特許 5715635 バチルス属微生物及び毒素分解剤、並びに、廃棄物の処理方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5715635

(24)【登録日】2015年3月20日

(45)【発行日】2015年5月13日

(54)【発明の名称】バチルス属微生物及び毒素分解剤、並びに、廃棄物の処理方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20150423BHJP

   C12N 9/54 20060101ALN20150423BHJP

   B09B 3/00 20060101ALN20150423BHJP

   A62D 3/02 20070101ALN20150423BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150423BHJP

   A62D 101/20 20070101ALN20150423BHJP

   C12R 1/125 20060101ALN20150423BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 AZAB

   C12N1/20 DZNA

   C12N1/20 F

   !C12N9/54

   !B09B3/00 304Z

   !B09B3/00 A

   !A62D3/02

   !C12N15/00 A

   C12N1/20 AZAB

   A62D101:20

   C12N1/20 AZAB

   C12R1:125

【請求項の数】1

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2012-535086(P2012-535086)

(86)(22)【出願日】2011年9月22日

(86)【国際出願番号】JP2011071724

(87)【国際公開番号】WO2012039483

(87)【国際公開日】20120329

【審査請求日】2013年4月12日

(31)【優先権主張番号】特願2010-214271(P2010-214271)

(32)【優先日】2010年9月24日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE BP-680

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000173913

【氏名又は名称】公益財団法人微生物化学研究会

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】土井 宏育

【審査官】 鶴 剛史

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−１８９９０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−２６２２７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 FUJITA,M. et al.，Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan.，Biochem. Biophys. Res. Commun.，１９９３年１２月３０日，Vol.197, No.3，pp.1340-7

【文献】 今井俊明 他，酵素を用いたクラゲ処理の研究，火力原子力発電，２００９年 ７月，Vol.60, No.7，p.636-40

【文献】 土井宏育 他，バチルス属微生物104-1-3-1株が産生する血栓溶解酵素によるクラゲ類の分解，マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集，２０１１年 ５月２８日，Vol.14th，p.89

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ａ６２Ｄ ３／０２

Ａ６２Ｄ １０１／２０

Ｂ０９Ｂ ３／００

Ｃ１２Ｎ ９／５４

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｒ １／１２５

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サチルス） １０４−１−３−１株（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−６８０）であり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生することを特徴とするバチルス属微生物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生するバチルス属微生物及び前記バチルス属微生物が産生した血栓溶解酵素、並びに、該血栓溶解酵素を用いた廃棄物の処理方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発電所、製鉄所などの臨海プラント施設は、大量の冷却水を必要とし、該冷却水として海水を利用している。そのため、海水の取水口が設けられている。
しかし、この取水口が廃棄物によって閉塞し、取水が制限乃至停止され、その運転に支障をきたすという被害が問題となってきている。

【0003】

前記廃棄物の一例として、クラゲ類が挙げられる。従来より、前記臨海プラント施設における前記クラゲ類による被害に対しては、クラゲ類が取水口に入り込むのを防ぐ目的で、エアバブリング、水流プロペラ、船舶等を使用してクラゲ類を強制移動させると共に取水口に防除網を設置する第一の対策や、回転式除塵機、ポンプ等を用いてクラゲ類を陸揚げして処分する第二の対策などが講じられてきた。

【0004】

しかし、前記第一の対策の場合、前記防除網の隙間からクラゲ類が侵入してしまうことがある。また、クラゲ類を生かしたまま放流させるため、クラゲ類の大発生を招くおそれがある。更に、前記防除網にはムラサキイガイ等の汚損生物が付着してしまうため、前記防除網の清掃や展張作業が必要となり、その作業の間は前記防除網を使用できない上、前記防除網の清掃や乾燥には多数の労力を要し、場所の確保も必要となり、前記防除網の維持管理には多大な費用を要するという問題がある。

【0005】

また、前記第二の対策の場合、陸揚げしたクラゲ類を処分する必要があり、多大な手間、費用等を要するという問題がある。具体的には、前記クラゲ類を天日乾燥して脱水や減容化後に廃棄処分する場合には、前記クラゲ類の廃棄処分量が天候に左右され易い上に天日乾燥に数日程度も要し、陸揚げした大量のクラゲ類を一度に天日乾燥させるための広大な場所を要し、腐敗臭の発生など、周囲の環境に与える影響も大きいという問題がある。また、前記クラゲ類を焼却処分する場合には、前記クラゲ類の個体は９５質量％〜９８質量％程度が水分であるため、該クラゲ類自体を焼却することが極めて困難であるという問題がある。また、前記クラゲ類を圧力や薬品を使用して物理化学的に分解処理する場合（特許文献１〜５参照）には、分解処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要し、処理装置の設備費、建設費、維持費等も多大となるという問題がある。前記クラゲ類を酸やアルカリによる化学的に分解処理する場合には、分解処理後に中和処理が必要になるという問題がある。

【0006】

また、微生物等を用いて前記クラゲを生物学的に分解処理する方法も知られている。例えば、微生物が分泌するクラゲ分解酵素を利用して、前記クラゲ類の体を形成しているタンパク質であるコラーゲン繊維を分解し、クラゲ類体内の水分を除去し減容させる方法などが挙げられる（特許文献６〜８参照）。
しかし、この場合、前記クラゲ類の分解に一日程度を要し、迅速な分解処理ができない上、分解が不完全であるという問題がある。

【0007】

また、海水に浮遊等しているクラゲ類は、主に温暖な時期にしばしば大発生し、様々な被害をもたらしており、前記臨海プラント施設以外でも問題になっている。例えば、日本近海で大量発生するエチゼンクラゲは、海流に乗って各地沿岸に出現し、近年、沿岸の定置網漁などの漁業に甚大な被害をもたらしている。
更に魚類を捕獲する際に同時に、例えば、エチゼンクラゲや、電気クラゲとも呼ばれるアンドングラゲ等の毒素を有するクラゲが網にかかると、該クラゲ類の毒素は魚類を白化させてしまい、魚類の商品価値を下げてしまう点で問題である。

【0008】

これらのクラゲ類の毒素は非常に強力であり、アナフィラキシーショックによる死亡例も報告されている。そのため、前記クラゲ類を生物学的に分解処理する方法では、処理液を処分する際に毒素に触れる危険性がある点においても問題である。
しかし、このような廃液の安全性を確保する方法は知られていない。

【0009】

したがって、前記臨海プラント施設における前記クラゲ類による被害に対しては、有効な対策がなく、前記クラゲ類を、圧力、薬品、高熱等の物理化学的エネルギーを極力消費することなく、迅速かつ容易に分解等することができ、該分解後の処理物を安全に廃棄できる関連技術の開発が望まれているのが現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】特開２００１−３００５０５号公報

【特許文献2】特開２０００−５７３８号公報

【特許文献3】特開平１１−２４４８３３号公報

【特許文献4】特開２００３−１４５１９６号公報

【特許文献5】特開２００１−１９８５６６号公報

【特許文献6】特開２００３−５３３０３号公報

【特許文献6】特開平１１−１７９３２７号公報

【特許文献7】特開２００１−９５５６４号公報

【特許文献8】特開２００２−１３６９５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、廃棄物に対する優れた分解活性を有する血栓溶解酵素を産生することができるバチルス属微生物、及び前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高い廃棄物の処理方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を含む廃棄物の処理方法は、前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高いことを知見し、本発明の完成に至った。

【0013】

本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・サチルス） １０４−１−３−１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−６８０）及びその誘導菌株のいずれかであり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生することを特徴とするバチルス属微生物である。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のバチルス属微生物により産生されることを特徴とする血栓溶解酵素である。
＜３＞ 至適ｐＨが６〜１２である前記＜２＞に記載の血栓溶解酵素である。
＜４＞ 至適温度が２０℃〜７０℃である前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載の血栓溶解酵素である。
＜５＞ ナットウキナーゼである前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載の血栓溶解酵素である。
＜６＞ 前記＜２＞から＜５＞のいずれかに記載の血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を含むことを特徴とする廃棄物の処理方法である。
＜７＞ 血栓溶解酵素が、前記＜１＞に記載のバチルス属微生物とタンパク質性原料とを混合し、前記タンパク質性原料を前記バチルス属微生物により発酵させた発酵物から分離して得られた血栓溶解酵素である前記＜６＞に記載の廃棄物の処理方法である。
＜８＞ 分解工程が、前記＜１＞に記載のバチルス属微生物と廃棄物とを混合した混合物中で行なわれる前記＜６＞に記載の廃棄物の処理方法である。
＜９＞ 廃棄物が、クラゲ類、魚類、プランクトン、及び毒素の少なくともいずれかである前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の廃棄物の処理方法である。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、廃棄物に対する優れた分解活性を有する血栓溶解酵素を産生することができるバチルス属微生物、及び前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高い廃棄物の処理方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、１０４−１−３−１株の光学顕微鏡写真である。

【図2】図２は、１０４−１−３−１株の１６Ｓ ｒＤＮＡを用いた分子系統樹であり、左下の線はスケールバー、株名の末尾のＴはその種の基準株を示す。

【図3】図３は、試験例３における、１０４−１−３−１株の培養温度と、培養に伴い１０４−１−３−１株の菌体外に産生された血栓溶解酵素活性の関係を示す図である。縦軸は、血栓溶解酵素活性（ＦＬＶ）を、横軸は、培養上清の保温時間（時間）をそれぞれ示す。また、「◆」は培養温度が２７℃、「■」は培養温度が３０℃、「▲」は培養温度が３５℃、「●」は培養温度が４０℃の場合を示す。グラフ中のプロットは、３回の平均値±標準偏差を示す。

【図4】図４は試験例４において、１０４−１−３−１株が産生する血栓溶解酵素の至適温度及び温度安定性を示す図である。縦軸は、血栓溶解酵素活性（ＦＬＶ）を、横軸は、反応時間（時間）をそれぞれ示す。また、「◆」は反応温度が５３℃、「▲」は反応温度が５０℃、「×」は反応温度が４７℃、「●」は反応温度が４３℃、「■」は反応温度が４０℃の場合を示す。グラフ中のプロットは、３回の平均値±標準偏差を示す。

【図5】図５は、試験例５において、１０４−１−３−１株が産生する血栓溶解酵素のｐＨ安定性を示す図である。縦軸は、血栓溶解酵素活性（ＦＬＶ）を、横軸は、培養上清のｐＨをそれぞれ示す。

【図6】図６は、試験例６における血栓溶解酵素の凍結乾燥安定性を示す図である。縦軸は、血栓溶解酵素活性（ＦＬＶ）を示す。

【図7A】図７Ａは、サチライシンＡの各濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性（ＦＬＶ）の相関を示す検量線である。

【図7B】図７Ｂは、トリプシンの各濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性（ＦＬＶ）の相関を示す検量線である。

【図7C】図７Ｃは、Ｖ型コラゲナーゼの各濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性（ＦＬＶ）の相関を示す検量線である。

【図7D】図７Ｄは、フィチンの各濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性（ＦＬＶ）の相関を示す検量線である。

【図8】図８は、試験例７において、各種酵素のフィブリンに対する分解能を示す図である。「Ｎ」はナットウキナーゼ、「Ｓ」はサチライシンＡ、「Ｔ」はトリプシン、「Ｃ」はＶ型コラゲナーゼ、「Ｆ」はフィチンをそれぞれ示す。

【図9】図９は、試験例８において１０４−１−３−１株の培養上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画した結果を示す図である。図９のクロマトグラムは、１０４−１−３−１株培養液から疎水性相互作用クロマトグラフィーによりタンパク質分解活性画分を分画した結果を示している。

【図10】図１０は、試験例８において１０４−１−３−１株の培養上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画した後、脱塩した血栓溶解酵素含有画分を更に密度勾配等電点電気泳動により分画した結果を示す図である。縦軸は、血栓溶解酵素活性（ＦＬＶ）を、横軸は、密度勾配等電点電気泳動による画分番号をそれぞれ示す。

