特許 5726321 オキサゾロ［５，４−Ｂ］ピリジン−５−イル化合物および癌治療へのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726321

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年5月27日

(54)【発明の名称】オキサゾロ［５，４−Ｂ］ピリジン−５−イル化合物および癌治療へのその使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 498/04 20060101AFI20150507BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150507BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20150507BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20150507BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150507BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20150507BHJP

【ＦＩ】

   C07D498/04 105

   C07D498/04CSP

   A61P35/00

   A61P13/12

   A61P15/08

   A61K45/00

   A61K31/437

【請求項の数】17

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2013-542030(P2013-542030)

(86)(22)【出願日】2011年11月17日

(65)【公表番号】特表2013-544835(P2013-544835A)

(43)【公表日】2013年12月19日

(86)【国際出願番号】US2011061099

(87)【国際公開番号】WO2012074761

(87)【国際公開日】20120607

【審査請求日】2014年5月19日

(31)【優先権主張番号】10382329.0

(32)【優先日】2010年12月3日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】61/439,151

(32)【優先日】2011年2月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100068526

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭生

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100138900

【弁理士】

【氏名又は名称】新田 昌宏

(74)【代理人】

【識別番号】100162684

【弁理士】

【氏名又は名称】呉 英燦

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・アンドリュー・コーツ

(72)【発明者】

【氏名】レイモンド・ギルモア

(72)【発明者】

【氏名】ホセ・アルフレード・マルティン

(72)【発明者】

【氏名】エヴァ・マリア・マルティン・デ・ラ・ナヴァ

【審査官】 堀 洋樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０１７８２２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００４／０１４９００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０１６３９２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００５／０７５４７８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式の化合物：

【化1】

（式中、
Ｘは、メトキシエチル又はエトキシメチルであり、
Ｑは、シクロプロピル、２−メチル−プロパノール−２−イル、３−メチルオキセタン−３−イル、または１−ヒドロキシメチル−１−シクロプロピルである）
又はその薬学的に許容し得る塩。

【請求項2】

２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールである請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。

【請求項3】

１５．０６におけるピーク、並びに１９．９４、１０．３１及び２０．７８（２θ＋／−０．２°）における１以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０６０Å）を特徴とする結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールである、請求項１又は請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

１３．７３におけるピーク、並びに１６．５４、２２．８７及び１８．５７（２θ＋／−０．２°）における１以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０６０Å）を特徴とする結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールである、請求項１又は請求項２に記載の化合物。

【請求項5】

５−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。

【請求項6】

５−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。

【請求項7】

［１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロピル］メタノールである、請求項１に記載の化合物、又はその薬学的に許容し得る塩。

【請求項8】

１以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又は塩を含む医薬組成物。

【請求項9】

１以上の治療剤を更に含む、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

治療において使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又は塩。

【請求項11】

癌の治療において使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又は塩。

【請求項12】

前記癌が、卵巣癌である、請求項１１に記載の使用のための化合物又は塩。

【請求項13】

前記癌が、多発性骨髄腫である、請求項１１に記載の使用のための化合物又は塩。

【請求項14】

癌の治療においてスニチニブと同時に、別々に、又は順次組合せて使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物又は塩。

【請求項15】

前記癌が、腎臓癌である、請求項１４に記載の使用のための化合物又は塩。

【請求項16】

卵巣癌を治療するための医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩の使用。

【請求項17】

多発性骨髄腫を治療するための医薬の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はオキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル化合物に関する。

【背景技術】

【0002】

ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、セリン／トレオニンキナーゼスーパーファミリーに属するマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼである。このキナーゼは、熱、紫外線及び浸透圧ストレス等の細胞外ストレスに加えて、リポ多糖類等の炎症性刺激によって活性化される。活性化されると、ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、炎症促進性のサイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）及びインターロイキン８（ＩＬ−８）の生合成を制御する細胞内タンパク質基質をリン酸化する。これらサイトカインは、多くの慢性炎症性障害の病理に関与している。慢性炎症は、癌の発現に重要な危険因子である。例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は、慢性炎症を生じさせ且つ肉腫を発現させるカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）の標的である。更に、ＩＬ−８等のｐ３８ＭＡＰキナーゼによって制御されるサイトカインは、腫瘍増殖に関連する血管新生の駆動に関与している。また、リン酸化型のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ−タンパク質キナーゼ２（又はｐＭＡＰＫＡＰＫ２）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路におけるキナーゼであり、ｐ３８ＭＡＰキナーゼによって直接活性化され得る。ＭＡＰＫＡＰＫ２に関するマウスノックアウト研究は、サイトカイン産生の減少を示し、これは、ＭＡＰＫＡＰＫ２が炎症応答の鍵となる制御因子である可能性があり、また抗炎症及び／又は癌治療の潜在的な標的となり得ることを示唆する（特許文献１）。

