特許 5721937 破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に使用できるキンセノシド含有医薬組成物および抽出液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5721937

(24)【登録日】2015年4月3日

(45)【発行日】2015年5月20日

(54)【発明の名称】破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に使用できるキンセノシド含有医薬組成物および抽出液

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7048 20060101AFI20150430BHJP

   A61K 36/18 20060101ALI20150430BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20150430BHJP

   A61P 19/10 20060101ALI20150430BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150430BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7048

   A61K35/78 C

   A61P19/02

   A61P19/10

   A61P29/00 101

【請求項の数】5

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2009-130326(P2009-130326)

(22)【出願日】2009年5月29日

(65)【公開番号】特開2010-155821(P2010-155821A)

(43)【公開日】2010年7月15日

【審査請求日】2009年6月3日

【審判番号】不服2012-22185(P2012-22185/J1)

【審判請求日】2012年11月8日

(31)【優先権主張番号】097151694

(32)【優先日】2008年12月31日

(33)【優先権主張国】TW

(73)【特許権者】

【識別番号】509075457

【氏名又は名称】中國醫藥大學

(74)【代理人】

【識別番号】100082418

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 朔生

(72)【発明者】

【氏名】林文川

(72)【発明者】

【氏名】呉金濱

(72)【発明者】

【氏名】蕭宏柏

(72)【発明者】

【氏名】何惠雅

【合議体】

【審判長】 内田 淳子

【審判官】 渕野 留香

【審判官】 安藤 倫世

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００２−１４５８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−９２４９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平７−７６５２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ＭＡＳＵＤＡ，Ｋ． ｅｔ ａｌ，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｍｉｎｅｒａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００８年，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．２，ｐ１２３−１２９

【文献】 Ｉｔｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ，１９９３，Ａｌｉｐｈａｔｉｃ ａｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｋｏｓｈｕｎｅｓｉｓ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．５，ｐ１１３３−１１３７

【文献】 Ｄｕ ＸＭ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｕｔａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４９，Ｎｏ．７，ｐ１９２５−１９２８

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K,A61P,C07H

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ），ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ），ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ），ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ），ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ），ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に用いられる医薬組成物であって、
有効量の式（Ｉ）の化合物

【化1】

またはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物。

【請求項2】

前記式（Ｉ）の化合物は金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）に由来する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記金線連は台湾金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ Ｈａｙａｔａ）である、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

抗骨粗しょうに用いられる、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくはエステルの含量が、式（Ｉ）の化合物に換算して、組成物総量の約４重量％から約８重量％である、請求項４に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化におけるキンセノシドの応用に関する。

【背景技術】

【0002】

骨は主に有機成分（コラーゲン、ムコイドなど）、無機成分（カルシウム塩、リン塩など）および水などからなり、一種の動的平衡の組織であり、停止することなく骨形成作用と骨吸収作用を行い、両者を総称して骨の再造形といい、微細な傷の修復だけでなく、骨の耐圧性を高めることができる。また、骨形成作用には新骨質の形成および骨の鉱質化が含まれる。

【0003】

骨の再造形は、形成作用を行う骨芽細胞と吸収作用を行う破骨細胞の２種の異なる細胞の協力によって行われる。この２つの細胞間の協調に誤りが発生すると、骨の再造形は平衡を失う。例を挙げると、吸収作用が形成作用より大きくなると臨床上よく見られる骨粗しょう症が現れる。特に閉経後の女性に現れる。この逆の状況は稀にしか見られないが、骨質の異常増加をもたらす。

【0004】

現在、世界で約２億の女性が骨粗しょう症を患っており、２００３年における骨粗しょうおよびホルモン補充療法の世界市場は８３億米ドルであり、２０１４年には１７９億米ドルに達すると推定される。そのうち、骨粗しょう症を治療する薬物は、薬物の作用メカニズムによる分類では大体次の４つに分類できる。１．骨吸収抑制作用。例えば重硫酸塩類、２．骨形成促進作用、例えばパラソルモン、３．骨のカルシウム放出抑制、例えばエストロゲン、４．小腸のカルシウム吸収促進、例えばビタミンＤ。しかし、重硫酸塩類薬物は頭痛、吐き気、嘔吐、下痢、発熱、腎不全、食道炎や下顎骨壊死など強い副作用があり、パラソルモンを服用すると頭痛、吐き気などの不快感が生じ、エストロゲンには発癌のリスクがある。また、ビタミンＤの利用によりカルシウムの吸収を増やして骨粗しょう症の改善を図る場合、その効果には限りがある。それゆえ、骨粗しょう症を効果的に治療し、かつ副作用の低い物質または医薬組成物が依然として必要とされている。

【0005】

マクロファージは、肝臓中のクッペル星細胞や脳部の小膠細胞など、異なる組織中では異なる分化形態の細胞を呈する。マクロファージは、骨組織中では破骨細胞の分化形態を呈しており、同時に骨芽細胞と動的平衡を保つ。

【0006】

血液中のマクロファージは、人体の免疫防御メカニズムにおける最初の防御線であるので、炎症反応において非常に重要な役割をもっている。具体的にいうと、マクロファージは病原体と接触すると活性化し、病原体を壊滅させる能力が働き始める。それと同時に腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）やインターロイキン−６（ＩＬ−６）など、炎症反応を促進するサイトカインを分泌する。したがって、病原体の刺激が強すぎた場合、あるいはマクロファージが短時間内にサイトカインを出しすぎた場合、患者に敗血症性ショックが引き起こされることがある。

【0007】

炎症発生過程において、マクロファージはサイトカインを放出するだけでなく、抗原を提示する働きもする。具体的にいうと、マクロファージが抗原作用を呈すると、Ｔ細胞の分化、さらにはＢ細胞および抗体の産生にも影響を与える。そしてＢ細胞および抗体も病原体を壊滅させる効果をもっている。したがって、マクロファージは第一線の免疫反応機能のみならず、免疫調節の役割ももっている。これについてはＦｕｉｊｗａｒａ Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４、２８１−２８６を参照されたい。

【0008】

現時点の研究が示すところによると、癌やリウマチ様関節炎などほとんどの慢性疾患が炎症反応と関係がある。言い換えれば、マクロファージはこれらの病気の発病機序に関与している。これについてはＮａｉｔｏ Ｍ．２００８．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｔｈｏｌ Ｉｎｔ ５８、１４３−１５６を参照されたい。

【0009】

リウマチ様関節炎を例にとると、その病理においてマクロファージが重要な役割を果たしている。概略的にいうと、リウマチ様関節炎によってマクロファージが活性化し、サイトカインを放出し、慢性炎症の発生を促進する。また関節の滑液内に各種炎症細胞が充満すると、それによって分泌されるサイトカインおよび成長因子がマクロファージを破骨細胞に分化させ、それによって関節の骨が損傷される。現在、リウマチ様関節炎の主な治療薬はステロイドである。しかし、ステロイドには、水腫、骨粗しょう症など多くの副作用がある。そのため、リウマチ様関節炎を有効に治療しかつ副作用の低い物質または医薬組成物を提供することが依然として強く必要とされている。