【図11】図１１は、試験例８において１０４−１−３−１株培養上清を精製した血栓溶解酵素のポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図である。左側のレーンは、マーカーを、右側のレーンは、ナットウキナーゼのバンドを示す（矢印で示す）。

【図12】図１２は、試験例９においてナットウキナーゼをトリプシン消化して調製したペプチドを、液体クロマトグラフィー／質量分析計にて分析したスペクトルを示す図である。縦軸は、相対イオン強度を、横軸は、カラム保持時間を示す。プリカーサーイオンをベースピーククロマトグラム（上）で、ＭＳ／ＭＳ分析によるフラグメントイオンをトータルイオンクロマトグラム（下）で示す。

【図13】図１３は、試験例１１において、ナットウキナーゼを含有する１０４−１−３−１株の培養上清でエチゼンクラゲを分解した時のクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（分間）をそれぞれ示す。また、「◆」は対照区を、「▲」は試験区を示す。グラフ中のプロットは、３回の平均値±標準偏差を示す。

【図14】図１４は、試験例１１において、ナットウキナーゼを含有する１０４−１−３−１株の培養上清でミズクラゲの完全個体を血栓溶解酵素含有１０４−１−３−１株培養液で分解した時のクラゲ残存質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣（％）を、横軸は、ナットウキナーゼ含有培養上清濃度（体積％）をそれぞれ示す。

【図15】図１５は、試験例１１において、ナットウキナーゼを含有する１０４−１−３−１株の培養上清で３ｃｍ角に裁断したミズクラゲを血栓溶解酵素含有１０４−１−３−１株培養液で分解した時のクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、消化時間（分間）をそれぞれ示す。グラフ中のプロットは、３回の平均値±標準偏差を示す。

【図16A】図１６Ａは、試験例１５において、人工海水中にミズクラゲを浸漬した対照区の結果を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図16B】図１６Ｂは、試験例１５において、ミズクラゲをナットウキナーゼで分解したときのクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図16C】図１６Ｃは、試験例１５において、ミズクラゲをサチライシンＡで分解したときのクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図16D】図１６Ｄは、試験例１５において、ミズクラゲをトリプシンで分解したときのクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図16E】図１６Ｅは、試験例１５において、ミズクラゲをフィチンで分解したときのクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図16F】図１６Ｆは、試験例１５において、ミズクラゲをＶ型コラゲナーゼで分解したときのクラゲ質量の変化を示す図である。縦軸は、クラゲ残渣率（％）を、横軸は、処理時間（時間）を示す。

【図17】図１７は、試験例１６において、ナットウキナーゼの濃度と、ヒツジ赤血球の溶血率との関係を示す図である。縦軸は、溶血率（％）を示す。

【図18】図１８は、試験例１６おいて、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）と、ヒツジ赤血球の溶血率との関係を示す図である。縦軸は、溶血率（％）を示す。

【図19】図１９は、試験例１６において、アンドンクラゲ毒素の熱安定性を示す図である。縦軸は、溶血率（％）を示す。

【図20】図２０は、試験例１６において、ナットウキナーゼのアンドンクラゲ毒素に対する分解能を示す図である。縦軸は、溶血率（％）を示す。

【図21】図２１は、試験例１７において、各種酵素のアンドンクラゲ毒素に対する分解能を示す図である。縦軸は、溶血率（％）を示す。

【図22】図２２は、本発明の廃棄物の処理方法に用いられる装置の一例を表す概略説明図である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

（バチルス属微生物）
本発明のバチルス属微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（「バチルス・サチルス」、「バチルス・スブチリス」、「バチルス・ズブチリス」などとも称する）１０４−１−３−１株及びその誘導菌株のいずれかであり、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生する微生物である。

【0017】

＜科学的性質＞
グラム陽性桿菌で、細胞は連鎖を示し、芽胞を形成する。芽胞による菌体の膨張は認められない。コロニー形態であり、直径は２．０ｍｍ〜３．０ｍｍ、色調はクリーム色、形は円形、隆起状態はレンズ状、周縁は波状、表面の形状などはラフ、透明度は不透明、粘稠度はバター様、カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性である。ＡＰＩ試験では、Ｌ−アラビノース、リボース、及びグルコース等を酸化し、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、及びＬ−キシロース等を酸化しない。嫌気条件下では生育せず、５０質量％及び１０質量％塩化ナトリウム含有培地で生育する。カゼインを加水分解し、でんぷんを加水分解しない。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく検索の結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓと相同であると考えられるが、一般的なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓとは生理学性状の一部が異なっているため、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの中の新たな株であることが推定された。

【0018】

＜分類学上の位置＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．

【0019】

＜培養条件＞
（１）培地名：ニュートリエントアガー
（２）培地の組成：ペプトン０．５質量％、牛肉エキス０．３質量％、寒天１．５質量％
（３）培地のｐＨ：７．０
（４）培地の殺菌条件：１２１℃、２０分間
（５）培養温度：３０℃
（６）培養期間：７日間
（７）酸素要求性：好気

【0020】

＜保管条件＞
（１）凍結条件：Ｌ−乾燥
（２）保護剤：２０体積％グリセロール
（３）凍結後の復元率：１００％

【0021】

＜寄託＞
前記１０４−１−３−１株は、平成２０年１１月２１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構に受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−６８０として受託されている。

【0022】

＜誘導菌株＞
前記１０４−１−３−１株の誘導菌株としては、廃棄物を分解する血栓溶解酵素を産生できれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記１０４−１−３−１株が、突然変異（自然発生又は誘発性）、形質転換、接合、遺伝子組換、紫外線、放射線、薬品等により性状などが変異したバチルス属微生物などが挙げられる。

【0023】

＜血栓溶解酵素活性の確認＞
前記バチルス属微生物が血栓溶解酵素活性を有するか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下の希釈法などが挙げられる。

【0024】

前記希釈法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バチルス属微生物を蒸留水等や培地等に懸濁し、適当な濃度に希釈後、該バチルス属微生物を含む液をフィブリン等のタンパク質成分を含む寒天培地などに植菌し、該バチルス属微生物が産生した血栓溶解酵素により前記タンパク質成分が分解することによって生じた透明な消化円を確認する方法などが挙げられる。この方法により、該バチルス属微生物の血栓溶解酵素産生能の有無を判定することができ、更に、前記消化円の範囲面積を測定することにより、前記血栓溶解酵素の産生量及び酵素活性を評価することができる。

【0025】

前記寒天培地中のタンパク質成分としては、特に制限はなく、公知のタンパク質成分の中から、目的に応じて、適宜選択することができ、例えば、カゼイン、ヘモグロビン、フィブリンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0026】

＜培養＞
前記バチルス属微生物は、前記培養条件以外でも公知の培地で生育することができ、液体培養であっても、固体培養であってもよい。
前記培地の組成としては、前記バチルス属微生物が増殖し前記血栓溶解酵素を産生させることができる培地であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類等の公知の培地成分を含む培地などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、市販されている大豆粉、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
前記炭素源としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トマトペースト、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリンなどの炭水化物、脂肪などが挙げられる。
前記無機塩類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食塩、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
また、必要に応じて微量の金属塩や、前記血栓溶解酵素の産生量を高めるような公知の成分を添加してもよい。
これらの材料は、前記バチルス属微生物が利用し、前記血栓溶解酵素の産生に役立つものであればよく、公知の培養材料は全て用いることができる。

【0027】

前記培養方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から、前記バチルス属微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、バッチ法、半連続法、連続法等の種々の方法が挙げられる。前記培養は、前記バチルス属微生物の生育を促進する公知の方法を併用してもよい。
前記液体培地による培養の条件としては、前記バチルス属微生物が死滅することなく、前記血栓溶解酵素を産生させることができる条件であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記培養の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜４５℃が好ましく、２７℃〜４０℃がより好ましく、２７℃〜３０℃が特に好ましい。前記特に好ましい範囲であると、血栓溶解酵素の産生量が多い点で有利である。
前記培養の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１２時間〜１２０時間が好ましく、４８時間〜９６時間がより好ましい。
前記培養は、好気培養であってもよく、嫌気培養であってもよいが、好気培養で行われることが、前記バチルス属微生物が効率よく増殖する点で好ましい。また、振盪培養であってもよく、静置培養であってもよい。

【0028】

前記液体培地中において、前記バチルス属微生物が増殖したことを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、集積培養用液体培地の濁度や添加した試薬による色の変化を、目視や吸光度測定により確認する方法、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー測定により確認する方法、化学的酸素要求量の測定により確認する方法などが挙げられる。

【0029】

＜使用＞
前記バチルス属微生物は、血栓溶解酵素を効率よく産生することができることから、本発明の廃棄物の処理方法に好適に利用可能である。

【0030】

（血栓溶解酵素）
本発明の血栓溶解酵素は、本発明の前記バチルス属微生物により産生される酵素であり、血栓を形成するフィブリンと呼ばれるタンパク質を溶解する酵素である。
前記バチルス属微生物が産生する血栓溶解酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ナットウキナーゼ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）、プラスミン、トリプシンなどが挙げられる。

【0031】

ナットウキナーゼは、サチライシンファミリーに属する酵素であり、古代から納豆などの食品として摂取されてきた枯草菌（納豆菌）から発見されたセリン血栓溶解酵素の一種で、強力な線溶活性を有することが知られている。納豆は古来から伝統食品として食されており、東南アジア諸国では納豆類似の伝統食品が数多く食されていることから、安全性は長い年月を通じて検証されたといえる。また、サチライシンファミリーに属する酵素はこれまで洗剤の洗浄成分として利用されており、酵素の安全性、酵素を含んだ排水に起因する特段の問題や事故が発生した事例はないため、後述する本発明の廃棄物の処理に問題なく使用できる点で好ましい。
ナットウキナーゼの全アミノ酸配列は決定されている（特開平６−１５３９７７号公報、特開２００６−３２５５３８号公報、特許文献９〜１０参照、Ｔ．Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ（１９９２） Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６， １８６９−１８７１、及びＴ． Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７， ２４６９０−２４６９６参照）。
本発明の前記バチルス属微生物により産生されるナットウキナーゼは、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有し、該アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ内に登録されているナットウキナーゼ遺伝子（アクセッション番号：Ｐ３５８３５）のアミノ酸配列と１００％の同一性を示す。

【0032】

前記バチルス属微生物から産生された前記溶解血栓酵素を分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液体培養又は固体培養で得られたバチルス属微生物菌体を、超音波処理、リゾチーム等のバチルス属微生物菌体を破壊する作用がある薬剤などを用いて前記バチルス属微生物菌体を破壊して分離する方法などが挙げられる。

【0033】

前記血栓溶解酵素の酵素活性及び産生量を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バチルス属微生物の培養上清を、タンパク質成分を含む寒天培地などに植菌し、該バチルス属微生物が産生した血栓溶解酵素により前記タンパク質成分が分解することによって生じた透明な消化円で確認する方法、タンパク質成分と任意の濃度の培養上清とを反応させて検量線を作成する方法などが挙げられる。

【0034】

（廃棄物の処理方法）
本発明の処理方法は、本発明の前記血栓溶解酵素により廃棄物を分解する分解工程を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。

【0035】

＜分解工程＞
前記分解工程は、前記血栓溶解酵素により廃棄物を分解する工程である。

【0036】

＜＜廃棄物＞＞
前記廃棄物としては、前記血栓溶解酵素で分解できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、有機廃棄物が好ましく、アミノ酸やタンパク質を含む廃棄物がより好ましい。前記タンパク質は、プロテイナーゼＫを０．１質量％、３０℃、１２０分間の条件で作用させた場合にも溶解しないような難分解性タンパク質であってもよい。これらの中でも、前記廃棄物の処理方法は、海洋生物や淡水生物からなる水産廃棄物に好ましく適用される。また、前記廃棄物の処理方法は、これらの廃棄物中又は該廃棄物から産生される毒素の分解にも好適に適用できる点で有利である。これらの廃棄物は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記水産廃棄物（海洋生物、淡水生物）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、魚介類、浮遊生物類、海綿類、ヒドロ虫類、管棲多毛類、苔虫類、ヨコエビ類、ワレカラ類、ホヤ類、甲殻類、扁形動物類などが挙げられる。