【0003】

抗炎症性疾患を治療するためのアザベンゾチアゾリルｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、特許文献２）が、当技術分野において開示されている。更に、癌を治療するためのアザベンズイミダゾリルｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、特許文献３）が、当技術分野において開示されている。更に、特許文献４には、ＰＩ３キナーゼの阻害剤として有用なイミダゾリルオキサゾール及びオキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−６−イルが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】国際公開第２００５１２０５０９号

【特許文献2】国際公開第２００７０１６３９２号

【特許文献3】国際公開第２００５０７５４７８号

【特許文献4】国際公開第２００９１７８２２号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかし、特定のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤又はサイトカイン阻害剤は、そのインビボにおける効果及び治療への使用を制限する生物学的利用能及び吸収性の問題を有する場合がある。更に、特定のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、患者にとって有害な毒性作用（特に、胃腸毒性）を示し、また、患者の薬物−薬物相互作用のリスクを有する場合がある。したがって、別のサイトカイン抑制薬が必要とされている。このような化合物は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼを阻害することができ、改善された効力及びより高い生物学的利用能を有することが好ましい。また、このような化合物は、改善された毒性プロファイル（特に、胃腸毒性）を有し、患者の薬物−薬物相互作用のリスクを低減することが好ましい。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、癌、特に卵巣癌及び／又は多発性骨髄腫を治療するための単剤としての臨床用途を有し得る新規オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル化合物を提供する。更に、本発明は、癌、特に腎臓癌を治療するための、スニチニブ等の別の治療剤と組み合わせて臨床用途を有し得る新規オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル化合物を提供する。更に、本発明の化合物は、強力なｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（癌細胞におけるｐ３８α、ｐ３８β及びｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル伝達）であり、且つ特定の既知のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤に比べて、改善された毒性プロファイル（特に、ＧＩ毒性）を有し、患者の薬物−薬物相互作用のリスクを低減することができる。

【0007】

本発明は、式Ｉの化合物：

【化1】

（式中、
Ｘは、メトキシエチル又はエトキシメチルであり、
Ｑは、シクロプロピル、２−メチル−プロパノール−２−イル、３−メチルオキセタン−３−イル、１−ヒドロキシメチル−１−シクロプロピルである）
又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。

【0008】

また、本発明は、１５．０６におけるピーク、並びに１９．９４、１０．３１及び２０．７８（２θ＋／−０．２°）における１以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０６０Å）を特徴とする結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールを提供する。

【0009】

また、本発明は、１３．７３におけるピーク、並びに１６．５４、２２．８７及び１８．５７（２θ＋／−０．２°）における１以上のピークを含むＸ線粉末回折パターン（Ｃｕ放射、λ＝１．５４０６０Å）を特徴とする結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールを提供する。

【0010】

本発明は、２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。

【0011】

本発明は、５−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。

【0012】

本発明は、５−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。

【0013】

本発明は、［１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロピル］メタノールである化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。

【0014】

本発明は、哺乳類における卵巣癌を治療する方法であって、有効量の本発明の化合物又は塩をこのような治療を必要としている哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

【0015】

本発明は、哺乳類における多発性骨髄腫を治療する方法であって、有効量の本発明の化合物又は塩をこのような治療を必要としている哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

【0016】

本発明は、哺乳類における癌、特に腎臓癌を治療する方法であって、同時に、別々に、又は順次スニチニブと組合せて、有効量の本発明の化合物又は塩をこのような治療を必要としている哺乳類に投与することを含む方法を提供する。

【0017】

また、本発明は、１以上の薬学的に許容し得る担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて本発明の化合物又は塩を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、前記組成物は、１以上の他の治療剤を更に含む。より具体的には、前記他の治療剤はスニチニブである。

【0018】

また、本発明は、治療において用いるための本発明の化合物又は塩を提供する。また、本発明は、癌の治療において用いるための本発明の化合物又は塩を提供する。更に、本発明は、癌を治療するための医薬の製造における本発明の化合物又は塩の使用を提供する。更に、本発明は、癌の治療において用いるための本発明の化合物又は塩の使用を提供する。特に、この癌は卵巣癌である。更に、この癌は多発性骨髄腫である。

【0019】

また、本発明は、治療において同時に、別々に、又は順次使用するための複合製剤としての、本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩、及びスニチニブを提供する。

【0020】

また、本発明は、癌の治療において、本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩と同時に、別々に、又は順次組合せて使用するためのスニチニブを提供する。あるいは、本発明は、癌の治療において、スニチニブと同時に、別々に、又は順次組合せて使用するための本発明の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。より具体的には、癌は腎臓癌である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

式Ｉで表される化合物は塩を形成することができることを、当業者であれば理解するであろう。本発明の化合物は、塩基性複素環を含有するので、多くの無機及び有機酸のいずれかと反応して、薬学的に許容し得る酸付加塩を形成する。このような薬学的に許容できる酸付加塩及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら、ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８年）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．６６，Ｎｏ．１，１９７７年１月を参照されたい。

