特許 5719593 ポリヌクレオチドプライマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5719593

(24)【登録日】2015年3月27日

(45)【発行日】2015年5月20日

(54)【発明の名称】ポリヌクレオチドプライマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150430BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20150430BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

【請求項の数】7

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2010-526365(P2010-526365)

(86)(22)【出願日】2008年9月29日

(65)【公表番号】特表2010-539920(P2010-539920A)

(43)【公表日】2010年12月24日

(86)【国際出願番号】GB2008003306

(87)【国際公開番号】WO2009040557

(87)【国際公開日】20090402

【審査請求日】2011年9月20日

(31)【優先権主張番号】0719034.1

(32)【優先日】2007年9月28日

(33)【優先権主張国】GB

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510084161

【氏名又は名称】キアゲン マンチェスター リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ボード ルース

(72)【発明者】

【氏名】ファーガソン ジェニファー

(72)【発明者】

【氏名】ラヴェット ポール フランシス

(72)【発明者】

【氏名】セルウェル ニコラ ジョー

(72)【発明者】

【氏名】ウィットクーム ディヴィッド

【審査官】 一宮 里枝

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０５０４６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／０９１８４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００７−１５９４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５３４７６４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の以下の変異配列のいずれか一つにハイブリダイズできるが、野生型配列には相補的ではない、以下のｉ）〜ｉｖ）のいずれかの配列からなるフォワードプライマー。
ｉ）Ｅ５４２Ｋ領域については、配列番号５；
ｉｉ）Ｅ５４５Ｋ領域については、配列番号１４；
ｉｉｉ）Ｈ１０４７Ｒ領域については、配列番号２１；
ｉｖ）Ｈ１０４７Ｌ領域については、配列番号２８。

【請求項2】

少なくとも２つのプライマーを含むキットであって、第一のプライマーが請求項１に記載のフォワードプライマーであり、第二のプライマーがリバースプライマーであり、第二のプライマーが、第一のプライマーが相補的である領域の下流のＰＩＫ３ＣＡ配列の断片の領域に相当する、上記キット。

【請求項3】

第二のプライマーが、以下の配列の一つを含む、請求項２に記載のキット。
Ｅ５４２Ｋ又はＥ５４５Ｋ領域については、配列番号１８に記載の配列；及び
Ｈ１０４７Ｒ又はＨ１０４７Ｌ領域については、配列番号３５に記載の配列。

【請求項4】

ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の少なくとも１つの断片を含む核酸試料における変異を検出するための、請求項１に記載のフォワードプライマー若しくは請求項２または３に記載のキットの使用。

【請求項5】

ａ）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の少なくとも１つの断片を含む核酸試料を、第一のプライマー及び第二のプライマーと混合し、混合物についてＰＣＲを行い；及び
ｂ）ハイブリダイゼーションが変異の存在を示す、核酸試料に対する第一のプライマーのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における変異の有無を検出する方法であって、第一のプライマーは請求項１に記載のフォワードプライマーであり、第二のプライマーが、第一のプライマーが相補的である領域の下流のＰＡＫ３ＣＡ配列の断片の領域に相当する、上記の方法。

【請求項6】

第一のプライマーが配列番号５又は１４からなる場合は、第二のプライマーは配列番号１８に記載の配列を有し、又は第一のプライマーが配列番号２１又は２８からなる場合は、第二のプライマーは配列番号３５に記載の配列を有する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

第二のプライマーがスコーピオンズプライマーである、請求項５又は６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むキット、及び遺伝子において変異の有無を検出する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、細胞シグナリングに関与する脂質キナーゼの大きなファミリーである。ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路は、多くの腫瘍型において活性化され、細胞生育、細胞増殖及び細胞生存の異常に至る（１最近のレビューのrefを加える）。近年、クラス１Ａ ＰＩ３Ｋ（ＰＩＫ３ＣＡ）の触媒サブユニットにおける変異が、ヒト癌で同定されている（非特許文献１参照）。発癌におけるこれら変異の正確な役割は、まだ、明確に定義されるのを待つ状態であるが、進行中の多数の標的ＰＩ３Ｋ阻害剤の開発に伴い、変異の検出が、患者選定にとってますます重要になるだろう。そのような変異の検出における技術的挑戦は、少量の変異配列のみ含有する可能性のある腫瘍の生検の制限に起因する。さらに、パラフィン包埋組織から抽出したＤＮＡは、しばしば分解しており、品質が悪い。シーケンシングによる検出に必要とされる変異ＤＮＡの最低水準は、１５〜２５％であるから、異種の試料において少量の変異対立遺伝子を検出することができる高感度測定法及びその測定法を実施するために必要なプロダクトを開発する差し迫った必要性がある。
本発明は、この必要性に対処することを求める。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】サミュエルズ・ワイ、ワング・ジー、バーデリ・エーら、「ヒト癌におけるPIK3CA遺伝子の高頻度の変異」サイエンス2004;304(5670): 554（Samuels Y，Wang Z, Bardelli A, et al. "High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science 2004;304(5670): 554）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、腫瘍性のＰＩＫ３ＣＡ変異のための高感度かつ強固な試験を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の一の態様によれば、配列番号３〜１６、１８、２０〜３３、３５若しくは３７〜３９のプライマー配列のうちの一つ又はその相補配列の少なくとも最後の６個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが提供される。すなわち、当該ポリヌクレオチドは、配列番号３〜１６、１８、２０〜３３、３５若しくは３７〜３９のプライマー配列のうちの一つ又はその相補配列の３’末端における少なくとも６個のヌクレオチドを含む。