【0037】

前記魚介類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フグ等の魚類；イタヤガイ科（例えば、ホタテなど）、イタボガキ科（例えば、カキなど）、ヤマヒタチオビ科（例えば、ヤマヒタチオビなど）、イガイ科（例えば、カワヒバリガイ、ムラサキイガイ、ミドリイガイ、コウロエンカワヒバリガイなど）、カワホトトギス科（例えば、カワホトトギスガイ、クワッガガイ、イガイダマシなど）、オリイレヨフバイ科（例えば、カラムシロなど）、シジミ科（例えば、タイワンシジミなど）、マルスダレガイ科（例えば、シナハマグリなど）、アフリカマイマイ科（例えば、アフリカマイマイなど）、リンゴガイ科（例えば、スクミリンゴガイなど）、イモガイ科（例えば、イモガイなど）、マダコ科（例えば、ヒョウモンダコなど）、ムシロガイ科（例えば、キンシバイ）等に属する貝類などが挙げられる。
前記魚介類は、水産食品加工で廃棄物となることや、発電所の取水管などに付着することで問題となっている廃棄物である。また、前記フグは猛毒を有する魚類であるため、非可食部は廃棄物である。これらの魚類は、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0038】

前記浮遊生物類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ミズクラゲ科、ビゼンクラゲ科（例えば、ビゼンクラゲ、エチゼンクラゲなど）、アンドンクラゲ科、オキクラゲ科（例えば、アカクラゲなど）等に属するのクラゲ類；ラン藻類、アオコ、アナベナ等の赤潮プランクトン；微小藻類として、緑藻、珪藻、渦鞭毛藻、黄色鞭毛藻等の付着珪藻類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記血栓溶解酵素は、クラゲ類体成分を構成するコラーゲンを好適に分解することができる。

【0039】

前記甲殻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イワガニ科（例えば、モクズガニなど）、ザリガニ科（例えば、アスタクス、ウチダザリガニ（シグナルクレイフィッシュ）など）、アメリカザリガニ科（例えば、アメリカザリガニ、ラスティークレイフィッシュなど）、ミナミザリガニ科（例えば、ケラクスなど）、ワタリガニ科（例えば、チチュウカイミドリガニ、ヨーロッパミドリガニなど）、フジツボ科（例えば、フジツボ、タテジマフジツボなど）、オウギガニ科（例えば、スベスベマンジュウガニなど）等に属する甲殻類などが挙げられる。

【0040】

前記扁形動物類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヤリガタリクウズムシ科（例えば、ニューギニアヤリガタリクウズムシなど）などが挙げられる。

【0041】

前記毒素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クラゲ類の毒素、フグの毒素などが挙げられる。
前記クラゲ類の毒素としては、特に制限はなく、クラゲの種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、アンドンクラゲ毒素のＣｒＴＸｓ、ハブクラゲ毒素のＣｑＴＸ−Ａ、ハコクラゲ（Ｃａｒｙｂｄｅａ ａｌａｔａ）毒素のＣａＴＸ−Ａなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。

【0042】

特定外来生物による生態系等に係る被害の防止に関する法律（通称：外来生物法、特定外来生物被害防止法、平成１６年６月２日法律第７８号）では、生態系、人体、農林水産業に害を与える生物を特定外来生物として指定している。前記特定外来生物は、飼養、栽培、保管、運搬、輸入等について規制されており、必要に応じて国や自治体が野外等の外来生物の防除を行うことが定められている。本願発明の前記廃棄物の処理方法は、前記特定外来生物にも好適に利用可能である。

【0043】

前記特定外来生物としては、例えば、ヤマヒタチオビ、カワヒバリガイ属、カワホトトギスガイ、クワッガガイ等の貝類；モクズガニ属（モクズガニを除く）、アスタクス属、ウチダザリガニ（シグナルクレイフィッシュ）、ラスティークレイフィッシュ、ケラクス属等の甲殻類；ニューギニアヤリガタリクウズムシ等の扁形動物などが挙げられる。

【0044】

また、要注意外来生物としては、例えば、ムラサキイガイ、ミドリイガイ、カラムシロ、コウロエンカワヒバリガイ、イガイダマシ、タイワンシジミ種群、シナハマグリ、アフリカマイマイ、スクミリンゴガイ等の貝類；アメリカザリガニ、チチュウカイミドリガニ、ヨーロッパミドリガニ、タテジマフジツボ等の甲殻類などが挙げられる。

【0045】

前記外来生物の他に、イモガイ、ヒョウモンダコ、キンシバイ等の有毒貝類；スベスベマンジュウガニ等の有毒甲殻類などの有毒生物の処理、特に該有毒生物が大量発生した際の駆除等の処理にも、前記廃棄物の処理方法を適用することができる。

【0046】

前記廃棄物は、採取後そのまま使用してもよく、加熱処理、物理的破砕処理などの前処理を適宜行ってもよい。
前記廃棄物がクラゲ類である場合、個体全体をそのまま使用してもよいが、その種類によっては適宜物理的破砕処理することが、処理時間が短く、処理効率が向上する点で好ましい。前記クラゲ類に物理的破砕処理を施す場合、その大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｃｍ角以下が好ましく、１０ｃｍ角以下がより好ましく、３ｃｍ角以下が特に好ましい。

【0047】

また、前記廃棄物は、例えば、採取後に凍結したものを再融解して用いてもよく、水分を除去した状態で用いてもよく、水分を含んだ状態で用いてもよい。
前記水分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製水、水道水、海水などが挙げられる。
前記廃棄物の処理方法は、塩分を含む海水中であっても前記廃棄物をそのまま処理することができ、広大な場所を要することなく、簡便に処理できる点で有利である。

【0048】

＜＜血栓溶解酵素＞＞
前記分解工程において、前記血栓溶解酵素は、その他の酵素と併用されてもよい。
前記その他の酵素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
本発明の分解工程に用いられる酵素は、前記１０４−１−３−１株により産生された血栓溶解酵素であるが、公知の血栓溶解酵素を併用してもよい。

【0049】

前記血栓溶解酵素の状態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記バチルス属微生物を含む培養液、前記バチルス属微生物の菌体を除去した培養上清、後述するその他の工程で処理したものなどが挙げられる。

【0050】

また、前記血栓溶解酵素を産生するバチルス属微生物は、担体に固定された状態で分解工程に用いられてもよい。
前記担体としては、特に制限はなく、目的等に応じて適宜、その形状、構造、大きさ、材質等について選択することができる。
前記担体の形状としては、例えば、球状、粒状、塊状（ペレット状）、シート状、柱状、網状、カプセル状などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記担体の構造としては、１種単独の部材で形成されていてもよいし、２以上の部材で形成されていてもよく、また、単層構造であってもよいし、積層構造であってもよい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
また、前記担体の微細構造としては、例えば、前記バチルス属微生物が前記廃棄物と接触可能な構造であれば特に制限はないが、例えば、多孔質構造、網状構造などが好ましい。前記担体がこれらの構造を有すると、該担体に固定化された前記バチルス属微生物と、前記廃棄物との接触面積を大きくすることができるため、前記廃棄物の分解処理効率に優れる点で有利である。
前記担体の大きさとしては、該担体を収容する容器等の大きさ等に応じて適宜選択することができる。前記担体の大きさとしては、均一（一定）であってもよいし、互いに異なっていてもよい。

【0051】

前記担体の材質としては、例えば、多糖類、タンパク質、合成高分子、無機物などが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記多糖類としては、例えば、セルロース、デキストラン、アガロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、カラギーナンなどが挙げられ、これらの中でも、前記バチルス属微生物を高濃度に保持可能であるとともに廃液中の成分の透過性に優れ、造粒操作が容易であり、毒性が少なく、処理や処分が容易であるという点で、寒天が好ましい。
前記タンパク質としては、例えば、不活性化されたものが好ましく、その中でも、ゼラチン、アルブミン、コラーゲンなどが挙げられる。
前記合成高分子としては、例えば、アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルクロリド、ポリスチレン、ポリウレタン、光硬化性樹脂などが挙げられる。
前記無機物としては、例えば、シリカゲル、活性炭、砂、ゼオライト、多孔性ガラス、アンスラサイト、ゼオライト、発泡煉石、溶融スラグなどが挙げられ、これらの中でも多孔質材であるシリカゲル、活性炭が好ましい。

【0052】

前記担体に前記バチルス属微生物を固定化する方法としては、特に制限はなく、公知の方法に従って行うことができ、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、付着法（担体結合法）、架橋法、包括法などが好適に挙げられる。これらは、１種単独で採用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記付着法（担体結合法）は、水に不溶性の前記担体の表面に前記バチルス属微生物を固定化させる方法である。前記架橋法は、２個以上の官能基を持つ試薬と架橋させる方法である。前記包括法は、前記バチルス属微生物をゲルの格子内に包み込むか（格子型）又はポリマーの皮膜によって被覆する方法（マイクロカプセル）である。

【0053】

なお、前記担体に前記バチルス属微生物を固定化する際の該バチルス属微生物の固定位置としては、特に制限はなく、目的等に応じて適宜選択することができるが、前記バチルス属微生物は好気性であるため、前記担体の表面近傍に固定化されているのが好ましい。

【0054】

前記固定化担体として、寒天を用いたゲル状の担体を製造する場合について、以下に説明する。
前記寒天は、例えば、固定化した前記バチルス属微生物の漏出や、内部への侵入が少なく、耐久性に優れ、寿命が長く、安定性が高い濃度である３質量％で担体の造粒を行なうのが好ましい。
前記寒天を３質量％になるように水を混合し、６０℃以上で撹拌しながら寒天を溶解する。その後、熱耐性のない前記バチルス属微生物群を安定に固定化するために、固化しない範囲で可能な限り低温（例えば５５℃以下）で前記バチルス属微生物と混合することが好ましい。
前記バチルス属微生物は、例えば、遠心分離などの操作によって集菌されたものを用いることができる。
前記バチルス属微生物を混合した前記寒天を、室温まで冷却させ固化させた後、成型容器に入れ所望の形状に切断することにより、前記バチルス属微生物固定化担体が得られる。

【0055】

前記バチルス属微生物を固定した担体（以下、「バチルス属微生物固定化担体」と称することがある。）は、前記廃棄物と接触させる際に容器中に収容されているのが好ましい。前記担体が前記容器に収容されていることにより、前記担体と前記廃棄物との接触を効率よく、かつ制御しつつ行うことができる等の点で好ましい。
前記容器としては、特に制限はなく、その形状、構造、大きさ、材質等について目的に応じて適宜選択することができる。
前記容器の形状としては、例えば、円筒状などが好適に挙げられる。
また、前記容器の材質としては、耐塩性材料で形成されているのが好ましく、ガラス、樹脂、ステンレスなどで形成されているのがより好ましく、これらの中でも、該容器の内部を視認可能であるものが好ましい。
前記容器内における前記バチルス属微生物固定化担体の充填率としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１００％であってもよく、１００％未満であってもよい。
また、前記容器は、廃棄物の負荷に応じて、複数を並列又は直列に接続しても良い。

【0056】

＜＜分解方法＞＞
前記廃棄物は、前記血栓溶解酵素と接触させることにより分解することができる。
前記血清溶解酵素として、前記バチルス属微生物を含む培養液をそのまま用いる場合は、前記分解工程は、前記バチルス属微生物と、前記廃棄物と、好ましくは前記バチルス属微生物の培養に適した培地とを混合した混合液中で、前記バチルス属微生物から前記血栓溶解酵素を産生させるのと同時に、前記廃棄物を分解してもよい。この方法によれば、操作が簡便であり、短時間で前記廃棄物を処理できる点で好ましい。
また、前記分解工程は、装置を用いて行なわれてもよい。前記装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００５−２６２１０５公報に記載の湿式処理装置などが挙げられる。

