特許 5723976 ニコチン中毒の予防または治療用コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5723976

(24)【登録日】2015年4月3日

(45)【発行日】2015年5月27日

(54)【発明の名称】ニコチン中毒の予防または治療用コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/385 20060101AFI20150507BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20150507BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20150507BHJP

   A61P 25/34 20060101ALI20150507BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20150507BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20150507BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20150507BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/385

   A61K47/48

   A61P37/04

   A61P25/34

   A61K39/39

   A61K39/00 H

   !C12N15/00 JZNA

【請求項の数】8

【全頁数】93

(21)【出願番号】特願2013-513036(P2013-513036)

(86)(22)【出願日】2011年6月3日

(65)【公表番号】特表2013-528616(P2013-528616A)

(43)【公表日】2013年7月11日

(86)【国際出願番号】IB2011052446

(87)【国際公開番号】WO2011151807

(87)【国際公開日】20111208

【審査請求日】2014年5月29日

(31)【優先権主張番号】61/351,342

(32)【優先日】2010年6月4日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】311007693

【氏名又は名称】ファイザー バクシーンズ エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(72)【発明者】

【氏名】ニコラス アナスタスー

(72)【発明者】

【氏名】ケシャブ バッタチャリヤ

(72)【発明者】

【氏名】アラン ダニエル ブラウン

(72)【発明者】

【氏名】ヘザー リン デイヴィス

(72)【発明者】

【氏名】ジャリ イルマリ フィネマン

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド ピー． ジェルヴェー

(72)【発明者】

【氏名】リン ハワード ジョーンズ

(72)【発明者】

【氏名】パラグ アショック コルヒー

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ジョン マックラスキー

(72)【発明者】

【氏名】ポール ロバート メヘリック

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ リチャード マーソン

(72)【発明者】

【氏名】エリン クリステン パーソンズ

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド キャメロン プライド

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド ロバート ステッド

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー マリー ソーン

【審査官】 天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００３−５２９５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５１６２９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０２３１５３１４（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開平０２−２１９５９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０１９３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３１４２１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ３９／３８５

Ａ６１Ｋ ３９／３９

Ａ６１Ｋ ４７／４８

Ａ６１Ｋ ４７／４２

Ａ６１Ｐ ２５／３４

Ａ６１Ｐ ３７／０４

Ｃ１２Ｎ １５／１１７

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート：

【化4】

［式中、
Ｗは−Ｏ−であり、Ｗはピリジン環の５位にあり、
−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、
Ｘ^＊は−ＮＨ−または−Ｓ−であり、
ｍは１であり、
ｎは１から１０００までの整数であり、
Ｙは、細菌トキソイド、免疫原性物質、ウイルス、ウイルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソームおよび免疫刺激複合体から選択される修飾されていてもよい担体タンパク質である］。

【請求項2】

前記担体タンパク質が、破傷風毒素の誘導体、ジフテリア毒素の誘導体、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、易熱性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂサブユニット、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の組換えエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、およびバクテリオファージＱｂの組換え外被タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎コア抗原またはビロゾームからアセンブルされたもの等の他のウイルス様粒子から選択される修飾されていてもよいタンパク質である、請求項１に記載のハプテン−担体コンジュゲート。

【請求項3】

前記担体が、それぞれ独立に修飾されていてもよいジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ_１９７から選択されるタンパク質である、請求項１または２に記載の式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート。

【請求項4】

請求項１から３のいずれかに記載の複数のハプテン−担体コンジュゲートと、
１つまたは複数のアジュバントと
を含む、組成物。

【請求項5】

１つまたは複数のアジュバントの１つが配列番号：１に示されるオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

１つまたは複数のアジュバントの１つがアルミニウム塩である、請求項４に記載の組成物。

【請求項7】

アルミニウム塩が水酸化アルミニウムである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記アジュバントが配列番号：１に示されるオリゴヌクレオチドおよび水酸化アルミニウムである、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ニコチンワクチンにおいて抗原成分としての役割を果たすニコチン誘導ハプテン、ハプテン−スペーサーコンジュゲートおよびハプテン−担体コンジュゲートに関する。本発明は、アジュバントとともに製剤化されたそのようなニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲート抗原を含有するワクチン組成物にも関する。そのような組成物は、断煙率を向上させる、または禁煙およびタバコ／ニコチン依存の治療努力における再発率を低減させるために使用される。

【背景技術】

【0002】

喫煙は、健康への多くの重大な悪影響を有し、喫煙を低減させまたは予防するための多くの政府の取り組みにより、社会的に許容されにくくなってきた。その結果、多くの喫煙者がその習慣を断つことを希望し、毎年多くが試みるものの、何とか断煙した人のうち再発しないのはごく少数のみである。非常に高い失敗率は、ニコチンの中毒性に加え、紙巻きタバコ（ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）の入手しやすさの結果である。

【0003】

喫煙、または他の形態（例えば、サイナス、パッチ、ガム）でのニコチンの使用により、ニコチンは血流に入り、その後迅速に脳に入り、そこでニコチン性アセチルコリン受容体を刺激し、ドーパミンの放出を引き起こし、これが引き続いて報酬中枢を活性化する。断煙の試みにより、報酬応答の喪失、および認知機能の低下を含む禁断症状がある。再発の主な理由は、報酬の喪失および不快な禁断症状が喫煙によって直ちに緩和され得ることである。

【0004】

禁煙のための種々の非ワクチン療法がある。ニコチン含有チューインガムまたは皮膚パッチ等のニコチン置き換え療法は、喫煙者が紙巻きタバコをやめるのを助けることができるが、ニコチンが引き起こす中毒サイクルは遮断しない。別のアプローチは、バレニクリン等、ニコチン性アセチルコリン受容体を標的とする薬物の使用である。喫煙によって通常起こる報酬を低減させるそのような薬物は、禁煙を支援することには比較的成功しているが、ささいな過ち（例えば、１本の紙巻きタバコを吸うこと）により簡単に報酬中枢の再活性化を伴って完全再発させ得るため、薬物治療終了後の再発率が高い。

【0005】

より最近の禁ニコチン戦略は、免疫系を刺激して血流中のニコチンと結合する抗ニコチン抗体を生成し、それによりニコチンが脳に入ることができる量および速度を低減させるワクチンに重点を置いてきた。これは引き続いて報酬中枢が活性化されるのを防止し、中毒サイクルを遮断するのを助ける。ワクチンによって誘発された抗体は長寿命であり得るため、抗ニコチンワクチンは、禁煙および再発の予防の両方を援助するのに有用である。加えて、抗体は末梢で作用するため、中枢神経系（ＣＮＳ）への悪影響のリスクはない。そのようなワクチンの例は、ＷＯ００／３２２３９、ＷＯ０２／４９６６７、ＷＯ０３／８２３２９およびＵＳ２００６／１１１２７１において記載されている。ニコチン誘導体は、ＥＰ−Ａ−４２１７６２、ＷＯ０１／７０７３０、ＷＯ０１／８０８４４およびＵＳ２００５／１１９４８０において記載されている。さらなるニコチン誘導体は、登録番号１３６４００−０２−７、２５０６８３−１０−４、８６１０２３−８０−５および８６１０２５−０４−９で同定されている。ニコチンハプテンは、ＷＯ９９／６１０５４、ＷＯ０２／５８６３５、ＷＯ０３／８２３２９、ＷＯ２００５／４０３３８およびＥＰ−Ａ−１８４９７８０において記載されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、ニコチン誘導ハプテン、ハプテン−スペーサーコンジュゲート、および禁煙治療努力において断煙率を向上させる、または再発率を低減させるように設計されたワクチンにおいて使用するための、免疫原性ハプテン−担体コンジュゲートを調製するために使用され得るコンジュゲーション法に関する。本発明は、上述のコンジュゲートをアジュバントまたは添加剤と一緒に含有するワクチン製剤にも関し、この製剤は、引き続いてニコチンを認識し特異的に結合するハプテンに対する抗体を惹起するための喫煙者の免疫化に使用される。本発明はさらに、ハプテン−担体コンジュゲートを、断煙を希望している喫煙者に投与するステップを含む、禁煙治療努力において断煙率を向上させる、または再発率を低減させるための方法に関する。他の実施形態において、ワクチンは、非喫煙者において、喫煙または他の手段によりその後ニコチンに暴露された場合にニコチン中毒になるのを防止するために使用され得る。

【0008】

本発明のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートは、当技術分野において知られているニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートよりも免疫原性であり、特異的であり、安定であり、または有用な特性を有するという利点を有し得る。

【0009】

本発明のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートは、抗ニコチンワクチンにおいて使用するための他の知られているニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートよりも免疫原性抗原であり得る。同様に、抗原としての本発明のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートをアジュバントと一緒に含有するワクチン製剤は、典型的に水酸化アルミニウムをアジュバントとする他の抗ニコチンワクチン製剤よりも免疫原性であり得、ニコチン／タバコに依存しており、断煙を希望している患者の間でより高い断煙率およびより低い再発率をもたらし得る。抗原内の先天的な、およびアジュバントによって強化された、より良好な免疫原性により、本発明のワクチン製剤は、より急速に、より少ない用量で、より高い抗ニコチン抗体力価を達成し、当技術分野において知られているワクチン製剤と比較して改善されたコンプライアンスをもたらすこともできる。

【0010】

本発明のニコチン誘導ハプテン化合物への合成経路は、全合成収率の増大を提供し（好ましくは、全合成収率の最大２０倍増大）、合成ステップ数の低減を伴い、得られるニコチン誘導ハプテンの純度の増大（例えば、純度９９％超）をもたらし、または当技術分野において知られているニコチン誘導ハプテン化合物への合成経路よりも有用な他の特性を有するという利点を有し得る。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明のニコチン誘導ハプテン−コンジュゲートをアジュバントと一緒に含むワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５、免疫刺激ＣｐＧモチーフ（５０μｇ）を含有する２１−ｍｅｒ ＴＬＲ９アゴニストの存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４、７、８、および１２のもの）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図2】本発明のハプテンを含むコンジュゲート抗原（ａｎｔｉｇｅｎｔ）を含有する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の得られた抗ニコチン抗体のアビディティに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４、７、８、および１２のもの）で免疫化した。アビディティ指数は、ニコチン−ＢＳＡコーティングプレートの抗ニコチン抗体の５０％を溶離するために必要とされるチオシアン酸アンモニウムの濃度に相当し、より高いアビディティの抗体ではより高い濃度の要件を示す。

【図3】本発明のハプテンを含むコンジュゲート抗原を含有する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、脳および血液中における静脈内（ＩＶ）投与された^３Ｈ−ニコチンの分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝６）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４、７、８、および１２のもの）で免疫化した。最後の追加免疫の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、^３Ｈの血漿／脳比を決定した。

【図4】本発明のハプテンから取得されたワクチンによるマウスの免疫化後の、ニコチンと抗ニコチン抗体との相互作用を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４、７、８、および１２のもの）で免疫化した。最後の追加免疫の２週間後、抗ニコチン抗体とニコチンとの相互作用を、競合ＥＬＩＳＡによって実証した。

【図5】本発明のハプテンを含有するワクチンによるマウスの免疫化後の、抗ニコチン抗体の特異性を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４および１２のもの）で免疫化した。最後の追加免疫の２週間後、ニコチン、コチニン、アセチルコリンおよびバレニクリンに対する抗ニコチン抗体の特異性を、競合ＥＬＩＳＡによって決定した。

【図6】本発明のニコチン誘導ハプテンを担体とコンジュゲートするために異なるスペーサーを使用する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、異なるリンカー（調製２４〜３４）を使用するコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４；５’アミノプロピルニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。

【図7】本発明のニコチン誘導ハプテンを担体とコンジュゲートするために異なるスペーサーを使用する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、血漿中の抗ニコチン抗体のレベルおよびアビディティに対する、ならびに血漿および脳中の^３Ｈ−ニコチンの分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、異なるリンカー（調製２４〜３４）を使用するコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４；５’アミノプロピルニコチン）で免疫化した。３回目の免疫化の２週間後、血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、アビディティをチオシアン酸アンモニウムアッセイによって測定した。^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、^３Ｈの血漿／脳比を決定した。

【図8】本発明のニコチン誘導ハプテンを担体とコンジュゲートするために異なるスペーサーを使用する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、異なるリンカー（調製２４〜３４）を使用するコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図9】本発明のニコチン誘導ハプテンを担体とコンジュゲートするために異なるスペーサーを使用する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、血漿中の抗ニコチン抗体のレベルおよびアビディティに対する、ならびに血漿および脳中の^３Ｈ−ニコチンの分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、異なるリンカー（調製２４〜３４）を使用するコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。３回目の免疫化の２週間後、血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡによって測定し、アビディティをチオシアン酸アンモニウムアッセイによって測定した。^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、^３Ｈの血漿／脳比を決定した。

【図10】本発明のハプテン−担体コンジュゲートのスクシニル化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、それぞれ無水コハク酸ステップ有りまたは無しの２種の異なる条件を使用して調製されるコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４；５’アミノプロピルニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図11】本発明のハプテン−担体コンジュゲートのスクシニル化の、血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、それぞれ無水コハク酸ステップ有りまたは無しの２種の異なる条件を使用して調製されるコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製４；５’アミノプロピルニコチン）で免疫化した。最後の追加免疫の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、脳および血漿中における^３Ｈのレベルを定量化した。

【図12】本発明のニコチン誘導ハプテンを担体とコンジュゲートするために異なるスペーサーを使用する抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、異なるリンカー（調製２４〜３４）を使用するコンジュゲートでジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）またはＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図13】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、マウスにおける^３Ｈ−ニコチン分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）またはＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。３回目の免疫化の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。

【図14】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）またはＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。様々な異なるハプテンローディングを評価した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図15】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、マウスにおける^３Ｈ−ニコチン分布に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種（０、２８、４２日目）により、ジフテリアトキソイド（ＤＴ；１０μｇ）またはＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。様々な異なるハプテンローディングを評価した。３回目の免疫化の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。

【図16】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルおよびアビディティに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＩＭＸ；０．１から３．０ユニット）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡ（２１および２８日目）によって測定し、アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。［ｉ］は１回目の投薬の３週間後の結果を示し、［ｉｉ］は２回目の投薬の１週間後の結果を示す。

【図17】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルおよびアビディティに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＩＭＸ；０．１から３．０ユニット）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡ（２１および２８日目）によって測定し、アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。２回目の投薬の１週間後のアビディティ（ＩＣ_５０）を示す。

【図18】抗ニコチンワクチンによるマウスの免疫化の、種々の時点における血漿中の抗ニコチン抗体レベルおよびアビディティに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＩＭＸ；０．１から３．０ユニット）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ＣＲＭ_１９７（１０μｇ）とコンジュゲートされたニコチン誘導ハプテン（調製１２；５’アミノエトキシニコチン）で免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡ（２１および２８日目）によって測定し、アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。血漿中におけるニコチンの隔離（上）および脳へのニコチンの取り込み（下）を示す。

【図19】表６のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートのコンジュゲート条件の、抗ニコチン抗体レベルに対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ニコチン誘導ハプテンで免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。

【図20】表６のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートのコンジュゲート条件の、対応するＩＣ_５０値に対する影響を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ニコチン誘導ハプテンで免疫化した。アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。

【図21】表６のハプテン−担体コンジュゲートについて血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの分布を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ニコチン誘導ハプテンで免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。

【図22】表６のハプテン−担体コンジュゲートについて血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの分布を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）およびＣｐＧ２４５５５（５０μｇ）の存在下での筋肉内ワクチン接種により、ニコチン誘導ハプテンで免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。

【図23】異なるパーセントの単量体担体タンパク質を持つハプテン−担体コンジュゲートとＣｐＧ／アルヒドロゲルとの結合についての試験の結果を示す図である。結合は、ＣｐＧ／アルヒドロゲルを既知の量のハプテン−担体コンジュゲートとともにインキュベートし、次いで、インキュベーション後に溶液中に残ったコンジュゲートの濃度を測定することによって決定した。コンジュゲートの濃度の％減少は、ＣｐＧ／アルヒドロゲルと結合している％コンジュゲートと同等である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および１０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射により、１０μｇの異なるコンジュゲートで免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。

【発明を実施するための形態】

【0012】

第１の態様において、本発明は、式（Ｉ）のハプテン：

【0013】

【化1】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、Ｘは−ＮＨ_２または−ＳＨである］
に関する。

【0014】

一実施形態において、Ｗは、ピリジン環の２、５または６位にある。

【0015】

別の実施形態において、Ｗはピリジン環の５位にある。

【0016】

別の実施形態において、Ｗは−Ｏ−である。

【0017】

別の実施形態において、Ｗは−Ｏ−であり、Ｗはピリジン環の５位にある。

【0018】

さらなる実施形態において、ハプテンは

【0019】

【化2】

である。

【0020】

別の実施形態において、ハプテンは

【0021】

【化3】

である。

【0022】

さらなる実施形態において、ハプテンは

【0023】

【化4】

である。

【0024】

第２の態様において、本発明は、式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート：

【0025】

【化5】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、Ｘは−ＮＨ_２または−ＳＨである］
に関する。

【0026】

本明細書において使用される場合、「アルキレン基」は−（ＣＨ_２）_ｎ−基を意味し、ここで、ｎは必要とされる炭素原子数である。本明細書において使用される場合、「１から４個の酸素原子によって中断されているアルキレン基」は、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２−または−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２−である。本明細書において使用される場合、「１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されているアルキレン基」は、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯＣＨ_２ＣＨ_２−である。

【0027】

一実施形態において、Ｗは、ピリジン環の２、５または６位にある。

【0028】

別の実施形態において、Ｗはピリジン環の５位にある。

【0029】

さらなる実施形態において、Ｗは−Ｏ−である。

【0030】

別の実施形態において、Ｗは−Ｏ−であり、Ｗはピリジン環の５位にある。

【0031】

一実施形態において、−（スペーサー）−はＣ_１〜Ｃ_６アルキレン基である。

【0032】

別の実施形態において、−（スペーサー）−は、１から４個の酸素原子によって中断されているＣ_１〜Ｃ_１０アルキレン基である。

【0033】

また別の実施形態において、−（スペーサー）−は、３個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されているＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基である。

【0034】

一実施形態において、ハプテン−スペーサーコンジュゲートは、

【0035】

【化6】

である。

【0036】

下記のさらなる実施形態が想定される。
（ｉ）Ｗが−Ｏ−である、上記した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、
（ｉｉ）Ｗが−ＣＨ_２−である、上記した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、
（ｉｉｉ）Ｘが−ＳＨである、上記または実施形態（ｉ）および（ｉｉ）において記述した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、
（ｉｖ）Ｗが、ピリジン環の２、５または６位にある、上記または実施形態（ｉ）から（ｉｉｉ）において記述した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、
（ｖ）Ｗがピリジン環の５位にある、上記または実施形態（ｉ）から（ｉｖ）において記述した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、
（ｖｉ）−（スペーサー）−が、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_６シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基である、上記または実施形態（ｉ）から（ｖ）において記述した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート、および
（ｖｉｉ）−（スペーサー）−がＣ_１〜Ｃ_８アルキレン基である、上記または実施形態（ｉ）から（ｖｉ）において記述した通りの式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート。

【0037】

式（Ｉ）の化合物を取得するための一般的方法を描写する下記のスキームにおいて、置換基は、別段の規定がない限り、式（Ｉ）の化合物またはその誘導体について上記で定義した通りである。