【0007】

好ましくは、当該ポリヌクレオチドは、配列番号３〜１６、１８、２０〜３３、３５若しくは３７〜３９のプライマー配列のうちの一つ、その相補配列、又はそれと８０％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有する配列の３’末端における８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１７個、１８個若しくは２０個のヌクレオチド又は全体の少なくとも７５％を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、配列番号３〜１６、１８、２０〜３３、３５若しくは３７〜３９のプライマー配列のうちの一つ又はその相補配列の３’末端における１０個のヌクレオチドの少なくとも７５％を含むポリヌクレオチドが提供される。
有用なものとして、当該ポリヌクレオチドは、１００ヌクレオチ長さ未満であり、好ましくは８０ヌクレオチド長さ未満であり、より好ましくは６０ヌクレオチド長さ未満であり、より好ましくは４０ヌクレオチド未満であり、より好ましくは３０ヌクレオチド長さ未満である。

【0008】

有利には、当該ポリヌクレオチドは、クエンチャー基（quencher group）及びフルオロフォア基(fluorophore group)をさらに含む。

【0009】

有用ものとして、クエンチャー基とフルオロフォア基とは、第一及び第二の領域を含むヌクレオチド・テイル配列によって分離され、第二の領域に対する第一の領域のハイブリダイゼーションによりクエンチャー基がフルオロフォア基に十分に近づき、フルオロフォア基を消光する結果となるように、第一の領域のヌクレオチドは、第二の領域のヌクレオチドと相補的であるが逆順である。

【0010】

好ましくは、前記テイル配列は、さらに、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の領域と相補的な配列を有する第三の領域を含む。

【0011】

有利には、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１８の少なくとも３’末端における６個のヌクレオチドを含み、かつ前記テイル配列は配列番号１７を含む。

【0012】

あるいは、当該ポリヌクレオチドは、配列番号３５の少なくとも３’末端における最後のヌクレオチドを含み、かつ前記テイル配列は配列番号３４を含む。

【0013】

あるいは、当該ポリヌクレオチドは、配列番号３９の少なくとも３’末端における最後のヌクレオチドを含み、かつ前記テイル配列は配列番号３８を含む。

【0014】

有用なものとして、クエンチャー基はダブシル（Dabcyl）を含む。

【0015】

好ましくは、フルオロフォアは、ヘックス（Hex）、ファム（Fam）又はロックス（Rox）を含む。

【0016】

本発明の別の態様によれば、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも二つを含むキットが提供される。

【0017】

有利には、当該キットは、配列番号１８を含むポリヌクレオチド及び配列番号３〜１６のいずれか１つを含むポリヌクレオチド；又は配列番号３５を含むポリヌクレオチド及び配列番号２０〜３３のいずれか１つを含むポリヌクレオチド；又は配列番号３９を含むポリヌクレオチド及び配列番号３７を含むポリヌクレオチドを含む。

【0018】

有利なものとして、当該キットは、ヌクレオチド三リン酸塩、重合酵素及び／又はバッファー溶液をさらに含む。

【0019】

本発明のさらなる態様によれば、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の少なくとも断片を含む核酸試料における変異を検出するための、本発明のポリヌクレオチド若しくはキット；又は配列番号３〜１６、１８、２０〜３３若しくは３５又はその相補配列の３’末端における６個のヌクレオチドの４個又は５個を含むポリヌクレオチドの使用が提供される。

【0020】

有利には、核酸試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の断片は、少なくとも１０ヌクレオチド長さであり、好ましくは２０ヌクレオチド長さであり、より好ましくは３０ヌクレオチド長さであり、より好ましくは４０ヌクレオチド長さである。

【0021】

本発明の別の態様によれば、
ａ）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の少なくとも断片を含む核酸試料を、配列番号３〜１６又は２０〜３３のプライマー配列のうちの一つ又はその相補配列の少なくとも３’末端における６個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドと混合し；及び
ｂ）ハイブリダイゼーションが変異の存在を示す、核酸試料に対するポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する、
工程を含む、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における変異の有無を検出する方法が提供される。