【0010】

金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．、キバナノシュスラン）はラン科植物に属し、そのうち、台湾金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ Ｈａｙａｔａ、台湾キバナノシュスラン）には降圧、降血糖、肝臓保護、抗炎症および免疫力調節など幅広い効果があると伝えられ、そのため「薬王」、「薬虎」などの別名をもっている。また、すでに文献で確認されているところによると、台湾金線連の粗抽出物には抗骨粗しょうの薬理的効果がある（Ｓｈｉｈ ＺＺ、Ｗｕ ＹＷ、Ｌｉｎ ＷＣ．２００１．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｏｖｅｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ ７７、２３３−２２８およびＭａｓｕｄａ Ｋ、Ｉｋｅｕｃｈｉ Ｍ、ｋｏｙａｍａ Ｔ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ、Ｗｏｏ ＪＴ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｔ、Ｙａｚａｗａ Ｋ．２００８．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｍｅｔａｂ ２６、１２３−１２９を参照）。

【0011】

しかし、台湾金線連のもつ抗炎症および抗骨粗しょう効果についてその有効成分は今なお明らかでなく、そのことが薬効の最適化および薬理研究の制約となっている。また、従来の株分け繁殖の方法は非常に時間がかかり、その上採集による消耗を食い止められないため、台湾金線連の天然産地のものの含量が非常に損なわれている。台湾金線連を組織培養する栄養繁殖法（Ｓｈｉａｕ ＹＪ、Ｓａｇａｒｅ ＡＰ、Ｃｈｅｎ ＵＣ、Ｙａｎｇ ＳＲ、Ｔｓａｙ ＨＳ．２００２．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ ＨＡＹＡＴＡ ｂｙ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｒｏｓｓ−ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｅｄｓ．Ｂｏｔ Ｂｕｌｌ Ａｃａｄ Ｓｉｎ ４３：１２３−１３０を参照されたい）や特開１０−０５６８７５に開示の苗根改良培養のように、業界は積極的に金線連の栽培方法の研究開発に取り組んでいるが、それでも金線連を提供できる数量は繁殖／培養速度の制約を受けている。そのため、金線連中の抗炎症および抗骨粗しょうに効く活性成分を知ることができれば、今後人工合成方式によって大量生産および製剤提供が可能になる。

【0012】

本発明は、上述の必要に応えて行われた研究であり、本願発明者は生体内および生体外の関連実験を行って、台湾金線連中の抗炎症および抗骨粗しょうの主要活性化合物を確認し、それが骨形成作用を促進し、骨吸収作用を抑制する機能をもつことを確認し、さらにこの化合物にはマクロファージの活性化を抑制する効果があることも発見した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明の一目的は、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に用いられ、有効量の（Ｉ）式の化合物またはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物を提供することであり、前記式（Ｉ）の化合物はキンセノシドである。

【0014】

【化1】

【0015】

本発明のもう１つの目的は、マクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に用いられ、前記式（Ｉ）の化合物を含む金線連抽出液を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明の分野の通常の知識をもつ者に本発明の特徴を知っていただくために、本発明の技術の詳細および実施するための最良の形態を以下に記す。

【0017】

以上に述べたように、台湾金線連の粗抽出物に抗炎症と抗骨粗しょうの薬効があることはすでに知られていたが、その有効成分は明らかでなかった。本願発明者は無数の生体外細胞実験と生体内動物実験を行った結果、下の式（Ｉ）の化合物が、台湾金線連中のマクロファージ活性化を抑制し、破骨細胞形成を抑制し、破骨細胞機能を抑制および／または骨芽細胞を活性化する主要活性成分であることを発見した。

【0018】

【化2】

式（Ｉ）の化合物はキンセノシドと俗称されているものであり、以下の文では「キンセノシド」で式（Ｉ）の化合物を表す。

【0019】

骨粗しょう症は骨中の形成作用と吸収作用の間の失調によってもたらされると考えられている。そのうち、骨中の骨芽細胞には骨形成作用があり、破骨細胞には骨吸収作用がある。具体的にいうと、骨粗しょう症が生じる原因の１つは、骨中に破骨細胞が多すぎる、あるいは破骨細胞が生じさせる吸収作用の速度が速すぎるために、骨中のカルシウムを過度に流失させて骨密度の低下をもたらすからである。したがって、破骨細胞の機能（即ち吸収作用の進行）および／または破骨細胞の形成（マクロファージの分化に由来）を抑制すれば、骨の吸収作用をコントロールし、さらには骨粗しょう症の予防および改善が可能になる。また、骨粗しょう症が生じるもう１つの原因は、骨中の骨芽細胞の形成作用が不足しているからである。そのため、骨芽細胞を活性化して骨の形成作用を促進することができれば、骨中のカルシウムを増加させ、さらには骨粗しょうの現象の予防または改善につながる。

【0020】

後述の実施例に示すように、本願発明者は、キンセノシドが破骨細胞を抑制し、その形成を抑制する効果があり、そのため骨の吸収作用を低下／抑制することができることを発見した。本願発明者はさらに、キンセノシドが同時に骨芽細胞を活性化させる効果があり、骨の生成作用を促進できることを発見した。驚くべきことに、キンセノシドは（１）破骨細胞の機能の抑制、（２）破骨細胞の形成の抑制、（３）骨芽細胞の活性化効果を同時に備えていることであり、これは明らかに骨粗しょうの予防および治療に満足できる効果をもたらすことができる。

【0021】

したがって、本発明のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物は、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化、特に抗骨粗しょうに有用である。本文中で使用する「抗骨粗しょう」という用語には、骨粗しょうの予防、骨粗しょうの改善および骨粗しょうの治療の意味が含まれる。

【0022】

また、上述のように、キンセノシドには骨芽細胞の活性化の効果があるので、骨の形成作用にとっても有益である。

【0023】

一方、本願発明者は、キンセノシドは破骨細胞機能の抑制／骨芽細胞の形成および活性化の機能の他に、マクロファージの活性を抑制する効果もあることを発見した。関連研究では、リポ多糖体（ＬＰＳ）がマクロファージを活性させることを発見している。これはグラム陰性菌の細胞壁の成分である（Ｃａｖａｉｌｌｏｎ ＪＭ．Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ Ｍ．２００５．Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｓｅｐｓｉｓ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３３、Ｓ５０６−Ｓ５０９を参照）。後述の実施例に示すように、キンセノシドはリポ多糖体によるマクロファージ活性化を抑制する作用がある。