【0038】

【化7】

【0039】

ボロン酸エステル（ｉｉ）は、（Ｓ）−（−）−ニコチン（ｉ）と、適切なイリジウム触媒、典型的にはメトキシ（シクロオクタジエン）イリジウム（Ｉ）二量体、４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ジピリジル等の配位子、およびビス（ピナコラト）ジボロンまたは４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン等のホウ素源との、１，４−ジオキサンまたはＴＨＦ等の適切な溶媒中、室温から還流の間の温度での反応から形成され得る。次いで、メタノール／水またはエタノール／水等の適切な溶媒系中、臭化銅（ＩＩ）を使用し、典型的には６０℃から還流の間の温度で、ボロン酸エステル（ｉｉ）を臭化物（ｉｉｉ）に変換することができる。

【0040】

【化8】

【0041】

次いで、アクリロニトリルを用い、パラジウムカップリング条件下、酢酸パラジウム（ＩＩ）またはテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム等の適切なパラジウム源を使用して、トリ（ｏ−トリル）ホスフィンまたはトリフリルホスフィン等の適切なホスフィン配位子の存在下、炭酸ナトリウム、トリエチルアミンまたはＮ−ジイソプロピルエチルアミン等の適切な塩基の存在下、アセトニトリルまたは１，４−ジオキサン等の適切な溶媒中、典型的には還流程度の温度で、臭化物（ｉｉｉ）を不飽和シアン化物（ｉｖ）に変換することができる。

【0042】

（ｖ）を得るための（ｉｖ）の水素化は、典型的には、パラジウム炭素、水酸化パラジウム炭素または白金活性炭等の適切な触媒を使用し、水素雰囲気下、メタノール、エタノールまたは酢酸エチル等の適切な溶媒中、典型的には室温程度の温度で行われる。

【0043】

ニトリル（ｖ）からアミン（ｖｉ）への還元は、典型的には、ラネーニッケル等の適切な触媒を使用し、水素雰囲気（典型的には５０〜１００ｐｓｉ程度の圧力）下、メタノールまたはエタノール等の適切な溶媒中、濃アンモニアの存在下、典型的には４０〜７０℃程度の温度で行われる。

【0044】

（ｖｉｉｉ）型のアミドの形成は、標準的な文献の条件下で行われ得る。塩化オキサリルまたは塩化チオニル等の適切な塩素化剤を使用し、ジクロロメタンまたはトルエン等の適切な溶媒中、場合により触媒ＤＭＦの存在下、典型的には０℃から室温の間の適切な温度で、酸（ｖｉｉ）を酸塩化物に変換することができる。次いで、酸塩化物を、アミン（ｖｉ）と、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン等の塩基の存在下、ジクロロメタンまたはトルエン等の適切な溶媒中、０℃から室温の間の温度で反応させてよい。代替として、Ｔ_３Ｐ、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ、ＥＤＣＩ．ＭｅＩ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢｏｐ、ＤＣＣまたはＣＤＩ等のカップリング剤を用い、ジクロロメタンまたはＤＭＦ等の適切な溶媒中、酸（ｖｉｉ）を適切な活性種に変換することができる。ＥＤＣＩ．ＨＣｌまたはＥＤＣＩ．ＭｅＩの存在下、ＨＯＢＴを添加してもよい。トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン等の適切な塩基も使用され、反応は、典型的には室温で行われる。

【0045】

【化9】

【0046】

（ｉ）の脱プロトン化は、超強塩基ｎＢｕＬｉ−ＬｉＤＭＡＥ（ｎ−ブチルリチウムとジメチルアミノエタノールとの反応によって形成されたもの）等の適切な塩基を用い、ヘキサン、トルエン、ヘキサン／トルエンまたはヘキサン／ＴＨＦ等の適切な溶媒中、典型的には−７８℃から０℃の間の適切な温度で行われ得る。得られたアニオンを、ヘキサクロロエタンまたはＮ−クロロコハク酸イミド等の適切な塩素源で、−７８℃から室温の間の温度でクエンチして、２つのクロロピリジン類似体（ｉｘ）および（ｘ）を得ることができる。

【0047】

エタノールアミンを好ましくは溶媒および反応物質として使用し、水素化ナトリウムまたはカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド等の適切な強塩基を使用して、典型的には５０〜１００℃の間の温度で、クロロピリジン類似体（ｉｘ）および（ｘ）をアミン（ｘｉ）および（ｘｉｉ）に変換することができる。

【0048】

【化10】

【0049】

臭化物（ｉｉｉ）を、アルコール（例えば、ベンジルアルコールまたは好ましくはｐ−メトキシベンジルアルコール）を担持する保護基と、適切な塩基、典型的には水素化ナトリウムを使用し、ＤＭＦまたはＮＭＰ等の適切な溶媒中、典型的には９０〜１３０℃程度の温度で反応させてよい。（ｘｉｖ）を得るための保護基の除去は、標準的な文献の方法を使用して行われ得る（例えば、ｐ−メトキシベンジルアルコールについては、トリフルオロ酢酸等の適切な酸が使用され得る）。

【0050】

ハロゲン化物、メシレートまたはトシレート等の適切なアルキル化剤（ｘｖｉ）、および炭酸カリウムまたは炭酸セシウム等の塩基を使用し、アセトニトリルまたはＤＭＦ等の適切な溶媒中、典型的には８０℃から還流の間の温度で、アルコール（ｘｉｖ）を保護アミン（ｘｖ）（保護基は好ましくはＢＯＣである）に変換することができる。アミンの脱保護は、（ｘｖｉｉ）を得るための標準的な文献の方法を使用して行われ得る（例えば、ＢＯＣ保護基の場合について、脱保護は、トリフルオロ酢酸または塩化水素等の適切な酸源を使用し、１，４−ジオキサン、ＴＨＦまたはジクロロメタン等の適切な溶媒中で行われ得る）。

【0051】

（ｘｖｉｉｉ）型のアミドの形成は、標準的な文献の条件下で行われ得る。塩化オキサリルまたは塩化チオニル等の適切な塩素化剤を使用し、ジクロロメタンまたはトルエン等の適切な溶媒中、場合により触媒ＤＭＦの存在下、典型的には０℃から室温の間の適切な温度で、酸（ｖｉｉ）を酸塩化物に変換することができる。次いで、酸塩化物を、アミン（ｘｖｉｉ）と、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン等の塩基の存在下、ジクロロメタンまたはトルエン等の適切な溶媒中、０℃から室温の間の温度で反応させてよい。代替として、Ｔ_３Ｐ、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ、ＥＤＣＩ．ＭｅＩ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢｏｐ、ＤＣＣまたはＣＤＩ等のカップリング剤を用い、ジクロロメタンまたはＤＭＦ等の適切な溶媒中、酸（ｖｉｉ）を適切な活性種に変換することができる。ＥＤＣＩ．ＨＣｌまたはＥＤＣＩ．ＭｅＩの存在下、ＨＯＢＴを添加してもよい。トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミン等の適切な塩基も使用され、反応は、典型的には室温で行われる。代替として、アミン（ｘｖｉｉ）を酸無水物またはラクトンと反応させて、一般構造（ｘｖｉｉｉ）のさらなる誘導体を調製してよい。例えば、このステップにおけるアシル源として、ｇ−ブチロラクトンもしくはｇ−チオブチロラクトン、または例えば無水コハク酸もしくは無水フタル酸等の無水物を使用して、誘導体（ｘｖｉｉｉ）を提供することができる。

【0052】

【化11】

【0053】

アルコール（ｘｉｖ）は、適切な酸化剤、典型的には過酸化水素、および酢酸等の適切な酸を使用し、ＴＨＦまたは１，４−ジオキサン等の適切な溶媒中、ボロン酸エステル（ｉｉ）を経由して調製することもできる。

【0054】

第３の態様において、本発明は、式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート：

【0055】

【化12】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基、またはＣ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基であり、ｍは０または１であり、Ｘ^＊は−Ｎ（Ｈ）−または−Ｓ−であり、ｎは１から１０００までの整数であり、Ｙは、細菌トキソイド、免疫原性物質、ウイルス、ウイルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソームおよび免疫刺激複合体から選択される修飾されていてもよい担体タンパク質である］
に関する。

【0056】

ある特定の実施形態において、ＹはジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ_１９７である。

【0057】

ハプテンと担体タンパク質との結合については、下記の方法が例証的である。例えば、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）またはＣＲＭ_１９７等の担体タンパク質は、無水物、例えば無水コハク酸で処理して担体タンパク質（ｘｉｘ）の誘導体化バージョンを生成することによって活性化され得る。次いで、この誘導体を、標準的なカップリング試薬の存在下、例えば、Ｔ_３Ｐ、ＥＤＣＩ．ＨＣｌ、ＥＤＣＩ．ＭｅＩ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＰｙＢｏｐ、ＤＣＣまたはＣＤＩを用いる、適切な溶媒または緩衝液（ダルベッコリン酸緩衝溶液等）中での適切な活性種への変換によって、ハプテン（ｘｖｉｉ）とカップリングしてよい。ＥＤＣＩ．ＨＣｌまたはＥＤＣＩ．ＭｅＩの存在下、ＨＯＢＴまたはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（またはその硫酸化バージョン）を添加してもよく、反応は、典型的には室温で行われて、コンジュゲート（ｘｘ）を提供する。代替として、スクシニル化／誘導体化ステップは省略されてもよく、上記の方法を使用してハプテンと担体タンパク質上の遊離カルボキシル基との直接的なカップリングを行って、コンジュゲート（ｘｘｉｖ）を提供することができる。代替として、担体タンパク質を、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド等の代替的な誘導体化試薬で処理して、誘導体化種（ｘｘｉ）を得ることができ、これをチオール含有ハプテン（ｘｘｉｉ）で処理して、コンジュゲート（ｘｘｉｉｉ）を提供することができる。

【0058】

【化13】

【0059】

下記の実施形態が想定される。
（ｉ）Ｗが−Ｏ−である、上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｉｉ）Ｗが−ＣＨ_２−である、上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｉｉｉ）Ｗが、ピリジン環の２、５または６位にある、上記または実施形態（ｉ）および（ｉｉ）において記述した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｉｖ）Ｗがピリジン環の５位にある、上記または実施形態（ｉ）から（ｉｉｉ）において記述した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｖ）−（スペーサー）−が、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_６シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよい、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン基である、上記または実施形態（ｉ）から（ｉｖ）において記述した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｖｉ）−（スペーサー）−がＣ_１〜Ｃ_８アルキレン基である、上記または実施形態（ｉ）から（ｉｖ）において記述した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｖｉｉ）ｍが０である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｖｉ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｖｉｉｉ）担体が、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドまたは非毒性突然変異体ジフテリアトキソイドＣＲＭ_１９７等のその誘導体、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ヘモシアニン、アルブミン、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、易熱性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂサブユニット、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の組換えエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）、およびバクテリオファージＱｂの組換え外被タンパク質からアセンブルされたもの等のウイルス様粒子から選択される修飾されていてもよいタンパク質である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｖｉｉ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｉｘ）担体が、修飾されていてもよいジフテリアトキソイドおよびＣＲＭ_１９７から選択されるタンパク質である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｖｉｉｉ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｘ）担体が修飾されていてもよいＣＲＭ_１９７である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｉｘ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｘｉ）ｎが、１から４０の範囲内の整数である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｘ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｘｉｉ）ｎが、１０から１８の範囲内の整数である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｘ）による式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート、
（ｘｉｉｉ）担体タンパク質が修飾されたスクシニル化タンパク質である、上記した通りのまたは実施形態（ｉ）から（ｘｉｉ）によるまたは上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲート。

【0060】

ジフテリア毒素は、３７℃での、ホルムアルデヒドおよび他の添加剤の存在下、４から６週間の間のインキュベーションにより、ジフテリアトキソイドに変換される。この処理は、タンパク質を非毒性にするがその免疫原性は保持する不均一な分子量の高度に架橋されたタンパク質を生じさせる。このタンパク質のワクチン担体タンパク質としての使用は十分に裏付けられており、ブタ用の抗ゴナドトロピン放出因子（ＧｎＲＦ）ワクチンとして、去勢手術の代替として（Ｉｍｐｒｏｖａｃ（商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）使用されてきた。該タンパク質は、ジフテリアに対するヒト用ワクチンとして、それぞれジフテリア、破傷風および無細胞百日咳を治療するためのＤＴａＰワクチンの一部として、非コンジュゲート形態でも市販されている。

【0061】

ＣＲＭ_１９７は、グルタミン酸残基の５２位におけるグリシン残基の単一点突然変異によって非毒性にされた、ジフテリア毒素の遺伝的に解毒されたバージョンである。突然変異は、ＮＡＤ＋と結合するタンパク質の能力を除去するため、タンパク質は酵素的に不活性である。架橋結合の非存在により、該タンパク質は、ジフテリア毒素のホルムアルデヒド不活性化調製物であるジフテリアトキソイドよりも均一な分子量の生成物である。ＣＲＭ_１９７は、市販の抗肺炎球菌ワクチン治療用の担体タンパク質としても使用されてきた（Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）。

【0062】

第４の態様において、本発明は、上記した通りのニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートを作製する方法であって、修飾されていてもよい担体タンパク質を、上記した通りの式（Ｉ）のニコチン誘導ハプテンまたは式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲートとカップリングするステップを含む方法に関する。

【0063】

ある特定の実施形態において、ハプテンと担体タンパク質との結合は、一緒に連結している担体タンパク質の数を最小化する手法で為され得る。ある特定の実施形態において、一緒に連結している担体タンパク質の数は、担体タンパク質の総数の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満または３０％未満である。

【0064】

好ましい実施形態において、上記した通りの式（ＩＩＩ）のニコチン誘導ハプテン担体コンジュゲート［式中、Ｘ^＊は−ＮＨ−である］を作製する方法であって、修飾されていてもよい担体タンパク質を、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩で処理し、次いで、上記した通りの式（Ｉ）のハプテンまたは式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート［式中、Ｘは−ＮＨ_２である］を添加するステップを含む方法に関する。

【0065】

代替的な実施形態において、本発明は、上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン担体コンジュゲート［式中、Ｘ^＊は−ＮＨ−である］を作製する方法であって、担体タンパク質を無水コハク酸で処理して修飾されたスクシニル化担体タンパク質を得るステップと、該修飾されたスクシニル化担体タンパク質を、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩で処理し、次いで、上記した通りの式（Ｉ）のハプテンまたは式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート［式中、Ｘは−ＮＨ_２である］を添加するステップとを含む方法に関する。

【0066】

代替的な実施形態において、本発明は、上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン担体コンジュゲート［式中、Ｘ^＊は−Ｓ−である］を作製する方法であって、担体タンパク質をブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルで処理し、次いで、上記した通りの式（Ｉ）のハプテンまたは式（ＩＩ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート［式中、Ｘは−ＳＨである］を添加するステップを含む方法に関する。

【0067】

第５の態様において、本発明は、上記で定義した通りの複数の式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲートと、１つまたは複数のアジュバントとを含む、ワクチン（またはワクチン組成物）に関する。

【0068】

適切なアジュバントの例は、担体分子とカップリングされた際のニコチンハプテンに対する抗体応答を含む、抗原に対する抗体応答を強化することが知られているものである。アジュバントは、当技術分野においてよく知られている（Ｊ．Ｃ．Ａｇｕｉｌａｒ、Ｅ．Ｇ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｒｅｖｉｅｗ：Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ、２００７、Ｖａｃｃｉｎｅ、２５、３７５２〜３７６２）。アジュバントは、直接的な先天性免疫活性化、デポー剤を生じさせること、または抗原のための送達ビヒクルとして作用することを含む１つまたは複数の機序によって作用し得る。直接的な先天性免疫活性化によって作用するアジュバントは、ＴＬＲ３を活性化する安定化ポリＩ：Ｃ、ＴＬＲ４を経由して活性化するモノホスホリル−脂質Ａ（ＭＰＬ）もしくはグリコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）等のリポ多糖の誘導体、ＴＬＲ５を経由して活性化するフラジェリン、ＴＬＲ７もしくはＴＬＲ８またはＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方を経由して活性化するイミキモドまたはレシキモド等のイミダゾキノリンファミリーの低分子、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を経由して活性化するオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）、ならびにＴＬＲ９を経由して活性化するＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含むがこれらに限定されないトール様受容体（ＴＬＲ）のアゴニストであってよい。ＣｐＧ ＯＤＮ ＴＬＲ９アゴニストは、Ｅ修飾として知られている５’Ｔのハロゲン化の有無にかかわらず、Ａ−クラス、Ｂ−クラス、Ｃ−クラスまたはＰ−クラスのものであってよく、全ホスホジエステル骨格、全ホスホロチオエート骨格、キメラ骨格、ＣｐＧモチーフのシトシンとグアノシンとの間を除いて全ホスホロチオエートである「半軟質」骨格で作製され得る。直接的な先天性免疫活性化によって作用するアジュバントは、ＱＳ２１または他のサポニン等の非ＴＬＲ機序を介して作用し得る。

【0069】

アジュバントは、インフラマソームを経由してデポー剤系および先天性免疫活性化因子の両方として作用するアルミニウム塩であってよい。アルミニウム塩は、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムから優先的に選択される。水酸化アルミニウムは、優先的にアルヒドロゲルオリジナルまたはアルヒドロゲル’８５である。

【0070】

免疫活性化および送達ビヒクルの両方を介して作用するアジュバントは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ等の免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）であってよい。

【0071】

送達ビヒクル特性を有するアジュバントは、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、マイクロスフェア、マイクロ粒子またはビロゾームであってよく、これらは、その表面上に、特定の細胞型への標的化を目的とした部分を有し得る。アジュバントは、水中油型エマルション、油中水型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系であってよい。リポソームは、単層であっても多重膜であってもよい。エマルションは、ＭＦ−５９等のスクアレンベースであってよい。

【0072】

アジュバントはビロゾームであってよい。

【0073】

好ましいアジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）、アルミニウム塩、ＱＳ２１およびＩＳＣＯＭＳから選択される。

【0074】

好ましいＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞を優先的に活性化するＢクラスのものである。本発明の態様において、ＣｐＧ ＯＤＮは、核酸配列５’Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ３’（配列番号１）を有し、ここで、＊はホスホロチオエート結合を示す。この配列のＣｐＧ ＯＤＮは、ＣｐＧ２４５５５として知られている。

【0075】

本明細書において使用される場合、用語「オリゴデオキシヌクレオチド」（ＯＤＮ）は、多重ヌクレオチド（すなわち、リン酸基と、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）またはチミジン（Ｔ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基と連結しているデオキシリボース糖を含む分子）を意味する。核酸分子は、既存の核酸源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）から取得され得るが、好ましくは合成である（例えば、核酸合成によって生成される）。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解（例えば、エンドおよびエキソヌクレアーゼを経由するもの）に対して比較的耐性があり、インビボで活性の強化を提供する。

