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特許5715418インスリン誘導体

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5715418

(24)【登録日】2015年3月20日

(45)【発行日】2015年5月7日

(54)【発明の名称】インスリン誘導体

(51)【国際特許分類】

C07K 14/62 20060101AFI20150416BHJP

A61K 38/28 20060101ALI20150416BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20150416BHJP

【ＦＩ】

C07K14/62

A61K37/26

A61P3/10

【請求項の数】15

【全頁数】79

(21)【出願番号】特願2010-532606(P2010-532606)

(86)(22)【出願日】2008年11月7日

(65)【公表番号】特表2011-503033(P2011-503033A)

(43)【公表日】2011年1月27日

(86)【国際出願番号】EP2008065141

(87)【国際公開番号】WO2009060071

(87)【国際公開日】20090514

【審査請求日】2011年8月29日

(31)【優先権主張番号】07120251.9

(32)【優先日】2007年11月8日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】08161557.7

(32)【優先日】2008年7月31日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】596113096

【氏名又は名称】ノボ・ノルデイスク・エー／エス

(74)【代理人】

【識別番号】100109726

【弁理士】

【氏名又は名称】園田吉隆

(74)【代理人】

【識別番号】100101199

【弁理士】

【氏名又は名称】小林義教

(72)【発明者】

【氏名】ガリベイ，パトリック，ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ヘーグ−イェンセン，トマス

【審査官】木原啓一郎

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００６／０８２２０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００５／０１２３４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００６／０８２２０４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ１５／００

Ａ６１Ｋ３８／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式
Ｉｎｓ−Ｑ_１−Ｑ_２−Ｘ_１−Ｑ_３−ＣＯＯＨ
[上式中：
Ｉｎｓは親インスリン部分であり、Ｑ_１−Ｑ_２−Ｘ_１−Ｑ_３−ＣＯＯＨは置換基であり、ここで、Ｉｎｓは、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、置換基のＱ_１又はＱ_２中のＣＯ基との間のアミド結合を介して置換基に結合しており；
Ｑ_１は：
・アミノ酸残基で、そのカルボン酸基と共に、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、アミド基を形成する残基；又は
・アミド結合を介して結合した、上に特定した２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖であって、アミド結合を介して、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している鎖、又は
・結合；
であり；
Ｑ_２は：
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_２-ＮＨ-(ＣＨ_２)_２-、-ＣＯ-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＨ_２-、又は

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができ；
Ｑ_３は：
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ_２)_ｍ-であり；
Ｘ_１は
・Ｏ；
・-Ｃ=Ｏ；
・結合；
・ＮＣＯＲ^１で、Ｒ^１がＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３；又は

で、Ｒが水素、Ｃ_１−３-アルキル、Ｃ_２−３-アルケニル、又はＣ_２−３-アルキニルとすることができる］
を有するインスリン誘導体、又はそのＺｎ^２＋錯体。

【請求項2】

Ｑ_１が、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、ＤＡＰ、ＤＡＢ及びオルニチンからなる群から選択される、請求項１に記載のインスリン誘導体。

【請求項3】

Ｑ_１が結合である、請求項１に記載のインスリン誘導体。

【請求項4】

Ｘ_１が、
・Ｏ；
・-Ｃ=Ｏ；
・結合；
・ＮＣＯＲ^１で、Ｒ^１がＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とできるもの；又は

で、Ｒが水素、Ｃ_１−３-アルキル、Ｃ_２−３-アルケニル、又はＣ_２−３-アルキニルである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項5】

Ｘ_１が、

であり、ここでＲは水素である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項6】

Ｑ_３が-(ＣＨ_２)_ｍ-であり、ここでｍが８〜２０の範囲の整数である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項7】

ｍが１２、１３、１４、１５又は１６である、請求項６に記載のインスリン誘導体。

【請求項8】

置換基が、親インスリンのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項9】

置換基が、親インスリンのＢ鎖に存在するＢ２９位においてＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項10】

親インスリンがインスリンアナログである、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のインスリン誘導体。

【請求項11】

請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のインスリン誘導体を治療的有効量含有する、このような処置が必要な患者における糖尿病を処置するための製薬用組成物。

【請求項12】

組成物が製薬的に許容可能な賦形剤を含有する、請求項１１に記載の製薬用組成物。

【請求項13】

組成物が速効作用型インスリンアナログを含有する、請求項１１又は１２に記載の製薬用組成物。

【請求項14】

糖尿病を治療するための医薬の製造における、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のインスリン誘導体の使用。

【請求項15】

糖尿病の肺処置用又は経口処置用の医薬の製造のための、請求項１４に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生理学的ｐＨ値で可溶性であり、長時間にわたる作用プロファイルを有する、新規ヒトインスリン誘導体に関する。また本発明は、本発明のインスリン誘導体を含有する製薬用組成物、本発明のインスリン誘導体を使用する糖尿病及び高血糖症を処置する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、１型糖尿病及び２型糖尿病の双方の糖尿病の処置は、いわゆる強化インスリン処置に、かなりの程度で頼っている。この治療法によれば、患者は、基礎インスリン必要量を補うための持続型インスリンの１日１又は２回の注射を含む複数回の毎日のインスリン注射に、食事に関連したインスリン必要量を補うための速効型インスリンのボーラス注射が補填された治療を受ける。
持続型インスリン組成物は当該分野でよく知られている。しかして、持続型インスリン組成物の主要な一タイプは、インスリン結晶又は非晶質インスリンの注入可能な水性懸濁液を含む。これらの組成物において、典型的に利用されるインスリン化合物は、プロタミンインスリン、亜鉛インスリン又はプロタミン亜鉛インスリンである。

【0003】

インスリン懸濁液の使用に関しては、ある種の欠点がある。よって、正確な投与を確実にするためには、定められた量の懸濁液がバイアルから抜き出されるか、又はカートリッジから放出される前に、穏やかに振揺して、インスリン粒子を均質に懸濁させなければならない。また、インスリン懸濁液の保存においては、凝集体形成又は凝固を避けるために、温度を、インスリン溶液の場合よりもより狭い範囲内で保持しなければならない。

【0004】

国際特許出願ＷＯ２００６／０８２２０４号(Novo Nordisk A/S)には、側鎖に芳香族基を有するインスリン誘導体が開示されている。
特許出願ＷＯ２００６／０８２２０５号(Novo Nordisk A/S)には、側鎖にＰＥＧを有するインスリン誘導体が開示されている。
置換基に荷電末端基を有するインスリン誘導体は国際特許出願ＥＰ２００７／０５４４４４号(Novo Nordisk A/S)に開示されている。
しかしながら、現在までに知られているインスリン誘導体より長時間にわたる作用プロファイルを有するインスリンが、なおも必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

一態様において、本発明は、次の式：

[上式中：
Ｉｎｓは親インスリン部分であり、Ｑ_１-Ｑ_２-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_１-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_３-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_２-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_４-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_３-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_５-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｚは置換基であり、ここで、Ｉｎｓは、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、置換基のＱ_１又はＱ_２中のＣＯ基との間のアミド結合を介して置換基に結合しており；
各ｎは独立して、０、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｑ_１、Ｑ_２、Ｑ_３、Ｑ_４及びＱ_５は互いに独立して：
・アミノ酸残基で、そのカルボン酸基と共に、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、アミド基を形成する残基；又は
・アミド結合を介して結合した、上に特定したような２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖であって、アミド結合を介して、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している鎖、又は
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_ｐ-ＮＲ^１-(ＣＨ_２)_ｐ-で、各ｐは独立して、１、２、３、４、５又は６であり；Ｒ^１はＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_ｐ-Ａｒ-(ＣＨ_２)_ｐ-で、ここでＡｒは-ＮＲ^１Ｒ^２、-(ＣＨ_２)_ｐ-ＮＲ^１Ｒ^２-からなる群の少なくとも一で置換されたアリーレン又はヘテロアリーレンとすることができ、またＡｒは-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよく、各ｐは独立して、１、２、３、４、５又は６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ_２)_ｍ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基と、鎖中の炭素原子の全数が４〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ_２-基を有する二価の炭化水素鎖；
・-ＣＯ-((ＣＲ^５Ｒ^６)_１−６-ＮＨ-ＣＯ)-；
・-(ＣＯ-(ＣＲ^５Ｒ^６)_１−６-ＣＯ-ＮＨ)_１−４-で、Ｒ^５は独立して、Ｈ、-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１-_６ＣＨ_３又は-ＣＯＮＨ_２とすることができ、Ｒ^６は独立して、Ｈ、-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６ＣＨ_３とすることができるもの；
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_０−３-Ａｒ-(ＣＨ_２)_０−３-で、ここでＡｒは-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３、-ＮＲ^１Ｒ^２、-ＣＯＮＲ^１Ｒ^２又は-ＳＯ_２ＮＲ^１Ｒ^２からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンとすることができ、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；
・ｙが１-２０である、(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-又は(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；-(ＣＨ_２ＯＣＨ_２)_ｙ-；
・-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３、-ＣＯＮＲ^１Ｒ^２又は-ＳＯ_２ＮＲ^１Ｒ^２からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンで、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；又は
・次の式-(ＣＨ_２)_ｓ-Ｙ_１-(Ａｒ)_ｖ１-Ｙ_２-(ＣＨ_２)_ｗ-Ｙ_３-(Ａｒ)_ｖ２-Ｙ_４-(ＣＨ_２)_ｔ-Ｙ_５-(Ａｒ)_ｖ３-Ｙ_６-(ＣＨ_２)_ｚ-で、Ａｒは上述したものであり、Ｙ_１-Ｙ_６は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓ=Ｏ、ＳＯ_２又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立して、ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜３０の範囲になるような、ゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ_１、ｖ_２及びｖ_３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができ、但しＹ_１-Ｙ_６は互いに結合せず、構造-Ｏ-(ＣＨ_２)_１-Ｏ-は生じないもの；又は
・結合；
とすることができ、但しＱ_１-Ｑ_５の少なくとも一は結合ではなく；
Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は互いに独立して、
・Ｏ；
・-Ｃ=Ｏ；
・結合；
・ＮＣＯＲ^１で、Ｒ^１がＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とできるもの；又は

で、Ｒが水素、Ｃ_１−３-アルキル、Ｃ_２−３-アルケニル、又はＣ_２−３-アルキニルであるもの；
であり、但し、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３はＺに結合できず、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３がＯである場合、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｑ_１、Ｑ_２、Ｑ_３、Ｑ_４及びＱ_５のＯに直接結合せず；
Ｚは：
-ＣＯＯＨ；
-ＣＯ-Ａｓｐ；
-ＣＯ-Ｇｌｕ；
-ＣＯ-Ｇｌｙ；
-ＣＯ-Ｓａｒ；
-ＣＨ(ＣＯＯＨ)_２；
-Ｎ(ＣＨ_２ＣＯＯＨ)_２；
-ＳＯ_３Ｈ；
-ＯＳＯ_３Ｈ；
-ＯＰＯ３Ｈ_２；
-ＰＯ_３Ｈ_２；
-テトラゾール-５-イル；
-Ｏ-Ｗ_１又は
-Ｗ_１；
であり；
ここではＷ_１は、テトラゾ-５-リル、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ_３Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-ＳＯ_３Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-Ｏ-ＰＯ_３Ｈ_２、-ＣＯＮＲ^３Ｒ^４又は-ＳＯ_２ＮＲ^３Ｒ^４からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンであり、Ｒ^３及びＲ^４は互いに独立して、Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-ＳＯ_３Ｈ、又は-(ＣＨ_２)_１−６-Ｏ-ＰＯ_３Ｈ_２とすることができる]
を有するインスリン誘導体、及び任意のそのＺｎ^２＋錯体で、但し少なくとも一のアミン又は正に荷電しているアミノ酸が置換基に存在しているものに関する。

【0006】

さらに本発明は、インスリン誘導体の亜鉛錯体、インスリン誘導体又は亜鉛錯体を含有する製薬用組成物、インスリン誘導体又は亜鉛錯体を使用することによる糖尿病患者を処置する方法に関する。

【0007】

(定義)
ここで使用される「インスリンアナログ」とは、天然に生じるインスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は交換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的には誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加された及び／又は交換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じる残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかとすることができる。
インスリンアナログは、Ｂ鎖の２８位が、天然Ｐｒｏ残基から、Ａｓｐ、Ｌｙｓ又はＩｌｅの一つに修飾され得るものであってよい。他の態様において、Ｂ２９位のＬｙｓはＰｒｏに修飾されている。また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、好ましくはＧｌｙに修飾されてもよい。さらに、Ｂ３位のＡｓｎはＬｙｓ又はＡｓｐに修飾されてよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン；ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンアナログ；ＰｈｅＢ１が欠失しているインスリンアナログ；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ-末端伸長を有しているインスリンアナログ、及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ-末端伸長を有しているインスリンアナログである。例えば、１又は２のＡｒｇが、Ｂ１位に付加されていてもよい。

