特許 5717281 ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5717281

(24)【登録日】2015年3月27日

(45)【発行日】2015年5月13日

(54)【発明の名称】ダブルビオチンアンカー型リガンド固定化分子

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20150423BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20150423BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 U

   G01N33/543 525E

【請求項の数】2

【全頁数】26

(21)【出願番号】特願2011-28447(P2011-28447)

(22)【出願日】2011年2月14日

(65)【公開番号】特開2012-167987(P2012-167987A)

(43)【公開日】2012年9月6日

【審査請求日】2014年1月22日

(73)【特許権者】

【識別番号】504190548

【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100137512

【弁理士】

【氏名又は名称】奥原 康司

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 直人

(72)【発明者】

【氏名】松岡 浩司

(72)【発明者】

【氏名】土渕 晃司

(72)【発明者】

【氏名】幡野 健

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−１５７１０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１６２５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５３−３３／５４３

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の式（ＩＶ）で表される化合物と、式（Ｖ）で表される化合物を反応させ、式（Ｉ）のリガンド固定化分子を製造する方法。

【化1】

（式（Ｉ）中、Ｒ^１は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^２は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Ａは硫黄を表し、Ｂはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Ｗは以下の式（ＩＩ）、

【化2】

（式（ＩＩ）中、Ｅは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Ｒ^３は水素又は炭化水素鎖を表し、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Ｘはリガンドを表し、ｋは０又は１の数、ｌは０、１又は２の数、ｍは０又は１数を表し、ｍが０のとき、ｌは２である）を表す）

【化3】

（式（ＩＶ）中、Ｒ^１は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^２は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Ａは硫黄を表し、Ｂはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Ｙは、アセチル基又はハロゲン化アルキル基を表す）。

【化4】

（式（Ｖ）中、Ｅは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Ａは硫黄を表し、Ｒ^１は炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^３は水素又は炭化水素鎖を表し、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Ｘはリガンドを表し、ｋは０又は１の数、ｌは０、１又は２の数、ｍは０又は１数を表し、ｍが０のとき、ｌは２であり、Ｚは、Ｙがアセチル基のときハロゲン化アルキル基を表し、Ｙがハロゲン化アルキル基のときアセチル基を表す）

【請求項2】

前記ｋが１、ｌが２、ｍが０である請求項１に記載のリガンド固定化分子を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、リガンドを固定するための分子に関する。具体的には、リガンドを固相支持体に固定する手段として、ビオチン又はビオチン誘導体を使用したリガンド固定化分子に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内における物質の相互作用は、様々な生理現象を惹起し、伝達する上で、重要な役割を担っている。例えば、細胞表面上の受容体を介して細胞へ到達したシグナルは、最終的には遺伝子発現などを制御することで、細胞内機能に影響を与えていると考えられているが、シグナルが核内へ到達するまでの間に、様々な物質が関与している。このような過程に関与する多くの物質群は、少なくからず、直接又は間接的に相互作用をしながらシグナルを伝達していくと考えられている。また、ウィルスや毒素などの生体に対する異物が細胞内に侵入する際には、ウィルスや毒素表面に存在する特定分子と生体内の細胞表面に存在する特定の分子との結合を介して、細胞内への侵入が開始される。
以上のように、細胞内における様々な現象は、細胞内に存在する物質同士の相互作用を介して生じることが多く、そのため、細胞機能の解明においては、生体分子同士の相互作用を考慮しながら研究開発等を進めていくことが非常に重要になってくる。

【0003】

生体分子同士の相互作用を解明していく方法として、すでに多くの方法が報告されている。例えば、生体分子に対する抗体を利用して、その生体分子に相互作用する分子を同定する免疫沈降法やファージディスプレイ法、遺伝子発現ライブラリーなどを用いたツーハイブリッド法、表面プラズモン法を利用したプロテインチップ法などが知られており、多くの研究者に利用されている。また、生体分子（リガンド）と直接結合する物質を生体試料などから取得するために、目的リガンドを何らかの方法によりプレートやビーズなどの固相支持体に固定化し、試験対象の生体試料をそのプレートやビーズと接触させて、目的リガンドと相互作用を行う物質を同定する方法も古くから行われている。

【0004】

生体分子などと結合するリガンドを磁気ビーズやプレート表面に固定化する場合、リガンドを結合させた適当な固定化用分子（リガンド固定化分子と称する）を、ビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合を利用してビーズなどの表面に固定化する方法がよく用いられる。
このような方法においては、リガンドを結合させたリガンド固定化分子を固相支持体に対して安定に強く固定することが重要な点として挙げられる。一般に、ビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合は、強固で安定な結合を実現すると考えられている。しかしながら、リガンドを固定化するリンカーをより安定に固定するためには、ビオチン−ストレプトアビジン結合をさらに増強することが望ましい。ストレプトアビジンは１分子内に４つのビオチン結合部位を有しており、リガンド固定化分子をストレプトアビジンに結合させるには、固定化分子を１個でビオチン化するより２個でビオチン化した方がより強い結合を得ることができる（非特許文献１及び非特許文献２など）。従って、リガンドを固定化するためにビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合を利用する場合には、１つのリガンド固定化用分子あたり２個以上のビオチンを保持させた方がより安定な固定化を実現することができると考えられる。

【0005】

一方、リガンドの配置についても留意する点がいくつか考えられる。まず、リガンドと結合する物質を同定するためには、リガンド−目的物質間の結合を安定に保持する必要がある。未知の物質を同定する場合には、リガンドは予め準備はできるとしても、同定する物質の物理的性質は不明な場合が多く、リガンド−目的物質同士の個々の結合を増強することは、なかなか難しい課題である。例えば、１つのリガンド固定化分子あたりのリガンドの数を増やすことによって、該固定化分子に捕捉される目的物質の数を増やすことが１つの解決手段となる。ただし、単に、リガンド固定化分子あたりのリガンドの数を増やすのみでは、リガンドと未知の目的物質との相互作用がリガンド又は目的物質の立体構造的な特徴（大きさや形など）に影響されることがあり、このような場合には、リガンド間の距離や空間あたりのリガンド数なども考慮してリガンドを固定化する必要がある。

【0006】

以上のように、所望の物質を同定するためのリガンド固定化分子としては、該固定化分子の固相支持体への結合が強度であり、かつ、固定化されるリガンド間の距離や空間あたりのリガンド数を容易に調製できるような分子が理想的である。
しかしながら、これまでに、そのような分子は開発されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｗｉｌｂｕｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，８：８１９−８３２，１９９７

【非特許文献2】Ｆａｒｒｅｒａら，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３：２３９３−２３９５，２００５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述のように、特定のリガンドと相互作用する所望の物質を同定するためには、リガンド間の距離などを容易に調節できる必要がある。そのため、リガンドを固相支持体に固定化するための分子（リガンド固定化分子）は、固相支持体とリガンドまでの距離を自在に調節できるように、該リガンド固定化分子の長さなどを、様々に、かつ、容易に変更し得ることが求められる。
そこで、本発明は、リガンド固定化分子のリガンドが結合する部分と固相支持体に結合する部分（本発明のリガンド固定化分子においては、ビオチン又はビオチン誘導体が結合部分）を別々に調製し、これらを結合させたリガンド固定用分子の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本出願の発明者らは、リガンド固定化分子のビオチン結合部分に１分子あたり２個のビオチンを保持させて、該リガンド固定化分子が固相支持体（ビーズ、プレートなど）に対し強固に結合することを可能にした。また、様々な種類の長さのリガンド固定化分子を調製し得るように、リガンド結合部分をビオチン結合部分とは別個に調製した。
リガンド固定化分子を固相支持体に結合させる点において、１分子あたりのビオチンの数を２個とすることで、従来の類似分子と比較して、固相支持体への結合安定性が顕著に上昇する。さらに、２個のビオチンを使用することで、より堅固で安定な立体構造をリガンド固定化分子に与えることが可能となる。その結果、リガンド同士の不自然な接触や重なり合いを回避することができ、よりネイティブな状態にリガンドを保ちつつ、結合パートナーの探索ために提示することができる。
また、リガンド結合部分をビオチン結合部分と別個に調製することで、リガンド固定化分子自体の長さ、保持するリガンドの数、空間あたりのリガンド密度などを調節することができる。そのため、リガンドと結合する結合パートナー分子の物理的特性が未知であってもパートナー分子を容易に同定し得ることとなる。このようなリガンド固定化分子の各部分の調製おいては、特に、リガンド結合部分については、デンドリマーの調製技術を利用することが可能である。

