して次の２４のアミノ酸変異、すなわち４ＳからＡ、５ＫからＳ、１２ＴからＶ、１６ＴからＫ、１７ＴからＶ、６６ＰからＱ、６７ＳからＡ、１０８ＳからＬ、１１７ＧからＡ、１１８ＹからＦ、１２０ＬからＭ、１２１ＭからＬ、１２５ＱからＨ、１２６ＭからＬ、１３２ＶからＬ、１３３ＬからＶ、１６２ＬからＶ、１６３ＶからＬ、２９３ＬからＭ、４０７ＡからＳ、４０８ＶからＱ、４１８ＡからＧ、４１９ＧからＡおよび４２２ＬからＱを含む。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））のデフォルトパラメータを使用したＥｇＤ８ＭおよびＥｇＤ８Ｓタンパク質配列のペアワイズアラインメントによると、４２２個のアミノ酸長にわたる２つのタンパク質の間で９４．３％の配列同一性および９７．９％のコンセンサスが示された。

【0192】

最近では、ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３Δ８デサチュラーゼ（「ＥａＤ８」）の単離および特徴づけについては米国特許出願第１２／０９９８１１号明細書に記載された（その中でＥａＤ８Ｄｅｓ３として同定された）。ＥａＤ８コード領域は１２６０ｂｐ長であり（配列番号２４）、４２０個のアミノ酸（配列番号２５）のタンパク質をコードする。ＥａＤ８は、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（上記）を有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を使用するＣｌｕｓｔａｌＶ分析法（上記）によると、ＥｇＤ８と７１．９％の配列同一性を共有する。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥａＤ８の発現時、酵素が基質としてＤＧＬＡと共に提示される場合にＣ２０脱飽和の平均５２．３％が報告された一方、基質としてＥＴｒＡと共に提示される場合にＣ２０脱飽和の平均４５．５％が報告された。

【0193】

ＥａＤ８のΔ８デサチュラーゼ活性の確認後、ＥａＤ８Ｓ（配列番号２６）がＥａＤ８のコード配列に基づいて設計された。翻訳開始部位の修飾に加え、１２６０ｂｐの中の２３１ｂｐのコード領域が修飾され（１８．３％）、２０８のコドンが最適化された（４９．５％）。ＧＣ含量は、ＥａＤ８内部の５６．８％からＥａＤ８Ｓ内部の５４．８％まで減少した。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号２７）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号２５）の場合に一致する。

【0194】

ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換のためのΔ５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６６７１号パンフレットにおいては、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のΔ５デサチュラーゼ（すなわちＥｇＤ５）が単離され、特徴づけられた。配列番号３４として示されるＥｇＤ５の１３５０ｂｐのコード領域は、約３３％の平均変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換する４４９個のアミノ酸（配列番号３５）のタンパク質をコードする。

【0195】

ＥｇＤ５のΔ５デサチュラーゼ活性は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ
ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現時、十分に特徴づけられたモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（すなわち「ＭａＤ５」；米国特許第６，０７５，１８３号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００４／０７１４６７号パンフレットおよび国際公開第２００５／０４７４７９号パンフレット）と比較された。ＥｇＤ５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、ＤＧＬＡ、ＥＤＡおよびＥＴＡが基質として使用される場合、ＭａＤ５よりも約２．６倍〜２．９倍活性が高かったが、デサチュラーゼはＥＴｒＡに対し
てほぼ同じ活性を有した（活性は特定の基質上でのＥｇＤ５における％Δ５脱飽和を同じ基質上でのＭａＤ５における％Δ５脱飽和で除することによって計算された）。ＤＧＬＡ（対ＥＤＡ）に対するＥｇＤ５およびＭａＤ５の基質特異性はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）においてほぼ同じであったが、ＥＴＡ（対ＥＴｒＡ）に対してはＥｇＤ５はＭａＤ５よりも約２．５倍優位性があり、ここで基質特異性は、ＤＧＬＡまたはＥＴＡにおける％Δ５脱飽和をそれぞれＥＤＡまたはＥＴｒＡにおける％Δ５脱飽和で除することによって計算された。ＥｇＤ５はまた、ω−６基質（すなわちＥＤＡおよびＤＧＬＡ）に対し、それぞれω−３基質（すなわちＥＴｒＡおよびＥＴＡ）よりも優位性を有した。これらの結果にかかわらず、インビボでの基質を使用する場合、ＥｇＤ５の活性において何らかの変化が観察可能であり、さらなる実験が必要とされうる。

【0196】

ＥｇＤ５のコドン最適化の結果、１３５０ｂｐの中の１９６ｂｐのコード領域が修飾され（１４．５％）、全部で４４９のコドンの中の１８９のコドンが最適化された（４２％）。コドン最適化ＥｇＤ５Ｓ遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号３７）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号３５）の場合に一致する。ＥｇＤ５Ｓとして同定されるコドン最適化遺伝子（配列番号３６）は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で発現される場合、ＤＧＬＡからＡＲＡへの脱飽和化で野生型遺伝子より３６％効率的であった。

【0197】

ペリディニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６Δ５デサチュラーゼ（ＲＤ５）は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１３６６４６号パンフレットにおいて単離され、特徴づけられた。ＲＤ５の１３９２ｂｐのコード配列は配列番号３８に示される一方、コードされるタンパク質は４６３個のアミノ酸（配列番号３９）である。このΔ５デサチュラーゼは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、約３５％の（平均）変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換する。ＲＤ５はまた、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Δ５デサチュラーゼ（ＭａＤ５；上記）と比較された。ＲＤ５は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）において、ＤＧＬＡ、ＥＤＡ、ＥＴｒＡおよびＥＴＡが基質として使用される場合、ＭａＤ５より約３．０倍〜９．７倍活性が高い。ＲＤ５の正確なω−６基質（すなわちＤＧＬＡ対ＥＤＡ）に対する基質特異性はＭａＤ５に対して約０．４であり、ω−３基質（すなわちＥＴＡ対ＥＴｒＡ）に対しては約０．６である。ＲＤ５はまた、ω−６基質（すなわちＥＤＡおよびＤＧＬＡ）に対し、それぞれω−３基質（すなわちＥＴｒＡおよびＥＴＡ）よりも約１．４倍の優位性を有する。ＥｇＤ５と同様、インビボでの基質を使用する場合、ＲＤ５の活性における何らかの変化が観察可能であり、さらなる実験が必要とされうる。

【0198】

ＲＤ５のコドン最適化の結果、翻訳開始部位の修飾に加え、１３９２ｂｐの中の２４７ｂｐのコード領域が修飾され（１７．７％）、２２９のコドンが最適化された（４９．４％）。ＧＣ含量は、ＲＤ５内部の４９．３％から合成遺伝子（すなわちＲＤ５Ｓ）内部の５４．２％に増加した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位がそれぞれ翻訳開始コドンの近辺およびＲＤ５Ｓ（配列番号４０）の停止コドンの後に組み込まれた。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号４１）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号３９）の場合に一致する。ＲＤ５Ｓは、ＤＧＬＡからＡＲＡへの変換で野生型ＲＤ５より約８．９％効率的であった。

【0199】

ユーグレナ・アナベナ（Ｅｕｇｌｅｎａ ａｎａｂａｅｎａ）ＵＴＥＸ３７３Δ５デサチュラーゼ（ＥａＤ５）は、米国特許出願第１２／１１１２３７号明細書において単離され、特徴づけられた（その中でＥａＤ５Ｄｅｓ１として同定された）。コード領域は１３６２ｂｐ（配列番号４２）であり、４５４個のアミノ酸（配列番号４３）のタンパク質をコードし、ペアワイズアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（上記）を有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）を使用するＣｌｕｓｔａｌ Ｖ分析法（上記）によると、ＥｇＤ５と７７．１％の配列同一性を共有する。ＥａＤ５は、ＤＧＬＡまたはＥＴＡに対し、それぞれＥＤＡまたはＥＴｒＡよりも約３．５倍優位のΔ５デサチュラーゼ活性を有することが示された。さらに、ＥａＤ５にとってはω−３基質よりもω−６基質の方が好ましい。

【0200】

ＥａＤ５のΔ５デサチュラーゼ活性の確認後、ＥａＤ５Ｓ（配列番号４４）がＥａＤ５のコード配列に基づいて設計された。翻訳開始部位の修飾に加え、１３６２ｂｐの中の１８３ｂｐのコード領域が修飾され（１３．４％）、１７４のコドンが最適化された（３８．３％）。ＧＣ含量は、野生型遺伝子（すなわちＥａＤ５）内部の５７．６％からＥａＤ５Ｓ内部の５４．６％へ減少した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位がそれぞれ翻訳開始コドンの近辺およびＥａＤ５Ｓ（配列番号４４）の停止コドンの後に組み込まれた。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号４５）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号４３）の場合に一致する。

【0201】

最近では、米国仮特許出願第６１／０９８３３３号明細書（参照により本明細書中に援用される）では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において異種的に発現される場合での突然変異体Δ５デサチュラーゼ（そのＥｇＤ５Ｓ、ＥａＤ５ＳおよびＲＤ５Ｓ対応物に対して改善された酵素活性を有する）について記載されている。Δ５デサチュラーゼはいくつかの保存された配列（すなわち３つのヒスチジンボックス［配列番号１９０〜１９５］およびチトクロームｂ_５ドメイン）を有するが、ヘム結合モチーフ（すなわちＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＧｌｙまたはＨＰＧＧ；配列番号１８２）が突然変異試験における標的として選択された。結果は、ＥｇＤ５Ｓ、ＥａＤ５ＳまたはＲＤ５ＳにおけるＨＰＧＧモチーフのプロリン残基も２番目のグリシン残基もΔ５デサチュラーゼ機能にとって必須でないことを示した。しかし、より意外なことが、非突然変異デサチュラーゼに対して増大したΔ５デサチュラーゼ活性を有する数種の突然変異体酵素の同定であった。ＥｇＤ５Ｓ−ＨＸＧＧ（配列番号１２２）は、ＨＧＧＧ（配列番号１８５）モチーフおよびＥｇＤ５Ｓに対して１０４．６％のΔ５デサチュラーゼ活性か、またはＨＨＧＧ（配列番号１８６）モチーフおよびＥｇＤ５Ｓに対して１０３．６％のΔ５デサチュラーゼ活性のいずれかを有した。ＨＰＧＳ（配列番号１８７）モチーフを含むＥｇＤ５Ｓ−ＨＰＧＳ（配列番号１２４）は、ＥｇＤ５Ｓに対して１０６．９％のΔ５デサチュラーゼ活性を有した。ＲＤ５Ｓ−ＨＸＧＧ（配列番号１２６）は、（ＲＤ５Ｓ−ＨＸＧＧの結果は最初のアッセイ結果であって定量分析に基づくものではないが）ＨＣＧＧ（配列番号１８８）モチーフおよびＲＤ５Ｓに対して１３８．６％のΔ５デサチュラーゼ活性か、またはＨＷＧＧ（配列番号１８９）モチーフおよびＲＤ５Ｓに対して１１３．５％のΔ５デサチュラーゼ活性のいずれかを有した。また、ＨＣＧＧ（配列番号１８８）モチーフを含むＥａＤ５Ｓ−ＨＣＧＧ（配列番号１２５）は、ＥａＤ５Ｓに対して１０７．９％のΔ５デサチュラーゼ活性を示した。好ましい突然変異体Δ５デサチュラーゼは、（配列番号１２２として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号１９６、（配列番号１２２として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号１９７、（配列番号１２４として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号１９８、（配列番号１２５として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号１９９、（配列番号１２６として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号２００および（配列番号１２６として示されるアミノ酸配列に対応する）配列番号２０１として示される核酸配列を有する。

【0202】

ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換のためのΔ１７デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書は、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ（「ＰｒＤ１７」）の単離および特徴づけについての詳細を提供する。ＰｒＤ１７は、配列番号４６で示される１０８６ｂｐのＯＲＦによってコードされる３６１個のアミノ酸（配列番号４７）の酵素である。ＰｒＤ１７は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために最適化され、詳細には、翻訳開始部位の修飾に加え、１６８ｂｐのコード領域が修飾され（１５．５％）、１６０のコドンが最適化された（４４．２％）。ＧＣ含量は、ＰｒＤ１７内部の６４．４％から合成遺伝子（すなわちＰｒＤ１７Ｓ）内部の５４．５％に減少した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位がそれぞれ翻訳開始コドンの近辺およびＰｒＤ１７Ｓ（配列番号４８）の停止コドンの後に組み込まれた。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号４９）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号４７）の場合に一致する。

【0203】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＰｒＤ１７Ｓの発現時、ＡＲＡはＥＰＡに約４９％の平均レート（ａｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ）で変換された。米国特許出願第１１／７７９９１５号明細書におけるＰｒＤ１７Ｓの基質特異性のさらなる分析によると、ＰｒＤ１７Ｓにおいて有効な基質としてＥＤＡおよびＤＧＬＡを使用する結果、各場合において２５％を超える変換効率が得られうることも判定された。

【0204】

ピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）由来のΔ１７デサチュラーゼが、米国特許出願第１１／７７９９１５号明細書において単離され、特徴づけられた。ＰａＤ１７コード領域は１０８０ｂｐ長（配列番号５０）であり、３５９個のアミノ酸（配列番号５１）のタンパク質をコードする。デフォルトパラメータを有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）中で見出される（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９−１９１頁（１９９２年）に記載の）Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ分析を使用する、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（ＰｉＤ１７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＪ３０８７０；ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０８３０５３号パンフレット）、フィトフトラ・ソジャエ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ）（ＰｓＤ１７；ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／１００２４１号パンフレット；ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／１２３９９９号パンフレット）、フィトフトラ・ラモラム（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｒａｍｏｒｕｍ）（ＰｒＤ１７；配列番号４７；上記）およびＰａＤ１７に由来するΔ１７デサチュラーゼタンパク質の間および中でのペアワイズ比較の結果、次のパーセント類似性、すなわちＰｉＤ１７およびＰａＤ１７の間で７４．５％；ＰｒＤ１７およびＰａＤ１７の間での７５．０％；ならびにＰｓＤ１７およびＰａＤ１７の間で７５．３％が得られた。

【0205】

ＰａＤ１７の最適化の結果、翻訳開始部位の修飾に加え、（停止コドンを含む）１０８０ｂｐの中の１８８ｂｐのコード領域（１７．４％）が修飾され、１７５のコドンが最適化された（４８．６％）。ＧＣ含量は、ＰａＤ１７内部の６１．８％からＰａＤ１７Ｓ（配列番号５２）内部の５４．５％に減少した。ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位がそれぞれ翻訳開始コドンの近辺およびＰａＤ１７Ｓの停止コドンの後に組み込まれた。コドン最適化遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号５３）は、野生型タンパク質配列（すなわち配列番号５１）の場合に一致する。ＰａＤ１７Ｓの変換効率は、野生型ＰａＤ１７における１８．４％〜１９．５％の変換効率に対し、５４．１％〜５５．６％の間の範囲であった。

【0206】

ＰａＤ１７Ｓ（配列番号５２）の基質特異性が、ＰｓＤ１７Ｓ（ＰｓＤ１７に由来し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現の
ためにコドン最適化された合成Δ１７デサチュラーゼ；米国特許出願第１１／７８７７７２号明細書）およびＰｒＤ１７Ｓ（配列番号４８）に対してさらに評価された。すべての３つのΔ１７デサチュラーゼがＡＲＡにおける最高の優位性、ＥＤＡおよびＤＧＬＡに対する比較的低い活性、およびＧＬＡに対する最低限の活性を有したが、ＰａＤ１７ＳがＡＲＡに対する最高の全体的活性を有することが見出された。さらに、ＰａＤ１７ＳはＣ１８基質ＬＡに対して有意なΔ１５デサチュラーゼ活性を有し、ここで活性はＣ２０基質ＥＤＡおよびＤＧＬＡに対するΔ１７デサチュラーゼ活性に匹敵した。

【0207】

オレイン酸からＬＡへの変換のためのΔ１２デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は米国特許第７，２１４，４９１号明細書で同定され、特徴づけられた、Δ１２デサチュラーゼをコードする天然遺伝子を保有する（「ＹｌＤ１２」；配列番号１および２）。しかし、ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載のように、フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ（「ＦｍＤ１２」；配列番号５４および５５によってコードされる）は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における１８：２の生成において、ＹｌＤ１２より高い効率で機能する。より詳細には、両方のΔ１２デサチュラーゼはオレイン酸からＬＡへの変換を触媒するが、２種の酵素はそれらの全体的な特異性が異なる（それにより各酵素のパーセント基質変換に作用する）。ＦｍＤ１２は、ＬＡのホスファチジルコリン基質のｓｎ−２位置に対し、ＹｌＤ１２より高い負荷能力を有する。これは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における翻訳伸長因子ＥＦ１−αプロモーター（ＴＥＦ；米国特許第６，２６５，１８５号明細書）の制御下でのＦｍＤ１２の発現時、ＴＥＦプロモーターの制御下でＹｌＤ１２をコードするキメラ遺伝子の発現によって先に達成できた場合（ＬＡの５９％の産物蓄積）より高いレベルの１８：２の生成（ＬＡの６８％の産物蓄積）が測定されることが示された。これはパーセント基質変換の差異（それぞれ８５％対７４％の（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）＊１００）として計算される）に対応する。これらの結果に基づき、真菌ＦｍＤ１２の発現は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の高ＥＰＡ生成株を改変するための手段として、天然ＹｌＤ１２に対して好ましい。さらに、ＹｌＤ１２のノックアウトを伴うＦｍＤ１２の過剰発現は、産物ＬＡのΔ９伸長を促進するのに特に有利でありうる。

【0208】

ＦｍＤ１２の最適化の結果、１４３４ｂｐの中の１８２ｂｐのコード領域（１２．７％）が修飾され、１７２のコドン（３６％）が最適化され、それによりＦｍＤ１２Ｓ（配列番号５６）として示される遺伝子が得られた。コドン最適化ＦｍＤ１２Ｓ遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号５７）は野生型タンパク質配列（すなわち配列番号５５）の場合に一致する。

【0209】

パルミチン酸塩からステアリン酸（１８：０）への変換のためのＣ_{１６／１８}エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットにおいて「ＹＥ２」として同定され、特徴づけられた）天然Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼを確かに保有するが、本出願における好ましいＣ_{１６／１８}エロンガーゼはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ（ＥＬＯ３）である。２７５個のアミノ酸の酵素であり、配列番号５８で示される８２８ｂｐのＯＲＦによってコードされるＥＬＯ３（配列番号５９）が、米国特許出願公開第２００７−００８７４２０Ａ１号明細書およびＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレットにおいて単離され、特徴づけられた。それらの中で記載のように、ＥＬＯ３は、強力な天然プロモーター（す
なわちＦＢＡＩＮ）の制御下でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において過剰発現され、それにより、ＥＬＯ３を含有しない対照株よりも３５％多いＣ１８脂肪酸（すなわち１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２およびＧＬＡ）および３１％少ないＣ１６脂肪酸を生成する形質転換体が得られた。これらのデータにより、ＥＬＯ３が基質としてＣ１６脂肪酸を使用し、Ｃ１８脂肪酸を生成することが示された。

【0210】

ＥＬＯ３の最適化の結果、８２８ｂｐの中の１１４ｂｐのコード領域（１３．８％）が修飾され、１１１のコドン（４０．２％）が最適化され、それによりＭＥ３Ｓ（配列番号６０）と称される遺伝子が生成された。コドン最適化ＭＥ３Ｓ遺伝子によってコードされるタンパク質配列（すなわち配列番号６１）は野生型タンパク質配列（すなわち配列番号５９）の場合に一致する。

【0211】

ＬＡからＡＬＡおよび／またはＧＬＡからＳＴＡへの変換のためのΔ１５デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
配列番号６２および６３としての本明細書中に記載のフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼ（ＦｍＤ１５）は、ＡＬＡの生成を増大させるのに好ましいΔ１５デサチュラーゼである。この酵素は、１２０９ｂｐのコード配列によってコードされる４０２個のアミノ酸を含む。

【0212】

この特定のΔ１５デサチュラーゼは、予め知られたΔ１５デサチュラーゼ（ＰＣＴ公開の国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットおよび国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）に対していくつかの固有の特性を有する。第一に、ＦｍＤ１５はその有意なΔ１２デサチュラーゼ活性によって区別される（それ故、酵素が二機能性として特徴づけられる）。先行試験によると、配列番号６２をコードするキメラ遺伝子で形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のΔ１２デサチュラーゼ破壊株が、９６％のＬＡのＡＬＡへの変換（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］＊１００として計算されるパーセント基質変換）に加え、２４％のオレイン酸をＬＡに変換（（［１８：２＋１８：３］／［１８：１＋１８：２＋１８：３］）＊１００として計算されるパーセント基質変換））可能であることが判定された。第二に、ＦｍＤ１５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において発現される場合、他の異種的に発現されたΔ１５デサチュラーゼについて記載されたものに対し、非常に高いＡＬＡの合成を可能にする［すなわち、配列番号６２をコードするキメラ遺伝子で形質転換されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、形質転換宿主細胞内での全脂肪酸に対し、ＡＬＡの３１％の産物蓄積を示すことができ、それは（［１８：３］／［１８：２＋１８：３］＊１００として計算された）８３％のＡＬＡへの変換効率に相当する。］。例えば、非油性酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現する場合でのＡＬＡの％産物蓄積が４．１％に過ぎなかった一方（Ｍｅｅｓａｐｙｏｄｓｕｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９：１１９４８−１１９５４頁（２０００年））、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において西洋ナタネ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）Δ１５デサチュラーゼを発現する場合でのＡＬＡの％産物蓄積は１．３％に過ぎなかった（Ｒｅｅｄ．Ｄ．Ｗ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２２：７１５−７２０頁（２０００年））。最後に、ＦｍＤ１５は、下流の１８：２のω−６誘導体に対して比較的広範な基質特異性を有する。詳細には、Δ１５デサチュラーゼは、ＧＬＡからＳＴＡ、ＤＧＬＡからＥＴＡ、およびＡＲＡからＥＰＡへの変換を触媒可能である。

【0213】

ＦｍＤ１５の最適化の結果、配列番号６４のＦｍＤ１５Ｓ遺伝子内に示される、１２０９ｂｐの中の１３５ｂｐのコード領域（１１．２％）が修飾され、１２８のコドン（３１．８％）が最適化された。コドン最適化遺伝子によってコードされる得られたＦｍＤ１５Ｓタンパク質配列（すなわち配列番号６５）は野生型タンパク質配列（すなわち配列番号６３）の場合に一致する。

【0214】

パルミチン酸塩からパルミトオレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換のためのΔ９デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＣＬＩＢ１２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１４９６）のゲノム配列内部での遺伝子座タグＹＡＬＩ０Ｃ０５９５１ｇは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ９デサチュラーゼとして同定される。ＹｌＤ９は、配列番号６６で示される１４４９ｂｐのＯＲＦによってコードされる４８２個のアミノ酸（配列番号６７）の酵素である。ＹｌＤ９がＹＡＴ１プロモーターの制御下でヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において過剰発現された時、形質転換体中のオイルは対照ＤＮＡ断片で形質転換された宿主細胞内のオイルに対して約６％増加した。

【0215】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥＰＡ生成に適するＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の配列が提示されるが、これらの遺伝子は限定的であることは意図されていない。本明細書における目的に適するＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする極めて多数の他の遺伝子であれば、種々の供給源から単離され、例えば細菌、藻類、真菌、植物、動物などの天然源から単離され、半合成経路を介して生成されるかまたはデノボで合成されうる。さらに、代替酵素であれば、適切なデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する野生型、コドン最適化、融合、合成および／または突然変異体酵素でありうる。これらの代替酵素であれば、１）ＬＡをＥＤＡおよび／またはＡＬＡをＥＴｒＡに伸長し（Δ９エロンガーゼ）、２）ＥＤＡからＤＧＬＡおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒し（Δ８デサチュラーゼ）、３）ＤＧＬＡからＡＲＡおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒し（Δ５デサチュラーゼ）、４）ＡＲＡからＥＰＡおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒し（Δ１７デサチュラーゼ）、５）オレイン酸からＬＡへの変換を触媒し（Δ１２デサチュラーゼ）、６）Ｃ１６基質を伸長し、Ｃ１８産物を生成し（Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ）、７）ＬＡからＡＬＡへの変換を触媒し（Δ１５デサチュラーゼ）、ならびに／あるいは８）パルミチン酸塩からパルミトオレイン酸および／またはステアリン酸からオレイン酸への変換を触媒する（Δ９デサチュラーゼ）能力によって特徴づけられることになる。