【0008】

本発明の態様においては、最大１７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大１０のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大８のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大７のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大６のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大５のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大４のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大３のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、最大２のアミノ酸が修飾される。本発明の態様においては、１のアミノ酸が修飾される。

【0009】

「ｄｅｓＢ３０インスリン」、「ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリン又はその類似体を意味する。同様に、「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０インスリン」又は「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」とは、Ｂ２９及びＢ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリン又はその類似体を意味する。
「Ｂ１」、「Ａ１」等とは、それぞれインスリンのＢ鎖の１位(Ｎ-末端から数える)のアミノ酸残基及びインスリンのＡ鎖の１位(Ｎ-末端から数える)のアミノ酸残基を意味する。特定の位置にあるアミノ酸残基は、例えばＢ１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味する、ＰｈｅＢ１として示されてよい。

【0010】

ここで使用される場合「インスリン」とは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間と、ＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間にジスルフィド架橋を、またＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインスリン、ブタインスリン、又はウシインスリンを意味する。
「親インスリン」とは、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン又はブタインスリンを意味する。また親インスリンはインスリンアナログであってもよい。

【0011】

「正に荷電」なる表現は、４と９の間のｐＨで正に荷電していると思われる少なくとも一の基、又は複数の基が存在することを意味する。

【0012】

本発明のインスリン誘導体が「生理学的ｐＨ値で溶解する」と記載されている場合は、インスリン誘導体が生理学的ｐＨ値で十分に溶解するインスリン組成物を調製するのに使用可能であることを意味する。このような好ましい溶解度は、インスリン誘導体単独の固有の特性、又はインスリン誘導体と、ビヒクルに含まれる一又は複数の成分との好ましい相互作用の結果のいずれかによるものである。

【0013】

ここで使用される場合「非鈍化（非ブランティング）」とは、速効型インスリンとアシル化インスリンの双方が同一又は実質的に同一の作用プロファイルを有し、一製剤に処方される場合、別々の製剤において速効型インスリンとアシル化インスリンが投与される場合を意味する。

【0014】

「高分子量インスリン」又は「ｈｍｗ」なる表現は、ヒトインスリン複合体、インスリンアナログ、又はインスリン誘導体の分子量が、ヒト血清アルブミン以上、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の１２量複合体以上、又は約７２ｋダルトン以上であることを意味する。
「中分子量インスリン」又は「ｍｍｗ」なる表現は、ヒトインスリン複合体、インスリンアナログ、又はインスリン誘導体の分子量が、ほぼインスリン６量体から２４〜８０ｋダルトンのインスリン１２量体までであることを意味する。
「低分子量インスリン」又は「ｌｍｗ」なる表現は、ヒトインスリン、インスリンアナログ又はインスリン誘導体の分子量が、２４ｋダルトン以下であることを意味する。

【0015】

「置換基」なる表現は、インスリンペプチドにコンジュゲートする、またインスリンアミノ酸配列の一部ではない化学部分を意味する。

【0016】

以下の略語が、明細書及び実施例で使用される：
ＣＶカラム容量
ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＡヒト血清アルブミン
ＬＣ液体クロマトグラフィー
ＭＡＬＤＩマトリックス支援レーザー脱離イオン化
ＭＳ質量分析
ＲＴ室温
ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＡシンチレーション近接アッセイ
Ｔｒｉｓトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
Ｏ.Ｄ. 光学密度＝吸光度
Ｘ２モノマーＡｓｐＢ９ＧｌｕＢ２７ヒトインスリン
ＤＩＥＡ：Ｎ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
Ｓａｒ：サルコシン(Ｎ-メチル-グリシン)
ｔＢｕ： tert-ブチル
ＴＳＴＵ：Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボレート
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＥｔＯＡｃ又はＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＧＩＲ：グルコース注入速度
ＤＡＰ２,３-ジアミノプロピオン酸
ＤＡＢ２,４-ジアミノ酪酸
Ｏｍオルニチン又は２,５-ジアミノ-ペンタン酸

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、インスリン誘導体分子中に、アミン又は正に荷電した置換基、及び帯電した末端基を有するといった認識に基づいており、ここで持続型インスリンの作用のインビボ持続時間、及びブラント化することなく、速効型インスリンと持続型インスリンとの混合可能性について、重要な役割を担っている。インスリン誘導体は高分子量の複合体を形成する傾向を有し、よって遅延性の作用プロファイルを示す。
有利には、本発明のインスリン誘導体は生理学的ｐＨ値で可溶性であり、ヒトインスリンのものに匹敵する有効性を有し、ブラント化することなく、速効型インスリンと混合可能である。

【0018】

本発明を次のパラグラフに要約する：
１．次の式：

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

【0019】

２．次の式：

[上式中：
Ｉｎｓは親インスリン部分であり、Ｑ_１-Ｑ_２-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_１-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_３-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_２-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_４-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｘ_３-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｑ_５-[ＣＨ_２]_ｎ-Ｚは置換基であり、ここで、Ｉｎｓは、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、置換基のＱ_１又はＱ_２中のＣＯ基との間のアミド結合を介して置換基に結合しており；
各ｎは独立して、０、１、２、３、４、５又は６であり；
Ｑ_１は：
・アミノ酸残基で、そのカルボン酸基と共に、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基と、アミド基を形成する残基；又は
・アミド結合を介して結合した、上に特定したような２、３又は４のα-アミノ酸残基からなる鎖であって、アミド結合を介して、ＩｎｓのＢ鎖のＮ-末端アミノ酸残基のα-アミノ基、又はＩｎｓのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している鎖、又は
・結合；
であり；
Ｑ_２は：
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_ｐ-ＮＲ^１-(ＣＨ_２)_ｐ-で、各ｐは独立して、１、２、３、４、５又は６であり；Ｒ^１はＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；

で、ｎ＝１-６であり、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；
・結合；
であり；
Ｑ_３、Ｑ_４及びＱ_５は互いに独立して：
・ｍが６〜３２の範囲の整数である-(ＣＨ_２)_ｍ-；
・１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基と、鎖中の炭素原子の全数が４〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ_２-基を有する二価の炭化水素鎖；
・-ＣＯ-((ＣＲ^５Ｒ^６)_１−６-ＮＨ-ＣＯ)-；
・-(ＣＯ-(ＣＲ^５Ｒ^６)_１−６-ＣＯ-ＮＨ)_１−４-で、Ｒ^５は独立して、Ｈ、-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１-_６ＣＨ_３又は-ＣＯＮＨ_２とすることができ、Ｒ^６は独立して、Ｈ、-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６ＣＨ_３とすることができるもの；
・-ＣＯ-(ＣＨ_２)_０−３-Ａｒ-(ＣＨ_２)_０−３-で、ここでＡｒは-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３、-ＮＲ^１Ｒ^２、-ＣＯＮＲ^１Ｒ^２又は-ＳＯ_２ＮＲ^１Ｒ^２からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンとすることができ、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；
・ｙが１-２０である、(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-又は(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；-(ＣＨ_２ＯＣＨ_２)_ｙ-；
・-ＣＨ_３、-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３、-ＣＯＮＲ^１Ｒ^２又は-ＳＯ_２ＮＲ^１Ｒ^２からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンで、Ｒ^１及びＲ^２は互いに独立して、Ｈ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とすることができるもの；又は
・次の式-(ＣＨ_２)_ｓ-Ｙ_１-(Ａｒ)_ｖ１-Ｙ_２-(ＣＨ_２)_ｗ-Ｙ_３-(Ａｒ)_ｖ２-Ｙ_４-(ＣＨ_２)_ｔ-Ｙ_５-(Ａｒ)_ｖ３-Ｙ_６-(ＣＨ_２)_ｚ-で、Ａｒは上述したものであり、Ｙ_１-Ｙ_６は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓ=Ｏ、ＳＯ_２又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立して、ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜３０の範囲になるような、ゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ_１、ｖ_２及びｖ_３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができ、但しＹ_１-Ｙ_６は互いに結合せず、構造-Ｏ-(ＣＨ_２)_１-Ｏ-は生じないもの；又は
・結合；
とすることができ、但しＱ_３-Ｑ_５の少なくとも一は結合ではなく；
Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は互いに独立して、
・Ｏ；
・-Ｃ=Ｏ；
・結合；
・ＮＣＯＲ^１で、Ｒ^１がＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とできるもの；又は

で、Ｒが水素、Ｃ_１−３-アルキル、Ｃ_２−３-アルケニル、又はＣ_２−３-アルキニルであるもの；
であり、但し、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３はＺに結合できず、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３がＯである場合、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｑ_３、Ｑ_４及びＱ_５のＯに直接結合せず；
Ｚは：
-ＣＯＯＨ；
-ＣＯ-Ａｓｐ；
-ＣＯ-Ｇｌｕ；
-ＣＯ-Ｇｌｙ；
-ＣＯ-Ｓａｒ；
-ＣＨ(ＣＯＯＨ)_２；
-Ｎ(ＣＨ_２ＣＯＯＨ)_２；
-ＳＯ_３Ｈ；
-ＯＳＯ_３Ｈ；
-ＯＰＯ３Ｈ_２；
-ＰＯ_３Ｈ_２；
-テトラゾール-５-イル；
-Ｏ-Ｗ_１又は
-Ｗ_１；
であり；
ここではＷ_１は、テトラゾ-５-リル、-ＣＯＯＨ、-ＳＯ_３Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-ＳＯ_３Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-Ｏ-ＰＯ_３Ｈ_２、-ＣＯＮＲ^３Ｒ^４又は-ＳＯ_２ＮＲ^３Ｒ^４からなる群から選択される１又は２の基で置換されていてもよいアリーレン又はヘテロアリーレンであり、Ｒ^３及びＲ^４は互いに独立して、Ｈ、-(ＣＨ_２)_１−６-ＳＯ_３Ｈ、又は-(ＣＨ_２)_１−６-Ｏ-ＰＯ_３Ｈ_２とすることができる]
を有する、パラグラフ１のインスリン誘導体、及び任意のそのＺｎ^２＋錯体で、但し少なくとも一のアミン又は正に荷電しているアミノ酸が置換基に存在しているインスリン誘導体。

【0020】

３．Ｑ_１が、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、ＤＡＰ、ＤＡＢ及びオルニチンからなる群から選択される、パラグラフ１-２のインスリン誘導体。
４．Ｑ_１が結合である、パラグラフ１-２のインスリン誘導体。

【0021】

５．Ｑ_２が、-ＣＯ-(ＣＨ_２)_２-ＮＨ-(ＣＨ_２)_２-、-ＣＯ-ＣＨ_２-ＮＨ-ＣＨ_２-、又は

である、パラグラフ１-４のインスリン誘導体。
６．Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３が互いに独立して、
・Ｏ；
・-Ｃ=Ｏ；
・結合；
・ＮＣＯＲ^１で、Ｒ^１がＨ、-ＣＨ_３又は-(ＣＨ_２)_１−６-ＣＨ_３とできるもの；又は

で、Ｒが水素、Ｃ_１−３-アルキル、Ｃ_２−３-アルケニル、又はＣ_２−３-アルキニルであるもの；
であり、但し、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３はＺに結合できず、
− Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３がＯである場合、Ｘ_１、Ｘ_２及びＸ_３は、Ｑ_３、Ｑ_４及びＱ_５のＯに直接結合しない、パラグラフ１-５のインスリン誘導体。
７．Ｘ_１が、

であり、ここでＲは水素である、パラグラフ１-６のインスリン誘導体。

【0022】

８．Ｑ_３が-(ＣＨ_２)_ｍ-であり、ここでｍが６〜３２、又は８〜２０の範囲の整数である、パラグラフ１-７のインスリン誘導体。
９．ｍが１２、１３、１４、１５又は１６である、パラグラフ８のインスリン誘導体。
１０．Ｑ_４、Ｑ_５、Ｘ_２及びＸ_３が結合であり、全てのｎがゼロである、パラグラフ１-９のインスリン誘導体。
１１．Ｚが-ＣＯＯＨである、パラグラフ１-１０のインスリン誘導体。
１２．Ｑ_３が結合である、パラグラフ１-７のインスリン誘導体。
１３．Ｑ_４が、１、２又は３の-ＣＨ=ＣＨ-基と、鎖中の炭素原子の全数が４〜３２の範囲となるのに十分な数の-ＣＨ_２-基を有する二価の炭化水素鎖である、パラグラフ１-７又は１２のインスリン誘導体。