【0010】

すなわち、本発明は、以下の式（Ｉ）で示されるリガンド固定化分子である。

【化1】

（式（Ｉ）中、Ｒ^１は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^２は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Ａは硫黄又は酸素を表し、Ｂはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Ｗは以下の式（ＩＩ）、

【化2】

（式（ＩＩ）中、Ｅは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Ｒ^３は水素又は炭化水素鎖を表し、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Ｘはリガンドを表し、ｋは０又は１の数字、ｌは０、１又は２の数字、ｍは０又は１の数字を表し、ｍが０のときｌは２である）を表す）

【0011】

また、本発明は上記式（Ｉ）に記載のリガンド固定化分子の製造に使用される式（ＩＶ）で表される化合物である。

【化3】

（式（ＩＶ）中、Ｒ^１は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^２は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖を表し、Ａは硫黄又は酸素を表し、Ｂはビオチン又はビオチン誘導体を表し、Ｙは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す）。

【0012】

さらに、本発明は、上記式（Ｉ）に記載のリガンド固定用分子の製造に使用される式（Ｖ）で表される化合物である。

【化4】

（式（ＩＩ）中、Ｅは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよく、Ａは硫黄又は酸素を表し、Ｒ^１は炭素数１〜１０の飽和炭化水素鎖を表し、Ｒ^３は水素又は炭化水素鎖を表し、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよく、Ｘはリガンドを表し、ｋは０又は１の数字、ｌは０、１又は２の数字、ｍは０又は１の数字を表し、ｍが０のときｌは２である。Ｚは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す）。

【発明の効果】

【0013】

本発明のリガンド固定化分子は、１分子あたり２個のビオチン分子を有しているため、任意のリガンドをビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合を介して、固相支持体に強力に固定させることができる。また、リガンド固定化分子の立体構造を安定に保つことができる。

【0014】

本発明のリガンド固定化分子は、分子あたりのリガンド数を自在に変えたり、あるいは、リガンド固定用分子自体の大きさや形状、さらにリガンド間の長さを適宜調節したりできるため、リガンドパートナー分子（レセプター分子）の大きさや形に適応させることが可能である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の実施形態の１つは、以下の式（Ｉ）で示されるリガンド固定化分子である。

【化5】

式（Ｉ）中、Ｒ^１は互いに同一でも異なっていてもよい炭素数１〜１０飽和炭化水素鎖を表し、好ましくは、炭素数１〜５の直鎖状飽和炭化水素鎖である。Ｒ^２は、炭素数１〜３０で、不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖である。好ましくは、炭素数は５〜２５の直鎖状炭化水素であって、適宜、アミド結合、エーテル結合を含む。また、Ａは硫黄又は酸素を表し、好ましくは、硫黄であり、Ｂはビオチン又はビオチン誘導体（ストレプトアビジン又はアビジンと結合するビオチン誘導体）を表す。２個のビオチン間の間隔は（つまり、Ｂ−Ｒ^２−ＣＨ−Ｒ^２−Ｂの長さ）、２０Å以上が好ましく、例えば、３０Å〜５０Å、より好ましくは、３５Å〜４５Åである。ビオチン間の距離がこの範囲内にあれば、Ｒ^２の炭化水素鎖は、親水性を有するものであれば、特に限定はされない。

【0016】

式（Ｉ）中、Ｗは以下の式（ＩＩ）で表される。

【化6】

式（ＩＩ）中、Ｅは炭素、ケイ素のいずれかで互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ^３は水素又は炭化水素鎖である。Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６は不飽和結合、スルフィド結合、アミド結合、トリアゾール結合及び／又はエーテル結合を含んでもよく、環を含んでもよい炭化水素鎖で互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘはリガンドを表す。ｋは０又は１の数字、ｌは０、１又は２の数字、ｍは０又は１の数字を表し、ｍが０のときｌは２である。
ここで「リガンド」とは、何らかの物質又は分子と結合する物質のことで、該リガンドの結合パートナーは既知であっても、未知であってもよい。例えば、受容体をリガンドとした場合、該受容体と結合するホルモン、神経伝達物質などが結合パートナーとなり得る。あるいは、ホルモンなどをリガンドとした場合には、受容体が結合パートナーとなり得る。本発明のリガンドは、いかなるものであってもよく、好ましくは、生体内に存在するか、又は人工物であっても生体内で作用すると予想される物質である。本発明のリガンドとしては、例えば、抗体、酵素、ペプチドアプタマー、受容体などのタンパク質性物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの誘導体などの核酸、抗生物質などのタンパク質性もしくは非タンパク質性生体内活性物質、あるいは、レクチンなどに結合し得る糖（例えば、ラクトース、シアリルラクトース、グロボトリオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、オリゴマンノースなどの他、生体内の特定の組織等に存在するレクチンと結合することが既知の糖鎖などであり、単糖、オリゴ糖などいかなる糖鎖であってもよい）などを挙げることができる。

【0017】

式（ＩＩ）中、Ｅ（ビオチン結合部分に最も近い位置に存在するＥ）とＸの距離（Ｅ−Ｘ間の炭化水素鎖を最も伸長させたときの長さ）は、リガンド結合パートナー分子の大きさ、形状、もしくは、リガンドと結合し得る部位の分子中における存在位置などによって、適宜調節してもよい。例えば、リガンド結合パートナー分子の大きさ（又は嵩）が大きければ（又は大きいと予想される場合には）、該Ｅ−Ｘ間の距離を長めに設定し、リガンド結合パートナー分子の大きさ（又は嵩）が小さければ（又は小さいと予想される場合には）、該Ｅ−Ｘ間の距離を短めに設定してもよい。例えば、リガンド分子が糖鎖等であり、リガンド結合パートナー分子がレクチンなどのタンパク質の場合、Ｅ−Ｘ間の距離は、例えば、１０Å〜５０Å、１５Å〜３０Å程度としてもよい。当業者であれば、該Ｅ−Ｘ間の距離は、予備的な実験を行うことで、適宜容易に決定することが可能である。

【0018】

式（ＩＩ）の部分は、ｋ、ｌ、ｍの組み合わせに応じて種々の構造を取り得るが代表的な化学式は下記のようになる。

【化7】

式（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）中、Ｅ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｘは上述の通りである。

【0019】

本発明の他の実施形態は、式（Ｉ）のリガンド固定化分子を製造するのに適した中間化合物であって、以下の式（ＩＶ）及び（Ｖ）で示される。

【化8】

【化9】

式（ＩＶ）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ａ及びＢは、上述の式（Ｉ）と同一の分子、原子、置換基等を表す。Ｙは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。また、式（Ｉ）の化合物と同様に、２個のビオチン間の間隔は（つまり、Ｂ−Ｒ^２−ＣＨ−Ｒ^２−Ｂの長さ）、２０Å以上が好ましく、例えば、３０Å〜５０Å、より好ましくは、３５Å〜４５Åである。
また、式（Ｖ）中、Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ａ及びＸは、上述の式（Ｉ）と同一の分子、原子、置換基等を表す。ｋは０又は１の数字、ｌは０、１又は２の数字、ｍは０又は１の数字を表し、ｍが０のときｌは２である。Ｚは、アセチル基、ハロゲン化アルキル基、アルキルアジド、アルキルアミン、アルキルイソシアネート、アルキルチオイソシアネート、アルキルチオール、アルキルチオアセテート、アルキルベンジルスルフィドを表す。Ｅ−Ｘ間の距離については、上述したように適宜決定することができる。

【0020】

式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＶ）のＹと式（Ｖ）の化合物のＺを反応させ、式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）の化合物を結合することにより、容易に合成することができる。この場合、ＹとＺは、互いに反応して化学結合を構築し得る組合せが好ましい。限定はしないが、例えば、アジド基とアルキニル基の組合せによる環化付加反応によるトリアゾール結合の構築などを挙げることができる。

【0021】

また、本発明の実施形態には、式（Ｉ）のリガンド固定用分子を製造するためのキットが含まれる。本発明のキットには、式（ＩＶ）の化合物（又はその誘導体）と式（Ｖ）の化合物（又はその誘導体）が含まれており、式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）の化合物から式（Ｉ）の化合物を合成するための試薬類が包含されていてもよい。本発明のキットには、Ｅ（ビオチン結合部分に最も近い位置に存在するＥ）とＸの長さ（Ｅ−Ｘ間の炭化水素鎖を最も伸長させたときの長さ）が異なる式（Ｖ）の化合物を複数含んでいてもよい。本発明の式（ＩＶ）及び式（Ｖ）の化合物は、これらの化合物の保存に適した容器中に収納され、使用説明書と共にパッキングされていてもよい。