【0022】

有用なものとしては、前記ポリヌクレオチドは、配列番号３〜１６又は２０〜３３のプライマー配列の一つを含む。

【0023】

好ましくは、当該方法は、工程ａ）の前に、熱サイクリング核酸増幅、好ましくはＰＣＲを用いて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の断片のコピー数を増幅する工程を有する。

【0024】

有利には、工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドを第一のプライマーとして用いＤＮＡ重合を実施すること、及び重合の伸張産物を検出することを含む。

【0025】

有用なものとしては、工程ｂ）は、前記ポリヌクレオチドが相補的な領域の下流にあるＰＩＫ３ＣＡ配列の断片の領域に対応する第２のプライマーと、核酸試料及び前記ポリヌクレオチドを混合し、該混合物についてＰＣＲを実施する工程を含む。

【0026】

好ましくは、第２のプライマーは配列番号１８を含み、かつ前記ポリヌクレオチドは配列番号３〜１６の３’末端における６個のヌクレオチドの少なくとも４個又は５個を含み；又は第２のプライマーは配列番号３５を含み、かつ前記ポリヌクレオチドは配列番号２０〜３３の３’末端における６個のヌクレオチドの少なくとも４個又は５個を含む。

【0027】

あるいは、当該方法は、コントロールプライマーを用いて試料についてＰＣＲを実施し、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の増幅と、前記ポリヌクレオチド及び第２のプライマーを用いた増幅とを比較する工程をさらに含む。

【0028】

有利には、コントロールプライマーは、配列番号３７及び３９を含む。

【0029】

有用なものとして、前記ポリヌクレオチドは、クエンチャー基及びフルオロフォア基を含み、工程ｂ）は、クエンチャー基の非存在下でフルオロフォアが反応する波長の光に混合物を暴露し、クエンチャー基の非存在下でフルオロフォア基によって放射される波長の光を検出することを含む。

【0030】

ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子は、本明細書に参照することにより組み込まれる、ジェンバンク・アクセション番号NM_006218 バージョン番号NM_006218.2 GI:54792081（GenBank accession no. NM_006218 version no. NM_006218.2 GI:54792081）として利用可能な配列であることが好ましい。

【0031】

参照配列の「３’末端における６個のヌクレオチドの少なくとも４個又は５個」について、本明細書において申し述べると、これは、該参照配列における６個のヌクレオチドのうち、１個かそれとも２個のヌクレオチドが欠失又は異なるヌクレオチドと置換しても良いことを意味する。もちろん、ある実施形態では、当該配列は、参照配列の全ての６個のヌクレオチドを含む。

【0032】

本明細書において、「ＡＲＭＳ」とは、例えば、ＥＰ−Ａ−０３３２４３５に開示される増幅不応性変異システム（Amplification Refractory Mutation System）である。

【0033】

参照ポリヌクレオチドと比較したポリヌクレオチドのパーセンテージについて、本明細書において申し述べると、これは、当該技術において知られているアルゴリズムによって決定することができる。

【0034】

例えば、二つの配列の間のパーセンテージ同一性は、ＢＬＳＴＰ・アルゴリズム・バージョン２．２．２（アルチャル、ステフェン・エフ、トーマス・エル、マッデン、アレジャンドロ・エー・スキャッファー、ジングアイ・ザング、ゼング・ザング、ウェブ・ミラー、及びデービッド・ジェー・リプマン（１９９７）、「ギャップ・ブラスト及びピー・エス・アイ−ブラスト：タンパク質データベース検索プログラムの新世代」、核酸リサーチ25:3389-3402）（Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を用い、デフォルト・パラメーターを用いて決定することができる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】変異ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子を含む試料についてスコーピオン検出及びシーケンシングを行った結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本発明の実施形態は、核酸を含有する試料においてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異の検出のためのアッセイに用いることができるポリヌクレオチドプライマーを提供する。

【0037】

具体的な実施形態において、ポリヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ増幅反応を行うことができる、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子にハイブリダイズするフォワード及びリバース・プライマーである。このように、フォワード・プライマーは、リバース・プライマーとは逆鎖に、かつその上流にハイブリダイズし、フォワード・プライマーとリバース・プライマーとは共に、ＰＣＲの間に増幅されるアンプリコン配列を定義する。フォワード・プライマーの配列は、野生型配列に相補的でないが、変異ＰＩＫ３ＣＡ配列にハイブリダイズ可能であるように、選択される。

【0038】

試料において変異ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の存在を検出するために、前記プライマーは試料と混合される。ＰＣＲに必要な物（適切なヌクレオチド三リン酸塩、ＤＮＡポリメラーゼ酵素及びバッファー溶液）が、次いで試料に加えられ、ＰＣＲが実施される。もし、試料が、フォワード・プライマーがハイブリダイズできる変異配列を含んでいる場合、ＰＣＲの間にアンプリコンが増幅され、試料における変異配列の存在がこのように示される。もし、試料が変異配列を含んでいない場合、フォワード・プライマーは、ＰＩＫ３ＣＡ配列に低い効率で結合するため、アンプリコン配列の増幅はほとんど又は全くない。