【0023】

１４．Ｑ_４が-(ＣＨ_２)_ｓ-Ｙ_１-(Ａｒ)_ｖ１-Ｙ_２-(ＣＨ_２)_ｗ-Ｙ_３-(Ａｒ)_ｖ２-Ｙ_４-(ＣＨ_２)_ｔ-Ｙ_５-(Ａｒ)_ｖ３-Ｙ_６-(ＣＨ_２)_ｚ-で、Ａｒは上述したものであり、Ｙ_１-Ｙ_６は互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓ=Ｏ、ＳＯ_２又は結合とすることができ；ｓ、ｗ、ｔ及びｚは互いに独立して、ｓ、ｗ、ｔ及びｚの合計が４〜３０の範囲になるような、ゼロ又は１〜１０の整数であり、ｖ_１、ｖ_２及びｖ_３は互いに独立して、ゼロ又は１とすることができ、但しＹ_１-Ｙ_６は互いに結合せず、構造-Ｏ-(ＣＨ_２)_１-Ｏ-は生じない、パラグラフ1-７又は１２のインスリン誘導体。
１５．ｖ_１、ｖ_２、又はｖ_３の少なくとも２がゼロである、パラグラフ１-７及び１４のいずれかのインスリン誘導体。
１６．Ｙ_１-Ｙ_６が結合である、パラグラフ１-７及び１４-１５のいずれかのインスリン誘導体。
１７．Ｙ_１-Ｙ_６の少なくとも一がＯ又はＳである、パラグラフ１-７及び１４-１５のいずれかのインスリン誘導体。
１８．Ｙ_１がＯ又はＳであり、ｖ_１が１である、パラグラフ１-７及び１４-１５及び１７のいずれかのインスリン誘導体。
１９．ｓが６、７、８、９又は１０である、パラグラフ１-７及び１４-１８のいずれかのインスリン誘導体。
２０．ＡｒがＣ_６Ｈ_４である、パラグラフ１-７及び１４-１９のいずれかのインスリン誘導体。

【0024】

２１．Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３及びＱ_５が結合であり、全てのｎがゼロである、パラグラフ１-７及び１３-２０のインスリン誘導体。
２２．Ｑ_３、Ｑ_４又はＱ_５の一つが、(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；(ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-又は(ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-；-(ＣＨ_２ＯＣＨ_２)_ｙ-であり、ここでｙが１-２０である、パラグラフ１-７のいずれかのインスリン誘導体。
２３．Ｑ_３、Ｑ_４又はＱ_５の一つが、(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙ-又は(ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｙであり、ここでｙが１-１２、２-４又は２-３の範囲にある、パラグラフ１-７及び２２のインスリン誘導体。
２４．ｙが１である、パラグラフ１-７及び２２-２３のインスリン誘導体。
２５．ｎが０、１、２又は３である、パラグラフ１-７及び２２-２４のインスリン誘導体。
２６．Ｚが-ＣＣＯＨである、パラグラフ１-７及び１２-２５のインスリン誘導体。

【0025】

２７．置換基が、親インスリンのＡ又はＢ鎖に存在するＬｙｓ残基のε-アミノ基に結合している、上述したパラグラフのいずれかのインスリン誘導体。
２８．置換基が、親インスリンのＢ鎖に存在するＢ２９位において、Ｌｙｓ残基のε-アミノ基に結合している、上述したパラグラフのいずれかのインスリン誘導体。
２９．親インスリンがヒトインスリン又はブタインスリンである、上述したパラグラフのいずれかのインスリン誘導体。
３０．親インスリンがインスリンアナログである、パラグラフ１-２８のインスリン誘導体。
３１．親インスリンのＢ３０位にあるアミノ酸残基がＬｙｓであるか、又は欠失している、上述したパラグラフのいずれかのインスリン誘導体。
３２．置換基が、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンのＢ２９位において、Ｌｙｓ残基のε-アミノ基に結合している、パラグラフ１-２８及び３０-３１のインスリン誘導体。

【0026】

３３．親インスリンが、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ヒトインスリン又はＧｌｙＡ２１ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ＡｒｇＢ３１ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、ＴｈｒＢ２９ＬｙｓＢ３０ヒトインスリン又はＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンである、パラグラフ1-２８及び３０-３２のインスリン誘導体。

【0027】

３４．２つの亜鉛イオン、３つの亜鉛イオン、４つの亜鉛イオン、５つの亜鉛イオン、６つの亜鉛イオン、７つの亜鉛イオン、８つの亜鉛イオン、９つの亜鉛イオン、又は１０の亜鉛イオンが、インスリン誘導体の６つの分子当たりに結合している、上述したパラグラフのいずれか一つのインスリン誘導体の亜鉛錯体。

【0028】

３５．パラグラフ１-３３のインスリン誘導体、又はパラグラフ３４の亜鉛錯体を治療的有効量含有する、このような処置が必要な患者における糖尿病を処置するための製薬用組成物。
３６．組成物が一又は複数の製薬的に許容可能な賦形剤を含有する、パラグラフ３５の製薬用組成物。
３７．組成物が速効性のインスリンアナログを含有する、パラグラフ３５-３６の製薬用組成物。
３８．速効型インスリンアナログがＡｓｐＢ２８ヒトインスリン；ＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ３ＧｌｕＢ２９ヒトインスリンからなる群から選択される、パラグラフ３５-３７の製薬用組成物。

【0029】

３９．パラグラフ１-３３のインスリン誘導体、パラグラフ３４の亜鉛錯体、又はパラグラフ３５-３８の製薬用組成物を治療的有効量使用する、このような処置が必要な患者における糖尿病を処置するための方法。
４０．糖尿病の肺処置用である、パラグラフ３９の方法。
４１．実施例に記載されるインスリン誘導体。

【0030】

本発明のインスリン誘導体及び速効型インスリンアナログは、約９０／１０％；約７０／３０％又は約５０／５０％の比率で混合することができる。
一態様において、本発明は、生理学的ｐＨ値で溶解する、本発明のインスリン誘導体を含有する製薬用組成物に関する。
一態様において。本発明は、約６．５〜約８．５の間のｐＨ値で溶解する、本発明のインスリン誘導体を含有する製薬用組成物に関する。
一態様において、本発明は、本発明のインスリン誘導体を含有する、長時間にわたる作用プロファイルを有する製薬用組成物に関する。
一態様において、本発明は、約１２０ｎｍｏｌ／ｍｌ〜２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約４００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌ、約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ、又は約６００ｎｍｏｌ／ｍｌ〜約１２００ｎｍｏｌ／ｍｌの本発明のインスリン誘導体、又は速効型インスリンアナログと本発明のインスリン誘導体との混合物を含有する溶液である製薬用組成物に関する。

【0031】

アシル化のための出発生成物、親インスリン又はインスリンアナログ又はそれらの前駆体は、よく知られているペプチド合成、又は適切に形質転換された微生物においてよく知られている組換え生成のいずれかにより生成させることができる。よって、インスリン出発生成物は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有し、ペプチドの発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地でポリペプチドを発現可能な宿主細胞を培養し、その後、得られたペプチドを培地から回収することを含む方法により生成可能である。

【0032】

細胞を培養するのに使用される培地は、宿主細胞の成長に適切な任意の従来からの培地、例えば適切な栄養補助剤を含有する複合培地又は最少培地であってよい。適切な培地は市販供給者から入手可能であり、また公開されている処方箋(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製されてもよい。ついで、細胞により生成されるペプチドは、遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、塩、例えば硫酸アンモニウムにより上清又は濾液のタンパク質様成分を沈殿させ、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、当該問題のペプチドの種類に応じて様々なクロマトグラフィー手順により精製することを含む、従来からの手順により、培養培地から回収され得る。

【0033】

親インスリンをコードするＤＮＡ配列は、適切には、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリを調製し、標準的な技術に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによりポリペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来ものであってよい(例えば、Sambrook, J, Fritsch、EF及びManiatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、1989を参照)。また、親インスリンをコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されているホスホアミダイト(phosphoamidite)法、又はMatthesら, EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載されている方法により、合成的に調製されてよい。またＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４６８３２０２号、又はSaikiら, Science 239 (1988),487-491に記載されているように、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されてよい。

【0034】

ＤＮＡ配列は、便宜的に、組換えＤＮＡ手順にかけられている任意のベクターに挿入されてよく、ベクターの選択は、多くの場合、導入される宿主細胞に依存する。例えば、ベクターは自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクターであってよく、その複製は染色体複製とは無関係、例えばプラスミドである。また、ベクターは、宿主細胞に挿入された場合に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた内部の染色体と共に複製されるものであってよい。

【0035】

ベクターは、例えば、親インスリンをコードするＤＮＡ配列が、プロモータ等、ＤＮＡの転写に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合している発現ベクターである。プロモータは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主細胞に対して同族又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導されてもよい。種々の宿主細胞において親インスリンをコードするＤＮＡの転写を指向するのに適切なプロモータの例は、例えばSambrookら, 上掲等、当該分野でよく知られている。
また、親インスリンをコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に結合していてよい。本発明の組換えベクターは、当該問題の宿主細胞において、ベクターが確実に複製するＤＮＡ配列をさらに有している。
さらに、ベクターは選択可能なマーカー、例えば遺伝子、宿主細胞における欠失を補完し、薬剤、例えばアンピシリン、カイナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートに対する耐性を付与する生成物をさらに有していてもよい。

【0036】

宿主細胞の分泌経路に本発明のペプチドを向かわせるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても公知)が、組換えベクター中に提供されてもよい。分泌シグナル配列は、正確なリーディングフレームにおいて、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５'に位置している。分泌シグナル配列は通常ペプチドに関連していてもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子からのものであってもよい。

【0037】

親インスリンをコードするＤＮＡ配列、プロモータ及び場合によってはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, 上掲)。

【0038】

ＤＮＡ配列又は組換えベクターが導入されている宿主細胞は、本ペプチドを生成可能な任意の細胞であってよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞を含む。よく知られており、当該分野で使用されている適切な宿主細胞の例は、限定されるものではないが、大腸菌、出芽酵母、又は哺乳類ＢＨＫ又はＣＨＯ細胞系である。

【0039】

ついで、親インスリン分子は、Ｂ鎖の選択されたＬｙｓ位又はＢ１位のいずれかに、関連置換基を導入することにより、本発明のインスリン誘導体に転換される。置換基は任意の簡便な方法により導入可能で、アミノ基をアシル化するための多くの方法が従来技術に開示されている。さらなる詳細は、以下の実施例により明らかになるであろう。

【0040】

製薬用組成物
請求項にある式のこのインスリン誘導体は、例えば、皮下、経口又は肺に投与することができる。
皮下投与用には、式の化合物は、公知のインスリンの製剤と同じように処方される。さらに、皮下投与用には、式の化合物は、公知のインスリンの投与と同じように投与され、一般的に医師はこの手順に通じている。

【0041】

この発明のインスリン誘導体は、循環インスリン濃度を増加させ、及び／又は循環グルコース濃度を低下させるための用量効果的な方式で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖症等の疾患の処置に効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明のインスリン誘導体を約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇの吸入用量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血中血糖値、患者の健康状態、患者の肺の状態等を含む要因を考慮に入れて、博学な実施者により決定することができる。
吸入による投与は、インスリンの皮下投与に匹敵する程の薬物動態に帰する可能性がある。同様の粒径及び同様の肺沈着レベルで比較する場合、典型的には、様々な吸入装置で同様の薬学動態が提供される。

【0042】

本発明において、この発明のインスリン誘導体は、吸入による治療剤の投与について、当該分野で公知の任意の種々の吸入装置により送達されてよい。これらの装置には、定量吸入器、噴霧器、乾燥パウダー発生器、スプレー等が含まれる。この発明のインスリン誘導体は、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明のインスリン誘導体を投与するための吸入装置には、いくつかの好ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。吸入装置は、良好な呼吸のためには、例えば約１０μｍ未満、例えば約１-５μｍの小さな粒子を送達させるべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、Turbohaler^TM(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、Spiros^TM吸入器(Dura)、Inhale Therapeuticsから市販されている装置、AERx^TM(Aradigm)、Ultravent(登録商標)噴霧器(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)噴霧器(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量吸入器(Glaxo)、及びSpinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。

【0043】

当業者であれば、この発明のインスリン誘導体の製剤、送達される製剤の量、及び単一用量の投与による持続時間が、使用される吸入装置の種類に依存することを認識しているであろう。いくつかのエアゾール送達システム、例えば噴霧器において、投与頻度及びシステムが活性化する時間の長さは、主として、エアゾールにおけるインスリンコンジュゲートの濃度に依存するであろう。例えば、より短い期間での投与では、噴霧溶液中、インスリンコンジュゲートをより高い濃度で使用することができる。定量吸入器等の装置は、より高いエアゾール濃度を作り出すことができ、所望される量のインスリンコンジュゲートを送達させるために、より短い期間で操作することができる。パウダー吸入器等の装置は、付与された充填量の薬剤が装置から出されるまで、活性剤を送達する。この種の吸入器において、付与された量のパウダーでのこの発明のインスリン誘導体の量により、単一投与で投与される用量が決定される。