【0022】

さらに、本発明の実施形態には、検出対象物、例えば、ウィルスや毒素の試験サンプル中における存在の有無を検出するための診断薬も含まれる。本発明の診断薬には、式（Ｉ）の化合物が有効組成物として含まれており、あるいは、式（ＩＶ）の化合物及び式（Ｖ）の化合物が個別に含まれていてもよい。この場合、式（Ｉ）及び式（ＩＶ）の化合物中のリガンドＸは、検出対象物と特異的に結合するリガンドである。例えば、検出対象物がウィルスや毒素の場合には、これらの表面上に存在するタンパク質等を特異的に認識する糖鎖をリガンドＸとして使用することができる。
本発明の診断薬は、上述のキットの形態で提供してもよく、この場合、該キットには、リガンド固定化分子を固定化する固相支持体、例えば、プレート（例えば、ウェル付きのプレートなど）やビーズ（例えば、磁気ビーズ）等が含まれていてもよい。あるいは、本発明の診断薬がキットの形態で提供される場合、分子の大きさが異なる種々の式（Ｉ）の化合物が、ビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）結合を介してマイクロアレイ用のチップ上に予め、各々、固定化されていてもよく、該チップは、ハイスループットの診断に用いられてもよい。

【0023】

以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0024】

１．［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＨ）］_２−（ビオチン）_２コンジュゲート（１９）の合成
式（Ｉ）の化合物の１例として、ｋ＝１、ｌ＝１、ｍ＝０の［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＨ）］_２−（ビオチン）_２コンジュゲートの製造方法を以下に示す。

【0025】

１−１．ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）ダイマーの合成
まず、ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）ダイマーを以下のスキーム１及び２の過程により合成した。

【化10】

【化11】

【0026】

１１−アジド−３，６，９−トリオキサ−１−ウンデカノール（３）

【化12】

テトラエチレングリコール（１）（５．００ｇ，２５．７ｍｍｏｌ）をピリジン（５０ｍＬ）に溶解させ、窒素雰囲気下０℃でｐ−トルエンスルホン酸クロライド（５．３９ｇ，２８．３ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。反応液は０℃で攪拌され、２時間後ＴＬＣ上で反応の進行を確認したところ、原料が多量に残っていたためｐ−トルエンスルホン酸クロライド（０．９８ｇ，５．１４ｍｍｏｌ）をさらに加えた。その後１時間攪拌し、綿栓ろ過により析出した塩をろ過した。そのろ液を濃縮し、黄色透明液体（R_f = 0.48 [CHCl₃ : EtOAc : MeOH = 5:4:1 (v/v/v)]）を得た。
得られた液体をＤＭＦ（４４ｍＬ）に溶解させ、次いでアジ化ナトリウム（５．０１ｇ，７７．１ｍｍｏｌ）を加えた後、窒素雰囲気下８０℃で３時間攪拌した。反応終了後、綿栓ろ過と濃縮を順次行い、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過を行い、濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィ［ヘキサン―酢酸エチル １：３ （ｖ／ｖ），シリカゲル ３００ｍＬ］により精製され、無色透明シラップの目的物（３）（２．５９ｇ，４５．９％）を得た。
R_f = 0.34 [CHCl₃: EtOAc: MeOH = 5:4:1 (v/v/v)]
IR (neat); 3447 (ν_O-H), 2872 (ν_C-H), 2108 (ν_N3), 1125 (ν_C-O-C) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 3.73 (br t, 2 H, HOCH₂), 3.69-3.67 (m, 10 H, CH₂), 3.62 (t, 2 H, J = 4.5 Hz, HOCH₂CH₂), 3.41 (t, 2 H, J = 5.0 Hz, CH₂N₃), 2.63 (br s, 1 H, OH)
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 72.46 (HOCH₂CH₂), 70.60, 70.57, 70.48, 70.23 and 69.94 (CH₂), 61.63 (HOCH₂), 50.59 (CH₂N₃)

【0027】

２−メチル−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−１，２−ジデオキシ−α−Ｄ−グルコピラノ）−［２，１−ｄ］−２−オキサゾリン（５）

【化13】

Ｎ−アセチルグルコサミンα−アセテート（４）（４．００ｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン置換をし、氷冷下で撹拌しながらトリフルオロメタンスルホン酸トリシリルメチル（２．０５ｍＬ，１１．３ｍｍｏｌ）を滴下した。その後６０℃で５時間撹拌した。反応終了後、反応液を氷冷し、過剰のトリエチルアミンを加えて塩基性条件とした。続いて濃縮を行い、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ［トルエン―酢酸エチル―トリエチルアミン １００：２００：１ （ｖ／ｖ／ｖ），シリカゲル ２３０ｍＬ］により精製し、オレンジ色透明のシラップとして目的物（５）（３．０８ｇ，９１．１％）を得た。
R_f = 0.49 [CHCl₃: MeOH = 10:1 (v/v)]
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 5.97 (d, 1 H, J_1,2 = 7.5 Hz, H-1), 5.27 (t, 1 H, J = 2.5 Hz, H-3), 4.96-4.90 (m, 1 H, H-4), 4.19-4.12 (m, 3 H, H-2, H-6a, H-6b), 3.65-3.56 (m, 1 H, H-5)

【0028】

１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデシル−Ｏ−２’−アセトアミド−３’，４’，６’−トリ−Ｏ−アセチル−２’−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（６）

【化14】

アジドアルコール（３）（５．３９ｇ，２４．３ｍｍｏｌ）およびオキサゾリン体（５）（３．０８ｇ，９．３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下でカンファースルホン酸（０．２１７ｇ，０．９３５ｍｍｏｌ）を加えた後、９０℃で１時間撹拌した。反応終了後クロロホルムで希釈し、氷水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。続いて無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させ、セライトろ過した後、濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ ［１回目；クロロホルム―メタノール ２０：１ （ｖ／ｖ），シリカゲル ７８０ｍＬ、２回目；クロロホルム―酢酸エチル―メタノール １５：１４：１（ｖ／ｖ／ｖ），シリカゲル ６３０ｍＬ］で精製することにより、白色ろう状固体として目的物（６）（３．８２ｇ，７４．５％）を得た。
R_f = 0.37 [CHCl₃: MeOH = 15:1 (v/v)]
[α]_D³³ -24.0^o (C 1.06, CHCl₃)
IR (neat); 2878 (ν_C-H), 2112 (ν_N3), 1746 (ν_C=O, ester), 1667 (ν_C=O, amide), 1553 (δ_N-H, amide), 1242 (ν_C-C(=O)-O, ester ), 1045 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 6.64(d, 1 H, J_NH,2 = 9.3 Hz, NH), 5.11-5.06 (m, 2 H, H-3, H-4), 4.79 (d, 1 H, J_1,2 = 8.6 Hz, H-1), 4.26 (dd, 1 H, J_5,6a = 12.3 Hz, J_6a,6b = 4.8 Hz, H-6a), 4.13 (dd, 1 H, J_5,6b = 2.5 Hz, J_6b,6a = 12.3 Hz, H-6b), 4.13-4.08 (m, 1 H, H-2), 3.91-3.60 (m, 15 H, -OCH₂-×7, H-5), 3.40 (dd, 2 H, J_gem = 5.6 Hz, J_vic = 4.5 Hz, -CH₂N₃), 2.09, 2.01 and 1.98 (each s, 12 H, OAc×3, NAc)
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 170.54, 170.47 and 170.43(-C=O, ester), 169.14 (-C=O, amide), 101.65 (C-1), 73.22, 71.46, 71.28, 70.55, 70.44, 70.31, 70.14, 69.62, 68.54, 68.46, 62.04, 53.65, 50.42, 22.74 (-NHCOCH₃), 20.52, 20.47 and 20.39 (-COCH₃)
MALDI-TOF-MS calcd for C₂₂H₃₆N₄O₁₂ [M+Na]⁺: 571.22, Found: 571.28
Anal. Calcd for C₂₂H₃₆N₄O₁₂: C, 48.17; H, 6.62; N, 10.21, Found: C, 48.11; H, 6.57; N, 10.12.

