特許 5726166 アオウキクサを用いたＫＯＤＡの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726166

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年5月27日

(54)【発明の名称】アオウキクサを用いたＫＯＤＡの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/42 20060101AFI20150507BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150507BHJP

   A01H 5/00 20060101ALN20150507BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/42ZNA

   !C12N15/00 A

   !A01H5/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2012-504548(P2012-504548)

(86)(22)【出願日】2011年3月11日

(86)【国際出願番号】JP2011055842

(87)【国際公開番号】WO2011111841

(87)【国際公開日】20110915

【審査請求日】2013年3月7日

(31)【優先権主張番号】特願2010-55166(P2010-55166)

(32)【優先日】2010年3月11日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001959

【氏名又は名称】株式会社 資生堂

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100166165

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 英直

(72)【発明者】

【氏名】横山 峰幸

(72)【発明者】

【氏名】別府 敏夫

【審査官】 一宮 里枝

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０９−２９５９０８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−３２４６０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−０２９４１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１１１８３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 YOKOYAMA M et al.，Plant Cell Physiol.，２０００年，vol. 41，p. 110-113

【文献】 TAKAGI K et al.，Plant Cell Physiol.，２０１０年 ３月１２日，vol. 51, suppl. (web only)，p. 172 (Abstract P1B043(549))，ＵＲＬ，http://www.jspp.org/

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ａ０１Ｈ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式：

【化1】

で表される化合物を生産する方法であって、下記（ａ）〜（ｂ）からなる群から選ばれるＤＮＡによりコードされるタンパク質及び／又は（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群から選ばれるＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現することを特徴とするアオウキクサ株にストレスを加え、当該ストレスを加えたアオウキクサ株から上記化合物を溶媒抽出し、そして精製することを含む、前記方法。
(ａ) 配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
(ｂ) 配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質コードするＤＮＡ；
（ｉ） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｉｉ） 配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％の同一性を有し、かつアレンオキサイドシンターゼ活性体をコードするＤＮＡ；
(ｉｉｉ) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質コードするＤＮＡ；
(ｉｖ) 配列番号４で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアレンオキサイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項2】

前記アオウキクサ株が、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるリポキシゲナーゼ及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡによりコードされるアレンオキサイドシンターゼを発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ストレスが、乾燥ストレス、熱ストレス、及び浸透圧ストレスからなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記溶媒が、クロロホルム、酢酸エチル、エーテル、及びブタノールからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、以下の式(Ｉ)：

【化1】

で表される構造を有する植物ホルモン(一般名：９-ヒドロキシ-１０-オキソ-cis-１２(Ｚ),１５(Ｚ)-オクタデカジエン酸、以下ＫＯＤＡと呼ぶ)の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＫＯＤＡは、植物花芽形成促進作用、植物賦活作用、及びそれらを包含する植物成長調整作用を有する植物ホルモンとして知られている(特開平９-２９５９０８号公報、特開平１１-２９４１０号公報、特開２００１-１３１００６号公報、特開２００９-１７８２９号公報)。ＫＯＤＡはさまざまな植物種において存在することが知られているが、ストレスを受けたアオウキクサ(Lemna paucicostata)が他の植物より極めて高いレベル(数百倍)のＫＯＤＡを放出することが知られている。この性質を利用してＫＯＤＡは、ウキクサ科植物の一種であるアオウキクサから抽出して得る抽出法を用いて製造することができる。他の製造方法として、不飽和脂肪酸であるα-リノレン酸(一般名：ｃｉｓ-９,１２,１５-オクタデカトリエン酸)に９位生成物特異性リポキシゲナーゼ(ＬＯＸ)、アレンオキサイドシンターゼ(ＡＯＳ)といった酵素を、植物体内における脂肪酸代謝経路に準じて作用させることにより得る酵素法、及び通常公知の化学合成法を駆使することにより得る化学合成法を用いてＫＯＤＡを製造することもできる。これらの製造方法は特開平１１-２９４１０号公報に開示されている。