【0057】

前記分解工程における前記廃棄物の使用量としては、特に制限はなく、前記血栓溶解酵素の精製度、血栓溶解酵素の力価などに応じて適宜選択することができる。

【0058】

前記分解工程における前記血栓溶解酵素の使用量としては、特に制限はなく、前記血栓溶解酵素の精製度や、酵素力価などに応じて適宜選択することができるが、前記廃棄物の体積に対して、０．１体積％以上が好ましく、１体積％以上がより好ましく、１体積％〜２体積％が更に好ましい。前記血栓溶解酵素の使用量が、０．１体積％未満であると、前記廃棄物の処理に時間がかかることや、分解効率が悪くなることがある。前記血栓溶解酵素の使用量が、２体積％を超えると、それ以上処理効率が高まらないことがあり、コスト的に不利であるが、分解処理上は上限に臨界的な意義はない。
前記血栓溶解酵素は、前記分解処理時に、必要に応じて、前記廃棄物の分解に必要な量を適宜追加し、処理液中の酵素濃度を一定にすることが好ましい。

【0059】

前記分解処理時の処理液中の水分量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２５体積％以上が好ましく、５０体積％〜７０体積％がより好ましい。前記水分量が、２５体積％未満であると、廃棄物と該酵素が十分に接触せず、酵素による分解反応が進行しないことがあり、７０体積％を超えると、酵素が希釈され、分解反応速度が遅くなることがある。

【0060】

前記分解処理時の温度としては、前記廃棄物を分解できる温度であれば、特に制限はなく、前記血栓溶解酵素の種類や、前記廃棄物の量などに応じて適宜選択することができるが、２０℃〜７０℃が好ましく、３０℃〜６０℃がより好ましく、４０℃〜５３℃が特に好ましい。前記温度が、２０℃未満であると、処理時間がかかることや、分解効率が悪くなることがあり、７０℃を超えると、前記血栓溶解酵素が失活して前記廃棄物を分解できなくなることがある。
なお、前記廃棄物が易分解性であり、短時間の反応で分解できる場合、前記温度は、前記血栓溶解酵素の初期酵素活性が高い点で、４５℃〜７０℃が好ましく、５０℃〜６０℃がより好ましい。
一方、前記廃棄物が難分解性であり、長時間の反応を要する場合、前記温度は、前記血栓溶解酵素が安定である点で、３０℃〜５０℃が好ましく、４０℃〜４７℃がより好ましい。

【0061】

前記分解処理時のｐＨとしては、特に制限はなく、前記血栓溶解酵素の種類などに応じて適宜選択することができるが、６〜１２が好ましく、６〜９がより好ましい。前記ｐＨが、６未満又は１２を超えると、前記血栓溶解酵素が失活して前記廃棄物を分解効率できなくなることがある。

【0062】

前記分解処理の時間としては、特に制限はなく、前記血栓溶解酵素の種類や量、前記廃棄物の種類や量などに応じて適宜選択することができるが、５分間以上が好ましく、１０分間以上が好ましい。また、前記反応時間の上限としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２時間以下が好ましい。前記廃棄物は、その種類にもよるが、２時間以下で完全に分解されることが多いため、２時間を超えて反応させても効率が悪くなることがある。

【0063】

前記分解工程において、前記廃棄物は、その種類によっては液体となるため、容易に除去することができる点で有利である。

【0064】

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製工程、発酵物調製工程、乾燥工程などが挙げられる。

【0065】

＜＜精製工程＞＞
前記精製工程は、前記血栓溶解酵素を精製する工程である。
前記血栓溶解酵素を精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記血栓溶解酵素を含有するバチルス属微生物の培養上清などを、疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画した後、ゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩を行い、密度勾配等電点電気泳動で精製する方法などが挙げられる。

【0066】

＜＜発酵物調製工程＞＞
前記発酵物調製工程は、前記血栓溶解酵素を産生するバチルス属微生物と、タンパク質性原料とを混合し、該タンパク質性原料を発酵させた発酵物を得る工程である。前記分解工程において、前記血清溶解酵素は、該発酵物から分離したものを用いてもよい。
前記発酵物を調製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、タンパク質性原料と、前記バチルス属微生物とを混合し、公知の方法で発酵させる方法などが挙げられる。
前記タンパク質性原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、大豆、小豆、インゲン豆、エンドウ豆、空豆、ウズラ豆、金時豆、落花生等の植物性原料；獣肉、魚肉、鳥肉等の動物性原料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記発酵の温度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜５０℃が好ましく、２７℃〜４０℃がより好ましい。
前記発酵の時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０時間〜７２時間が好ましく、４８時間〜７２時間がより好ましい。
前記発酵物を分離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩析や各種クロマトグラフィーによって分離する方法などが挙げられる。

【0067】

＜＜乾燥工程＞＞
前記乾燥工程は、前記血栓溶解酵素を乾燥させる工程である。これにより、前記分解工程に用いる血栓溶解酵素を長期間保存することができ、使用時に適当量を適宜使用しやすい点で好ましい。
前記乾燥する方法としては、特に制限はなく、公知の手法により行うことができ、例えば、凍結乾燥、通風乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥など通常の方法が利用できる。
また、前記血栓溶解酵素は、凍結乾燥後、目的に応じた溶媒に再融解させたものであってもよい。前記血栓溶解酵素は、凍結乾燥後においても、その酵素活性は安定であり、保存安定性が高い点で有利である。
ここで、乾燥させた血栓溶解酵素としては、例えば、前記バチルス属微生物を含む培養液、前記バチルス属微生物の培養上清、前記精製工程で精製した血栓溶解酵素、前記発酵物調製工程で分離したものなどを乾燥させたものなどが挙げられる。

【0068】

以下に、本発明の廃棄物の処理方法の一態様として、装置を用いて行う態様について、図面を用いて説明するが、本発明の廃棄物の処理方法はこれに限られるものではない。また、以下の説明において、廃棄物がクラゲの場合を例に挙げて説明するが、下記装置を用いた方法は、廃棄物であればよく、クラゲに限られるものではない。

【0069】

図２２は、前記廃棄物の処理方法に用いられる装置（湿式処理装置）の一例を示す概略説明図である。該装置はサイフォンを利用した装置であり、（１）分解槽の中に攪拌装置を必要としない、（２）ポンプが１台で運転が可能なのでランニングコストを抑え、保守管理を容易にすることができる、（３）分解槽から分解液が溢れることがない、（４）分解の様子が容易に観察できる、（５）装置を簡単に大型化できる、及び（６）連続的に分解できる、などの特長を有する。

【0070】

図２２に示す装置において、循環・加温槽５０内に予め収容させておいた前記バチルス属微生物から産生された血栓溶解酵素を含む処理液（以下、「クラゲ分解用組成物」と表す）を、前記配管における仕切弁１４０を「開」にし、仕切弁６０、仕切弁７０、仕切弁１１０及び仕切弁１３０を「閉」にしておき、前記配管に設けた送液ポンプ４０を駆動させて汲み上げて、分解槽１０内に移送させる。すると、前記クラゲ分解用組成物は、前記液状物流入口から分解槽１０内に流入し、仕切槽２０内に収容されたクラゲに接触し、該クラゲが該クラゲ分解用組成物によって接触処理される。このとき、このとき、前記クラゲは、分解槽１０の下部から内部に流入するクラゲ分解用組成物により、上方に押し上げられるようにして接触処理される。即ち、前記クラゲは、重力方向に落下しようとするのに対し、前記クラゲ分解用組成物は、この落下しようとするクラゲを押し上げるようにして接触する。このため、前記クラゲに付加される重力と、前記クラゲ分解用組成物の流圧との相乗効果により、前記接触処理が効果的に行われ、前記クラゲが効率よく分解される。

【0071】

分解槽１０内に流入する前記クラゲ分解用組成物の一部は、分解槽１０の下部に設けられた前記液状物流出口からサイフォン管３０内に流出する。そして、分解槽１０内に流入する前記クラゲ分解用組成物の液量の増量（水位の上昇）と共に、分解槽１０における前記液状物流出口に接続され、該液状物流出口付近から上方に向けて延設され、分解槽１０の上部付近で下方に向けて湾曲するサイフォン管３０内において前記クラゲ分解用組成物の液量も同様の速度で増量（水位が上昇）する。そして、サイフォン管３０内において前記クラゲ分解用組成物の液量（水位）がサイフォン管３０の湾曲部に達すると、サイフォンの原理により、分解槽１０内の前記クラゲ分解用組成物が、前記液状物流出口からサイフォン管３０を通して外部に連続的に移送され、サイフォン管３０の先端１７０から循環・加温槽５０内に連続的に移送される。このとき、仕切槽２０内においては、前記クラ分解用組成物の減量と共に前記クラゲが自重で落下していき、該クラゲ分解用組成物が総て外部に移送された際には、仕切槽２０の底面に衝突し、その際の衝撃等により破損等し小片化する。

【0072】

循環・加温槽５０内に移送された前記クラゲ分解用組成物は、前記配管に設けた送液ポンプ４０を駆動させることにより、再度汲み上げられて、分解槽１０内に再度移送される。これにより、分解槽１０内において２回目の接触処理が行われる。このとき、前記配管における仕切弁１４０は「開」にし、仕切弁６０、仕切弁７０、仕切弁１１０及び仕切弁１３０は「閉」にしておく。なお、前記配管に設けた送液ポンプ４０を連続的に駆動させておくと、分解槽１０内に再移送、分解槽１０内での再接触処理を連続的に繰り返すことができる。この接触処理を複数回行うことにより、仕切槽２０内に収容されたクラゲが完全に分解され、前記クラゲ分解用組成物中に溶解する。

【0073】

また、循環・加温槽５０内では、必要に応じて、サイフォン管３０により移送された前記クラゲ分解用組成物を加温管８０内を通過させ、循環させることによって加温乃至反応させることができる。即ち、加温管８０内を通過し、循環・加温槽５０内を循環することにより、前記クラゲ分解用組成物は、均一に混合され、また、ヒーター９０によって該クラゲ分解用組成物中に含まれる前記血栓溶解酵素の至適温度に加温されることにより（前記クラゲ分解用組成物の温度が、そこに含まれる酵素の至適温度に既に達している場合には、ヒーター９０を作動させる必要はない）、該クラゲ分解用組成物中に含まれる未分解のクラゲ細片等（クラゲタンパク質）の完全かつ効率的な分解が進み、前記クラゲタンパク質が均一に溶解した溶液としての前記クラゲ分解用組成物が調製される。なお、循環・加温槽５０内の前記クラゲ分解用組成物を、加温管８０内を通過させて循環・加温槽５０内で循環させるには、前記配管における仕切弁７０を「開」にし、仕切弁６０、仕切弁１３０及び仕切弁１４０を「閉」にしておき、前記配管に設けた送液ポンプ４０を駆動させることにより行うことができる。また、このとき、循環・加温槽５０内の前記クラゲ分解用組成物の全部を、加温管８０内を通過させて循環・加温槽５０内で循環させてもよいし、循環・加温槽５０内の前記クラゲ分解用組成物の一部を、加温管８０内を通過させて循環・加温槽５０内で循環させ、残りの一部を分解槽１０内に移送させてもよい。

【0074】

＜使用＞
前記廃棄物の処理方法は、前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高いことから、種々のタンパク質を含む廃棄物の処理に好適に利用可能であり、特に発電所などの臨海産業、漁業分野等で混獲された海産廃棄物の処理、淡水系生物の廃棄物等の水産廃棄物の処理に好適に利用可能である。
前記血栓溶解酵素により減容化された廃棄物は、例えば、排水処理等の公知の処理方法により海洋、河川などにに排出できるレベルにまで処理される。