【0029】

１，１−ビス（ペンタ−２’−オキサ−４’−イン−１’−イル）エテン（８）

【化15】

３−クロロ−２−クロロメチル−１−プロペン（７）（３．００ｇ，２４．０ｍｍｏｌ）およびプロパルギルアルコール（８．５０ｍＬ，１４４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０．０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン置換した後、氷冷した。続いて５０％水素化ナトリウム（７．６０ｇ，１５８ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えていき、１時間かけて全てを加え終えた後、室温に戻してさらに１時間撹拌した。反応終了後、反応液に過剰のメタノールを加え、濃縮した。残渣を酢酸エチルで希釈し、氷水、飽和食塩水で順次洗浄した。有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過を行った後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ［ヘキサン―酢酸エチル ２０：１ （ｖ／ｖ），シリカゲル ５８０ｍＬ］によって精製し、無色透明オイル状のジアルキン体（８）（３．１９ｇ，８１．０％）を得た。
R_f = 0.41 [n-Hexane: EtOAc = 12:1 (v/v)]
IR (neat); 3293 (ν_≡C-H), 2857 (ν_C-H), 2116 (ν_C≡C), 1443, 1358 and 1263 (ν_as,C-O-C of ether, δ_C-H), 1086 (ν_s,C-O-C, ether), 675-644 (δ_≡C-H) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 5.26 (m, 2H, CH₂=), 4.16 (d, 4H, CH₂C≡C×2), 4.09 (t, 4H, =CCH₂×2), 2.45 (t, 2H, C≡CH×2)
¹³C-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 141.07 (H₂C=C), 115.57 (H₂C=C), 79.50 (-C≡CH), 74.46 (-C≡CH), 70.12 (=CCH₂×2), 57.16 (OCH₂C≡×2)

【0030】

１，１−ビス［４’−｛１’−Ｎ−［１１’’−（Ｏ−３’’’，４’’’，６’’’−トリｉ−Ｏ−アセチル−２’’’−Ｎ−アセトアミド−２’’’−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノ）−３’’，６’’，９’’−トリオキサウンデシル］−１’，２’，３’−トリアゾール｝メトキシメチル］エテン，［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）］_２−Ｃ＝Ｃ （９）

【化16】

アジ化グリコシド（６）（３．５７ｇ，６．４４ｍｍｏｌ）とジアルキン体（８）（０．４４０ｇ，２．６８ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷下で攪拌しながら、０．１Ｍ硫酸銅（II）五水和物水溶液（１３．４ｍＬ，１．３４ｍｍｏｌ）と１．０Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液（７．５ｍＬ，７．５ｍｍｏｌ）を順に滴下した。その後室温に戻して４時間攪拌した。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を氷水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過を行い、濃縮した後にフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ ［クロロホルム―メタノール ２０：１ （ｖ／ｖ），シリカゲル ４８０ｍＬ］で数回精製することにより、無色透明の高粘性シラップとして目的物（９）（３．１９ｇ，９４．４％）を得た。
R_f = 0.36 [CHCl₃: MeOH = 10:1 (v/v)]
IR (neat); 2937 (ν_C-H), 1746 (ν_C=O, ester), 1661 (ν_C=O, amide), 1559 (δ_N-H, amide), 1240 (ν_C-C(=O)-O, ester ), 1045 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.44 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.67 (d, 2 H, J_NH,2 = 9.2 Hz, NHAc×2), 5.26 (s, 2 H, CH₂=), 5.14 (t, 2 H, J = 9.9 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.6 Hz, H-4×2), 4.78 (d, 2 H, J_1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.62 (s, 4 H, =C(CH₂OCH₂-)₂), 4.56 (t, 4 H, J_vic = 5.3 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J_5,6a = 12.3 Hz, J_6a,6b = 4.8 Hz, H-6a×2), 4.12 (dd, 2 H, J_5,6b = 2.4 Hz, J_6a,6b = 12.3 Hz, H-6b×2), 4.04 (q, 2 H, J = 9.5 Hz, H-2×2), 3.91-3.56 (m, 26 H, -OCH₂-×12 and H-5×2), 3.90 (t, 4 H, J_vic = 5.3 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 2.08, 2.01, 2.00 and 1.93 (each s, 24 H, OAc×6, NAc×2)
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 170.77×2 and 170.48 (-C=O, ester), 169.32 (-C=O, amide), 144.89 (-CH=C- of triazole ring), 141.97 (CH₂=C-), 123.65(-CH=C- of triazole ring), 115.01 (CH₂=C-), 101.66 (C-1), 73.26, 71.68, 71.28, 70.97, 70.66, 70.56, 70.47, 70.23, 69.30, 68.70, 63.56, 62.18, 54.01, 50.17, 23.00 (-NHCOCH₃), 20.74, 20.70 and 20.60 (-COCH₃)
MALDI-TOF-MS calcd for C₅₄H₈₄N₈O₂₆ [M+Na]⁺: 1283.54, Found: 1283.55

【0031】

１−クロロ−３−｛［２’，２’−ビス（４’’−｛１’’−Ｎ−［１１’’’−（Ｏ−３’’’’，４’’’’，６’’’’−トリ−Ｏ−アセチル−２’’’’−Ｎ−アセトアミド−２’’’’−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノ）−３’’’，６’’’，９’’’−トリオキサウンデシル］−１’’，２’’，３’’−トリアゾール｝メトキシメチル）エチル］スルファニル｝プロパン， ［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）］_２−Ｓ−Ｃｌ（１０）

【化17】

Ｎ−アセチルグルコサミンアセテート二量体（９）（３０８ｍｇ，２４４μｍｏｌ）と３−クロロ−１−プロパンチオール（３５７μＬ，３．６６ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（１．５ｍＬ）に溶解させ、続いて室温にてＡＩＢＮ（２０．０ｍｇ，１２２μｍｏｌ）を添加し、アルゴン置換を行った。その後反応系を一気に８０℃の油浴に浸たし、８０℃で１時間攪拌した。ＴＬＣ上で反応が終了したことを確認し、シクロヘキセン（３７１μＬ，３．６６ｍｍｏｌ）を加えて反応を停止させた。続いて濃縮を行い、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ［クロロホルム―メタノール ２０：１ （ｖ／ｖ），シリカゲル ６０ｍＬ］で精製することにより白色泡状〜無色透明高粘性シラップとして目的物（１０）（２６９ｍｇ，８０．３％）を得た。
R_f = 0.22 [CHCl₃: MeOH = 15:1 (v/v)]
[α]_D²⁸ -16.3^o (C 0.58, CHCl₃)
IR (neat); 2872 (ν_C-H), 1748 (ν_C=O, ester), 1667 (ν_C=O, amide), 1557 (δ_N-H, amide), 1233 (ν_C-C(=O)-O, ester ), 1045 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.70 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.58 (d, 2 H, J_NH,2 = 9.2 Hz, NHAc×2), 5.13 (t, 2 H, J = 9.8 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.5 Hz, H-4×2), 4.79 (d, 2 H, J_1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.60 (s, 4 H, -CH₂CH(CH₂OCH₂-)₂), 4.55 (t, 4 H, J_vic = 4.3 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J_5,6a = 12.3 Hz, J_6a,6b = 4.7 Hz, H-6a×2), 4.13 (dd, 2 H, J_5,6b = 2.3 Hz, J_6a,6b = 12.3 Hz, H-6b×2), 4.05 (q, 2 H, J = 9.5 Hz, H-2×2), 3.91-3.54 (m, 32 H, -OCH₂-×12, -CH₂CH(CH₂O-)₂, -CH₂Cl and H-5×2), 3.90 (t, 4 H, J_vic = 5.3 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 2.63 (t, 2 H, J = 7.0 Hz, -SCH₂CH₂CH₂Cl), 2.60 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, -CHCH₂SCH₂CH₂CH₂Cl), 2.30-1.90 (m, 3 H, -CHCH₂SCH₂CH₂CH₂Cl), 2.08, 2.01 and 1.94 (each s, 24 H, OAc×6, NAc×2)
¹³C-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 170.66×2, 170.40 (-C=O, ester), 169.24 (-C=O, amide), 144.76 (-CH=C- of triazole ring), 123.45(-CH=C- of triazole ring), 101.59 (C-1), 73.16, 71.53, 71.24, 70.55, 70.43, 70.37, 70.11, 69.74, 69.19, 68.59×2, 64.40, 62.07, 53.83, 50.06, 43.41, 39.68, 31.97, 30.93, 29.48, 22.92 (-NHCOCH₃), 20.66×3 (-COCH₃)
MALDI-TOF-MS calcd for C₅₇H₉₁ClN₈O₂₆S [M+Na]⁺: 1393.54, Found: 1393.55
Anal. Calcd for C₅₇H₉₁ClN₈O₂₆S・2H₂O: C, 48.63; H, 6.80; N, 7.96, Found: C, 48.61; H, 6.50; N, 7.67.