【0216】

あるいは、表４に示されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同一である他のＤＮＡは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＥＰＡの生成に使用されうる。「実質的に同一」は、選択されるポリペプチドまたはアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して少なくとも８０％、９０％もしくは９５％の相同性を優位性が高まる順序で示すアミノ酸配列または核酸配列が意図されている。ポリペプチドにおいては、比較配列の長さは、一般的に少なくとも１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸または最も好ましくは３５個のアミノ酸である。核酸においては、比較配列の長さは、一般的に少なくとも５０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５個のヌクレオチド、および最も好ましくは１１０個のヌクレオチドである。

【0217】

相同性は、典型的には配列分析ソフトウェアを使用して測定され、ここで用語「配列分析ソフトウェア」はヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列分析ソフトウェア」は、市販されているかまたは独立に開発されている。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定はされないが、１）一連のＧＣＧプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；および４）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．」［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１−２０頁、Ｓｕｈａｉ、Ｓａｎｄｏｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含むことになる。この記述の中では、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合には常に、分析結果は、他に特に規定がなければ参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものである。本明細書で使用される「デフォルト値」は、最初に初期化される場合に最初にソフトウェアに読み込まれる任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。一般的に、かかるコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、および他の修飾に対して様々な相同度を割り当てることによって類似配列に一致する。

【0218】

他のＤＮＡは、表４中に提示される好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼに対して実質的に同一でないが、前記代替デサチュラーゼおよびエロンガーゼが上記の好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼと実質的に同様に機能する場合、本明細書における目的のためにさらに使用されうる。

【0219】

当業者であれば二機能性または三機能性活性を有するキメラ融合タンパク質を作製できると考えられる。したがって、エロンガーゼおよびデサチュラーゼ活性の双方（例えば、２００８年４月３日に出願された米国特許出願第１２／０６１７３８号明細書に記載のΔ９エロンガーゼ−Δ８デサチュラーゼ遺伝子融合体）；二または三機能性エロンガーゼ活性（例えばＣ_{１６／１８}エロンガーゼ−Δ９エロンガーゼ遺伝子融合体）；または二または三機能性デサチュラーゼ活性（例えばΔ５デサチュラーゼ−Δ１２デサチュラーゼ遺伝子融合体）を有するキメラ融合タンパク質が作製されうると思われる。例えば、本明細書における目的に適するΔ１２デサチュラーゼおよびΔ５デサチュラーゼ活性の双方を有するキメラ融合タンパク質が、Δ１２デサチュラーゼおよびΔ５デサチュラーゼを共に隣接するリンカーと融合することによって合成されうると思われる。Δ１２デサチュラーゼまたはΔ５デサチュラーゼのいずれかであれば、融合タンパク質のＮ末端部分に存在しうる。適切なリンカー分子を設計し、合成するための手段は当業者によって容易に理解され、例えばリンカーはアラニンまたはリジンアミノ酸のストレッチであり得、かつ融合酵素の活性に作用しないことになる。共に融合されうる好ましいデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子であれば、上の表４に記載のものから選択されることになる。

【0220】

最後に、配列を合成しかつ配列を共に接合するための方法は文献において十分に確立されていることは当該技術分野で周知である。したがって、インビトロでの突然変異誘発および選択、部位特異的突然変異誘発、化学的突然変異誘発、「遺伝子シャッフリング」の方法または他の手段を用い、天然デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ遺伝子の変異、例えば表４に記載のものが得られうる。これを仮定すると、宿主細胞内で機能するためのより望ましい物理学的および動力学的パラメータ（例えば所望されるＰＵＦＡの生成のより長い半減期またはより高い速度）を伴う、インビボでのデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性をそれぞれ有するポリペプチドの生成が可能となる。

【0221】

最適化されたＥＰＡ生合成のためのジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼの発現
例えば全脂質中で２５％超のＥＰＡを生成する能力を有する、本明細書中に記載の最適化された組換えヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、最低限、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼおよびＣ_{１６／１８}エロンガーゼを含む。しかし、それらデサチュラーゼおよびエロンガーゼに加え、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の好ましい株は、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ［「ＣＰＴ１」］をコードする少なくとも１つの遺伝子をさらに含む。

【0222】

ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．８．２）は、ホスファチジルコリン生合成に関与するＣＤＰ−コリン経路内部の次の反応、すなわちＣＤＰ−コリン＋１，２−ジアシルグリセロール＝シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）＋ホスファチジルコリンを触媒する酵素である。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＹｌＣＰＴ１）はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０１７０３（ＹＡＬＩ０Ｃ１０９８９ｇ）として示され、３９４個のアミノ酸（配列番号６９）のこの酵素は配列番号６８の１１８５ｂｐのコード配列によってコードされる。国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット中に前述のように、強力なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーターの制御下でのＹｌＣＰＴ１の過剰発現が、天然ＹｌＣＰＴ１が過剰発現されない親株と比較し、ＥＰＡ生成株中で全脂肪酸に対するＥＰＡの百分率の増加をもたらすことが示された。

【0223】

最適化されたＥＰＡ株中での好ましい遺伝子ノックアウト
組換えヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）において、様々な好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼおよびジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（上記）の発現の調節に加え、様々な天然酵素活性が同時に欠如することが有用でありうる。これは、線形ＤＮＡの宿主のゲノムへの組み込みの間になされる標的化遺伝子ノックアウトによって行われることが多い。当然のことながら、好ましいノックアウトは、形質転換体（例えば、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ［Ｕｒａ３−］、サッカロピンデヒドロゲナーゼ［Ｌｙｓ５−］、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ［Ｌｅｕ２−］）および脂肪酸分解およびＴＡＧ分解を低減するもの（例えば、アシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイム［ＰＯＸ１−、Ｐｏｘ２−、Ｐｏｘ３−、Ｐｏｘ４−およびＰＯＸ５−］、リパーゼ［Ｌｉｐ１−、Ｌｉｐ２−、Ｌｉｐ３−、Ｌｉｐ４ａ−］）の選択にとって有用なものを含む。他の好ましい遺伝子ノックアウトは表現型的に「中立の」突然変異をもたらすように見られるものであり、ここでヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞は作用を受けないように思われる（例えば、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０５８１９］、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０１９８７］、ＳＣＰ２−［ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０３４１０］）。それに対し、一部の好ましい遺伝子ノックアウトが、全脂肪酸のパーセントとして全オイル含量および／またはＥＰＡの増加をもたらすことが示されている（例えば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２［ＤＧＡＴ２−］、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質３［Ｐｅｘ３ｐ−］、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質１０［Ｐｅｘ１０ｐ−］、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質１６［Ｐｅｘ１６ｐ−］）。遺伝子ノックアウトのこれらの広範なカテゴリの各々は、下記にさらに詳細に記述されることになる（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Δ１２デサチュラーゼのノックアウトの有用性については下記に再び記述されることはなく、というのはこの理由はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの説明中に予め提示された）。

【0224】

特定の遺伝子における下記に提供される典型的な配列番号にもかかわらず、遺伝子ノックアウトについての考察が本明細書中に提供される特定の配列に決して限定されないことに着目することは重要である。下記のコード配列に対して実質的に同一な他のＤＮＡが有用でありうる（したがって、例えば異なる株および宿主の間でのわずかな配列の変異が想定されるべきである）ことは当該技術分野で周知である。

【0225】

形質転換体の選択のための遺伝子ノックアウト：
ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット中に前述のように、発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子座（Ｕｒａ３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１［配列番号７０］）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子座（Ｌｅｕ２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０［配列番号７２］）およびサッカロピンデヒドロゲナーゼ遺伝子座（Ｌｙｓ５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９［配列番号７４］）に組み込むことは可能である。典型的には、この結果、組み込み遺伝子座で遺伝子ノックアウトがもたらされ、それは、ウラシル、ロイシンまたはリジンが欠如した培地上で成長するその能力に基づき、形質転換細胞と非形質転換細胞とを区別するための手段として容易に用いられうる。

【0226】

一部の好ましい方法では、Ｕｒａ３遺伝子は、５−フルオロオロチン酸（５−フルオロウラシル−６−カルボキシル酸一水和物または「５−ＦＯＡ」）の選択と組み合わせて繰り返し使用されうる。５−ＦＯＡは、オロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して毒性を示す。この毒性に基づき、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定にとって特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ Ｓ．、Ｙｅａｓｔ ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７巻、１０９−１４７頁、１９９７年）。より詳細には、最初に天然Ｕｒａ３遺伝子をノックアウトし、Ｕｒａ−表現型を有する株を生成でき、ここでは選択が５−ＦＯＡ耐性に基づいて行われる。次いで、複数のキメラ遺伝子のクラスタおよび新しいＵｒａ３遺伝子であれば、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込まれ、それによりＵｒａ＋表現型を有する新しい株が生成されうる。その後の組み込みにより、導入されたＵｒａ３遺伝子がノックアウトされる場合、（５−ＦＯＡの選択を使用して再び同定された）新しいＵｒａ３−株が生成されることになる。したがって、Ｕｒａ３遺伝子は（５−ＦＯＡの選択と組み合わせて）複数回の形質転換で選択マーカーとして使用可能であり、それにより手軽な方法でヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの遺伝子組換えの組み込みが容易に可能である。

【0227】

脂肪酸およびＴＡＧの分解を低減するための遺伝子ノックアウト：
本明細書中に記載の最適化されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において（例えば様々な発現カセットを細胞に組み込む場合）脂肪酸分解およびＴＡＧ分解に作用する経路を意図的に破壊することも有用である。これはアシル−ＣｏＡプールまたは細胞のＴＡＧ画分のいずれかの中での蓄積されたＥＰＡの分解を最小化する（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。これらの経路は、それぞれアシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびリパーゼ遺伝子によって表される。より詳細には、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ（ＥＣ１．３．３．６）はペルオキシソームβ酸化反応を触媒し、ここで分解の各サイクルでは、脂肪酸基質より２個の炭素原子分短いアセチル−ＣｏＡ分子および脂肪酸が得られる。５つのアシル−ＣｏＡオキシダーゼアイソザイムが、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において存在し、ＰＯＸ１、ＰＯＸ２、ＰＯＸ３、ＰＯＸ４およびＰＯＸ５遺伝子（Ａｃｏ１、Ａｃｏ２、Ａｃｏ３、Ａｃｏ４およびＡｃｏ５遺伝子としても知られる）（それぞれＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１２９９−ＡＪ００１３０３に対応）（対応するＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０４７０３［配列番号７５］、ＸＰ＿５０５２６４［配列番号７６］、ＸＰ＿５０３２４４［配列番号７７］、ＸＰ＿５０４４７５［配列番号７８］およびＸＰ＿５０２１９９［配列番号７９］も参照）によってコードされる。アイソザイムの各々は異なる基質特異性を有する。例えば、ＰＯＸ３遺伝子は、短鎖脂肪酸に対して活性があるアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする一方、ＰＯＸ２遺伝子はより長鎖の脂肪酸に対して活性があるアシル−ＣｏＡオキシダーゼをコードする（Ｗａｎｇ Ｈ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：５１４０−５１４８頁（１９９９年））。何らかの混乱を回避するため、出願人は上記のアシル−ＣｏＡオキシダーゼをＰＯＸ遺伝子と称することになるが、この用語は、一部の一般に公開されている文献によると、命名のＡｃｏ遺伝子と同義に使用されうる。

【0228】

同様に、細胞内、膜結合および細胞外酵素を含むいくつかのリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において検出されている（Ｃｈｏｕｐｉｎａ Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３５：２９７頁（１９９９年）；Ｐｉｇｎｅｄｅ Ｇ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８２：２８０２−２８１０頁（２０００年））。例えば、Ｌｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０［配列番号８０］）およびＬｉｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２４９７５１［配列番号８４］）が細胞内または膜結合である一方、Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２［配列番号８２］）は細胞外リパーゼをコードする。Ｌｉｐ４ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３８２５［配列番号８６］）はヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）リパーゼ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３６９７）相同体である。それはカンジダ・デフォルマンス（Ｃａｎｄｉｄａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ）の細胞外トリアシルグリセロールリパーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＤ２１４３０）と高い相同性を有する。これらリパーゼの各々は、酵素がＴＡＧおよび水がＤＡＧおよび脂肪酸アニオンまで直接分解される反応を触媒することから破壊のための適切な標的である。

【0229】

したがって、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット中に前述のように、発現カセットを含むプラスミドＤＮＡを、次の遺伝子座、すなわちＰｏｘ１（Ａｃｏ１）、Ｐｏｘ２（Ａｃｏ２）、Ｐｏｘ３（Ａｃｏ３）、Ｐｏｘ４（Ａｃｏ４）、Ｐｏｘ５（Ａｃｏ５）、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３およびＬｉｐ４ａのいずれかに組み込み、それにより遺伝子ノックアウトをもたらすことは有利である。

【0230】

他の遺伝子ノックアウト：
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における相同組換えの頻度が比較的低いことから、発現カセットのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノムへの組み込みが時として生じ、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子で最初に標的化されたもの以外を意図せずに破壊しうる。これは、形質転換体中でのＥＰＡ生成の促進についてスクリーニングし、さらなる有用な遺伝子ノックアウトを同定するのを可能にする。次の３つのノックアウトならびに下記のＰｅｘ１０−ノックアウトがこれらの手段によって同定された。

【0231】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＳＣＰ２（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ［配列番号８７］）は、脂質の輸送および代謝に関与するステロール担体タンパク質をコードする（Ｆｅｒｒｅｙｒａ Ｒ．Ｇ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、４５３：１９７−２０６頁（２００６年））。ＳＣＰ２タンパク質がペルオキシソームに局在化し、酵素と基質の相互作用を促進することによって長鎖脂肪酸の酸化に関与することが示唆される。ＳＣＰ２は、脂肪酸およびそのＣｏＡエステルの双方に結合することが示されている。したがって、この遺伝子を破壊し、ＥＰＡおよび経路の他の中間体の酸化のレベルを低下させることは有益でありうる。本明細書中の実施例においては、ＳＣＰ２−ノックアウトが株Ｙ４３０５中で同定された。

【0232】

ＯＲＦ ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０１９８７［配列番号８９］）はまた、その翻訳開始コドン内部への発現カセットの挿入時、遺伝子破壊に耐性があることが見出された。ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子ＹＬＲ０５０Ｃ（その遺伝子の機能は未知である）に対して相同である。ＧＦＰおよびＹＬＲ０５０Ｃからなるキメラタンパク質は小胞体領域に局在化することが示されたが（Ｈｕｈ Ｗ．Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４２５（６９５９）：６８６−６９１頁（２００３年））、それは脂肪酸の脱飽和または脂質の生成に関連しうることを示唆している。本明細書中の実施例においては、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−ノックアウトが株Ｙ４２１７中で最初に同定された。

【0233】

時として、発現カセットの組み込みは、その特定のコード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列内部以外の遺伝子のコード領域の外側で生じる。このタイプの挿入はＯＲＦの発現に作用しうる。本出願では、発現カセットは、開始コドンの１５４ｂｐ上流の、株Ｙ４０８６におけるＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０５８１９［配列番号９１］）の５’領域に挿入された。ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇは、（正確な機能は不明確であるが）胞子形成の間に発現されるように見られるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＰＳ４遺伝子に対して相同である（Ｈｅｐｗｏｒｔｈ Ｓ．Ｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５（７）：３９３４−３９４４頁（１９９５年））。

【0234】

ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウト：
ＴＡＧの生合成におけるアシルトランスフェラーゼの密接な関与および４つの真核生物のアシルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーについては、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている。これらは、一般的にステロールアシルトランスフェラーゼ；レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ［「ＬＣＡＴ」］ファミリー；グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼおよびアシル−ＣｏＡリソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＧＰＡＴ／ＬＰＡＡＴ」］ファミリー；およびジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＤＡＧ ＡＴ」］ファミリーとして知られるアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ［「ＡＣＡＴ」］ファミリーを含む。また、Ｄ．ＳｏｒｇｅｒおよびＧ．Ｄａｕｍ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６１：２８９−２９９頁（２００３年）ならびにＨ．ＭｕｅｌｌｎｅｒおよびＧ．Ｄａｕｍ、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ、５１（２）：３２３−３４７頁（２００４年）による引用される概説を参照のこと。ＤＧＡＴ２を含むＤＡＧ ＡＴファミリー（ＥＣ２．３．１．２０）はＴＡＧ生合成の最終ステップに関与し、詳細には酵素は第３の脂肪酸の１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］のｓｎ−３位置への付加を触媒し、ＴＡＧを形成する。

【0235】

ＤＧＡＴ１（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２９１４号パンフレットにおいて特徴づけられる）、ＤＧＡＴ２（配列番号９３および９４；米国特許第７，２６７，９７６号明細書において特徴づけられる）およびＰＤＡＴ（米国特許第７，２６７，９７６号明細書において特徴づけられる）をコードする天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子のノックアウトについてはＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに記載されている（その中の実施例２９および３０を参照）。詳細には、破壊されたＤＧＡＴ２および／またはＤＧＡＴ１および／またはＰＤＡＴ遺伝子を含む株において全オイル含量が減少し、かつパーセントＥＰＡが増加することが見出された。例えば、ＤＧＡＴ２のノックアウトの結果、天然ＤＧＡＴ２が破壊されていない親株に対し、（全脂肪酸［「ＴＦＡ」］の）％ＥＰＡが２倍になり、かつ（％乾燥細胞重量のＴＦＡとして）脂質含量が半分になった。ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２９１２号パンフレットにおいて詳述されるように、さらなる実験により、宿主生物の天然ＤＡＧ ＡＴの活性を調節でき、それにより宿主の脂質およびオイル内部のＰＵＦＡのパーセントを操作可能であるという仮説が導かれた。詳細には、オイル生合成がオレアジニー（ｏｌｅａｇｉｎｙ）の間に多価不飽和と競合することが想定されることから、生物の１種以上のアシルトランスフェラーゼ（例えばＰＤＡＴおよび／またはＤＧＡＴ１および／またはＤＧＡＴ２）の活性を低下または不活性化させ、それによりオイル生合成の全体レートを減少させると同時に、脂質およびオイル画分に取り込まれた（全脂肪酸に対する）ＰＵＦＡのパーセントを増加させることが可能である。多価不飽和がより効率的にまたは換言すれば特定のＤＡＧ ＡＴの活性のダウンレギュレーションによって生じうることからこれが生じ、オイル生合成および多価不飽和の間での基質の競合がオレアジニー（ｏｌｅａｇｉｎｙ）の間に多価不飽和故に低下する。

【0236】

上でまとめられたデータに基づき、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主にとってＤＧＡＴ２をコードするその天然遺伝子（配列番号９３）が欠如することが望ましい場合がある。

【0237】

ペルオキシソーム生合成因子タンパク質（ＰＥＸ）遺伝子ノックアウト：
ペルオキシソームは、すべての真核細胞内で見出される遍在オルガネラである。その主要な役割は、細胞の局在化オルガネラ内部の様々な物質、例えば毒性化合物、脂肪酸などの分解である。例えば、脂肪酸分子が分解され、最終的にアセチル−ＣｏＡの遊離分子（これらは細胞質ゾルに再び輸送される）を生成するβ酸化のプロセスがペルオキシソーム内で生じうる。ミトコンドリア内でのβ酸化のプロセスがＡＴＰ合成をもたらすが、ペルオキシソーム内でのβ酸化が高電位電子のＯ_２への移動を引き起こし、Ｈ_２Ｏ_２の形成をもたらし、それはその後にペルオキシソームカタラーゼによって水およびＯ_２に変換される。Ｃ_１８〜Ｃ_２２などの非常に長い鎖の脂肪酸がペルオキシソーム内で初期のβ酸化、その後にミトコンドリアβ酸化を受ける。

【0238】

ペルオキシソーム膜を介したＡＴＰ加水分解によるタンパク質の取り込みに関与するタンパク質は、ペルオキシソーム生合成因子タンパク質または「ペルオキシン」として知られる。これらのペルオキシソーム生合成因子タンパク質はまた、ペルオキシソーム生合成／構築に関与するタンパク質を含む。ペルオキシソーム生合成因子タンパク質における遺伝子の頭文字はＰｅｘであり、命名法はＤｉｓｔｅｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３５：１−３頁（１９９６年）に記載されている。これまで少なくとも３２の異なるＰｅｘ遺伝子が様々な真核生物において同定されている。しかし、真菌においては、Ｋｉｅｌら（Ｔｒａｆｆｉｃ、７：１２９１−１３０３頁（２００６年））の最近の概説は、ペルオキシソーム生合成／マトリックスタンパク質の取り込みのための最低限の要件は１７と番号付けられ、それ故にＰｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２２ｐおよびＰｅｘ２６ｐのみが必要とされることを示唆している。これらのタンパク質は、調整された方法で作用し、ペルオキシソームの増殖（複製）およびペルオキシソームへの転位置を介するタンパク質取り込みを行う（Ｗａｔｅｒｈａｍ Ｈ．Ｒ．およびＪ．Ｍ．Ｃｒｅｇｇ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、１９（１）：５７−６６頁（１９９６年）中に概説されている）。

【0239】

酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で、種々の異なるＰｅｘ遺伝子が相同性およびペルオキシソーム生合成機構の強力な保存（Ｋｉｅｌら、上記）に基づいて同定されており、それらにはＹｌＰｅｘ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２１７８［配列番号９５］）、ＹｌＰｅｘ２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７［配列番号９６］）、ＹｌＰｅｘ３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５［配列番号９７］）、ＹｌＰｅｘ３Ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８３３５６［配列番号９８］）、ＹｌＰｅｘ４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９１３０［配列番号９９］）、ＹｌＰｅｘ５ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８８０３［配列番号１００］）、ＹｌＰｅｘ６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２３０６［配列番号１０１］）、ＹｌＰｅｘ７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８３８９［配列番号１０２］）、ＹｌＰｅｘ８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８０４４７［配列番号１０３］）、ＹｌＰｅｘ１０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６［配列番号１０４］）、ＹｌＰｅｘ１２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２［配列番号１０５］）、ＹｌＰｅｘ１３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１７８９［配列番号１０６］）、ＹｌＰｅｘ１４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９３２３［配列番号１０７］）、ＹｌＰｅｘ１６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２［配列番号１０８］）、ＹｌＰｅｘ１７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８４０２５［配列番号１０９］）、ＹｌＰｅｘ１９ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ８４８２７［配列番号１１０］）、ＹｌＰｅｘ２０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９２２６［配列番号１１１］）、ＹｌＰｅｘ２２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７８７６［配列番号１１２］）およびＹｌＰｅｘ２６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６０７２、ヌクレオチド１１７２３０−１１８３８７［配列番号１１３］のアンチセンス翻訳）が含まれる。さらに、これら遺伝子の一部もまた単離され、特徴づけられている。Ｂａｓｃｏｍ Ｒ．Ａ．ら（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ、１４：９３９−９５７頁（２００３年））はＹｌＰｅｘ３ｐについて記載し、Ｓｚｉｌａｒｄ Ｒ．Ｋ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３１：１４５３−１４６９頁（１９９５年））はＹｌＰｅｘ５ｐについて記載し、Ｎｕｔｔｌｅｙ Ｗ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：５５６−５６６頁（１９９４年））はＹｌＰｅｘ６ｐについて記載し、Ｅｌｉｚｅｎ Ｇ．Ａ．ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０：１４２９−１４３６頁（１９９５年））はＹｌＰｅｘ９ｐについて記載し、Ｅｌｉｚｅｎ Ｇ．Ａ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３７：１２６５−１２７８頁（１９９７年））およびＴｉｔｏｒｅｎｋｏ Ｖ．Ｉ．ら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１７：５２１０−５２２６頁（１９９７年））はＹｌＰｅｘ１６ｐについて記載し、Ｌａｍｂｋｉｎ Ｇ．Ｒ．およびＲ．Ａ Ｒａｃｈｕｂｉｎｓｋｉ（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．、１２（１１）：３３５３−３３６４頁（２００１年））はＹｌＰｅｘ１９について記載し、またＴｉｔｏｒｅｎｋｏＶ．Ｉ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１４２：４０３−４２０頁（１９９８年））およびＳｍｉｔｈ Ｊ．Ｊ．およびＲ．Ａ．Ｒａｃｈｕｂｉｎｓｋｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２７６：１６１８−１６２５頁（２００１年））はＹｌＰｅｘ２０ｐについて記載している。しかし、ＹｌＰｅｘ１０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６、登録番号ＡＢ０３６７７０および登録番号ＡＪ０１２０８４）が本明細書中の当初の目的であった。Ｓｕｍｉｔａら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２１４：３１−３８頁（２００２年））での特徴づけによると、１）ＹｌＰｅｘ１０ｐがペルオキシソームの成分として機能し、かつ２）ＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフがタンパク質の機能にとって必須であることが示され、それはＣ３４１Ｓ、Ｃ３４６ＳおよびＨ３４３Ｗ点突然変異の生成とそれに続く成長の分析を介して判定された。