【実施例】

【0075】

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

【0076】

（試験例１：プロテアーゼ産生能を有する微生物の選抜）
神奈川県三浦市沖の海洋底泥から、土壌試料を採取し、該土壌試料中の微生物から希釈液列を作製し、該希釈液からプロテアーゼ産生能を有する微生物を選抜した。なお、海底汚泥は、バクテリアコアーサンプラー（株式会社離合社製）を用いて採取した。
採取した前記土壌試料各１ｇを、滅菌生理的食塩水９ｍＬにそれぞれ添加し、懸濁後、室温で約１時間放置した。次に、固形物が沈澱した上記土壌懸濁生理的食塩水の上清を分取し、新たな前記滅菌生理的食塩水９ｍＬに添加した。これを繰り返して希釈液列を調製した。
調製した希釈液列をそれぞれ１００μＬ用い、下記タンパク質含有寒天培地に塗抹し、３０℃にて３日間、静置培養することにより微生物を育成した。前記微生物がプロテアーゼを産生する場合に、該微生物が生育した周囲はタンパク質が溶解し透明な消化円を与える。これにより、該微生物がプロテアーゼ産生能を有すると判断された微生物コロニーを釣菌した。
−タンパク質含有寒天培地の組成（ｐＨ８．０）−
［１．５質量％寒天溶液（下層）］
・ディフコ マリンアガー ５．５１質量％
［０．８質量％寒天と１．５質量％スキムミルク溶液（上層）］
・ディフコ マリンアガー ０．８質量％
・スキムミルク １．５質量％

【0077】

前記集積培養により選抜され、プロテアーゼ活性が高かった神奈川県海洋底泥土壌由来の微生物１種を、１０４−１−３−１株とし、以下の試験に用いた。１０４−１−３−１株の光学顕微鏡写真を図１に示す。

【0078】

（試験例２：微生物の同定）
＜１６Ｓ ｒＤＮＡ−Ｆｕｌｌ解析及び分子系統解析＞
１０４−１−３−１株を培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ、英国ハンプシャー州、Ｏｘｏｉｄ製）にて、３０℃で２４時間、好気培養した。
培養した１０４−１−３−１株らＤＮＡ抽出キット（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いてＤＡＮを抽出し、Ｐｒｉｍｅ ＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＰＣＲを行った。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型とし、プライマーとして、９Ｆ、３３９Ｆ、７８５Ｆ、１０９９Ｆ、５３６Ｒ、８０２Ｒ、１２４２Ｒ、及び１５１０Ｒ（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、シークエンス（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を行った。
解析は、解析ソフトウェア（Ａｕｔｏ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、及び、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ、日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製）を用いて行った。
また、相同性検索を、細菌基準株データベース（テクノスルガ・ラボ）及び国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）を用いて行った。

【0079】

ＢＬＡＳＴを用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、下記表１に示すように１０４−１−３−１株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示し、中でもＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＡＭ１２１１８株の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した（相同率９９％）。
また国際塩基配列データベースに対する相同性検索の結果においても、下記表２に示すように１０４−１−３−１株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の１６Ｓ ｒＤＮＡに対し高い相同性を示した。

【0080】

【表1】

【0081】

【表2】

【0082】

１０４−１−３−１株は、下記表３に示すＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの亜種であり、これらとクラスターを形成し非常に近縁なＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｓｐｉｚｉｚｅｎｉｉを含めた８種１亜種と比較的近縁な２種（アウトグループ）の基準株由来の１６Ｓ ｒＤＮＡを取得し分子系統解析を行った。ここで、株名の末尾のＴは、その種の基準株（Ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）であることを示す。

【0083】

【表3】

【0084】

更に、表３に示す基準株の塩基配列を用いてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２， ｐｐ．４６７３−４６８０）にてアライメントを作成し、ＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１（Ｓ．Ｋｕｍａｒ， Ｋ． ２００４， Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ５， ｐｐ．１５０−１６３）の系統樹作成ソフトを用いて図２に示す系統樹を作成した。系統樹の推定には近隣結合法（Ｎ．Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｍ．Ｎｅｉ， １９８７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ４， ｐｐ．４０６−４２５）を用い、図２の各枝に示す数値で表される各系統枝の信頼度はブートストラップ法（Ｊ．Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ， １９８５， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ３９， ７８３−７９１）により評価した。
その結果、図２に示すように、１０４−１−３−１株の１６Ｓ ｒＤＮＡはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの１６Ｓ ｒＤＮＡと系統枝を形成し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに属することが推定された。

【0085】

＜形態観察及び生理・生化学的性状試験＞
１０４−１−３−１株を培地（ニュートリエントアガー、ベクトンデッキンソン社製）にて３０℃で２４時間培養した。
培養した１０４−１−３−１株をグラム染色（フェイバーＧ、日水製薬株式会社製）し、光学顕微鏡（ＢＸ５０Ｆ４、オリンパス株式会社製）で形態観察及びグラム染色観察を行った。
また、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）等の生理・生化学試験を、ＡＰＩ５０ＣＨ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ製）を用いて行った。

【0086】

形態観察及び生理・生化学的性状試験の結果を下記表４〜６に示す。表４〜６において、「＋」は陽性、「−」は陰性であることを示す。
下記表４に示すように、１０４−１−３−１株は好気条件下で生育するグラム陽性桿菌で、細胞は連鎖を示し、芽胞を形成した。芽胞による菌体の膨張は認められなかった。カタラーゼ反応は陽性、オキシダーゼ反応は陰性を示した。
また、下記表５〜６に示すようにＡＰＩ試験では、Ｌ−アラビノース、リボース、及びグルコース等を酸化し、エリスリトール、Ｄ−アラビノース及びＬ−キシロース等を酸化しなかった。更に、下記表４に示すように、嫌気条件下では生育せず、５０℃及び１０％ＮａＣｌ含有培地で生育した。カゼインを加水分解し、でんぷんを加水分解しなかった。

【0087】

【表4】

【0088】

【表5】

【0089】

【表6】

【0090】

これらの性状は、１６Ｓ ｒＤＮＡ解析及び分子系統解析で１０４−１−３−１株が帰属を推定されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓに類似する点が認められたが、アルブチン、サリシン、セロビオース、でんぷん、及びグリコーゲンを酸化しないことで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの典型性状と相違した。以上のことから、１０４−１−３−１株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の中の新たな株であることが推定された。

【0091】

なお、１０４−１−３−１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号（郵便番号２９２−０８１８））に、２００８年１１月２１日に受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−６８０として受託されている。

【0092】

（試験例３：１０４−１−３−１株の培養温度のプロテアーゼ活性に対する影響）
１０４−１−３−１株を２．５質量％大豆脱脂成分（製品名：トーストソーヤ、日清オイリオ株式会社製）、６．０質量％スクロース（和光純薬工業株式会社製）、０．１質量％リン酸水素カリウム（和光純薬工業株式会社製）、及び０．２％炭酸カルシウム（和光純薬工業株式会社製）を含むｐＨ６．２の液体培地に添加し、２７℃、３０℃、３５℃、及び４０℃でそれぞれ振盪培養した。培養開始から、０時間、２４時間、４１時間、及び６５時間経過後に１０４−１−３−１株の菌体を遠心分離して除去し、菌体外に産生されたプロテアーゼ含有培養上清のプロテアーゼ活性を、Ｃ．Ｅ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｌｏｒａ Ｌ．Ｃｈｅｎ， “Ｔｈｅ Ｌｏｗｒｙ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （１９６５）， １０， １７５−１７７．に記載の方法を改変した方法、即ち、下記の方法により定量した。

【0093】

試験管（１８ｍｍ×１８０ｍｍ）に２質量％ミルクカゼイン溶液５ｍＬを採り、４０℃の恒温槽中で３分間保温した。次に２質量％ミルクカゼイン溶液が４０℃になったところで、前記１０４−１−３−１株の培養上清をそれぞれ１ｍＬ添加した。これを４０℃で１０分間反応後、タンパク質沈澱剤（酢酸１９．５ｍＬ、酢酸ナトリウム（無水）（和光純薬工業株式会社製）１８ｇ、及びトリクロロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）１８ｇをそれぞれ３００ｍＬの蒸留水に溶解後、混合して全量を１，０００ｍＬとした。）５ｍＬを入れて反応を停止させた。反応停止後、反応液をそのまま３０分間、恒温槽中で４０℃に保持した後、濾紙Ｎｏ．２（アドバンテック株式会社製）にて自然濾過をした。次に、この濾液２ｍＬを別の試験管に採り、ここへ０．５Ｍ炭酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社製）溶液５ｍＬを添加し、３倍希釈のフォーリン試薬（製品名：フェノール試液、ナカライテスク株式会社製）１ｍＬを添加して混合した。混合後、４０℃で３０分間恒温槽中にて保温した。３０分間経過後、直ちに分光光度計を用い６６０ｎｍの波長で吸光値を測定し、この値をＴとした。
また、盲検値（ブランク）は、前記１０４−１−３−１株の培養上清のプロテアーゼ活性測定において、前記１０４−１−３−１株の培養上清を添加せず、４０℃に保温した２質量％ミルクカゼイン溶液５ｍＬに前記タンパク質沈澱剤５ｍＬを添加して充分に混合した後、前記液体培地（ｐＨ６．２）を１ｍＬ添加したこと以外は、前記１０４−１−３−１株の培養上清のプロテアーゼ活性測定と同様の操作を行い、吸光値を測定した。この盲検値をＢとした。
前記１０４−１−３−１株の培養上清の吸光値（Ｔ）と盲検値（Ｂ）とから、下記式１によりプロテアーゼ活性を算出した。このように算出される活性の単位を「ＦＬＶ」とする（Ｃ．Ｅ．ＭｃＤｏｎａｌｄ ａｎｄ Ｌｏｒａ Ｌ．Ｃｈｅｎ， “Ｔｈｅ Ｌｏｗｒｙ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， （１９６５）， １０， １７５−１７７．参照）。
プロテアーゼ活性（ＦＬＶ）＝［（Ｔ−Ｂ）×６６．７＋２］×培養上清希釈倍率 ・・・（式１）

【0094】

結果を図３に示す。なお、それぞれの温度での１０４−１−３−１株由来プロテアーゼ活性の測定は３回行い、グラフ中のプロットは、平均値±標準偏差を示す。
図３の結果から、１０４−１−３−１株は３０℃で培養したときに、最もプロテアーゼが多く産生され、したがって、最も高いプロテアーゼ活性を示すことが観察された。また、培養時間が長いほど高いプロテアーゼ活性が認められた。

【0095】

（試験例４：プロテアーゼの至適温度の検討）
１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この１０４−１−３−１株の培養上清を、４０℃、４３℃、４７℃、５０℃、及び５３℃で、０時間、１時間、２時間、及び３時間それぞれ加熱し、急冷した。
試験例３において、１０４−１−３−１株の培養上清を、試験例３で調製したものに代えて、試験例４で調製した各培養上清を用い、ミルクカゼインと培養上清との反応温度を４０℃に変えて、前記培養上清の加熱温度に対応した温度（４０℃、４３℃、４７℃、５０℃、及び５３℃）にしたこと以外は、実施例２と同様の方法でプロテアーゼ活性を測定した。

【0096】

結果を図４に示す。図４の結果から、４０℃〜５３℃の温度範囲でそれぞれの温度での保温時間が０時間の場合、加熱温度が高いほどプロテアーゼ活性が高く、例えば、４０℃で加熱した場合のプロテアーゼ活性は、５３℃で加熱した場合のプロテアーゼ活性の約半分の活性だった。また、プロテアーゼの加熱温度が高いほど３時間後の酵素活性低下の減少が速いことがわかった。