【0044】

吸入装置により送達される製剤におけるこの発明のインスリン誘導体の粒子径は、肺、及び下気道又は肺胞において、それを作製するインスリンの能力に関して重要である。この発明のインスリン誘導体は、送達されるインスリンコンジュゲートの少なくとも約１０％、例えば約１０〜約２０％、又はそれ以上が肺に沈着するように処方することができる。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られることが知られている。粒子径が約５μｍを越えると、肺沈着はかなり低減する。約１μｍ以下の粒子径では肺沈着は低減し、治療的に有効な十分な質量を有する粒子を送達することが困難になる。よって、吸入により送達されるインスリン誘導体の粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子経を有する。インスリン誘導体の製剤は、選択される吸入装置に所望される粒子径を生じるように選択される。

【0045】

有利には、乾燥パウダーとして投与されるために、この発明のインスリン誘導体は、約１０μｍ未満、例えば約１〜約５μｍの粒子径を有する粒状形態に調製される。この粒子径により、患者の肺の肺胞への送達が効果的になされる。乾燥パウダーは、多くの粒子が所望の範囲のサイズを有するように製造された粒子から主としてなる。有利には、少なくとも約５０％の乾燥パウダーが、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。このような製剤は、インスリンコンジュゲート及び他の所望する成分を含有する溶液の噴霧乾燥、製粉又は臨界点濃縮により達成可能である。また本発明に有用な粒子を製造するのに適した他の方法も、当該分野で公知である。

【0046】

粒子は、通常、容器中において、乾燥パウダー製剤から分離され、運搬気流を介して、患者の肺に移送される。典型的には、現在の乾燥パウダー吸入器において、固体を破壊する力は、単に、患者の吸入により提供される。他の種類の吸入器においては、患者の吸入により生じる気流で、粒子を崩壊させるインペラモータを起動する。

【0047】

乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明のインスリン誘導体の製剤は、誘導体を含有する微細に分割された乾燥パウダーを典型的には含んでいるが、パウダーは、増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をさらに含有可能である。添加剤は、例えば特定のパウダー吸入器からの送達に要求されているように、パウダーを希釈し、製剤のプロセシングを容易にし、製剤に有利なパウダー特性を提供し、吸入装置からのパウダーの分散を容易にし、製剤を安定化させ(例えば酸化防止剤又はバッファー)、製剤に風味を付与するために、インスリンコンジュゲートの乾燥パウダー製剤に含有せしめることができる。有利には、添加剤は、患者の気道に悪影響を与えないものである。インスリン誘導体は分子レベルで添加剤と混合することもできるし、又は固体製剤は、添加剤の粒子と混合させるか、又は該粒子上をコートするインスリンコンジュゲートの粒子を含有可能である。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類及び多糖類；糖アルコール及び他のポリオール、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は製剤の重量に対して約５０％〜約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等の、タンパク質の製剤について、当該分野で公知の添加剤も、本製剤に含めることができる。

【0048】

この発明のインスリン誘導体を収容するスプレーは、インスリンコンジュゲートの懸濁液又は溶液を、加圧下にて、強いてノズルを通過させることにより製造することができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給量は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続した電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、例えば約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子径を有する。

【0049】

スプレーを用いて使用するのに適したこの発明のインスリン誘導体の製剤は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのインスリンコンジュゲート濃度で、水溶液中にインスリン誘導体を含有している。製剤は、賦形剤、バッファー、等張剤、保存料、界面活性剤、及び例えば亜鉛等の薬剤を含有することができる。また製剤は、賦形剤、又はインスリン誘導体を安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。インスリンコンジュゲートの製剤に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。インスリンコンジュゲートの製剤に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。またインスリン誘導体製剤は、エアゾールの形成において、溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を、さらに含有することができる。種々の従来からの界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することもできる。量は、一般的には、製剤の重量に対して約０．００１〜約４％の範囲である。

【0050】

本発明のインスリン誘導体を含有する製薬用組成物は、このような処置が必要な患者に非経口的に投与されてよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射することにより実施されてよい。または、非経口投与は、輸液ポンプにより実施することもできる。さらなる選択肢は、目的に対して特異的に考案された組成物、パウダー又は液体等において、インスリンを鼻又は肺に投与することである。

【0051】

本発明のインスリン誘導体の注射用組成物は、所望する最終生成物が付与されるのに適切なように、成分を溶解及び混合することを含む、製薬工業の従来からの技術を使用して調製することができる。よって、一手順において、本発明のインスリン誘導体は、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、等張剤、保存料及びバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨが調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が付与されるように、水を用いて調節される。

【0052】

本発明の他の態様において、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれ一つは、本発明の別の態様を構成する。

【0053】

本発明のさらなる態様において、製剤は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る、製薬的に許容可能な保存料をさらに含有する。本発明のさらなる態様において、保存料は０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、保存料は０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、保存料は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、保存料は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料各自は、本発明の別の態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が参照される。

【0054】

本発明のさらなる態様において、製剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、本発明のさらなる態様において、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様において、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤各自は、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版、1995が参照される。

【0055】

典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な保存料は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。

【0056】

本発明のインスリン誘導体の鼻投与用の組成物は、例えば、欧州特許第２７２０９７号(Novo Nordisk A/S)に記載されているようにして調製されてよい。

【0057】

この発明のインスリン誘導体を含有する組成物は、インスリンに対して敏感な状態の処置に使用することができる。よってそれらは、１型糖尿病、２型糖尿病及び例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる高血糖症の処置に使用することができる。任意の患者に対する最適な用量レベルは、用いられる特定のインスリン誘導体の効能、年齢、体重、身体活動性、及び患者の食事、他の薬剤との併用の可能性、治療される状態の重篤度を含む様々な要因に依存する。この発明のインスリン誘導体の毎日の投薬量が、既知のインスリン組成物に対するものと同様の方法で当業者によって各個々の患者に対して決定されることが推奨される。
都合がよいことに、この発明のインスリン誘導体は、他のタイプのインスリン、例えばさらに速効で作用を開始するインスリンアナログと混合して使用してもよい。このようなインスリンアナログの具体例は、例えば、公開番号ＥＰ２１４８２６(Novo Nordisk A/S)、ＥＰ３７５４３７(Novo Nordisk A/S)及びＥＰ３８３４７２(Eli Lilly & Co)を有する欧州特許出願に記載されている。

【0058】

本発明を以下の実施例によりさらに例証するが、本発明の範囲を制限すると解釈されるものではない。
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは簡便に使用され、決して本発明を限定するものと解するべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解するべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
この発明は、適用される法律に容認されるならば、ここに提供される請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。

【実施例】

【0059】

実施例１
Ｎ^εＢ２９-{３-[２-(１６-カルボキシヘキサデシルカルバモイル)エチルアミノ]プロピオニル}ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

工程１：３-(２-ベンジルオキシカルボニルエチルアミノ)プロピオン酸
３-アミノプロピオン酸(５ｇ、５６ｍｍｏｌ)をエタノール(５０ｍＬ)に添加し、ＴＥＡ(７．８ｍｌ、５６ｍｍｏｌ)及び水(５０ｍＬ)を添加し、混合物を窒素下で還流した。アクリル酸ベンジルエステル((９．１ｇ、５６ｍｍｏｌ)、及びさらなるエタノール(５０ｍＬ)を添加し、混合物を１６時間還流した。サンプルを真空下で濃縮し、トルエンを添加し、２回再蒸発させたところ、１７．５グラム(生成物プラスＴＥＡ)生じた。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ)δ７．１２-７．４０(ｍ，５Ｈ)、４．４９(ｓ，２Ｈ)、２．９８(ｔ，４Ｈ)、２．４２(ｔ，４Ｈ)(プラスＴＥＡシグナル２．７９及び１．０８)。

【0060】

工程２：３-[(２-ベンジルオキシカルボニルエチル)tert-ブトキシカルボニルアミノ]プロピオン酸
３-(２-ベンジルオキシカルボニルエチルアミノ)プロピオン酸(２ｇ、７．２ｍｍｏｌ)をＤＣＭ(２０ｍＬ)に溶解させ、ジ-tert-ブチルジカルボナート(３．５ｇ、１５．８ｍｍｏｌ)及びＴＥＡ(２．５９ｍＬ、１８．６ｍｍｏｌ)を添加した。８日後、ＤＣＭ(５０ｍＬ)を添加し、溶液を水(７５ｍＬ)及び１ＮのＨＣｌ(３０ｍｌ)で洗浄した。水性洗浄相をＤＣＭ(２５ｍＬ)で抽出した。有機相をプールし、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。化合物をフラッシュクロマトグラフィー(ＡｃＯＥｔ／ヘプタン)により精製したところ、０．４ｇ生じた。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ)δ１２．２４(ｂｒ．１Ｈ)、７．２５-７．４５(ｍ，５Ｈ)、５．０９(ｓ，２Ｈ)、３．４２(ｔ，２Ｈ)３．３４(ｔ-ｂｒ，４Ｈ，theo．２Ｈ)、２．５８(ｔ，２Ｈ)、２．４１(ｔ，２Ｈ)。

【0061】

工程３：１７-アミノヘプタデカン酸tert-ブチルエステル
アセトニトリル(１０ｍＬ)をオクタデカンジオン酸-モノ-tert-ブチルエステル(５００ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ)に添加し、ＴＥＡ(０．２２６ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ)を添加した。ジフェニルホスホンアジド(０．３７ｇ、１．３ｍｍｏｌ)をアセトニトリル(１ｍＬ)溶液に添加した。混合物を、還流にて２時間、室温で１６時間攪拌した。反応体を真空下で濃縮し、１：２のＡｃＯＥｔ：ヘプタン(２ｍＬ)に懸濁／溶解させ、シリカの乾燥床(２ｘ４ｃｍ直径)に適用した。１：２のＡｃＯＥｔ：ヘプタン(２ｍＬ)、及び１：１のＡｃＯＥｔ：ヘプタン(６０ｍＬ)で溶出させた。溶出液を所定の濃縮乾固した。残留物を部分的にＴＨＦ(２ｍＬ)に懸濁させ、１ＮのＮａＯＨ(２ｍＬ)を添加した。濁った溶液／懸濁液を室温で１時間攪拌した。水(１５ｍＬ)を添加し、これをＡｃＯＥｔ(２ｘ２５ｍＬ)で抽出し、分離を補助するために幾ばくかのブラインを添加した。有機相を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥させ、濾過し、濃縮乾固した。残留物に２０％のアセトニトリル／水(１５ｍＬ)、ＴＦＡ(１５-２０μｌ)及びＤＭＳＯ(１ｍＬ)を添加した。混合物の濾過は失敗したので、フィルターと溶液をＤＣＭ(２ｘ６０ｍＬ)で抽出した。有機抽出物を濃縮したところ、粗生成物(０．１４ｇ)が生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：３４２(Ｍ＋１)

【0062】

工程４：１７-{３-[(２-ベンジルオキシカルボニルエチル)tert-ブトキシカルボニルアミノ]プロピオニルアミノ}ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル
３-[(２-ベンジルオキシカルボニルエチル)tert-ブトキシカルボニルアミノ]プロピオン酸(０．１７ｇ、０．４８ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(２ｍＬ)に溶解させ、ＨＯＢｔ(０．０６５ｇ、０．４８ｍｍｏｌ)及びＥＤＡＣ(０．０９３ｇ、０．４８ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を３０分攪拌し、ＤＩＥＡ(０．０８３ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ)を添加し、ＴＨＦ(３ｍＬ)＋ＤＭＦ(０．５ｍＬ)に溶解させた１７-アミノヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(０．１５ｇ、０．４４ｍｍｏｌ)を添加した。反応体を２日間攪拌した。反応体を濃縮し、残留物をＡｃＯＥｔ(５０ｍＬ)に溶解させ、０．２ＮのＨＣｌ(２ｘ１５ｍＬ)で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮した。生成物を、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン(１：１、７：３、８：２)、ついでＤＣＭ、ＤＣＭ：メタノール(８：２)、及びＤＣＭに５％のＡｃＯＨが入ったもので溶出させるフラッシュクロマトグラフィー(シリカ)により精製した。適切なフラクションをプールし、真空下で濃縮した。残留物をＤＣＭに溶解させた。シリカを添加し、生成物を真空下、シリカ上で濃縮した。シリカを、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン(３：７及び１：１)で溶出させる他のフラッシュクロマトグラフィーに使用した。適切なフラクションをプールし、真空下で濃縮したところ、１３５ｍｇ生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：６９７(Ｍ＋２３)
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ)δ７．３１-７．４１(ｍ，５Ｈ)、５．１２(ｓ，２Ｈ)、３．４８(ｍ，２Ｈ)、３．２１(ｍ，２Ｈ)、２．６０(ｔ，２Ｈ)、２．２０(ｔ，２Ｈ)、１．５７(ｍ，２Ｈ)、１．４５(ｍ，２０Ｈ，１．２５(ｍ-ｂｒ，２４Ｈ)。