【0024】

上述のように、マクロファージは病原体を壊滅させると同時に、炎症反応を促進するサイトカインも分泌するので、炎症反応において非常に重要な役割をもっている。キンセノシドがマクロファージの活性化を抑制する効果があることから、マクロファージの炎症反応を促進させるサイトカインの放出をも抑制し、ひいては抗炎症の作用を果たす。したがって、本発明のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物は、マクロファージの活性化の抑制、特に抗炎症に使用することができる。本文中の「抗炎症」という用語には、炎症の予防、炎症の改善および炎症の治療の意味が含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】キンセノシドの抽出および単離の工程図である。

【図2】キンセノシドをＩＣＲマウスに投与後のＩＣＲマウスの死亡率変化図である。

【図3A】キンセノシドを関節炎ＩＣＲマウスに投与後のＴＮＦ−αのｍＲＮＡの電気泳動図である。

【図3B】キンセノシドを関節炎ＩＣＲマウスに投与後のＴＮＦ−αのｍＲＮＡの統計直線図である。

【図4】キンセノシドをＲＡＮＫＬで活性化したＲＡＷ ２６４．７マクロファージに投与した顕微鏡図である。

【図5A】ＲＡＮＫＬでＲＡＷ ２６４．７マクロファージを活性化後のＮＦ−κＢの電気泳動度移動アッセイ（ＥＭＳＡ）図である。

【図5B】キンセノシドをＲＡＷ ２６４．７マクロファージに投与後のＮＦ−κＢの電気泳動度移動アッセイ図である。

【図5C】キンセノシドをＲＡＷ ２６４．７マクロファージに投与後のＮＦ−κＢの細胞核への進入の統計直線図である。

【図6A】キンセノシドをＲＡＷ ２６４．７マクロファージに投与後の金属プロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）のｍＲＮＡの電気泳動図である。

【図6B】キンセノシドをＲＡＷ ２６４．７マクロファージに投与後の金属プロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）のｍＲＮＡの統計直線図である。

【図7】キンセノシドをＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に投与後の細胞培養皿の染色図である。

【図8】キンセノシドを卵巣除去ＩＣＲマウスに投与後のその大腿骨骨端部位のマイクロコンピュータ断層走査図である。

【図9】キンセノシドを卵巣除去ＩＣＲマウスに投与後のその大腿骨骨梁周囲の破骨細胞の顕微鏡図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明の具体的な一実施形態では、本発明のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含む医薬組成物は特に関節炎の炎症反応の治療に適している。具体的にいうと、関節炎の初期に関節の滑膜液内に多くのマクロファージが集まり、それによって放出されたサイトカインが炎症反応を促進し、軟骨の損傷をもたらす。そのために骨の吸収作用が起こり、関節の骨を損傷させる。言い換えると、関節炎の治療は、マクロファージの活性化を抑制することが重要なステップである。したがって、キンセノシドを各種関節炎の症状の予防および治療に使用することができる。例えば、リウマチ様関節炎、痛風性関節炎、細菌性関節炎、退化性関節炎、硬直性関節炎や骨関節症などである。

【0027】

それゆえ、本発明は一方においてはマクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に用いられる、有効量のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを含有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物中で、キンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルの含量は絶対的に重要な点ではなく、所望のマクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化の効果を提供できさえすればよい。したがって、投与ターゲットの必要によって、１日１回、１日多数回、数日に１回など異なる投与頻度で本発明の医薬組成物を投与してよい。抗骨粗しょうへの使用を例にとると、本発明の組成物のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルの含量は、キンセノシドに換算して組成物総量の約４重量％から約８重量％であり、適量は約５重量％から約７重量％である。しかし、抗炎症に使用する場合、本発明の組成物のキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルの含量は、キンセノシドに換算して組成物総量の約７重量％から約１３重量％であり、適量は約９重量％から約１１重量％である。

【0028】

実際の投与では、抗骨粗しょうを例にとると、キンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルの用量は、キンセノシドに換算して通常１人当たり（体重６０ｋｇの成人を例にとる）１日の平均用量は約２０ｍｇから約２００ｍｇであり、適量は約４０ｍｇから約１５０ｍｇである。最適な量は１人当たり１日約６０ｍｇから約１００ｍｇである。抗炎症に用いる場合は、キンセノシドに換算して、通常１人１日の平均用量は約３０ｍｇから約３００ｍｇであり、適量は約５０ｍｇから２００ｍｇである。最適な量は１人１日当たり約７０ｍｇから１５０ｍｇである。ただし、急性疾患（急性関節炎や骨質の流失がひどい場合）の場合の用量は実際の必要に応じて数倍または数十倍に増量してよい。

【0029】

本発明の医薬組成物が適切な方式で施用可能であることを例を挙げて説明したが、この限りではなく、経口、皮下または静脈内などの投与方式で施用することができる。キンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルは、単独使用してもよいし、医薬用補剤と一緒に使用してもよい。また実際に獣医および人対象の医薬に使用可能である。

【0030】

したがって、本発明はもう一方ではキンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルの薬剤製造への応用（使用方法）を含み、これは適切な方式でマクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化、特に抗骨粗しょうと抗炎症（抗関節炎など）に用いられる薬剤の製造に使用することができる。経口投与に適した薬剤の製造についていうと、キンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを、この目的に適いかつキンセノシドの活性に影響しない補剤、例えば溶剤、油性溶剤、希釈剤、安定剤、吸収遅延剤、崩壊剤、乳化剤、粘着剤、潤滑剤、吸湿剤などと混合できる。例えば、溶剤は水や蔗糖溶液から、希釈剤は乳糖、澱粉、マイクロクリスタルセルロースから、吸収遅延剤は多糖類（キトサン）とグルコサミン多糖から、潤滑剤は炭酸マグネシウムから、油性溶剤はオリーブ油、ひまわり油、肝油などの植物や動物油からそれぞれ選ぶことができる。したがって、周知の方法を利用して適切な経口投与薬の形態に製造することが可能である。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、軟稠剤、液剤、シロップ剤、懸濁液剤、乳剤、チンキ剤などである。

【0031】

皮下または静脈内投与方式に適した薬剤についていうと、キンセノシドまたはその医薬上許容される塩もしくはエステルを、必要に応じてこの目的に慣用の材料、例えば可溶化剤、乳化剤やその他の補剤などと混合して静注液、乳剤静注液、注射剤、乾燥粉末注射剤、懸濁液注射剤、乾燥粉末懸濁液注射剤などに製造する。採用可能な溶剤は、水、生理食塩液、アルコール類（エチルアルコール、プロピルアルコールやグリセリンなど）、糖溶液（ブドウ糖やマンニトールなど）または上記の組合せなどである。