【0097】

（試験例５：ｐＨ安定性の検討）
１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この前記１０４−１−３−１株の培養上清に、等量の緩衝液を混合してｐＨを３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２にそれぞれ調整（ｐＨ３〜６は、５０ｍＭ クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液、ｐＨ１０〜１２は、５０ｍＭ グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液で調整）した後、１０℃で２４時間保温した後、溶液のｐＨを７に調整した。
試験例３において、１０４−１−３−１株の培養上清を、試験例３で調製したものに代えて、試験例５で調製した各培養上清を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法でプロテアーゼ活性を測定した。

【0098】

結果を図５に示す。図５の結果から、１０４−１−３−１株由来プロテアーゼは、ｐＨ７で最も安定であることがわかった。強酸側では極端に活性が低下したが、強アルカリ側ではｐＨ７の１５％ほど活性が残存していた。

【0099】

（試験例６：プロテアーゼの凍結乾燥安定性）
１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、プロテアーゼ含有培養上清を得た。この１０４−１−３−１株の培養上清８Ｌを用い、バーチス社製の凍結乾燥機を用いて凍結乾燥した。凍結乾燥粉末を粉砕後、０．１ｍｇの粉末を５ｍＬのリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）に溶解して一昼夜４℃で保存した。この粉末溶解液のプロテアーゼ活性を、試験例３と同様の方法で測定し、凍結乾燥前のプロテアーゼ活性と比較した。プロテアーゼ活性は、培養上清１０Ｌあたりの活性として換算した。

【0100】

結果を図６に示す。図６の結果から、１０４−１−３−１株由来プロテアーゼは、凍結乾燥後でもほとんど活性が低下せず、溶液の態様より体積が少ない粉末の態様で、該プロテアーゼを保存できることがわかった。

【0101】

（試験例７：１０４−１−３−１株由来プロテアーゼの繊維素（血栓）溶解活性の検討） 試験例６において、凍結乾燥前に、プロテアーゼの含有培養上清をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）で透析後、試験例６と同様の方法で凍結乾燥し、得られた粉末を粉砕した粗精製プロテアーゼ０．１ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）５ｍＬに溶解したものを用いて、難分解性タンパク質である繊維素（フィブリン）を基質として溶解活性について検討した。
また、セリン血栓溶解酵素であるサチライシンＡ（ＥＣ３．４．２１．１４、エムピーバイオメディカル社製（ＵＳＡ））、セリン血栓溶解酵素であるトリプシン（ＥＣ３．４．２１．４、和光純薬工業株式会社製）、システイン血栓溶解酵素であるフィチン（ＥＣ３．４．２２．３、エムピーバイオメディカル社製（ＵＳＡ））、及びメタロ血栓溶解酵素であるＶ型コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３、和光純薬工業株式会社製）を用いた。なお、これらの血栓溶解酵素無添加を対照区として用いた。

【0102】

＜酵素溶液の調製＞
前記粗精製プロテアーゼ溶液の酵素活性（ＦＬＶ）を試験例３と同様の方法を測定したところ、酵素活性（ＦＬＶ）は１１１であった。
前記粗精製プロテアーゼ溶液の酵素活性（ＦＬＶ＝１１１）と、前記各種プロテアーゼの酵素活性とが同一の条件となるようにするため、カゼインに対する各種プロテアーゼの酵素活性を比較検討した。
試験例３において、プロテアーゼとして前記各種プロテアーゼを下記に示す濃度で用い、試験例３と同様の方法で、酵素活性の測定及び評価を行った。下記に示すように、各種プロテアーゼの段階希釈液を調製し、それぞれのプロテアーゼ濃度における酵素活性の検量線を作成した。これによりそれぞれの濃度におけるカゼインを基質とした酵素活性を測定した検量線から、任意の酵素活性を示すときの各種プロテアーゼ濃度が計算によって求められる。検量線を図７Ａ〜Ｄに示す。
［酵素の種類及び濃度］
・サチライシンＡ：０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１５ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３ｍｇ／ｍＬ
・トリプシン：０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ
・Ｖ型コラゲナーゼ：０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ
・フィチン：０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ

【0103】

＜フィブリン含有固形培地の調製＞
フィブリン含有固形培地は下記組成に従い、以下の方法で調製した。下層を９ｃｍプレートに分注し、固化した。次いで、１０ユニットのトロンビン（伊藤ライフサイエンス株式会社製）、０．０２Ｍ塩化カルシウム、０．０５Ｍホウ砂緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍＬを前記プレートに分注し、更に溶解したアガロース溶液、及びフィブリノゲン溶液を同時に分注して、前記固形培地を調製した。
−フィブリン含有固形培地の組成−
［１．５質量％寒天（下層）］
・ディフコ 寒天（ディフコ社製） １．５質量％
［２質量％アガロース、及び０．６質量％フィブリン（上層）］
・アガロース（蒸留水に溶解） ２．０質量％
・フィブリノゲン（０．０５Ｍホウ砂緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解、伊藤ライフサイエンス株式会社製） ０．６質量％

【0104】

＜繊維素溶解活性の測定＞
前記フィブリン含有固形培地の上層の上に直径８ｍｍ（８ｍｍ厚、ペーパーディスク抗生物質検定用、東洋濾紙株式会社製）を置き、プロテアーゼ活性（ＦＬＶ）が１１１となるように調製した各種プロテアーゼ液８０μＬを浸含させ、３７℃で一昼夜静置後、消化円（繊維素の溶解円）直径を測定した。

【0105】

結果を図８に示す。これらの結果、１０４−１−３−１株由来プロテアーゼ（図８の「Ｎ」）は、明確な消化円が観察され、血栓溶解活性を有する血栓溶解酵素であることが確認された。
なお、対象区のトリプシン（図８の「Ｔ」）では消化円が観察されたが、サチライシンＡ（図８の「Ｓ」）、Ｖ型コラゲナーゼ（図８の「Ｃ」）、フィチン（図８の「Ｆ」）では、全く消化円は認められなかった。
したがって、１０４−１−３−１株由来の血栓溶解酵素は、フィブリンのような難分解性タンパク質の分解において固有の基質分解性を有することがわかった。

【0106】

（試験例８：血栓溶解酵素の精製）
前記１０４−１−３−１株の培養上清中の血栓溶解酵素は、以下の方法により精製した。最初に、１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、血栓溶解酵素含有培養上清を得た。この１０４−１−３−１株の培養上清から血栓溶解酵素含有画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーで分画し、次にゲル濾過クロマトグラフィーで脱塩を行った。脱塩した血栓溶解酵素含有画分は密度勾配等電点電気泳動で精製した。

【0107】

＜疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分画＞
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、以下の条件下で行った。
カラム：プレパックカラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐ １６／１０ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ ｈｉｇｈ、バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）
装置：ＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗシステム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）
溶媒：Ａ液 ３０容量％ ２−プロパノール＋０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７） Ｂ液 １Ｍ 硫酸アンモニウム＋０．０５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７）
添加量：１ｍＬ
流速：２ｍＬ／分間

【0108】

図９に、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーのクロマトグラム及び硫酸アンモニウム濃度変化を示す。図９のクロマトグラムにおける全画分を回収した。
試験例３において、試験例３で調製した１０４−１−３−１株の培養上清に代えて、前記画分を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法で血栓溶解酵素活性を測定した。
その結果、図９中矢印で示すピーク画分（画分３９〜画分４３）において、血栓溶解酵素活性が確認された。

【0109】

＜ゲル濾過クロマトグラフィーによる脱塩＞
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーで、血栓溶解酵素活性が確認された画分は、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）で脱塩し、以下に示す密度勾配等電点電気泳動で精製した。

【0110】

＜密度勾配等電点電気泳動による精製＞
両性担体（４０％濃度）は、Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ（３／１０及び７／９）（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）を用い、グリセリン密度勾配等電点電気泳動装置（カラム容量９０ｍＬ、Ｎ−１７２０型、日本エイドー株式会社製）で血栓溶解酵素活性画分の分画を行った。電圧は６００Ｖに設定し、７２時間電気泳動を行った。５０質量％ショ糖で密度勾配をかけた。
試験例３において、試験例３で調製した１０４−１−３−１株の培養上清に代えて、前記密度勾配等電点電気泳動の各画分を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法で血栓溶解酵素活性を測定した。また、各画分のｐＨの測定を行った。

【0111】

図１０に前記密度勾配等電点電気泳動のクロマトグラム及びｐＨ測定の結果を示す。図１０に示した、最も血栓溶解酵素活性が高かった画分（画分３５）の等電点は８．７であった。これは、１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素の等電点を示す。

【0112】

＜血栓溶解酵素の分子量の確認＞
前記画分（画分３５）のタンパク質成分５０ｎｇを、ジチオエリトリトールを含むレムリ緩衝液（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール、２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１Ｍジチオエリトリトール、０．０２％ブロモフェノールブルー）１３μＬに混和して９５℃にて３分間処理した後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下にてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルのアクリルアミド濃度は、濃縮に４質量％、分離に１０質量％で行い、それぞれ１０ｍＡ、２５ｍＡの定電流条件下で泳動した。泳動後のポリアクリルアミドゲルは、固定液（４０容量％エタノール＋１０容量％酢酸）で固定した後、Ｆｌａｍｉｎｇｏゲルステイン（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）により蛍光染色し、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔトランスイルミネーター（フナコシ株式会社製）を用いてＵＶ励起下にて観察した。

【0113】

結果を図１１に示す。図１１より、前記画分（画分３５）のタンパク質成分から、単一のバンドが得られた（図１１に矢印で示す）。得られた単一バンドの相対分子質量は、標準タンパク質試料（マーカー、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、バイオラッド社製）との泳動度を比較することにより約２７，０００Ｄａと推定された。

【0114】

（試験例９：血栓溶解酵素の同定）
試験例８における電気泳動後のポリアクリルアミドゲル中の１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素の単一バンドを切り出し、超純水にて洗浄した。ゲル中の酵素は還元アルキル化処理の後、トリプシンを用いて３７℃にて消化し、ペプチド溶液を調製した。

【0115】

前記調製したペプチド溶液は、下記条件にて逆相クロマトグラフィーにより分離した。
［逆相クロマトグラフィー］
カラム：Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ＡＱ（粒子径３μｍ、孔径２００Å、カラム内径２００μｍ、カラム長さ５０ｍｍ：ミクローム・バイオリソース社製）
オートサンプラー：ＣＴＣ−ＨＴＳ ＰＡＬ（エーエムアール株式会社製）
ポンプ：Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭＳ４システム（エーエムアール株式会社製）
溶媒：Ａ液 ２容量％アセトニトリル／９８容量％超純水（０．１容量％ギ酸を含む） Ｂ液 ９０容量％アセトニトリル／１０容量％超純水（０．１容量％ギ酸を含む）
流速：２μＬ／分間
濃度勾配：９５容量％Ａ液＋５容量％Ｂ液から５５容量％Ａ液＋４５容量％Ｂ液の条件で２０分間かけて、溶出した。

【0116】

前記逆相クロマトグラフィーにより分離したペプチドは、ナノスプレーイオン化法によりイオン化し、質量分析計（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）にて個々のペプチド（プリカーサーイオン）のｍ／ｚを測定した。更に、ペプチドの内部配列情報を得るために、コリジョンセル内にてペプチドにヘリウムガスを衝突させ、分解生成したプロダクトイオンのｍ／ｚを測定した（ＭＳ／ＭＳ分析）。

【0117】

図１２にクロマトグラムを示す。図１２の結果から、液体クロマトグラフィーによりペプチドが良好に分離されたとともに、ＭＳ／ＭＳ分析が十分に行われたことが確認された。質量分析計により得られた測定値から、２種類のデータベース検索エンジンＭａｓｃｏｔ（マトリックスサイエンス株式会社製）、及びＳＥＱＵＥＳＴ（ＢｉｏＷｏｒｋｓソフトウェア、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製）を用いたＭＳ／ＭＳ ｉｏｎ ｓｅａｒｃｈ法により血栓溶解酵素を同定した。