【0240】

ペルオキシソームが異化および同化での脂質代謝の双方にとって必要とされることが示唆されているが（Ｌｉｎ Ｙ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１３５：８１４−８２７頁（２００４年））、この仮説はＰｅｘ１６ｐの相同体を用いる試験に基づくものであった。より具体的には、Ｌｉｎ Ｙ．ら（上記）は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｓｅｅｄ １（ｓｓｅ１）突然変異体が、ｓｓｅ１種における野生型の約１０〜１６％へのオイルの低下に基づき、異常なペルオキシソーム生合成および脂肪酸合成の双方を有することを報告した。それに関し、Ｂｉｎｎｓ Ｄ．ら（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１７３（５）：７１９−７３１頁（２００６年））は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるペルオキシソーム−脂質体相互作用について検討し、２つのオルガネラ間での広域の物理的接触が、脂質体内部でのリポリーシスのペルオキシソーム脂肪酸酸化との共役を促進することを判定した。より詳細には、遊離脂肪酸対ＴＡＧの比が様々なＰｅｘノックアウトにおいて検討され、野生型に対して増加することが見出された。しかし、Ｐｅｘノックアウトを使用する試験は、出願人の譲受人による研究に先立ち、ＰＵＦＡを生成する生物において過去に実施されていなかった。

【0241】

本明細書中に記載の一部の好ましい組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主においては、宿主は、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様およびＰｅｘ２６ｐからなる群から選択されるペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子が欠如している。より好ましい破壊されたペルオキシソーム生合成因子タンパク質はＰｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ１０ｐおよび／またはＰｅｘ１２ｐであり、ここでこれら３つのＰｅｘタンパク質すべては、それらのＣ末端近傍にそれらの活性にとって必要とされることが予測される類似のＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフを有する（図２Ａ）。あるいは、破壊されたペルオキシソーム生合成因子タンパク質は、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ１０ｐおよびＰｅｘ１６ｐからなる群から選択される。

【0242】

ペルオキシソーム生合成因子タンパク質をコードする天然遺伝子の破壊は、遺伝子の一部の内部、例えばタンパク質のＮ末端部分の内部またはタンパク質のＣ末端部分の内部での挿入、欠失、または標的化突然変異でありうる。あるいは、破壊の結果、完全な遺伝子ノックアウトが遺伝子が宿主細胞ゲノムから除去される程度に生じうる。あるいは、破壊は、場合により、非機能的タンパク質をもたらす標的化突然変異でありうる。いずれの場合でも、破壊は、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない親株に対し、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主の全脂質画分中およびオイル画分中で、全脂肪酸のパーセントとしてのＰＵＦＡの量の増加をもたらす。

【0243】

下記、実施例に示され、また表５にまとめられるように、ＹｌＰｅｘ１０ｐのＣ_３ＨＣ_４ジンクリングフィンガーモチーフのＣ末端部分における破壊（実施例４および５）または全染色体ＹｌＰｅｘ１０遺伝子の欠失（実施例８）の双方により、天然Ｐｅｘ１０ｐが破壊されていない親株に対し、全脂質画分中およびオイル画分中で全脂肪酸のパーセントとしてＰＵＦＡの増加量を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変ＥＰＡ生成株が得られた。さらに、ゲノムＰｅｘ１０ｐ内での破壊を有する、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の改変ＥＰＡ生成株における染色体外ＹｌＰｅｘ１０ｐの発現および全脂質画分中およびオイル画分中でのＰＵＦＡの量の増加により、効果が失われた（実施例６）。

【0244】

より詳細には、表５は、Ｐｅｘ１０ｐの破壊またはノックアウトの存在または不在に基づき、全脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、所与の脂肪酸の全脂肪酸の重量パーセント［「％ＴＦＡ」］として表される濃度、および所与の脂肪酸の乾燥細胞重量のそのパーセント［「％ＤＣＷ」］としての含量に関する傾向が推定されうるように、実施例４、５、６および８の中に含められるデータをまとめたものである。「所望されるＰＵＦＡ％ＴＦＡ」および「所望されるＰＵＦＡ％ＤＣＷ」は、改変されたＰＵＦＡ生合成経路が生成するように設計された所望されるＰＵＦＡ産物（すなわちＥＰＡ）の特定の濃度または含量をそれぞれ定量化する。「全ＰＵＦＡ」は、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡを含む一方、「Ｃ２０ＰＵＦＡ」はＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡに限定される。

【0245】

【表13】

【0246】

次の結論が、（天然Ｐｅｘタンパク質が破壊されていない親株または破壊された天然Ｐｅｘタンパク質の「置換」コピーを発現していた親株に対して）導かれうる。すなわち、
１）ＰＵＦＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＰｅｘの破壊により、全脂質画分中およびオイル画分中で全脂肪酸の重量パーセント（％ＴＦＡ）に対する単一のＰＵＦＡ、例えばＥＰＡまたはＤＬＧＡの重量パーセントの増加がもたらされ、
２）ＰＵＦＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＰｅｘの破壊により、全脂質画分中およびオイル画分中で全脂肪酸の重量パーセントに対するＣ_２０ＰＵＦＡの重量パーセントの増加がもたらされ、
３）ポイント１）を拡張し、ＰＵＦＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＰｅｘの破壊により、全脂質画分中およびオイル画分中で全脂肪酸の重量パーセントに対するあらゆる組み合わせのＰＵＦＡの量の増加がもたらされ、かつ
４）ＰＵＦＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＰｅｘの破壊により、乾燥細胞重量に対する単一のＰＵＦＡ、例えばＥＰＡまたはＤＬＧＡのパーセントの増加がもたらされる。

【0247】

「全ＰＵＦＡ％ＤＣＷ」、「Ｃ２０ＰＵＦＡ％ＤＣＷ」およびＴＦＡ％ＤＣＷにおけるＰｅｘの破壊の効果を比較する場合、様々な結果が認められる。詳細には、場合によっては、ＰＵＦＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＰｅｘの破壊により、（天然Ｐｅｘタンパク質が破壊されていない親株に対する）全脂質画分中およびオイル画分中で乾燥細胞重量のパーセントとしてのＣ_２０ＰＵＦＡまたは全ＰＵＦＡの量の増加がもたらされる。他の場合、（天然Ｐｅｘタンパク質が破壊されていない親株に対する）全脂質画分中およびオイル画分中で乾燥細胞重量のパーセントとしてのＣ_２０ＰＵＦＡまたは全ＰＵＦＡの量が減少する。全脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）については、Ｐｅｘの破壊の効果が全脂質含量の増加または減少をいずれかもたらしうる点で同様の結果が認められる。

【0248】

ペルオキシソーム生合成因子タンパク質の、細胞内部の調整された機能性と作用する能力に基づき、任意の特定の説明または理論に拘束されたくないが、油性酵母細胞内部でのＰｅｘ遺伝子の破壊またはノックアウトが、ペルオキシソーム内で天然に生じるかまたはペルオキシソームによる作用を受ける異化および同化での脂質代謝の双方に作用すると仮定される。破壊またはノックアウトにより、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない油性酵母に対し、全脂肪酸のパーセントとしての全脂質画分中およびオイル画分中でのＰＵＦＡの量の増加がもたらされる。場合によっては、乾燥細胞重量のパーセントとしての全脂質画分中およびオイル画分中でのＰＵＦＡの量の増加、および／または乾燥細胞重量のパーセントとしての全脂質含量の増加もまた認められる。この一般化機構は、すべての真核生物、例えば藻類、真菌、卵菌、酵母、鞭毛虫、ストラメノパイル、植物および一部の哺乳動物系の内部に、すべてがペルオキシソームを含むことから適用可能であると仮定される。

【0249】

遺伝子ノックアウトのための破壊方法
当業者にとって、Ｕｒａ３、Ｌｙｓ５、Ｌｅｕ２、Ｐｏｘ１、Ｐｏｘ２、Ｐｏｘ３、Ｐｏｘ４、Ｐｏｘ５、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４ａ、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ、ＳＣＰ２［ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ］、ＤＧＡＴ２、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３ＢｐＰｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、Ｐｅｘ２６ｐおよびΔ１２デサチュラーゼからなる群から選択される天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子の破壊を行うための極めて多数の技術が利用可能であるが、一般的に特定の遺伝子の内因性活性は、次の技術、例えば、１）標的遺伝子の全部または一部の挿入、置換および／または欠失を介する遺伝子の破壊、または２）タンパク質の発現を制御する調節配列の操作、によって低下または除去されうる。これら技術の双方は下記に簡単に説明されるが、当業者であれば、これらが既存の文献において十分に記載がなされており、本明細書中に記載の方法、宿主細胞、および産物が限定されないことを理解するであろう。当業者はまた、任意の特定の油性酵母での使用にとって最適な技術を理解するであろう。

【0250】

挿入、置換および／または欠失を介する破壊：
遺伝子破壊においては、外来ＤＮＡ断片（典型的には選択可能マーカー遺伝子であるが、場合により発現時に所望の表現型を伝えるキメラ遺伝子またはキメラ遺伝子クラスタ）が標的化遺伝子にそのコード領域またはプロモーター配列を中断するために挿入され、そ
れにより遺伝子を機能的に不活性化する。破壊カセットの宿主細胞への形質転換の結果、外来ＤＮＡ断片との相同組換えによって機能的天然遺伝子の置換が行われる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７１：４６１７−４６２２頁（１９８９年）；Ｂａｌｂａｓら、Ｇｅｎｅ、１３６：２１１−２１３頁（１９９３年）；Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４：２５１９−２５２４頁（１９９６年）；およびＳｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２７０−２７７頁（１９９６年）を参照）。当業者は、陽性または陰性選択、遺伝子ノックアウトの作製、ならびに外因性ＤＮＡ配列の、例えば哺乳動物系、植物細胞、糸状真菌および／または微生物系における特定のゲノム部位への挿入を可能にする、遺伝子標的化の一般的方法の多数の変形を理解するであろう。この方法は、出願人によっては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において遺伝子破壊をもたらすための手段として好ましい（例えば、Ｌｅｕ−およびＵｒａ−をコードする天然遺伝子が、上記の手段を介し、本明細書中の実施例における様々な高ＥＰＡ生成組換え株中で破壊された）。

【0251】

しかし、上記のように、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は比較的低頻度の相同組換えを示し、それ故、発現カセットは、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノムの、ベクター内部に標的化遺伝子座が存在するにしても当初の標的化される位置以外に挿入されることが多い。この結果、本明細書中に示されるように、ランダムなヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の破壊が、例えばＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ、ＳＣＰ２およびＰｅｘ１０ｐをコードする天然遺伝子の破壊によってなされうる。

【0252】

遺伝子破壊の他の非特異的な方法は、転位因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンはランダムにＤＮＡに挿入する遺伝要素であるが、後に配列に基づく検索によって挿入の遺伝子座が判定されうる。インビボおよびインビトロでの転位技術の双方は既知であり、転位因子のトランスポーゼースとの併用を含む。転位因子またはトランスポゾンがトランスポーゼースの存在下で核酸断片と接触される場合、転位因子は核酸断片にランダムに挿入することになる。破壊された遺伝子が転位因子の配列に基づいて同定されうることから、この技術はランダム突然変異誘発および遺伝子単離にとって有用である。インビトロ転位のためのキットは市販されており、１）酵母Ｔｙ１因子に基づく、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手可能なＰｒｉｍｅｒ Ｉｓｌａｎｄ Ｔｒａｎｄｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｋｉｔ、２）細菌性トランスポゾンＴｎ７に基づく、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手可能なＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｉｍｉｍｇ Ｓｙｓｔｅｍ、および３）Ｔｎ５細菌転位因子に基づく、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手可能なＥＺ：：ＴＮ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓを含む。

【0253】

調節配列の操作：
特定の遺伝子の内因性活性はまた、タンパク質の発現を制御する調節配列の操作によって低下または除去されうる。当該技術分野で周知のように、コード配列に関連した調節配列は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置する転写および翻訳「制御」ヌクレオチド配列を含み、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を与える。したがって、遺伝子の調節配列の操作は、特定の遺伝子の遺伝子プロモーター、サイレンサー、５’未翻訳リーダー配列（転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、エンハンサー、開始制御領域、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造の操作を示しうる。しかし、すべての場合、操作の結果は遺伝子の発現のダウンレギュレーションである。

【0254】

したがって、例えば、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇとして同定されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＯＲＦのプロモーターは、本明細書中に記載の最適化された高ＥＰＡ生成株の一部において破壊された。同様の操作であれば、Ｕｒａ３、Ｌｙｓ５、Ｌｅｕ２、Ｐｏｘ１、Ｐｏｘ２、Ｐｏｘ３、Ｐｏｘ４、Ｐｏｘ５、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４ａ、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ、ＳＣＰ２［ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ］、ＤＧＡＴ２、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３ＢｐＰｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、Ｐｅｘ２６ｐおよび／またはΔ１２デサチュラーゼをコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子に対応する調節配列内部で行われ、その結果、遺伝子がダウンレギュレーションまたはノックアウトされうることは明らかであろう。あるいは、上記の遺伝子の中の１つの発現を駆動する天然プロモーターであれば、天然プロモーターに対して低減されたプロモーター活性を有する異種プロモーターと置換されうる。調節配列の操作にとって有用な方法は当業者に周知である。

【0255】

当業者は、当該技術分野で周知のこれらや他の方法を使用し、油性酵母細胞内部で、天然Ｕｒａ３、Ｌｙｓ５、Ｌｅｕ２、Ｐｏｘ１、Ｐｏｘ２、Ｐｏｘ３、Ｐｏｘ４、Ｐｏｘ５、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４ａ、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ、ＳＣＰ２［ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ］、ＤＧＡＴ２、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３ＢｐＰｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、Ｐｅｘ２６ｐおよび／またはΔ１２デサチュラーゼを破壊できるであろう。

【0256】

外来遺伝子の発現のための一般的発現系、カセット、ベクターおよび形質転換
外来タンパク質の高レベル発現を誘導する調節配列を有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれかを使用すれば、好ましいデサチュラーゼ、エロンガーゼおよびＣＰＴ１タンパク質をコードするキメラ遺伝子が作成されうる。次いで、これらのキメラ遺伝子を、形質転換の標準的方法を用いてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入することで、コードされた酵素の高レベル発現が提供されうる。

【0257】

ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞の形質転換に有用なベクター（例えば、コンストラクト、プラスミド）は当該技術分野で周知である。コンストラクト内に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質および形質転換細胞と非形質転換細胞を分離する手段案に依存している。しかし典型的には、ベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能マーカーおよび自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を有する。適切な発現カセットは、典型的には、転写開始を制御する遺伝子の領域５’（例えばプロモーター）、遺伝子コード配列、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’（すなわちターミネーター）を含む。両制御領域が形質転換宿主細胞由来の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、それらが生成宿主（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））として選択される特定種に固有の遺伝子に由来する必要はない。

【0258】

２種以上の遺伝子が別々の複製ベクターから発現される場合、各ベクターが異なる選択手段を有し、かつ、安定な発現を維持しかつコンストラクト内での因子の再組み合わせ（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を阻止するように他のコンストラクトに対する相同性が欠如することが望ましい。調節領域、選択手段および導入コンストラクトの増幅方法の選択が賢明か否かは実験的に判定可能であることから、すべての導入遺伝子が所望の産物の合成をもたらすための必要なレベルで発現される。

【0259】

目的の遺伝子を含むコンストラクトまたはベクターは、任意の標準技術によりヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）などの宿主細胞に導入されうる。これらの技術は、形質転換（例えば酢酸リチウムの形質転換［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６−１８７頁（１９９１年）］）、原形質融合、微粒子銃衝撃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｍｐａｃｔ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または目的の遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法を含む。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書およびＣｈｅｎ Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））に記載のようなＤＮＡの線状化断片に基づく組み込み技術が本明細書中でより好ましい。

【0260】

便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を用いるための任意の方法により操作されている宿主細胞は、本明細書中で「形質転換」、「形質転換体」または「組換え」と称される。形質転換宿主は発現カセットの少なくとも１つのコピーを有することになり、発現カセットがゲノムに組み込まれるかまたは複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかに依存して２つ以上を有しうる。形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載のように、様々な選択技術により同定されうる。

【0261】

本明細書において用いられる好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノ配糖体Ｇ４１８に対する耐性とともに、ウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジン欠損培地上で成長する能力である。他の実施形態では、５−フルオロオロチン酸（５−フルオロウラシル−６−カルボキシル酸一水和物；「５−ＦＯＡ」）は、酵母Ｕｒａ−突然変異体を選択するために用いられる。化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ（ＯＭＰデカルボキシラーゼ）をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して毒性がある（Ｂａｒｔｅｌ Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ２−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、第７巻、１０９−１４７頁、１９９７年）。

【0262】

より詳細には、最初に天然Ｕｒａ３遺伝子をノックアウトし、Ｕｒａ−表現型を有する株を生成でき、ここで選択性は５−ＦＯＡの耐性に基づいて生じる。次いで、複数のキメラ遺伝子群および新しいＵｒａ３遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムの異なる遺伝子座に組み込み、それによってＵｒａ＋表現型を有する新しい株を生成しうる。導入Ｕｒａ３遺伝子がノックアウトされる場合、その後の組み込みにより、（再び５−ＦＯＡの選択性を用いて同定された）新しいＵｒａ３−株が生成されうる。したがって、Ｕｒａ３遺伝子は、５−ＦＯＡの選択性と組み合わせて、複数回の形質転換での選択マーカーとして使用可能であることから、容易な方法で、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムに組み込まれるように容易に遺伝的修飾がなされうる。

【0263】

本明細書中で用いられる他の好ましい選択方法は、スルホニル尿素耐性に基づくヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における主要な非抗生物質マーカーに依存する。より詳細には、マーカー遺伝子は、スルホニル尿素除草剤耐性を付与する単一のアミノ酸変化すなわちＷ４９７Ｌを有する天然アセトヒドロキシ酸シンターゼである（「ＡＨＡＳ」またはアセト乳酸シンターゼ；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）（配列番号１２１；ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット）。ＡＨＡＳは分岐鎖アミノ酸の生合成における経路内の第１の共通の酵素であり、それはスルホニル尿素およびイミダゾリノン除草剤の標的である。

【0264】

選択マーカーを再生するためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における本明細書で用いられる追加的方法は、部位特異的リコンビナーゼ系に依存する。つまり、部位特異的組換え系は、２つの要素、すなわち１）特徴的なＤＮＡ配列を有する組換え部位［例えばＬｏｘＰ］、および２）組換え部位の２つ以上が同じＤＮＡ分子上で所与の間隔で同じ方向に方向づけられる場合、ＤＮＡ配列に特異的に結合し、ＤＮＡ配列間の組換え（すなわち切除）を触媒するリコンビナーゼ酵素［例えばＣｒｅ］からなる。この方法は、１対の好ましい選択マーカーを複数の逐次形質転換でのその使用において「再生する」ことが可能であることから、選択の手段としての有用性を有する。

【0265】

より詳細には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの挿入に対して望ましい標的遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１）および組換え部位に隣接される第１の選択マーカー（例えば、Ｕｒａ３、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ［ＨＰＴ］）を含む組み込みコンストラクトが作成される。形質転換体の形質転換および選択の後、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカー（例えばＡＨＡＳ）およびゲノムに導入される部位特異的組換え部位を認識するのに適切なリコンビナーゼを有する複製プラスミドの導入により、染色体から切除される。第２のマーカーを有するそれら形質転換体を選択し、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムからの第１の選択マーカーの切除を確認する時、複製プラスミドは選択の不在下で宿主から回復される。これにより第１でも第２でもない選択マーカーを有する形質転換体が生成され、それ故に回復された株は別のラウンドの形質転換に使用可能である。当業者は、本方法が本明細書で使用される特定の選択マーカーまたは部位特異的組換え系に限定されないことを理解するであろう。

【0266】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における外来遺伝子の過剰発現
当業者に周知であるように、単に遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１）をクローニングベクターに挿入することは、所望される速度、濃度、量などでその発現を保証するものではない。宿主細胞からの転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質の安定性および位置、酸素制限ならびに分泌に関する態様を制御する多数の異なる遺伝要素を操作することが望ましい場合がある。より詳細には、遺伝子発現は、次の事柄、すなわち関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；クローン化遺伝子のコピーの数；遺伝子がプラスミドに担持されるかまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれるか；合成された外来タンパク質の最終の細胞位置；宿主生物における翻訳の効率；宿主細胞内部のクローン化遺伝子／タンパク質の固有安定性；およびクローン化遺伝子内部でのコドン使用を、その頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように改変することによって制御されうる。過剰発現のこれら方法のいくつかは下記に考察されることになり、例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼおよびＣＰＴ１タンパク質を過剰発現するための手段として、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞において有用である。

【0267】

所望される遺伝子の発現は、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかからの不安定化配列の除去／欠失または安定化配列のｍＲＮＡへの付加により、発現の増大を引き起こすより強力なプロモーター（調節性または構成的のいずれか）の使用を介し、転写レベルで増大しうる（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。

【0268】

ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞における異種遺伝子またはその一部の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは極めて多数あり、当業者に既知である。発現は誘導的または構成的になされうる。誘導的発現は目的の遺伝子に作動可能に連結される調節可能なプロモーターの活性を誘導することによってなされうる一方、構成的発現は目的の遺伝子に作動可能に連結される構成的プロモーターの使用によってなされうる。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるデサチュラーゼ、エロンガーゼおよびＣＰＴ１遺伝子の発現を指令可能な仮想的に任意のプロモーター（すなわち、天然、合成、またはキメラ）が適切となるが、宿主種に由来する転写および翻訳領域は特に有用である。（例えば、構成的または誘導的転写のいずれが所望されるか、目的のＯＲＦの発現におけるプロモーターの効率、作成の容易性などに依存し）ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における遺伝子の発現にとって使用可能な多数の調節配列が存在するのに反し、好ましい実施形態では、プロモーターは下の表６に示されるもの（またはそれらの誘導体）から選択される。下記プロモーターの活性の比較が、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットに提供される。

【0269】

【表14】

【0270】

当然のことながら、他の実施形態では、表６に記載のプロモーター領域のいずれかに由来する他のプロモーターをヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種発現においても使用し、ＴＡＧ中および全脂質画分中でのＥＰＡの高レベルの生成および蓄積が促進されうる。特に、上記のプロモーターのいずれかの長さの修飾により、同一のまたは改変された活性を有する突然変異体プロモーターが得られうるが、プロモーターはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における遺伝子発現を駆動するようにさらに機能的となる。

【0271】

一般的に、終結領域は、開始領域が得られた元の遺伝子の３’領域または異なる遺伝子に由来しうる。多数の終結領域は既知であり、同じ属および異なる属とそれらが得られた元の種の双方において用いられる場合、種々の宿主内で十分に機能する。終結領域は通常、任意の特定の性質が理由というよりも便宜上選択される。好ましくは、終結領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、スキゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類遺伝子の３’領域はまた、酵母内で機能することが知られている。３’領域はまた、当業者が入手可能な情報を利用し、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列を設計し、合成しうることから合成でありうる。終結部位は不要でありうるが、それは極めて好ましい。

【0272】

本明細書中での開示において有用な終結領域は、限定を意図されていないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に特有の様々な遺伝子に由来し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞外プロテアーゼ（ＸＰＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１７７４１）；アシル−ｃｏＡオキシダーゼ（Ａｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１および登録番号ＣＡＡ０４６６１；Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４）ターミネーター；Ｐｅｘ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０５４６１３）ターミネーター；Ｐｅｘ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７５４３３）ターミネーター；Ｌｉｐ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）ターミネーター；Ｌｉｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）ターミネーター；および３−オキソアシル−ｃｏＡチオラーゼ（ＯＣＴ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６９９８８）ターミネーターの約１００ｂｐの３’領域を含む。