【0076】

オリゴヌクレオチドの合成および化学修飾のための方法は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ Ｊ．ら、（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３１〜４１７において記述されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、当技術分野においてよく知られている若干数の手順のいずれかを使用して新たに合成され得る。例えば、ｂ−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．、（１９８１）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２２：１８５９）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２７：４０５１〜４０５４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９〜５４０７；Ｇａｒｅｇｇら、（１９８６）２７：４０５５〜４０５８；Ｇａｆｆｎｅｙら、（１９８８）Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．２９：２６１９〜２６２２）である。これらの化学は、市場で入手可能である多様な自動核酸合成機によって実施され得る。これらのオリゴヌクレオチドを、合成オリゴヌクレオチドと称する。ホスホロチオエート等の修飾された骨格は、ホスホラミデートまたはＨ−ホスホネート化学のいずれかを用いる自動化された技術を使用して合成され得る。アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号において記述されている通りに作製されてもよく、アルキルホスホトリエステル（荷電酸素部分が米国特許第５，０２３，２４３号において記述されている通りにアルキル化される）は、市販の試薬を使用する自動固相合成によって調製されてもよい。他のＤＮＡ骨格修飾および置換を作製するための方法が記述されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４４、１９９０；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１：１６５、１９９０）。

【0077】

、
最も好ましいアジュバントは、アルヒドロゲル等の水酸化アルミニウム塩と一緒に使用されるＣｐＧ２４５５５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、同時係属出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００９／０５５４４４号において記述されている通りのもの）である。故に、一実施形態において、上記で定義した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲートとＣｐＧ２４５５５とを含むワクチン（またはワクチン組成物）が提供される。さらなる実施形態において、上記した通りの式（ＩＩＩ）のハプテン−担体コンジュゲートと、ＣｐＧ２４５５５と、水酸化アルミニウム塩とを含むワクチン（またはワクチン組成物）が提供される。別の実施形態において、ＣｐＧ２４５５５と、複数の式（ＩＶ）のハプテン−担体コンジュゲート：

【0078】

【化14】

［式中、ＹはジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ_１９７であり、ｎは、１から４０の範囲内の整数である］
とを含む、ワクチン（またはワクチン組成物）が提供される。

【0079】

また別の実施形態において、ＣｐＧ２４５５５と、水酸化アルミニウム塩と、複数の式（ＩＶ）のハプテン−担体コンジュゲート：

【0080】

【化15】

［式中、ＹはジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ_１９７であり、ｎは、１から４０の範囲内の整数である］
とを含む、ワクチン（またはワクチン組成物）が提供される。

【0081】

また別の実施形態において、水酸化アルミニウム塩（例えばアルヒドロゲル）と、複数の式（ＩＶ）のハプテン−担体コンジュゲート：

【0082】

【化16】

［式中、ＹはジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ_１９７であり、ｎは、１から４０の範囲内の整数である］
とを含む、ワクチン（またはワクチン組成物）が提供される。

【0083】

ある特定の実施形態において、ｎは、１から３０の両端を含めた範囲内の整数である。ある特定の実施形態において、ｎは、５から２３の両端を含めた範囲内の整数である。ある特定の実施形態において、ｎは、１０から１８の両端を含めた範囲内の整数である。ある特定の実施形態において、ｎは１０である。ある特定の実施形態において、ｎは１１である。ある特定の実施形態において、ｎは１２である。ある特定の実施形態において、ｎは１３である。ある特定の実施形態において、ｎは１４である。ある特定の実施形態において、ｎは１５である。ある特定の実施形態において、ｎは１６である。ある特定の実施形態において、ｎは１７である。ある特定の実施形態において、ｎは１８である。

【0084】

以下の例示で分かるが、ハプテン−担体コンジュゲートを形成するカップリング条件を変動させることにより、担体タンパク質のクロスカップリングを最小化することができる。担体タンパク質がクロスカップリングしている場合、得られるハプテン−担体コンジュゲートは、一緒に共有または非共有結合している多重担体タンパク質を含み、本明細書においては「高分子量種」と称される。対照的に、「低分子量種」は、本明細書において使用される場合、担体タンパク質の一部がコンジュゲートの調製中に失われたハプテン−担体コンジュゲートを指す。ある特定の実施形態において、高分子量種は効果の低いワクチンにつながることが観察された。したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、ハプテン−担体コンジュゲートの一部である担体タンパク質の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満または３０％未満がクロスカップリングしている（すなわち、高分子量種である）、前述のワクチン組成物のいずれかを指す。

【0085】

ある特定の実施形態において、本発明は、ハプテン−担体コンジュゲートの一部である担体タンパク質の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％がクロスカップリングしていない、前述のワクチン組成物のいずれかに関する。

【0086】

ある特定の実施形態において、前述のワクチン組成物のいずれか１つの抗原成分の７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超が、式ＩＶのハプテン−担体コンジュゲートである。

【0087】

ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の担体タンパク質が５０，０００ダルトンから７０，０００ダルトンの間の分子量を有する、前述のワクチン組成物のいずれかに関する。ある特定の実施形態において、本発明は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の担体タンパク質が約５８，０００ダルトンの分子量を有する、前述のワクチン組成物のいずれかに関する。

【0088】

本発明のワクチン組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる添加剤を場合により含有してよい。適切な添加剤は、滅菌水、食塩水および緩衝液を含む。一実施形態において、ハプテン−担体コンジュゲートは、薬学的に許容できるｐＨで生理食塩水に可溶化される。ワクチン組成物は、分散媒、コーティング、界面活性剤、保存剤および安定剤等の少なくとも１つの助剤を場合により含有してもよい。本発明のワクチン組成物は、好ましくは無菌である。

【0089】

本発明のワクチン組成物は、概して、初回免疫および追加免疫用量の両方のために投与されることになる。初期シリーズは、数週間の間隔が空けられる数用量を含み、さらなる追加免疫用量は数か月もしく数年の間隔が、または断煙率向上と相関することが臨床的に示された所望のレベルを循環抗体のレベルが下回るような時間が空けられるであろうことが予測される。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、６から２４週間かけて投与される３から６用量の初期シリーズとして投与され、その後、追加免疫用量が３から１２か月毎に投与される。

【0090】

本発明のワクチン組成物は、非経口経路によって、例えば、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）もしくは皮下（ＳＣ）注射を経由して、または適正なデバイスを使用する場合、皮膚（経皮）もしくは粘膜表面への局所投与によって、投与され得る。

【0091】

ある特定の実施形態において、本発明のハプテン担体コンジュゲートおよび／またはワクチンは、極微針デバイスの使用を介して皮内（ＩＤ）投与され得る。一態様において、本発明は、本発明のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物でコーティングされた、それを含む、またはそれを送達するのに有効な、１本または複数の極微針を含む極微針デバイスを提供する。ある特定の実施形態において、１本または複数の極微針は、極微針が皮膚への単純な非侵襲性投与を可能にするパッチとして調製され得る。本発明の別の態様は、本発明のニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物の送達のための極微針技術の使用を企図している。

【0092】

極微針送達技術は、短（例えば、長さ４ｍｍ未満）針（複数可）のアレイを使用して、ニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートを含有するワクチン組成物の特定の望ましい皮膚深度への送達を容易にすることができる。そのような極微針は、表皮の角質層および基底層を突き刺して、薬物を表皮または隣接する真皮内に直接提示する。極微針のサイズが小さいことにより、適用は比較的無痛であり、出血または適用部位の反応は（あったとしても）最小である。本明細書において、用語「極微針」は、角質層皮膚層を貫通して表皮／真皮層まで貫入する程度に十分長いが、神経終末の活性化による実質的な痛みをもたらさない程度に十分短い、細長い構造を指す。

【0093】

経皮送達を容易にする極微針は、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５６（２００４）５８１〜５８７；Ｚａｈｎら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ６（２００４）１８３〜１９０；Ｓｈｉｒｋｈａｎｄｅｈ Ｊ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉ．１６（２００５）３７〜４５；Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０４（２００５）５１〜６６；米国特許第３，９６４，４８２号、同第６，５０３，２３１号、同第６，７４５，２１１号、同第６，６１１，７０７号、同第６，３３４，８５６号、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２０９５６５号、同第２００４／０１０６９０４号、同第２００４／０１８６４１９号、同第２００２／０１９３７５４号および同第２０１０／０１９６４４５号において記述されており、これらはいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。適切な極微針は、シリコン、金属およびポリマーを含む多くの材料から加工されている。Ｄａｖｉｓらは、皮膚への極微針挿入の機械について記述している（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．３７（２００４）１１５５〜１１６３）。

【0094】

本明細書において記述されている実施形態において、中実または中空極微針を使用してよい。一実施形態において、本発明に使用するための極微針は中実である。例えば、チャネルは、極微針アレイで皮膚を貫通し、続いて針の除去およびその後薬物の適用をすることによって作製され得る（例えば、Ｍａｒｔａｎｔｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２１（２００４）およびＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒら、ＰＮＡＳ １００（２００３）１３７５５〜１３７６０を参照されたい）。本発明による治療剤を含む製剤は、ゲル剤、ヒドロゲル剤、局所クリーム剤、膏薬、軟膏剤もしくは他の局所製剤として、および／または包帯、密封体（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｂｏｄｙ）、パッチ等の送達デバイスを使用することによって、極微針で処置した部位に適用され得る。

【0095】

別の実施形態において、中実（非多孔性）極微針は、皮膚への適用前に、本発明によるニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物でコーティングされる。次いで、極微針を使用して表皮を穿刺し、該針を皮膚表面と接触させたまま十分な期間保ち、周囲の皮膚組織へのハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物の拡散を可能にする。（そのような方式での治療剤の投与については、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５６（２００４）５８１〜５８７を参照されたい）。別の実施形態において、本発明のハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物の貯蔵を可能にするチャネルを含有する、中空（多孔性）極微針が使用される。皮膚への適用時に、ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物は、拡散または圧力駆動流によって皮膚組織内に拡散する。（そのような方式での治療剤の投与については、Ｚａｈｎら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ６（２００４）１８３〜１９０を参照されたい）。

【0096】

また別の実施形態において、従来の中空針技術とは対照的に、本発明のある特定の態様は、本発明のワクチン組成物を送達するために使用され得る溶解性および／または生分解性材料の中実マトリックスから形成される極微針に関する。中実極微針の例については、いずれも生分解性ポリマー製の極微針アレイについて記述しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９４５，９５２号、同第７，６１１，４８１号、ならびに出願公開第２００２／００８２５４３号、同第２００５／０１９７３０８号および同第２００８／０２６９６８５号を参照されたい。

【0097】

ある特定の実施形態において、中実極微針は、合成および／または天然由来の熱成形ポリマー材料を含む速溶性および／または膨張性材料から構成され得る。ある特定の実施形態において、中実極微針は、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリエーテルエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリウレタンおよびコポリマー、ならびにそれらの混和物等の適切な生体適合性、生分解性ポリマーから形成され得る。他の実施形態において、中実極微針は、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルおよび他のアシル置換酢酸セルロースのポリマー、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、それらの混和物およびコポリマー等の非生分解性ポリマーから形成され得る。

【0098】

極微針は、単独で、または複数の極微針のアレイとして使用され得る。種々のサイズのアレイが本発明での使用に適している。一実施形態において、１〜１０本の極微針が使用される。他の実施形態において、１０〜２５、１０〜５０、２５〜５０、２５〜２００、２５〜１００または５０〜１００本の針を含む極微針アレイが使用される。極微針のアレイは、使用される極微針の長さ、直径、針間の距離、鋭度および総数を含むがこれらに限定されないいくつかの要因に基づいて変動し得る。例示的な実施形態において、極微針のアレイは１０×１０マトリックスを含む。別の実施形態において、極微針のアレイは２０×２０マトリックスを含む。いくつかの実施形態において、アレイ中の各極微針間の距離は、約１００μｍから約４００μｍまでである。一実施形態において、アレイの特定の寸法は、皮膚透過性の所望の強化に応じて選択され得る。

【0099】

いくつかの実施形態において、極微針は、２０μｍから約１０００μｍまで、例えば、約５０μｍから約１５０μｍまで、または約１５０μｍから約５００μｍまで、または５００μｍから約１０００μｍまで、または６００μｍから約８００μｍまでの長さを有する。他の実施形態において、極微針は、約５０、１００、２５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍの長さである。また他の実施形態において、極微針は、少なくとも５０、１００、２５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍの長さである。他の実施形態において、極微針は、５０、１００、２５０、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍ未満の長さである。一実施形態において、極微針は、約７００μｍの長さである。いくつかの実施形態において、極微針は、約４００μｍから約７００μｍの深度で皮膚を貫通する。一実施形態において、極微針は、角質層の底部にほぼ相当する深度で皮膚を貫通する。別の実施形態において、極微針は、ほぼ真皮層の最上部まで皮膚を貫通する。また他の実施形態において、極微針は、ほぼ角質層の底部と真皮層の最上部との間の深度まで皮膚を貫通する。極微針は、効能を維持するために必要とされる通りの多様な直径のいずれかであってよい。いくつかの実施形態において、極微針の外径は、約２０μｍから約１００μｍまでであってよい。他の実施形態において、極微針の外径は、約１０μｍから約５０μｍまでであってよい。中空極微針の内径は、いくつかの実施形態において、約５μｍから約７０μｍまでであってよい。加えて、極微針の外径または内径は、最大１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００μｍであってよい。上記の極微針寸法の任意の組合せを、本明細書において記述されているシステムおよび方法で必要に応じて使用してよい。

【0100】

極微針は、シリコン、金属、ポリマーおよびガラスを含むがこれらに限定されない多様な材料から製造され得る。いくつかの実施形態において、シリコン極微針が使用される。シリコン極微針は、中実であるか中空であるかにかかわらず、シリコンウエハーからエッチングすることができる。例えば、各極微針の位置に印をつけ、周囲のシリコンをエッチング除去して、極微針のアレイを共通の基盤に付着させる。いくつかの実施形態において、シリコンウエハーの厚さは、約３００〜６００μｍの間である。

【0101】

他の実施形態において、極微針は、ニッケル、チタン、およびステンレス鋼等の合金を含むがこれらに限定されない金属から作製される。いくつかの実施形態において、金属極微針をエポキシ鋳型から作製し、次いで選択した金属で電気めっきし、その一方でその後エポキシ鋳型をエッチング除去する。得られる極微針は、再使用可能または使い捨てのいずれであってもよい。極微針は、Ｚｏｓａｎｏ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｉｕｍおよび３Ｍを含む商業的供給源から入手することもできる。Ｚｏｓａｎｏおよび３Ｍは、いずれもコーティングされた極微針含有パッチを開発した。Ｃｏｒｉｕｍは、生分解性極微針を開発した。３Ｍは、中空極微針（例えば、Ｉｎｔａｎｚａ（登録商標）／ＩＤｆｌｕ（登録商標））を開発した。

【0102】

ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物は、多様な方法を使用して極微針に適用され得る。一実施形態において、ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物を含む溶液を調製し、該溶液を極微針上／内に配置させ、続いて溶液を乾燥させる。代替として、ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物を含む溶液にマイクロアレイを浸漬して、ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物で極微針をコーティングする。追加のタンパク質または成分を本発明の極微針上または内にコーティングする場合、追加のコーティングステップを実施してよい。代替として、溶液の数種またはすべての成分を１つの溶液に混合し、次いでこれを極微針上／内に配置させる。浸漬コーティング、スプレーコーティング、または当技術分野において知られている他の技術、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３８７１９号において記述されているものが使用され得る。コーティングは、固体であっても半固体であってもよい。

【0103】

各ワクチン用量中のハプテンコンジュゲート担体タンパク質の量は、典型的なワクチンにおける有意な有害副作用無しに免疫防御応答を誘発する量として選択される。適切な投薬量範囲は、０．０１から１０ｍｇ／用量、好ましくは０．１から１．０ｍｇ／用量である。概して、人が単回ワクチン用量の後に外来抗原に対する抗体を産生するには２週間以上かかり、概して、抗ニコチンワクチンが禁煙を支援するために望ましいもの等の高度に持続性の抗体力価を誘発するには、数週間にわたって投与される数回のワクチン用量を要する。人の血液中における抗体の生成は、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴およびウエスタンブロッティング法等、当業者によく知られている技術を使用してモニターすることができる。

【0104】

故に、第６の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、上記で定義した通りのハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物に関する。

【0105】

またさらなる態様において、本発明は、断煙を希望している喫煙者、再発の回避を希望している元喫煙者において断煙率を増大させ、再発率を低減させるのに使用するための、またはニコチン中毒の予防のための、上記で定義した通りのハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物に関する。

【0106】

またさらなる態様において、本発明は、そのような治療を必要とする人におけるニコチン依存の治療または予防用薬剤の製造のための、上記で定義した通りのニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物に関する。

【0107】

またさらなる態様において、本発明は、そのような治療を必要とする人におけるニコチン中毒を治療または予防するのに使用するための、上記で定義した通りのニコチン誘導ハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物に関する。

【0108】

またさらなる態様において、本発明は、断煙を希望している喫煙者における禁煙を支援するため、または断煙した喫煙者における再発を予防するため、または別の源からの喫煙またはニコチンに暴露される可能性がある人におけるニコチン中毒を予防するための治療方法であって、該人に、有効量の上記で定義した通りのハプテン−担体コンジュゲートまたはワクチン組成物を投与するステップを含む方法に関する。

【0109】

一実施形態において、本発明は、該人に、別の非ワクチン禁煙製品を投与するステップをさらに含む。適切な製品は、場合により持続放出形態のバレニクリンまたはブプロピオン等、ニコチン性アセチルコリン受容体を標的とする薬物療法製品を含む。本発明の方法において使用され得る他の製品は、クロニジンおよびノルトリプチリンを含む。追加の適切な製品は、例えば、パッチ（１６時間および２４時間）、ガム、鼻腔用スプレーまたは吸入器の形態の、ニコチン置き換え療法（ＮＲＴ）製品を含む。

【0110】

またさらなる態様において、本発明は、本発明によるハプテン担体コンジュゲートを作製する方法であって、修飾されていてもよい担体タンパク質を、本発明によるハプテンまたは本発明によるハプテン−スペーサーコンジュゲートとカップリングするステップを含む方法に関する。

【0111】

またさらなる態様において、本発明は、式（ＩＩＩ）のハプテン担体コンジュゲート：

【0112】

【化17】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、Ｘ^＊は−ＮＨ−であり、ｍは０または１であり、ｎは１から１０００までの整数であり、Ｙは、細菌トキソイド、免疫原性物質、ウイルス、ウイルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソームおよび免疫刺激複合体から選択される修飾されていてもよい担体タンパク質である］を作製する方法であって、修飾されていてもよい担体タンパク質を、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩で処理し、次いで、式（Ｉ）のハプテン：

【0113】

【化18】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、Ｘは−ＮＨ_２である］
または式（ＩＩ）によるハプテン−スペーサーコンジュゲート：

【0114】

【化19】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、Ｘは−ＮＨ_２である］
のいずれかを添加するステップを含む方法に関する。

【0115】

またさらなる態様において、本発明は、式（ＩＩＩ）のコンジュゲート：

【0116】

【化20】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、Ｘ^＊は−ＮＨ−であり、ｍは０または１であり、ｎは１から１０００までの整数であり、Ｙは、細菌トキソイド、免疫原性物質、ウイルス、ウイルス様粒子、タンパク質複合体、タンパク質、ポリペプチド、リポソームおよび免疫刺激複合体から選択される修飾されていてもよい担体タンパク質である］を作製する方法であって、担体タンパク質を無水コハク酸で処理して修飾されたスクシニル化担体タンパク質を得るステップと、該修飾されたスクシニル化担体タンパク質を、スルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、続いて１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩で処理し、次いで、式（Ｉ）のハプテン：

【0117】

【化21】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、Ｘは−ＮＨ_２である］
または式（ＩＩ）によるハプテン−スペーサーコンジュゲート：