【0032】

上記の使用可能な医薬製剤の補剤成分の他に、必要に応じて矯味剤、調色剤、着色剤などの添加剤を加えることにより、得られる薬剤の服用時の口当たりや見た目をよくすることができる。また合理的な用量の保存剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤などを添加して、得られる薬剤の保存性を改善させることができる。

【0033】

他方、本発明の医薬組成物の効果を一層強化し、薬剤配合の柔軟な活用および調合性を高めるために、必要に応じて本発明の医薬組成物に１種類または多種類の他の活性成分を併せて含有させることができる。例を挙げると、本発明の医薬組成物と併用できる他の活性成分には、アレンドロネート、パラソルモン、エストロゲン、カルシウム化合物やビタミンＤなど骨粗しょう症の治療薬、コンドロイチンやグルコサミンなどの抗関節炎症薬やその他の活性成分がある。これらの活性成分はキンセノシドの効果に悪影響さえ与えなければよい。

【0034】

本発明の医薬組成物に含まれるキンセノシドは天然でも人工合成で提供してもよい。できれば、キンセノシドは金線連由来のもの、特に台湾金線連由来のものであることが好ましい。したがって、適切な抽出手段に単離操作を組み合わせて金線連からキンセノシドを得る。これらの分離方法についてはＩｔｏ Ａ、Ｋａｓａｉ Ｒ、Ｙａｍａｓａｋｉ Ｋ、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｈ、１９９３、Ａｌｉｐｈａｔｉｃ ａｎｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｋｏｓｈｕｎｅｓｉｓ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１１３３−１１３７およびＤｕ ＸＭ、Ｙｏｓｈｉｚａｗａ Ｔ、Ｓｈｏｙａｍａ Ｙ．１９９８、Ｂｕｔａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４９：１９２５−１９２８に掲載のものを参照できる。この文献の全文を参考のためにここに示す。他にＺｈａｎｇ Ｘ、Ｌｉｎ ＺＹ、Ｈｕａｎｇ ＨＨ、Ｃｈｅｎ ＱＨ、２００４、Ｎｏｖｅｌ ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｋｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ、Ｃｈｉｎｅｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２、３１７−３１８に掲載の全合成方式によりキンセノシドを得ることも可能である。この文献の全文を参考のためにここに示す。

【0035】

したがって、本発明のキンセノシドを含む金線連抽出液に関しても同様に、マクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化に用いることができる。本発明の金線連抽出液中に親酢酸エチル成分が実質的に含まれていないことが好ましい。本文中の「親酢酸エチル成分」とは当該成分を水中に溶かしたとき酢酸エチルを用いて分配させ除去できる成分をさす。発見によると、金線連抽出液中の親酢酸エチル成分は肝細胞の傷害を悪化させる。金線連抽出液中の親酢酸エチル成分を実質的に除去すれば、金線連抽出液の医薬品としての用途で投薬された者に与える潜在的傷害を有効的に緩和することができる。

【0036】

本発明の金線連抽出液は水性抽出液であり、親酢酸エチル成分が含まれていないことが好ましい。これは以下の操作によって得られる。即ち、金線連を水中でつぶして漿液にする→濾過して水性抽出液を採取する→酢酸エチルをその抽出液に添加する→酢酸エチル分配液を除去する。できるだけ抽出液中の酢酸エチルに溶ける成分を低減するために、必要に応じてこの酢酸エチル分配操作を繰り返す。

【0037】

本発明の具体的な一実施形態では、次のようにして本発明のキンセノシドを含む抽出液を得る。まず金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ Ｈａｙａｔａ）（１０ｋｇ）を水１００Ｌで攪拌して汁にし、濾過して汁液を取る（水で金線連の乾燥品を煎じて煎じ液を取ってもよい）。次に毎回酢酸エチル２５Ｌで分配を行い、上層の酢酸エチル層を除去してから、さらに酢酸エチル２５Ｌで分配を行い、これを３回続け、酢酸エチル層を合わせた酢酸エチル部分と下層の水溶性部分を得る。この水溶性部分が本発明におけるキンセノシドを含む抽出液であり、これには親酢酸エチル成分が含まれていない。また、この水溶性部分を必要に応じてアルコール類（１０％のメチルアルコールなど）で溶出させて、キンセノシドの含量を増加させてもよい。

【0038】

本発明はまた、この金線連抽出液を薬剤への応用に使用することに関し、マクロファージ活性化の抑制、破骨細胞形成の抑制、破骨細胞機能の抑制および／または骨芽細胞の活性化、特に抗骨粗しょうおよび抗炎症（抗関節炎など）に適宜用いられる薬剤の製造に使用することができる。

【0039】

ここでは具体的な実施形態を挙げてさらに本発明について説明する。これらの実施形態は説明のために提供するものであって、本発明の範疇を制限するためのものではない。

【0040】

材料
台湾金線連（Ａｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓ ｆｏｒｍｏｓａｎｕｓ Ｈａｙａｔａ）は有容農場（台湾の埔里）が育成した植物を購入した。この植物サンプルはすでに中国医薬大学薬学院に寄託し（受託番号：ＣＭＵ ＡＦ ０６０９）、当院の鑑定を受けた。

【0041】

キンセノシドの抽出および単離
（１）まず１０ｋｇの新鮮な金線連を１００Ｌの水で攪拌して汁にし、濾過して汁液を取る（ＡＦＥで表す）。このステップは水で金線連の乾燥品を煎じて、その煎じ液を取る方式で代替してもよい。次に毎回酢酸エチル２５Ｌで分配を行い、上層の酢酸エチル層を除去してから、さらに酢酸エチル２５Ｌで分配を行い、これを３回続け、酢酸エチル層を合わせた酢酸エチル部分（ＡＦＥＥで表す）と下層の水溶性部分（ＡＦＥＷで表す）を得る。

【0042】

（２）減圧下でＡＦＥＥ部分およびＡＦＥＷ部分を蒸発させて、それぞれ４７．４ｇの緑色の油状残留物と２１８．４ｇの赤色残留物を得る。ＡＦＥＷ部分から得られた赤色残留物（２１０ｇ）をＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０カラム（Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｅｎｓｕｉ Ｃｏ．、日本より購入）に入れ、水、１０％メチルアルコール（水中に溶かす）、２０％メチルアルコール（水中に溶かす）、５０％メチルアルコール（水中に溶かす）および１００％メチルアルコールで溶出させて、５つの区画を得、それぞれをＡＦＥＷ−１からＡＦＥＷ−５で表す。ＡＦＥＷ−１からＡＦＥＷ−５の乾燥重量はそれぞれ１４１．３８ｇ、２２．０６ｇ、８．１６ｇ、９．２１ｇおよび３．７８ｇである。以上の操作は図１に示すとおりである。