【0273】

ＰＵＦＡ生合成経路デサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子および／またはＣＰＴ１遺伝子のさらなるコピー（すなわち２つ以上のコピー）をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に導入することで、ＥＰＡの生成および蓄積が増大しうる。詳細には、遺伝子のさらなるコピーが単一の発現コンストラクト内部にクローン化され、および／または、クローン化遺伝子のさらなるコピーがプラスミドコピー数の増加またはクローン化遺伝子のゲノムへの複数の組み込みによって宿主細胞に導入されうる（下記）。例えば、一実施形態では、Δ９エロンガーゼの４コピー、Δ８デサチュラーゼの４コピー、Δ５デサチュラーゼの３コピー、Δ１７デサチュラーゼの３コピー、Δ１２デサチュラーゼの３コピーおよびＣ_{１６／１８}エロンガーゼの１コピーを含むキメラ遺伝子のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの導入および組み込みにより、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株（すなわち株Ｙ４１２８）を改変し、全脂肪酸のパーセントとして３７．６％超のＥＰＡが生成された。

【0274】

同様に、他の実施形態では、Δ９エロンガーゼの７コピー、Δ８デサチュラーゼの７コピー、Δ５デサチュラーゼの５コピー、Δ１７デサチュラーゼの３コピー、Δ１２デサチュラーゼの５コピー、Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼの３コピーおよびジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ（ＣＰＴ１）の２コピーを含むキメラ遺伝子のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムへの導入および組み込みにより、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株Ｙ４３０５を改変し、全脂肪酸のパーセントとして５３．２％超のＥＰＡが生成された。

【0275】

本明細書中の方法に従い、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の最適化株を調製する場合、様々なデサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびＣＰＴ１のコピーは次のように称されることが多いことに留意することが重要である。例えばΔ９エロンガーゼの２コピーが必要とされる場合、これは１）単一種から単離される特定のΔ９エロンガーゼにおける同一のコード配列の２つのコピー、または２）種「Ａ」から単離されるΔ９エロンガーゼにおける１つのコード配列および種「Ｂ」から単離されるΔ９エロンガーゼにおける１つのコード配列（それ故、集合的に２つのΔ９エロンガーゼをもたらす）を示しうる。

【0276】

一般的に、一旦、油性酵母における発現に適する（例えば、プロモーター、ＯＲＦおよびターミネーターを含むキメラ遺伝子を含む）ＤＮＡカセットが得られていると、それは宿主細胞内で自律複製可能なプラスミドベクターに配置されるかまたは宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内部にランダムに生じうるか、または宿主遺伝子座での組換えの標的化に十分な宿主ゲノムと相同性がある領域を有するコンストラクトの使用によって標的化されうる。本明細書中に左右されないが、転写および翻訳調節領域の全部または一部が、コンストラクトが内因性遺伝子座に対して標的化される場合での内因性遺伝子座によって提供されうる。

【0277】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内で遺伝子を発現する好ましい方法は、線形ＤＮＡ断片の宿主のゲノムへの組み込みによるものである。ゲノム内部の複数の位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用でありうる。このような目的で、複数のコピー中に存在するゲノム内部の配列、例えば、少なくとも３５コピー／ゲノムおよび５０〜６０コピー／ゲノムでヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の一部の株のゲノム全体にわたって分散的様式で存在するＹｌｔ１および単独のζ（ｚｅｔａ）因子を同定することは望ましい（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔ．、１７６（９）：２４７７−２４８２頁（１９９４年））。しかし残念なことに、ｚｅｔａ領域を有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株は全部ではない（例えばＡＴＣＣ＃２０３６２として同定された株）。株においてかかる領域が欠損している場合、発現カセットを有する線状化ＤＮＡ断片を他の遺伝子座に組み込み、所望されるコピー数にすることも可能である。例えば、好ましい他の遺伝子座は、Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０３２４４；またはＡｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子座（米国特許第７，２１４，４９１号明細書）、Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）および／またはＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）を含む。他の実施形態では、Ｐｏｘ１、Ｐｏｘ４、Ｐｏｘ５、Ｌｉｐ３、Ｌｉｐ４ａ、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ、ＳＣＰ２［ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ］、ＤＧＡＴ２、Ｐｅｘ１ｐ、Ｐｅｘ２ｐ、Ｐｅｘ３ｐ、Ｐｅｘ３Ｂｐ、Ｐｅｘ４ｐ、Ｐｅｘ５ｐ、Ｐｅｘ５Ｂｐ、Ｐｅｘ５Ｃｐ、Ｐｅｘ５／２０ｐ、Ｐｅｘ６ｐ、Ｐｅｘ７ｐ、Ｐｅｘ８ｐ、Ｐｅｘ１０ｐ、Ｐｅｘ１２ｐ、Ｐｅｘ１３ｐ、Ｐｅｘ１４ｐ、Ｐｅｘ１５ｐ、Ｐｅｘ１６ｐ、Ｐｅｘ１７ｐ、Ｐｅｘ１４／１７ｐ、Ｐｅｘ１８ｐ、Ｐｅｘ１９ｐ、Ｐｅｘ２０ｐ、Ｐｅｘ２１ｐ、Ｐｅｘ２１Ｂ、Ｐｅｘ２２ｐ、Ｐｅｘ２２ｐ様、Ｐｅｘ２６ｐおよびΔ１２デサチュラーゼ遺伝子座は、上記のようにコンストラクトの組み込みにとって有用でありうる。

【0278】

Ｊｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ、１８：９７−１１３頁（２００１年））は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内での組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個別の形質転換体、レシピエント株および標的化プラットフォームに依存することに言及している。したがって、当業者は、複数の形質転換体が、所望される発現レベルおよびパターンを示す株を得るためにスクリーニングされる必要があることを理解するであろう。かかるスクリーニングはＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１−２）：１３３−１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウエスタン分析、表現型分析またはＰＵＦＡ産物のＧＣ分析によって行われうる。

【0279】

ＥＰＡ生成のための発酵プロセス
形質転換微生物宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＣＰＴ１などをコードする）の発現を最適化し、最大でかつ最も経済的な収量のＥＰＡを生成する条件下で成長させる。一般に、培地条件は、炭素供給源のタイプおよび量、窒素供給源のタイプおよび量、炭素対窒素比、異なるミネラルイオンの量、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、オイル蓄積段階の長さ、ならびに細胞採取の時間および方法を変更することによって最適化可能である。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、一般に、酵母抽出物−ペプトン−デキストロース培養液（ＹＰＤ）などの複合培地中、または成長にとって必要な成分が欠如することから所望の発現カセット（例えばＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））の選択が強いられる化学的組成の明らかな（ｄｅｆｉｎｅｄ）最少培地中で成長させる。

【0280】

本明細書に記載の方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に教示されるような適切な炭素供給源を含有する必要がある。本発明において用いられる炭素の供給源が多種多様な炭素を有する供給源を包含しうると考えられるが、好ましい炭素供給源は糖類、グリセロールおよび／または脂肪酸である。グルコースおよび／または１０〜２２個の炭素を有する脂肪酸が最も好ましい。

【0281】

窒素は、無機（例えば（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸塩）供給源から供給されうる。発酵培地はまた、適切な炭素および窒素供給源に加え、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液、ビタミンおよびＥＰＡ生産性の高い油性酵母の成長やＥＰＡ生成用の酵素経路の促進に適する当業者に既知の他の成分を含有する必要がある。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する数種の金属イオン（Ｆｅ^＋２、Ｃｕ^＋２、Ｍｎ^＋２、Ｃｏ^＋２、Ｚｎ^＋２、およびＭｇ^＋２など）に対して特別な注意が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ Ｔ．ら、Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｏｉｌｓ、Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編 ６１−９７頁（１９９２年））。

【0282】

本明細書に記載の方法および宿主細胞に好ましい成長培地は、一般的な商業的に調製された培地、例えばＹｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））である。他の限定または合成された成長培地の使用も可能であり、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の成長に適する培地について微生物学または発酵科学における当業者は知っているであろう。発酵に適するｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、ここではｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件における範囲として好ましい。発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、ここでは微好気条件が好ましい。

【0283】

典型的には、代謝状態が脂肪の成長および合成／保存の間で「均衡化」されなければならないことから、油性酵母細胞内での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には２段階のプロセスが必要である。したがって、最も好ましくは、２段階発酵プロセスはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）内でのＥＰＡの生成にとって必要である。このアプローチは、様々な適切な発酵プロセスの設計（すなわち、バッチ、供給バッチおよび連続）および成長の間での検討事項として、米国特許第７，２３８，４８２号明細書中に記載されている。

【0284】

ＥＰＡの精製およびプロセシング
本明細書中の一部の態様では、一次産物は油性酵母バイオマスである。したがって、バイオマス由来のＥＰＡ含有オイルの単離および精製が必要でありうる（すなわちここでは全細胞バイオマスが産物である）。

【0285】

しかし、特定の最終使用および／または産物形態では、バイオマス由来のＥＰＡ含有オイルの部分的および／または完全な単離／精製により、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡを得ることが必要でありうる。ＥＰＡを含むＰＵＦＡは、遊離脂肪酸としてかまたはアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質または糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物（例えばヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ））において見出されうる。これらの脂肪酸は、当該技術分野で周知の種々の手段を介して宿主細胞から抽出されうる。酵母脂質における抽出技術、品質分析、および合格基準（ａｃｃｅｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）に関する１つのレビューがＺ．Ｊａｃｏｂｓのものである（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３−４９１頁（１９９２年））。下流加工に関する簡単なレビューについてもＡ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄによるものが入手可能である（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１−３１２頁（１９９７年））。

【0286】

一般に、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス由来のＥＰＡおよび他のＰＵＦＡを精製するための手段は、有機溶媒での抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば二酸化炭素を使用）、鹸化およびプレス、ビードビーターなどの物理的手段、またはこれらの組み合わせを含みうる。さらなる詳細については、米国特許第７，２３８，４８２号明細書の教示内容が参照のこと。

【0287】

精錬および／または精製されているＥＰＡ含有オイルは水素添加され、それにより様々な融解特性およびテクスチャを有する脂肪が得られうる。スプレッド、製菓用脂肪（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎａｒｙ ｆａｔ）、硬質バター、マーガリン、ベーキングショートニングなどを含む多数の加工脂肪は、室温で異なる程度の固形性を必要とし、油源の物理特性の改変のみを介して製造されうる。これは最も一般的には触媒水素添加を介して行われる（さらなる詳細および参照についてはＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照）。

【0288】

ＥＰＡを含有する組成物の使用
ＥＰＡを含む油性酵母バイオマスを含有する、食品、調製粉乳、機能食品、医療食品、医療用栄養食品、栄養補助食品、医薬組成物、動物飼料、およびパーソナルケア製品が本明細書中に提供される。同様に、ＥＰＡまたは組換え油性酵母バイオマスから単離されるＥＰＡを含む微生物オイルを含有する、食品、調製粉乳、栄養補助食品、医薬組成物、動物飼料、およびパーソナルケア製品もまた提供される。

【0289】

加工および製剤の当業者は、バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡのいかなる量および組成物が標的種および／または最終使用に応じて特定の産物に添加されうるかを理解するであろう。より詳細には、「有効」量が製剤に取り込まれる必要があるが、この量は、食品または飼料製品、製品による補助が意図された食事、あるいは医療食品または医療用栄養食品による是正または治療が意図された病状に依存することになる。

【0290】

最も望ましくは、ＥＰＡの有効量はω−３／ω−６ ＰＵＦＡの消費に関連した所望の健康特性をもたらすのに十分となる。典型的には、製品に取り込まれるＥＰＡの量においては、数例を挙げると、加工条件、典型的な処理および貯蔵条件、製品におけるＥＰＡの安定性、および標的種の場合でのバイオアベイラビリティ／生体吸収効率に関連した減少が考慮される。

【0291】

加工および製剤の当業者は、本明細書中に記載の組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主細胞から生成されるオイルを濃縮し、それにより全脂質画分中のＥＰＡの濃度をそれが少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％もしくはさらに少なくとも約９０％のＥＰＡを含有するように増加させるためのプロセスに精通しているであろう。本明細書中に記載の精製オイルを他の精製脂肪酸（例えば、ＬＡ、ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ）または代替脂肪酸を含有するオイルと好ましい濃度で混和するための手段はまた、当業者に周知である。これらの技術により、独自に調整された脂肪特性を含むオイルを容易に製造可能である。

【0292】

パーソナルケア製品：
パーソナルケア製品との関連の中で、ω−３脂肪酸は、スキンコンディショニング効果を高めるために使用されうる場合、皮膚製剤における特定の用途を有する。当業者は、関連のω−３脂肪酸またはそれを含むオイルの有効量をスキンケア組成物にいかに提供するかを理解するであろう。ＰＵＦＡオイルまたはω−３脂肪酸に加え、スキンケア組成物は、スキンケア組成物にとって美容上許容可能な媒体をさらに含有する場合があり、その例がＰｈｉｌｉｐｐｅら、米国特許第６，２８０，７４７号明細書に記載されている。例えば、美容上許容可能な媒体は、脂肪相が少なくとも１つの液体、固体または半固体脂肪物質を含有する場合、一般的に組成物の全重量に対する約１０重量％〜約９０重量％の割合で脂肪物質を含有する無水組成物でありうる。脂肪物質は、限定はされないが、オイル、ワックス、ガム、およびいわゆる粥状脂肪物質を含む。あるいは、組成物は、油中水または水中油エマルジョンなどの安定な分散剤の形態でありうる。さらに、組成物は、限定はされないが、抗酸化剤、保存料、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、浸潤剤およびアニオン性、非イオン性もしくは両性ポリマー、ならびに色素を含む、１種以上の従来の化粧品または皮膚用添加剤（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）またはアジュバントを含有しうる。

【0293】

食品：
市場は、現行ではω−３および／またはω−６脂肪酸（特にＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ）を取り入れた多種多様な食品および飼料製品を支持している。本明細書中に記載の酵母バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡが、食品中で、現行の製剤の健康上の利点をもたらすように機能すると考えられる。

【0294】

本明細書中に記載の酵母宿主によって生成されるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡは、限定はされないが、食品類似体、飲料、肉製品、穀物製品、焼成食品、スナック食品および乳製品を含む種々の食品中での使用に適することとなる。

【0295】

食品類似物は当業者に周知のプロセスを用いて製造されうる。肉類似物、チーズ類似物、ミルク類似品などについても言及可能である。大豆から作られる肉類似品は、種々の肉を模倣するため、大豆タンパク質または豆腐および一緒に混合される他の原料を含有する。これらの肉代替品は冷凍、缶詰または乾燥食品として販売される。通常、それらはその代替食品と同様に用いられうる。肉代替品の例として、限定はされないが、ハム類似品、ソーセージ類似品、ベーコン類似品などが挙げられる。

【0296】

食品類似物は、その機能および組成特性に応じて模倣物または代替物として分類されうる。例えば、イミテーションチーズはその代替用に設計されたチーズにあくまで類似する必要がある。しかし、製品は一般に、それが代替しているチーズに対して栄養的に等価であり、かつそのチーズにおける最低限の組成要件を満たす場合に限って代替チーズと称されうる。したがって、代替チーズは、イミテーションチーズよりも高いタンパク質レベルを有し、ビタミンおよびミネラルで強化されることが多くなる。

【0297】

ミルク類似品または非乳食品として、限定はされないが、イミテーションミルクおよび非乳食品の冷凍デザート（例えば大豆から作られるものおよび／または大豆タンパク質製品）が挙げられる。

【0298】

肉製品は多種多様な製品を包含する。米国では、「肉」は牛、豚および羊から生産される「赤肉」を含む。赤肉に加え、鶏、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、アヒルや魚および貝を含む家禽製品がある。加工された調味肉製品には、新鮮肉、塩漬け肉および揚げ肉や塩漬けされ調理された肉といった幅広い品揃えがある。ソーセージおよびホットドックは加工肉製品の例である。したがって、本明細書で用いられる「肉製品」という用語は、限定はされないが加工肉製品を含む。

【0299】

穀物食品は穀物の加工から得られる食品である。穀物は食用穀物（種子）を生成するイネ科由来の任意の植物を含む。最も有名な穀物は、大麦、トウモロコシ、キビ、オート麦、キノア、米、ライ麦、サトウモロコシ、ライ小麦、小麦およびワイルドライスである。穀物食品の例として、限定はされないが、全粒、破砕穀物（ｃｒｕｓｈｅｄ ｇｒａｉｎ）、グリット、小麦粉、ぬか、胚芽、朝食用シリアル、押出食品（ｅｘｔｒｕｄｅｄ ｆｏｏｄｓ）、パスタなどが挙げられる。

【0300】

焼き食品（ｂａｋｅｄ ｇｏｏｄｓ ｐｒｏｄｕｃｔ）は、上記の穀物食品のいずれかを含み、ベーキング（すなわち加熱による乾燥または硬化）と同様の方法での焼き付けまたは加工がなされている。焼き食品の例として、限定はされないが、パン、ケーキ、ドーナツ、棒状の食品（ｂａｒｓ）、パスタ、パン粉、ベークドスナック（ｂａｋｅｄ ｓｎａｃｋｓ）、ミニビスケット、ミニクラッカー、ミニクッキー、およびミニプレッツェルが挙げられる。上記のように、組換えＥＰＡ生成宿主細胞由来のオイルは原料として用いられうる。

【0301】

スナック食品は、上記または下記の食品のいずれかを含む。

【0302】

フライ食品は、揚げられている上記または下記の食品のいずれかを含む。

【0303】

飲料は、液体中にかまたは乾燥粉末形態で存在しうる。例えば、非炭酸飲料；フルーツジュース、フレッシュジュース、冷凍ジュース、缶ジュースまたは濃縮ジュース；フレーバーまたはプレーンの乳飲料についての言及が可能である。成人用および乳児用栄養製剤は当該技術分野で周知であり、市販されている（例えば、Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＳｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）、およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標））。

【0304】

乳製品はミルクから得られる製品である。ミルク類似品または非乳製品、例えば豆乳は、上で考察したようにミルク以外の供給源から得られる。これらの製品として、限定はされないが、全乳、スキムミルク、ヨーグルトまたは酸乳などの発酵乳製品、クリーム、バター、濃縮ミルク、粉ミルク、コーヒーホワイトナー、コーヒークリーマ、アイスクリーム、チーズなどが挙げられる。

【0305】

ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡが含有されうるさらなる食品として、例えば、チューイングガム、菓子およびフロスティング、ゼラチンおよびプディング、ハードおよびソフトキャンデー、ジャムおよびゼリー、白グラニュー糖、糖代替物、スイートソース、トッピングおよびシロップ、ならびにドライブレンドされた粉体混合物が挙げられる。

【0306】

調製粉乳：
調製粉乳は幼児および若年小児に供給される液体または再構成粉乳である。「調製粉乳」は、本明細書中で幼児への供給においてヒト母乳と代替可能な経腸栄養製剤と規定され、典型的には、水溶液中で所望される百分率の炭水化物およびタンパク質と混合された所望される百分率の脂肪からなる（例えば米国特許第４，６７０，２８５号明細書を参照）。世界的な組成物の研究ならびに専門家集団によって特定されるレベルに基づき、平均のヒト母乳は典型的には（脂肪から約５０％のカロリーを仮定すると）約０．２０％〜０．４０％の全脂肪酸を含有し、一般的にはＤＨＡ対ＡＲＡの比であれば約１：１〜１：２の範囲となる（例えば、Ｅｎｆａｍｉｌ ＬＩＰＩＬ（商標）［Ｍｅａｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ］およびＳｉｍｉｌａｃ Ａｄｖａｎｃｅ（商標）［Ｒｏｓｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］の製剤を参照）。調製粉乳は、幼児にとっての唯一の栄養源であることが多いことから、幼児の食事において果たすべき特別な役割を果たす。依然として授乳が幼児における最良の栄養であるが、調製粉乳は乳児が生存するだけでなく成長する上での第２の同等物である。

【0307】

健康食品および医薬品：
本バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡは、機能食品、医療食品、医療用栄養食品および栄養補助食品を含む健康食品において健康上の利点を与えるように製剤中で使用されうる。さらに、本発明のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡは、標準の医薬組成物中で使用されうる。ＥＰＡを含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本改変株またはそれから生成される微生物オイルであれば、上記食品のいずれかに容易に取り込まれ、それにより例えば機能または医療食品の生産が可能である。例えば、ＥＰＡを含有するより濃縮された製剤は、ヒトまたはヒト以外の動物における栄養補助食品として使用可能な、カプセル、粉末、タブレット、ソフトゲル、ジェルキャップ、液体濃縮物およびエマルジョンを含む。

【0308】

動物飼料製品：
動物飼料は、一般的に、ヒト以外の動物における飼料としての使用または飼料中での混合が意図された製品として本明細書中で規定される。本明細書中に記載のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）バイオマス、部分精製バイオマス、精製オイル、および／または精製ＥＰＡは、様々な動物飼料中の原料として使用されうる。

【0309】

より詳細には、限定されるものと解釈されないが、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主細胞由来のＥＰＡ生成物がペット食品、反芻動物および家禽食品ならびに養殖食品の中で使用可能であると想定される。ペット食品は、犬、猫、鳥、爬虫類、齧歯類などのペットへの給与が意図された食品である。これらの食品は、上記の穀物および健康食品、ならびに肉および肉副産物、大豆タンパク質製品、アルファルファ、オオアワガエリ、オートまたはスズメノチャヒキ、野菜などの、生草および乾草製品を含みうる。反芻動物および家禽食品は、例えば、七面鳥、チキン、牛、および豚への給与が意図された食品である。上記ペット食品と同様、これらの食品は、上に列挙される穀物および健康食品、大豆タンパク質製品、肉および肉副産物、および生草および乾草製品を含みうる。養殖食品（または「養殖飼料」）は養殖での使用が意図された食品であり、それは増殖、培養または水生生物および／または動物の淡水または海水中での飼育に関する。

【0310】

高濃度のＥＰＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本改変株を大部分の動物飼料製剤中に含めることが特に有用となると考えられる。必要なω−３ ＰＵＦＡの提供に加え、酵母自体は、動物の健康および栄養全体に寄与するとともに製剤の嗜好性を高めうるタンパク質および他の栄養素（例えば、ビタミン、ミネラル、核酸、複合炭水化物など）の有用な供給源である。したがって、組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主を含む酵母バイオマスの添加が動物飼料製剤中の飼料栄養素の優れた追加的供給源となると考えられる。より詳細には、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃２０３６２）は、乾燥細胞重量に対するパーセントとして次の大体の化学組成、すなわち３５％のタンパク質、４０％の脂質、１０％の炭水化物、５％の核酸、５％の灰分および５％の水分を有する。さらに、炭水化物画分中で、β−グルカンを約４５．６ｍｇ／ｇ含有し、マンナンを約１１．４ｍｇ／ｇ含有し、またキチンを約５２．６ｍｇ／ｇを含有する（一方、トレハロースは微量成分である［約０．７ｍｇ／ｇ］）。

【0311】

多数の文献において、β−グルカン、マンナンおよびキチンの免疫調節効果が検討されている（ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット中で概説されている）。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の固有のタンパク質：脂質：炭水化物組成物および（マンナン：β−グルカン：キチンの約１：４：４．６の比を含む）固有の複合炭水化物特性に基づき、本明細書中に記載の遺伝子組換えされた酵母細胞（またはその一部）であれば、動物飼料製剤に対する有用な添加物となる。これは、例えば全［凍結乾燥］酵母細胞、精製細胞壁、精製酵母炭水化物の添加または様々な他の断片化形態の添加によって生じうると思われる。