【0118】

【化22】

［式中、Ｗは−ＣＨ_２−または−Ｏ−であり、−（スペーサー）−は、Ｃ_１〜Ｃ_８アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１０シクロアルキレン基または１から４個の酸素原子によって中断されており、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよいＣ_１〜Ｃ_１２アルキレン基であり、Ｘは−ＮＨ_２である］
のいずれかを添加するステップとを含む方法に関する。

【0119】

生物学的アッセイ
抗ニコチン抗体ＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血漿中における抗ニコチン抗体のレベルを次の通りに定量化した。ニコチン分子はＥＬＩＳＡプレートへのコーティングに適していないため、生体接着特性を有するさらに大きな分子（ウシ血清アルブミン）と連結させた。ニコチン誘導体（ｒａｃ−ｔｒａｎｓ３’−チオメチルニコチン）をウシ血清アルブミンとコンジュゲートさせ、取得されたニコチン−ＢＳＡコンジュゲートを使用して、炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中１μｇ／ｍＬの最終濃度で９６ウェルイムノマキシソープＥＬＩＳＡプレート（ＶＷＲ）をコーティングし（１００μＬ／ウェル）、４℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートを吸引し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ３５６３）を含有するリン酸緩衝溶液で洗浄した。プレートを、３７℃で１時間、２００μＬのブロッキング緩衝液（炭酸緩衝液＋１０％仔ウシ血清、Ｆｉｓｈｅｒ）でブロックし、次いで上記のように洗浄した。試料および標準血漿を希釈緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％ＢＣＳを加えた１×ＰＢＳ）中で連続希釈し、プレートに添加した（１００μＬ／ウェル）。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。これらを再度洗浄し、次いで、希釈緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％ＢＣＳを加えた１×ＰＢＳ）で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを再度洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（リン酸クエン酸緩衝液に溶解した１×５ｍｇのＯＰＤ錠、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、室温、暗所で３０分間インキュベートした。各ウェルへの５０μＬの４Ｎ硫酸（ＶＷＲ）の添加によって反応を停止させ、自動プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。試料は、非免疫性血漿の値よりも２倍大きい抗体吸光度（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｒｂａｎｃｅ）値（ＯＤ４５０）を０．０５のカットオフ値でもたらす最大血漿希釈として定量化された。

【0120】

抗ニコチン抗体のアビディティの測定。抗ニコチン抗体のアビディティは、チオシアン酸アンモニウム溶離ベースのＥＬＩＳＡ法を使用して次の通りに測定した。９６ウェルイムノマキシソープＥＬＩＳＡプレート（ＶＷＲ）を、炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中１μｇ／ｍＬの濃度のニコチン−ＢＳＡ抗原溶液でコーティング（１００μＬ／ウェル）し、４℃で終夜インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、３７℃で１時間、２００μＬ炭酸緩衝液＋１０％仔ウシ血清（Ｆｉｓｈｅｒ）でブロックした。プレートを再度洗浄した。抗ニコチン抗体を含有することが予め判明している血漿試料を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％仔ウシ血清（ＢＣＳ）を含有するＰＢＳ中で希釈して、４５０ｎｍで約１．０の最適な抗体吸光度値を達成し、次いで、１００μＬ／ウェルでプレートに添加した。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、次いで洗浄した。次に、チオシアン酸アンモニウム（ＮＨ_４ＳＣＮ）（１００μＬ／ウェル）を、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中で希釈した０から２．０Ｍまでの範囲の濃度で添加することにより、溶離を実施し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、希釈緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％ＢＣＳを加えた１×ＰＢＳ）で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、３７℃で１時間、抗体結合を検出した。次いで、プレートを再度洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（リン酸クエン酸緩衝液に溶解した１×５ｍｇのＯＰＤ錠、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、室温、暗所で３０分間インキュベートした。各ウェルへの５０μＬの４Ｎ硫酸（ＶＷＲ）の添加によって反応を停止させ、自動プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。次いで、結果をＮＨ_４ＳＣＮの存在下における抗原−抗体の結合のパーセント低減（ＯＤにおける％低減）として表現し、ＮＨ_４ＳＣＮのモル濃度に対してプロットした。アビディティ指数は、結合の５０％低減を生成するために必要とされるＮＨ_４ＳＣＮの濃度として算出した。

【0121】

血漿および脳中におけるニコチン分布の評価。血漿および脳中におけるニコチン分布に対する免疫化の影響は、動物（抗ニコチンワクチンで予め免疫化したもの）に、１００μＬのＰＢＳ中の３μＣｉ ^３Ｈ−ニコチンを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇの（−）酒石酸水素ニコチンを、１０秒間かけて尾静脈注入を経由して投与することによって決定した。５分後、心穿刺によって血液を取得し、血漿を収集した。２０ｍＬを心臓の左室に１から２分間かけて注射することによってマウスをＰＢＳで直ちに灌流し、脳を採取し、秤量した。脳を、１ｍＬの消化緩衝液（１００ｍｇの組織当たり、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％イゲパルＣＡ−６３０および０．３ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ）中、約５０℃で７２時間消化した。１００μＬアリコートの脳消化物または血漿を５ｍＬの液体シンチレーション流体と混合し、液体シンチレーション計数によって放射性標識ニコチンのレベルを決定した。

【0122】

抗ニコチンワクチンによって誘発された抗体の特異性を決定するための競合ＥＬＩＳＡ。抗ニコチン抗体の特異性は、競合ＥＬＩＳＡを使用し、次の通りに決定した。９６ウェルイムノマキシソープＥＬＩＳＡプレート（ＶＷＲ）を、炭酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中１μｇ／ｍＬの濃度のニコチン−ＢＳＡ抗原溶液でコーティング（１００μＬ／ウェル）し、４℃で終夜インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、３７℃で１時間、２００μＬ炭酸緩衝液＋１０％仔ウシ血清（Ｆｉｓｈｅｒ）でブロックし、次いで再度洗浄した。このインキュベーションの間に、抗ニコチン抗体を含有することが予め判明している血漿試料を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％仔ウシ血清（ＢＣＳ）を含有するＰＢＳ中で希釈して、４５０ｎｍで約１．０から１．５の最適な抗体吸光度値を達成し、異なる阻害剤（ニコチン、コチニン、アセチルコリン、バレニクリン）を、２０，０００μＭから出発して連続希釈した。等体積（６５μＬ）の希釈された試料および選択された阻害剤を、コーティングされていない９６ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートさせた。インキュベーション後、予めブロックしたニコチン−ＢＳＡコーティングプレートに、血漿／阻害剤混合物を１００μＬ／ウェルで添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートし、次いで再度洗浄した。希釈緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０＋１０％ＢＣＳを加えた１×ＰＢＳ）で希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、３７℃で１時間、抗体結合を検出した。次いで、プレートを再度洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（リン酸クエン酸緩衝液に溶解した１×５ｍｇのＯＰＤ錠、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、室温、暗所で３０分間インキュベートした。各ウェルへの５０μＬの４Ｎ硫酸（ＶＷＲ）の添加によって反応を停止させ、自動プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。４５０ｎｍでのＯＤ読み取りを、阻害剤のモル濃度に対してプロットし、試験した各試料について５０％阻害を外挿した。

【0123】

例示
本発明を下記の調製および実施例によって例証するがこれらに限定せず、その中で、下記の略号を使用する。

【0124】

【表1】

【0125】

^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、いずれの場合も、推定構造と一致していた。特徴的な化学シフト（δ）は、主要なピークの呼称を表す従来の略号：例えば、ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；ｂｒ、広域；ｂｒｍ、広域多重線；ｂｒｔ、広域三重線を使用し、テトラメチルシランから低磁場を百万分率で記す。

【0126】

ＬＣＭＳは、別段の指示がない限り、下記の条件下で実施した：ＷａｔｅｒｓクロスブリッジＣ１８ ５ｎｍ、２．１×３０ｍｍカラム、３．１分間かけて０：１００から９５：５、ＭｅＣＮ：（１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＨＣＯ_３水溶液）。

【0127】

調製
調製１：（Ｓ）−３−ブロモ−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン（または５−ブロモニコチン）

【0128】

【化23】

この化合物は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００７、５０、１５４３４〜１５４３５において記述されている方法に準拠して調製した。

【0129】

ビス（ピナコラト）ジボロン（７．１６ｇ、２８．２１ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（６０ｍＬ）に溶解し、次いで、アルゴンを吹き込んで発泡させることによって脱気した。（Ｓ）−（−）−ニコチン（６．４８ｍＬ、４０．３ｍｍｏｌ）、続いて４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ジピリジル（６５０ｍｇ ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を添加した。脱気を１０分間続け、次いでメトキシ（シクロオクタジエン）イリジウム（Ｉ）二量体（７５３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流温度で１８時間加熱した。溶媒を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解した。水（１００ｍＬ）中の臭化銅（ＩＩ）（２７．０ｇ、１２０．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８０℃で３時間加熱した。アンモニア溶液（１０％水溶液、１００ｍＬ）を反応混合物に添加し、次いでこれを酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物を橙色油（６．１４ｇ、６３％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.68-1.70 (m, 1H),
1.80-1.82 (m, 1H), 1.92-1.94 (m, 1H), 1.99-2.02 (m, 1H), 2.03 (s, 3H),
2.20-2.34 (m, 1H), 3.08 (t, 1H), 3.20 (t, 1H), 7.86 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.54
(s, 1H).

【0130】

調製２：（Ｓ）−３−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イル）アクリロニトリル

【0131】

【化24】

ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中の、（Ｓ）−３−ブロモ−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン（調製１）（３００ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（１４ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（７５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．３５ｍＬ、２．４８ｍｍｏｌ）の混合物に、アルゴンを吹き込んで発泡させることによって脱気した。次いで、アクリロニトリル（０．１２ｍＬ、１．８７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を還流温度で１８時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、セライトに通して濾過し、溶媒を蒸発させて、褐色固体を得た。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を赤褐色油（１８８ｍｇ、７１％、シスおよびトランス異性体の混合物）として得た。
¹H NMR (400
MHz, CDCl₃) δ = 1.60-1.79 (m, 1H), 1.80-1.90
(m, 1H), 1.90-2.04 (m, 1H), 2.17および2.19 (2 x s, 3H),
2.16-2.40 (m, 2H), 3.11-3.30 (m, 2H), 5.57および6.00 (2 x
d, 1H), 7.16および7.40 (2 x d, 1H), 7.80および8.26 (2 x s, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.60および8.71
(2 x s, 1H).

【0132】

調製３：（Ｓ）−３−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イル）プロパンニトリル

【0133】

【化25】

ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の（Ｓ）−３−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イル）アクリロニトリル（調製２）（１８５ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）および５％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を、水素雰囲気下で７２時間撹拌した。反応混合物をセライトに通して濾過し、次いで溶媒を蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を淡黄色油（１４１ｍｇ、７５％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.66-1.78 (m, 1H),
1.78-1.89 (m, 1H), 1.89-2.02 (m, 1H), 2.17 (s, 3H), 2.17-2.25 (m, 1H), 2.31 (q,
1H), 2.65 (t, 2H), 2.97 (t, 2H), 3.10 (t, 1H), 3.24 (t, 1H), 7.61 (d, 1H), 8.38
(s, 1H), 8.44 (s, 1H).

【0134】

調製４：（Ｓ）−３−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イル）プロパン−１−アミン

【0135】

【化26】

ＭｅＯＨ中２０％アンモニア（５０ｍＬ）中の（Ｓ）−３−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イル）プロパンニトリル（調製３）（１４０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）およびラネーニッケル（５０ｍｇ）を、５０ｐｓｉの水素下、５０℃で４時間撹拌した。反応混合物をセライトに通して濾過し、次いで溶媒を蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中７％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を淡黄色油（１２６ｍｇ、８８％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CD₃OD) δ = 1.70-1.85 (m, 3H), 1.85-2.03
(m, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.35 (q, 2H), 2.59-2.78 (m, 4H), 3.12-3.37 (m, 2H), 7.70
(s, 1H), 8.31 (br s, 2H).
LCMS: 1.91分(97%),
m/z = 220.16 [M+H]⁺

【0136】

調製５および６：（Ｓ）−２−クロロ−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン（または６−クロロニコチン）および（Ｓ）−２−クロロ−３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン（または２−クロロニコチン）

【0137】

【化27】

これらの化合物は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００６、３５６２〜３５６５において記述されている方法に準拠して調製した。

【0138】

ブチルリチウム（ヘキサン中２Ｍ、８３ｍＬ、１６６ｍｍｏｌ）を、ヘキサン（７０ｍＬ）中のジメチルアミノエタノール（９．３ｍＬ、９２．５ｍｍｏｌ）の溶液に−２０℃で添加した。ヘキサン（３０ｍＬ）中の（Ｓ）−（−）−ニコチン（５．０ｇ、３０．８ｍＭｏｌ）を添加し、反応混合物を−２０℃で１時間撹拌した。次いで、緑色溶液を−７８℃に冷却し、ヘキサクロロエタン（２９．１ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで塩化アンモニウム（飽和水溶液）の添加によってクエンチした。ＤＣＭおよび２Ｍ ＨＣｌ（水溶液）を添加した。水層をＤＣＭ（×２）で洗浄し、次いで氷／アンモニア（水溶液）の添加によって塩基性化した。水層をＤＣＭ（×２）で抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中２０％酢酸エチル）によって精製して、６−クロロニコチン（調製５）（２．２ｇ、３６％）および２−クロロニコチン（調製６）（１２０ｍｇ、２％）をいずれも黄色油として得た。
６−クロロニコチン：¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ =
1.58-2.01 (m, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.10-2.23 (m, 1H), 2.28 (q, 1H), 3.05 (t, 1H),
3.19 (dt, 1H), 7.26 (d, 1H), 7.64 (dd, 1H), 8.27 (d, 1H).
２−クロロニコチン：¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ =
1.45-1.60 (m, 1H), 1.76-1.98 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 2.31-2.49 (m, 2H), 3.24 (t,
1H), 3.55 (t, 1H), 7.20-7.29 (m, 1H), 7.93 (d, 1H), 8.24 (dd, 1H).

【0139】

調製７：（Ｓ）−２−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−２−イルオキシ）エタンアミン

【0140】

【化28】

水素化ナトリウム（油中６０％、約５００ｍｇ）を、エタノールアミン（３ｍＬ）中の６−クロロニコチン（調製５）（６９０ｍｇ、３．５ｍｍｏｌ）に添加した。室温で１５分後、反応混合物を８０℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルと水とに分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を無色油（４４ｍｇ、６％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CD₃OD) δ = 1.71-2.00 (m, 3H), 2.17
(s, 3H), 2.17-2.23 (m, 1H), 2.31 (q, 1H), 2.99 (t, 2H), 3.09 (t, 1H), 3.20 (t,
1H), 4.26 (t, 2H), 6.83 (d, 1H), 7.68 (d, 1H), 8.02 (d, 1H).
LCMS: 2.02分(100%),
m/z = 222.1 [M+H]⁺

【0141】

調製８：（Ｓ）−２−（３−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−２−イルオキシ）エタンアミン

【0142】

【化29】

水素化ナトリウム（油中６０％、約２００ｍｇ）を、エタノールアミン（２ｍＬ）中の２−クロロニコチン（調製６）（１２０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）に添加した。室温で１５分後、反応混合物を８０℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルと水とに分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を無色油（８．５ｍｇ、６％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CD₃OD) δ = 1.60-1.70 (m, 1H),
1.81-1.99 (m, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.23-2.40 (m, 2H), 3.03 (t, 2H), 3.19 (t, 1H),
3.53 (t, 1H), 4.27-4.41 (m, 2H), 6.96 (d, 1H), 7.74 (d, 1H), 8.00 (d, 1H).
LCMS: 2.03分(99%),
m/z = 222.1 [M+H]⁺

【0143】

調製９：（Ｓ）−３−（４−メトキシベンジルオキシ）−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン

【0144】

【化30】

水素化ナトリウム（油中６０％、６５０ｍｇ、３２．５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の４−メトキシベンジルアルコール（１．４ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）に添加した。室温で３０分後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中の５−ブロモニコチン（調製１）（１．４ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を９０℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルと水とに分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中２．５％→５％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物を約３０％の別の異性体と混合された黄色油（４０２ｍｇ、２３％）として得た。

【0145】

調製１０：（Ｓ）−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−オール（または５−ヒドロキシニコチン）

【0146】

【化31】

調製１０ａ：（Ｓ）−３−（４−メトキシベンジルオキシ）−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン（調製９）（４００ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）およびＤＣＭ（５ｍＬ）中、２時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、次いでＤＣＭ（×５）およびＭｅＯＨ中２０％アンモニアと共蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物を黄色油（２２５ｍｇ、９４％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 2.20-2.39 (m, 3H),
2.48-2.59 (m, 1H), 2.76 (s, 3H), 3.83 (br s, 1H), 4.38 (br s, 1H), 7.42 (d,
1H), 8.16 (s, 1H), 8.20 (s, 1H).
LCMS: 1.26分(100%),
m/z = 179.1 [M+H]⁺

【0147】

調製１０ｂ：（Ｓ）−ニコチン（５４ｍＬ、３３６．２ｍｍｏｌ）および４，４’−ジ−ｔｅｒｔブチル−２，２’−ジピリジル（５．４１ｇ、２０．２ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン（２１８ｍＬ）中のビス（ピナコラト）ジボロン（５９．８ｇ、２３５．５ｍｍｏｌｓ）の溶液に連続的に添加した。得られた溶液を、真空下室温で１５から２０分間脱気し、次いで窒素中に放出した。次いでこの手順をもう２回繰り返した。

【0148】

［Ｉｒ（ｃｏｄ）（ＯＭｅ）］_２（６．７ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を反応ベッセルに投入し、反応混合物を、真空下室温で５分間脱気し、次いで窒素中に放出した。次いで、この手順をもう２回繰り返した。

【0149】

得られた溶液を８５℃で１６時間加熱し、その時間の後、分析は完全反応を示した。反応混合物を室温に冷却し、減圧下５０から５５℃で濃縮乾固した。得られた橙色残留物をテトラヒドロフラン（７４０ｍＬ）に溶解し、溶液を０から５℃の間に冷却した。酢酸（５２．１ｍＬ、９０８．８ｍｍｏｌ）をベッセルに投入し、続いて温度を０から１０℃の間に維持しながら、過酸化水素溶液（３０％、４３．１ｍＬ、４５４．４ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。得られた混合物を室温で１６時間撹拌し、その時間の後、分析は完全反応を示した。

【0150】

次いで、反応混合物を０から５℃の間に冷却し、メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液（３０％、５０ｍＬ）の添加によってクエンチした。得られた混合物のｐＨを、濃水酸化アンモニウム溶液（１３０ｍＬ）の添加によって調整した。得られた二相混合物の層を分離し、水層をテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗化合物を橙色ガム状物として得た。これをシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中ＭｅＯＨ、５から２０％）によって精製して不純物の大部分を除去し、続いてさらなるカラムクロマトグラフィー（１００％ＴＨＦ）をして異性体の不純物を除去した。純粋な５−ヒドロキシニコチンが黄色固体（２６ｇ、４８％収率）として単離された。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.70-2.05 (m, 4H), 2.21
(s, 3H), 2.31 (m, 1H), 3.11 (t, 1H), 3.25 (m, 1H), 7.32 (d, 1H), 8.01 (s,
1H), 8.05 (s, 1H).