【0003】

ＫＯＤＡは植物成長調整作用を有する植物ホルモンであることから、農業分野における使用が期待されている。農業分野で使用する場合、医薬品などの分野とは異なり、低コストで大量に生産することができなければ、実用に耐えることができない。

【0004】

α-リノレン酸を開始物質として使用する酵素法においては、以下に記載されるようにα-リノレン酸を基質として、９位生成物特異性リポキシゲナーゼ(ＬＯＸ)を作用させて、９位にヒドロペルオキシ基(-ＯＯＨ)を導入し、次にアレンオキサイドシンターゼ(ＡＯＳ)を作用させることによりＫＯＤＡを製造することができる。

【化2】

しかしながら、９位生成物特異性リポキシゲナーゼは商業的に入手できず、植物から抽出するにも材料の入手や処理に大変手間がかかり、またこれまでに知られている９位生成物特異性リポキシゲナーゼでは活性が低かった。さらに、現在までに得られている９位生成物特異性リポキシゲナーゼのｃＤＮＡを大腸菌で発現すると、多くが不溶性となり、活性を示すタンパク質を多量に得ることが困難であった。

【0005】

アレンオキサイドシンターゼは、ヒドロペルオキシ化した脂肪酸をアレンオキサイドに変換する活性を有する酵素であり、アレンオキサイドは不安定なため非酵素的にケトール体に変換される。ＡＯＳは、植物、動物及び酵母において存在し、植物であれば被子植物全般において存在している酵素である。しかしながら、アレンオキサイドシンターゼは、一般に自殺基質的な性質を有し、基質の濃度を上げた場合に、却って生成量の減少をもたらすことになる。これらのリポキシゲナーゼ、アレンオキサイドシンターゼの欠点のため、酵素法は大量生産には不向きなものであった。一方、化学合成法では、農業分野において望まれる低コストを実現することが困難であった。

【0006】

一方、従来の抽出法においては、高効率で花芽誘導物質を生産することが知られているアオウキクサ４４１株を培養して抽出法が行われていたが、かかる株を使用した場合であっても、生産されるＫＯＤＡの量は十分とは言えなかった。そこで、低コストかつ大量にＫＯＤＡを製造する方法を提供することが望まれていた。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、収量の点で改良されたＫＯＤＡの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らが、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、様々なアオウキクサ株をスクリーニングした結果、他のアオウキクサ株に比べて、アオウキクサＳＨ株が極めて高いレベルのＫＯＤＡを生産することを発見した。

【発明の効果】

【0009】

上記の発見に基づき、本発明者らは、抽出法に基づくＫＯＤＡの製造方法においてアオウキクサＳＨ株を出発物質として用いることにより、高い収量でＫＯＤＡを製造する方法を提供する。

【0010】

さらに本発明者らは、ＫＯＤＡ高生産株であるアオウキクサＳＨ株の代謝経路に着目し、アオウキクサにおいて９位生成物特異性リポキシゲナーゼの遺伝子配列(配列番号１)、並びにアレンオキサイドシンターゼの遺伝子配列(配列番号２)を初めて同定した。当該配列番号１及び配列番号２の塩基配列は共にアオウキクサＳＨ株由来の配列である。

【0011】

したがって本発明者らは、抽出法に基づくＫＯＤＡの製造方法において、配列番号１及び／又は配列番号２で表される配列からなるＤＮＡ、又は当該ＤＮＡと実質的に同一なＤＮＡからなる遺伝子を含むアオウキクサ株を用いることにより、高い収量でＫＯＤＡを製造する方法を提供する。

【0012】

本発明は、さらに上に記載されたＫＯＤＡ高生産アオウキクサ株を用いた製造方法より生産されたＫＯＤＡも提供する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、６２種のアオウキクサ株におけるＫＯＤＡ生産量を示す図である。