【0312】

養殖業に関しては、様々な魚種における栄養上の要件および飼料製造における技術的進歩に対する理解の深まりにより、製造または人工飼料（調合飼料）の開発および使用から、天然飼料を補助するかまたは置き換えることが可能になっている。しかし、一般的には、養殖魚用飼料中に含まれる一般的割合の様々な栄養素は、（乾燥飼料によるパーセントについては）：３２〜４５％のタンパク質、４〜２８％の脂肪（ここでは少なくとも１〜２％がω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡである）、１０〜３０％の炭水化物、１．０〜２．５％のミネラルおよび１．０〜２．５％のビタミンを含む。種々の他の原料が、場合によって製剤に添加されうる。これらは、１）肉および皮膚の着色をそれぞれ促進するための、特にサケ科および装飾用の「観賞」魚におけるカロチノイド；２）ペレットに安定性をもたらしかつ栄養素の水への浸出を低減するための結合剤（例えば、牛の心臓肉、デンプン、セルロース、ペクチン、ゼラチン、アラビアゴム、イナゴマメ、寒天、カラゲニンおよび他のアルギン酸塩）；３）魚飼料の貯蔵寿命を延長しかつ脂肪の酸敗臭を低減するための保存料、例えば抗菌剤および抗酸化剤（例えば、ビタミンＥ、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、エトキシキン、ならびにプロピオン酸、安息香酸またはソルビン酸のナトリウムおよびカリウム塩）；４）飼料の嗜好性およびその摂取を促進するための化学誘引物質および香味料；ならびに５）他の飼料を含む。これらの他の飼料は、飼料の栄養価を高め、魚によるその許容性を高めるための、繊維質および灰分（充填剤として、またそれぞれカルシウムおよびリンの供給源として使用される）などの原料、ならびに植物質および／または魚もしくはスクイッドミール（例えば、生きた藻、凍った藻もしくは乾いた藻、ブラインシュリンプ、クルマムシまたは他の動物性プランクトン）を含みうる。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｆｉｓｈ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）、１９９３年）は、魚における必須栄養素および様々な原料の栄養素含量についての詳細な説明を提供する。

【0313】

アクアフィード製剤の製造では、完全な飼料が、栄養的にバランスがとれ、味が良く、耐水性があり、かつ適切なサイズおよびテクスチャを有する必要があることから、種々の要素を考慮する必要がある。アクアフィードの栄養組成物に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｆｏｒ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｅｅｄｓ」（Ｈｅｒｔｒａｍｐｆ Ｊ．Ｗ．およびＦ Ｐｉｅｄａｄ−Ｐａｓｃｕａｌ．Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、２０００年）および「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｆａｒｍｅｄ Ｆｉｓｈ ａｎｄ Ｓｈｒｉｍｐ」（Ｔａｃｏｎ Ａ．Ｇ．Ｊ．Ａｒｇｅｎｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｅｄｍｏｎｄ）、１９９０年）が参照される。一般的に、飼料は、乾燥（すなわち６〜１０％の最終含水率）、半湿潤（すなわち３５〜４０％の含水率）または湿潤（すなわち５０〜７０％の含水率）であるように調合される。乾燥飼料は、次のもの、すなわち乾燥原料の単純な遊離混合物（すなわち「マッシュ」または「ミール」）；圧縮ペレット、クランブルまたは顆粒；およびフレークを含む。魚の給餌要件に依存し、ペレットは沈殿または浮遊するように作製されうる。半湿潤および湿潤飼料は、単一または混合原料、例えば雑魚または調理されたレグメ（ｌｅｇｕｍｅｓ）から作製され、ケーキ状またはボール状に形作られうる。

【0314】

そこでは高濃度のＥＰＡを生成するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本改変株を大部分の養殖飼料中に含めることが特に有用となることは明らかである。必要なω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡの提供に加え、酵母自体は製剤の嗜好性を高めうるタンパク質の有用な供給源である。他の実施形態であれば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の本株によって生成されるオイルは、細胞塊からの抽出および精製後、養殖飼料製剤に直接導入されうる。

【0315】

ＥＰＡの補給から得られる臨床健康上の利点
ＥＰＡの栄養補助食品が血清コレステロールおよびトリグリセリドの低下に有用であることが示されているが、例えば、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性疾患（例えば関節リウマチ）、肺および腎疾患、ＩＩ型糖尿病、肥満、潰瘍性大腸炎、クローン病、拒食症、やけど、骨関節炎、骨粗鬆症、注意欠陥／多動性障害、結腸直腸癌の初期ステージおよび精神障害（例えば統合失調症）（例えば、ＭｃＣｏｌｌ Ｊ．、ＮｕｔｒａＣｏｓ、２（４）：３５−４０頁（２００３年）；Ｓｉｎｃｌａｉｒ Ａ．ら、Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈｆｕｌ Ｌｉｐｉｄｓ；Ｃ．Ｃ．ＡｋｏｈおよびＯ．−Ｍ．Ｌａｉ編；ＡＯＣＳ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，ＩＬ）（２００５年）、第１６章の概説を参照）において有益な効果を有するが、これらの臨床観察の根底にある分子的および生化学的機構は依然として解明されていない。特に、多数の先行研究では、個別の長鎖ω−３脂肪酸（例えばＥＰＡおよびＤＨＡ）が代謝的かつ機能的に互いに明確に分かれており、それ故に各々が特定の生理的機能を有しうることが把握できていなかった。このような機構的な明確さの欠如は、臨床研究における純粋なＥＰＡまたは純粋なＤＨＡの使用とは対照的に、主にＰＵＦＡの供給源としての魚油の使用の結果である［メンハーデン、タラの肝臓、イワシおよびアンチョビーに由来するオイルの脂肪酸組成物は、（「Ｔｈｅ Ｌｉｐｉｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、第２版；Ｆ．Ｄ．Ｇｕｎｓｔｏｎｅ、Ｊ．Ｌ．ＨａｒｗｏｏｄおよびＦ．Ｂ．Ｐａｄｌｅｙ編；Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、１９９４年の中のデータに基づくと）例えば約０．９：１〜１．６：１のＥＰＡ：ＤＨＡ比を有するオイルを含む］。それに反し、ＥＰＡがそれ自体重要なω−３脂肪酸であるという認識が高まりつつある。その結果、本明細書中で、本明細書中に記載の組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）生成宿主のＥＰＡリッチオイルが、種々の治療用途、例えば、炎症、心臓血管疾患、遺伝子発現の栄養調節および脂質異常症において、また詳細には冠動脈心疾患、高血圧、炎症性疾患、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、拒食症、やけど、骨関節炎、骨粗鬆症、および注意欠陥／多動性障害を含む臨床症状の治療において極めて広範な有用性を有することが想定される。

【0316】

これら用途の各々に関する下記の結果はヒトの臨床研究に基づくが、これは限定的なものとして解釈されるべきではなく、具体的には、出願人は種々の他の動物（例えば、家庭のペット類、反すう動物、家禽、魚など）における類似の健康不安の治療のためのＥＰＡリッチオイルの使用を予見している。

【0317】

ＥＰＡおよび炎症：
多数の生化学的機構は、魚油によって伝えられる抗炎症特性を説明することを提示している。現在、周知の機構によると、ω−３脂肪酸が炎症性細胞膜内でのω−６脂肪酸の量を減少させ、かつω−６脂肪酸に由来する炎症誘発性メディエーター（例えばシリーズ２プロスタグランジンおよびシリーズ４ロイコトリエン）の合成を可能にするω−６脂肪酸代謝を阻害することが示唆される。さらに、ω−３脂肪酸は、強力な炎症性メディエーター（例えばシリーズ３プロスタグランジンおよびシリーズ５ロイコトリエン）を生じさせる。しかし、最近の研究によると、今ではレゾルビン（「回復期相互作用産物」）と称される脂質抗炎症メディエーターの新しいファミリーが同定されており、それは低いナノモル範囲内でのその生物学的活性で示されるように非常に強力である。このファミリー内には、ＥＰＡ由来のレゾルビン（すなわちＥシリーズレゾルビンまたは「ＲｖＥｓ」）およびＤＨＡ由来のレゾルビン（すなわち、Ｄシリーズレゾルビンまたは「ＲｖＤｓ」）の双方が存在する（Ｓｅｒｈａｎ Ｃ．Ｎ．、Ｐｈａｒｍａ．＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０５：７−２１頁（２００５年）中に概説）。Ａｒｉｔａ Ｍ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０２（２１）：７６７１−７６７６頁（２００５年））中に示されるＲｖＥ１（５Ｓ、１２Ｒ、１８Ｒ−トリヒドロキシ−６Ｚ、８Ｅ、１０Ｅ、１４Ｚ、１６Ｅ−ＥＰＡ）の明確な役割は、ヒトの健康および疾患におけるＥＰＡの有利な作用の一部における基礎を形成しうる機構的証拠をもたらす。

【0318】

この新しい生物学は、炎症性プロセスの栄養的および医学的管理の双方におけるＥＰＡリッチ産物の潜在的な有用性を強調する。さらに、炎症が心臓血管疾患から代謝性疾患（例えば、メタボリックシンドロームＸ、肥満、糖尿病）、さらに神経疾患（例えばアルツハイマー）にわたる範囲の多数の疾患の根底をなすことから、ＥＰＡリッチオイル（本明細書中に記載のものなど）が極めて広範な有用性を有することが想定される。医学的有用性が１）医療食品における生体活性剤としてのＥＰＡまたはＲｖＥの使用；および／または、２）補助療法としてのＥＰＡの店頭または処方医薬品への添加から得られうることが想定される。最後に、ＥＰＡには、ＲｖＥおよび薬学的に最適化された新しい化学的実体の合成における前駆体としての有用性が見出されうる。

【0319】

ＥＰＡおよび心臓血管疾患：
魚油およびその関連ω−３脂肪酸が、二次予防における心臓血管疾患の管理において著しい心臓保護を示している（すなわち被験体が心臓血管症状を既に呈するかまたは心臓血管イベントを患っていたという設定）。しかし、これらの試験が有望であると共に、回答がなされていない主要な課題、特にＥＰＡ対ＤＨＡの相対的重要性および［例えば、１）心筋梗塞または狭心症の病歴がなくかつ血管形成術／ステント植込み術も冠動脈バイパスグラフトも受けておらず、また２）狭心症の臨床徴候または心電計の異常がない場合の患者における］一次予防の設定におけるこれら脂肪酸の有効性といった課題が数多く残っている。

【0320】

Ｊａｐａｎｅｓｅ ＥＰＡ Ｌｉｐｉｄ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｙ（「ＪＥＬＩＳ」）は、９８％超の精製ＥＰＡ−エチルエステルをスタチンと併用した大規模無作為化対照試験において、これら課題に対処しようと努めた（Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｍ．およびＨ．Ｏｒｉｇａｓａ、Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．、１４６：６１３−６２０頁（２００３年）；Ｙｏｋｏｙａｍａ Ｍ．ら、Ｌａｎｃｅｔ、３６９：１０９０−１０９８頁（２００７年））。予測によると、筆者らは、ＥＰＡ＋スタチンの投与を受ける患者における心臓血管イベントがスタチン単独の投与を受ける患者に対して１９％減少することを発見した。これは、ＥＰＡが本質的に心保護薬であり、それ故、ＥＰＡリッチオイルの市場への参入に役立つはずであることを強く裏付けるものである。それはまた、ＥＰＡ／レゾルビン型混合物をスタチンと併用するための機会、および／または、本明細書中に記載の組換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に由来するオイルが、現在魚油から供給され、製造されるＥＰＡ−エチルエステル薬（例えばＭｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製のＥＰＡＤＥＬ）の生産におけるＥＰＡの高純度供給源として使用されるための機会を提供しうる。

【0321】

Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）が、様々な炎症性および代謝状態、例えば心臓代謝疾患（例えば、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、「インスリン抵抗性」などの前糖尿病状態（ｐｒｅ−ｄｉａｂｅｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、糖尿病）、神経行動学的症状（例えば、アルツハイマー病、注意欠陥／多動性障害、うつ病、双極性障害、統合失調症、分娩後うつ病、更年期障害、例えば体熱感）、炎症性障害、例えば、大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、およびレゾルビン関連疾患（ｒｅｓｏｌｖｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＣＲＰの血清濃度の上昇が疾患リスクの増大に関連する場合）の追跡における有用なバイオマーカーであることが長年にわたって確立されてきた（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４３（７）：５１２頁（２０００年）；「Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ」、２８：８７８−８８１頁（２００５年）；「Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ」、４０（３）：１９４−１９９頁（２００８年）；「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」、３２（６）：１００８−１０２４頁（２００７年）；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２９４（１，Ｐｔ．１）：Ｇ２７−Ｇ３８頁（２００８年）；「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ」、９（２）：１２４−１３３頁（２００７年）；「Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，Ｓｔｒｅｓｓ，ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、３１７−３２４頁（２００６年）．Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｅｈｕｄａ、Ｓｈｌｏｍｏ；Ｍｏｓｔｏｆｓｋｙ、Ｄａｖｉｄ Ｉ．、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｈｕｍａｎｉａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。Ｃ反応性タンパク質の血清濃度を試験するための方法は高度化し、十分に特徴づけられている。多数の試験では、ω−３脂肪酸の投与がＣ反応性タンパク質の血清レベルの低下と相関しうることが結論づけられている（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、２８（５）：３０９−３１４頁（２００８年）；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆａｉｓａｌａｂａｄ，Ｐａｋｉｓｔａｎ）、７（８）：１３６８−１３７４頁（２００７年）；「Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｌｙｓｉｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、２２（１２）：３５６１−３５６７頁（２００７年））。したがって、例えば上記の臨床症状を治療するための方法、および摂取可能な形態での本明細書中に記載の組換え微生物オイルの投与を介したＣ反応性タンパク質の血清レベルを低下させるための方法を提供することで、臨床症状が治療されるかまたはＣ反応性タンパク質のレベルが低下することは本発明の範囲内にある。

【0322】

ω−３ ＰＵＦＡおよび遺伝子発現の栄養調節：
長鎖ω−３ ＰＵＦＡが１）脂肪酸生合成から分離され、グリコーゲン貯蔵に向けられるグルコースと、２）トリグリセリド合成から分離され、酸化に向けられる脂肪酸と、を誘導可能な燃料のパーティショナー（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｒｓ）として機能することが周知である。この再区分の正味効果は、循環するトリグリセリドの減少と、一部の種では脂肪沈着の低下である。これらの長鎖ω−３ ＰＵＦＡが代謝に対するそれらの効果を発揮する分子機構が順に遺伝子発現を調節する様々なリガンド活性化転写因子との相互作用の結果であるという科学的証拠が増加している。

【0323】

今日まで、脂肪酸による遺伝子転写の調節は、少なくとも４つの転写因子ファミリー、すなわちＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）、ＬＸＲ（肝臓ｘ受容体）、ＨＮＦ−４α（肝核因子４）およびＳＲＥＢＰ（ステロール調節因子結合タンパク質）の活性の変化または豊富さに起因すると思われる（Ｃｌａｒｋｅ Ｓ．Ｄ．、Ｊ Ｎｕｔｒ．、１３１（４）：１１２９−１１３２頁（２００１年）およびＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ、１５：１３−１８頁（２００４年）；Ｐｅｇｏｒｉｅｒ Ｊ．−Ｐ．ら、Ｊ Ｎｕｔｒ．、１３４：２４４４Ｓ−２４４９Ｓ頁（２００４年））。この相互作用の例としては、ＥＰＡが血清トリグリセリドを肝臓内のＰＰＡＲαの活性化を介して低下させ、かつ（特に血管壁のレベルでの）その抗炎症活性の一部がまた動脈性マクロファージにおけるＰＰＡＲの生物機構によって媒介されうると考えられる。

【0324】

脂肪酸が特定の遺伝子発現を制御する機構についての知識は、全身脂質代謝のよりよい管理のための新しい治療法の開発ならびに冠動脈心疾患および他の慢性疾患における確立されたリスク因子であるトリグリセリドおよびコレステロールの血清レベルの制御への洞察を提供しうる。同様に、将来の研究では、ＥＰＡ対ＤＨＡで最適なヒト健康の維持および促進における栄養素−遺伝子相互作用の調節因子として異なる役割を発揮することが理解されると予想される。

【0325】

ω−３ ＰＵＦＡおよび脂質異常症：
魚油の摂取は、心臓疾患のリスクの増大をもたらす不都合なイベントである低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールの微増に関連していることが多い。Ｔｈｅｏｂａｌｄ Ｈ．Ｅ．ら（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、７９：５５８−５６３頁（２００４年））の最近の試験によると、ＬＤＬコレステロールのこの増加が実際には（ＥＰＡとは対照的な）ＤＨＡに起因しうることが示唆される。具体的には、中年男性および女性において、約０．７ｇのＤＨＡの日常摂取が３か月にわたりＬＤＬコレステロールを７％増加させ、それに対し、精製ＥＰＡまたはＥＰＡリッチオイルを使用した試験では、一般的にはＬＤＬコレステロールでの同様の増加は報告されていない（Ｈａｒｒｉｓ Ｗ．Ｓ．、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、６５（付録）：１６４５Ｓ−１６５４Ｓ（１９９７年））。低用量のＤＨＡに起因してＬＤＬコレステロールが増加する理由を明らかにするにはさらなる試験が必要であるが、潜在的にＤＨＡを含有しない本発明のＥＰＡリッチオイルの有用性は有意な臨床上の利点を有しうる。

【0326】

本明細書中に記載の組換え微生物オイルを精製し、比較的純粋なＥＰＡを含有するオイルを得ることが望ましい場合があるが、他の実施形態では、ＥＰＡおよび少なくとも１つの他のＰＵＦＡが豊富に含まれる最終オイル産物の使用によって認められる利点がありうる。例えば、証拠によると、ＥＰＡおよびＧＬＡの組み合わせの補給が血清脂質に対して好ましい効果を有しうることが示される。詳細には、Ｍ．ＬａｉｄｌａｗおよびＢ．Ｊ．Ｈｏｌｕｂ（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、７７：３７−４２頁（２００３年））での報告によると、健常女性において、ＥＰＡおよびＤＨＡ（全部で４ｇ）とＧＬＡ（２ｇ）の混合物を含む日常的補給により、血液脂質および脂肪酸特性が２８日間で好ましく改変された。ＥＰＡ、ＤＨＡおよびＧＬＡの投与を受けた患者においては、患者のＬＤＬコレステロールが１１．３％低下したことに加え、心筋梗塞の１０年リスク計算値が４３％低下した。したがって、ＧＬＡの添加が、ＥＰＡおよびＤＨＡがＬＤＬコレステロールの微増を引き起こす傾向を打ち消した（Ｔｈｅｏｂａｌｄら、上記）。総合すれば、ＬａｉｄｌａｗおよびＨｏｌｕｂおよびＴｈｅｏｂａｌｄらによる試験によると、ＤＨＡではなくＥＰＡおよびＧＬＡの双方が豊富に含まれるオイルにおいて臨床効果があることが示唆されうる。

【0327】

ＧＬＡおよびＥＰＡサプリメントの組み合わせの有用性はまた、慢性炎症が関節炎、糖尿病および心臓疾患などの疾患に関することからそれを低減し、治療するための手段として幅広く普及している（Ｆ．ＣｈｉｌｔｏｎおよびＬ．Ｔｕｃｋｅｒ、「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｖｅｎ Ｅａｔｉｎｇ Ｐｌａｎ ｔｏ Ｅｎｄ Ｏｕｒ Ｎａｔｉｏｎ’ｓ Ｓｅｃｒｅｔ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ．」 Ｆｉｒｅｓｉｄｅ Ｂｏｏｋｓ）。具体的には、ＧＬＡの補給が炎症の脂質メディエーターの生成を低下させ、かつ慢性炎症性疾患（例えば関節リウマチ）の臨床徴候を軽減することが予め示されたが、この同じ脂肪酸の補給がまた、潜在的に有害な副作用である血清ＡＲＡレベルの著明な上昇を引き起こすことが知られた。これらの二分効果における理論的根拠は肝臓におけるΔ５デサチュラーゼ活性の存在に帰着され、それは（ω−６ Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路を介して、またＧＬＡおよびＤＧＬＡ中間体を介して）必須ω−６脂肪酸ＬＡからＡＲＡへの完全な変換を可能にした一方、好中球などの炎症性細胞においてＤＧＬＡをＡＲＡに変換する代謝能力が欠如した。したがって、ＥＰＡとの同時補給を行えば、肝臓におけるＡＲＡの合成が遮断される一方、ＤＧＬＡの合成が可能になると仮定された。Ｊ．Ｂ．Ｂａｒｈａｍら（Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３０：１９２５−１９３１頁（２０００年））によるヒト摂食試験において、原則の臨床的証拠が確立され、ここでは（血清ＡＲＡレベルの上昇を引き起こすことなく）脂質メディエーターを低下させるＧＬＡの能力を維持する補給方法ではＥＰＡの添加が必要であることが示された。したがって、炎症に関するこれらの試験は、ＧＬＡおよびＥＰＡを含有するオイルの有用性におけるさらなる裏付けを提供する（一方で、ＥＰＡ補給の不在下でのＧＬＡの使用は禁忌でありうる）。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）においてＧＬＡを生成するための方法は、ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット中に教示される。

【0328】

好ましい実施形態の説明
油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の全脂質画分中の全脂肪酸のパーセントとしての５３．２％超のＥＰＡの合成が本明細書中に示される。図３に示されるように、極めて多数のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の株を様々な遺伝子を野生型ＡＴＣＣ＃２０３６２ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に統合させることによって作成し、ここで各形質転換体株は様々な量の（ＥＰＡを含む）ＰＵＦＡを生成できた。Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現するいくつかの代表的な形質転換生物の遺伝子型および完全な脂質特性は下記の表７および８に示される。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、１８：３（ＡＬＡ）、ＧＬＡ、２０：２（ＥＤＡ）、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定され、それぞれの組成物は全脂肪酸の％として示される。「ＴＦＡ％ＤＣＷ」は、乾燥細胞重量のパーセントとしての細胞内の全脂肪酸を示す。

【0329】

オイル特性を、発酵培地（ＦＭ）中で２日間および高グルコース培地（ＨＧＭ）中で５日間成長させたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株からＧＣ分析によって得た（培地レシピにおける一般的方法を参照）。ＧＣ特性は、異なる成長条件に基づき、実施例中に提供されるものとやや異なりうる（例えば、異なる培地、フラスコまたはチューブでの成長、および成長時間の長さなど）。

【0330】

【表15】

【0331】

【表16】

【0332】

上の表中に見られるように、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を発現しかつ大部分のＥＰＡ生成する株は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株Ｙ４３０５であった。この生物において得られるＧＣクロマトグラムを図４に示す。株Ｙ４３０５内部に含まれる遺伝子組換えのより詳細な概要について下記に説明する（ここで完全な詳細は実施例に提供される）。
（１）ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０およびＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴキメラ遺伝子内部でのフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼの２つのコピーの発現、
（２）ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＡｃｏおよびＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２キメラ遺伝子内部でのフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の３つのコピーの発現、
（３）ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６およびＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子内部でのモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Ｃ_{１６／１８}エロンガーゼ遺伝子の３つのコピーの発現、
（４）ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２キメラ遺伝子内部でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼの１つのコピーの発現、
（５）ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２およびＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２キメラ遺伝子内部でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子の５つのコピーの発現、
（６）ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：Ｏｃｔキメラ遺伝子内部でのユートレプティエラ属（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９Δ９エロンガーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ９エロンガーゼ遺伝子の１つのコピーの発現、
（７）ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、およびＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１キメラ遺伝子内部での（ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ８デサチュラーゼに由来し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））における発現のためにコドン最適化された）合成Δ８デサチュラーゼに由来する突然変異体Δ８デサチュラーゼ遺伝子の７つのコピーの発現、
（８）ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏキメラ遺伝子内部でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼの１つのコピーの発現、
（９）ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡｃｏおよびＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏキメラ遺伝子内部でのユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子の３つのコピーの発現、
（１０）ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴキメラ遺伝子内部でのペリディニウム属（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６Δ５デサチュラーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ５デサチュラーゼ遺伝子の１つのコピーの発現、
（１１）ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６およびＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏキメラ遺伝子内部でのピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼの２つのコピーの発現、
（１２）ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１キメラ遺伝子内部でのピチウム・アファニデルマツム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼに由来する（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のためにコドン最適化された）合成Δ１７デサチュラーゼ遺伝子の１つのコピーの発現、
（１３）ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡｃｏおよびＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏキメラ遺伝子内部でのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼの２つのコピーの発現、
（１４）ペルオキシソーム生合成因子１０タンパク質（ＰＥＸ１０）をコードする天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の破壊、
（１５）ＳＣＰ２（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０３４１０）をコードする天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の破壊、
（１６）ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０１９８７をコードする天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の破壊）、および
（１７）ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０５８１９）をコードする天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の破壊。