【0043】

（３）続いてＡＦＥＷ−２（１０ｇ）の精製を行う。この場合はシリカゲルカラム（Ｓｉ ６０ Ｆ２４５、Ｍｅｒｃｋ、ドイツより購入）を使用し、クロロホルム／エチルアルコール（８：３から１５：８の濃度勾配）を移動相として、４つの区画を得、これを区画１〜４で表す。区画４（４．５ｇ）を取り、分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用して精製を行う。得られた主成分（４．１ｇ）を確認した結果、キンセノシド（即ち式（Ｉ）の化合物）であった。

【0044】

分取用ＨＰＬＣの使用条件は以下のとおりである。即ち、ポンプはＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−８Ａ（京都、日本より購入）、移動相は水、カラムはＭｉｇｈｔｙｓｉｌ ＯＤＳ ＲＰ−１８ Ａｑｕａカラム（内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ、顆粒の大きさ５μｍ、Ｋａｎｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、東京、日本より購入）。

【0045】

区画４の主成分含量は７７．６％に達し、質量分析計（Ｊｅｏｌ ＧＣｍａｔｅ、東京、日本より購入）および核磁気共鳴装置（ＮＭＲ，¹Ｈ、¹³Ｃ、ＤＥＰＴ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ；Ｊｅｏｌ ４００ＭＨｚ、東京、日本）での分析により、該主成分がキンセノシド（３−（Ｒ）−３−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシブタノリド、即ち式（Ｉ）の化合物）であることが確認された。表１は単離後のキンセノシドのＮＭＲデータである。

【0046】

【化3】

【0047】

【表1】

【実施例1】

【0048】

キンセノシドによるリポ多糖誘発のＩＣＲマウス敗血症の抑制
炎症反応は複雑なプロセスであり、フリーラジカル分子（一酸化窒素、過酸化水素など）、サイトカイン（プロスタグランジン２（ＰＧＥ２）、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）など）などの産生が含まれる。したがって、体内の炎症反応と関係のあるフリーラジカル分子およびサイトカインを測定することによって、炎症反応の程度を知ることができる。

【0049】

実験Ａ：キンセノシドによるリポ多糖誘発のマウス血中炎症サイトカイン産生の抑制
腹腔注射により異なる濃度のキンセノシド（１００ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマウスに投与した。３０分後さらに腹腔注射によりリポ多糖（４０ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマウスに投与した。１時間後にＩＣＲマウスの眼の縁から採血し、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）試薬（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡより購入）でＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの濃度を測定した。結果は表２に示すとおりである。

【0050】

【表2】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝１０）。
抑制群との比較、^#Ｐ＜０．０５、^##Ｐ＜０．０１。ＬＰＳ＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１。

【0051】

実験Ｂ：キンセノシドによる高用量リポ多糖誘発のマウス敗血症ショック死の抑制
腹腔注射により異なる濃度のキンセノシド（１００ｍｇ／ｋｇと３００ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマウスに投与した。３０分後さらに腹腔注射によりリポ多糖（８０ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマウスに投与し、７２時間内のマウスの死亡率を観察した。結果は図４に示すように、キンセノシドはマウスの死亡率を減少させることができる。

【0052】

表２および図２から分かるように、キンセノシドは、リポ多糖のマウス腹腔マクロファージの誘発、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージの一酸化窒素放出を抑制でき、さらにリポ多糖誘発のマウス血中ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの量を減少させることができ、そのため高用量リポ多糖が引き起こすマウスの死亡率を有効抑制することができる。これらの結果は、キンセノシドがリポ多糖誘発のマウスの炎症反応を有効抑制できることを示す。

【実施例2】

【0053】

キンセノシドによるコラーゲンタンパク質誘発のＢＡＬＢ／ｃマウスのリウマチ様関節炎の抑制
リウマチ様関節炎の初期は、マクロファージが活性化し、サイトカインを放出して炎症を引き起こし、末期はマクロファージが分化して破骨細胞となり、骨を損傷させる。したがって、マクロファージの活性化を抑制し、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制することにより、リウマチ様関節炎を治療することができる。

【0054】

実験Ｃ：
ＢＡＬＢ／ｃマウスは国家実験動物センターより購入した。マウスの尾部に２００μｇのＩＩ型コラーゲンタンパク質（Ｓｉｇｍａより購入）を皮下注射して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにリウマチ様関節炎を発生させた。ＩＩ型コラーゲンタンパク質は先に補剤フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａより購入）で乳化させる。２１日目にさらに２００μｇのＩＩ型コラーゲンタンパク質をマウスに皮下注射する。このときのＩＩ型コラーゲンタンパク質は先に補剤フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａより購入）で乳化させる。２回目にコラーゲンタンパク質を注射した日から、毎日キンセノシド（１００または３００ｍｇ／ｋｇ）を経口投与し、期間は２１日間とする。投与期間の満了後、マウスを屠殺し、採血するとともに鼠蹊部リンパ節と関節付き足裏を取り出し、測定する。

【0055】

血清中ＴＮＦ−αおよび抗体ＩｇＥ、ＩｇＧ１の濃度を酵素免疫測定法で測定した。抗体ＩｇＥおよびＩｇＧ１試薬はＢｅｔｈｙｌ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸより購入した。結果は表３および表４に示すとおりである。

【0056】

【表3】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。
抑制群との比較、^#Ｐ＜０．０５。コラーゲンタンパク質＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５。

【0057】

【表4】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。
抑制群との比較、^###Ｐ＜０．００１。コラーゲンタンパク質＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^***Ｐ＜０．００１。

【0058】

表３に示すように、コラーゲンタンパク質は関節炎を誘発し、マウスの血中ＴＮＦ−αの濃度上昇を引き起こすが、キンセノシドはこの作用を抑制することができる。表４に示すように、コラーゲンタンパク質は関節炎を誘発し、マウスの血中抗体ＩｇＥとＩｇＧ１の量を上昇させるが、キンセノシドはこの作用を抑制することができる。

【0059】

マウスの両側の鼠蹊部からリンパ節を取り出し、それを篩にかけて単一浮遊細胞をつくり、フローサイトメトリーでリンパ球の数を測定した。また、抗体ＣＤ１９／４５とＣＤ４／２７８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅより購入）でＢ細胞およびＴｈ２細胞を染色して、その占める比率を求めた。結果は表５と表６に示す。

【0060】

【表5】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。
抑制群との比較、^#Ｐ＜０．０５。コラーゲンタンパク質＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^***Ｐ＜０．００１。

【0061】

【表6】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。
抑制群との比較、^##Ｐ＜０．０１、^###Ｐ＜０．００１。コラーゲンタンパク質＋水群との比較、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。