【0039】

変異Ｅ５４２Ｋを検出するために、フォワード・プライマー配列は、配列番号３〜９のうちの一つ、好ましくは配列番号５であってもよい。変異Ｅ５４５Ｋを検出するために、フォワード・プライマー配列は、配列番号１０〜１６のうちの一つ、好ましくは配列番号１４であってもよい。変異Ｈ１０４７Ｒを検出するために、フォワード・プライマー配列は、配列番号２０〜２６のうちの一つ、好ましくは配列番号２１であってもよい。変異Ｈ１０４７Ｌを検出するために、フォワード・プライマー配列は、配列番号２７〜３３のうちの一つ、好ましくは配列番号２８であってもよい。しかし、フォワード・プライマーが野生型配列よりもより容易に変異配列にハイブリダイズするならば、フォワード・プライマーの正確な配列はこれらの配列と同一である必要がないことは評価されるべきものである。上記に示した配列において、結合特異性をもたらすのは、プライマーの最後の６個のヌクレオチド（３’末端にけるヌクレオチド）であるので、これらのヌクレオチドは、与えられる配列と同一でなければならない。

【0040】

試料において形成されるアンプリコンの存在を検出するために、本発明の実施形態では、リバース・プライマーは、いわゆる「スコーピオンズ」（"Scorpions"）プライマーである。スコーピオンズ・プライマーの詳細は、本明細書に参照として組み込まれるＷＯ−Ａ−９９／０６６０７１に提供されている。スコーピオンズ・プライマーは、遺伝子（本発明ではＰＩＫ３ＣＡ）の第１の標的配列に相補的なプライマー配列を含み、テイル配列は、両側に二つの相互に相補的な配列が並ぶプローブ配列を含む。ＤＮＡポリメラーゼ・ブロック部位（例えば、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）モノマー）が、プライマー配列とテイル配列との間に設けられる。フルオロフォア基がテイル配列の一方の端に設けられ、クエンチャー基がテイル配列のもう一方の端に設けられる。使用において、スコーピオンズ・プライマーのプライマー配列は、通常、ＰＣＲの間、リバース・プライマーとして作用し、したがって、テイル配列を含む全体のスコーピオン・プライマーが各アンプリコンに組み込まれるようになる。ＤＮＡポリメラーゼ・ブロック部位は、テイル配列の重複を回避する。このように、テイル配列における相互に相補的な配列は、互いにハイブリダイズする傾向を有し、フルオロフォア基とクエンチャー基を接近させ、フルオロフォア基からの発光を回避する。しかし、アンプリコンが、プローブ配列と相補的な第２の標的配列を含んでいる場合、プローブ配列は、相互に相補的な配列を分離して、第２の標的配列に優先的に結合する。結果として、フルオロフォア基及びクエンチャー基は空間的に遠ざけられ、フルオロフォア基は、ある波長の入射光に応答して他の波長の光を放射する。したがって、アンプリコンが第２の標的配列を含む場合にのみシグナルが生じることから、スコーピオンズ・プライマーは、アンプリコンの簡易な検出を可能とし、さらに偽陽性の結果（例えば、プライマーダイマーに起因する）を回避する。

【0041】

フルオロフォア基は、ヘックス（Hex） (4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロ-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル)-6-カルボキサミドヘキシル］-1-O-（2-シアノエチル）-(N,N-ジイソプロピル)-フォスフォルアミダイト)
（（4,7,2',4',5',7'-hexachloro-(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite）、ファム（Fam）（[(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル)-6-カルボキサミドヘキシル]-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-フォスフォルアミダイト)
（[(3',6'-dipivaloylfluoresceinyl)-6-carboxamidohexyl]-1-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidite)、又は、ロックス（Rox）(5,6,-カルボキシ-エックス-ローダミン) (5,6,-Carboxy-X-Rhodamine)であってもよい。クエンチャー基は、ダブシル（Dabcyl）(5'-ジメトキシトリチロキシ-5-[(N-4'-カルボキシ-4-(ジメチルアミノ)-アゾベンゼン)-アミノヘキシル-3-アクリリミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]- フォスフォルアミダイト)
(5'-Dimethoxytrityloxy-5-[(N-4'-carboxy-4-(dimethylamino)-azobenzene)-aminohexyl-3-acrylimido]-2'-deoxyUridine-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)であってもよい。