【0063】

工程５：１７-{３-[tert-ブトキシカルボニル(２-カルボキシエチル)アミノ]プロピオニルアミノ}ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル
１７-{３-[(２-ベンジルオキシカルボニルエチル)tert-ブトキシカルボニルアミノ]プロピオニルアミノ}ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(０．１３５ｇ、０．２ｍｍｏｌ)を、フラスコ中のＴＨＦ(１０ｍＬ)に溶解させた。フラスコに窒素を満たし、真空下で数回パージした。湿った１０％のＰｄ／Ｃ(０．０３ｇ)を添加し、フラスコに、混合物(mixter)で満たされたバルーンを取り付け、１６時間攪拌した。混合物をセライトを通して濾過し、ＴＨＦで溶出させた。濾液を真空下で濃縮させた。ＴＬＣで、反応が完了していないことが示されたので、本方法を２回以上繰り返した。真空下で濾液を濃縮したところ、黄色の油(０．１２ｇ)が生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：６０７(Ｍ＋２３)

【0064】

工程６：１７-(３-{tert-ブトキシカルボニル[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニル)エチル]アミノ}プロピオニルアミノ)ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル
１７-{３-[tert-ブトキシカルボニル(２-カルボキシエチル)アミノ]プロピオニルアミノ}ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(０．１２２ｇ、０．２ｍｍｏｌ)をＴＨＦ(５ｍＬ)に溶解させた。ＤＩＥＡ(３９μｌ)を添加し、混合物を０℃まで冷却した。ＴＳＴＵ(６６ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を０℃で３０分、ついで、室温で１６時間攪拌した。混合物を真空下で濃縮した。ＡｃＯＥｔ(１５ｍＬ)及び溶液を、０．２ＮのＨＣｌ(５ｍＬ)及び飽和ＮａＣｌ(５ｍｌ)で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で乾燥させた。残留物を、ＡｃＯＥｔ／ヘプタン(９：１)及びＡｃＯＥｔで溶出させるフラッシュクロマトグラフィー(シリカ)により精製した。適切なフラクションをプールし、真空下で濃縮したところ、５８ｍｇ生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：６８２(Ｍ＋１)

【0065】

工程７：Ｎ^εＢ２９-{３-[２-(１６-カルボキシヘキサデシルカルバモイル)エチルアミノ]プロピオニル}ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
１０ｍｌの丸底フラスコにおいて、１００ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３(１．５ｍｌ)及びアセトニトリル(１．５ｍｌ)を添加することにより、ＤｅｓＢ３０インスリン(１２６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ)を溶解させた。１７-(３-{tert-ブトキシカルボニル[２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニル)エチル]アミノ}プロピオニルアミノ)ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル(１５ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ)をアセトニトリル(７５０μｌ)に添加し、Ｎａ_２ＣＯ_３(７５０μｌ)を添加し、最終溶液を５０：５０の１００ｍＭＮａ_２ＣＯ_３／アセトニトリルにした。溶液を室温で１時間攪拌した。溶液を１５ｍＬの遠心分離用チューブに移し、Ｍｉｌｌｉ-Ｑ水(６ｍＬ)で洗浄した。溶液を氷上で冷却し、１ＮのＨＣｌを添加することにより、ｐＨを５．１に調節し、沈殿に至らしめた。チューブを１０℃で１０分、５０００ｒｐｍの遠心分離にかけた。固体から溶媒をデカントした。９５：５のＴＦＡ／水(２．５ｍＬ)を固体に添加した。溶液をＲＢ-フラスコに注ぎ、さらに９５：５のＴＦＡ／水(２．５ｍｌ)で洗浄した。溶液を室温で３０分攪拌し、真空下で濃縮した。ＤＣＭを添加し、２回除去し、フラスコを室温、真空下で乾燥させた。イオン交換クロマトグラフィーを使用し、生成物を精製した。
カラム：リソース(Resource)Ｑ６ｍｌ
バッファーＡ：１５ｍＭのＴＲＩＳ、３０ｍＭの酢酸アンモニウム、５０％ｖ／ｖのエタノール、ＡｃＯＨを用いてｐＨ７．５。
バッファーＢ：１５ｍＭのＴＲＩＳ、３００ｍＭの酢酸アンモニウム、５０％ｖ／ｖのエタノール、ＡｃＯＨを用いてｐＨ７．５。
４ｍｌ／分で溶出。２ＣＶをバッファーＡ、ついで、１２ＣＶ超を０-８０％勾配のバッファーＢ。
適切なフラクションを水で希釈し、ｐＨ２まで酸性化し、２０％のエタノール、０．１％のＴＦＡにおいて、リソースＲＰＣ３ｍｌカラムに充填し、５０％のエタノール、０．１％のＴＦＡで溶出させた。適切なフラクションをプールし、水で希釈し、統括乾燥させたところ、１５ｍｇ生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：１５２９．７(Ｍ／４＝１５２９．３)

【0066】

実施例２
Ｎ^εＢ２９-{３-[２-(１４-カルボキシテトラデシルカルバモイル)エチルアミノ]プロピオニル}ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

表題の化合物を実施例１に記載した方法に類似した方式で調製したが、最終生成物は調製用ＨＰＬＣ(直径２ｃｍ、Ｃ_１８カラム、アセトニトリル／水／０．１％のＴＦＡ)を使用して精製した。
ＬＣＭＳ：１５２３．３(Ｍ／４＝１５２２．３)

【0067】

実施例３
Ｎ^εＢ２９-(２-{[(１４-カルボキシテトラデシルカルバモイル)メチル]アミノ}アセチル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

工程１：(tert-ブトキシカルボニルメトキシカルボニルメチルアミノ)酢酸
(tert-ブトキシカルボニルカルボキシメチルアミノ)酢酸(９．５ｇ、４１ｍｍｏｌ)をＤＭＦに溶解させ、ＡＤＡＣ(７．７８ｇ、４１ｍｍｏｌ)を添加した。溶液を、室温、窒素下で１時間攪拌し、ＭｅＯＨ(１．６５ｍｌ、４１ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を４時間攪拌し、真空下で濃縮した。ＡｃＯＥｔ(１５０ｍＬ)を添加し、溶液を水(３ｘ１００ｍＬ)で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮したところ、無色の油(９．１５ｇ)が生じた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：２７０．１(Ｍ＋２３)

【0068】

工程２：１５-[２-(tert-ブトキシカルボニルメトキシカルボニルメチルアミノ)アセチルアミノ]ペンタデカン酸tert-ブチルエステル
１５-アミノペンタデカン酸tert-ブチルエステルを、１７-アミノヘプタデカン酸tert-ブチルエステルに類似した方式で調製し、実施例１、工程４に記載した方法に類似した方式で、(tert-ブトキシカルボニルメトキシカルボニルメチルアミノ)酢酸にカップリングさせた。

【0069】

工程３：１５-[２-(tert-ブトキシカルボニル-カルボキシメチル-アミノ)アセチルアミノ]ペンタデカン酸tert-ブチルエステル
１５-[２-(tert-ブトキシカルボニルメトキシカルボニルメチルアミノ)アセチルアミノ]ペンタデカン酸tert-ブチルエステル(０．２２ｇ、０．４０５ｍｍｏｌ)をＴＨＦ(５ｍＬ)に溶解させ、１ＮのＮａＯＨ(０．４０５ｍＬ)を添加した。混合物を窒素下で１６時間攪拌した。混合物を真空下で濃縮した。残留物をＡｃＯＥｔ(約２５ｍＬ)に懸濁させ、水(１５ｍＬ)とＡｃＯＨ(３ｍＬ)を添加した。有機相を単離し、水(１５ｍＬ)＋ＡｃＯＨ(１ｍＬ)、水(１５ｍＬ)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮した。
残った工程を、実施例１で使用した方法に類似した方式で実施したが、最終生成物は、まず調製用ＨＰＬＣ、ついでリソースＱ１ｍＬカラムを使用し、０．２５％の酢酸アンモニウムから２．５％の酢酸アンモニウム(０．２４％のＴｒｉｓ、４２．５％のエタノール、ｐＨ７．５)で溶出させるイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：１５１６．５５(Ｍ／４＝１５１５．３)

【0070】

実施例４
Ｎ^εＢ２９-[(Ｓ)-２-アミノ-６-(１５-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ヘキサノイル]ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

ヘキサデカンジオン酸モノ-tert-ブチルエステルは、実施例１、工程６に記載した方法に類似した方式で、ＴＳＴＵを用いて活性化させることができる。生成物は、ＤＭＦにおいて、室温で１６時間、Ｂｏｃ-Ｌｙｓ-ＯＨと反応させることができる。真空下で濃縮した後、ＡｃＯＥｔは残留物に添加可能で、混合物は０．２ＮのＨＣｌで洗浄することができる。ついで、有機相をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮したところ、粗生成物である１５-((Ｓ)-５-tert-ブトキシカルボニルアミノ-５-カルボキシペンチルカルバモイル)ペンタデカン酸tert-ブチルエステルが生じる。これは、さらなる精製をすることなく使用することもでき、又はフラッシュクロマトグラフィーにより精製することもできる。この化合物は、実施例１、工程６に記載した方法に類似した方式で、ＴＳＴＵを用いて活性化させることができ、１５-[(Ｓ)-５-tert-ブトキシカルボニルアミノ-５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニル)ペンチルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルが生じ、この化合物はインスリンとカップリング可能で、脱保護され、生成物を単離するための調製用ＨＰＬＣを使用する、実施例１、工程７に記載されたようにして表題の化合物が生じる。

【0071】

実施例５
Ｎ^εＢ２９-{(Ｓ)-２-アミノ-３-[(Ｓ)-２-アミノ-３-(１５-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロピオニルアミノ]プロピオニル}ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成
１５-[(Ｓ)-２-tert-ブトキシカルボニルアミノ-２-(２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルオキシカルボニル)エチルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルは、(Ｓ)-３-アミノ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸を使用し、１５-[(Ｓ)-５-tert-ブトキシカルボニルアミノ-５-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニル)ペンチルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルについて記載したものに類似した方式で調製することができ、ＤＭＦにおいて、室温で１６時間、(Ｓ)-３-アミノ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸と反応させることができる。真空下で濃縮した後、ＡｃＯＥｔは残留物に添加可能で、混合物は０．２ＮのＨＣｌで洗浄することができる。ついで、有機相をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮したところ、粗生成物である１５-[(Ｓ)-２-tert-ブトキシカルボニルアミノ-２-((Ｓ)-２-tert-ブトキシカルボニルアミノ-２-カルボキシエチルカルバモイル)エチルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルが生じる。これは、さらなる精製をすることなく使用することもでき、又はフラッシュクロマトグラフィーにより精製することもできる。

この化合物は、実施例１、工程６に記載した方法に類似した方式で、ＴＳＴＵを用いて活性化させることができ、１５-{(Ｓ)-２-tert-ブトキシカルボニルアミノ-２-[(Ｓ)-２-tert-ブトキシカルボニルアミノ-２-(２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシカルボニル)エチルカルバモイル]エチルカルバモイル}ペンタデカン酸tert-ブチルエステルが生じ、この化合物はインスリンとカップリング可能で、生成物を単離するための調製用ＨＰＬＣを使用する、実施例１、工程７に記載されたようにして表題の化合物が生じる。

【0072】

実施例６
Ｎ^εＢ２９-[(Ｓ)-６-アミノ-２-(１５-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ヘキサノイル]ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

表題の化合物は、実施例４で使用した方法に類似した方式で調製することができる。

【0073】

実施例７
Ｎ^εＢ２９-３-{[２-(１５-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオニルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

１-Ｂｏｃ-アミノ-２-メチルアミノ-エタン(１ｇ、４．７５ｍｍｏｌ)とtert-ブチルアクリレート(０．６１ｇ、４．７５ｍｍｏｌ)を、トリエチルアミン(１．３２ｍＬ、９．５ｍｍｏｌ)と共にエタノール(１０ｍＬ)に溶解させ、一晩還流した。溶媒を真空で蒸発させ、３-(Ｂｏｃ-アミノエチル-メチル-アミノ)-プロピオン酸tert-ブチルエステルを酢酸エチル(３００ｍｌ)を添加することにより単離し、２ｘ５％の炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄し、続いて硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空で蒸発させたところ、油(６３０ｍｇ、４４％)が残った。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：３０３．５(Ｍ＋Ｈ)
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ)δ５．１１(ｂｓ，１Ｈ)、３．２０(ｔ，２Ｈ)、２．６５(ｔ，２Ｈ)、２．４６(ｔ，２Ｈ)、２．３７(ｔ，２Ｈ)、２．２１(ｓ，３Ｈ)、１．４６(ｓ，９Ｈ)、１．４４(ｓ，９Ｈ)。