【0032】

１−２．ビオチンダイマーの合成
次に、ビオチンダイマーを以下のスキーム３及び４の過程により合成した。

【化18】

【化19】

【0033】

２−［２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエトキシ］エタノール（１２）

【化20】

２−（２−アミノエトキシ）エタノール（１１）（１０．０ｇ，９５．１ｍｍｏｌ）を蒸留水（６５ｍＬ）に溶解させ、さらに水酸化カリウム（５．８７ｇ，１０５ｍｍｏｌ）を加えて攪拌し、窒素置換した後０℃に氷冷した。次に１，４−ジオキサン（３５ｍＬ）に二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（２２．８ｇ，１０５ｍｍｏｌ）を溶解させた溶液を全て滴下し、０℃で１時間攪拌した後、室温に戻してさらに７時間攪拌した。その後反応液をクロロホルムで２回抽出し、その抽出液を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。最後にシリカゲルカラムクロマトグラフィ［ヘキサン―酢酸エチル ２：５ （ｖ／ｖ），シリカゲル ７９０ｍＬ］で精製することにより、無色透明の液体として目的物（１２）（１８．１ｇ，９２．８％）を得た。
R_f = 0.61 [CHCl₃: EtOAc: MeOH = 5:4:1 (v/v/v)]
IR (neat); 3358 (ν_O-H), 2976-2872 (ν_C-H), 1694 (ν_C=O, amide), 1518 (δ_N-H, amide) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 5.28 (br s, 1 H, NHBoc), 3.78-3.71 (m, 2 H, HOCH₂-), 3.68-3.53 (m, 4 H, J = 5.2 Hz, -CH₂OCH₂-), 3.33 (q, 2 H, -CH₂NHBoc), 3.09 (t, 1 H, J = 5.6 Hz, HO), 1.45 (s, 9 H, Boc)
¹³C-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 156.10 (-C=O, amide), 79.38 (-C(CH₃)₃), 72.17 (HOCH₂CH₂O-), 70.27 (-OCH₂CH₂NHCO-), 61.67 (HOCH₂-), 40.34 (-CH₂NHCO-), 28.33 (CH₃×3 of Boc)

【0034】

６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノヘキサン酸（１４）

【化21】

６−アミノヘキサン酸（３．００ｇ，２２．９ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３４ｍＬ）と蒸留水（２３ｍＬ）に溶解させ、０℃に氷冷した。次に１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２３ｍＬ，２３ｍｍｏｌ）と、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５．５０ｇ，２２．５ｍｍｏｌ）―１，４−ジオキサン（１２ｍＬ）混合溶液を順に滴下し、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ上で原料が消失したことを確認した後、反応液を酢酸エチルで洗浄し、水層に１Ｍ硫酸水溶液を加えて攪拌した。その酸性水溶液をクロロホルムで３回抽出し、無水硫酸マグネシウムで脱水乾燥させた後、セライトろ過と濃縮を行うことにより、白色固体として目的物（１４）（５．１１ｇ，９６．６％）を得た。
R_f = 0.23 [Hexane: EtOAc = 1:1 (v/v)], 0.71 [CHCl₃: MeOH: H₂O = 65:25:4 (v/v/v)]
IR (neat); 3347 (ν_COO-H), 2976 (ν_C-H), 1692 (ν_C=O, amide), 1530 (δ_N-H, amide), 1173 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 4.68 (br s, 1 H, -NHBoc×2), 3.10 (br m, 2 H, -CH₂NHBoc), 2.33 (t, 2 H, J = 7.5 Hz, -CH₂COOH), 1.63 (quintet, 2 H, J = 7.6 Hz, -CH₂CH₂COOH), 1.52-1.32 (m, 4 H, --CH₂CH₂CH₂NHBoc), 1.46 (s, 9 H, -NHBoc)
¹³C-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 178.58 (-COOH), 156.07 (-C=O, amide), 79.13 (C(CH₃)₃), 40.25 (-CH₂NHBoc), 33.85 (HOOCCH₂-), 29.51 (CH₂CH₂NHBoc), 28.23 (CH₃×3), 26.08 (CH₂CH₂CH₂NHBoc), 24.24 (HOOCCH₂CH₂-)

【0035】

１，１−ビス｛２−［２−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノエトキシ］エトキシメチル｝エテン（１５）

【化22】

アルコール（１２）（１９．７ｇ，９６．０ｍｍｏｌ）と３−クロロ−２−クロロメチル−１−プロペン（７）（３．００ｇ，２４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２３０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下かつ室温で５０％水素化ナトリウムを少量ずつ加えてはＴＬＣ上で反応の進行を確認した。ＴＬＣ上で目的物のスポットが最も濃くなるまで水素化ナトリウムを加えた後、過剰のメタノールを加えて反応を停止させた。続いて反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した後、氷水、飽和食塩水で順に洗浄した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥し、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ［ヘキサン―酢酸エチル １：１→２：３ （ｖ／ｖ），シリカゲル ８２０，５９０ｍＬ］で２回精製することにより、無色透明液体として目的物（１５）（４．４１ｇ，４０．４％）を得た。
R_f = 0.49 [Hexane: EtOAc = 1:2 (v/v)]
[a]_D³⁴ +0.15 ^o (C 0.60, CHCl₃)
IR (neat); 2978-2897 (ν_C-H), 1701 (ν_C=O, amide), 1516 (δ_N-H, amide), 1172 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 5.01 (s, 2 H, CH₂=), 5.07 (br s, 2 H, -NHBoc×2), 4.04 (s, 4 H, =C(CH₂O-)₂), 3.62-3.53 (m, 12 H, -OCH₂CH₂OCH₂-×2), 3.31 (br s, 4 H, -CH₂NHBoc), 1.44 (s, 18 H, -NHBoc×2)
¹³C-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ: 159.96 (-C=O, amide), 142.33 (CH₂=C-), 114.44 (CH₂=), 79.15 (C(CH₃)₃×2), 71.76 , 70.25 and 69.40 (-CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂NHBoc×2), 40.35 (-CH₂NHBoc×2), 28.41 (CH₃×6)
MALDI-TOF-MS calcd for C₂₂H₄₂N₂O₈ [M+Na]⁺: 485.28, Found: 485.25
Anal. Calcd for C₂₂H₄₂N₂O₈・0.5H₂O: C, 56.03; H, 9.19; N, 5.94, Found: C, 55.87; H, 9.02; N, 5.84.

【0036】

１，１−ビス［２−（２−｛［６−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノヘキサノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシメチル］エテン（１６）