【図2A】図２Ａは、アオウキクサＳＨ株のＬＯＸ遺伝子の遺伝子配列を示す図である。

【図2B】図２Ｂは、図２Ａの遺伝子配列の続きを示す図である。

【図2C】図２Ｃは、図２Ｂの遺伝子配列の続きを示す図である。

【図3A】図３Ａは、アオウキクサＳＨ株のＡＯＳ遺伝子の遺伝子配列を示す図である。

【図3B】図３Ｂは、図３Ａの遺伝子配列の続きを示す図である。

【図3C】図３Ｃは、図３Ｂの遺伝子配列の続きを示す図である。

【図4】図４は、大腸菌において発現されたイネＬＯＸ(ｒ９-ＬＯＸ)とアオウキクサＳＨ株のＬＯＸの活性を比較して示す図である。

【図5】図５は、大腸菌において発現されたシロイヌナズナＡＯＳとアオウキクサＳＨ株のＡＯＳの活性を比較して示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明のＫＯＤＡを生産する方法は、ＫＯＤＡ高生産性の特定のアオウキクサ株にストレスを加え、当該ストレスを受けたアオウキクサ株からＫＯＤＡを溶媒抽出し、そして精製することを含んでなる。

【0015】

本発明のある態様では、本発明において使用されるＫＯＤＡ高生産性の特定のアオウキクサ株は、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと同一又は実質的に同一なＤＮＡ及び／又は配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと同一又は実質的に同一なＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現する株である。さらには、本発明において使用されるＫＯＤＡ高生産性の特定のアオウキクサ株は、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は実質的に同一なタンパク質、及び／又は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同一又は実質的に同一なタンパク質を発現する株である。配列番号３は、アオウキクサＳＨ株由来の９位生成物特異性リポキシゲナーゼのアミノ酸配列であり、配列番号４は、アオウキクサＳＨ株由来のアレンオキサイドシンターゼのアミノ酸配列である。

【0016】

ＫＯＤＡは、植物中でリノレン酸からＬＯＸ及びＡＯＳの作用を受けて生成されるので、ＫＯＤＡ高生産性のアオウキクサＳＨ株が有するＬＯＸ及び／又はＡＯＳと同一又は実質的に同一なＬＯＸ及び／又はＡＯＳを発現する株は、アオウキクサＳＨ株と同様にＫＯＤＡの生産性が高いと考えられる。ここで、「実質的に同一なＤＮＡ」とは、参照元のＤＮＡに対して、少なくとも７０％の同一性を有し、かつ転写・翻訳された場合に、参照元のＤＮＡが転写・翻訳されて生成するタンパク質の酵素活性(配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの場合ＬＯＸ活性、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡの場合ＡＯＳ活性)と同一の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを指す。同一性は、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％、又は少なくとも９９.９％である。

【0017】

また、「実質的に同一なＤＮＡ」は、高ストリンジェント条件下で参照元のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡにハイブリダイゼーションすることができ、参照元のＤＮＡがコードするタンパク質の酵素活性(配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの場合ＬＯＸ活性、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡの場合ＡＯＳ活性)と同一の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを指す。ハイブリダイゼーションは周知の方法又はそれに準じる方法、例えばJ.Sambrookら、Molecular Cloning 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法に従って行うことができ、そして高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えばＮａＣｌ濃度が約１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃であることを含む条件をいう。更に、本発明は上記ＤＮＡ配列の断片であって、元のＤＮＡがコードするタンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片にも関する。

【0018】

「実質的に同一なタンパク質」とは、参照元のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ参照元のタンパク質の活性を有するタンパク質をいう。さらに、「実質的に同一なタンパク質とは、参照元のアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性を有する配列からなり、かつ参照元のタンパク質の活性を有するタンパク質をいう。同一性は、好ましくは、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％、又は少なくとも９９.９％である。