【0074】

(Ｂｏｃ-アミノエチル-メチル-アミノ)-プロピオン酸tert-ブチルエステル(６３０ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ)を、トリフルオロ酢酸(６ｍＬ)を用いて２時間処理した。３-(アミノエチル-メチル-アミノ)-プロピオン酸トリフルオロ酢酸塩を、ＴＨＦから結晶化することにより単離したところ、白色のパウダー、９７４ｍｇ(定量)が得られた。

(アミノエチル-メチル-アミノ)-プロピオン酸(４４８ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ)及びtert-ブチルスクシンイミジルヘキサデカンジオアート(４７４ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ)を、ＤＭＦ(６ｍＬ)において、トリエチルアミン(０．５３ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ)と一晩反応させた。溶媒を真空で蒸発させ、３-{[２-(１５-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオン酸を酢酸エチルを添加することにより単離し、０．１Ｍのリン酸バッファーｐＨ４、水及びブラインで洗浄し、続いて硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空で蒸発させた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：４７１．４(Ｍ＋Ｈ)

【0075】

３-{[２-(１５-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオン酸(２５ｍｇ、０．０５３ｍｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン(０．３ｍＬ)に溶解させ、Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(１０ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(７．３μＬ、０．０５３ｍｍｏｌ)で一晩処理した。粗混合物を直接、インスリンのアシル化に使用した。
ＤｅｓＢ３０ヒトインスリン(２００ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ)を１００ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ１０．５(１ｍＬ)に、室温で溶解させた。上から粗３-{[２-(１５-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオン酸Ｏ-スクシンイミジルエステルをインスリン溶液に添加した。３０分後、ＨＣｌによりｐＨを５．５に調節し、遠心分離により等電沈殿物を収集し、真空で乾燥させた。保護されたインスリン中間体を９５％のＴＦＡ(３ｍＬ)に溶解させ、３０分後、真空で蒸発させた。
Ｎ^εＢ２９-３-{[２-(１５-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオニルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを、バッファーＡ：０．１％のＴＦＡ−水に１０％のＭｅＣＮ、バッファーＢ：０．１％のＴＦＡ−水に８０％のＭｅＣＮにおいて、Ｃ４カラムでのＲＰ-ＨＰＬＣにより精製した。
ＬＣＭＳ：１５２６．６(Ｍ／４＝１５２６．８)

【0076】

実施例８
Ｎ^εＢ２９-３-{[２-(１４-カルボキシ-テトラデカノイルアミノ)-エチル]-メチル-アミノ}-プロピオニルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

本化合物を、１-Ｂｏｃ-アミノ-２-メチルアミノ-エタン及びtert-ブチルアクリレート及びtert-ブチルスクシンイミジルペンタデカノアートから、上述したようにして調製する。

【0077】

実施例９
Ｎ^εＢ２９-３-{[２-(１５-カルボキシ-テトラデカノイルアミノ)-プロピル]-メチル-アミノ}-プロピオニルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

本化合物を、１-Ｂｏｃ-アミノ-３-メチルアミノ-プロパン及びtert-ブチルアクリレート及びtert-ブチルスクシンイミジルペンタデカノアートから、上述したようにして調製する。

【0078】

実施例１０
Ｎ^εＢ２９-３-{[２-(１５-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エチル]-エチル-アミノ}-プロピオニルｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

本化合物を、１-Ｂｏｃ-アミノ-２-アミノ-エタン及びtert-ブチルアクリレートから、上述したようにして調製する。中間の３-(Ｂｏｃ-アミノエチル-アミノ)-プロピオン酸tert-ブチルエステルを、メタノールにおいてアセトアルデヒド及び水素化ホウ素ナトリウムを使用して、還元的にアルキル化し、続いて保護されたtert-ブチルスクシンイミジルヘキサデカンジオアートと反応させ、スクシンイミジルエステルとして活性化させ、上述したようにしてインスリンと反応させる。

【0079】

実施例１１
Ｎ^εＢ２９-(１５-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-Ｌ-グルタミル-(２-ジメチルアミノエチル-アミド)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの合成

Ｂｏｃ-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)-ＯＳｕを、テトラヒドロフラン及びトリエチルアミンにおいて、室温で一晩、２-ジメチルアミノ-エチルアミンと反応させ、上述したようにして、酢酸エチルから作製する。生成物、Ｂｏｃ-Ｌ-Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)-ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＭｅ_２をトリフルオロ酢酸で２時間処理し、真空で乾燥させる。生成物、Ｌ-グルタミル-２-ジメチルアミノエチル-アミドをtert-ブチルスクシンイミジルヘキサデカンジオアートと反応させ、スクシンイミジルエステルとして活性化させ、上述したようにしてｄｅｓＢ３０ヒトインスリンにカップリングさせる。

【0080】

実施例１２
疎水性度、アルブミン親和性、自己会合特性、及び長時間作用するインスリンと短時間作用するインスリンの混合性
本発明のインスリン誘導体の自己会合特性の分析
大きいが可溶性の複合体における自己会合性についての、本発明のインスリン誘導体の能力を、ＳＥＣ(サイズ排除クロマトグラフィー)を使用して分析する：
カラム：Superose^ＴＭ６ＰＣ３．２／３０、ＣＶ＝２．４ｍｌ
(Amerham Biosciences)
温度：３７℃
ＳＥＣバッファー：１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．０１％のＮａＮ_３、ｐＨ７．５
注入容量：２０μｌ
流量：０．０５ｍｌ／分
実施時間：６０分及び追加の１００分の平衡

【0081】

この分析用の本発明のインスリン誘導体は、０．６ｍＭの誘導体、２．１Ｚｎ^２＋／六量体、１６ｍＭのフェノール、７ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．８からなる溶液にある。ついで、誘導体の保持時間を、次の標準分子の保持時間と比較する：ブルーデキストラン(＞５ＭＤａ、Ｋ_ＡＶ０．０)、チログロブリン(６６９ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．２８)、フェリチン(４４０ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．３９)、オボアルブミン(４４．５ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．５６)、リボヌクレアーゼ(１３．７ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．６９)、第２の参照のアルブミン(６６ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．５３)、Ｃｏ(ＩＩＩ)インスリン-六量体(３５ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．６１)、及び単量体インスリンＸ２(６ｋＤａ、Ｋ_ＡＶ０．７３)。

【0082】

次の等式を使用し、誘導体についてのＫ_ａＶを決定する：
Ｋ_ａＶ＝(ｔ−ｔ_０)／(Ｖ_ｔ／(ｆ＋ｔ_ｄ−ｔ_０))
ここで、ｔは付与されるピークに対する保持時間であり、ｔ_０はブルーデキストランに対する保持時間であり、Ｖ_ｔは全カラム容量(ここでは２．４ｍｌ)であり、ｆは流量(ここでは０．０４ｍｌ／分)であり、及びｔ_ｄは、システムにおいてカラムのないブルーデキストランに対する保持時間である。
Ｋ_ａＶ値は誘導体の自己会合性の度合いを示し、すなわち、Ｃｏ(ＩＩＩ)六量体及びＸ２インスリンモノマーに対するＫ_ａｖに類似して大きなＫ_ａＶであることは、大きな自己会合性複合体を形成するための誘導体の傾向が低いか又は無いことを示し、これに対し、Ｋ_ａＶが０に近い程非常に小さいか又は負であるということは、大きな溶解性複合体において自己会合する誘導体の傾向が大きいことを示す。

【0083】

本発明のインスリン誘導体における疎水性度データ
ヒトインスリンに対する、本発明のインスリン誘導体の疎水性度(疎水性指標)、ｋ'_ｒｅｌを、溶離液としてＡ）１０％のアセトニトリルを含有する０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．３、及びＢ）水に５０％のアセトニトリルが入ったものの混合物を使用し、４０℃で定組成溶離させることにより、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂＲＰ１８(５μｍ、２５０ｘ４ｍｍ)ＨＰＬＣカラムにおいて測定した。２１４ｎｍでの溶出液のＵＶ吸収度を追跡することにより、溶出をモニターした。ボイド時間、ｔ_０を０．１ｍＭの硝酸ナトリウムを注入することにより見出した。ヒトインスリンについての保持時間ｔヒトを、Ａ及びＢ溶液の間の比率を変えることにより、少なくとも２ｔ_０に調節した。ｋ'_ｒｅｌ＝(ｔ_derivative−ｔ_０)／(ｔ_human−ｔ_０)。本発明の多くのインスリン誘導体について見出されたｋ'_ｒｅｌを、表１にまとめる。

【0084】

ヒト血清アルブミン親和アッセイ
ヒト血清アルブミンに対する１２５Ｉ-ＴｙｒＡ１４-類似体の相対結合定数をMinileak粒子に固定し、２３℃で測定した(生理食塩水バッファーにおいてデテミル＝１)。

【0085】

インスリン混合物のサイズ排除クロマトグラフィーにより分析された長時間作用する及び短時間作用するインスリンの混合性
ＳＥＣ：ＳＥＣ(上に記載)からフラクションを収集し、それぞれ高分子量フラクション(フラクション２、ＭＷ＞ＨＳＡ)及び低分子量フラクション(フラクション３、ＭＷ＝ＨＳＡ)における、長時間作用する及び速効作用するインスリンの存在性をＨＰＬＣにより定量することで測定される、インスリンアスパルト(３Ｚｎ／６インスリン、グリセロール１．６％、１６ｍＭのフェノール、及び１６ｍＭのｍ-クレゾール、１０ｍＭの塩化ナトリウム、７ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．４)と長時間作用するインスリン(２．１又は６Ｚｎ／６インスリン)３０／７０の混合性。
４つのフラクションを１６分遅れのサイズで収集し、そのフラクション２[１６-３２分](ピーク１)はアルブミンより大きな会合型(３２分はＫ_ＡＶ０．４６に相当)を含有し、フラクション３(ピーク２)はインスリンのジヘキサマー、六量体、二量体及び単量体を含有する。
ＨＰＬＣ：ＺｏｒｂａｘＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ-Ｃ１８２．１*１５ｍｍ(１．８μｍ)における逆相クロマトグラフィー、次のものを用いた勾配溶出、バッファーＡ：０．２Ｍの硫酸ナトリウム、０．０４Ｍのリン酸ナトリウム、１０％のアセトニトリル、ｐＨ７．２、及びバッファーＢ：７０％のアセトニトリル、３０℃、１９−３４％のＢ、４．５分、直線状、突然開始条件５分、操作時間７分、流速０．５ｍｌ／分、注入容量１４μＬ、及び双方の類似体について、６０９μＭのインスリンアスパルト参照を使用し、２７６ｎｍでＵＶ検出。

【0086】

表の説明：
Ｋ_ａＶ＝ヒト血清アルブミンに対して０．５５、Ｋ_ａＶ＝ヒトインスリンＣｏ(ＩＩＩ)六量体に対して０．６３、Ｋ_ａＶ＝単量体インスリンアナログＸ２に対して０．７２、ｎ.ａ.＝分析せず

【0087】

実施例１３：
ブタにインスリン調製物を皮下投与した後の正常血糖グルコースクランプ
メスのブタ、６０-９０ｋｇ、１８時間絶食。実験中、ブタは、それらのペンにおいて、自由に移動する。多くの場合、２つの貯蔵部に分割された用量サイズに応じて、インスリン用量を皮下投与する。２０％のグルコース溶液の静脈注射の速度を変えることによって、２４時間まで、各ブタでの個々の空腹時血糖値を正常血糖に保持する。注入は、頸静脈に挿入されたカテーテルを介してなされる。血漿グルコースを頻繁にモニタリングする間に観察される、血漿グルコース濃度の変化に応じて、経験的に、グルコース注入の必要性が調節される。１５-３０分毎に、ＥＤＴＡガラスチューブに血液サンプルを収集し、グルコース及びインスリン測定用に血漿を分離した。ＹＳＩ(Yellow Springs Instruments)グルコース分析器(グルコースオキシダーゼ法)を用い、サンプリングした血液について１．５分内にグルコース測定した。平均グルコース注入速度(ＧＩＲ)プロファイル及び平均血漿インスリンプロファイルを、各インスリン調製物用に作製する(図２-４は平均±ＳＥＭを示す)。