【0042】

本発明の実施形態では、スコーピオンズ・プライマーが、Ｅ５４２Ｋ及びＥ５４５Ｋ変異の検出に提供され、そのプライマー配列は配列番号１８であり、そのプローブ配列は配列番号１７である。スコーピオンズ・プライマーが、Ｈ１０４７Ｒ及びＨ１０４７Ｌ変異の検出に提供され、そのプライマー配列は配列番号３５であり、そのプローブ配列は配列番号３４である。

【0043】

しかし、スコーピオンズ・プライマーの使用は本発明に必須でなく、特許番号ＵＳ−Ａ−５４８７９７２及びＵＳ−Ａ−５２１００１５に記載されるような、ＴａｑＭａｎ(商標)プロダクト・ディテクション等のアンプリコンの合成を検出する他の方法が利用されてもよいことは評価されるべきである。

【0044】

ある実施形態では、試料においてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の全体の濃度を検出するために、コントロールアッセイがまた実施される。これは、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の他の領域におけるアンプリコンを定義するコントロールのフォワード及びリバース・プライマーを用いた別のＰＣＲ反応を実施することによって達成される。フォワード・プライマーは配列番号３７であり、かつリバース・プライマーは、プライマー配列が配列番号３９であってプローブ配列が配列番号３８であるスコーピオンズ・プライマーであることが好ましい。試料におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異コピーの割合を評価するために、コントロールのアンプリコンの閾値数を生成するのに必要なＰＣＲサイクル数を、次いで、変異配列を含むアンプリコンの閾値数を生成するのに必要なＰＣＲサイクル数と比較する。このようなコントロールアッセイは、通常、試験アッセイとは別に実施される。

【0045】

ＰＣＲアッセイは、多重リアルタイムＰＣＲアッセイ（multiplexed real time PCR assay）として好ましくは実施される。

【0046】

核酸の試験試料は、有用なものとしては、血液、糞便、痰、結腸洗浄、気管支洗浄若しくはその他体液の試料、又は固体から得られる組織である。固体は、有用なものとしてはヒト、好ましくは、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）である。試験試料は、試験試料における配列に対応する核酸配列と同等であってもよいことが評価されるだろう。すなわち、本発明の方法における使用の前に、試料核酸における全部又は一部の領域が、熱サイクリング核酸増幅、特にＰＣＲ、又は全ゲノム増幅（ＷＧＡ）等のあらゆる有用な技術を用いて、まず、増幅されてもよい。

【0047】

かなりの程度において正常な鋳型配列と変異の鋳型配列とを区別するＤＮＡポリメラーゼの能力に影響しない限り、重合のためのあらゆる有用な酵素が用いられてもよい。有用な酵素の例としては、著しい３'−５'エクソヌクレアーゼ活性を有しない耐熱性酵素、例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、特に"Ampli Taq Gold"（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＥアプライド・バイオシステムズ）、ストッフェル・フラグメント（Stoffelfragment）、又はＴａｑ若しくはＴｔｈ（サーマス サーモフィラス）（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼのその他の適切なＮ末端欠失改良を含む。

【0048】

本発明のさらなる実施形態では、１個以上の本発明のポリヌクレオチド及びヌクレオチド三リン酸塩、並びに、ＰＣＲ反応を実施するために必要なＤＮＡポリメラーゼ酵素及びバッファー溶液を含むキットが提供される。好ましいキットは、特定の変異の検出のためのフォワード及びリバース・プライマー、並びに、フォワード及びリバースのコントロール・プライマーを含む。

【実施例】

【0049】

＜材料及び方法＞
プライマーを、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子（アクセッション番号：ＮＭ＿００６２１８）における４つの最も一般的な変異に対して設計した。エクソン２０における２つの変異：Ｈ１０４７Ｒ及びＨ１０４７Ｌ；並びに、エクソン９における２つの変異：Ｅ４５２Ｋ及びＥ４５４Ｋを検出するために、ＡＲＭＳプライマーを設計した。コントロール・プライマーを、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子におけるｃＤＮＡ位置２４５０に対して設計した。

【0050】

スコーピオンズについてもまた設計した。各反応におけるいくつかのアッセイの多重化を許容するために、３つのスコーピオン・プライマーを、異なるフルオロフォアを用いて標識した。

【0051】

（プライマーの設計）
各標的領域に対して特異的ないくつかのＡＲＭＳプライマーを設計した。Ｅ５４２Ｋ及びＥ５４５Ｋ変異の標的領域を、それぞれ、配列番号１及び２として以下に示す（変異の塩基は括弧に示され、最初のものが正常変異である）。変異に対するフォワード・プライマーもまた以下（配列番号３〜１６）に示す。これらの反応の特異性を高めるために、３'末端近傍のさらなるプライマー・ミスマッチが用いられた（プライマー配列において下線で示す）。最適なプライマー（Ｅ５４２Ｋ−２及びＥ５４５Ｋ−４）を、記載する実験に用いた。プライマー配列と共に使用可能なスコーピオンズ・プライマーを、配列番号１７及び１８として示す。スコーピオンズ・プライマーと標的領域との間で対応する領域は、同一の強調表示又は下線で示されている。