【0062】

表５が示すように、コラーゲンタンパク質は関節炎を誘発してマウス鼠蹊部リンパ節のリンパ球の数を増加させるが、キンセノシドはこの作用を抑制できる。表６が示すように、コラーゲンタンパク質はマウス鼠蹊部リンパ節の中のＢ細胞とＴｈ２細胞の占める比率を上昇させるが、キンセノシドはこの作用を抑制することができる。

【0063】

マウスの右足裏および関節からｍＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現を分析した。結果を図３Ａと図３Ｂに示す。

【0064】

図３Ａと図３Ｂから分かるように、コラーゲンタンパク質は関節炎を誘発してマウス右足裏のＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現を上昇させるが、キンセノシドはＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現を抑制することができる。

【0065】

コラーゲンタンパク質誘発のマウスのリウマチ様関節炎に対しては、キンセノシドは炎症サイトカインの放出を抑制でき、またリンパ球中のＴｈ２細胞およびＢ細胞の比率を抑制でき、さらに抗体ＩｇＥおよびＩｇＧ２の産生を抑制することができる。これらの結果は、キンセノシドがコラーゲンタンパク質の引き起こす関節炎を軽減させることを示す。またその抗炎症作用はマクロファージ活性化の抑制およびマクロファージの抗原を呈する作用の軽減と関係がある。

【実施例3】

【0066】

キンセノシドによる破骨細胞形成の抑制
実験Ｄ：キンセノシドによるラット骨髄細胞の破骨細胞形成の抑制
まず骨髄細胞を用意する。体重２５０ｇから３００ｇのウィスター雄ラットを使用して骨髄細胞を用意する。麻酔下でラットの大腿骨を取り出し、リン酸緩衝液で骨髄細胞を洗い出す。骨髄細胞を培養皿（成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した１０％の胎牛血清、１００活性単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の中で培養し、さらに破骨細胞形成を誘発する分化剤細胞核因子κＢ受容体活性化リガンド（ＲＡＮＫＬ）（５０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫより購入）とマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣより購入）を加えた。９日培養して骨髄の単球を破骨細胞に分化させる。抗酒石酸酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡより購入）で破骨細胞を染色し、破骨細胞の数を計数する。

【0067】

実験群Ａ：キンセノシドとエストラジオールを加える
抑制群と同様の分化剤（ＲＡＮＫＬ、Ｍ−ＣＳＦ）を培養皿中に添加するとともに、それぞれ異なる濃度のキンセノシド（０、５、２５、５０と１００μモル濃度）または１０ナノモル濃度（ｎＭ）のエストラジオール（Ｗａｋｏ、日本より購入）を添加する。次に、ラットの骨髄細胞を９日間培養し、骨髄単球の破骨細胞への変化状況を観察し、さらに下の公式でキンセノシドとエストラジオールの破骨細胞形成抑制のパーセンテージを計算した。得られた結果は表７に示すとおりである。
抑制パーセント（％）＝（抑制群の破骨細胞の数−実験群の破骨細胞の数）／抑制群の破骨細胞の数×１００％

【0068】

実験群Ｂ：エストラジオール拮抗剤を添加
上記の分化剤ＲＡＮＫＬとキンセノシドおよび／またはエストラジオールを培養皿中に添加するとともに、エストラジオール抑制剤フルベストラント（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡより購入）（１ｎモル濃度）を添加した。次に、ラットの骨髄細胞を９日間培養し、骨髄単球の破骨細胞への分化状況を観察し、さらにキンセノシドの破骨細胞形成抑制のパーセンテージを計算した。得られた結果は表７に示すとおりである。

【0069】

【表7】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。
抑制群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。
ｔ−ｔｅｓｔ検査によるエストラジオール群との比較、^#Ｐ＜０．０５。

【0070】

表７から分かるように、キンセノシドもエストラジオールも破骨細胞の形成に対して抑制効果がある。エストロゲンが不足すると骨粗しょう症をもたらすことは周知のとおりである。そのため、骨粗しょう症の治療にすでにエストロゲンの一種であるエストラジオールが使用されている。また、乳癌はエストロゲンの分泌過多と関係があることが実証されている。それゆえ、エストロゲンの分泌過多を抑制するために、乳癌患者は通常フルベストラント薬物を服用する必要がある。したがって、乳癌と骨粗しょう症を同時に患った場合、その骨粗しょう症がエストロゲン不足によるものではなくても、フルベストラント薬物がエストラジオールに対して拮抗性があるためにエストラジオールを使って骨粗しょう症を治療することができないことになる。しかし、表９が示すように、フルベストラントはキンセノシドに対しては抑制効果がないから、キンセノシドを骨粗しょう症のある乳癌患者に活用することができ、同時にフルベストラント薬物も服用可能である。

【0071】

実験Ｅ：ＲＡＷ ２６４．７マクロファージの生存率試験
実験群Ｃ：キンセノシドのＲＡＷ ２６４．７マクロファージ生存率への影響
それぞれ異なる濃度のキンセノシド（０、１０、２５と５０μモル濃度）をＲＡＷ ２６４．７マクロファージ（財団法人食品工業発展研究所より購入）含有の培養皿（成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した１０％の胎牛血清、１００活性単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の中に添加して３日間培養した後、ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡより購入）でその生存率を測定した。その結果を表８に示す。

【0072】

実験群Ｄ：分化剤存在下のキンセノシドのＲＡＷ ２６４．７マクロファージ生存率への影響
上記の各種濃度のキンセノシド（０、１０、２５と５０μモル濃度）をそれぞれ添加するとともに、分化剤ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、３日間培養した後、ＭＴＳによりその生存率を測定した。結果を表８に示した。

【0073】

ＭＴＳの作用原理：生きた細胞はデヒドロゲナーゼ活性があるため、ＭＴＳを赤紫色の水溶性の生成物に還元でき、４９０ｎｍの波長で最高の吸光値をもつ。そのため、吸光値の比率から細胞の生存率を判断できる。細胞の生存率は、以下の式に換算する。
生存率＝実験群の吸光値／抑制群の吸光値×１００％

【0074】

【表8】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。

【0075】

表８から分かるように、キンセノシドもそれとＲＡＮＫＬの組合せもＲＡＷ２６４．７マクロファージの生存率に影響しない。

【0076】

実験Ｆ：キンセノシドによるＲＡＷ ２６４．７マクロファージの破骨細胞形成の抑制
ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを分化剤ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む培養皿で培養した場合、ＲＡＷ ２６４．７マクロファージは通常５日後に分化して破骨細胞になる。実験Ｆでは、各種濃度のキンセノシド（０、１０と５０μモル濃度）またはエストラジオール（１０ｎモル濃度）をそれぞれＲＡＷ ２６４．７マクロファージ含有培養皿に加え、５日間培養した後、ＴＲＡＰ染色試薬で破骨細胞を染色し、顕微鏡でその分化の状況を観察した。結果は図４に示すとおりである。破骨細胞の数を計数し、下記の公式で破骨細胞形成のパーセンテージを計算した。結果は表９に示すとおりである。
抑制％＝（抑制群の破骨細胞の数−実験群の破骨細胞の数）／抑制群の破骨細胞の数×１００％