【化23】

ジアミンＢｏｃ保護体（１５）（１００ｍｇ，２１６μｍｏｌ）を塩化メチレン（１．０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下トリフルオロ酢酸（２４０μＬ，３．２４ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ上で原料が消失したことを確認した後に反応液を濃縮し、淡黄色透明の液体としてジアミンのトリフルオロ酢酸塩（Ｒ_ｆ＝０．１４［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝６５：２５：４（ｖ／ｖ／ｖ）］）を得た。
得られたアミン塩をＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下０℃でＮ−メチルモルホリン（５０μＬ，０．４５ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下後、室温に戻して１時間攪拌した。続いてカルボン酸（１４）（１００ｍｇ，４３２μｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン：ＤＭＡＰ（６３．１ｍｇ，５１８μｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１２４ｍｇ，６４８μｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。その後ＴＬＣ上で反応の進行を確認したところ、原料がわずかに残っていたためＥＤＣ（２５．２ｍｇ，１３０μｍｏｌ）とＤＭＡＰ（１１．２ｍｇ，８６．４ｍｍｏｌ）を追加し、反応を完全に進ませた。反応終了後、反応液を濃縮し、残渣を酢酸エチルで希釈した。希釈液は氷水、飽和食塩水で順に洗浄され、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した後、セライトろ過、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ ［クロロホルム―メタノール ２５：１ （ｖ／ｖ），シリカゲル ４４ｍＬ］で精製することにより、無色透明シラップとして目的物（１６）（１２９ｍｇ，８６．６％）を得た。
R_f = 0.45 [CHCl₃: MeOH = 10:1 (v/v)]
[α]_D³³ -0.04 ^o (C 0.34, CHCl₃)
IR (neat); 2934 (ν_C-H), 1701 and 1647 (ν_C=O, amide), 1506 (δ_N-H, amide), 1170 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 6.29 (br s, 2 H, -CH₂NHCOCH₂-×2), 5.21 (s, 2 H, CH₂=), 4.75 (br s, 2 H, -NHBoc×2), 4.04 (s, 4 H, =C(CH₂O-)₂), 3.64-3.57 (m, 8 H, -OCH₂CH₂O-×2), 3.56 (t, 4 H, J = 5.2 Hz, -CH₂CH₂NHCOCH₂-×2), 3.44 (q, 4 H, J = 5.3 Hz, -CH₂CH₂NHCOCH₂-×2), 3.10 (br q, 4 H, -CH₂NHBoc×2), 2.18 (t, 4 H, J = 7.5 Hz, -NHCOCH₂-×2), 1.64 (q, 4 H, J = 7.6 Hz, -CH₂CH₂CH₂CH₂NHBoc×2), 1.52-1.47 (m, 4 H, -CH₂CH₂NHBoc×2), 1.44 (s, 18 H, -NHBoc×2), 1.37-1.31 (m, 4 H, -CH₂CH₂CH₂NHBoc×2),
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 172.99 (-C=O, amide), 156.02 (NHCOC(CH₃)₃), 142.27 (CH₂=C-), 114.65 (CH₂=), 78.94 (C(CH₃)₃×2), 71.68 , 70.16, 69.89, 69.37, 40.36 (-CH₂NHBoc×2), 39.10, 36.38, 29.75, 28.41 (CH₃×6), 26.38, 25.27
MALDI-TOF-MS calcd for C₃₄H₆₄N₄O₁₀ [M+Na]⁺: 711.45, Found: 711.36
Anal. Calcd for C₃₄H₆₄N₄O₁₀・0.3H₂O: C, 58.82; H, 9.34; N, 8.07, Found: C, 58.88; H, 9.43; N, 7.91.

【0037】

１，１−ビス［２−（２−｛［６−Ｎ−（シス−テトラヒドロ−２−オキソチエノ［３，４−ｄ］イミダゾリン−４−バレリル）アミノヘキサノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシメチル］エテン，（ビオチン）_２−Ｃ＝Ｃ （１７）

【化24】

ジアミンＢｏｃ保護体（１６）（２．３１ｇ，３．３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１６ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下０℃でトリフルオロ酢酸（４．４５ｍＬ，６０．３ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で３時間攪拌した。ＴＬＣ上で原料の消失を確認した後反応液を濃縮し、黄色透明シラップとしてジアミンのトリフルオロ酢酸塩（Ｒ_ｆ＝０．１７ ［ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝６５：２５：４ （ｖ／ｖ／ｖ）］）を得た。
得られたアミン塩をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下０℃でＮ−メチルモルホリン（０．８２ｍＬ，７．４ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下後、室温に戻して３０分攪拌した。続いてビオチン（１．８０ｇ，７．３７ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（０．９８０ ｇ，８．０４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．４５ｇ，１２．７ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で一晩攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ［１回目：クロロホルム―メタノール ５：１（ｖ／ｖ），シリカゲル ２４０ｍＬ；２回目：クロロホルム―メタノール―水 ６５：１５：２ （ｖ／ｖ／ｖ），シリカゲル ３００ｍＬ］とゲルろ過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，メタノール，ゲル容量 ３００ｍＬ）で精製することにより、白色固体として目的物（１７）（２．１４ｇ，６７．７％）を得た。
R_f = 0.33 [CHCl₃: MeOH : H₂O = 65:25:4 (v/v/v)]
[α]_D³⁰ +41.6 ^o (C 0.53, MeOH)
IR (KBr); 3306 and 3092 (ν_N-H, amide), 2929 and 2859 (ν_C-H), 1701 and 1643 (ν_C=O, amide), 1553 (δ_N-H, amide), 1099 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 5.13 (s, 2 H, CH₂=), 4.41 (dd, 2 H, J_1exo,2 = 4.9 Hz, J_2,3 = 7.8 Hz, H-2 of biotin×2), 4.22 (dd, 2 H, J_2,3 = 7.8 Hz, J_3,4 = 4.5 Hz, H-3 of biotin×2), 3.97 (s, 4 H, =C(CH₂O-)₂), 3.55-3.50 (m, 8 H, -OCH₂CH₂O-×2), 3.46 (t, 4 H, J = 5.5 Hz, -OCH₂CH₂NHCO-×2), 3.27 (t, 4 H, J = 5.5 Hz, -OCH₂CH₂NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4 of biotin), 3.08 (t, 4 H, - CH₂CH₂CH₂NHCO-×2), 2.85 (dd, 2 H, J_1exo,2 = 5.0 Hz, J_1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1_exo of biotin×2), 2.63 (d, 2 H, J_1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1_endo of biotin×2),
2.14-2.10 (m, 8 H, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂-×2),
1.59-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂-×2)
¹³C-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 176.15 and 175.93 (-C=O, amide), 166.10 (NHCOC(CH₃)₃), 144.22 (CH₂=C-), 114.99 (CH₂=), 72.65, 71.25, 70.68, 70.62, 63.39 (C-3 of biotin), 61.63 (C-2 of biotin), 57.02 (C-4 of biotin), 41.06, 40.35, 40.22, 36.92, 36.83, 30.15, 29.80, 29.51, 27.58, 26.94, 26.66
MALDI-TOF-MS calcd for C₄₄H₇₆N₈O₁₀S₂ [M+H]⁺: 941.52, Found: 941.51
Anal. Calcd for C₄₄H₇₆N₈O₁₀S₂・0.5H₂O: C, 55.61; H, 8.17; N, 11.79, Found: C, 55.64; H, 8.13; N, 11.54.

【0038】

Ｓ−２，２−ビス［２−（２−｛［６−Ｎ−（シス−テトラヒドロ−２−オキソチエノ［３，４−ｄ］イミダゾリン−４−バレリル）アミノヘキサノイル］アミノ｝エトキシ）エトキシメチル］エチル チオアセテート，（ビオチン）_２−ＳＡｃ （１８）

【化25】

ビスビオチンチオアセチル体（１７）（５００ｍｇ，５３１μｍｏｌ）を蒸留水―２−メトキシエタール混合溶媒（１：１（ｖ／ｖ），２．５ｍＬ）に溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸（１．１３ｍＬ，１５．９ｍｍｏｌ）と２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（８９．７ｍｇ，５４６μｍｏｌ）を加え、８０℃で３時間攪拌した。その後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、反応液をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ［クロロホルム―メタノール―水 ８５：１６：２ （ｖ／ｖ／ｖ），シリカゲル ７０ｍＬ］で３回精製した。続いてゲルろ過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０，溶媒：メタノール，ゲル体積： １５０ｍＬ）で精製することにより、白色固体として目的物（１８）（１６０ｍｇ，２９．６％）を得た。なおこの反応では未反応の原料（１７）をほぼ回収することができた（３１５ｍｇ，仕込み量に対して６３．０％）。
R_f = 0.38 [CHCl₃: MeOH : H₂O = 65:15:2 (v/v/v)]
[α]_D³⁰ +39.0 ^o (C 0.72, MeOH)
IR (KBr); 3296 and 3086 (ν_N-H, amide), 2926 and 2859 (ν_C-H), 1697 and 1639 (ν_C=O, thioester and amide), 1553 (δ_N-H, amide), 1134 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 4.41 (dd, 2 H, J_1exo,2 = 4.5 Hz, J_2,3 = 7.8 Hz, H-2 of biotin×2), 4.22 (dd, 2 H, J_2,3 = 7.9 Hz, J_3,4 = 4.5 Hz, H-3 of biotin×2), 3.54-3.48 (m, 8 H, -OCH₂CH₂O-×2), 3.46 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH₂CH₂NHCO-×2), 3.41 (dddd, 4 H, J = 5.8, 9.7 and 25.4 Hz, AcSCH₂CH(CH₂O-)₂), 3.28 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH₂CH₂NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4 of biotin), 3.08 (t, 4 H, - CH₂CH₂CH₂NHCO-×2),
2.92 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, AcSCH₂-), 2.85 (dd, 2 H, J_1exo,2 = 5.0 Hz, J_1exo,1endo = 12.7 Hz, H-1_exo of biotin×2),
2.63 (d, 2 H, J_1exo,1endo = 12.8 Hz, H-1_endo of biotin×2), 2.25 (s, 3 H, SAc),
2.14-2.10 (m, 8 H, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂-×2), 1.98 (septet, 1 H, J = 6.1 Hz, AcSCH₂CH-),
1.68-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂-×2)
¹³C-NMR (MeOD, 200 MHz) δ: 197.33 (-C=O, thioester), 176.03, 175.95, 175.80 and 175.71 (-C=O, amide), 165.84 (-C=O, amide of biotin), 71.47, 71.06, 70.48, 63.21 (C-3 of biotin), 61.45 (C-2 of biotin), 56.90 (C-4 of biotin), 41.05, 40.84, 40.34, 40.23, 36.80, 30.71, 30.62, 30.02, 29.68, 29.37, 28.80, 27.45, 26.82, 26.53
MALDI-TOF-MS calcd for C₄₆H₈₀N₈O₁₁S₃ [M+H]⁺: 1017.52, Found: 1017.51
Anal. Calcd for C₄₆H₈₀N₈O₁₁S₃: C, 54.31; H, 7.93; N, 11.01, Found: C, 54.12; H, 7.95; N, 10.84