【0333】

したがって、次の脂肪酸濃度を有する微生物オイルが全脂肪酸の重量パーセントとして次のように記載される。
ａ）約４８％〜約５５％ＥＰＡ；
ｂ）約１．５％〜約３．０％ＥＴＡ；
ｃ）約０．１％〜０．７％ＡＲＡ；
ｄ）約１．０％〜約２．５％ＤＧＬＡ；
ｅ）約２．０％〜約３．５％ＥＤＡ；
ｆ）約２．０％〜約３．０％ＡＬＡ；
ｇ）約１７．０％〜約２０．０％リノール酸（１８：２）；
ｈ）約３．５％〜約６．５％オレイン酸（１８：１）；
ｉ）約１．０％〜約２．０％ステアリン酸（１８：０）；
ｊ）約０．５％〜約３．５％パルミトレイン酸（１６：１）；および
ｋ）約２．５％〜約４．５％パルミチン酸（１６：０）。

【0334】

他の実施形態では、微生物オイルは本明細書中に提供され、ここで前記オイルは全脂肪酸の重量パーセントとして次の脂肪酸濃度を有する。
ａ）少なくとも約４３．３％ＥＰＡ；
ｂ）約２３．６％未満のＬＡ（１８：２）；および
ｃ）約９．４％未満のオレイン酸（１８：１）。

【0335】

より好ましい実施形態では、微生物オイルは、全脂肪酸の重量パーセントとして約４．２％未満のＥＤＡをさらに含む。

【0336】

出願人が全脂肪酸の重量パーセントとして最大で５５．６％のＥＰＡの生成を示すが、これら特定のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組換え株では、本明細書に記載のように、宿主細胞内でのＥＰＡの濃度であればさらなる遺伝子組換えを介して有意に修飾されうると考えられる。この結果としては、ＥＰＡの生成あるいはＥＰＡと少なくとも１つの他のω−３および／またはω−６ＰＵＦＡとを含むヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）オイルの生成が増大しうる。さらに、本明細書中に記載の教示および結果に基づき、当業者が、実現可能性および商業的有用性がΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用した種々のω−３および／またはω−６ ＰＵＦＡの合成のための製造プラットフォームとしての油性酵母の使用によりもたらされることを理解することが期待される。

【実施例】

【0337】

本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性をその主旨および範囲から逸脱することなく確認でき、本発明の様々な変更および改良を行い、それを様々な用法および条件に適合させることができる。

【0338】

一般的方法
実施例において使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ． 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；および３）Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ）発行（１９８７）に記載されている。

【0339】

微生物培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野で周知である。次の例における使用に適する技術は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，ＷＩｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４年））；またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）に示される場合に応じて見出されうる。微生物細胞の成長および維持において使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に規定がなければ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にはＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）プレート上で３７℃で成長させた。

【0340】

一般的な分子クローニングを標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）に従って実施した。オリゴヌクレオチドをＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ）によって合成した。個別のＰＣＲ増幅反応は、他に規定がなければ、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐモルの各プライマーおよび１μｌのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を含む５０μｌの全容量で行った。部位特異的突然変異誘発は、製造業者の使用説明書により、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットを使用して行った。ＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発がサブクローン化に関与する場合、コンストラクトを配列決定し、配列に誤りが全く導入されていないことを確認した。ＰＣＲ産物をＰｒｏｍｅｇａのｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙベクター（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した。

【0341】

ＤＮＡ配列を、ベクターおよび挿入物に特異的なプライマーの組み合わせを使用する染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用してＡＢＩ Ａｕｔｏｍａｔｉｃシーケンサ上で生成した。配列編集をＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））で行った。すべての配列が、両方向で少なくとも２倍の範囲を示す。遺伝子配列の比較をＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡ Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。あるいは、遺伝子配列の操作を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．から入手可能な一連のプログラムを使用して行った（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））。ＧＣＧプログラム「Ｐｉｌｅｕｐ」は、１２のギャップ作成デフォルト値および４のギャップ伸長デフォルト値の場合で使用した。ＧＣＧ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムは、５０のデフォルトギャップ作成ペナルティおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティの場合で使用した。他に規定されない限り、他のすべての場合、ＧＣＧプログラムデフォルトパラメータを使用した。

【0342】

ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年）およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２頁（１９９７年））探索を行い、（すべての非冗長ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳、三次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースから得られる配列を含む）ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース中に含まれる配列に対して類似性を有する単離配列を同定した。配列をすべてのリーディングフレームにおいて翻訳し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ Ｄ．Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３：２６６−２７２頁（１９９３年））を使用し、「ｎｒ」データベース中に含まれるすべての一般に公開されているタンパク質配列との類似性について比較した。

【0343】

クエリー配列が最高の類似性を有した配列を要約するＢＬＡＳＴ比較の結果を、％同一性、％類似性、および期待値によって報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質間で一致するアミノ酸の百分率として規定される。「％類似性」は、２つのタンパク質間で一致するかまたは保存されるアミノ酸の百分率として規定される。「期待値」は、このサイズのデータベースの探索において全く偶然に期待される、所与のスコアとの一致の統計的有意性を推定し、一致の数を特定する。

【0344】

略語の意味は以下のとおりである。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ＤＣＷ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＴＦＡ」は全脂肪酸を意味する。

【0345】

発現カセットにおける命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により示されることになり、ここでＸはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子コード領域断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、それらはすべて互いに作動可能に連結される。

【0346】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を、慣例的には下記の手法に従い、いくつかの培地中、２８〜３０℃で成長させた。寒天プレートは２０ｇ／Ｌの寒天の各液体培地への添加によって必要であることから、標準的方法に従って調製した。

【0347】

ＹＰＤ寒天培地（１リットル当たり）：１０ｇの酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］、および２０ｇのグルコース

【0348】

基本最少培地（ＭＭ）（１リットル当たり）：２０ｇのグルコース、１．７ｇのアミノ酸を有しない酵母窒素塩基、１．０ｇのプロリン、およびｐＨ６．１（調節なし）

【0349】

最少培地＋ウラシル（ＭＭ＋ウラシルまたはＭＭＵ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのウラシルおよび０．１ｇのウリジンを添加する。

【0350】

最少培地＋ウラシル＋スルホニル尿素（ＭＭＵ＋ＳＵ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭＵ培地を調製し、２８０ｍｇのスルホニル尿素を添加する。

【0351】

最少培地＋ロイシン＋リシン（ＭＭＬｅｕＬｙｓ）（１リットル当たり）：上記のようにＭＭ培地を調製し、０．１ｇのロイシンを添加する。

【0352】

最少培地＋５−フルオロオロチン酸（ＭＭ＋５−ＦＯＡ）（１リットル当たり）：（供給者から受け取った各バッチ内部でばらつきが生じることから）１００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度範囲に対するＦＯＡ活性試験に基づく、２０ｇのグルコース、６．７ｇの酵母窒素塩基、７５ｍｇのウラシル、７５ｍｇのウリジンおよび適量のＦＯＡ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））。

【0353】

高グルコース培地（ＨＧＭ）（１リットル当たり）：８０グルコース、２．５８ｇのＫＨ_２ＰＯ_４および５．３６ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５（調節を必要としない）

【0354】

酵母抽出物を有しない発酵培地（ＹＥを有しないＦＭ）（１リットル当たり）：６．７０ｇ／Ｌの酵母窒素塩基、６．００ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．００ｇのＫ_２ＨＰＯ_４、１．５０ｇのＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、および２０ｇのグルコース

【0355】

発酵培地（ＦＭ）（１リットル当たり）：上記のようにＹＥを有しないＦＭ培地を調製し、５．００ｇの酵母抽出物（ＢＢＬ）を添加する。

【0356】

特に断りのない限り、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換を、Ｃｈｅｎ Ｄ．Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２−２３５頁（１９９７年））の方法に従って行った。つまり、ヤ
ロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃で約１８時間成長させた。多量の数白金耳の細胞をプレートからこすり、５０％ＰＥＧ２．２５ｍＬ、平均分子量３３５０；２Ｍ酢酸Ｌｉ０．１２５ｍＬ、ｐＨ６．０；および２Ｍ ＤＴＴ０．１２５ｍＬを含有する形質転換緩衝液１ｍＬ中に再懸濁した。次いで、約５００ｎｇの線状化プラスミドＤＮＡを再懸濁細胞１００μｌ中でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃で１時間維持した。細胞を選択培地プレート上に播種し、３０℃で２〜３日間維持した。

【0357】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析においては、細胞を遠心分離により回収し、脂質をＢｌｉｇｈ Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１−９１７頁（１９５９年））に記載のように抽出した。脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を脂質抽出物とナトリウムメトキシドとのエステル交換により調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ Ｇ．、およびＮｉｓｈｉｄａ Ｉ．、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２７６（１）：３８−４６頁（１９９０年））、次いで３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径） ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを具備するＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間保持）〜１８５℃であった。

【0358】

直接の塩基エステル交換においては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を採取し、蒸留水で１回洗浄し、真空下、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃで５〜１０分間乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）を試料に添加し、次いで試料をボルテックスし、２０分間振とうした。３滴の１Ｍ ＮａＣｌおよびヘキサン４００μｌの添加後、試料をボルテックスし、回転した。上部層を除去し、上記のようにＧＣにより分析した。

【0359】

実施例１
全脂質の約１４％のＥＰＡをΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を介して生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４０８６の作成
本実施例では、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介して全脂質に対して約１４％のＥＰＡを生成可能なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する株Ｙ４０８６の作成について記載する（図３）。

【0360】

株Ｙ４０８６の作成には、株Ｙ２２２４（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ＃２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自発的突然変異からのＦＯＡ耐性突然変異体）、（Ｌｅｕ−表現型で１７％ＥＤＡを生成する）株Ｙ４００１、株Ｙ４００１Ｕ（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型）、（Ｌｅｕ−表現型で１８％ＤＧＬＡを生成する）株Ｙ４０３６、株Ｙ４０３６Ｕ（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−表現型）および（Ｕｒａ−表現型で１２％ＡＲＡを生成する）株Ｙ４０７０の作成が必要であった。株Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６ＵおよびＹ４０７０の作成についてのさらなる詳細は、（ここで参照により本明細書中に援用される）ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されている。

【0361】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４０７０の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ−、未知の１−、未知の３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴであった。

【0362】

全脂質の約１４％のＥＰＡを生成するためのＹ４０８６株の作成
コンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図５Ａ；配列番号１２７）を作成し、３種のΔ１７デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４０７０のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）に組み込み、それによりＥＰＡの生成を可能にした。ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕプラスミドは以下の成分を有した。

【0363】

【表17】

【0364】

ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４０７０の形質転換のために用いた。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種
し、３０℃で２〜３日間維持した。次いで、単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで３０℃で液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0365】

ＧＣ分析によると、ＥＰＡがｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３種のキメラ遺伝子を有する形質転換体中に存在するが親Ｙ４０７０株中に存在しないことが示された。選択された９６株の大部分が全脂質の１０〜１３％のＥＰＡを生成した。それぞれ全脂質の約１４．２％および約１３．８％のＥＰＡを生成した２つの株（すなわち＃５８および＃７９）があった。これらの２つの株は、それぞれＹ４０８５およびＹ４０８６と称された。

【0366】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４０８６の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、未知の１−、未知の２−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。

【0367】

実施例２
Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を介して全脂質の約３７％ＥＰＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８の作成
本実施例では、全脂質に対して約３７．６％のＥＰＡ（すなわちＹ４０８６に対して全脂肪酸のパーセントとしてＥＰＡ濃度の２倍超の増加）を生成可能なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する株Ｙ４１２８の作成について記載する。

【0368】

株Ｙ４１２８の作成には、（実施例１に記載の）株Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、Ｙ４０７０およびＹ４０８６の作成ならびに株Ｙ４０８６Ｕ１（Ｕｒａ−）の作成が必要であった。

【0369】

株Ｙ４０８６Ｕ１（Ｕｒａ−）の作成
株Ｙ４０８６Ｕ１を、株Ｙ４０８６内部のコンストラクトｐＹ１１７（図５Ｂ；配列番号１２８；ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレット中に記載）におけるＣｒｅリコンビナーゼ酵素の一時的発現を介して作成し、Ｕｒａ−表現型を生成した。これによりゲノムからＬｏｘＰサンドイッチ型Ｕｒａ３遺伝子が放出された。プラスミドｐＹ１１７内の突然変異したヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）アセトヒドロキシ酸シンターゼ酵素（すなわち、配列番号１２１で示されるＷ４９７Ｌ突然変異を含む「ＡＨＡＳ」；Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿５０１２７７；ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照）にスルホニル尿素除草剤耐性（ＳＵ^Ｒ）を付与し、それを陽性スクリーニングマーカーとして使用した。

【0370】

プラスミドｐＹ１１７をプラスミドｐＹ１１６（ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載）から、ＰａｃＩ−ＳｗａＩ部位に隣接される突然変異ＡＨＡＳ遺伝子のＰａｃＩ−ＳｗａＩで消化されたｐＹ１１６への挿入により誘導し、それによりＬＥＵ選択可能マーカーをスルホニル尿素マーカーと交換した。した
がって、コンストラクトｐＹ１１７は以下の成分を有した。

【0371】

【表18】

【0372】

プラスミドｐＹ１１７を用い、株Ｙ４０８６を一般的方法に従って形質転換した。形質転換後、細胞をＭＭＵ＋ＳＵ（２８０μｇ／ｍＬのスルホニル尿素；クロリムロンエチルとしても知られる、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））プレート上に播種し、３０℃で２〜３日間維持した。ＭＭＵ＋ＳＵプレート上で成長させた各ＳＵ^Ｒコロニーを採取し、３０℃でＹＰＤ液体培地に画線培養し、２５０ｒｐｍ／分で１日間振とうし、ｐＹ１１７プラスミドを救済した。成長させた培養物をＭＭＵプレート上に画線培養した。３０℃で２日後、各コロニーをＭＭおよびＭＭＵプレート上に再度画線培養した。ＭＭＵ上で成長できるがＭＭプレート上で成長できないコロニーを選択した。Ｕｒａ−表現型を有するこれらの株の中の２つをＹ４０８６Ｕ１およびＹ４０８６Ｕ２と称した。

【0373】

全脂質の約３７％のＥＰＡを生成するためのＹ４１２８株の作成
コンストラクトｐＺＰ２−２９８８（図６Ａ；配列番号１２９）を作成し、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、２種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、および１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子を株Ｙ４０８６Ｕ１のＰｏｘ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＰ２−２９８８プラスミドは以下の成分を有した。

【0374】

【表19】

【0375】

ｐＺＰ２−２９８８プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法に従って株Ｙ４０８６Ｕ１の形質転換用に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃で２〜３日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで液体ＭＭＬｅｕＬｙｓに３０℃で接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。
細胞を遠心分離によって回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離遠心分離によって回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換によって調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣで分析した。

【0376】

ＧＣ分析によると、選択した９６株の大部分が全脂質の１２〜１５．６％ＥＰＡを生成することが示された。全脂質の約３７．６％および１６．３％ＥＰＡを生成する２つの株（すなわち、グループＩ内の＃３７およびグループＩＩ内の＃３３）があった。これら２つの株はそれぞれＹ４１２８およびＹ４１２９と称した。

【0377】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４１２８の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、Ｐｅｘ１０−、未知の１−、未知の２−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。２００７年８月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託したヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８が有する名称はＡＴＣＣ ＰＴＡ−８６１４である。

【0378】

実施例３
全脂質の５３％超のＥＰＡをΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を介して生成するための最適化されたヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５の作成
本実施例では、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介し、全脂質に対して５３％超のＥＰＡを生成可能なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に由来する株Ｙ４３０５の作成について記載する（図３）。

【0379】

株Ｙ４３０５の作成には、（実施例１に記載の）株Ｙ２２２４、Ｙ４００１、Ｙ４００１Ｕ、Ｙ４０３６、Ｙ４０３６Ｕ、Ｙ４０７０およびＹ４０８６、（実施例２に記載の）株Ｙ４０８６Ｕ１およびＹ４１２８、ならびに株Ｙ４１２８Ｕ３（Ｕｒａ−）、（全脂質の４２％ＥＰＡを生成する）Ｙ４２１７、Ｙ４２１７Ｕ２（Ｕｒａ−）、（全脂質の４６．５％ＥＰＡを生成する）Ｙ４２５９およびＹ４２５９Ｕ２（Ｕｒａ−）の作成が必要であった。

【0380】

Ｙ４１２８Ｕ株の作成
株Ｙ４１２８中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図６Ｂ；配列番号１３０）を作成し、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を株Ｙ４１２８のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＵＥ３Ｓは以下の成分を有した。

【0381】

【表20】

【0382】

プラスミドｐＺＫＵＥ３ＳをＳｐｈＩ／ＰａｃＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４１２８の形質転換のために用いた。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、３０℃で２〜３日間維持した。

【0383】

ＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上で成長させた全部で２４の形質転換体を採取し、新しいＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線培養した。細胞をプレートから掻き取り、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0384】

ＧＣ分析によると、プレートからのｐＺＫＵＥ３Ｓによる形質転換体のすべてにおいて全脂質の１０〜１５％ＥＰＡの存在が示された。全脂質の１２．９％、１４．４％、１５．２％、１５．４％、１４％および１０．９％ＥＰＡを生成した＃３、＃４、＃１０、＃１２、＃１９および＃２１として同定された株をそれぞれＹ４１２８Ｕ１、Ｙ４１２８Ｕ２、Ｙ４１２８Ｕ３、Ｙ４１２８Ｕ４、Ｙ４１２８Ｕ５およびＹ４１２８Ｕ６（集合的にＹ４１２８Ｕ）と称した。

【0385】

Ｙ４１２８（実施例２に記載のように３７．６％）対Ｙ４１２８Ｕ（平均１３．８％、上記）での定量された％ＥＰＡの相違は成長条件の違いに基づく。詳細には、前者の培養物を液体培養物中で２日成長させた後に分析する一方、後者の培養物を寒天プレート上での成長後に分析した。出願人は、寒天プレートからの結果を液体培養物中での結果と比較する場合、全脂質中の％ＥＰＡが２〜３倍増加することを観察している。したがって、結果は直接的に比較し難いが、Ｙ４１２８およびＹ４１２８Ｕ株の双方はＥＰＡを多量に生成することが示される。

【0386】

全脂質の約４２％のＥＰＡを生成するためのＹ４２１７株の作成：コンストラクトｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ（図７Ａ；配列番号１３１）を作成し、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）を株Ｙ４１２８Ｕ３のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣプラスミドは以下の成分を有した。

【0387】

【表21】

【0388】

ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４１２８Ｕ３の形質転換のために用いた。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで３０℃で液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0389】

ＧＣ分析によると、選択した９６株の大部分が全脂質の３２〜３９．９％ＥＰＡを生成することが示された。全脂質の約４１．１％、４１．８％、４１．７％、４１．１％、４１％および４１．１％ＥＰＡを生成する６つの株（すなわち、第２群の＃３５、＃３８、＃４０、＃７１、＃７６および＃８１）があった。これら６つの株をそれぞれＹ４２１５、Ｙ４２１６、Ｙ４２１７、Ｙ４２１８、Ｙ４２１９およびＹ４２２０と称した。

【0390】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４２１５、Ｙ４２１６、Ｙ４２１７、Ｙ４２１８、Ｙ４２１９およびＹ４２２０の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。

【0391】

株Ｙ４２１７Ｕ２（Ｕｒａ−）の生成：株Ｙ４２１７中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図６Ｂ；配列番号１３０）を用い、キメラＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０遺伝子を株Ｙ４２１７のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレート上に播種し、３０℃で３〜４日間維持した。

【0392】

ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で６種の形質転換体を採取し、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別々に再度画線培養した。６つ全部の株がＵｒａ−表現型を有した（すなわち細胞がＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長できたがＭＭプレート上で成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから擦り取り、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ
６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0393】

ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長したｐＺＫＵＥ３Ｓによる形質転換体のすべてにおいて、全脂質の１８．７％〜２８．６％ＥＰＡの存在が示された。全脂質の２２．５％および２８．６％ＥＰＡを生成する２つの株（すなわち＃４および＃５）をそれぞれ株Ｙ４２１７Ｕ１およびＹ４２１７Ｕ２と称した。

【0394】

全脂質の約４６．５％のＥＰＡを生成するためのＹ４２５９株の作成
コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃ（図７Ｂ；配列番号１３２）を作成し、１種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子、および１種のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）を株Ｙ４２１７Ｕ２のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８Ｃプラスミドは以下の成分を含有した。

【0395】

【表22】

【0396】

ｐＺＫＬ１−２ＳＰ９８ＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４２１７Ｕ２の形質転換のために用いた。形質体転換細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで３０℃で液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0397】

ＧＣ分析によると、選択した７２株の大部分が全脂質の４０〜４４％を生成することが示された。全脂質の約４６．５％、４４．５％、４４．５％、４４．８％、４４．５％および４４．３％ＥＰＡを生成する６つの株（すなわち、＃２、＃４、＃８、＃９、＃４８および＃５８）があった。これら６つの株をそれぞれＹ４２５９、Ｙ４２６０、Ｙ４２６１、Ｙ４２６２、Ｙ４２６３およびＹ４２６４と称した。

【0398】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４２５９の最終的な遺伝子型は、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、未知の８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。

【0399】

株Ｙ４２５９Ｕ２（Ｕｒａ−）の作成
Ｙ４２５９株中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図８Ａ；配列番号１３３）を用い、Ｕｒａ３突然変異遺伝子を株Ｙ４２５９のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。プラスミドｐＺＫＵＭは以下の成分を有した。

【0400】

【表23】

【0401】

ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させた全部で３種の形質転換体を採取し、ＭＭプレートおよびＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に別々に再度画線培養した。３つ全部の株は、Ｕｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上では成長できたがＭＭプレート上では成長できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから掻き取り、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0402】

ＧＣ分析によると、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長させたｐＺＫＵＭでの＃１、＃２および＃３形質転換体中に全脂質中３１．４％、３１％および３１．３％のＥＰＡが存在することが示された。これら３つの株をそれぞれ株Ｙ４２５９Ｕ１、Ｙ４２５９Ｕ２およびＹ４２５９Ｕ３と称した（集合的にＹ４２５９Ｕ）。

【0403】

全脂質の約５３％超のＥＰＡを生成するためのＹ４３０５株の作成
コンストラクトｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２（図８Ｂ；配列番号１３５）を作成し、1種のΔ９エロンガーゼ遺伝子、１種のΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１種のΔ８デサチュラーゼ遺伝子および１種のΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を株Ｙ４２５９Ｕ２のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）遺伝子座に組み込み、それによりＥＰＡのより高レベルの生成を可能にした。ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドは以下の成分を含有した。

【0404】

【表24】

【0405】

ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次いで一般的方法による株Ｙ４２５９Ｕ２の形質転換のために用いた。形質転換体細胞をＭＭプレート上に播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一のコロニーをＭＭプレート上に再度画線培養し、次いで３０℃で液体ＭＭに接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁し、次いで２５０ｒｐｍ／分で５日間振とうした。細胞を遠心分離により回収し、脂質を抽出し、ＦＡＭＥをエステル交換により調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣを用いて分析した。

【0406】

ＧＣ分析によると、選択した９６株の大部分が全脂質の４０〜４６％ＥＰＡを生成することが示された。全脂質の約５３．２％、４６．４％、４６．８％および４７．８％ＥＰＡをそれぞれ生成する４つの株（すなわち、＃１２、＃４４、＃５６および＃９３）があった。これら４つの株をそれぞれＹ４３０５、Ｙ４３０６、Ｙ４３０７およびＹ４３０８と称した。

【0407】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４３０５の最終的な遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知の１−、未知の３−、未知の８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった。

【0408】

実施例４
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８の全脂質含量の測定
株Ｙ４１２８によって生成される脂質の総量および脂質中の各脂肪酸種の百分率をＧＣ分析によって測定した。具体的には、一般的方法に記載のように、全脂質を抽出し、エステル交換によってＦＡＭＥを調製し、次いでＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ６８９０ＧＣで分析した。

【0409】

乾燥細胞重量を、１０ｍＬの培養物から細胞を遠心分離によって回収し、細胞を水で１回洗浄し、残留培地を除去し、細胞を８０℃での真空オーブン下で一晩乾燥し、乾燥細胞を秤量することによって測定した。試料中のＦＡＭＥの総量を、ＧＣ特性におけるすべてのピークの領域を添加される既知の量の国内標準Ｃ１５：０脂肪酸のピーク領域と比較することによって判定した。