【0088】

実施例１４
インスリン誘導体-６００-９００-１２００-１８００-２４００-３０００ｎｍｏｌ／ｍＬの製剤
Ａ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｂ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｃ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0089】

Ｄ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｅ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｆ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0090】

Ｇ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｈ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｉ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0091】

Ｊ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｋ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｌ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0092】

Ｍ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｎ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｏ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0093】

Ｐ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｑ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｒ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0094】

Ｓ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｔ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｕ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0095】

Ｖ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｘ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
Ｙ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0096】

ＡＡ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＢ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＣ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0097】

ＡＤ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＥ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛７．５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＦ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0098】

ＡＧ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＨ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＩ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン６μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0099】

ＡＪ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＫ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛７．５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＬ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン９μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0100】

ＡＭ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＮ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＯ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0101】

ＡＰ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＱ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＲ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0102】

ＡＳ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＴ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＵ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛３０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0103】

ＡＶ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＸ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛２５μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＡＹ．ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン３０μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した。酢酸亜鉛３０μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．６に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0104】

実施例１５
インスリン誘導体-１２００-１８００-２４００ｎｍｏｌ／ｍｌ及びインスリンアスパルト-１２００-１８００-２４００ｎｍｏｌ／ｍｌの製剤
Ａ：インスリンアスパルト１２μｍｏｌを水に懸濁させ、６μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｂ：インスリンアスパルト１８μｍｏｌを水に懸濁させ、９μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｃ：インスリンアスパルト２４μｍｏｌを水に懸濁させ、１２μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0105】

Ｄ：インスリンアスパルト１２μｍｏｌを水に懸濁させ、６μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｅ：インスリンアスパルト１８μｍｏｌを水に懸濁させ、９μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｆ：インスリンアスパルト２４μｍｏｌを水に懸濁させ、１２μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0106】

Ｇ：インスリンアスパルト１２μｍｏｌを水に懸濁させ、６μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｈ：インスリンアスパルト１８μｍｏｌを水に懸濁させ、９μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｉ：インスリンアスパルト２４μｍｏｌを水に懸濁させ、１２μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0107】

Ｊ：インスリンアスパルト１２μｍｏｌを水に懸濁させ、６μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｋ：インスリンアスパルト１８μｍｏｌを水に懸濁させ、９μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｌ：インスリンアスパルト２４μｍｏｌを水に懸濁させ、１２μｍｏｌの酢酸亜鉛及び塩酸を含有する溶液と混合し、溶液を得た。ついで、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する溶液を添加した。最終的に、水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨを７．４に調節し、水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0108】

Ｍ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｎ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｏ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0109】

Ｐ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｑ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｒ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0110】

Ｓ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｔ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｕ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0111】

Ｖ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｘ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
Ｙ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛３２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0112】

Ｚ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＡ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＢ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0113】

ＡＣ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＤ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＥ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0114】

ＡＦ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＧ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＨ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0115】

ＡＩ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＪ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＫ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛３２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0116】

ＡＬ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＭ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＮ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0117】

ＡＯ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＰ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＱ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0118】

ＡＲ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＳ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＴ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0119】

ＡＵ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＶ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＸ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１６ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１６ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛３２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0120】

ＡＹ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＡＺ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＡ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＢ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１２μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0121】

ＢＣ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛９μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＤ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＥ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１８μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＦ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン１８μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0122】

ＢＧ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＨ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛１６μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＩ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛２４μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。
ＢＪ：ＬｙｓＢ２９Ｎε-ヘキサデカンジオイル-γ-ＧｌｕｄｅｓＢ３０ヒトインスリン２４μｍｏｌを水に溶解させ、フェノール０．１９ｍｍｏｌ、ｍ-クレゾール０．１９ｍｍｏｌ、塩化ナトリウム０．１０ｍｍｏｌ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン７０μｍｏｌ及びグリセロール約２ｍｍｏｌを含有する水溶液と混合した(等張にするため)。酢酸亜鉛３２μｍｏｌを添加し、ｐＨを７．４に調節し、最終的に水を添加することによって、容量を８ｍＬに調節した。

【0123】

ＢＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ａと７．２ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ａと６．４ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ａと５．６ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0124】

ＢＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ａと４．８ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ａと４．０ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ａと３．２ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0125】

ＢＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ａと２．４ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ａと１．６ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ａと０．８ｍＬの製剤Ｍとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0126】

ＢＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ａと７．２ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ａと６．４ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ａと５．６ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0127】

ＢＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ａと４．８ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ａと４．０ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＢＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ａと３．２ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0128】

ＣＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ａと２．４ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ａと１．６ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ａと０．８ｍＬの製剤Ｎとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0129】

ＣＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ａと７．２ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ａと６．４ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ａと５．６ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0130】

ＣＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ａと４．８ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ａと４．０ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ａと３．２ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0131】

ＣＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ａと２．４ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ａと１．６ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ａと０．８ｍＬの製剤Ｏとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0132】

ＣＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ａと７．２ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ａと６．４ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ａと５．６ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0133】

ＣＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ａと４．８ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ａと４．０ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ａと３．２ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0134】

ＣＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ａと２．４ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ａと１．６ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ａと０．８ｍＬの製剤Ｐとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0135】

ＣＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｂと７．２ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｂと６．４ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＣＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｂと５．６ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0136】

ＣＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｂと４．８ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｂと４．０ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｂと３．２ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0137】

ＤＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｂと２．４ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｂと１．６ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｂと０．８ｍＬの製剤Ｑとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0138】

ＤＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｂと７．２ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｂと６．４ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｂと５．６ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0139】

ＤＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｂと４．８ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｂと４．０ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｂと３．２ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0140】

ＤＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｂと２．４ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｂと１．６ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｂと０．８ｍＬの製剤Ｒとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0141】

ＤＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｂと７．２ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｂと６．４ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｂと５．６ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0142】

ＤＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｂと４．８ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｂと４．０ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｂと３．２ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0143】

ＤＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｂと２．４ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｂと１．６ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｂと０．８ｍＬの製剤Ｓとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0144】

ＤＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｂと７．２ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＤＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｂと６．４ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｂと５．６ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0145】

ＥＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｂと４．８ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｂと４．０ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｂと３．２ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0146】

ＥＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｂと２．４ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｂと１．６ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｂと０．８ｍＬの製剤Ｔとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0147】

ＥＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｃと７．２ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｃと６．４ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｃと５．６ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0148】

ＥＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｃと４．８ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｃと４．０ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｃと３．２ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0149】

ＥＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｃと２．４ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｃと１．６ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｃと０．８ｍＬの製剤Ｕとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0150】

ＥＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｃと７．２ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｃと６．４ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｃと５．６ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0151】

ＥＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｃと４．８ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｃと４．０ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｃと３．２ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0152】

ＥＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｃと２．４ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｃと１．６ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＥＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｃと０．８ｍＬの製剤Ｖとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0153】

ＦＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｃと７．２ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｃと６．４ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｃと５．６ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0154】

ＦＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｃと４．８ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｃと４．０ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｃと３．２ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0155】

ＦＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｃと２．４ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｃと１．６ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｃと０．８ｍＬの製剤Ｘとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0156】

ＦＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｃと７．２ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｃと６．４ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｃと５．６ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0157】

ＦＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｃと４．８ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｃと４．０ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｃと３．２ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0158】

ＦＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｃと２．４ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｃと１．６ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｃと０．８ｍＬの製剤Ｙとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0159】

ＦＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｄと７．２ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｄと６．４ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｄと５．６ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0160】

ＦＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｄと４．８ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｄと４．０ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＦＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｄと３．２ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0161】

ＦＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｄと２．４ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｄと１．６ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｄと０．８ｍＬの製剤Ｚとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0162】

ＧＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｄと７．２ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｄと６．４ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｄと５．６ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0163】

ＧＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｄと４．８ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｄと４．０ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｄと３．２ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0164】

ＧＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｄと２．４ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｄと１．６ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｄと０．８ｍＬの製剤ＡＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0165】

ＧＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｄと７．２ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｄと６．４ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｄと５．６ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0166】

ＧＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｄと４．８ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｄと４．０ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｄと３．２ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0167】

ＧＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｄと２．４ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｄと１．６ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｄと０．８ｍＬの製剤ＡＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0168】

ＧＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｄと７．２ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｄと６．４ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｄと５．６ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0169】

ＧＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｄと４．８ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＧＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｄと４．０ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｄと３．２ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0170】

ＨＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｄと２．４ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｄと１．６ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｄと０．８ｍＬの製剤ＡＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0171】

ＨＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｅと７．２ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｅと６．４ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｅと５．６ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0172】

ＨＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｅと４．８ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｅと４．０ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｅと３．２ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0173】

ＨＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｅと２．４ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｅと１．６ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｅと０．８ｍＬの製剤ＡＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0174】

ＨＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｅと７．２ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｅと６．４ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｅと５．６ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0175】

ＨＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｅと４．８ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｅと４．０ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｅと３．２ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0176】

ＨＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｅと２．４ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｅと１．６ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｅと０．８ｍＬの製剤ＡＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0177】

ＨＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｅと７．２ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｅと６．４ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＨＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｅと５．６ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0178】

ＩＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｅと４．８ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｅと４．０ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｅと３．２ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0179】

ＩＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｅと２．４ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｅと１．６ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｅと０．８ｍＬの製剤ＡＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0180】

ＩＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｅと７．２ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｅと６．４ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｅと５．６ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0181】

ＩＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｅと４．８ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｅと４．０ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｅと３．２ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0182】

ＩＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｅと２．４ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｅと１．６ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｅと０．８ｍＬの製剤ＡＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0183】

ＩＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｆと７．２ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｆと６．４ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｆと５．６ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0184】

ＩＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｆと４．８ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｆと４．０ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｆと３．２ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0185】

ＩＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｆと２．４ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｆと１．６ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＩＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｆと０．８ｍＬの製剤ＡＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0186】

ＩＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｆと７．２ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｆと６．４ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｆと５．６ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0187】

ＪＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｆと４．８ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｆと４．０ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｆと３．２ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0188】

ＪＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｆと２．４ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｆと１．６ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｆと０．８ｍＬの製剤ＡＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0189】

ＪＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｆと７．２ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｆと６．４ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｆと５．６ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0190】

ＪＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｆと４．８ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｆと４．０ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｆと３．２ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0191】

ＪＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｆと２．４ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｆと１．６ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｆと０．８ｍＬの製剤ＡＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0192】

ＪＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｆと７．２ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｆと６．４ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｆと５．６ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0193】

ＪＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｆと４．８ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｆと４．０ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｆと３．２ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0194】

ＪＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｆと２．４ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＪＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｆと１．６ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｆと０．８ｍＬの製剤ＡＫとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0195】

ＫＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｇと７．２ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｇと６．４ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｇと５．６ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0196】

ＫＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｇと４．８ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｇと４．０ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｇと３．２ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0197】

ＫＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｇと２．４ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｇと１．６ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｇと０．８ｍＬの製剤ＡＬとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0198】

ＫＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｇと７．２ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｇと６．４ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｇと５．６ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0199】

ＫＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｇと４．８ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｇと４．０ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｇと３．２ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0200】

ＫＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｇと２．４ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｇと１．６ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｇと０．８ｍＬの製剤ＡＭとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0201】

ＫＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｇと７．２ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｇと６．４ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｇと５．６ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0202】

ＫＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｇと４．８ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｇと４．０ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＫＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｇと３．２ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0203】

ＬＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｇと２．４ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｇと１．６ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｇと０．８ｍＬの製剤ＡＮとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0204】

ＬＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｇと７．２ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｇと６．４ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｇと５．６ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0205】

ＬＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｇと４．８ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｇと４．０ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｇと３．２ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0206】

ＬＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｇと２．４ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｇと１．６ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｇと０．８ｍＬの製剤ＡＯとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0207】

ＬＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｈと７．２ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｈと６．４ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｈと５．６ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0208】

ＬＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｈと４．８ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｈと４．０ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｈと３．２ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0209】

ＬＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｈと２．４ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｈと１．６ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｈと０．８ｍＬの製剤ＡＰとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0210】

ＬＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｈと７．２ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｈと６．４ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＬＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｈと５．６ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0211】

ＬＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｈと４．８ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｈと４．０ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｈと３．２ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0212】

ＭＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｈと２．４ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｈと１．６ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｈと０．８ｍＬの製剤ＡＱとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0213】

ＭＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｈと７．２ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｈと６．４ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｈと５．６ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0214】

ＭＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｈと４．８ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｈと４．０ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｈと３．２ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0215】

ＭＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｈと２．４ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｈと１．６ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｈと０．８ｍＬの製剤ＡＲとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0216】

ＭＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｈと７．２ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｈと６．４ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｈと５．６ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0217】

ＭＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｈと４．８ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｈと４．０ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｈと３．２ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0218】

ＭＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｈと２．４ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｈと１．６ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｈと０．８ｍＬの製剤ＡＳとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0219】

ＭＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｉと７．２ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＭＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｉと６．４ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｉと５．６ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0220】

ＮＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｉと４．８ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｉと４．０ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｉと３．２ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0221】

ＮＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｉと２．４ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｉと１．６ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｉと０．８ｍＬの製剤ＡＴとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0222】

ＮＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｉと７．２ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｉと６．４ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｉと５．６ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0223】

ＮＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｉと４．８ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｉと４．０ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｉと３．２ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0224】

ＮＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｉと２．４ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｉと１．６ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｉと０．８ｍＬの製剤ＡＵとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0225】

ＮＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｉと７．２ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｉと６．４ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｉと５．６ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0226】

ＮＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｉと４．８ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｉと４．０ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｉと３．２ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0227】

ＮＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｉと２．４ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｉと１．６ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＮＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｉと０．８ｍＬの製剤ＡＶとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0228】

ＯＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｉと７．２ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｉと６．４ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｉと５．６ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0229】

ＯＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｉと４．８ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｉと４．０ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｉと３．２ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0230】

ＯＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｉと２．４ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｉと１．６ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｉと０．８ｍＬの製剤ＡＸとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0231】

ＯＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｊと７．２ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｊと６．４ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｊと５．６ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0232】

ＯＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｊと４．８ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｊと４．０ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｊと３．２ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0233】

ＯＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｊと２．４ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｊと１．６ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｊと０．８ｍＬの製剤ＡＹとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0234】

ＯＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｊと７．２ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｊと６．４ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｊと５．６ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0235】

ＯＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｊと４．８ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｊと４．０ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＯＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｊと３．２ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0236】

ＯＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｊと２．４ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｊと１．６ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｊと０．８ｍＬの製剤ＡＺとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0237】

ＰＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｊと７．２ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｊと６．４ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｊと５．６ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0238】

ＰＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｊと４．８ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｊと４．０ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｊと３．２ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0239】

ＰＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｊと２．４ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｊと１．６ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｊと０．８ｍＬの製剤ＢＡとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0240】

ＰＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｊと７．２ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｊと６．４ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｊと５．６ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0241】

ＰＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｊと４．８ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｊと４．０ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｊと３．２ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0242】

ＰＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｊと２．４ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｊと１．６ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｊと０．８ｍＬの製剤ＢＢとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0243】

ＰＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｋと７．２ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｋと６．４ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｋと５．６ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0244】

ＰＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｋと４．８ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＰＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｋと４．０ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｋと３．２ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0245】

ＱＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｋと２．４ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｋと１．６ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｋと０．８ｍＬの製剤ＢＣとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0246】

ＱＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｋと７．２ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｋと６．４ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｋと５．６ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0247】

ＱＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｋと４．８ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｋと４．０ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｋと３．２ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0248】

ＱＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｋと２．４ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｋと１．６ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｋと０．８ｍＬの製剤ＢＤとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0249】

ＱＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｋと７．２ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｋと６．４ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｋと５．６ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0250】

ＱＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｋと４．８ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｋと４．０ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｋと３．２ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0251】

ＱＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｋと２．４ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｋと１．６ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｋと０．８ｍＬの製剤ＢＥとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0252】

ＱＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｋと７．２ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｋと６．４ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＱＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｋと５．６ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0253】

ＲＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｋと４．８ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｋと４．０ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｋと３．２ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0254】

ＲＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｋと２．４ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｋと１．６ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｋと０．８ｍＬの製剤ＢＦとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0255】

ＲＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｌと７．２ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｌと６．４ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｌと５．６ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0256】

ＲＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｌと４．８ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｌと４．０ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｌと３．２ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0257】

ＲＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｌと２．４ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｌと１．６ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｌと０．８ｍＬの製剤ＢＧとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0258】

ＲＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｌと７．２ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｌと６．４ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＲ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｌと５．６ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0259】

ＲＳ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｌと４．８ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＴ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｌと４．０ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＵ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｌと３．２ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0260】

ＲＶ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｌと２．４ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＸ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｌと１．６ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＲＹ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｌと０．８ｍＬの製剤ＢＨとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0261】

ＲＺ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｌと７．２ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＡ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｌと６．４ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＢ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｌと５．６ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0262】

ＳＣ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｌと４．８ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＤ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｌと４．０ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＥ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｌと３．２ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0263】

ＳＦ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｌと２．４ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＧ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｌと１．６ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＨ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｌと０．８ｍＬの製剤ＢＩとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0264】

ＳＩ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、０．８ｍＬの製剤Ｌと７．２ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＪ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、１．６ｍＬの製剤Ｌと６．４ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＫ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、２．４ｍＬの製剤Ｌと５．６ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0265】

ＳＬ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、３．２ｍＬの製剤Ｌと４．８ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＭ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．０ｍＬの製剤Ｌと４．０ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＮ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、４．８ｍＬの製剤Ｌと３．２ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0266】

ＳＯ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、５．６ｍＬの製剤Ｌと２．４ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＰ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、６．４ｍＬの製剤Ｌと１．６ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。
ＳＱ：インスリンアスパルトとインスリン誘導体とからなる製剤を、７．２ｍＬの製剤Ｌと０．８ｍＬの製剤ＢＪとを混合することにより得、最終的に水を添加することによって、容量を１０ｍＬに調節した。

【0267】

薬理学的方法
アッセイ(Ｉ)
本発明のインスリン誘導体のインスリンレセプター結合性
ヒトインスリンレセプターに対する本発明のインスリンアナログの親和性を、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定した。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．０２５％のトゥイーン(Tween)-２０)と混合した。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：５０００に希釈された精製組換えヒトインスリンレセプター−エクソン１１、１００μｌの試薬混合物当たり５０００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[^１２５Ｉ]-ヒトインスリンの所定量の保存溶液、１２μｌの１：１０００に希釈されたＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ、及び全体を１２ｍｌにする結合バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌ添加し、希釈系を適切なサンプルから作製する。ついで、希釈系に１００μｌの試薬混合物を加え、ゆっくりと振盪させつつ、サンプルを１６時間インキュベートした。ついで、１分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測した。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させた。

【0268】

アッセイ(ＩＩ)
ヒトインスリンに対する本発明のインスリン誘導体の有効性
実験日、２３８-３８３ｇでオスのスプラーグドーリーラットを、クランプ実験に使用する。制御された周囲条件下、ラットは餌に自由に接近し、クランプ実験の前には一晩(３ｐｍから)、絶食させる。

【0269】

実験プロトコル
外科手順の少なくとも１週間前に、ラットを動物施設に慣れさせる。クリンプ実験の約１週間前、ハロタン麻酔下で、頸静脈(注入のため)及び頸動脈(血液のサンプリングのため)にタイゴンカテーテルを挿入し、露出させ、頸部の後ろに固定する。外科手術後、ラットにStreptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；０．１５ｍｌ／ラット、筋肉内)を付与し、回復期間中、動物ケアユニット(２５℃)におく。無痛覚とするために、麻酔中にアノルフィン(Anorphin)(０．０６ｍｇ／ラット、皮下)を投与し、麻酔から十分に回復した(２-３時間)後、再度２日に１回、リマダイル(Rimadyl)(１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下)を投与する。

【0270】

使用したクランプ技術を、(１)実験日の７ａｍに一晩(前日の３ｐｍから)絶食させたラットを計量し、サンプリング用シリンジ及び注入システム(Harvard 22 Basic pumps，Harvard，及びPerfectum Ｈypodermicｇlass syringe，Aldrich)につなぎ、ついで個々のクランプ用ゲージに配し、実験開始前の約４５分、そこで休ませる。全実験中、それらの通常の寝具上を、ラットは自由に動くことができ、水飲み場に自由に接近することもできる。血漿血糖値を１０分間隔で測定する、３０分の基本期間後、試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリン(ラット当たり１回の投与レベル、投与レベル当たりｎ＝６-７)を、３００分、一定の速度で注入する(静脈内)。１０分の間隔で、血漿血糖値を測定し、正常血糖を維持するために、２０％水性グルコースの注入を調節する。再懸濁させた赤血球のサンプルを各ラットからプールし、頸動脈カテーテルを介して、約１／２ｍｌ容量を戻す。

【0271】

各実験日において、試験される個々のインスリン誘導体溶液及びヒトインスリン溶液のサンプルを、クリンプ実験の前及び終了時に取り出し、ペプチド濃度をＨＰＬＣにより確認した。ラットインスリン及びＣ-ペプチド、並びに試験されるインスリン誘導体及びヒトインスリンの血漿濃度を、研究の前及び終了の時点で測定する。ペントバルビタール過剰投与を使用し、実験の終了時にラットを殺す。

【0272】

試験用化合物及び用量：
試験されるインスリンを、５ｍＭのホスフェート、ｐＨ７．７に９７μＭのインスリン誘導体を含有する保存溶液から希釈する。使用準備が整った溶液中の最終濃度は、０．４５μＭのインスリン誘導体、５ｍＭのホスフェート、１００ｍＭの塩化ナトリウム、０．００７％のポリソルベート(polysorbate)２０である。ｐＨは７．７であり、静脈内注入速度は１５及び２０ｐｍｏｌ・分^−１・ｋｇ-^１であった。
参照化合物として使用されるヒトインスリンの保存溶液を、類似した媒体で処方し、６、１５又は３０ｐｍｏｌ・分^−１・ｋｇ-^１で静脈内注入する。
双方の保存溶液を−２０℃で保存し、使用前に４℃で一晩解凍する。それらを注入用シリンジに移す１５分前に、溶液を数回、ゆっくりと上下逆さまにする。

【0273】

アッセイ(ＩＩＩ)
本発明のインスリン誘導体のＴ_５０％のブタにおける測定
Ｔ_５０％は、試験されるインスリンのＡ１４Ｔｙｒ[^１２５Ｉ]標識された誘導体の注射量の５０％が、外部γ計測器を用いて測定して、注射部位から消失した時間である。
実験用動物ケアの原則に従い、薬物動態及び薬力学的研究のために、特定の病原菌を持たないＬＹＹＤ、糖尿病ではないメスのブタ、デンマーク在来種、ヨークシャー及びデュロックの交雑種を使用する(Holmenlund, Haarloev, Denmark)。ブタは意識があり、４-５ヶ月の年齢、７０-９５ｋｇの体重である。実験前に動物を１８時間、一晩絶食させる。
^１２５Ｉを有するＴｙｒ^Ａ１４で標識されたインスリン誘導体の処方された調製物を、先に記載したように、ブタに皮下注射する(Ribel, U., Jorgensen, K, Brange, J, 及びHenriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M及びLefebvre, P. J. 891-896. 1985. Amsterdam; New York; Oxforｄ，Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding))。

【0274】

実験の開始時に、本発明のインスリン誘導体(試験用化合物)６０ｎｍｏｌ用量とインスリンデテミル６０ｎｍｏｌ用量(双方ともＴｙｒＡ１４において^１２５Ｉ標識した)を、各ブタの頸部の２つの別々の部位に注射する。
皮下注射部位から放射性標識が消失するのを、伝統的な外部ガンマ-計測法の修正法を使用し、モニターする(Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. 及びGries，F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; New York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding))。この修正法を用いると、コードレスポータブル装置を使用して、数日間、皮下沈着物から放射活性が消失するのを連続して測定することができる(Scancys Laboratorieteknik, Varlose, DK-3500, Denmark)。測定を１分間隔で実施し、計測された値をバックグラウンド活性に対して修正する。

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