【0052】

（エクソン９領域）

【化1】

【0053】

【化2】

【0054】

【表1】

【0055】

（エクソン２０領域）
Ｈ１０４７Ｒ及びＨ１０４７Ｌ変異の標的領域は、以下配列番号１９として示す（変異の塩基は括弧に示され、最初のものが正常変異である）。変異に対するフォワード・プライマーもまた以下（配列番号２０〜３３）に示す。これらの反応の特異性を高めるために、３'末端近傍のさらなるプライマー・ミスマッチが用いられた（プライマー配列において下線で示す）。最適なプライマー（Ｈ１０４７Ｒ−１及びＨ１０４７Ｌ−１）を、記載する実験に用いた。プライマー配列と共に使用可能なスコーピオンズ・プライマーを、配列番号３４及び３５として示す。スコーピオンズ・プライマーと標的領域との間で対応する領域は、同一の強調表示又は下線で示されている。

【0056】

【化3】

【0057】

【表2】

【0058】

（コントロール・プライマー）
コントロール・プライマーを以下に示す。スコーピオンズ・プライマーと標的領域との間で対応する領域は、同一の強調表示又は下線で示す。

【0059】

【化4】

【0060】

【表3】

【0061】

全てのプライマーは、インビトロジェン社によって合成、提供された。ＰＣＲバッファー、Ｔａｑ及びマグネシウムは、ユーロジェンテック（Eurogentec）社によって提供され、ｄＮＴＰＳは、アブジェン社（Abgene Ltd.）から購入した。スコーピオンズは、エーティーディーバイオ社（ＡＴＤＢｉｏ）によって合成され、提供された。

【0062】

アッセイは、コントロールアッセイ及び２つのＡＲＭＳアッセイ（１×エクソン９及び１×エクソン２０）を含む２つの反応に多重化した。アッセイは、１×ＰＣＲバッファー、４．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２００μＭ ｄＮＴＰミックス、０．２５μＭの各プライマー（コントロール・プライマー及び２つのＡＲＭＳプライマー）及び０．２５μＭの各スコーピオン（コントロール・スコーピオン（配列番号３８及び３９）、エクソン２０スコーピオン（配列番号３４及び３５）及びエクソン９スコーピオン（配列番号１７及び１８））を含有する２５μＬの反応容積において行った。２．５μＬのＤＮＡ鋳型を各反応に添加した。Ｈ１０４７Ｒ及びＥ５４２Ｋプライマーを、反応当たり２．５ユニットのＴａｑポリメラーゼと多重化した。Ｈ１０４７Ｌ及びＥ５４５Ｋプライマーを、反応当たり３．０ユニットのＴａｑポリメラーゼと多重化した。使用したＥ５４２Ｋプライマーは、Ｅ５４２Ｋ−２（配列番号５）であった。使用したＥ５４５Ｋプライマーは、Ｅ５４５Ｋ−４（配列番号１４）であった。使用したＨ１０４７Ｒプライマーは、Ｈ１０４７Ｒ−１（配列番号２１）であった。使用したＨ１０４７Ｌプライマーは、Ｈ１０４７Ｌ−１（配列番号２８）であった。

【0063】

全てのケースにおいて、９５℃で１０分間、続いて９０℃で３０秒間及び６０℃で１分間を４５サイクルの条件下で、Stratagene Mx3000Pで増幅した。

【0064】

ポジティブ・コントロールとして使用した点変異を内部に有するＤＮＡカセットは、Higuchiら（参考文献２）に記載の方法に基づいて構築した。概略、対応する外側のプライマー及び変異プライマーを用い、相補的な末端を有する半分のカセット（各半分のカセットは変異塩基を含んでいる）を生成した。これらのＰＣＲ産物を混合し、内部ネスティッド・プライマー（nested primers）を用いて増幅した。相補的な半分のカセット同士の自己プライミング、及び続く増幅により、変異させた塩基を有する最終産物を生成した。産物について、正確な配列が生成されていることを確かめるために、シーケンスを行った。この過程を、注目する各変異について繰り返した。１００％のポジティブ・コントロールを作成するために、ＤＮＡカセットは、等量のゲノムＤＮＡと混合した。