【0039】

１−３．［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＨ）］_２−（ビオチン）_２コンジュゲートの合成
化合物（１０）と化合物（１８）から［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＨ）］_２−（ビオチン）_２コンジュゲートを以下のスキーム５の過程により合成した。

【化26】

【0040】

［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＨ）］_２−（Ｂｉｏｔｉｎ）_２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （１９）

【化27】

Ｎ−アセチルグルコサミン２量体（１０）（１８８ｍｇ，１３７μｍｏｌ）とビオチン２量体 （１８）（１３９ｍｇ，１３７μｍｏｌ）をメタノール―ＤＭＦ混合溶媒（１：１ （ｖ／ｖ），１．０ｍＬ）に溶解させ、ナトリウムメトキシド（１２．５ｍｇ，２３０μｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。反応溶液が濁り始めたため、４０℃の熱をかけ、さらに１１時間攪拌した。ＴＬＣ上で原料の消失を確認し、強酸性陽イオン交換樹脂ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ^＋）を適量加えて中和した。その反応液を綿栓ろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ［クロロホルム―メタノール―水 ６５：２５：４ （ｖ／ｖ／ｖ），シリカゲル ７０ｍＬ］で精製し、さらに分取型リサイクルＨＰＬＣ（カラムＪＡＩＧＥＬ−Ｗ５２５；溶媒 メタノール）で精製することにより、白色泡状固体として最終目的物（１９）（１４０ｍｇ，４９．６％）を得た。
R_f = 0.24 [CHCl₃: MeOH: H₂O = 65:25:4 (v/v/v)]
IR (KBr); 3296 and 3086 (ν_O-H, ν_N-H, amide), 2926 and 2859 (ν_C-H), 1694 and 1647 (ν_C=O, amide), 1557 (δ_N-H, amide), 1078 (ν_C-O-C, ether) cm^-1
1H-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 7.95 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 4.52 (t, 4 H, J = 5.1 Hz,-OCH₂CH₂N(triazole)-×2), 4.50 (s, 4 H, -CH=CN(CH₂-)×2), 4.42 (dd, 2 H, J_1’exo,2’ = 4.6 Hz, J_2’,3’ = 7.5 Hz, H-2’ of biotin×2), 4.40 (d, 2 H, J_1,2 = 8.5 Hz, H-1), 4.23 (dd, 2 H, J_2’,3’ = 7.9 Hz, J_3’,4’ = 4.5 Hz, H-3’ of biotin×2), 3.87-3.79 (m, 4 H, H-6a, 6b), 3.83 (t, 4 H, J = 5.1 Hz, OCH₂CH₂N(triazole)-×2), 3.63-3.17 (m, 48 H, H-2×2, H-5×2, -OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂O-×2, -SCH₂CH(CH₂OCH₂C(N-)=)₂, -SCH₂CH(CH₂OCH₂CH₂OCH₂-)₂×2), 3.36 (dd, 2 H, J_2,3 = 10.3 Hz, J_3,4 = 8.5 Hz, H-3), 3.28 (t, 4 H, J = 5.6 Hz, -OCH₂CH₂NHCO-×2), 3.15-3.11 (m, 2 H, H-4’ of biotin), 3.09 (t, 4 H, J = 7.1 Hz, - CH₂CH₂CH₂NHCO-×2),
2.85 (dd, 2 H, J_1’exo,2 = 5.0 Hz, J_{1’exo,1’endo} = 12.7 Hz, H-1’_exo of biotin×2),
2.63 (d, 2 H, J_{1’exo,1’endo} = 12.7 Hz, H-1’_endo of biotin×2), 2.54-2.49 (m, 8 H, -CH₂SCH₂CH₂CH₂SCH₂-), 2.13 (q, 8 H, J = 7.2 Hz, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂-×2), 2.00-1.95 (m, 2 H, -CHCH₂SCH₂CH₂CH₂SCH₂CH-), 1.90 (s, 6 H, NHAc×2), 1.74 (quintet, 2 H, J = 7.1 Hz, -SCH₂CH₂CH₂S-), 1.68-1.24 (m, 24 H, -NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CH₂CH₂-×2)
¹³C-NMR (MeOD, 500 MHz) δ: 176.13, 175.91 and 173.73(-C=O, amide), 166.07 (-C=O, amide of biotin), 145.85 (-CH=C- of triazole ring), 125.88 (-CH=C- of triazole ring), 102.81 (C-1), 78.04, 76.31, 72.16, 71.74. 71.66, 71.62, 71.58, 71.50, 71.44, 71.25, 70.84, 70.63, 70.38, 69.88, 65.03, 63.38, 62.84, 61.62, 57.37, 57.02, 51.43, 41.25, 41.20, 41.08, 40.37, 40.23, 36.94, 36.84, 32.28, 32.23, 31.82, 30.47, 30.16, 29.80, 29.51, 27.59, 26.94, 26.66, 23.15.
MALDI-TOF-MS calcd for C₈₉H₁₅₆N₁₆O₃₀S₄ [M+Na]⁺: 2080.00, Found: 2080.00

【0041】

２．式（Ｖ）の化合物の合成例
次に、式（Ｉ）の化合物を合成するために使用可能な式（Ｖ）（ｋ＝１、ｌ＝１、ｍ＝１）の化合物として、ＧｌｃＮＡｃテトラマーの合成例を以下に示す。
ＧｌｃＮＡｃテトラマーは以下のスキーム６の過程により合成した。

【化28】

【0042】

Ｓ−２，２−ビス［４’−｛１’−Ｎ−［１１’’−（Ｏ−３’’’，４’’’，６’’’−トリ−Ｏ−アセチル−２’’’−Ｎ−アセトアミド−２’’’−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノ）−３’’，６’’，９’’−トリオキサウンデシル］−１’，２’，３’−トリアゾール｝メトキシメチル］エチル チオアセテート，［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）］_２−ＳＡｃ（２０）