【0019】

本発明のＫＯＤＡの製造方法は、抽出法を利用する。具体的には、アオウキクサの破砕物を遠心分離(８０００×ｇ、１０分間程度)にかけ、得られた上清と沈澱物のうち、上清を除いたものがＫＯＤＡを含む画分として次の工程に用いられる。かかる画分を出発物としてＫＯＤＡを単離・精製することが可能である。アオウキクサによるＫＯＤＡの生産を促進するため、遠心分離にかける前にアオウキクサに以下に説明する特定のストレスを与えることが好ましい。

【0020】

そして、さらに調製効率の上で好ましい出発物として、アオウキクサを浮かばせた又は浸漬した後の水溶液を挙げることができる。この水溶液は、アオウキクサが生育可能なものである限りにおいて特に限定されない。この水溶液の具体例は、後述する実施例において記載する。

【0021】

浸漬時間は、室温で２〜３時間程度でも可能であるが、特に限定されるべきものではない。また、この方法でＫＯＤＡを調製する場合にも、あらかじめアオウキクサにＫＯＤＡを誘導することができる特定のストレスを与えることが製造効率上好ましい。

【0022】

具体的には、特定のストレスとして乾燥ストレス、熱ストレス、浸透圧ストレス等を挙げることができる。乾燥ストレスは、例えば低湿度(好ましくは相対湿度で５０％以下)で室温下、好ましくは２４〜２５℃程度で、アオウキクサを乾燥したフィルター紙上に広げた状態で放置することによって与えることができる。この場合の乾燥時間は、概ね２０秒以上、好ましくは５分以上、より好ましくは１５分以上である。

【0023】

熱ストレスは、例えば温水中にアオウキクサを浸漬することによって与えることができる。この場合の温水の温度は、４０℃〜６５℃であり、好ましくは４５℃〜６０℃、より好ましくは５０℃〜５５℃である。また、温水に処理する時間は、概ね５分程度で足るが、比較的低温の場合、例えば４０℃程度の温水中でアオウキクサを処理する場合は、２時間以上処理することが好ましい。また、上記熱ストレス処理後は、速やかにアオウキクサを冷水中に戻すことが好ましい。

【0024】

浸透圧ストレスは、例えば高濃度の糖溶液等の高浸透圧溶液にアオウキクサを接触させることにより与えることができる。この場合の糖濃度は、例えばマンニトール溶液であれば０.３Ｍ以上、好ましくは０.５Ｍ以上であることが好ましい。処理時間は、例えば０.５Ｍマンニトール溶液を用いる場合は１分以上、好ましくは３分以上である。このようにして、所望する本発明のＫＯＤＡを含む出発物を調製することができる。

【0025】

次に、上記のように調製した出発物に以下のような分離・精製手段を施して、所望するＫＯＤＡを製造することができる。なお、ここに示す分離手段は例示であり、これらの分離手段に上記出発物からＫＯＤＡを製造するための分離手段が限定されるものではない。

【0026】

まず、上記出発物に対して溶媒抽出を行い、本発明ＫＯＤＡを含有する成分を抽出することが好ましい。かかる溶媒抽出に用いる溶媒は特に限定されるものではなく、例えばクロロホルム、酢酸エチル、エーテル、ブタノール等を用いることができる。これらの溶媒の中でもクロロホルムは、比較的容易に不純物を除去することが可能であるという点において好ましい。

【0027】

この溶媒抽出で得られた油相画分を、通常公知の方法を用いて洗浄・濃縮し、ＯＤＳ(オクタデシルシラン)カラム等の逆相分配カラムクロマトグラフィー用カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)にかけて、花芽誘導活性画分を同定・単離することにより本発明ＫＯＤＡを単離することができる。なお、出発物の性質等に応じて通常公知の他の分離手段、例えば限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせて用いることも可能である。