【0410】

上記分析に基づき、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の百分率としての脂質含量および脂質組成物を株Ｙ４０８６およびＹ４１２８について測定した。株Ｙ４１２８は株Ｙ４０８６に対して減少した脂質含量を有した（１１．２ＴＦＡ％ＤＣＷ対２８．６ＴＦＡ％ＤＣＷ）。それに対し、下の表１７に示されるように、株Ｙ４１２８は脂質中で株Ｙ４０８６に対して増加したＥＰＡ濃度を有した。脂肪酸は１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定しており、脂肪酸組成物は全脂肪酸（ＴＦＡ）の重量パーセント（ｗｔ．％）として表した。

【0411】

【表25】

【0412】

ｍｇ ＥＰＡ／ｇ乾燥細胞として表され、次の式、すなわち（ＥＰＡ／脂質の％）＊（脂質／乾燥細胞重量の％）＊０．１に従って計算される細胞内のＥＰＡ含量は、株Ｙ４０８６中の２８ｍｇ ＥＰＡ／ｇ ＤＣＷから株Ｙ４１２８中の４７．９ｍｇ ＥＰＡ／ｇ ＤＣＷに増加した。

【0413】

したがって、表１７に示される結果によると、株Ｙ４１２８は、親株Ｙ４０８６と比較し、より低い全脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１１．２％対２８．６％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４２．８％対９．８％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（４．８％対２．８％）を有することが示された。さらに、株Ｙ４１２８は、ＥＰＡの量で全ＰＵＦＡに対する３．３倍の増加（５４％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対１６．３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）およびＣ２０ＰＵＦＡの量で全ＰＵＦＡに対する１．７倍の増加（７３％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］対４２％のＰＵＦＡ［％ＴＦＡとして］）を有した。

【0414】

実施例５
Ｐｅｘ１０の組み込みとしてのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８のｐＺＰ２−２９８８の組み込み部位の判定
株Ｙ４１２８中のｐＺＰ２−２９８８のゲノム組み込み部位を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｋｉｔを使用し、製造業者の推奨プロトコルに従い、ゲノム歩行によって判定した。プラスミドの配列に基づき、次のプライマー、すなわちｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号１３６）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−２（配列番号１３７）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−３（配列番号１３８）、ｐＺＰ−ＧＷ−５−４（配列番号１３９）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号１４０）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−２（配列番号１４１）、ｐＺＰ−ＧＷ−３−３（配列番号１４２）およびｐＺＰ−ＧＷ−３−４（配列番号１４３）をゲノム歩行用に設計した。

【0415】

ゲノムＤＮＡを、改良されたプロトコルを有するＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用し、株Ｙ４１２８から調製した。細胞をＹＰＤ培地プレートからこすって１．５ｍＬのマイクロチューブに入れた。細胞ペレット（１００μｌ）を０．１２５Ｍのβ−メルカプトエタノールおよび１ｍｇ／ｍＬのｚｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ））を含有する緩衝液Ｐ１ ２５０μｌで再懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、緩衝液Ｐ２（２５０μｌ）をチューブに添加した。チューブに数回挿入することによって混合後、緩衝液Ｎ３ ３５０μｌを添加した。次いで、混合物を、微量遠心管中で、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をＱｉａｇｅｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐスピンカラムに注ぎ、１分間遠心した。カラムを緩衝液ＰＥ０．７５ｍＬの添加によって１回洗浄後、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間のさらなる遠心分離によって乾燥させた。ゲノムＤＮＡを緩衝液ＥＢ５０μｌのカラムへの添加によって溶出し、１分間静置させておき、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。

【0416】

精製ゲノムＤＮＡをゲノム歩行用に使用した。ＤＮＡを、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットのプロトコルに従い、制限酵素ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩおよびＳｔｕＩで別々に消化した。各消化においては、反応混合物は全容量１００μｌ中に１０×制限緩衝液１０μｌ、適切な制限酵素１０μｌおよび８μｇのゲノムＤＮＡを含有した。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。次いで、消化ＤＮＡ試料を、製造業者のプロトコルに正確に従い、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ＤＮＡ試料を水１６μｌ中に溶出した。次いで、精製し、消化したゲノムＤＮＡ試料をＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプターにライゲートした（下記）。各ライゲーション混合物は、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター１．９μｌ、１０×ライゲーション緩衝液１．６μｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ０．５μｌおよび消化されたＤＮＡ４μｌを含有した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。次いで、５０ｍＭ トリスＨＣｌ７２μｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を各ライゲーション混合物に添加した。

【0417】

５’末端ゲノム歩行においては、各ライゲーション混合物１μｌを鋳型として個別に使用し、４つのＰＣＲ反応を行った。さらに、各反応混合物は、１０μＭプライマーｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号１３６）１μｌ、１０μＭのキットに供給されたＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター１μｌ、水４１μｌ、１０×ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液５μｌおよびＣｌｏｎｔｅｃｈ製のＡｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス１μｌを含有した。Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプターの配列（配列番号１４４［上鎖］および１４５［下鎖］）を下記に示す。
５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＴ−３’
３’−Ｈ２Ｎ−ＣＣＣＧＡＣＣＡ−５’
ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で１分間、その後に９５℃で２０秒間および６８℃で３分間の３０サイクル、その後に６８℃で７分間の最終の伸長。ＰＣＲ産物をそれぞれ１：１００に希釈し、希釈ＰＣＲ産物１μｌを２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用した。条件は、ｐＺＰ−ＧＷ−５−２（配列番号１３７）がｐＺＰ−ＧＷ−５−１（配列番号１３６）の代わりに使用される以外は全く同じであった。

【0418】

３’末端のゲノム歩行においては、４つのＰＣＲ反応を、プライマーｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号１４０）およびネスト化アダプタープライマー（配列番号１４６）を使用した点を除き、上記のように行った。ＰＣＲ産物を同様に希釈し、２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用し、ｐＺＰ−ＧＷ−３−２（配列番号１４１）を使用し、ｐＺＰ−ＧＷ−３−１（配列番号１４０）と置換した。

【0419】

ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分析した。１つの反応産物が、鋳型としてＥｃｏＲＶで消化されたゲノムＤＮＡとプライマーｐＺＰ−ＧＷ−３−２およびネスト化アダプタープライマーを使用し、約１．６ｋＢの断片を生成した。この断片を単離し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットで精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。配列分析によると、断片がプラスミドｐＺＰ２−２９８８の一部およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の染色体Ｃ由来のゲノムＤＮＡを含むことが示された。それらの間の接合部は、染色体Ｃのヌクレオチド位置１３９８２６にあった。これはＰｅｘ１０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）のコード領域内部であった。

【0420】

接合部の５’末端を決定するため、ＰＣＲ増幅を、鋳型として株Ｙ４１２８由来のゲノムＤＮＡおよびプライマーＰｅｒ１０Ｆ１（配列番号１４７）およびＺＰＧＷ−５−５（配列番号１４８）を使用して実施した。反応混合物は、１μｌずつの２０μＭプライマー、ゲノムＤＮＡ１μｌ、水２２μｌおよびＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ２×プレミックス（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Ｏｔｓｕ Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ））２５μｌを含有した。熱サイクラー条件は、９４℃で１分間、その後に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で２分間の３０サイクル、その後に７２℃で７分間の最終の伸長であった。１．６ｋＢのＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。配列分析によると、それがヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の染色体Ｃ由来のゲノムＤＮＡとｐＺＰ２−２９８８の間のキメラ断片であることが示された。接合部は染色体Ｃのヌクレオチド位置１３９８１７にあった。したがって、染色体Ｃの１０のヌクレオチドセグメントを、株Ｙ４１２８中のｐＺＰ２−２９８８（図６Ａ）に由来するＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で置換した。その結果、株Ｙ４１２８中のＰｅｘ１０にはコードされたタンパク質（配列番号１２０）の最後の３２個のアミノ酸が欠如していた。

【0421】

上記結論に基づき、実施例３（上記）で単離されたＹ４１２８Ｕ株は、以降でΔｐｅｘ１０株と称されることになる。明確にするため、株Ｙ４１２８Ｕ１は株Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）に等しい。

【0422】

実施例６
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）におけるＰｅｘ１０のプラスミド発現
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０遺伝子を有する３つのプラスミド、すなわち１）ＦＢＡＩＮｍプロモーターの制御下でのＰｅｘ１０ ＯＲＦの発現を可能にするｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０、ならびに２）天然Ｐｅｘ１０プロモーターの制御下でのＰｅｘ１０の発現を可能にするｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２を作成したが、ｐＰＥＸ１０−１ではプロモーターのより短いバージョン（約５００ｂｐ）を使用した一方、ｐＰＥＸ１０−２ではより長いバージョン（約９００ｂｐ）を使用した。これらの発現プラスミドの作成および形質転換の後、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）における全オイルおよびＥＰＡレベルに対するＰｅｘ１０プラスミド発現の効果を判定した。Ｐｅｘ１０の欠失の結果、細胞内でＴＦＡのパーセントとしてのＥＰＡの量は増加したが、ＤＣＷのパーセントとしての全脂質の量は減少した。

【0423】

ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０、ｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２の作成
ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０を作成するため、プライマーＰｅｒ１０ Ｆ１（配列番号１４７）およびＰｅｒ１０Ｒ（配列番号１４９）を使用し、鋳型としてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡを使用してＰｅｘ１０遺伝子のコード領域を増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、１μｌずつの２０μＭプライマー、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）１μｌ、ＥｘＴａｑ ２×プレミックス２５μｌおよび水２２μｌを含有した。反応を、９４℃で１分間、その後に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で９０秒間の３０サイクル、その後に７２℃で７分間の最終の伸長に従って行った。ＰＣＲ産物である１１６８ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１（配列番号１５０；図９Ａ）にクローン化し、同じ２種の制限酵素で消化した。

【0424】

配列分析を施した８つの個別のクローンの中の２つがＰｅｘ１０の正確な配列を有し、全くエラーを有しなかった。ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０（配列番号１５１；図９Ｂ）の成分を下の表１８に列挙する。

【0425】

【表26】

【0426】

ｐＰＥＸ１０−１およびｐＰＥＸ１０−２を作成するため、プライマーＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩ（配列番号１５２）、ＰＥＸ１０−Ｆ１−ＳａｌＩ（配列番号１５３）およびＰＥＸ１０−Ｆ２−ＳａｌＩ（配列番号１５４）を設計し、合成した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡとプライマーＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩおよびＰＥＸ１０−Ｆ１−ＳａｌＩを使用するＰＣＲ増幅により、いずれかの末端でＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位によって隣接された、Ｐｅｘ１０遺伝子のＰｅｘ１０ ＯＲＦ、５００ｂｐの５’上流領域および２１５ｂｐの３’下流領域を有する１８７３ｂｐの断片が生成された。この断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで精製し、ＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、同じ２種の酵素で消化されたｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１（配列番号１５５；図１０Ａ）にクローン化し、ｐＰＥＸ１０−１（配列番号１５６；図１２Ｂ）を作成した。プラスミドｐＥＸＰ−ＭＯＤ１はｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１（配列番号１５０；図９Ａ）に、後者におけるＦＢＡＩＮｍプロモーターをＥＸＰ１プロモーターで置換した以外では類似する。表１９はｐＰＥＸ１０−１の成分を列挙する。

【0427】

【表27】

【0428】

ＰＥＸ１０−Ｒ−ＢｓｉＷＩ（配列番号１５２）およびＰＥＸ１０−Ｆ２−ＳａｌＩ（配列番号１５４）を使用するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅により、いずれかの末端でＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩ制限部位によって隣接されたＰｅｘ１０遺伝子のＰＥＸ１０ ＯＲＦ、９９１ｂｐの５’上流領域および２１５ｂｐの３’下流領域を有する２３６５ｂｐの断片が生成された。この断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットで精製し、ＳａｌＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、同様に消化されたｐＥＸＰ−ＭＯＤ−１にクローン化した。この結果、キメラＰｅｘ１０−５’：：Ｐｅｘ１０：：ＰＥＸ１０−３’遺伝子における長い方のＰｅｘ１０−５’プロモーターを除いて作成がプラスミドｐＰＥＸ１０−１（表１９、上記）のそれに類似したｐＰＥＸ１０−２（配列番号１５７）が合成された。

【0429】

株Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）におけるＰｅｘ１０の発現
プラスミドｐＦＢＡＩＮ−ＭＯＤ−１（対照；配列番号１５０）、ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０（配列番号１５１）、ｐＰＥＸ１０−１（配列番号１５６）およびｐＰＥＸ１０−２（配列番号１５７）を、一般的方法におけるプロトコルに従ってＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）に形質転換した。形質転換体をＭＭプレート上に播種した。上記プラスミドを有する形質転換体の全脂質含量および脂肪酸組成物を実施例４に記載のように分析した。

【0430】

乾燥細胞重量の百分率としての脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）および脂質組成物を下の表２０に示す。詳細には、脂肪酸は１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡおよびＥＰＡとして同定しており、脂肪酸組成物は全脂肪酸の重量パーセント（ｗｔ．％）として表した。

【0431】

【表28】

【0432】

表２０における結果は、天然ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｅｘ１０プロモーターまたはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＦＢＡＩＮｍプロモーターのいずれかからのＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）におけるＰｅｘ１０の発現により、ＥＰＡのパーセントが減少してＹ４０８６のレベルまで戻る一方、全脂質量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）がＹ４０８６のレベルまで増加することを示した（比較のための表１７のデータを参照）。乾燥細胞１グラムあたりのＥＰＡ含量は、対照試料（すなわちｐＦＢＡＩｎ−ＭＯＤ−１を有する細胞）の場合での６３．２ｍｇから、ｐＦＢＡＩｎ−ＰＥＸ１０を有する細胞内での３１．５ｍｇ、ｐＰＥＸ１０−１を有する細胞内での２９ｍｇおよびｐＰＥＸ１０−２を有する細胞内での３０．８ｍｇまで変化した。これらの結果は、Ｐｅｘ１０のリングフィンガードメインの破壊が、細胞内でのＥＰＡの量を増加させるが、全脂質の量を減少させることを示した。

【0433】

したがって、表２０における結果は、対照プラスミドでのＹ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）形質転換体に対し、Ｐｅｘ１０を発現するプラスミドでのすべての形質転換体は、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（＞２７％対２２．８％）、より低いＥＰＡ％ＴＦＡ（約１０．８％対２７．７％）、およびより低いＥＰＡ％ＤＣＷ（＜３．１％対６．３％）を示した。さらに、Ｐｅｘ１０を発現するプラスミドでの形質転換体に対する対照プラスミドでの株Ｙ４１２８Ｕ１（Δｐｅｘ１０）形質転換体は、全ＰＵＦＡに対してＥＰＡの量で２．５倍の増加（［％ＴＦＡとして］ＰＵＦＡの４４％対［％ＴＦＡとして］ＰＵＦＡの１７．５％（平均））と、全ＰＵＦＡに対してＣ２０ＰＵＦＡの量で１．５倍の増加を有した（［％ＴＦＡとして］ＰＵＦＡの６７％対［％ＴＦＡとして］ＰＵＦＡの４４％（平均））。

【0434】

実施例７
ＥＰＡを生成するためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕの作成
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕを以下、実施例８における宿主として使用した。株Ｙ４１８４Ｕはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導されたものであり、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を介し、全脂質に対して高ＥＰＡを生成可能である。株はＵｒａ−表現型を有し、その作成はＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレット（ここで参照により本明細書中に援用される）の実施例７に記載されている。

【0435】

しかし、まとめると、株Ｙ４１８４Ｕの作成には、株Ｙ２２２４、株Ｙ４００１、株Ｙ４００１Ｕ、株Ｙ４０３６、株Ｙ４０３６Ｕおよび株Ｙ４０６９の作成が必要であった（上記、実施例１）。（図１１Ｂに図示される）株Ｙ４１８４Ｕのさらなる作成には、株Ｙ４０８４、株Ｙ４０８４Ｕ１、（２００７年１１月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに登録番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８８０２下で寄託された）株Ｙ４１２７、株Ｙ４１２７Ｕ２、株Ｙ４１５８、株Ｙ４１５８Ｕ１および株Ｙ４１８４の作成が必要であった。

【0436】

野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２についての株Ｙ４１８４（全脂質中３１％のＥＰＡを生成する）の最終的な遺伝子型は、未知の１−、未知の２−、未知の４−、未知の５−、未知の６−、未知の７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：Ｒｄ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった。

【0437】

最後に、株Ｙ４１８４中のＵｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（図６Ｂ；配列番号１３０）を使用し、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子を株Ｙ４１８４のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ結果、それぞれ株Ｙ４１８４Ｕ１（全脂質の１１．２％ＥＰＡ）、Ｙ４１８４Ｕ２（全脂質の１０．６％ＥＰＡ）およびＹ４１８４Ｕ４（全脂質の１５．５％ＥＰＡ）（集合的にＹ４１８４Ｕ）が得られた。

【0438】

実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４におけるＰｅｘ１０の染色体欠失によってＥＰＡおよび全脂質含有物の蓄積が増大する コンストラクトｐＹＰＳ１６１（図１１Ｂ、配列番号１５８）を使用し、ＥＰＡを生成するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株Ｙ４１８４Ｕ４（実施例７）に由来する染色体Ｐｅｘ１０遺伝子をノックアウトした。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４のＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトでの形質転換の結果、株Ｙ４１８４（Δｐｅｘ１０）が生成した。全オイルおよびＥＰＡレベルに対するＰｅｘ１０ノックアウトの効果を測定し、比較した。詳細には、Ｐｅｘ１０のノックアウトの結果、（％ＴＦＡおよび％ＤＣＷとしての）ＥＰＡの百分率が増加し、細胞内の全脂質の量が増加した。

【0439】

コンストラクトｐＹＳＰ１６１
コンストラクトｐＹＰＳ１６１は次の成分を含有した。

【0440】

【表29】

【0441】

ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ノックアウト株Ｙ４１８４（ΔＰｅｘ１０）の作成
一般的方法に記載の標準プロトコルを使用し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４Ｕ４（実施例７）をＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトｐＹＰＳ１６１の５．３ｋＢの精製ＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で形質転換し（上記）、細胞単独対照も調製した。形質転換実験の各々において約２００〜２５０のコロニーが存在した一方、細胞単独プレート上には全くコロニーが存在しなかった（期待値あたり）。

【0442】

コロニーＰＣＲを使用し、Ｐｅｘ１０欠失を有する細胞についてスクリーニングした。詳細には、ＰＣＲ反応を、ＰＣＲプライマーＰｅｘ−１０ｄｅｌ１ ３’．Ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１５９）およびＰｅｘ−１０ｄｅｌ２ ５’．Ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１６０）を使用する標準プロトコルに従い、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して実施した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間、その後に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で２分間の３０サイクル、その後に７２℃で６分間の最終の伸長であった。次いで、反応物を４℃で保持した。Ｐｅｘ１０ノックアウトコンストラクトがＰｅｘ１０領域内部に組み込まれる場合、サイズが２．８ｋＢの単一のＰＣＲ産物が生成されることが期待された。それに対し、株におけるＰｅｘ１０領域以外の染色体領域内にＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトが組み込まれる場合、２つのＰＣＲ断片、すなわち２．８ｋＢおよび１．１ｋＢが生成されることになる。スクリーニングされた２８８の中の大部分のコロニーが、ランダム部位に組み込まれたＰｅｘ１０ノックアウトコンストラクトを有した。２８８の中に１つのコロニーだけがＰｅｘ１０ノックアウトを有した。この株をＹ４１８４（Δｐｅｘ１０）と称した。

【0443】

全オイルおよびＥＰＡの生成のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１８４およびＹ４１８４（ΔＰｅｘ１０）の評価
全脂質画分中のＰＵＦＡのパーセントに対するＰｅｘ１０ノックアウトの効果および細胞内の全脂質含量を評価するため、株Ｙ４１８４およびＹ４１８４（Δｐｅｘ１０）を比較可能な油性条件下で成長させた。特に、培養物を、２５０ｍＬのフラスコ内で２５ｍＬの発酵培地（ＦＭ）または酵母抽出物を有しないＦＭ培地（ＹＥを有しないＦＭ）のいずれかの中で、約０．１の開始ＯＤ_６００で４８時間成長させた。細胞を、５０ｍＬの円錐管内、８０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって回収した。上清を廃棄し、細胞を２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁し、新しい２５０ｍＬのフラスコに移した。細胞を、通気下、３０℃でさらに１２０時間インキュベートした。

【0444】

乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を測定するため、５ｍＬのＦＭ成長培地および１０ｍＬのＹＥを有しないＦＭ成長培地に由来する細胞を処理した。培養細胞を４３００ｒｐｍで１０分間遠心した。ペレットを、生理食塩水１０ｍＬを使用して再懸濁し、同じ条件下で再度遠心した。次いで、ペレットを無菌Ｈ_２Ｏ １ｍＬを使用して再懸濁し（３回）、予め秤量した（ｐｒｅ−ｗｅｉｇｈｅｄ）アルミニウムパンに移した。細胞を８０℃超での真空オーブン内で一晩乾燥した。細胞の重量を測定した。

【0445】

上記プラスミドを有する形質転換体の全脂質含量および脂肪酸組成物を実施例４に記載のように分析した。

【0446】

ＤＣＷ、全脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）、全ＥＰＡ％ＴＦＡ、およびＥＰＡ％ＤＣＷを下の表２２に示す。

【0447】

【表30】

【0448】

表２２における結果は、Ｙ４１８４（ΔＰｅｘ１０）中の染色体Ｐｅｘ１０遺伝子のノックアウトにより、天然Ｐｅｘ１０ｐがノックアウトされていない株Ｙ４１８４中のＥＰＡのパーセントおよび全オイル含量に対し、（％ＴＦＡおよび％ＤＣＷとしての）ＥＰＡのパーセントが増加し、全オイル含量が増加することを示した。より詳細には、ＦＭ培地中では、ＥＰＡ（％ＴＦＡ）が約１０９％増加し、ＥＰＡの生産性（％ＤＣＷ）が約２１６％増加し、全オイル（ＴＦＡ％ＤＣＷ）が約４９％増加した。ＹＥを有しないＦＭ培地中では、ＥＰＡ（％ＴＦＡ）が約１００％増加し、ＥＰＡの生産性（％ＤＣＷ）が約２０５％増加し、全オイル（ＴＦＡ％ＤＣＷ）が約５０％増加した。

【0449】

したがって、表２２における結果は、ＦＭ培地が、親株Ｙ４１８４、Ｙ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株に対し、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１７．６％対１１．８％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４３．２％対２０．６％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（７．６％対２．４％）を有することを示した。同様に、ＹＥを有しないＦＭ培地は、親株Ｙ４１８４、Ｙ４１８４（ΔＰｅｘ１０）株に対し、より高い脂質含量（ＴＦＡ％ＤＣＷ）（１３．２％対８．８％）、より高いＥＰＡ％ＴＦＡ（４６．１％対２３．２％）、およびより高いＥＰＡ％ＤＣＷ（６．１％対２．０％）を有した。

【0450】

当業者であれば、ｐＹＰＳ１６１と同様、親ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株への形質転換時、他の染色体Ｐｅｘ遺伝子のノックアウトをもたらすのに適切なノックアウトコンストラクトを容易に設計できる。好ましいＰｅｘ遺伝子であれば、Ｐｅｘ１ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２１７８；配列番号９５）、Ｐｅｘ２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７６４７；配列番号９６）、Ｐｅｘ３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５；配列番号９７）、Ｐｅｘ３Ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８３３５６；配列番号９８）、Ｐｅｘ４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９１３０；配列番号９９）、Ｐｅｘ５ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８８０３；配列番号１００）、Ｐｅｘ６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８２３０６；配列番号１０１）、Ｐｅｘ７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８３８９；配列番号１０２）、Ｐｅｘ８ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８０４４７；配列番号１０３）、Ｐｅｘ１２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１５３２；配列番号１０５）、Ｐｅｘ１３ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１７８９；配列番号１０６）、Ｐｅｘ１４ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９３２３；配列番号１０７）、Ｐｅｘ１６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２；配列番号１０８）、Ｐｅｘ１７ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８４０２５；配列番号１０９）、Ｐｅｘ１９ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ８４８２７；配列番号１１０）、Ｐｅｘ２０ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９２２６；配列番号１１１）、Ｐｅｘ２２ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７７８７６；配列番号１１２）およびＰｅｘ２６ｐ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００６０７２、ヌクレオチド１１７２３０〜１１８３８７のアンチセンス翻訳；配列番号１１３）を含むことになる。