【0151】

調製１１：（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イルオキシ）エチルカルバメート

【0152】

【化32】

ＤＭＦ（７ｍＬ）中の、（Ｓ）−５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−オール（調製１０）（１７５ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル２−ブロモエチルカルバメート（５５０ｍｇ、２．４５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（６７６ｍｇ、４．９ｍｍｏｌ）を、９０℃で１６時間加熱した。反応混合物を酢酸エチルと水とに分配した。水層を酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製して、表題化合物を黄色油（１０８ｍｇ、３４％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s, 9H), 1.70-2.00
(m, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.09-2.20 (m, 1H), 2.20-2.30 (q, 1H), 3.15-3.26 (m, 2H),
3.45 (t, 2H), 4.08 (t, 2H), 7.43 (d, 1H), 8.07 (s, 1H), 8.13 (s, 1H).
LCMS: 2.62分(100%),
m/z = 322.15 [M+H]⁺

【0153】

調製１２：（Ｓ）−２−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イルオキシ）エタンアミン

【0154】

【化33】

調製１２ａ：（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−（５−（１−メチルピロリジン−２−イル）ピリジン−３−イルオキシ）エチルカルバメート（調製１１）（１０５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）およびＤＣＭ（５ｍＬ）中で１．５時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、次いでＤＣＭ（×５）およびＭｅＯＨ中２０％アンモニアと共蒸発させた。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ中５％［ＭｅＯＨ中２０％アンモニア］）によって精製して、表題化合物を黄色油（６２ｍｇ、８５％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.70-2.01 (m, 3H), 2.17
(s, 3H), 2.18-2.30 (m, 1H), 2.30-2.40 (m, 1H), 3.03 (t, 2H), 3.14-3.28 (m, 2H),
4.08 (t, 2H), 7.44 (d, 1H), 8.08 (s, 1H), 8.16 (s, 1H).
LCMS: 1.87分(100%),
m/z = 222.12 [M+H]⁺

【0155】

調製１２ｂ：メタノール（４０ｍＬ）中のカリウムメトキシド（３．３７ｇ、４６．２ｍｍｏｌ）を、メタノール（４０ｍＬ）中の５−ヒドロキシニコチン（調製１０ｂ）（８．０ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）の溶液に、０から５℃の間で投入した。得られた混合物を９０分間撹拌し、次いで、減圧下４５℃で濃縮乾固した。

【0156】

ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）中のＢｏｃ−１−アミノ−２−ブロモエタン（１４．８ｇ、６６．０ｍｍｏｌ）を、窒素下で５０℃に加熱し、この時点で、予め調製した５−ヒドロキシニコチンのカリウム塩、続いて直ちに炭酸カリウム（６．７ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）をベッセルに投入した。

【0157】

得られた混合物を８５℃で４時間加熱し、次いで室温に冷却した。これを減圧下５０℃で濃縮し、得られた橙色混合物を１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）中で１５分間撹拌した。次いで、溶液を濾過し、液を０から５℃の間に冷却し、次いで１，４−ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（６５ｍＬ）で酸性化した。混合物を、減圧下５０℃で濃縮し、得られた残留物をテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）に溶解した。次いで、この混合物を０から５℃の間に冷却し、ｐＨを水酸化ナトリウム溶液（１０Ｍ、４５ｍＬ）で調整した。得られた二相混合物の層を分離し、水層をテトラヒドロフラン（２×５０ｍＬ）で再抽出した。合わせた有機層を濃縮して、粗化合物を赤色油として得た。粗生成物をＤＣＭに溶解し、１０分間撹拌し、次いで濾過し、液をシリカカラムにロードし、酢酸エチル中５から３０％メタノール（２０％水酸化アンモニウムを含有する）で溶離することによって精製した。表題化合物は黄色油、７．１５ｇ（７３％収率）として取得された。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.65-1.80 (m, 3H), 1.85
(m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.21 (m, 1H), 2.35 (q, 1H), 3.12 (m, 3H),
3.28 (t, 1H), 4.08 (t, 2H), 7.28 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 8.23 (s, 1H).

【0158】

調製１３：ｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−４−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）カルバモイル］シクロヘキシル｝カルバメート

【0159】

【化34】

２−メチルテトラヒドロフラン（２ｍｌ）中の３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロパン−１−アミン（調製４）（１００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸（１３２ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）、続いてＴ３Ｐ（５８０μｌ、０．９１ｍｍｏｌ）、次いでＥｔ_３Ｎ（１１８μｌ、０．９１ｍｍｏｌ）で処理した。３時間撹拌後、溶液をＴ３Ｐ（２４０μＬ、０．３８ｍｍｏｌ）で処理した。１８時間撹拌後、溶液を真空で濃縮し、残留物をＭｅＯＨに溶かし、ＳＣＸ−２カートリッジに適用し、ＭｅＯＨ、続いてＭｅＯＨ中アンモニア（約２Ｍ）で溶離した。生成物含有画分を真空で濃縮し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＮＨ_３（１：０：０から９０：１０：１までの勾配）で溶離するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製して、表題化合物をガム状物（１３０ｍｇ、６４％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.04-1.14 (m, 2H), 1.42
(s, 9H), 1.48-1.59 (m, 2H), 1.65-1.74 (m, H), 1.79-2.02 (m, 7H), 2.05-2.09
(brm, 2H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.33 (m, H), 2.60-2.64 (t, 2H),
3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m, 3H), 3.40 (brm, H), 4.39 (brm, H), 5.56 (brt,
H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).
MS, m/z=568 ES+[M+H]⁺, 567 CI
[M+H]⁺

【0160】

調製１４：ｔｅｒｔ−ブチル（１９−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザノナデカ−１−イル）カルバメート

【0161】

【化35】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに３−（２−｛２−［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１８０ｍｇ、７０％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.41 (s, 9H), 1.65-1.76
(m, H), 1.78-1.86 (m, 3H), 1.88-2.01 (m, H), 2.13-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (m,
H), 2.44-2.47 (t, 2H), 2.61-2.65 (t, 2H), 3.03-3.07 (t, H), 3.19-3.29 (m, 6H),
3.49-3.52 (t, 2H), 3.57-3.62 (m, 11H), 3.70-3.73 (t, 2H), 5.21 (brm, H), 6.66
(brm, H), 7.51 (t, H), 8.30-8.31 (d, H),] 8.33 (d, H).
MS, m/z=445 ES+ [M+H]⁺, 445 CI
[M+H]⁺

【0162】

調製１５：ｔｅｒｔ−ブチル｛２−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−２−オキソエチル｝カルバメート

【0163】

【化36】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−酢酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１３３ｍｇ、７７％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.45 (s, 9H), 1.66-1.77
(m, H), 1.79-1.90 (m, 3H), 1.91-2.02 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.34 (q,
H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.09 (t, H), 3.21-3.26 (m, H), 3.28-3.34 (m,
2H), 3.75-3.76 (d, 2H), 5.21 (brm, H), 6.29 (brm, H), 7.52 (t, H),
8.31-8.32 (d, H), 8.34-8.35 (d, H).
MS, m/z=377 ES+ [M+H]⁺, 377 CI
[M+H]⁺

【0164】

調製１６：ｔｅｒｔ−ブチル｛３−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−３−オキソプロピル｝カルバメート

【0165】

【化37】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１３０ｍｇ、７３％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.41 (s, 9H), 1.67-1.75
(m, H), 1.79-1.88 (m, 3H), 1.91-2.00 (m, H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q,
H), 2.37-2.40 (t, 2H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.04-3.08 (t, H), 3.20-3.30 (m,
3H), 3.37-3.41 (q, 2H), 5.26 (brm, H), 6.00 (brm, H), 7.52 (t, H), 8.31-8.32
(d, H), 8.34 (d, H).
MS, m/z=391 ES+ [M+H]⁺, 391 CI
[M+H]⁺

【0166】

調製１７：ｔｅｒｔ−ブチル｛４−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−４−オキソブチル｝カルバメート

【0167】

【化38】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ブタン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１４０ｍｇ、７６％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.40 (s, 9H), 1.64-1.72
(m, H), 1.74-1.87 (m, 5H), 1.87-1.89 (m, H), 2.12-2.20 (m , 6H), 2.24-2.31 (q,
H), 2.62-2.66 (m, 2H), 3.02-3.06 (t, H), 3.11-3.16 (q, 2H), 3.18-3.29 (m , 3H),
4.91 (brm, H), 6.57 (brm, H), 7.51 (t, H), 8.30 (d, H), 8.32 (d, H).
MS, m/z=405 ES+ [M+H]⁺, 405 CI
[M+H]⁺

【0168】

調製１８：ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２−｛２−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−２−オキソエトキシ｝エトキシ）エチル］カルバメート

【0169】

【化39】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−酢酸（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．編（２００６）、４５（３０）、４９３６〜４９４０において記述されている通りに調製したもの）を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（６０ｍｇ、２８％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s, 9H), 1.67-1.98
(m, 7H), 2.14-2.23 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.64-2.68 (m, 2H), 3.04-3.09 (t,
H), 3.21-3.26 (m, H), 3.29-3.37 (m, 3H), 3.53-3.56 (t, 2H), 3.62-3.68 (m, 4H),
3.98 (s, 2H), 4.99 (brm, H), 6.88 (brm, H), 7.53 (t, H), 8.33 (d, H), 8.35 (d,
H).
MS, m/z=465 ES+ [M+H]⁺, 465 CI
[M+H]⁺

【0170】

調製１９：ｔｅｒｔ−ブチル（２−｛２−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−２−オキソエトキシ｝エチル）カルバメート
表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−酢酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１０５ｍｇ、５５％）を産出した。

【0171】

【化40】

¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.43(s, 9H),
2.16-2.24(m, 5H), 2.31(q, 4H), 2.66(t, 1H), 3.07 (t, 2H), 3.24 (t, 1H), m, 1H),
3.32-3.37 (m, 4H), 3.56 (t, 2H), 3.94(s, 2H), 4.98 (br, 1H), 6.69 (br, 1H),
7.54 (t, 1H), 8.33-8.36 (m, 2H).
MS m/z=421 ES+ [M+H]⁺

【0172】

調製２０：ｔｅｒｔ−ブチル｛５−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−５−オキソペンチル｝カルバメート

【0173】

【化41】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１９１ｍｇ、６４％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.43 (s, 9H), 1.47-1.53
(m, 2H), 1.63-1.75 (m, 3H), 1.80-1.89 (m, 4H), 1.94-2.05 (m, H), 2.16 (s, 3H),
2.16-2.23 (m, 2H), 2.31 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.07 (t, H), 3.14-31.6 (m, 2H),
3.22-3.30 (m, 3H), 5.30 (br, H), 5.80 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m, H), 8.35
(m, H).
MS m/z=420 ES+ [M+H]⁺

【0174】

調製２１：ｔｅｒｔ−ブチル｛６−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−６−オキソヘキシル｝カルバメート

【0175】

【化42】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘキサン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１９７ｍｇ、５０％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.32-1.37 (m, 2H), 1.43
(s, 9H), 1.46-1.54 (m, 2H), 1.61-1.69 (m, 2H), 1.69-1.77 (m, H), 1.81-1.89 (m,
5H), 1.95-2.00 (m, H), 2.14-2.22 (m, 5H), 2.30 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.13
(m, 3H), 3.22-3.33 (m, 3H), 4.62 (br, H), 5.63 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m,
H), 8.35 (m, H).
MS m/z=434 ES+ [M+H]⁺

【0176】

調製２２：ｔｅｒｔ−ブチル｛７−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アミノ］−７−オキソヘプチル｝カルバメート

【0177】

【化43】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘプタン酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（２０４ｍｇ、５５％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.31-1.35 (m, 4H), 1.44
(s, 9H), 1.44-1.49 (m, 2H), 1.60-1.67 (m, 2H), 1.70-1.77 (m, H), 1.81-1.89 (m,
5H), 1.94-1.99 (m, H), 2.13-2.23 (m, 5H), 2.30 (q, H), 2.65 (t, 2H), 3.05-3.12
(m, 3H), 3.22-3.33 (m, 3H), 4.37 (br, H), 5.68 (br, H), 7.53 (t, H), 8.33 (m,
H), 8.35 (m, H).
MS m/z=448 ES+ [M+H]⁺

【0178】

調製２３：ｔｅｒｔ−ブチル（２２−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１９−ジアザドコサ−１−イル）カルバメート

【0179】

【化44】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにＮ−（３−｛２−［２−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸を使用し、調製１３について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（２８４ｍｇ、５３％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.43 (s, 9H), 1.71-1.77
(m, 9H), 1.87-2.02 (m, 4H), 2.16-2.22 (m, 4H), 2.30 (q, H), 2.63 (t, 2H), 3.06
(t, H), 3.19-3.28 (m, 5H), 3.33-3.37 (m, 2H), 3.51-3.65 (m, 12H), 5.09 (br, H),
6.59 (br, H), 6.64 (br, H), 7.52 (t, H), 8.32 (m, H), 8.35 (m, H).
MS m/z=622 ES+ [M+H]⁺

【0180】

調製２４：ｔｒａｎｓ−４−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）シクロヘキサンカルボキサミド

【0181】

【化45】

ＤＣＭ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル｛ｔｒａｎｓ−４−［（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）カルバモイル］シクロヘキシル｝カルバメート（調製１３）（１３０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液を、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）で処理した。得られた溶液を周囲温度で２時間撹拌し、その時間の後、これを真空で濃縮した。残留物をＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸ−２カートリッジに適用し、ＭｅＯＨ、続いてＭｅＯＨ中アンモニア（２Ｍ）で溶離した。生成物を含有する画分を真空で濃縮して、表題化合物を無色ガム状物（９８ｍｇ、９７％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.02-1.12 (m, 2H),
1.45-1.76 (m, 5H), 1.77-2.03 (m, 9H), 2.12-2.21 (m, 4H), 2.25-2.32 (q,
H), 2.59-2.68 (m, 3H), 3.02-3.06 (t, H), 3.19-3.29 (m, 3H), 5.66 (br, H), 7.49
(t, H), 8.29 (d, H), 8.33 (d, H).
MS, m/z= 345および367
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 345
CI [M+H]⁺

【0182】

調製２５：１−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド

【0183】

【化46】

表題化合物は、調製１４から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（１４９ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.64-1.75 (m, H),
1.77-1.99 (m, 7H), 2.12-2.21(m, 4H), 2.25-2.32 (q, H), 2.44-2.46 (t, 2H),
2.60-2.64 (t, 2H), 2.82-2.85 (t, 2H), 3.02-3.06 (t, H), 3.19-3.29 (m, 3H),
3.47-3.50 (t, 2H), 3.59-3.61 (m, 11H), 3.69-3.72 (t, 2H), 6.76 (brm, H), 7.50
(t, H), 8.30-8.31 (d, H), 8.33 (d, H).
MS, m/z= 467および489
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 467 CI
[M+H]⁺

【0184】

調製２６：Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）グリシンアミド

【0185】

【化47】

表題化合物は、調製１５から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（９９ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.66-2.01 (m, 7H),
2.13-2.22 (m, 4H), 2.27-2.33 (q, H), 2.62-2.66 (t, 2H), 3.05-3.09 (t, H),
3.21-3.26 (t, H), 3.29-3.34 (m, 4H), 7.35 (brm, H), 7.53 (t, H), 8.32 (d, H),
8.33-8.34 (d, H).
MS, m/z= 277および291
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 277 CI
[M+H]⁺

【0186】

調製２７：Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）−ベータ−アラニンアミド

【0187】

【化48】

表題化合物は、調製１６から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（９９ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.65-1.76 (m, H),
1.77-2.00 (m , 6H), 2.13-2.22 (m, 4H), 2.26-2.32 (m ,3H), 2.62-2.66 (t, 2H),
2.98-3.01 (t, 2H), 3.03-3.08 (t, 2H) 3.20-3.31 (m, 3H), 7.26 (brm, H), 7.51 (t,
H) 8.31-8.32 (d, H), 8.33-8.34 (d, H).
MS, m/z= 291および313
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 291 CI
[M+H]⁺

【0188】

調製２８：４−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）ブタンアミド

【0189】

【化49】

表題化合物は、調製１７から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（１０４ｍｇ、９９％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.65-2.00 (m , 9H),
2.13-2.32 (m, 7H), 2.61-2.65 (t, 2H), 2.72-2.76 (t, 2H) 3.03-3.07 (t, H)
3.20-3.30 (m, 3H), 6.22 (brm, H), 7.50 (t, H), 8.30-8.31 (d, H) 8.33-8.34 (d,
H).
MS, m/z= 305および327
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 305 CI
[M+H]⁺

【0190】

調製２９：２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アセトアミド

【0191】

【化50】

表題化合物は、調製１８から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、無色ガム状物（４９ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.67-1.78 (m, H),
1.79-2.02 (m , 4H), 2.15-2.34 (m, 7H), 2.64-2.67 (t, 2H), 2.88-2.91 (t, 2H),
3.06-3.10 (t, 1H), 3.22-3.27 (t, 1H), 3.31-3.36 (q, 2H), 3.54-3.57 (t, 2H),
3.63-3.70 (m, 4H), 3.99 (s, 2H), 7.02 (dm, 2H), 7.54 (t, H), 8.33-8.34
(d, H), 8.35 (d, H).
MS, m/z= 365および387
ES+ [M+H]⁺および[M+Na]⁺, 365 CI [M+H]⁺

【0192】

調製３０：２−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）アセトアミド

【0193】

【化51】

表題化合物は、調製１９から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（８７ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.70-1.97 (m, 6H), 2.17
(s, 3H), 2.18-2.23 (m, H), 2.31 (q, H), 2.67 (t, 2H), 2.94 (m, 2H), 3.08 (t,
H), 3.26 (m, H), 3.35 (q, 2H), 3.56 (t, 2H), 3.98 (s, 2H), 7.35 (br, H), 7.55
(t, H), 8.34 (d, H), 8.35 (d, H).
MS, m/z= 321 ES+ [M+H]⁺

【0194】

調製３１ ５−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）ペンタンアミド

【0195】

【化52】

表題化合物は、調製２０から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（７８ｍｇ、５４％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.46-1.52 (m, H),
1.64-1.72 (m, 3H), 1.81-2.02 (m, 7H), 2.15-2.24 (m, 5H), 2.31(q, H), 2.65
(t, 2H), 2.72 (t, H), 3.07 (t, H), 3.20-3.32 (m, 4H), 5.79 (br, H), 6.25 (br,
H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H), 8.35 (m, H).
MS, m/z= 319 ES+ [M+H]⁺

【0196】

調製３２：６−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）ヘキサンアミド

【0197】

【化53】

表題化合物は、調製２１から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（７０ｍｇ、４６％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.32-1.41 (m, 2H),
1.50-1.57 (m, H), 1.59-1.70 (m, 4H), 1.81-1.85 (m, 3H), 1.87-2.01 (m, 2H), 2.15
(s, 3H), 2.15-23 (m, 3H), 2.30 (q, H), 2.63 (t, 2H), 2.765 (t, H), 3.06 (t, H),
3.19-2.29 (m, 3H).
MS, m/z= 333 ES+ [M+H]⁺

【0198】

調製３３：７−アミノ−Ｎ−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）ヘプタンアミド

【0199】

【化54】

表題化合物は、調製２２から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（５９ｍｇ、３７％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.32-1.29 (m, 3H),
1.46-1.50 (m, H), 1.61-1.66 (m, 2H), 1.70-1.74 (m, H), 1.82-1.89 (m, 3H),
1.94-2.04 (m, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.15-2.23 (m, 3H), 2.32 (q, H), 2.65 (t, 2H),
2.71 (t, H), 3.08 (t, H), 3.18-3.33 (m, 4H), 5.58 (br, H), 5.65 (br, H), 7.53
(d, H), 8.34 (m, H), 8.36 (m, H).
MS, m/z= 347 ES+ [M+H]⁺