【0077】

【表9】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。
抑制群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１。

【0078】

表９および図４から分かるように、キンセノシド濃度が増すほどそのＲＡＷ ２６４．７マクロファージの破骨細胞への分化を抑制する効果が高い（例えば、図４の赤い矢印で標示する部分）。また、表８に示すように、キンセノシドもＲＡＮＫＬとの組合せもＲＡＷ ２６４．７マクロファージの生存率に影響しない。したがって、この抑制作用のメカニズムはＲＡＷ ２６４．７マクロファージの分化に対するものであって、このＲＡＷ ２６４．７マクロファージの死亡によるものではない。

【実施例4】

【0079】

ＥＭＳＡによるキンセノシドの破骨細胞形成抑制のメカニズムの分析
実験Ｇ：ＲＡＮＫＬ刺激時間と反応との関係
電気泳動度移動アッセイ（ＥＭＳＡ）を利用してキンセノシドの破骨細胞形成抑制のメカニズムを観察した。現在知られているように、分化剤ＲＡＮＫＬはＲＡＷ２６４．７マクロファージを活性化させ、ＮＦ−κＢを細胞核中に入らせ、ＲＡＷ２６４．７マクロファージの破骨細胞への分化を促進させる（Ｗａｄａ Ｔ、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｔ、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｎ、Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ ＪＭ．２００６．ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１２、１７−２５を参照）。

【0080】

分化剤ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）をＲＡＷ ２６４．７マクロファージ含有培養皿に添加し、０分間、１５分間、３０分間、６０分間、１２０分間培養した後、それぞれ細胞核中のタンパク質を抽出し、ＥＭＳＡ分析を行った。結果は図５Ａに示すとおりである。ＥＭＳＡの分析で使用したＤＮＡ配列は以下のとおりである。

【0081】

cy5-5'-TCGACCAACTGGGGACTCTCCCTTTGGGAACA-3'
cy5-5'-TCGATGTTCCCAAAGGGAGAGTCCCCAGTTGG-3'。

【0082】

図５Ａから分かるように、分化剤ＲＡＮＫＬで刺激後のＲＡＷ２６４．７マクロファージでは、ＮＦ−κＢの細胞核への進入量が６０分後に最大値に達している。そこで、これを根拠に次の実験では６０分間をＲＡＮＫＬ刺激反応の測定時間とした。

【0083】

実験Ｈ：キンセノシドによるＮＦ−κＢの細胞核への進入量の低減
分化剤ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）をＲＡＷ ２６４．７マクロファージ含有培養皿に添加し、さらに異なる濃度のキンセノシド（０、１０、２５、５０μモル濃度）をそれぞれ添加して試験を行った。ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを６０分間培養した後、細胞核中のタンパク質をそれぞれ取り出し、ＥＭＳＡ分析を行った。結果は図５Ｂと図５Ｃに示すとおりである。ここで使用したＤＮＡ配列は上記のＤＮＡ配列と同じである。図５Ｂと図５Ｃから分かるように、キンセノシドはＮＦ−κＢの細胞核への進入量を低減させることができる。

【0084】

以上で分かるように、キンセノシドはＲＡＷ２６４．７マクロファージの細胞核へのＮＦ−κＢの進入量を低減させ、それによって破骨細胞への分化が抑制される。本発明はこのメカニズムを通じてキンセノシドを含む医薬組成物および抽出液が骨の吸収作用を抑制する効果を達成させる。

【実施例5】

【0085】

キンセノシドによる破骨細胞の活性の抑制
破骨細胞が活性化すると、金属プロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）を放出して骨質中のコラーゲンタンパク質を吸収する。ＲＴ−ＰＣＲによってＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現を分析すると、キンセノシドが破骨細胞の骨吸収活性を抑制できるか否かを知ることができる。

【0086】

実験Ｉ：キンセノシドによる破骨細胞ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現の抑制
ＲＡＷ ２６４．７マクロファージを分化剤ＲＡＮＫＬ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む培養皿で培養するとき、同時にキンセノシド（５０μモル濃度）を加えて２４、４８、７２時間培養した後、ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＭＭＰ−９の発現を分析した。結果は図６Ａと図６Ｂに示すとおりである。キンセノシドは破骨細胞のＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現を抑制することができる。したがって、キンセノシドは破骨細胞の骨吸収作用を抑制できる。

【実施例6】

【0087】

キンセノシドによる骨芽細胞の活性化
実験Ｊ：キンセノシドのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽前駆細胞生存率への影響
実験群Ｅ：キンセノシドのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存率への影響
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡより購入）は骨芽前駆細胞である。骨芽細胞の後段階の分化過程を観察するために、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を含む培養皿中に適度の分化剤を添加してもよい。各種濃度のキンセノシド（０、１００、１，０００ｎモル濃度）をそれぞれＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を含む培養皿（成分はα−最少必須培地、熱で活性を除去した１０％の胎牛血清、１００活性単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン）の中に加え、３日間培養した後、ＭＴＳにてその生存率を測定した。結果は表１０に示した。

【0088】

実験群Ｆ：分化剤存在下のキンセノシドのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞生存率への影響
上記各種濃度のキンセノシドをそれぞれ添加するとともに、分化剤としてビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａより購入）とβ−グリセロリン酸（１０μモル濃度、Ｓｉｇｍａより購入）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を含む培養皿に加え、３日間培養した後、ＭＴＳでその生存率を測定した。結果は表１０に示すとおりである。細胞生存率は以下の公式に換算した。
生存率＝実験群の吸光値／抑制群の吸光値×１００％

【0089】

【表10】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。
抑制群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１。

【0090】

表１０から分かるように、キンセノシドは単独ではＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存率をやや低下させるが、ビタミンＣおよびβ−グリセロリン酸と組み合わせるとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存率に影響しない。

【0091】

実験Ｋ：キンセノシドによるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のアルカリ性ホスファターゼの放出
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）は骨芽前駆細胞の早期活性化の生物指標または分子マーカーであり、その活性を観察すると骨芽前駆細胞の活性化状況を知ることができる。まずビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）およびβ−グリセロリン酸（１０μモル濃度）を骨芽前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を含む培養皿に加え、それぞれ異なる濃度のキンセノシド（０、１００、１，０００ｎモル濃度）を加える。この骨芽前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１をそれぞれ３、５、１０日間培養した後、細胞内のタンパク質を抽出し、ｐ−ニトロフェニルホスフェート液体基質系（Ｓｉｇｍａより購入）の試薬を使用してアルカリ性ホスファターゼの活性を測定した。結果は表１１に示すとおりである。