【実施例】

【0028】

実施例１：ＫＯＤＡ高生産アオウキクサ株のスクリーニング
様々な場所から採取された６２種類のアオウキクサを準備し、１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地中において、２４〜２５℃の昼光色蛍光ライトからの連続的な光照射の下で継代培養した。１／２倍に稀釈したＨｕｔｎｅｒの培地は、次の成分：
スクロース １０ｇ／ｌ
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２００ｍｇ／ｌ
ＮＨ₄ＮＯ₃ １００ｍｇ／ｌ
ＥＤＴＡ遊離酸 ２５０ｍｇ／ｌ
Ｃａ(ＮＯ₃)・４Ｈ₂Ｏ １７６ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ２５０ｍｇ／ｌ
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １２.４ｍｇ／ｌ
ＭｎＣｌ₂・４Ｈ₂Ｏ ８.９２ｍｇ／ｌ
ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ３２.８ｍｇ／ｌ
Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ １２.６ｍｇ／ｌ
Ｈ₃ＢＯ₃ ７.１ｍｇ／ｌ
Ｃｏ(ＮＯ₃)・６Ｈ₂Ｏ ０.１ｍｇ／ｌ
ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ １.９７ｍｇ／ｌ
を含み、ＫＯＨ（５０％）を用いてｐＨ６．２〜６．５に調整した。

【0029】

増殖したアオウキクサをろ紙上に広げ、２時間放置した後、水中に１時間浸漬した。その水を高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ；カラム:TYPE UG120 5μm SIZE 4.6mm I.D×250mm；ガードフィルター:INERTSTL 4.6mm×50mm；溶離液:50%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸；条件:吸光度の波長210λ(nm)、流速1.mL/min、カラム温度40℃)を用いてＫＯＤＡの濃度を分析した。全てのアオウキクサ株のＫＯＤＡ生産量の平均は４.９７μＭであった。その中で、アオウキクサＳＨ株は６０.２μＭのＫＯＤＡを生産しており、全株の平均ＫＯＤＡ生産量の約１２倍も多く、極めて高い生産量を与えた(図１)。

【0030】

実施例２：アオウキクサＳＨ株由来リポキシゲナーゼのクローニングとその活性測定
アオウキクサ(SH株)からRNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて全ＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡ１.８μｇを鋳型としてLongRange 2Step RT-PCR Kit(QIAGEN)によりｃＤＮＡを合成した。
その後、ｃＤＮＡを鋳型とし、下記縮重プライマー(ＬｐＤＰｆ、ＬｐＤＰｒ)を用いて縮重ＰＣＲ(ＰＣＲ条件：初期変性９４℃３分；９４℃０.５分、４７℃０.５分,７２℃１.３分のサイクルを３９回)を行い、目的とする９-リポキシゲナーゼの部分配列を得た。
ＬｐＤＰｆ: 5'-GCITGGMGIACIGAYGARGARTTY-3' (配列番号５)
ＬｐＤＰｒ: 5'-GCRTAIGGRTAYTGICCRAARTT-3' (配列番号６)
ここで、Ｉはイノシンを表す。
当該部分配列の塩基配列の決定を行い、得られた配列情報を元にＢＬＡＳＴ検索を行った結果、得られた配列は複数の既知植物由来のＬＯＸに対して高い相同性を示した（Corylus avellana（セイヨウハシバミ）75%、Actinidia deliciosa（キウイフルーツ）74%、Solanum tuberosum（ジャガイモ）75%、Oryza sativa（イネ）76%、Nicotiana tabacum（タバコ）74%、Cucumis sativus（キュウリ）75%、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）73%など）。

【0031】

この配列情報をもとに、以下の３'または５'ＲＡＣＥ法(Rapid Amplification of cDNA end)用のプライマーを作成し、３'ＲＡＣＥ、５'ＲＡＣＥ法により全長配列を決定した（図２）。
SH-3'-TP: 5'-AGCTCTTCATCTTGGACC-3' (配列番号７)
SH-5'-TP: 5'-TTTCATCCTTCTTGTCGC-3' (配列番号８)