【0200】

調製３４：Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）−Ｎ’−（３−｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝プロピル）スクシンアミド

【0201】

【化55】

表題化合物は、調製２３から出発し、調製２４について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（１２０ｍｇ、５１％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.71-1.87 (m, 6H),
1.90-2.02 (m, H), 2.16 (s, 3H), 2.17-2.24 (m, H), 2.30 (q, H), 2.40-2.51 (m,
6H), 2.61-2.67 (m, 2H), 2.87 (t, 2H), 3.22-3.29 (m, 3H), 3.31 (q, 2H),
3.51-3.65 (m, 12H), 6.85 (br, H), 6.95 (br, H), 7.53 (s, H), 8.33 (m, H), 8.35
(m, H).
MS, m/z= 522 ES+ [M+H]⁺

【0202】

調製３５：ｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−４−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］カルバモイル｝シクロヘキシル）カルバメート

【0203】

【化56】

２−メチルテトラヒドロフラン（２ｍｌ）中の２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エタンアミン（調製１２）（５５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸（９１ｍｇ、０．３７３ｍｍｏｌ）、続いてＴ３Ｐ（３１７μｌ、０．４９８ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１１８μｌ、０．９１ｍｍｏｌ）で処理した。３時間撹拌後、溶液をＴ３Ｐ（６９μＬ、０．４９８ｍｍｏｌｅ）で処理した。１８時間撹拌後、溶液を真空で濃縮し、残留物をＭｅＯＨに溶かし、ＳＣＸ−２カートリッジに適用し、メタノール、続いてＭｅＯＨ中アンモニア（約２Ｍ）で溶離した。生成物含有画分を真空で濃縮し、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＮＨ３（１：０：０から９０：１０：１までの勾配）で溶離するシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。次いで、この材料をＤＣＭに溶解し、ＰＳ−イソシアネート樹脂で３時間処理し、その後、濾過し、真空で蒸発させて、表題化合物を淡黄色ガム状物（３５ｍｇ、３５％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.14-1.25 (m,2H), 1.42
(d,9H), 1.47-1.58 (m,2H), 1.75-1.85 (m,3H), 1.87-2.06 (m,4H), 2.09-2.18 (m,1H),
2.21 (s,3H), 2.23-2.32 (m,1H), 2.38-2.45 (q,1H), 3.24-3.29 (m,3H), 3.55-3.58
(t,2H), 4.11-4.14 (t,2H), 7.45-7.43 (m,1H), 8.10 (d,1H), 8.15-8.16 (d,1H).
MS m/z = 447 ES+ [M+H]⁺, 447 CI
[M+H]⁺

【0204】

調製３６：ｔｅｒｔ−ブチル｛２−［２−（２−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）エトキシ］エチル｝カルバメート

【0205】

【化57】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−酢酸（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ．編（２００６）、４５（３０）、４９３６〜４９４０において記述されている通りに調製したもの）を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（５０ｍｇ、４３％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.41 (s,9H), 1.72-1.81
(m,1H), 1.84-2.01 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.21-2.30 (m,1H), 2.33-2.40 (q,1H),
3.16-3.26 (m,4H), 3.50-3.52 (t,2H), 3.62-3.69 (m,6H), 4.01 (s,2H), 4.16-4.19
(t,2H), 7.44-7.45 (m,1H), 8.10 (d,1H), 8.15-8.16 (d,1H).
MS m/z = 467 ES+ [M+H]⁺, 467 CI
[M+H]⁺

【0206】

調製３７：ｔｅｒｔ−ブチル（２−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）カルバメート

【0207】

【化58】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−酢酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（５０ｍｇ、５３％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s,9H), 1.87-2.09
(m,3H), 2.30-2.38 (m,4H), 2.60-2.67 (q,1H), 3.37-3.43 (brt,1H), 3.52-3.56
(brt,1H), 3.61-3.64 (t,2H), 3.70 (s,2H), 4.14-4.17 (t,2H), 7.49-7.50 (m,1H),
8.14-8.15 (d,1H), 8.20-8.21 (d,1H).
MS m/z = 379 ES+ [M+H]⁺, 379 CI
[M+H]⁺

【0208】

調製３８：ｔｅｒｔ−ブチル（３−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−３−オキソプロピル）カルバメート

【0209】

【化59】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロピオン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（７０ｍｇ、７２％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.39 (s,9H), 1.75-1.84
(m,1H), 1.87-2.04 (m,2H), 2.21 (s,3H), 2.23-2.31 (m,1H), 2.37-2.47 (m,3H),
3.24-3.33 (m,4H), 3.58-3.61 (t,2H), 4.12-4.15 (t,2H), 7.44-7.45 (m,1H),
8.10-8.11 (d,1H), 8.16-8.17 (d,1H).
MS m/z = 393 ES+ [M+H]⁺, 393 CI
[M+H]⁺

【0210】

調製３９：ｔｅｒｔ−ブチル（４−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−４−オキソブチル）カルバメート

【0211】

【化60】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ブタン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（４３ｍｇ、４２％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.41 (s,9H), 1.70-1.78
(m,2H), 1.96-2.12 (m,3H), 2.21-2.24 (t,2H), 2.33-2.42 (m,4H), 2.69-2.76 (q,1H),
3.02-3.07 (m,2H), 3.43-3.49 (brt,1H), 3.58-3.61 (t,2H), 3.64-3.69 (brt,1H),
4.15-4.18 (t,2H), 7.51-7.52 (m,1H), 8.16-8.17 (d,1H), 8.23-8.24 (d,1H).
MS m/z = 407 ES+ [M+H]⁺, 407 CI
[M+H]⁺

【0212】

調製４０：ｔｅｒｔ−ブチル（５−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−５−オキソペンチル）カルバメート

【0213】

【化61】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ペンタン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（４９ｍｇ、４７％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.41-1.50 (m,11H),
1.57-1.65 (m,2H), 2.01-2.18 (m,3H), 2.20-2.24 (t,2H), 2.37-2.44 (m,1H), 2.46
(s,3H), 2.78-2.85 (q,1H), 3.00-3.05 (m,2H), 3.49-3.55 (m,1H), 3.58-3.61 (t,2H),
3.76-3.80 (brt,1H), 4.15-4.16 (t,2H), 7.55-7.56 (m,1H), 8.18-8.19 (d,1H),
8.25-8.26 (d,1H).
MS m/z = 421 ES+ [M+H]⁺, 421 CI
[M+H]⁺

【0214】

調製４１：ｔｅｒｔ−ブチル（６−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−６−オキソヘキシル）カルバメート

【0215】

【化62】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘキサン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（６５ｍｇ、６０％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.29-1.35 (m,2H),
1.42-1.49 (m,11H), 1.57-1.65 (m,2H), 2.05-2.15 (m,3H), 2.19-2.23 (t,2H), 2.38-2.46
(m,1H), 2.48 (s,3H), 2.82-2.89 (m,1H), 2.96-3.00 (t,2H), 3.53-3.61 (m,3H),
3.62-3.66 (brt,1H), 4.15-4.18 (t,2H), 7.55-7.56 (m,1H), 8.19-8.20 (d,1H),
8.26-8.27 (d,1H).
MS m/z = 435 ES+ [M+H]⁺, 435 CI
[M+H]⁺

【0216】

調製４２：ｔｅｒｔ−ブチル（７−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−７−オキソヘプチル）カルバメート

【0217】

【化63】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−ヘプタン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（６７ｍｇ、６０％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.28-1.34 (m,4H),
1.39-1.45 (m,11H), 1.55-1.64 (m,2H), 2.03-2.15 (m,3H), 2.19-2.22 (t,2H),
2.38-2.46 (m,1H), 2.48 (s,3H), 2.81-2.88 (m,1H), 2.97-3.00 (t,2H), 3.51-3.57
(m,1H), 3.58-3.61 (t,2H), 3.80-3.84 (m,1H), 4.15-4.18 (t,2H), 7.55-7.57 (m,1H),
8.19 (d,1H), 8.16 (d,1H).
MS m/z = 449 ES+ [M+H]⁺, 449 CI
[M+H]⁺

【0218】

調製４３：ｔｅｒｔ−ブチル［２−（２−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）エチル］カルバメート

【0219】

【化64】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−酢酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、淡黄色ガム状物（４２ｍｇ、４２％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s,9H), 2.15-2.32
(m,3H), 2.43-2.52 (s,1H), 2.61 (s,3H), 3.03-3.10 (m,1H), 3.24-3.29 (m,2H),
3.52-3.55 (t,2H), 3.66-3.69 (m,3H), 3.98 (s,2H), 4.06-4.13 (m,1H), 4.21-4.24
(t,2H), 7.62-7.63 (m,1H), 8.24 (d,1H), 8.32-8.33 (d,1H).
MS m/z = 423 ES+ [M+H]⁺, 423 CI
[M+H]⁺

【0220】

調製４４：ｔｅｒｔ−ブチル［２１−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）−１５，１８−ジオキソ−４，７，１０−トリオキサ−１４，１９−ジアザヘンイコサ−１−イル］カルバメート

【0221】

【化65】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりにＮ−（３−｛２−［２−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（８０ｍｇ、５１％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s,9H), 1.68-1.76
(m,4H), 1.97-2.15 (m,3H), 2.35-2.52 (m,9H), 2.71-2.80 (m,1H), 3.09-3.14 (m,2H),
3.20-3.26 (m,2H), 3.48-3.51 (t,5H), 3.55-3.64 (m,10H), 3.66-3.76 (m,1H),
4.14-4.17 (t,2H), 7.53-7.54 (m,1H), 8.17-8.18 (d,1H), 8.24-8.25 (d,1H).
MS m/z = 625 ES+ [M+H]⁺, 625 CI
[M+H]⁺

【0222】

調製４５：ｔｅｒｔ−ブチル［１８−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）−１５−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサ−１６−アザオクタデカ−１−イル］カルバメート

【0223】

【化66】

表題化合物は、ｔｒａｎｓ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−シクロヘキサンカルボン酸の代わりに３−（２−｛２−［２−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオン酸を使用し、調製３５について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（８０ｍｇ、５６％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.42 (s,9H), 2.03-2.20
(m,3H), 2.38-2.50 (m,6H), 2.85-2.91 (m,1H), 3.19-3.22 (m,2H), 3.47-3.50 (t,2H),
3.53-3.63 (m,15H), 3.71-3.74 (t,2H), 3.84-3.92 (m,1H), 4.17-4.19 (t,2H),
7.58-7.59 (m,1H), 8.20-8.21 (d,1H), 8.28 (d,1H).
MS m/z = 570 ES+ [M+H]⁺, 570 CI
[M+H]⁺

【0224】

調製４６：ｔｒａｎｓ−４−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］シクロヘキサンカルボキサミド

【0225】

【化67】

ＤＣＭ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（ｔｒａｎｓ−４−｛［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］カルバモイル｝シクロヘキシル）カルバメート（調製３５）（３５ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）の溶液を、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）で処理した。得られた溶液を周囲温度で終夜撹拌し、その時間の後、これを真空で濃縮した。残留物をＭｅＯＨに溶解し、ＳＣＸ−２カートリッジに適用し、ＭｅＯＨ、続いてＭｅＯＨ中アンモニア（２Ｍ）で溶離した。生成物を含有する画分を真空で濃縮して、表題化合物を橙色ガム状物（１７ｍｇ、６２％）として得た。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.16-1.26 (m,2H),
1.47-1.57 (m,2H), 1.71-2.01 (m,8H), 2.13-2.30 (m,4H), 2.33-2.40 (q,1H),
2.68-2.76 (m,1H), 3.18-3.26 (m,2H), 3.56-3.59 (t,2H), 4.12-4.14 (t,2H),
7.43-7.44 (m,1H), 8.09-8.10 (d,1H), 8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 347 ES+ [M+H]⁺, 347 CI
[M+H]⁺

【0226】

調製４７：２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アセトアミド

【0227】

【化68】

表題化合物は、調製３６から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（３７ｍｇ、９５％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.72-1.81 (m,1H),
1.84-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.22-2.30 (m,1H), 2.34-2.41 (q,1H), 2.83-2.86
(t,2H), 3.19-3.26 (m,2H), 3.54-3.57 (t,2H), 3.65-3.71 (m,6H), 4.02 (s,2H),
4.16-4.19 (t,2H), 7.44-7.45 (m,1H), 8.10-8.11 (d,1H), 8.15 (d,1H).
MS m/z = 367 ES+ [M+H]⁺, 367 CI
[M+H]⁺

【0228】

調製４８：Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］グリシンアミド

【0229】

【化69】

表題化合物は、調製３７から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（３７ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.74-1.84 (m,1H),
1.87-2.05 (m,2H), 2.20 (s,3H), 2.23-2.32 (m,1H), 2.38-2.44 (q,1H), 3.23-3.28
(m,2H), 3.37 (s,2H), 3.63-3.66 (t,2H), 4.15-4.17 (t,2H), 7.45-7.47 (m,1H),
8.10-8.11 (d,1H), 8.15-8.16 (d,1H).
MS m/z = 279 ES+ [M+H]⁺, 279 CI
[M+H]⁺

【0230】

調製４９：Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］−ベータ−アラニンアミド

【0231】

【化70】

表題化合物は、調製３８から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（５２ｍｇ、１００％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.72-1.81 (m,1H),
1.84-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.21-2.30 (m,1H), 2.33-2.44 (m,3H), 2.93-2.96
(t,2H), 3.16-3.26 (m,2H), 3.60-3.62 (t,2H), 4.13-4.16 (t,2H), 7.43-7.44 (m,1H),
8.10 (d,1H), 8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 293 ES+ [M+H]⁺, 293 CI
[M+H]⁺

【0232】

調製５０：４−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］ブタンアミド

【0233】

【化71】

表題化合物は、調製３９から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（２８ｍｇ、８８％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.73-1.82 (m,3H),
1.84-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.21-2.30 (m,3H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.68-2.72
(t,2H), 3.18-3.26 (m,2H), 3.58-3.61 (t,2H), 4.12-4.15 (t,2H) 7.43-7.44 (m,1H),
8.10 (d,1H), 8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 307 ES+ [M+H]⁺, 307 CI
[M+H]⁺

【0234】

調製５１：５−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］ペンタンアミド

【0235】

【化72】

表題化合物は、調製４０から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（３０ｍｇ、８１％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.48-1.56 (m,2H),
1.61-1.68 (m,2H), 1.71-1.81 (m,1H), 1.85-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.22-2.30
(m,3H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.68-2.72 (t,2H), 3.18-3.26 (m,2H), 3.58-3.61 (t,2H),
4.12-4.15 (t,2H), 7.43-7.44 (m,1H), 8.10 (d,1H), 8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 321 ES+ [M+H]⁺, 321 CI
[M+H]⁺

【0236】

調製５２：６−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］ヘキサンアミド

【0237】

【化73】

表題化合物は、調製４１から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（３８ｍｇ、７６％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.31-1.39 (m,2H),
1.48-1.55 (m,2H), 1.59-1.66 (m,2H), 1.72-1.81 (m,1H), 1.84-2.03 (m,2H), 2.18
(s,3H), 2.21-2.30 (m,3H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.65-2.69 (t,2H), 3.18-3.26 (m,2H),
3.57-3.60 (t,2H), 4.15-4.12 (t,2H), 7.43-7.44 (m,1H), 8.09-8.10 (d,1H),
8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 335 ES+ [M+H]⁺, 335 CI
[M+H]⁺

【0238】

調製５３：７−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］ヘプタンアミド

【0239】

【化74】

表題化合物は、調製４２から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（３７ｍｇ、７２％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.32-1.37 (m,4H),
1.44-1.51 (m,2H), 1.57-1.65 (m,2H), 1.72-1.82 (m,1H), 1.83-2.03 (m,2H),
2.18-2.30 (m,6H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.65-2.68 (t,2H), 3.18-3.26 (m,2H),
3.57-3.60 (t,2H), 4.12-4.15 (t,2H), 7.43-7.44 (m,1H), 8.09-8.10 (d,1H),
8.14-8.15 (d,1H).
MS m/z = 349 ES+ [M+H]⁺, 349 CI
[M+H]⁺

【0240】

調製５４：２−（２−アミノエトキシ）−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］アセトアミド

【0241】

【化75】

表題化合物は、調製４３から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（２７ｍｇ、８４％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.72-1.82 (m,1H),
1.84-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.22-2.30 (m,1H), 2.34-2.40 (q,1H), 2.86-2.89
(t,2H), 3.18-3.26 (m,2H), 3.55-3.58 (t,2H), 3.66-3.68 (t,2H), 4.00 (s,2H),
4.16-4.19 (t,2H), 7.44-7.45 (m,1H), 8.10 (d,1H), 8.15 (d,1H).
MS m/z = 323 ES+ [M+H]⁺, 323 CI
[M+H]⁺

【0242】

調製５５：Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノプロポキシ）エトキシ］エトキシ｝プロピル）−Ｎ’−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］スクシンアミド

【0243】

【化76】

表題化合物は、調製４４から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（５９ｍｇ、８８％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.70-1.80 (m,5H),
1.86-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.21-2.30 (m,1H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.44-2.52
(m,4H), 2.76-2.80 (t,2H), 3.18-3.26 (m,4H), 3.48-3.51 (t,2H), 3.55-3.63
(m,12H), 4.11-4.14 (t,2H), 7.43-7.44 (m,1H), 8.10 (d,1H), 8.15 (d,1H).
MS m/z = 524 ES+ [M+H]⁺, 524 CI
[M+H]⁺

【0244】

調製５６：１−アミノ−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］−３，６，９，１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド

【0245】

【化77】

表題化合物は、調製４５から出発し、調製４６について上記した一般的方法によって調製して、橙色ガム状物（５５ｍｇ、８５％）を産出した。
¹H NMR
(400 MHz, CDCl₃) δ = 1.71-1.81 (m,1H),
1.84-2.03 (m,2H), 2.18 (s,3H), 2.22-2.30 (m,1H), 2.33-2.40 (q,1H), 2.45-2.48
(t,2H), 2.78-2.80 (t,2H), 3.18-3.25 (m,2H), 3.50-3.53 (t,2H), 3.58-3.62
(m,14H), 3.71-3.74 (t,2H), 4.13-4.15 (t,2H), 7.44-7.45 (m,1H), 8.10 (d,1H),
8.15-8.16 (d,1H).
MS m/z = 469 ES+ [M+H]⁺, 469 CI
[M+H]⁺

【0246】

調製５７：４−メルカプト−Ｎ−［２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エチル］ブタンアミド

【0247】

【化78】

水（１０ｍｌ）中の２−（｛５−［（２Ｓ）−１−メチルピロリジン−２−イル］ピリジン−３−イル｝オキシ）エタンアミン（調製１２）（１１００ｍｇ、４．９７１ｍｍｏｌ）の溶液をγ−チオブチロラクトン（８６１ｕｌ、９．９４ｍｍｏｌ）で処理し、反応混合物を６０℃に終夜加熱した。次いでこれを真空で蒸発させると無色ガム状物が残り、これをＭｅＯＨからシリカに予め吸着させた。次いでこれを、ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：ＮＨ３ ８０：２０：１で溶離する４０ｇのＩＳＣＯカラム上でクロマトグラフィーにかけた。適正な画分を真空で蒸発させて、表題化合物を無色ガム状物６９０ｍｇとして得た。収率＝４３％。
¹H NMR
(400Mhz, CD₃OD): δ=1.77-2.06 (m, 6H), 2.22-2.35
(m, 6H), 2.41-2.51 (m, 3H), 3.26-3.32 (m, H), 3.58-3.61 (t, 2H),
4.13-4.15 (t, 2H), 7.45-7.47 (m, H), 8.11-8.12 (d, H), 8.17 (d, H). MS m/z=324
ES+ [M+H]⁺および322 CI- [M-H]^-