【0092】

【表11】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。
抑制群との比較、^*Ｐ＜０．０５。

【0093】

表１１から分かるように、時間の増加に伴い、キンセノシドはアルカリ性ホスファターゼの活性を約２５％から５０％に強化することができる。またキンセノシドは細胞内の関係酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼ）の活性化により、前記骨芽前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の骨芽細胞へのさらなる分化を促進することができる。

【0094】

実験Ｌ：キンセノシドのＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の鉱質化作用発生の促進
まずビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）とβ−グリセロリン酸（１０μモル濃度）を骨芽前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を含む培養皿に加え、１４日間培養すると、骨芽前駆細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１は鉱質化作用を起こし、カルシウム沈積をもたらす。このとき、アリザリンＳ（Ｓｉｇｍａより購入）染色法を利用してカルシウム含量を測定できる（Ｇｒｅｇｏｒｙ ＣＡ、Ｇｕｎｎ ＷＧ、Ｐｅｉｓｔｅｒ Ａ、Ｐｒｏｃｋｏｐ ＤＪ．２００４．Ａｎ Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ−ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｏｆ ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｃｅｔｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２９、７７−８４参照）。

【0095】

ビタミンＣ（５０μｇ／ｍｌ）およびβ−グリセロリン酸（１０μモル濃度）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を含む培養皿に加え、それぞれ異なる濃度のキンセノシド（０、１００、１，０００ｎモル濃度）を添加し、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１４日間培養した後、アリザリンＳ染色法を利用してカルシウム含量を測定した。結果を表１２に示す。染色後の外観は図７に示すとおりである。

【0096】

【表12】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝３）。
抑制群との比較、^*Ｐ＜０．０５。

【0097】

表１２と図７から分かるように、キンセノシドはアリザリンＳの吸光値を上昇させる。つまり、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞内のカルシウム含量を増やすことができるため、鉱質化作用が促進される。

【実施例7】

【0098】

キンセノシドによる卵巣除去マウスの骨粗しょう症の改善
上記のように、エストロゲンの分泌不足が骨粗しょう症をもたらすことはすでに知られているので、この実験では、ＩＣＲマウスの卵巣を除去し、エストロゲンを分泌できないようにして骨粗しょう症を誘発させた。

【0099】

まずＩＣＲマウスの卵巣を除去し、３日後にそれぞれ異なる用量のキンセノシド（０、１００、３００ｍｇ／ｋｇ）をＩＣＲマウスに投与した。この「ｍｇ／ｋｇ」という単位は動物の体重１ｋｇ当たり必要な投与量をさす。投与の３週間後にＩＣＲマウスを屠殺し、酵素免疫測定法で血清中のオステオカルシンとＩ型コラーゲンのＣ−末端架橋テロペプチド（ＣＴｘ）の含量を測定した。オステオカルシンおよびＣＴｘ試薬はＩＤＳ Ｎｏｒｄｉｃ Ａ／Ｓ、Ｈｅｒｌｅｖ、Ｄａｎｍａｒｋｉｄｓより購入したものである。結果は表１３に示す。前記屠殺したＩＣＲマウスの大腿骨を取り出し、図８に示すようにマイクロコンピュータ断層走査装置（ＳｋｙＳｃａｎ １０７６、Ｋｏｎｔｉｚｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）でコンピュータ断層走査図を撮影した。さらに分析ソフトで骨の体積と組織の体積の比および骨梁の数を分析し、得られた結果を表１４に記録した。次に大腿骨のカルシウムを除去した後冷凍してスライスし、ＴＲＡＰ染色試薬で破骨細胞を染色し、骨梁周辺の破骨細胞の数を計数した。その結果は図９と表１５に示すとおりである。

【0100】

【表13】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。「ＯＶＸ」は卵巣除去を示す。抑制群との比較、^##Ｐ＜０．０５、^###Ｐ＜０．００１。ＯＶＸ＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。

【0101】

表１３に示すように、卵巣除去マウスの血中ＣＴｘの濃度が上昇し、オステオカルシン濃度にも上昇傾向が見られた。ＣＴｘは骨中のコラーゲンタンパク質の分解産物であり、その血中濃度が上昇するということは、骨吸収作用が強まったことを示す。オステオカルシンは骨芽細胞が産出する小タンパク質である。その濃度の上昇は、造骨の活性の増強または骨の更新率の増強を表す（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ Ｒ．２００１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｂｏｎｅ ｔｕｒｎｏｖｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ３１３、９５−１０５を参照）。表１３から分かるように、キンセノシドはＣＴｘ濃度を低下させ、オステオカルシンの濃度を増やすことができる。これはキンセノシドが破骨細胞を抑制し、骨芽細胞の活性または骨の更新率を強化できることを示す。

【0102】

【表14】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。「ＯＶＸ」は卵巣除去を示す。抑制群との比較、^##Ｐ＜０．０５、^###Ｐ＜０．００１。ＯＶＸ＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５。

【0103】

表１４から分かるように、キンセノシドは卵巣除去ＩＣＲマウスの骨体積と組織体積の比および骨梁の数を増やすことができ、卵巣除去ＩＣＲマウスの骨粗しょう症を有効改善させるとともに、骨梁の数を正常状態（卵巣未除去ＩＣＲマウスとの比較）に回復させる。また、図８から分かるように、卵巣未除去ＩＣＲマウスと比較して、マイクロコンピュータ断層走査図は、キンセノシドがＩＣＲマウスの大腿骨の骨組織を正常に回復させることができることを示している。

【0104】

【表15】

データはすべて平均数±標準偏差（サンプリング数＝７）。「ＯＶＸ」は卵巣除去を示す。抑制群との比較、^##Ｐ＜０．０５。ＯＶＸ＋水群との比較、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１。

【0105】

図９と表１５は、それぞれこの実験の卵巣除去ＩＣＲマウスの破骨細胞の顕微鏡図および統計表である。これらの破骨細胞は該ＩＣＲマウスの大腿骨の骨梁周囲にあったものである。図９の黒い矢印で示すように、キンセノシドは卵巣除去ＩＣＲマウスの破骨細胞の数および密度を有効に減少させている。

【0106】

上記に述べた実施例は本発明の原理および効果を説明するために例示したにすぎず、本発明を制限するものではない。この技術を熟知している者であれば本発明の技術原理および精神から逸脱せずに上記実施例を修正、変更することができる。したがって、本発明の権利保護範囲は後述の特許請求の範囲に示すものとする。

【図1】

【図2】

【図3B】

【図5C】

【図6B】

【図3A】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図7】

【図8】

【図9】