【0032】

得られたＳＨＬｐＬＯＳＸの配列を、タンパク質発現用ベクター(ｐＥＴ２３ｄ, Novagen)に導入し、大腸菌(ＢＬ２１(ＤＥ３),Novagen)に形質転換し、ＳＨＬｐＬＯＸタンパク質を発現させた。このＳＨＬｐＬＯＸタンパク質を用いてＫＯＤＡ製造における活性試験を行った。

【0033】

ＫＯＤＡ製造における活性試験は、５ｍＭリノレン酸溶液(０.１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液に溶解；２５μｌ)、０.２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７、１０μｌ)、蒸留水(５μｌ)を加えた水溶液中に、酵素液(１０μｌ)を加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後に反応液をＨＰＬＣに供し、生成するリノレン酸ヒドロペルオキシドの部位特異性および生成量を測定した。ＨＰＬＣ分析は、カラム：カプセルパックＣ-１８ ＵＧ１２０(４.６×２５０ｍｍ、資生堂)、カラム温度４０℃、移動相：５０％アセトニトリル溶液(０.０２％ＴＦＡ)、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍで行った。この場合において、９位特異的な対照酵素として、イネ胚芽由来の９位特異的なリポキシゲナーゼであるｒ９-ＬＯＸ１を用いた。アオウキクサＳＨ株から得られた新規ＬＯＸが、既知の９位生成物特異性リポキシゲナーゼの中でも活性が強いとされていたｒ９-ＬＯＸ１よりはるかに活性の高い９位生成物特異性リポキシゲナーゼであることが明らかとなった(図４)。

【0034】

これらアオウキクサ由来の新規ＬＯＸの中で、リノレン酸−９−ヒドロペルオキシド体の生成量が最も高かったＳＨＬｐＬＯＸのカイネティクス解析を行った。４０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０の反応液を用い、反応温度は２５℃で行った。基質であるα−リノレン酸は、１０〜１００μＭの基質濃度で試験した。反応液１００μＬをキュベットに加え、ＳｍａｒｔＳｐｅｃ Ｐｌｕｓスペクトロフォトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、２３４ｎｍの吸光度を、１５秒のインターバルで経時的に１０分間スキャニングした。測定したＡ₂₃₄から反応産物の量を算出した（ｅ＝２５，０００）。カイネティックパラメーターはＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット（［Ｓ］／ｖ ｖｅｒｓｕｓ［Ｓ］プロット）を用いて決定した。この結果、表１に示すように、ＳＨＬｐＬＯＸでは、基質との親和性パラメーターであるＫ_m値がｒ９−ＬＯＸ１より低く、ＳＨＬｐＬＯＸが基質であるα−リノレン酸との親和性が高いことを示している。また、最大反応速度Ｖ_maxはｒ９−ＬＯＸ１とＳＨＬｐＬＯＸは、ほぼ同程度ではあるが、単位時間当たりの反応回数であるｋ_cat値はＳＨＬｐＬＯＸのほうがｒ９−ＬＯＸ１と比較して高かった。酵素活性の指標となるｋ_cat／Ｋ_m値は、ＳＨＬｐＬＯＸがｒ９−ＬＯＸ１の約１．６倍となった。このことから、アオウキクサＳＨ株由来の新規９−ＬＯＸが非常に高活性の９−ＬＯＸであることが明らかとなった。

【表1】

【0035】

実施例３：アオウキクサＳＨ株からＡＯＳ遺伝子のクローニングと活性測定
アオウキクサＳＨ株(Lemna paucicostata, SH)からＲＮＡを抽出し、ＲＴ-ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、以下に示すシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来プライマーを使用し、ＰＣＲのアニーリング温度を４５℃と低めに設定し、ＳＨ株由来アレンオキサイドシンターゼ(ＳＨＬｐＡＯＳ)の一部配列情報を得た。
AOS-Forward 5'-GGAACTAACCGGAGGCTACCG-3' (配列番号９)
AOS-Reverse 5'-CCGTCTCCGGTCCATTCGACCACAA-3' (配列番号１０)