【実施例】

【0248】

（実施例１）
下記の手順を使用して、調製４のハプテンをジフテリアトキソイドタンパク質とカップリングした。

【0249】

ａ）ハプテンを黄色油として取得し、使用日まで２〜８℃で貯蔵した（最大１週間、それより長い貯蔵は−２０℃で）。この油を、ＣａもＭｇも含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）または脱イオン水のいずれかに、溶液１ｍｌ当たり５０ｍｇのハプテンで溶解した。結果は、黄褐色懸濁液または溶液であった。

【0250】

ｂ）別個に、アリコートの濃ジフテリアトキソイド（ＤＴ）を取得し、ゲル濾過脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＤＴの緩衝液をＤＰＢＳに変更した。カラムからの溶離液は、ウシ血清アルブミン標準曲線を使用するブラッドフォードアッセイ（クマシーブリリアントブルー試薬、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって決定したところ、約１１ｍｇ／ｍｌの４ｍｌ溶液であった。アリコートのこれをさらなるＤＰＢＳで希釈して、ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質の４ｍｌ溶液を得た。

【0251】

ｃ）このアリコートのＤＴを無水コハク酸と反応させて、修飾されたスクシニル化ジフテリアトキソイドを生じさせた。ＤＰＢＳ中の４ｍｌアリコートのＤＴを固体としての８０ｍｇ無水コハク酸と合わせ、チューブローラー上に置いて、室温で３時間穏やかにかき混ぜた。この方法を使用すると、最終生成物が透明溶液ではないことが認められた。３時間の反応時間の終わりに、アリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して、未反応の低分子成分を除去した。これにより、試料の体積を計６ｍｌに増大させた。

【0252】

ｄ）２８ｍｇの固体としてのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を、６ｍｌスクシニル化ＤＴアリコートに添加し、管を反転させて穏やかに混合することによってｓ−ＮＨＳを溶解させた。次いで、２８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。反応混合物（スクシニル化ＤＴ／ＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳ）を室温で１０分間インキュベートし、２００μｌの上記で調製したハプテン溶液を添加し、ボルテックスを使用し反応混合物を手早く撹拌して、混合した。

【0253】

ｅ）混合物を、チューブローラー上で穏やかにかき混ぜながら、室温で３から４時間反応させた。反応時間の終わりに、アリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して、未反応の低分子成分を除去した。これにより、コンジュゲート試料の体積を計８ｍｌに増大させた。次いで、この８ｍｌの溶離液を、３ｋ ＭＷＣＯ遠心限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約３．０〜３．５ｍｌに濃縮した。

【0254】

ｆ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は２．３ｍｇ／ｍｌと決定された。タンパク質含有量が正規化された非コンジュゲート対照と対比した２５０〜２７０ｎｍ領域における紫外分光法を使用して、コンジュゲートをハプテン組み込みについて分析し、この領域において、天然トキソイドと比較してより強く抗体吸収する（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｒｂ）ことが分かった。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、１００μｇのコンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣを使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した。ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１９個のハプテンを有することが分かった。

【0255】

ｇ）最後に、試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、０．５ｍｌアリコートに無菌で細分した。これらの無菌アリコートを、ドライアイス上の研究位置への輸送まで、−８０℃で貯蔵した。

【0256】

（実施例２）
下記の変更を加えた、実施例１について上記した一般的手順を使用して、調製１２のハプテンをジフテリアトキソイドタンパク質とカップリングした：ステップｄ）において、１８６μｌのハプテン溶液を反応混合物に添加し；ステップｆ）において、最終濃度は３．３ｍｇ／ｍｌと決定され、ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１３個のハプテンを有することが分かった。

【0257】

（実施例３）
ステップｃ、ｅおよびｆにおいて下記の変更を加えた、実施例１について上記した一般的手順を使用して、調製７のハプテンをジフテリアトキソイドタンパク質とカップリングした。

【0258】

ステップｃ）において、３ｍｌ部のアリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して未反応の低分子成分を除去し、それにより、精製試料の体積を計４ｍｌに増大させ；ステップｄ）は次の通りに実施した：８０μｌのハプテン溶液を４ｍｌのスクシニル化ＤＴアリコートに添加し、穏やかに反転させて混合した。次いで、２８ｍｇのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。最後に、２８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。

【0259】

ステップｅ）において、混合物を２時間反応させ、コンジュゲート試料の体積を溶離後に計６ｍｌに増大させ、次いで、６ｍｌの溶離液を、１０ｋ ＭＷＣＯ遠心限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約２．５〜３．０ｍｌに濃縮した。

【0260】

ステップｆ）において、最終濃度は２．４ｍｇ／ｍｌと決定され、ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１４．５個のハプテンを有することが分かった。

【0261】

（実施例４）
下記の変更を加えた、実施例１について上記した一般的手順を使用して、調製８のハプテンをジフテリアトキソイドタンパク質とカップリングした：ステップｄ）は次の通りに実施した：１２０μｌのハプテン溶液を６ｍｌのスクシニル化ＤＴアリコートに添加した。混合物をボルテックスで手早く撹拌した。次いで、２８ｍｇのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を固体として添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。最後に、２８ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させ；ステップｆ）において、最終濃度は２．５ｍｇ／ｍｌと決定され、ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１９．３個のハプテンを有することが分かった。

【0262】

（実施例５）
調製２４から３４および４６から５６のハプテン−スペーサーコンジュゲートを、以下の方法において記述する通り、ジフテリアトキソイドタンパク質とカップリングした。

【0263】

ａ）ハプテン−スペーサーコンジュゲートを黄色油として取得し、使用日まで２から８℃で貯蔵した（最大１週間、それより長い貯蔵は−２０℃で）。この油を、ＣａもＭｇも含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）に、溶液１ｍｌ当たり５０ｍｇのハプテンで溶解した。結果は、黄褐色懸濁液または溶液であった。調製３３は、脱イオン水に完全には溶解しなかったため、５０％メタノールにさらに溶解して、溶液１ｍｌ当たり２５ｍｇのハプテン−スペーサーコンジュゲートの最終濃度とした。

【0264】

ｂ）別個に、アリコートの濃ジフテリアトキソイド（ＤＴ）を取得し、ゲル濾過脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＤＴの緩衝液をＤＰＢＳに変更した。カラムからの溶離液は、ウシ血清アルブミン標準曲線を使用するブラッドフォードアッセイ（クマシーブリリアントブルー試薬、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって決定したところ、約１１ｍｇ／ｍｌの４ｍｌ溶液であった。アリコートのこれをさらなるＤＰＢＳで希釈して、ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質の２ｍｌ溶液を得た。

【0265】

ｃ）このアリコートのＤＴを無水コハク酸と反応させて、修飾されたスクシニル化ジフテリアトキソイドを生じさせた。ＤＰＢＳ中の２ｍｌアリコートのＤＴを固体としての４０ｍｇの無水コハク酸と合わせ、チューブローラー上に置いて、室温で３時間穏やかにかき混ぜた。この方法を使用すると、最終生成物が透明溶液ではないことが認められた。３時間の反応時間の終わりに、アリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して、未反応の低分子成分を除去した。これにより、試料の体積を計３ｍｌに増大させた。

【0266】

ｄ）９ｍｇの固体としてのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を、３ｍｌのＤＴアリコートに添加し、管を反転させて穏やかに混合することによってｓ−ＮＨＳを溶解させた。次いで、９ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。５０μｌの上記で調製したハプテン−スペーサーコンジュゲート溶液（調製３３では１００ｕｌ）を反応混合物（スクシニル化ＤＴ／ＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳ）に添加した。

【0267】

ｅ）混合物を、チューブローラー上で穏やかにかき混ぜながら、室温で３から４時間反応させた。反応時間の終わりに、アリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して、未反応の低分子成分を除去した。これにより、コンジュゲート試料の体積を計４ｍｌに増大させた。

【0268】

ｆ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は表１において示される通りに決定された。タンパク質含有量が正規化された非コンジュゲート対照と対比した２５０から２７０ｎｍ領域における紫外分光法を使用して、コンジュゲートをハプテン組み込みについて分析し、この領域において、天然トキソイドと比較してより強く抗体吸収することが分かった。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、１００μｇのコンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣを使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した。試験試料へのハプテンローディングについて、表１および２において以下で詳述する。

【0269】

ｇ）最後に、試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、１．０ｍｌアリコートに無菌で細分した。これらの無菌アリコートを、ドライアイス上の研究位置への輸送まで、−８０℃で貯蔵した。

【0270】

【表2】

【0271】

【表3】

【0272】

（実施例６）
反応性アミン基を持つハプテンを、無水コハク酸の添加無しに、ジフテリアトキソイドとコンジュゲートしてもよい。ジフテリアトキソイドとコンジュゲートされた調製１２のハプテンの例を以下で詳述するが、これは調製４、７、８、２４〜３４および４６〜５６で実施することもできる。

【0273】

ａ）ハプテンを黄色油として取得し、使用日まで２から８℃で貯蔵した（最大１週間、それより長い貯蔵は−２０℃で）。この油を、ＣａもＭｇも含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）に、溶液１ｍｌ当たり５０ｍｇのハプテンで溶解した。結果は、黄褐色懸濁液または溶液であった。

【0274】

ｂ）別個に、アリコートの濃ジフテリアトキソイド（ＤＴ）を取得し、ゲル濾過脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＤＴの緩衝液をＤＰＢＳに変更した。カラムからの溶離液は、ウシ血清アルブミン標準曲線を使用するブラッドフォードアッセイ（クマシーブリリアントブルー試薬、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）によって決定したところ、約１１ｍｇ／ｍｌの４ｍｌ溶液であった。アリコートのこれをさらなるＤＰＢＳで希釈して、ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質の２ｍｌ溶液を得た。

【0275】

ｃ）９ｍｇの固体としてのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を、２ｍｌのＤＴアリコートに添加し、管を反転させて穏やかに混合することによってｓ−ＮＨＳを溶解させた。次いで、９ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を固体としての混合物に添加し、管を反転させて穏やかに混合することによって溶解させた。５０μｌの上記で調製したハプテン溶液を反応混合物（ＤＴ／ＥＤＣ／ｓ−ＮＨＳ）に添加した。この段階で、１Ｍ ＨＣｌの滴下添加によりｐＨをｐＨ５．６まで調整した。

【0276】

ｄ）混合物を、チューブローラー上で穏やかにかき混ぜながら、室温で３から４時間反応させた。反応時間の終わりに、アリコートをゲル濾過脱塩カラムに適用し、ＤＰＢＳ中に溶離して、未反応の低分子成分を除去した。これにより、コンジュゲート試料の体積を計３ｍｌに増大させた。

【0277】

ｅ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は３．０１ｍｇ／ｍｌと決定された。タンパク質含有量が正規化された非コンジュゲート対照と対比した２８０ｎｍ領域における紫外分光法を使用して、コンジュゲートをハプテン組み込みについて分析し、この領域において、天然トキソイドと比較してより強く抗体吸収することが分かった。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、１００μｇのコンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣを使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した。ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１１．６個のハプテンを有することが分かった。

【0278】

ｇ）最後に、試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、１．０ｍｌアリコートに無菌で細分した。これらの無菌アリコートを、ドライアイス上の研究位置への輸送まで、−８０℃で貯蔵した。

【0279】

（実施例７）
調製１２をＣＲＭ_１９７と、およびジフテリアトキソイドとカップリングしてもよい。そのようなコンジュゲートの例を以下に記す。図示されていないが、４、７、８、２４〜３４および４６〜５６等のハプテンを含有する他のアミンに同じプロセスを適用してもよい。

【0280】

ａ）調製１２のハプテンを黄色油として取得し、−２０℃で貯蔵した。この油を、ＣａもＭｇも含まないダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）に、溶液１ｍｌ当たり５０ｍｇのハプテンで溶解した。結果は、黄褐色懸濁液または溶液であった。

【0281】

ｂ）別個に、２０ｍｌアリコートの濃ＣＲＭ_１９７（５．９１ｍｇ／ｍｌ）を、−８０℃から２〜８℃に解凍した。８．６２ｍｌアリコートの解凍した材料を取り、１．３８ｍｌのＤＰＢＳで希釈して、ＤＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌタンパク質の１０ｍｌ溶液を得た。

【0282】

ｃ）５００μｌの上記で調製したハプテン溶液を、１０ｍｌのＣＲＭ_１９７溶液に添加し、これをゆっくり滴下添加し、次いでチューブローラー上で５分間反応させておいた。

【0283】

ｄ）この時間の後、次いで９０ｍｇの固体としてのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）を１０ｍｌのＣＲＭ_１９７溶液に添加した。穏やかに混合しながら管を反転させることによって、ｓ−ＮＨＳを溶解させた。次いで、溶液をチューブローラー上で５分間反応させておいた。

【0284】

ｅ）５分後、９０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をＣＲＭ_１９７溶液に、再度固体として添加し、穏やかに混合しながら管を反転させることによって、これを溶解させた。この段階で、１Ｍ ＨＣｌの滴下添加によりｐＨをｐＨ５．６まで調整した。

【0285】

ｆ）次いで、反応混合物を冷室（２〜８℃）に移し、チューブローラー上で６時間反応させておいた。

【0286】

ｇ）反応時間の終わりに、５×ＮＡＰ２５カラムを使用し試料をｄＰＢＳ中に脱塩して、過剰な未反応の試薬を除去した（オン：２ｍｌ、オフ：３ｍｌ）。最終体積は１５ｍｌに増大した。

【0287】

ｈ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は２．８８ｍｇ／ｍｌと決定された。タンパク質含有量が正規化された非コンジュゲート対照と対比した２８０ｎｍ領域における紫外分光法を使用して、コンジュゲートをハプテン組み込みについて分析し、この領域において、天然トキソイドと比較してより強く抗体吸収することが分かった。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、１００μｇのコンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣを使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した。ハプテン−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり８．０個のハプテンを有することが分かった。

【0288】

ｉ）最後に、試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、１．０ｍｌアリコートに無菌で細分した。これらの無菌アリコートを、ドライアイス上の研究位置への輸送まで、−８０℃で貯蔵した。

【0289】

（実施例８）
反応混合物のｓＮＨＳ／ＥＤＣ濃度を増大させることにより、担体タンパク質にロードされるハプテンの量を制御できることが分かった。調製７とジフテリアトキソイドとのコンジュゲートの例を以下に示す。該方法は、ステップｃおよびｅにおいて下記の変更を加えた、実施例６について記述した通りのものである。

【0290】

ステップｃ）において：この段階で、２ｍｌアリコートの脱塩されたＤＴに添加されるスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓ−ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の量を変動させてよい。この実験においては、９ｍｇのｓＮＨＳおよびＥＤＣを１つのアリコートに添加し（これを条件２と称する）、３６ｍｇのｓＮＨＳおよびＥＤＣを別のアリコートに添加した（これを条件４と称する）。試料を１Ｍ ＨＣｌの滴下添加によりｐＨ５．６までｐＨ調整しなかった。

【0291】

ステップｅ）において：条件２を使用して作製されたコンジュゲートについて、最終濃度は３．１４ｍｇ／ｍｌと決定され、ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり８．３個のハプテンを有することが分かった。条件４を使用して作製されたコンジュゲートについて、最終濃度は２．４６ｍｇ／ｍｌと決定され、ハプテン−ＤＴコンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１３．２個のハプテンを有することが分かった。

【0292】

（実施例９）
ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＢＡＡＮＳ）コンジュゲート化学を経由するＣＲＭ_１９７およびホルマリン不活性化ジフテリアトキソイド（ＤＴ）上へのチオール化ハプテン−スペーサーコンジュゲートの調製

【0293】

ａ）３ｍｌのＣＲＭ_１９７（５．９１ｍｇ／ｍｌで１７．７３ｍｇ）および３ｍｌのＤＴ（８ｍｇ／ｍｌで２４ｍｇ）を解凍し、１０ＤＧ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０中に脱塩した（オン：３ｍｌ、オフ：４ｍｌ）。同じ緩衝液を使用して濃度を４ｍｇ／ｍｌに調整した。

【0294】

ｂ）１ｍｌアリコートの脱塩したＣＲＭ_１９７およびＤＴ試料を取り、２〜８℃に冷却した。

【0295】

ｃ）２０ｍｇの調製５７のハプテン−スペーサーコンジュゲートを３００ｕｌのＤＭＳＯおよび７００ｕｌのｄＰＢＳに溶解して、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。

【0296】

ｄ）５００ｕｌ（１０ｍｇ）のハプテン−スペーサーコンジュゲート溶液を、５００ｕｌの予め洗浄したＴＣＥＰ（（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン））ゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、室温でかき混ぜながら３時間インキュベートした。残ったハプテン溶液を、長期貯蔵では−２０℃で冷凍した。

【0297】

ｅ）ステップ（ｄ）に入って９０分後に、１０ｍｇのＢＡＡＮＳ（Ｓｉｇｍａ）を５００ｕｌのＤＭＳＯに溶解して、２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。

【0298】

ｆ）１．５ｍｇ（７５ｕｌ）のＢＡＡＮＳを、１ｍｌのＤＴ／ＣＲＭ_１９７に、ゆっくり滴下添加した（４ｍｇ／ｍｌで）。これを１１℃未満で９０分間反応させた（１ｍｇのＣＲＭ_１９７／ＤＴ当たり０．３７５ｍｇのＢＡＡＮＳを添加した）。

【0299】

ｇ）９０分後、依然として１１℃未満で動作し、ＮＡＰ１０カラムを使用して、ブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７／ＤＴを冷１００ｍＭ炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液、ｐＨ９．１中に脱塩した（１ｍｌオン、１．５ｍｌオフ）。

【0300】

ｈ）ハプテン−スペーサーコンジュゲートをＴＣＥＰゲルから吸引し、２５０ｕｌ（５ｍｇ）のハプテン−スペーサーコンジュゲートを、混合して濃度勾配が形成されるのを防止しながら、活性化されたＣＲＭ_１９７／ＤＴ試料両方に再度ゆっくり滴下添加した。

【0301】

ｉ）ハプテン−スペーサーコンジュゲートを添加した後、ｐＨを確認し、必要ならば、０．１Ｍ ＮａＯＨ／ＨＣｌの滴下添加によって９．１に調整した。

【0302】

ｊ）反応混合物を混合しながら光のアンチボディセンス（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｇｈｔ）中に１８時間保った。

【0303】

ｋ）この時間の後、２ｕｌのＮ−アセチルシステアミン（ＮＡＣ）を各反応混合物に添加し、ここでも光のアンチボディセンス中、かき混ぜながら３時間反応させた（１ｇのＣＲＭ_１９７／ＤＴ当たり０．５ｍｌ）。

【0304】

ｌ）反応後、１０ＤＧ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、これをダルベッコＰＢＳ中に脱塩した（３ｍｌオン、４ｍｌオフ）。

【0305】

ｍ）最後に、試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、無菌でアリコートした。これらの無菌アリコートを、研究位置への輸送まで、２〜８℃で貯蔵した。

【0306】

ｎ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は１．５９ｍｇ／ｍｌと決定された。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、１５０μｇのコンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣを使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した。ハプテン−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートは、タンパク質単量体１個当たり１１．６個のハプテンを有することが分かった。