【0451】

Ｐｅｘの染色体破壊が生じれば、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない真核生物に対し、全脂肪酸のパーセントとして全脂質画分中およびオイル画分中のＰＵＦＡの量が増加することが想定されることになり、ここでＰＵＦＡの量は、１）ＰＵＦＡ中間体または副産物（例えばＥＰＡ）ではなく所望される機能的ＰＵＦＡ生合成経路の最終産物であるＰＵＦＡ、２）Ｃ_２０およびＣ_２２ ＰＵＦＡ、および／または３）全ＰＵＦＡでありうる。好ましい結果は、全脂肪酸のパーセントとしてのＰＵＦＡの量の増加をもたらすだけでなく、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない真核生物に対し、乾燥細胞重量のパーセントとしてのＰＵＦＡの量の増加をもたらす。また、ＰＵＦＡの量は、１）ＰＵＦＡ中間体または副産物ではなく機能的ＰＵＦＡ生合成経路の所望される最終産物であるＰＵＦＡ、２）Ｃ_２０およびＣ_２２ ＰＵＦＡ、および／または３）全ＰＵＦＡでありうる。場合によっては、全脂質含量もまた、天然ペルオキシソーム生合成因子タンパク質が破壊されていない真核生物のそれに対して増加することになる。

【0452】

実施例９
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５におけるｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２、ｐＺＰ３−ＰＡ７７７ＵおよびｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣの組み込み部位の判定
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５におけるｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２、ｐＺＰ３−ＰＡ７７７ＵおよびｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのゲノム組み込み部位を、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４１２８におけるｐＺＰ２−２９８８の組み込み部位の同定のための実施例５に記載の方法と同様の方法で、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｋｉｔを使用し、ゲノム歩行によって判定した。

【0453】

ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２組み込み部位を同定するためのゲノム歩行
プライマーＫＬ２−３−１（配列番号１６１）およびＫＤ２−３−２（配列番号１６２）をｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２配列（配列番号１３５）に基づいて設計し、組み込みコンストラクトの３’末端の組み込み部位（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子［配列番号９３］の３’隣接領域）を同定した。

【0454】

ゲノムＤＮＡを、実施例５に記載の改良されたプロトコルでＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットを使用し、株Ｙ４３０５から調製した。ゲノムＤＮＡの単離後、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩおよびＳｔｕＩでの制限酵素消化物を実施例５の方法に従って調製し、次いで精製し、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒアダプター（配列番号１４４および１４５）にライゲートした。

【0455】

ゲノム歩行においては、４つのＰＣＲ反応を、鋳型として各ライゲーション混合物１μｌを個別に使用して実施した。さらに、各反応混合物は、１０μＭプライマーＫＬ２−３−１（配列番号１６１）１μｌ、キットからの１０μＭアダプタープライマー（配列番号１４４および１４５）１μｌ、水４１μｌ、１０×ｃＤＮＡ ＰＣＲ反応緩衝液５μｌおよびＣｌｏｎｔｅｃｈ製のＡｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡポリメラーゼミックス１μｌを含有した。ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間、その後に９５℃で２０秒間および６８℃で３分間の３０サイクル、その後に６８℃で７分間の最終の伸長であった。ＰＣＲ産物をそれぞれ１：１００に希釈し、希釈ＰＣＲ産物１μｌを２回目のＰＣＲにおける鋳型として使用した。条件は、ＫＤ２−３−２（配列番号１６２）でＫＬ２−３−１（配列番号１６１）を置換したこと以外は正確に同じであった。

【0456】

２回目からのＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分析した。１つの反応産物は約５６０ｂｐの断片を含有した。この断片を単離し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットで精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。配列分析によると、断片がプラスミドｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２の一部およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｅ由来のゲノムＤＮＡの一部を含むことが示された。それらの間の接合部は染色体Ｅのヌクレオチド位置１５０９０５にあった。これはＳＣＰ２遺伝子（配列番号８７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿５０３４１０）のコード領域内部であった。

【0457】

接合部の５’末端を決定するため、ＰＣＲ増幅を鋳型として株Ｙ４３０５由来のゲノムＤＮＡとプライマーＳＣＰ−５−２（配列番号１６３）およびＫＤ２−５−３（配列番号１６４）を使用して実行した。反応混合物は、１μｌずつの２０μＭプライマー、ゲノムＤＮＡ１μｌ、水２２μｌおよびＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ２×プレミックス（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ））２５μｌを含有した。熱サイクラー条件は、９４℃で１分間、その後に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル、その後に７２℃で７分間の最終の伸長であった。約９００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。

【0458】

配列分析によると、１）染色体Ｅ由来のヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡの一部；２）ＮＣＢＩデータベース中の任意の既知の配列との相同性を全く有しない、３０３ヌクレオチド長の未知のＤＮＡのストレッチ（配列番号１７４）；および３）ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２（配列番号１３５）由来のＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片の５’末端を含む８４４ｂｐのキメラ断片（配列番号１７３）が示された。接合部は染色体Ｅのヌクレオチド位置１５０９０１にあった。したがって、３ｂｐの染色体Ｅのヌクレオチドセグメントを、株Ｙ４３０５における未知のＤＮＡ断片およびｐＺＤ２−５Ｕ８９Ａ２由来のＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片で置換した。その結果、ＳＣＰ２遺伝子は１２９アミノ酸長のタンパク質のコドン７１の後で中断された。得られた切断型ＳＣＰ２ ＯＲＦではＣ末端で５８のコドンが欠如している。

【0459】

ｐＺＰ３−ＰＡ７７７Ｕ組み込み部位を同定するためのゲノム歩行
ｐＺＰ３−ＰＡ７７７Ｕにおいては、次のプライマー、すなわち７９−５−ＰＯＸ−１（配列番号１６５）および７９−５−ＰＯＸ−２（配列番号１６６）を設計した。５’挿入接合部（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）におけるゲノム歩行を、１）ＰＣＲの１回目においてプライマー７９−５−ＰＯＸ−１がＫＬ２−３−１の代わりに使用され、かつ２）ＰＣＲの２回目においてプライマー７９−ＰＯＸ−５−２がＫＤ２−３−２の代わりに使用される以外では同一条件を用い、ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２の場合に上記と同じＹ４３０５ゲノムＤＮＡライゲーション混合物セットを使用して実行した。約２３５０ｂｐの断片をＰＣＲ反応物の１つ（配列番号１７５）から得た。この断片は配列決定され、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｆ由来のゲノムＤＮＡ、未知のＤＮＡの１７２９ｂｐの断片（配列番号１７６）、およびｐＺＰ３−ＰＡ７７７Ｕ（配列番号１２７）の５’末端由来のＤＮＡを有することが示された。挿入接合部は染色体Ｆ上のヌクレオチド位置３１５９６０５にあった。挿入部位は、胞子形成に特異的なタンパク質をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＲＦ ＹＯＲ３１３Ｃ（ＳＰＳ４）にわずかに類似するＯＲＦであるＯＲＦ ＹＡＬｉ０Ｆ２４１６７ｇ（配列番号９１）の開始コドンの１５４ｂｐ上流であった。

【0460】

３’末端接合部を、プライマー４３０５ＺＰ３−３−２（配列番号１６７）および７９−３−ＰＯＸ−３（配列番号１６８）を使用するＰＣＲによって得た。反応混合物は、１μｌずつの２０μＭプライマー、ゲノムＤＮＡ１μｌ、水２２μｌおよびＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ ２×プレミックス（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐ
ａｎ））２５μｌを含有した。熱サイクラー条件は、９４℃で１分間、その後に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル、その後に７２℃で７分間の最終の伸長であった。約３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化した。

【0461】

配列分析によると、それはヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｆ由来のゲノムＤＮＡとｐＺＰ３−ＰＡ７７７Ｕ（配列番号１２７）の間での３２６ｂｐのキメラ断片（配列番号１７７）であることが示された。接合部は染色体Ｆのヌクレオチド位置３１５９６０５にあった。

【0462】

５’および３’の分析に基づき、ｐＺＰ３−ＰＡ７７７ＵのＡｓｃＩ／ＰａｃＩ断片を有するＤＮＡ断片および１７２９ｂｐの未知のＤＮＡを、ＹＡＬｉ０Ｆ２４１６７ｇ ＯＲＦ（配列番号９１）の１５４ｂｐ上流の位置３１５９６０５で染色体Ｆに挿入した。

【0463】

ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ組み込み部位を同定するためのゲノム歩行
ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣにおいては、次のプライマー、すなわちＫＬ２−５−２（配列番号１６９）、ＫＬ２−５−３（配列番号１７０）、ＫＬ２−３−２（配列番号１７１）、およびＫＬ２−３−３（配列番号１７２）をゲノム歩行のために設計した。５’挿入接合部におけるゲノム歩行を、１）ＰＣＲの１回目においてプライマーＫＬ２−５−２がＫＬ２−３−１の代わりに使用され、かつ２）ＰＣＲの２回目においてプライマーＫＬ２−５−３がＫＤ２−３−２の代わりに使用される以外では同一条件を用い、ｐＺＫＤ２−５Ｕ８９Ａ２における記載と同じＹ４３０５ゲノムＤＮＡライゲーション混合物セットを使用して実行した。反応産物の中の１つに由来する５１９ｂｐの断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、配列決定した。ＢＬＡＳＴ分析によると、この５１９ｂｐの断片（配列番号１７８）がヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｃに由来するＤＮＡおよびｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片の５’末端を有することが示された。接合部は位置２５６８７９３にあった。より詳細には、６６ｂｐの未知のＤＮＡ（配列番号１７９）を染色体ＣとｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ（配列番号１３１）の間に挿入した。

【0464】

３’挿入接合部におけるゲノム歩行を、１）ＰＣＲの１回目においてプライマーＫＬ２−３−２がＫＬ２−５−２の代わりに使用され、かつ２）ＰＣＲの２回目においてプライマーＫＬ２−３−３がＫＬ２−５−３の代わりに使用される以外では５’挿入接合部における場合と全く同様に実行した。ＰＣＲ産物の中の１つに由来する７１１ｂｐの断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローン化し、配列決定した。ＢＬＡＳＴ分析によると、この７１１ｂｐの断片（配列番号１８０）がヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｃに由来するＤＮＡおよびｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣを有することが示された。接合部は位置２５６８７８７にあった。したがって、６５ｂｐの未知のＤＮＡ（配列番号１８１）を染色体ＣとｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣの間に挿入した。

【0465】

５’および３’接合部の分析に基づき、ｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣ由来のＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片をヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の染色体Ｃに挿入した。それを２５６８７８７と２５６８７９３の間の染色体Ｃの５ｂｐのヌクレオチドセグメントと置換した。６６ｂｐの未知のＤＮＡを位置２５６８７９３とｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片の５’末端の間に挿入し、６６ｂｐの未知のＤＮＡを位置２５６８７８７とｐＺＫＬ２−５Ｕ８９ＧＣのＡｓｃＩ／ＳｐｈＩ断片の３’末端の間に挿入した。挿入により、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子ＹＬＲ０５０Ｃの相同体であるＯＲＦ ＹＡＬｉ０Ｃ１８７１１ｇ（配列番号８９）における翻訳開始コドンの最初のヌクレオチド「Ａ」が欠失した。それ故、挿入により、開始コドンが破壊され、プロモーター領域が非機能的ＯＲＦから分離された。

【0466】

実施例１０
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５の発酵
本実施例では、１６２時間の期間にわたるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株Ｙ４３０５（実施例３）の２Ｌの発酵について記載する。脂質特性を４〜１５時間ごとに監視した。最大ＥＰＡは１４８時間後に生成された全脂質の５５．６％であり、それは１２．１ＥＰＡ％ＤＣＷに対応した。

【0467】

種培養物：
振盪フラスコ内で種培養物を調製するため、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４３０５の遺伝子組換え株の解凍したグリセロールストック（０．１ｍＬ）を、Ｄ−グルコース（２０ｇ／Ｌ）、アミノ酸を有しない酵母窒素塩基（３．４ｇ／Ｌ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（６．０ｇ／Ｌ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ（３．３ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（１．５ｇ／Ｌ）およびチアミン・ＨＣｌ（１．５ｍｇ／Ｌ）を含有する複合培地５０ｍＬを有する５００ｍＬの振盪フラスコに移した。フラスコ培養物を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ_６００）が約２になるまで、３０℃で４８時間インキュベートした。

【0468】

発酵：
２−リットルのＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｂ発酵糖（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｇｅｒｍａｎｙ））を発酵実験に使用した。上記の振盪フラスコ種培養（５０ｍＬ、約２のＯＤ_６００）を２−リットルのＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｂ発酵糖に移し、新しい発酵培地９５０ｍＬを含有する発酵を開始した（ｔ＝０時間）。新しい発酵培地は、酵母抽出物（５．０ｇ）、アミノ酸を有しない酵母窒素塩基（６．７ｇ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（６．０ｇ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ（３．３ｇ）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（１．５ｇ）、チアミン・ＨＣｌ（１．５ｍｇ）、Ｄ−グルコース（５０ｇ）、微量金属溶液（１００×）（２４ｍＬ）、およびアンチフォーム（ａｎｔｉｆｏｒｍ）２０４（０．２ｍＬ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含有した。微量金属溶液（１００×）は、クエン酸（１０ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（１．５ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（１０ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．３９ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．３８ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（０．２０ｇ／Ｌ）、およびＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ（０．３０ｇ／Ｌ）を含有した。溶存酸素濃度（ｐＯ_２）を、８０〜１２００ｒｐｍのインペラ速度のカスケード制御によって０超で制御した。通気速度を１．０Ｌ／分〜２．０Ｌ／分で制御した。グルコース（６００ｇ／Ｌ）の供給を、培地中のその濃度が２０ｇ／Ｌ未満に減少した時、開始した。グルコース濃度を、全発酵プロセスの間、２０〜６０ｇ／Ｌ以内に維持した。

【0469】

ｐＨ制御のための酸はＨ_３ＰＯ_４（２０％、ｗ／ｖ）であった。ｐＨ制御のための塩基は成長相でのＮＨ_４ＯＨ（２８％ＮＨ_３、ｗ／ｖ）であり、次いでそれを脂質生成相でのＫＯＨ（５６％、ｗ／ｖ）に交換した。それぞれ、温度を３０〜３２℃に制御し、ｐＨ値を５〜７に制御した。

【0470】

発酵実験を１６２時間行った。発酵試料（１０〜２０ｍＬ）を４〜１５時間ごとに採取し、細胞内脂質濃度、脂質特性、細胞の光学密度、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、グルコース、大部分のカチオン、および有機酸の濃度を測定した。一般的方法における方法に従い、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞の細胞内脂質をメタノールおよびクロロホルムによって抽出し、その濃度および特性をＧＣによって判定した。

【0471】

結果：
全脂肪酸の％として示される、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、全脂質（ＴＦＡ％ＤＣＷ）および各個別の脂肪酸の組成物を１６２時間の発酵の間での１５の各時点で下の表２３に示す。

【0472】

【表31】

【0473】

したがって、発酵中の８９．９時間経過時の結果は、少なくとも約４３．３％のＥＰＡ、約２３．６％未満のＬＡ（１８：２）および約９．４％未満のオレイン酸（１８：１）を有する微生物オイルの生成を示し、ここでは各脂肪酸はＴＦＡの％として示される。微生物オイルは、ＴＦＡの％として約４．２％未満のＥＤＡをさらに含みうる。

【0474】

％ＴＦＡとしての全ω−３含量は、ＡＬＡ、ＥＴｒＡ、ジュニペロン酸（シス５，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、２０：４）、ＥＴＡおよびＥＰＡにおける％ＴＦＡの合計によって判定される。ω−３含量は、発酵の８９．９時間から１６２．１時間にかけてＴＦＡのパーセントとして５０．７％超であり、最大レベルが６１％に達する（１４７．８時間）。

【0475】

同様に、各時点でのＥＰＡ％ＤＣＷを式：［（エイコサペンタエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）］／１００を用いて計算した。発酵中の８９．９時間経過時、ＥＰＡ％ＤＣＷは９．３５であり、発酵を通じてのその後の他の全時点で、ＥＰＡ％ＤＣＷは増加し、１３７．９時間後に１２．１３のＥＰＡ％ＤＣＷの最大レベルであった。
発酵の当業者は、（表２３に示されるように）特定のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株（例えばＹ４３０５）のオイル特性において、発酵作業自体、培地条件、プロセスパラメータ、スケールアップなどに依存し、また培養物がサンプリングされる特定の時点で、変動性が生じることを理解するであろう。結果として、例えば、株Ｙ４３０５の発酵から生じる微生物オイルが少なくとも約４３％のＥＰＡ、約２４％未満のＬＡ（１８：２）、約１０％未満のオレイン酸（１８：１）、約４％未満のＥＤＡ、約２％未満のＥＴＡ、約１％未満のＡＲＡ、約４％未満のステアリン酸（１８：０）および約４％未満のパルミチン酸（１６：０）（ここで各脂肪酸はＴＦＡの％に相当する）を含有しうることが想定されうる。

【0476】

以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．エイコサペンタエン酸を生産するための組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞であって、
ａ）配列番号５、７、９、１１、１３、１５および１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子、
ｂ）配列番号１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１および３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、ここで上記ヤロウィア属エスピー生産宿主細胞は、該生産宿主細胞における総脂肪酸の質量パーセントとして測定された少なくとも約４３．３質量パーセントのエイコサペンタエン酸を生産する、組換えヤロウィア属エスピー生成宿主細胞。
２．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子またはΔ８デサチュラーゼを
コードする少なくとも１つの遺伝子が、ヤロウィア・リポリティカプロモーターの制御下にある、上記１に記載の組換え生産宿主。
３．ヤロウィア・リポリティカプロモーターが、ＧＰＤ、ＧＰＤＩＮ、ＧＰＭ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ、ＧＰＡＴ、ＹＡＴ１およびＥＸＰ１からなる群から選択される、上記２に記載の組換え生産宿主。
４．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子またはΔ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が、Ａｃｏ３、Ｐｏｘ３、Ｐｅｘ２０、Ｐｅｘ１６、Ｌｉｐ１、Ｌｉｐ２およびＯＣＴからなる群から選択されるヤロウィアターミネーターの制御下にある、上記１に記載の組換え生産宿主。
５．Δ９エロンガーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在する、上記１に記載の組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞。
６．Δ８デサチュラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が少なくとも５つのコピー内に存在する、上記１に記載の組換えヤロウィア属エスピー生産宿主細胞。
７．エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産するための方法であって、
ａ）エイコサペンタエン酸を含む微生物オイルを生産させる、上記１に記載の生産宿主を培養するステップ；および
ｂ）場合により、ステップ（ａ）の微生物オイルを回収するステップ
を含む、上記方法。
８．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約２５質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含有する微生物オイル。
９．総脂肪酸の質量パーセントとして１質量パーセント未満のγ−リノレン酸を含有する、上記８に記載の微生物オイル。
１０．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約３０質量パーセントのエイコサペンタエン酸および約２５質量パーセント未満のリノール酸を含む微生物オイル。
１１．総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約５０質量パーセントのω−３多価不飽和脂肪酸を含む微生物オイル。
１２．総脂肪酸の質量パーセントとして、次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）約４８〜約５５質量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約１．５〜約３．０質量パーセントのエイコサテトラエン酸、
ｃ）約０．１〜０．７質量パーセントのアラキドン酸、
ｄ）約１．０〜約２．５質量パーセントのジホモ−γ−リノレン酸、
ｅ）約２．０〜約３．５質量パーセントのエイコサジエン酸、
ｆ）約２．０〜約３．０質量パーセントのα−リノレン酸、
ｇ）約１７．０〜約２０．０質量パーセントのリノール酸（１８：２）、
ｈ）約３．５〜約６．５質量パーセントのオレイン酸（１８：１）、
ｉ）約１．０〜約２．０質量パーセントのステアリン酸（１８：０）、
ｊ）約０．５〜約３．５質量パーセントのパルミトレイン酸（１６：１）、および
ｋ）約２．５〜約４．５質量パーセントのパルミチン酸（１６：０）
を含む微生物オイル。
１３．総脂肪酸の質量パーセントとして、次の脂肪酸濃度、すなわち
ａ）少なくとも約４３．３質量パーセントのエイコサペンタエン酸、
ｂ）約２３．６質量パーセント未満のリノール酸（１８：２）、および
ｃ）約９．４質量パーセント未満のオレイン酸（１８：１）
を含む微生物オイル。
１４．総脂肪酸の質量パーセントとして約４．２質量パーセント未満のエイコサジエン酸をさらに含む、上記１３に記載の微生物オイル。
１５．上記１３に記載のオイルに由来するオイル濃縮物。
１６．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約６０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１７．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約７０質量パーセントのエ
イコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１８．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約８０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
１９．オイルが、総脂肪酸の質量パーセントとして少なくとも約９０質量パーセントのエイコサペンタエン酸を含む、上記１５に記載のオイル濃縮物。
２０．上記１３に記載のオイル、ならびにリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加量の脂肪酸を含むブレンドオイル。
２１．上記１５に記載のオイル濃縮物、ならびにリノール酸、γ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される追加量の脂肪酸を含むブレンドオイル。
２２．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む食品。
２３．食品類似体、機能性食品、医療用食品および医療用栄養剤からなる群から選択される、上記２２に記載の食品。
２４．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む薬剤組成物。
２５．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む調製粉乳。
２６．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む栄養補助食品。
２７．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む医療用食品。
２８．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含む動物飼料。
２９．上記１３に記載のオイルを含む微生物バイオマス。
３０．上記２９に記載の微生物バイオマスを含む動物飼料。
３１．飼料が養殖飼料である、上記３０に記載の動物飼料。
３２．飼料が、次の改良、すなわち
ａ）３２〜４５％のタンパク質、
ｂ）４〜２８％の脂肪、
ｃ）１０〜３０％の炭水化物、
ｄ）１．０〜２．５％のミネラル、および
ｅ）１．０〜２．５％のビタミン
を含む、上記３１に記載の養殖飼料。
３３．場合により、
ａ）カロチノイド、
ｂ）結合剤、
ｃ）保存料、
ｄ）化学誘引剤、および
ｅ）香味料
からなる群から選択される改良を含む、上記３２に記載の養殖飼料。
３４．上記１３に記載のオイルまたはその誘導体を含有するパーソナルケア製品。
３５．製品がスキンコンディショナーである、上記３４に記載のパーソナルケア製品。
３６．エイコサペンタエン酸に富むヒト、動物または養殖生物用の栄養補助食品を提供するための方法であって、ヒトまたは動物によって摂取または使用可能な形態でエイコサペンタエン酸を含有する上記１３に記載の微生物オイルを備えるステップを含む、方法。
３７．ヒトまたは動物における臨床状態を処置するための方法であって、該臨床状態が処置されるヒトまたは動物に摂取可能な形態で上記１３に記載のオイルを与えるステップを含む、方法。
３８．臨床状態が、心臓代謝疾患、神経行動学的状態、および炎症性障害からなる群から選択される、上記３７に記載の方法。
３９．臨床状態が、代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾患、前糖尿病状態、冠動脈心疾患、高血圧、炎症性疾患、ＩＩ型糖尿病、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、神経性食欲不振、やけど、骨関節炎、骨粗鬆症、脂質異常症、レゾルビン関連疾患、アルツハイマー病、注意欠陥／多動性障害、うつ病、双極性障害、統合失調症、分娩後うつ病、および更年期障害からなる群から選択される、上記３８に記載の方法。
４０．ヒトまたは動物におけるＣ反応性タンパク質の血清レベルを変化させるための方法であって、Ｃ反応性タンパク質のレベルを変化させるヒトまたは動物に摂取可能な形態で上記１３に記載のオイルを与えるステップを含む、方法。
４１．臨床状態を治すための上記１３に記載のオイルの使用。
４２．臨床状態を治すための上記１５に記載の濃縮物の使用。
４３．臨床状態を治すための上記２０に記載のブレンドオイルの使用。
４４．臨床状態を治すための上記２１に記載のブレンドオイルの使用。
４５．動物またはヒトにおけるエイコサペンタエン酸の欠乏を処置するための方法であって、該欠乏を処置するため、ヒトまたは動物によって摂取または使用可能な形態で、エイコサペンタエン酸を含有する、上記３０に記載の方法によって生産される微生物オイルを与えるステップを含む、方法。
４６．ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８８０２で示されるヤロウィア属エスピー生産宿主。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]