【化29】

Ｎ−アセチルグルコサミンアセテート２量体（９）（５０９ｍｇ，４０４μｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）に溶解させ、さらにアルゴン雰囲気下でチオ酢酸（４３１μＬ，６．０６ｍｍｏｌ）と２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（３３．４ｍｇ，２０３μｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間攪拌した。ＴＬＣ上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたため２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（３３．０ｍｇ，２０１μｍｏｌ）を追加し、さらに２時間攪拌した。反応終了後、室温でシクロヘキセンを加えて反応を停止させ、濃縮を行った。残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ［クロロホルム―メタノール１５：１ （ｖ／ｖ）， シリカゲル ６７ｍＬ］で精製することにより、白色泡状固体として目的物（２０）（４６０ｍｇ，８５．２％）を得た。
R_f = 0.48 [CHCl₃: MeOH = 10:1 (v/v)]
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.73 (s, 2 H, H of triazole ring×2), 6.64 (d, 2 H, J_NH,2 = 9.1 Hz, NHAc×2), 5.15 (t, 2 H, J = 9.8 Hz, H-3×2), 5.07 (t, 2 H, J = 9.6 Hz, H-4×2), 4.79 (d, 2 H, J_1,2 = 8.6 Hz, H-1×2), 4.59 (s, 4 H, AcSH₂CH(CH₂OCH₂-)₂), 4.56 (t, 4 H, J = 5.1 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 4.25 (dd, 2 H, J_5,6a = 12.3 Hz, J_6a,6b = 4.7 Hz, H-6a×2), 4.12 (dd, 2 H, J_5,6b = 2.1 Hz, J_6a,6b = 12.2 Hz, H-6b×2), 4.05 (q, 2 H, J = 9.3 Hz, H-2×2), 3.90 (t, 4 H, J = 5.3 Hz,-OCH₂CH₂N-×2), 3.90-3.49 (m, 30 H, -OCH₂-×12, -CH₂CH(CH₂O-)₂ and H-5×2), 2.93 (d, 2 H, J = 6.7 Hz, -CH₂SAc), 2.33 (s, 3 H, -SAc), 2.14-2.05 (m, 1 H, -CHCH₂SAc), 2.08, 2.01×2 and 1.94 (each s, 24 H, OAc×6 and NAc×2)
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 170.73×2 and 170.42 (-C=O, ester), 169.28 (-C=O, amide), 144.90 (-CH=C- of triazole ring), 123.56 (-CH=C- of triazole ring), 101.66 (C-1), 73.24, 71.66, 71.29, 70.65, 70.46, 70.22, 69.76, 69.28, 68.67, 64.53, 62.16, 53.9, 50.13, 39.68, 30.57, 27.91, 22.99 (-NHCOCH₃), 20.73, 20.68, 20.59 (-COCH₃)
MALDI-TOF-MS calcd for C₅₆H₈₈N₈O₂₇S [M+Na]⁺: 1359.54, Found: 1359.60

【0043】

１，１−ビス［（２’，２’−｛４’’−［１’’−（１’’’−テトラアセチレングリコール−３’’’，４’’’，６’’’−トリ−Ｏ−アセチル−２’’’−Ｎ−アセトアミド−２’’’−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド）−１’’，２’’，３’’−トリアゾール］メトキシメチル｝エチル）スルファニルメチル］エテン，［ＧｌｃＮＡｃ（ＯＡｃ）］_４−Ｃ＝Ｃ（２１）

【化30】

ビス［Ｎ−アセチルグルコサミンアセテート］チオアセチル体（２０）（４２８ｍｇ，３２０ μｍｏｌ）と３−クロロ−２−クロロメチル−１−プロペン（７）（１７．０μＬ，１６０μｍｏｌ）をメタノール―ＤＭＦ混合溶媒（１：１（ｖ／ｖ），２．２ｍＬ）に溶解させ、アルゴン置換した後に氷冷した。続いて、ナトリウムメトキシド（１４．５ｍｇ，２６８μｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌した。その後ＴＬＣ上で反応の進行を確認したところ、原料が残っていたためナトリウムメトキシド（２５．２ｍｇ，４６６μｍｏｌ）を加え、反応を完全に進行させた。反応終了後、酢酸（４２．３μＬ，７３９μｍｏｌ）を加えて中和し、濃縮を行った。
得られた残渣をピリジン（３．０ｍＬ）に溶解させ、無水酢酸（３．０ｍＬ）を加えて室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ上で反応終了を確認後、反応液を濃縮し、残渣をクロロホルムで希釈した。その希釈液を１ Ｍ硫酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で順に洗浄し、得られた有機層に無水硫酸マグネシウムを加えて脱水乾燥した。続いてセライトろ過、濃縮を行い、残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ［クロロホルム―メタノール１５：１（ｖ／ｖ），シリカゲル ５０ｍＬ］で精製することにより、白色泡状固体として目的物（２１）（２９７ｍｇ，７０．２％）を得た。
R_f = 0.43 [CHCl₃: MeOH = 10:1 (v/v)]
¹H-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 7.72 (s, 4 H, H of triazole ring×4), 6.70 (d, 4 H, J_NH,2 = 8.6 Hz, NHAc×4), 5.64 (t, 4 H, J = 9.8 Hz, H-3×4), 5.06 (t, 4 H, J = 9.6 Hz, H-4×4), 4.93 (s, 2 H, CH₂=), 4.80 (d, 4 H, J_1,2 = 8.6 Hz, H-1×4), 4.58 (s, 8 H, -CH=C(triazole)-CH₂O-×4), 4.56 (br s, 8 H, -OCH₂CH₂N-×4), 4.25 (dd, 4 H, J_5,6a = 12.3 Hz, J_6a,6b = 3.5 Hz, H-6a×4), 4.12 (br d, 4 H, J_6a,6b = 12.2 Hz, H-6b×4), 4.05 (q, 4 H, J = 9.0 Hz, H-2×4), 3.91-3.56 (m, 68 H, -OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂N-×4, H-5×4, -SCH₂CH(CH₂O-)₂×2), 3.21 (s, 4 H, CH₂=C(CH₂S-)₂), 2.46 (d, 4 H, J = 6.0 Hz, -CHCH₂S-×2), 2.21-1.90 (m, 2 H, -SCH₂CH(CH₂-)₂×2), 2.08, 2.01 and 1.93 (each s, 48 H, OAc×12, NAc×4)
¹³C-NMR (CDCl₃, 500 MHz) δ: 170.67×2, 170.41 (-C=O, ester), 169.25 (-C=O, amide), 144.79 (-CH=C- of triazole ring), 140.51 (CH₂=), 123.54 (-CH=C- of triazole ring), 115.74 (CH₂=C-), 101.58 (C-1), 73.17, 71.58, 71.20, 70.59, 70.46, 70.41, 70.16, 69.80, 69.24, 68.63, 64.42, 62.12, 53.91, 50.08, 39.32, 35.74, 29.97, 22.95 (-NHCOCH₃), 20.68, 20.64 and 20.55 (-COCH₃)
MALDI-TOF-MS calcd for C₁₁₂H₁₇₆N₁₆O₅₂S2 [M+Na]⁺: 2664.10, Found: 2663.83
化合物（２１）は、例えば、スキーム４に示す方法などにより、Ｚに相当する部分をアセチル基等にし、本発明の式（Ｖ）の化合物の１つとして使用することができる。

【0044】

３．本発明のリガンド固定化分子を用いたリガンド結合力の検討
本発明の実施例で合成した化合物（１９）は、リガンドとして１分子あたり２個のＧｌｃＮＡｃを有している。従って、ＧｌｃＮＡｃを１個のみしか有していない分子と比較すると、ＧｌｃＮＡｃと結合パートナー分子との結合親和性が上昇していることが予想される。この点について、以下に検討を行った。結合パートナー分子として、ＷＧＡレクチンを使用した。また、ＧｌｃＮＡｃ１個のみを有する対照分子として以下の化合物Ａを使用した。

【化31】

ＷＧＡレクチンと糖（化合物（１９）のＧｌｃＮａｃなど）が結合すると蛍光強度の変化が生じる。この蛍光スペクトルの変化から、ＷＧＡレクチンとリガンド（化合物（１９）又は対照化合物Ａ）との結合親和性を測定することができる。
ＷＧＡレクチン溶液（０．６５μＭ、ｐＨ７．２、５．０±０．１℃）に化合物（１９）（６５７μＭ、０．１５ＭＮａＣｌ含有５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー）又は化合物Ａ（３５．３ｍＭ、０．１５ＭＮａＣｌ含有５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー）を５μＬずつ加えた時の蛍光スペクトル（Ｅｘ．２９５ｎｍ）変化から、３４８ｎｍにおける蛍光強度変化を測定し、結合親和性（Ｋａ）を測定した。
その結果、本発明の化合物（１９）の結合親和性は、Ｋａ＝５．７×１０^５Ｍ^−１であったのに対し、化合物Ａは、Ｋａ＝８．２×１０^３Ｍ^−１と２桁程度低かった。従って、本発明のリガンド固定化分子は、リガンド数を自在に増加させることが可能であり、所望の結合親和性を有するリガンド固定化分子の調製が可能な優れた分子である。

【産業上の利用可能性】

【0045】

本発明は、結合パートナー分子に応じた所望の親和性を実現し得るリガンド固定化分子を提供するものであり、創薬の分野の他、疾患の診断など、広く医療分野においての利用が期待される。