【0307】

（実施例１０）
反応混合物のＢＡＡＮＳ濃度を増大させることにより、担体タンパク質にロードされるハプテン／ハプテン−スペーサーコンジュゲートの量を制御できることが分かった。調製５７とＣＲＭ_１９７とのコンジュゲートの例を以下に示す。

【0308】

ａ）９ｍｌのＣＲＭ_１９７（５．９１ｍｇ／ｍｌで５３．１９ｍｇ）を解凍し、１０ＤＧ脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０中に脱塩した（オン：３ｍｌ、オフ：４ｍｌ）。同じ緩衝液を使用して濃度を４ｍｇ／ｍｌに調整した。

【0309】

ｂ）３０ｍｇの調製５７のハプテン−スペーサーコンジュゲートを、１．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解した（最終濃度２０ｍｇ／ｍｌ）。

【0310】

ｃ）ダルベッコＰＢＳ中で２回洗浄することによって１ｍｌのＴＣＥＰゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）を調製した後、１．５ｍｌのハプテン−スペーサーコンジュゲート含有溶液を添加した。次いで、これを回転台上、２〜８℃で２時間インキュベートした。

【0311】

ｄ）１時間のＴＣＥＰインキュベーション後、１０ｍｌの４ｍｇ／ｍｌ ＣＲＭ_１９７溶液を、別個の反応ベッセル中で５×２ｍｌアリコートに分割し、冷室で３０分間貯蔵して、溶液の温度を２〜８℃に調整した。以後すべてのステップは２〜８℃で実施した。

【0312】

ｅ）同時に、２０ｍｇのＢＡＡＮＳを１ｍｌのＤＭＳＯに溶解することにより、ＢＡＡＮＳのストック溶液を調製した。５つの反応ベッセルに、条件１、２、３、４または５のいずれかとしてラベル付けした。ＣＲＭ_１９７アリコートの温度を２〜８℃に調整した後、様々な量のＢＡＡＮＳ溶液（５０ｕｌ、１００ｕｌ、１５０ｕｌ、２２５ｕｌおよび３００ｕｌ）を、表２において示される通りに５×２ｍｌの反応ベッセルに添加した。ＢＡＡＮＳ溶液をゆっくり（滴下）混合しながら添加した。

【0313】

ｆ）アリコートを、回転台上、２〜８℃で３０分間反応させた。

【0314】

ｇ）３０分間のインキュベーション後、ＮＡＰ２５（Ｇｉｂｃｏ）カラムを使用して、５×２ｍｌのブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７を１００ｍＭ炭酸ナトリウム／重炭酸緩衝液ｐＨ９．１中に脱塩した（オン：２ｍｌ、オフ：３ｍｌ）。

【0315】

ｈ）ＴＣＥＰゲルをハプテン試料から回転分離し、脱塩したブロモアセチル化ＣＲＭ_１９７試料のそれぞれに、５．６ｍｇ（２８０ｕｌ）のハプテン−スペーサーコンジュゲートを混合しながら（ゆっくり、滴下）添加した。内容物を光から保護するために、反応ベッセルをホイルで覆った。

【0316】

ｉ）混合物を、回転台上で１８時間反応させた。

【0317】

ｊ）１ｇのＣＲＭ_１９７当たり０．５ｍｌ（したがって１反応当たり４ｕｌ）のＮＡＣを反応混合物に添加することにより、未反応のＢｒＡｃ基をクエンチした。混合物を、回転台上で３時間反応させた（光から保護するためにホイルで覆ったまま）。

【0318】

ｋ）最後に、ＤＧ１０カラムを使用して、各反応物をダルベッコＰＢＳ中に脱塩した（オン：３ｍｌ、オフ：４ｍｌ）。最終体積は４ｍｌであった。

【0319】

ｌ）試料を０．２２μｍのシリンジフィルターに通して滅菌濾過し、無菌でアリコートした。これらの無菌アリコートを、研究位置への輸送まで、２〜８℃で貯蔵した。

【0320】

ｍ）ウシ血清アルブミン標準物質を使用し、最終コンジュゲートをタンパク質含有量についてブラッドフォード（Ｐｉｅｒｃｅクマシーブリリアントブルー試薬）アッセイを使用して分析し、最終濃度は表３に示す通りに決定された。コンジュゲートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって、およびＬＡＬアッセイを使用してエンドトキシン含有量についても分析した。最後に、４５０μｇの各コンジュゲートの試料を加水分解し、逆相ＨＰＬＣ（Ｎ＝３）を使用して分析して、タンパク質分子１個当たりの組み込まれたハプテンの数を決定した（ハプテンローディングデータを表５に示す）。

【0321】

【表4】

【0322】

【表5】

【0323】

【表6】

【0324】

（実施例１１）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ．）（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例１から４のコンジュゲートで免疫化した。血漿中の抗ニコチンＩｇＧ抗体レベルを上記した通りのＥＬＩＳＡによって測定した。

【0325】

結果は図１に示されており、ここから、初回免疫注射の４週間後に試験コンジュゲートそれぞれについて強いニコチン抗体応答が取得され、その応答は、１回目および２回目の追加免疫注射のそれぞれの後２週間、持続または増大することが分かる。

【0326】

（実施例１２）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例１から４のコンジュゲートで免疫化した。アビディティ指数を種々の時点で算出した。アビディティ指数は、上記した通りのニコチン−ＢＳＡコーティングプレートから抗ニコチン抗体の５０％を溶離するために必要とされるチオシアン酸アンモニウムの濃度に相当する。

【0327】

結果は図２に示されており、ここから、マウスにおける試験コンジュゲートによる抗体は初回免疫注射の４週間後に高いアビディティを呈し、これは、１回目および２回目の追加免疫注射のそれぞれの後２週間、持続または増大することが分かる。

【0328】

（実施例１３）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝６）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例１から４のコンジュゲートで免疫化した。最後の追加免疫の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）を静脈注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、^３Ｈの脳／血漿比を上記した通りに決定した。

【0329】

結果は図３に示されており、ここから、試験コンジュゲートの血漿／脳比は対照動物のものよりも有意に大きく、試験コンジュゲートによって誘発された抗体がニコチンに対して特異的であり、血液中のニコチンを隔離し、脳へのニコチン取り込みを防止したことを示しているのが分かる。

【0330】

（実施例１４）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例１から４のコンジュゲートで免疫化した。２回目の追加免疫の２週間後、上記した通りの競合ＥＬＩＳＡによって、抗ニコチン抗体とニコチンとの相互作用が実証された。

【0331】

結果は図４に示されており、ここから、試験コンジュゲートによって誘発された抗体がニコチンを認識し、それと結合することが分かる。

【0332】

（実施例１５）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例１および２のコンジュゲートで免疫化した。２回目の追加免疫の２週間後、ニコチン、コチニン、アセチルコリンおよびバレニクリンに対する抗ニコチン抗体の特異性を、上記した通りの競合ＥＬＩＳＡによって決定した。

【0333】

結果は図５に示されており、ここから、添加されるニコチンの量が増加するにつれて、抗ニコチン抗体とニコチンコーティングＥＬＩＳＡプレートとの結合の用量依存的阻害があることが分かる。しかしながら、バレニクリン、コチニンまたはアセチルコリンではそのような効果は観察されず、試験コンジュゲートによって誘発された抗体がニコチンに対して特異的であり、コチニン、バレニクリンまたはアセチルコリンのいずれに対しても特異的でないことを示している。

【0334】

（実施例１６）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例５のコンジュゲートで免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）を、上記した通りのＥＬＩＳＡによって測定した。

【0335】

結果は図６、７、８および９に示されており、ここから、初回免疫注射の４週間後に試験コンジュゲートそれぞれについて非常に強い抗ニコチン抗体応答が取得され、その応答は、追加免疫の後２週間増大することが分かる。さらに、抗ニコチン抗体のレベルおよび抗ニコチン抗体のアビディティの両方は、使用されるスペーサーに応じて変動する。加えて、すべての試験コンジュゲートが、対照動物におけるものよりも高い血漿／脳比をもたらし、試験コンジュゲートによって誘発された抗体が、対照動物よりも高い程度まで、血液中のニコチンを隔離し、その脳への取り込みを防止することができるのを示している。

【0336】

（実施例１７）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例６および７のコンジュゲートで免疫化した。血漿中の抗ニコチン抗体レベル（全ＩｇＧ）をＥＬＩＳＡによって測定した。最後の追加免疫の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）を静脈注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた^３Ｈのレベルの％変化を上記した通りに決定した。

【0337】

結果は図１２（抗ニコチン抗体レベル）および１３（^３Ｈのレベルの％変化）に示されており、ここから、試験コンジュゲートそれぞれについて免疫応答が取得され、その応答は、用量依存的に増大することが分かる。これは、ＤＴおよびＣＲＭ_１９７の両方がニコチン誘導ハプテンの適切な担体であることを示す。加えて、すべての試験コンジュゲートが、対照動物よりも脳に入る^３Ｈ−ニコチンのレベルを低くし、試験コンジュゲートによって誘発された抗体が、対照動物よりも高い程度まで、血液中のニコチンを隔離し、その脳への取り込みを防止することができるのを示している。

【0338】

（実施例１８）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１２）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および５０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射（０、２８、４２日目）により、１０μｇの実施例６、７および８のコンジュゲートで免疫化した。血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。最後の追加免疫の２週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をｉｖ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた^３Ｈのレベルの％変化を上記した通りに決定した。

【0339】

結果は図１４（抗ニコチン抗体レベル）および１５（^３Ｈのレベルの％変化）に示されており、ここから、試験コンジュゲートそれぞれについて免疫応答が取得され、その応答は、ハプテンローディングにより増大することが分かる。加えて、すべての試験コンジュゲートが、対照動物よりも脳に入る^３Ｈ−ニコチンのレベルを低くし、試験コンジュゲートによって誘発された抗体が、対照動物よりも高い程度まで、血液中のニコチンを隔離し、その脳への取り込みを防止することができるのを示している。

【0340】

（実施例１９）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および１０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＩＭＸ；０．１から３．０ユニット）の存在下での筋肉内注射により、１０μｇの実施例７のコンジュゲートで免疫化した。血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡ（２１および２８日目）によって、アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。結果は図１６および１７に示されており、ここから、組合せアジュバントとしてのＣｐＧ２４５５５および水酸化アルミニウムの使用、または単独アジュバントとしてのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸによって、免疫応答（Ａｂレベルおよびアビディティ）が取得され、その応答は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ用量に伴って増大することが分かる。

【0341】

２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。結果は図１８に示されており、ここから、組合せアジュバントとしてのＣｐＧ２４５５５および水酸化アルミニウムまたは単独アジュバントとしてのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸの使用が、対照動物よりも脳に入る^３Ｈ−ニコチンのレベルを低くし、試験コンジュゲートによって誘発された抗体が、免疫化されていない対照動物よりも高い程度まで、血液中のニコチンを隔離し、その脳への取り込みを防止することができるのを示していることが分かる。

【0342】

（実施例２０）
以下の表６において記載されている試料は、次の通りに調製した。

【0343】

ａ）冷凍ＣＲＭ_１９７（５．９ｍｇ／ｍｌで２００ｍｌ）を、４℃で終夜解凍した。

【0344】

ｂ）解凍したら、１０ｋＤ分子量カットオフでクイックスタートポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用する限外濾過（ＵＦ）によって、ＣＲＭ_１９７を２００ｍｌから１００ｍｌに濃縮した。

【0345】

ｃ）５０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を使用して、濃ＣＲＭ_１９７をダイアフィルター（ＤＦ）８ＴＯＶｓ（回転体積）にかけた。ＳＡＲＴＯＰＯＲＥ ２ １５０滅菌カプセルフィルターを使用して、ＵＦ／ＤＦ後のＣＲＭ_１９７を濾過した。

【0346】

ｄ）０．９４２の消散係数を使用してＡ_２８０での吸光度を測定することにより、ＣＲＭ_１９７の濃度を決定した。濃度は９．６５ｍｇ／ｍｌであると決定された。

【0347】

ｆ）５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を使用して、ＵＦ／ＤＦ後のＣＲＭ_１９７を９．６５ｍｇ／ｍｌから７．１８ｍｇ／ｍｌに希釈した。

【0348】

ｇ）別個のベッセル内、６Ｍ ＨＣｌ溶液（７．４６ｍＬ）を、氷浴中で冷却しながら７４６０ｍｇの調製１２のハプテンにゆっくり添加した。次いで、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２緩衝液を添加し（２．００ｍＬ）、ｐＨ試験紙によってｐＨを確認した。ｐＨは約９であった。７．５のｐＨが達成されるまで、６Ｍ ＨＣｌを少量ずつ添加した（１．７０ｍＬのＨＣｌを添加した）。溶液の総体積は１８．６５ｍＬであり、調製１２のハプテンの４００ｍｇ／ｍＬの濃度をもたらした。

【0349】

ｈ）別個のベッセル内、７０００ｍｇのスルホ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ｓＮＨＳ）を、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２溶液（１４ｍＬ）に溶解し、７．１３のｐＨが達成されるまで、１９．２５ＭのＮａＯＨ溶液を少量ずつ添加した（１．４４ｍＬのＮａＯＨを添加した）。溶液の総体積は１８．５０ｍＬであり、ｓＮＨＳの３７８ｍｇ／ｍＬの濃度をもたらした。

【0350】

ｉ）別個のベッセル内、８０００ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を、５ｍＬの５０ｍＭ ＭＯＰＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に溶解した。溶液の総体積は１２．０ｍＬであり、ＥＤＣの６６６ｍｇ／ｍＬの濃度をもたらした。ＥＤＣ溶液は、最後、コンジュゲート反応物への添加直前に作製した。

【0351】

ｊ）ＵＦ／ＤＦ後のＣＲＭ_１９７、調製１２のハプテン、ｓＮＨＳおよびＥＤＣ溶液を、表６に収載されている２４の試料を生じるような手法で合わせた。２４の試料について、正確に算出された量の溶液を、下記のように一緒に混合した：ＵＦ／ＤＦ ＣＲＭ_１９７、調製１２のハプテンおよびｓＮＨＳを合わせ、混合物のｐＨを確認した。試料番号１０および１８について、１Ｎ ＮａＯＨを使用してｐＨをさらに調整し、ｐＨを約７．５にした。最後に、ＥＤＣを試料に添加した。各反応管を手早くボルテックスし、水浴中、１５℃で１８時間インキュベートした。

【0352】

ｋ）１８時間のインキュベーション後、３０ｋＤ分子量カットオフでアミコンウルトラ遠心濃縮器を使用して、試料を緩衝液交換した。使用した緩衝液は、２０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７．０であった。市販のマイクロＢＣＡキットを使用して、タンパク質濃度を決定した。

【0353】

ｌ）２００ｍｇ／ｍｌのスクロースを水に溶解し、２４のコンジュゲート試料のそれぞれに１：１（体積）比で添加した。その後、ＰＳ８０を添加して、０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。試料を、短期貯蔵では４℃、長期貯蔵では−２０℃で貯蔵した。

【0354】

【表7】

【0355】

試料１〜２４を検査するために利用される分析的方法論を以下で詳述する。

【0356】

ＳＥＬＤＩ−ＭＳ。表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）は、タンパク質混合物の分析に使用される質量分析におけるイオン化法である。アッセイでは、コンジュゲートプロセスを介して、ＣＲＭ_１９７骨格への正味質量ゲインを報告する。質量の変化は、骨格への付加物として報告される。理想的には、付加物は、ハプテン特異的エピトープ密度アッセイと一致するべきである。付加物＝（質量_{コンジュゲート}−質量_骨格）／質量_ハプテン。過剰のＥＤ値における付加物レベルは、ハプテン以外の質量が骨格に付加されていることを示すこと、および付加物が多い試料はＨＭＭＳも多いことに留意されたい。

【0357】

サイズ排除クロマトグラフィー。サイズ排除アッセイは、ＨＭＭＳ（高分子量種）、二量体、単量体およびＬＭＭＳ（低分子量種）を、これらの成分の相対存在度に影響を及ぼす処理パラメーターを理解するために分解するために開発された。該方法は、ＨＭＭＳピーク群、二量体、単量体およびＬＭＭＳピーク群について、相対面積パーセントを報告するものである。プロセス化学量論および出発材料間の比は、ＨＭＭＳ、二量体、単量体およびＬＭＭＳ間のピーク面積の見かけの分布に影響を及ぼしたことに留意されたい。

【0358】

エピトープ密度。酸加水分解試料調製に連動した逆相液体クロマトグラフィーアッセイは、ＣＲＭ_１９７担体タンパク質とコンジュゲートされたハプテンの量を決定するために開発された。ハプテン分子は、アミド結合を経由してＣＲＭ_１９７骨格とコンジュゲートされ、標準的な加水分解化学により、この結合を加水分解して、ハプテンを置換基アミノ酸とともに放出する。コンジュゲートされたハプテン７の量は、プロセスの一貫性、製品品質および効能の尺度である。

【0359】

試料１〜２４の特性付けの結果を表７に示す。このデータは、効能とＣＲＭ_１９７に連動したハプテンエピトープ密度との間の強固な関係を示している。加えて、該データは、最適なエピトープ密度値が、高単量体、低ＨＭＭＳおよび低付加物と相関することを示している。

【0360】

【表8-1】

【0361】

【表8-2】

【0362】

（実施例２１）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および１０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射により、１０μｇの試料１〜２４（実施例２０、表６および７を参照されたい）で免疫化した。血漿中の抗ニコチンＩｇＧ ＡｂレベルをＥＬＩＳＡ（２１および２８日目）によって、アビディティを阻害ＥＬＩＳＡによって測定した。結果は図１９および２０に示されており、ここから、試験コンジュゲートそれぞれについて免疫応答が取得され、その応答は、％単量体に伴って増大し、単位担体当たり１０から１８個のハプテンの間のハプテンローディングで最適となることが分かる。

【0363】

２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。結果は図２１および２２に示されており、ここから、すべての試験コンジュゲートが、免疫化されていない対照動物よりも脳に入る^３Ｈ−ニコチンのレベルを低くし、試験コンジュゲートによって誘発された抗体が、対照動物よりも高い程度まで、血液中のニコチンを隔離し、その脳への取り込みを防止することができること、効能が％単量体に伴って増大し（図２１）、単位担体当たり１０から１８個のハプテンの間のハプテンローディングで最適となる（図２２）ことを示しているのが分かる。

【0364】

（実施例２２）
試料１〜２４（実施例２０、表６および７を参照されたい）を、アルヒドロゲルとの結合について試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりｎ＝１０）を、水酸化アルミニウム（ミョウバン；アルヒドロゲル−８５：４０μｇのＡｌ^３＋）および１０μｇのＣｐＧ２４５５５の存在下での筋肉内注射により、１０μｇのこれらの異なるコンジュゲートでも免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、^３Ｈ−ニコチン（３μＣｉ ^３Ｈ−ｎｉｃを含有する０．０５ｍｇ／ｋｇのニコチン）をＩＶ注射によって投与し、血液を収集し、動物を灌流し、脳を切除し、^３Ｈのレベルを定量化し、対照動物と比べた血液および脳中における^３Ｈ−ニコチンの％変化を決定した。結果は図２３に示され、ここから、より高い％単量体含有量を持つコンジュゲートは、アルヒドロゲルとのより高い％結合を有し、これは、脳中の^３Ｈ−ニコチンの量のより大きな低減によって実証される通り、より大きな効能と相関することが分かる。

【配列表フリーテキスト】

【0365】

配列番号１は、免疫刺激オリゴヌクレオチドＯＤＮ ＣｐＧ２４５５５のヌクレオチド配列である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]