【0118】

前記データベース検索の結果から、１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素は、サチライシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）に属する酵素であると同定された。前記質量分析にて検出されたペプチドは、ＳＥＱＵＥＳＴ検索では、前駆体サチライシンの全アミノ酸配列の３１．８％を占めていた。一方、Ｍａｓｃｏｔ検索では、前駆体サチライシンのアミノ酸配列の４８％、活性型サチライシンのアミノ酸配列の３０％を占めていた。

【0119】

（試験例１０：血栓溶解酵素遺伝子の塩基配列の決定）
前記１０４−１−３−１株からＩＳＯＰＬＡＮＴキット（株式会社ニッポンジーン製）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素の遺伝子を増幅させるため、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ内に登録されている複数の近縁菌種に由来するサチライシン遺伝子（アクセッション番号：ＮＣ＿０００９６４、Ｓ５１９０９、Ｄ００２６４、Ｍ６４７４３）の上下流の塩基配列から、以下のＰＣＲプライマーを設計した。即ち、サチライシン遺伝子の上流にある遺伝子内の２０ｂｐにハイブリダイズする下記配列番号：１で表されるプライマー配列と、下流にある遺伝子内の２０ｂｐにハイブリダイズする下記配列番号：２で表されるプライマー配列とを増幅用プライマーとした。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いたＰＣＲの条件としては、９４℃で２分間、続いて、９４℃で１５秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング及び６８℃で２分間の伸長を３０サイクル行った。期待された大きさのＰＣＲ産物（〜１，８００ｂｐ）を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター（プロメガ株式会社製）にクローニングした。
５’−ＡＧＣＣＡＴＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡ−３’ （配列番号：１）
５’−ＴＡＡＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＡＴＴＧＧＴＴ−３’ （配列番号：２）

【0120】

前記ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター内のｐＵＣ／Ｍ１３シークエンシングプライマー（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を用いて、前記クローン化した１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素の遺伝子の塩基配列のシークエンシングを行い、決定した（株式会社バイオマトリックス研究所委託）。決定した塩基配列をアミノ酸配列（配列番号：３）に翻訳し、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰを用いてホモロジー検索を行った。

【0121】

前記ホモロジー検索の結果から、１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素を構成するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ内に登録されているナットウキナーゼ遺伝子（アクセッション番号：Ｐ３５８３５）のアミノ酸配列と１００％の同一性を示した。このことから、１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素はナットウキナーゼと同定された。

【0122】

前記遺伝子解析の結果、１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素は、２７５のアミノ酸から構成され、相対分子質量が２７．７であり、バチルス属微生物が産生する細胞外セリン血栓溶解酵素、サチライシンＥと９９．５％、サチライシンＡｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓと９９．３％の相同性を示す（Ｔ． Ｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ， ２７， ２４６９０−２４６９６参照）。以上の試験例において、同定された１０４−１−３−１株由来血栓溶解酵素を、ナットウキナーゼと称することがある。

【0123】

（試験例１１：クラゲ類の分解試験）
１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、ナットウキナーゼ含有培養上清（ｐＨ７．２）を得た。この培養上清中のナットウキナーゼの酵素活性を、試験例３と同様の方法で測定したところ、酵素活性（ＦＬＶ）は６，５００であった。

【0124】

＜エチゼンクラゲの分解＞
クラゲは、京都府舞鶴市の定置網で捕獲したエチゼンクラゲ（Ｎｅｍｏｐｉｌｅｍａ ｎｏｍｕｒａｉ Ｋｉｓｈｉｎｏｕｙｅ）個体を使用した。エチゼンクラゲをドライアイスで凍結し輸送後、−２０℃で保管した。分解試験時には流水で解凍し、５ｃｍ〜１０ｃｍ角に切断した。
ホットスターラー上にビーカーを設置し、ビーカー内に２Ｌの前記ナットウキナーゼ含有培養上清を入れ、５０℃に加温し、エチゼンクラゲ３００ｇを入れた１ｍｍメッシュ籠をビーカー内に入れ、常時低速（８０ｒｐｍ）で攪拌しながら分解試験を行った。エチゼンクラゲを培養上清中に入れてから、５分間、１０分間、３０分間、及び６０分間後に、それぞれエチゼンクラゲの質量を測定し、下記式２により残渣率を求めた。各時間エチゼンクラゲと培養上清とを反応させたサンプルについて、それぞれ４系統で行い、平均と標準偏差を求めた（以下、「試験区」と称することがある。）。
対照区としては、５０℃に加温した水道水を用いた。試験区においてエチゼンクラゲ分解に供した培養上清は淡水であるため、対照区も同様に海水を用いず淡水（水道水）を用いた。なお、エチゼンクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で３回行い、再現性を確認した。
残渣率（％）＝｛（分解前クラゲ質量−分解後クラゲ質量）／分解前クラゲ質量｝×１００ ・・・（式２）

【0125】

エチゼンクラゲ分解試験の結果を図１３に示す。図１３の結果から、ナットウキナーゼ含有培養上清を添加した試験区は、エチゼンクラゲを１時間以内で完全に分解することができた。これに対して対照区では、０分間の残渣率と、６０分間の残渣率とを比較すると、分解できた割合は５０％程度であった。
また、エチゼンクラゲ個体の皮の部分は分解されにくく、分解試験開始後３０分間からは分解されにくい皮状の部分が残存したため、残渣率は低かった。しかし、その他の部分については、開始後約３０分以内に完全に分解され、溶解液となった。
以上の結果から、クラゲをナットウキナーゼにより分解することにより、陸揚げされて産業廃棄物となっているクラゲ個体を最小限のエネルギーで短時間に分解できることがわかった。

【0126】

＜ミズクラゲの分解＞
−完全個体の分解−
前記ナットウキナーゼ含有培養上清１００ｍＬと、リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）１００ｍＬとを３００ｍＬ容ビーカーに混合し、これに新鮮なミズクラゲ（Ａｕｒｅｌｉａ ａｕｒｉｔａ、傘径：約１４ｃｍ〜１７ｃｍ）３個体（完全個体）をそれぞれ別のビーカーに入れて３０℃で静置し、クラゲ形態の消失を目視観察した。
その結果、いずれの個体も約２時間（１０５分間±８分間）でクラゲは完全に分解され、液状となった。なお、すべてのミズクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で３回行い、再現性を確認した。

【0127】

−裁断個体の分解−
前記ミズクラゲ完全個体の分解において、ミズクラゲの完全個体に代えて、ミズクラゲを約３ｃｍ角に裁断したもの１００ｇを使用したこと以外は、前記ミズクラゲ完全個体の分解と同一条件で分解試験を行った。
その結果、裁断したミズクラゲは、約６５分間で完全に分解され液状となった。

【0128】

−対照区−
前記ミズクラゲ完全個体の分解において、前記ナットウキナーゼ含有培養上清とリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）とを混合した溶液に代えて、前記ナットウキナーゼ含有培養上清とリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）とを混合した溶液を、１２１℃、３０分間のオートクレーブ処理によりナットウキナーゼを失活させた混合溶液を使用したこと以外は、前記ミズクラゲ完全個体の分解と同一条件で分解試験を行った。
その結果、前記対照区ではミズクラゲの分解は観察されなかった。

【0129】

（試験例１２：クラゲ類の分解におけるナットウキナーゼ濃度の検討）
１０４−１−３−１株を試験例３と同じ液体培地（ｐＨ６．２）に添加し、３０℃で７２時間培養後、菌体を遠心分離して、ナットウキナーゼ含有培養上清（ｐＨ７．２）を得た。この培養上清中のナットウキナーゼの酵素活性（ＦＬＶ）を、試験例３と同様の方法で測定したところ５，０００であった。
クラゲは、前記エチゼンクラゲと同様に身が厚くて硬い北方性のアカクラゲ（Ｃｈｒｙｓａｏｒａ ｈｙｓｏｃｅｌｌａ）を捕獲後、ドライアイスで凍結し輸送後、−２０℃で保管した。分解試験時には流水で解凍し、５ｃｍ〜１０ｃｍ角に切断した。

【0130】

５Ｌ容ビーカーに３Ｌの水を入れ、ホットスターラーで４７℃に加熱した。加熱後、ナットウキナーゼ含有培養上清の濃度が、０体積％、０．２体積％、０．５体積％、１．０体積％となるように４区に分けたビーカーに、前記切断した北方性アカクラゲをそれぞれ１．４ｋｇずつ投入し、直ちに所定の濃度になるように培養液を混合し、４７℃に維持し、マグネットスターラーで北方性アカクラゲ混合液を攪拌しながら反応させた。２時間経過後、北方性アカクラゲ残渣の質量を測定し、前記式２を用いて投入した北方性アカクラゲ質量に対する残渣率を算出して北方性アカクラゲを２時間以内で溶解する最小の培養上清濃度を求めた。

【0131】

結果を図１４に示す。ナットウキナーゼ含有培養上清を入れなくても加熱するだけで、分解開始２時間後に約８６％減量（残渣 約１４％）することができた。これは加熱によりクラゲに脱水と熱変性が生じたためと推測された。しかし、加熱のみでは前記培養上清を投入したときのように、完全に（１００％）分解されることはなく、熱によって変性したと考えられる固形物が残存した。
これに対し、培養上清濃度が１．０体積％の場合、試験開始後１時間程でほとんどの北方性アカクラゲが溶解し、２時間後には完全に溶解した。

【0132】

（試験例１３：最適条件下におけるミズクラゲの分解）
試験例１１に記載した３ｃｍ角に切断したミズクラゲ１００ｇを５００ｍＬ容ビーカーに入れ、５０℃に保温した人工海水（ダイゴ人工海水ＳＰ、日本製薬株式会社製）を３００ｍＬ入れた。これに試験例１１で調製したナットウキナーゼ含有培養上清の酵素活性（ＦＬＶ）が１００になるように混合し、攪拌しながら分解試験を行った。ミズクラゲの分解時の温度は５０℃、ｐＨ８とした。所定時間ごとにミズクラゲを取り出してその質量変化を測定し、試験例１１の式２より残渣率を算出した（以下、「試験区」と称することがある。）。
また、対照区としては、ナットウキナーゼ含有培養上清に代えて、５０℃に保温した人工海水を用いた。なお、ミズクラゲ分解試験は、それぞれ同一条件で３回行い、再現性を確認した。

【0133】

結果を図１５に示す。グラフ中のプロットは平均値±標準偏差を示している。図１５の結果、ナットウキナーゼを混合しなかった対照区は、３０分間経過後において、約４０％のミズクラゲが残存していた。
これに対し、ナットウキナーゼを添加した試験区は、１５分間以内で完全にミズクラゲが溶解され液状となった。

【0134】

（試験例１４：クラゲ分解廃液の急性毒性試験）
試験例１１において、ナットウキナーゼ含有培養上清を用いて分解したエチゼンクラゲ分解液の毒性をＪＩＳ Ｋ０１０２（２００３）「工場排水試験方法」（日本規格協会 ２００３）魚類を用いた急性毒性試験に従い検討を行った。発電所から排出される排水の排水基準値は、事業所によっても異なるが、ＣＯＤ値（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｏｘｙｇｅｎ Ｄｅｍａｎｄ；化学的酸素要求量）として１５ｍｇ／Ｌ以下である。
ナットウキナーゼ含有分解処理後の分解液のＣＯＤ値を日本工業規格（ＪＩＳ）に準拠したポータブル吸光光度計（ＤＲ−２４００、ＨＡＣＨ社製）により測定したところ、１，９２０ｍｇ／Ｌであった。これを海水で、ＣＯＤ値１５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、及び７５ｍｇ／Ｌにそれぞれ希釈して試験液とした。供試生物としては、ヒメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）を用いた。対照は、エチゼンクラゲ分解処理液を混合しない海水とした。