【0036】

この配列情報をもとに、３'または５'ＲＡＣＥ法(Rapid Amplification of cDNA end)により全長配列を決定した。この結果、ＳＨ株より１配列の新規ＡＯＳホモログ(核酸配列１４４３ｂｐ、アミノ酸配列４８０ａａ、推定分子量５３.３ＫＤａ)が得られた(図３)。

【0037】

得られたＳＨＬｐＡＯＳの配列を、タンパク質発現用ベクター(ｐＥＴ４１ａ, Novagen)に導入し、大腸菌(ＢＬ２１(ＤＥ３),Novagen)に形質転換し、ＳＨＬｐＡＯＳタンパク質を発現させた。このＳＨＬｐＡＯＳタンパク質を用いてＫＯＤＡ製造における活性試験を行った。

【0038】

ＫＯＤＡ製造における活性試験は、５ｍＭリノレン酸溶液(０.１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液に溶解)を作成し、ｐＨ７の条件下で、イネの胚芽より抽出したリポキシゲナーゼと室温で１０分間反応させ、９-ヒドロペルオキシリノレン酸(９-ＨＰＯＴ)反応溶液を合成した。この９-ＨＰＯＴ反応溶液２０μｌに対し、ＳＨＬｐＡＯＳタンパク質またはシロイヌナズナ(A. thaliana)由来ＡＯＳ(ＡｔＡＯＳ)タンパク質０.３２ｎｇを加え、室温で１０分間反応させた。反応後、５０度で３分間の加熱処理により反応を終了させた。この溶液１０μｌをＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析は、カラム：カプセルパックＣ-１８ ＵＧ１２０(４.６×２５０ｍｍ)、移動相：５０％アセトニトリル溶液(０.０２％ＴＦＡ)、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２１０ｎｍで行った。
その結果、ＳＨＬｐＡＯＳタンパク質はＡｔＡＯＳタンパク質より７倍近く活性が強かった(図５)。

【0039】

アオウキクサＳＨ株より得られたＳＨＬｐＡＯＳのカイネティクス解析を行った。４０ｍＭＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）、１％ＥｔＯＨの反応液を用い、反応温度は２５℃で行った。基質である９−ＨＰＯＴは５−５３μＭの基質濃度で試験した。ｎあお、基質となる９−ＨＯＰＴはＥｔＯＨ溶液として添加し、ＥｔＯＨ終濃度が１％となるように調製した。反応液１００μＬをキュベットに加えＳｍａｒｔＳｐｅｃ Ｐｌｕｓ スペクトロフォトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、２３４ｎｍの吸光度の減少を、２秒のインターバルで経時的に１分間スキャニングした。測定したＡ₂₃₄から反応産物の量を算出した（ｅ＝２５，０００）。カイネティックパラメーターは、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロット（［Ｓ］／ｖ ｖｅｒｓｕｓ ［Ｓ］プロット）を用いて決定した。この結果、表２に示すようにＳＨＬｐＡＯＳでは、Ｋ_m値がＡｔＡＯＳより大幅に低く、９−ＨＰＯＴとの親和性は約５倍高かった。また、Ｖ_maxはＡｔＡＯＳの約２．８倍と非常に高かった。ｋ_cat値もＳＨＬｐＡＯＳのほうがＡｔＡＯＳの約２．８倍と高いものであり、反応回転が非常に効率的に起こっている。ｋ_cat／Ｋ_m値は、ＳＨＬｐＡＯＳがＡｔＡＯＳの約１４倍となった。ＳＨＬｐＡＯＳがＡｔＡＯＳと比較して、実用的なＫＯＤＡ製造において非常に有用なＡＯＳであると考えられる。以上のことから、アオウキクサＳＨ株からクローニングしたＳＨＬｐＡＯＳは、これまでに報告のない、非常に高い活性を有するＡＯＳであることが明らかとなった。

【表2】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]