【0065】

（実施例１）
反応及びプライマーの特異性を決定するために、各アッセイは、反応当たり５〜５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて行い、ミスマッチしたプライマーの伸長により生じたブレイクスルー・シグナル（breakthrough signal）を評価した。各反応について、ΔＣｔ値（コントロールＣｔ−変異Ｃｔ）を定義した（Ｃｔ＝閾値サイクル（threshold cycle））。その値未満でいずれの増幅も変異の配列の存在に起因するものであり、かつブレークスルー・シグナルに起因するものではないと言える、カットオフΔＣｔ値を定義するために、反応は、各ＤＮＡ濃度について６回行い、別々の場合で三重（triplicate）に繰り返した。カットオフΔＣｔ値は、各アッセイについて全ての反応において見出された最も低いΔＣｔ値未満の１Ｃｔであると決定した。Ｈ１０４７Ｒ及びＨ１０４７Ｌアッセイについて、カットオフΔＣｔは１２と定義され、Ｅ５４２Ｋアッセイについて、カットオフΔＣｔは９であり、Ｅ５４５Ｋアッセイについては、カットオフΔＣｔは８であった。

【0066】

（実施例２）
アッセイの感度を評価するために、変異ＤＮＡの５コピーを、野生型に対して５、２、１、０．５及び０．１％変異ＤＮＡの最終濃度となるように、各種濃度のゲノムＤＮＡにおいて希釈した。表１は、４つのＡＲＭＳアッセイの感度を示している。表は、野生型ＤＮＡのバックグラウンド内において減少する濃度の変異ＤＮＡに対するΔＣｔ値を示す。事前に定義されたカットオフΔＣｔは最後の欄に示されている。エクソン２０アッセイは、（事前に定義したカットオフΔＣｔ内において）総ＤＮＡの０．１％のみを含有する場合に、変異ＤＮＡの５コピーを検出することができた。エクソン９アッセイは、事前に定義したカットオフ値内でΔＣｔとともに１％濃度において５コピーのＤＮＡを検出することができた（表１）。

【0067】

【表4】

【0068】

（実施例３）
シーケンシングと比較したＡＲＭＳアッセイの相対的な感度を比較するために、変異Ｈ１０４７Ｒ（ＨＣＴ−１１６）及びＥ５４５Ｋ（ＭＣＦ−７）を含む細胞株の混合物を用いた。両細胞株は、変異についてヘテロ接合であった。シーケンシングは、Samuelsら（参考文献１）によって記載されるプライマー及びＰＣＲのサイクル条件を用いて行った。ＡＲＭＳアッセイ及びシーケンシングは、総混合物の１００％、５０％、３０％、１０％及び１％の変異遺伝子の濃度で実施した。結果を図１に示す。図１において、表題の「スコーピオンズ」(Scorpions)の下の結果は、PCRの連続の繰り返しの後のアンプリコンのコピー数における増加を示す（コントロール・プライマー及び変異プライマーを用いた結果は別々の線として示されている）。表題の「ＤＮＡシーケンシング」の下には、該混合物において当該遺伝子の逆鎖をシーケンスした結果が示されている。シーケンシングでは、総混合物の５０％未満で存在する場合にはＨ１０４７Ｒの変異の存在を検出することはできず、総混合物の３０％未満で存在する場合にはＥ５４５Ｋの変異の存在を検出することができなかった。これに対して、本発明のプライマーを用いたアッセイは、１％の濃度において変異の存在を検出することができた。

【0069】

（実施例４）
ＡＲＭＳ／スコーピオン・アッセイを用いてＰＩＫ３ＣＡ変異の存在が評価された様々な腫瘍型からの新鮮凍結組織から抽出したＤＮＡに本アッセイを適用した。合計で、２７９の腫瘍試料からＤＮＡが利用可能であった。アッセイにより、４９の直腸結腸癌試料のうち５個（１０．２％）、４９の乳癌試料のうち１９個（３８．７％）、５１の肺癌試料のうち１個（１．９％）、及び３４の黒色腫（メラノーマ）試料のうち１個（２．９％）において、変異が報告された。５０の前立腺癌試料又は４６の卵巣癌試料では、変異は検出されなかった。ＰＩＫ３ＣＡ変異が陽性の直腸結腸癌試料のうち、３個はＨ１０４７Ｒであり、１個はＨ１０４７Ｌであり、１個はＥ５４２Ｋであった。ＰＩＫ３ＣＡ変異が陽性の乳癌試料のうち、１５個はＨ１０４７Ｒであり、１個はＨ１０４７Ｌであり、３個はＥ５４５Ｋであった。ＰＩＫ３ＣＡ変異が陽性である両肺癌試料及び黒色腫試料における変異はＨ１０４７Ｒであった。シーケンシングは、検出された２６の総変異のうち１４（５３％）のみ同定した。シーケンシングは、ＡＲＭＳアッセイでは検出されるように設計されていない、一つの乳癌試料において変異を検出した（c. 1634 Ａ＞Ｇ；p Ｅ５４５Ｇ）。これは、新規の変異でなく、乳癌及び直腸結腸癌において以前記載されていたものである（参考文献３〜５）。