【0135】

室温２０℃〜２２℃の実験室に５Ｌ容量の飼育水槽を設置し、上記試験液中にヒメダカ１０個体をそれぞれ収容した。この条件下で９６時間飼育し、２４時間毎に観察して生死個体数を数えた。

【0136】

ヒメダカに対する急性毒性を測定した結果を下記表７に示す。４日間（９６時間）にわたって対照区も試験区もヒメダカの死亡は確認されなかった。したがって、希釈したエチゼンクラゲ個体の分解液には毒性が認められないものと判断した。

【0137】

【表7】

【0138】

（試験例１５：ナットウキナーゼとその他のプロテアーゼとの比較）
＜酵素溶液の調製＞ ナットウキナーゼは、試験例６において、凍結乾燥前に、ナットウキナーゼ含有培養上清をリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）で透析後、試験例６と同様の方法で凍結乾燥し、得られた粉末を粉砕した粗精製ナットウキナーゼ０．１ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）５ｍＬに溶解したものを用いた。このナットウキナーゼ溶液の酵素活性（ＦＬＶ）を試験例３と同様の方法を測定したところ、１４，９５２であった。
その他のプロテアーゼとしては、試験例７で使用した、サチライシンＡ、トリプシン、フィチン、及びＶ型コラゲナーゼを用いた。なお、これらのプロテアーゼを添加しなかったものを対照区とした。
前記ナットウキナーゼの活性と、前記各種プロテアーゼの活性とが同一の条件となるようにするため、試験例１５と同様の方法で、検量線法により前記各種プロテアーゼの活性（ＦＬＶ）が１００となるように調製した。

【0139】

２００ｍＬ容ビーカーに人工海水（ダイゴ人工海水ＳＰ、日本製薬株式会社製）１００ｍＬを入れ、前記調製した各種プロテアーゼを混合し、３ｃｍ角に切断したミズクラゲを１個（約２０ｇ）浸漬し、３７℃で保温した。これを攪拌せず静置状態で所定の時間毎にクラゲブロック残渣を取り出して質量を測定し、投入したミズクラゲ質量に対する残渣（質量％）を算出した。すべてのミズクラゲブロック分解試験は、それぞれ同一条件で３回行い、再現性を確認した。

【0140】

結果を図１６Ａ〜Ｆに示す。人工海水中に浸漬しただけの対照区では、５時間経過後も約６５質量％の組織が溶解せず残存していた（図１６Ａ）。これに対し、ナットウキナーゼでは浸漬開始から１時間後に残渣が約２０％となり、２時間後には完全にミズクラゲが消失していた（図１６Ｂ）。ナットウキナーゼと同じセリンプロテアーゼに属するサチライシンＡ及びトリプシンでは、２時間経過後も１０％〜２０％のミズクラゲが未溶解であった（図１６Ｃ及びＤ）。植物由来システインプロテアーゼであるフィチンは、対照区と同様にほとんどミズクラゲを減量することができなかった（図１６Ｅ）。Ｖ型コラゲナーゼ試験区では、５時間経過後になってから完全なミズクラゲの溶解が観察された（図１６Ｆ）。
これらの結果より、ナットウキナーゼは、プロテアーゼの中でも、クラゲの分解に優れた活性を示すことが確認された。

【0141】

（試験例１６：ナットウキナーゼによるアンドンクラゲ毒素タンパク質の失活の検討）
アンドンクラゲ（Ｃａｒｙｂｄｅａ ｒａｓｔｏｎｉ Ｈａａｃｋｅ）は、神奈川県の海岸で採取し、採取後直ちにビニール袋に入れドライアイスで凍結後持ち帰り、−８０℃下で実験に供するまで保管した。アンドンクラゲ毒素はクラゲ触手部分を解凍後、プラスチック容器に入れ、氷冷下で超音波破壊を行い、これをアンドンクラゲ毒素液（以下、「ＣｒＴＸｓ」と称することがある。）とした。
なお、以下の試験において使用した容器は、毒素液のガラス容器への不可逆的な吸着を防止するため、全てプラスチック容器を使用した。

【0142】

−溶血率の算出方法−
ヒツジ赤血球（日本生物材料センター製）８μＬを１ｍＬのＰＢＳ（＋）（カルシウム、マグネシウム含有リン酸緩衝食塩水）に懸濁し、ここへ、任意の量のアンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を添加して混合した。これを室温で４時間放置した後、３，０００×ｇで２分間遠心分離した。この上清を５５０ｎｍの波長で吸光値を測定して「試験値」とした。
また、８μＬのヒツジ赤血球を１００倍に希釈した溶解緩衝液（６質量％ドデシル硫酸ナトリウム、７質量％トリトンＸ−１００溶液）と混合し、これを室温で４時間放置した後、３，０００×ｇで２分間遠心分離した。この上清を５５０ｎｍの波長で吸光値を測定したときの吸光値を溶血率１００％とし、これを「対照値」とした。
前記方法で測定した試験値と、対照値から、下記式３により溶血率（％）を評価した。
溶血率（％）＝（試験値／対照値）×１００ ・・・（式３）

【0143】

＜ナットウキナーゼの赤血球溶血に対する影響の検討＞
ナットウキナーゼとしては、試験例１５で調製したナットウキナーゼを用いた。試験例２において、培養上清に代えて、試験例１５で調製したナットウキナーゼを用いたこと以外は、試験例３と同様の方法で酵素活性（ＦＬＶ）を算出したところ５，５６３であった。このナットウキナーゼを、ＰＢＳ（＋）（カルシウム、マグネシウム含有リン酸緩衝食塩水）で５体積％に希釈して、以下の試験に用いた。

【0144】

前記溶血率の算出方法において、試験値の算出時に、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）に代えて、前記希釈したナットウキナーゼを５０μＬ（アンドンクラゲ毒素液に対して５体積％）添加したこと以外は、前記溶血率の算出方法と同様の方法で前記（式３）により溶血率を算出した。

【0145】

結果を図１７に示す。ヒツジ赤血球に対する溶血率は、ナットウキナーゼ含有区で９．０％だった。ナットウキナーゼ非含有の対照区においては、７．１％だった。また、このときの酵素活性（ＦＬＶ）は、２７８．１５だった。
この結果から、５体積％、即ち酵素活性（ＦＬＶ）が２７８以下においてはナットウキナーゼが、ヒツジ赤血球の溶血を起こさないということがわかった。

【0146】

＜アンドンクラゲ毒素の赤血球溶血に対する影響の検討＞
前記溶血率の算出方法と同様の方法で、アンドンクラゲ毒素の赤血球溶血に対する影響について検討した。このとき、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）は、１μＬ、２μＬ、５μＬ、１０μＬ、５０μＬ、及び１００μＬのいずれかの容量となるように添加した。

【0147】

結果を図１８に示す。図１８より、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を含まない対照区では、溶血率が１４．３％であったが、これに対し、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を添加した全ての試験区において１００％の溶血率を示した。
また、顕微鏡観察下においても赤血球の形態は認められず、アンドンクラゲ毒素により溶血したものと考えられた。ただし、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）が０．１体積％量（１μＬ添加）の場合、他の試験区に比べて完全な溶血までに時間を要した。

【0148】

＜アンドンクラゲ毒素の熱安定性の検討＞
次に、アンドンクラゲ毒素の熱安定性について前記溶血率の算出方法と同様の方法を用いて検討した。
試験に用いたアンドンクラゲ毒素液としては、前記アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を、室温（２５℃）で３０分間放置、３７℃で３０分間、及び１００℃で５分間のいずれかの条件においたものを用い、それぞれ０．５体積％（５μＬ）又は１．０体積％（１０μＬ）となるように添加した。

【0149】

結果を図１９及び下記表８に示す。これらの結果より、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を含まない対照区では、溶血率が１４．０％であった。
アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を、室温又は３７℃で３０分間放置した試験区においては溶血率が９０％以上を示し、これらの温度条件下においては３０分間の加熱でアンドンクラゲ毒素は失活しないことがわかった。
一方、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を１００℃で５分間加熱した試験区においては、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）をいずれの容量で添加した場合も、その溶血率は１１．０％以下を示し、アンドンクラゲ毒素が加熱により変性し失活したことが示唆された。

【0150】

【表8】

【0151】

＜アンドンクラゲ毒素タンパク質の失活におけるナットウキナーゼ量の検討＞
前記溶血率の算出方法において、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を０．５体積％（５μＬ）となるように添加し、更に、前記ナットウキナーゼを０．１体積％（１μＬ）、０．５体積％（５μＬ）、１．０体積％（１０μＬ）、及び２．０体積％（２０μＬ）のいずれかの容量で混合し、３７℃で３０分間反応させた。
対照区としては、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）及びナットウキナーゼを添加しないものを用いた。

【0152】

結果を図２０及び下記表９に示す。図２０及び表９より、ナットウキナーゼ量が２．０体積％以上、即ちカゼインを基質としたときの酵素活性（ＦＬＶ）として１１１以上で、前記アンドンクラゲ毒素液を３７℃、３０分の定温放置条件下でほぼ完全に失活できることがわかった。

【0153】

【表9】

【0154】

（試験例１７：各種プロテアーゼによるアンドンクラゲ毒素タンパク質の失活の検討）
試験に用いるプロテアーゼとして、ナットウキナーゼ、サチライシンＡ、トリプシン、フィチン、及びＶ型コラゲナーゼを、試験例１５と同様の方法で、検量線法によりそれぞれ酵素活性（ＦＬＶ）が１１１となるように調製した。
前記溶血率の算出方法において、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）を２．０体積％となるように添加し、更に、前記各種プロテアーゼを、前記検量から、酵素活性（ＦＬＶ）が１１１となるように調製し、３７℃で３０分間反応させた。
対照区としては、アンドンクラゲ毒素液（ＣｒＴＸｓ）及びナットウキナーゼを添加しないものを用いた。

【0155】

結果を図２１及び下記表１０に示す。この結果、ナットウキナーゼ以外のプロテアーゼ（サチライシンＡ、トリプシン、Ｖ型コラゲナーゼ、フィチン）を用いた場合、アンドンクラゲ毒素の失活は、ほとんど認められなかった。一方、ナットウキナーゼを用いた場合、低い溶血率を示し、アンドンクラゲ毒素の顕著な失活が認められた。
このことからナットウキナーゼは、カゼイン分解を指標とした同値の酵素活性の条件下において、よりアンドンクラゲ毒素を分解する能力が高いことがわかった。

【0156】

【表10】

【産業上の利用可能性】

【0157】

本発明のバチルス属微生物は、血栓溶解酵素を効率よく産生することができることから、本発明の廃棄物の処理方法に好適に利用可能である。
前記廃棄物の処理方法は、前記廃棄物を、広大な場所を要することなく、簡便で迅速に、かつ完全に処理でき、該処理のための多大な熱エネルギーや電気エネルギーを要することがなく、安価に該廃棄物を減容化できると同時に、処理時の腐敗臭の発生を抑制でき、更に処理後の廃棄物の安全性が高いことから、種々のタンパク質を含む廃棄物の処理に好適に利用可能であり、特に発電所などの臨海産業、漁業分野等で混獲された海産廃棄物の処理、淡水系生物の廃棄物等の水産廃棄物の処理に好適に利用可能である。

【受託番号】

【0158】

ＮＩＴＥ Ｐ−６８０

【符号の説明】

【0159】

１０ 分解槽
２０ 仕切槽
３０ サイフォン管
４０ 送液ポンプ
５０ 循環・加温槽
６０ 仕切弁
７０ 仕切弁
８０ 加温管
９０ ヒーター
１００ オゾン発生装置
１１０ 仕切弁
１２０ 逆止弁
１３０ 仕切弁
１４０ 仕切弁
１５０ 活性炭処理筒
１６０ クラゲ分解処理水
１７０ サイフォン管通過処理液出口
１８０ 活性炭処理筒通過清浄排水

【図5】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]