【0070】

分析された試料におけるＰＩＫ３ＣＡ変異の出現は、卵巣癌を除いて、以前の研究と一致した（参考文献１、３〜９）。ＰＩＫ３ＣＡ変異は、卵巣癌において以前記載されているが、類内膜癌及び明細胞癌と関係しているかもしれないことが示唆されている（参考文献８、１０）。本調査において試験された全ての卵巣癌は、いずれのＰＩＫ３ＣＡ変異も存在しないことを説明するだろう漿液性腺癌であった。

【0071】

ＡＲＭＳアッセイは、ダイレクト・シーケンシングよって見られるよりも、臨床試料においてより多くの変異を同定した。細胞株の混合物により、本アッセイは、注目するＰＩＫ３ＣＡ変異を検出するのに、シーケンシングよりもより感度が高いことが確認された。腫瘍及び正常組織の両方を含むだろう臨床試料の不均一性は、場合によっては変異の出現はシーケンシング法によっては検出可能ではないことを意味し、ＡＲＭＳアッセイが臨床適用により好適である。不利な点としては、特定のＡＲＭＳ特異的変異のみが検出されることである。しかしながら、この一連の２７９の試料において、ＡＲＭＳアッセイでは検出されるように設計されていない、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン９又は２０において一つのみの変異が検出された。

【0072】

要約すると、実施例は、本発明がＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における４つの最も一般的な変異の検出のための感度が高く、高いスループットのアッセイを提供することを示す。本アッセイは、少量のＤＮＡに適用してもよく、試料内において低レベルの変異ＰＩＫ３ＣＡを検出することができる。

【0073】

＜配列表フリーテキスト＞

<210> 1
<223> E542K 標的領域

<210> 2
<223> E545K 標的領域

<210> 3
<223> E542K-0 フォワード・プライマー

<210> 4
<223> E542K-1 フォワード・プライマー

<210> 5
<223> E542K-2 フォワード・プライマー

<210> 6
<223> E542K-3 フォワード・プライマー

<210> 7
<223> E542K-4 フォワード・プライマー

<210> 8
<223> E542K-5 フォワード・プライマー

<210> 9
<223> E542K-6 フォワード・プライマー

<210> 10
<223> E545K-0 フォワード・プライマー

<210> 11
<223> E545K-1 フォワード・プライマー

<210> 12
<223> E545K-2 フォワード・プライマー

<210> 13
<223> E545K-3 フォワード・プライマー

<210> 14
<223> E454K-4 フォワード・プライマー

<210> 15
<223> E545K-5 フォワード・プライマー

<210> 16
<223> E545K-6 フォワード・プライマー

<210> 17
<223> エクソン9 スコーピオン

<210> 18
<213> エクソン 9 スコーピオン２

<210> 19
<223> H1047R及びH1047L 標的領域

<210> 20
<223> H1047R-0 フォワード・プライマー

<210> 21
<223> H1047R-1 フォワード・プライマー

<210> 22
<223> H1047R-2 フォワード・プライマー

<210> 23
<223> H1047R-3 フォワード・プライマー

<210> 24
<223> H1047R-4 フォワード・プライマー

<210> 25
<223> H1047R-5 フォワード・プライマー

<210> 26
<223> H1047R-6 フォワード・プライマー

<210> 27
<223> H1047L-0 フォワード・プライマー

<210> 28
<223> H1047L-1 フォワード・プライマー

<210> 29
<223> H1047L-3 フォワード・プライマー

<210> 30
<223> H1047-3 フォワード・プライマー

<210> 31
<223> H1047L-4 フォワード・プライマー

<210> 32
<223> H1047L-5 フォワード・プライマー

<210> 33
<223> H1047L-6 フォワード・プライマー

<210> 34
<223> エクソン20 スコーピオン

<210> 35
<223> エクソン20 スコーピオン２

<210> 36
<223> コントロール標的領域

<210> 37
<223> コントロール・プライマー

<210> 38
<223> コントロール・スコーピオン

<210> 39
<223> コントロール・スコーピオン２

【0074】

（参考文献）
1. サミュエルズ・ワイ、ワング・ジー、バーデリ・エーら、「ヒト癌におけるPIK3CA遺伝子の高頻度の変異」サイエンス2004;304(5670): 554（Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science 2004;304(5670):554.）
2. ヒグチ・アール、クラメル・ビー、サイキ・アールケー、「ＤＮＡ断片のイン・ビトロ調整及び特定の変異生成の一般的方法：タンパク質及びＤＮＡの相互作用の研究」、核酸リサーチ1988;16(15):7351-67（Higuchi R, Krummel B, Saiki RK. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res 1988;16(15):7351-67.）
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8. キャンプベル・アイジー、ラッセル・エスイー、コーング・ディーワイら、「卵巣癌及び乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子の変異」、癌リサーチ2004;64(21):7678-81（Campbell IG, Russell SE, Choong DY, et al. Mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer. Cancer Res 2004;64(21):7678-81.）
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【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]