【0022】

当業者は、本発明の化合物が少なくとも１つのキラル中心を含有することを理解するであろう。本発明は、鏡像異性体又はジアステレオマー、並びにラセミ体を含む前記化合物の鏡像異性体及びジアステレオマーの混合物を全て意図する。少なくとも１つのキラル中心を含有する本発明の化合物は、単一の鏡像異性体又はジアステレオマーとして存在することが好ましい。単一の鏡像異性体又はジアステレオマーは、キラル試薬から出発して、又は立体選択的若しくは立体特異的な合成技術によって調製することができる。あるいは、単一の鏡像異性体又はジアステレオマーは、標準的なキラルクロマトグラフィー又は結晶化の技術によって混合物から分離することができる。

【0023】

ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）として販売されているスニチニブは、腎細胞癌及びイマチニブ耐性消化管間質腫瘍を治療するための、ＦＤＡによって承認されている経口、小分子、多標的受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。スニチニブは、国際公開第２００１６０８１４号パンフレットに開示されている。

【0024】

スキームＩ
式Ｉ（式中、Ｒは、シクロプロピル又は３−メチルオキセタン−３−イルであり；Ｘは、上に定義した通りである）で表される化合物の調製。

【化2】

オルト−ヒドロキシピリジル−３−アミン（Ａ）を、加熱しながらエタノール中にて、ラセミ体であっても単一の鏡像異性体であってもよいイソチオシアネート（Ｂ）で処理する。加熱中周期的に、過剰のＮ，Ｎ’−二置換−カルボジイミドを添加して、硫化水素を除去する。例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミド、又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を使用してよい。ラセミ体であっても単一の鏡像異性体であってもよいイソチオシアネート（Ｂ）の合成については、以下の調製物に記載する。

【0025】

スキームＩＩ
式Ｉ（式中、Ｒは、メチル２−メチル−プロパンカルボキシレート−２−イル又はメチルシクロプロパンカルボキシレート−１−イルであり；Ｘは、上に定義した通りである）で表される化合物の調製。

【化3】

５−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン（Ｃ）を、エーテル中にて水素化ホウ素リチウムで還元して、式Ｉで表される化合物を得る。中間体（Ｃ）は、スキームＩの通り、イソチオシアネート（Ｂ）を用いて、対応するヒドロキシピリジル−３−アミン（Ａ）（スキームＩ）（式中、Ｒは、メチル２−メチル−プロパンカルボキシレート−２−イル又はメチルシクロプロパンカルボキシレート−１−イルである）から同様に調製される。

【0026】

スキームＩＩＩ
中間体（Ａ）（式中、Ｒは、メチル２−メチル−プロパンカルボキシレート−２−イル、メチルシクロプロパンカルボキシレート−１−イル、シクロプロピル、又は３−メチルオキセタン−３−イルである）の合成。

【化4】

６−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン（Ｄ）に対して２−ピリジルアミン基のジアゾ化を含むピリジン環における官能基操作を行い、次いで、水でクエンチし、次いで、３−ピリジルニトロ基を水素化して、中間体（Ａ）を得る。

【0027】

スキームＩＶ
中間体（Ｄ）（式中、Ｒは、スキームＩＩＩに定義した通りである）の合成。

【化5】

ジオキサン中で酢酸アンモニウムと共に加熱することによって、１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン（Ｆ）及び公知のアルデヒド（Ｅ）から中間体（Ｄ）を調製する。中間体（Ｆ）の合成については、以下の調製物に記載する。

【0028】

本発明の化合物は、本質的に以下のスキーム、調製物及び実施例に例証する通り調製される。試薬及び出発物質は、当業者が容易に入手可能であるか、又は有機化学及び複素環化学の標準的な技術、公知の構造的に類似する化合物の合成と同様の技術、及び任意の新規手順を含む以下の実施例に記載の手順から選択される手順によって作製することができる。調製物及び実施例は、例証のために記載するものであって、当業者であれば様々な改変を行い得ることを理解すべきである。

【0029】

以下の調製物及び実施例では、一般的に、ＳＹＭＹＸ（登録商標）Ｄｒａｗバージョン３．２．ＮＥＴにおけるＩＵＰＡＣ命名法を用いて命名を行う。

【0030】

調製物１
ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−［ベンジル−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ］ブタノエート

【化6】

調製物１及び２は、Ｒ，Ｒ鏡像異性体について国際公開第２００６／０７６５９５号パンフレットに記載されている。また、（Ｅ）−ブタ−２−エノエート（クロトネート）からの３−アミノブタノエートの不斉合成については、Ｄａｖｉｅｓ，Ｓ．Ｇ．及びＩｃｈｉｈａｒａ，Ｏ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １９９１年，２，１８３−１８６を参照されたい。

【0031】

（１Ｓ）−Ｎ−ベンジル−１−フェニル−エタンアミン（２８．５３ｇ、１３５ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解させ、溶液をアルゴン雰囲気下で０℃まで冷却する。Ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、５４ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下する。０℃で２０分間反応混合物を撹拌し、次いで、−７８℃まで冷却する。ｔｅｒｔ−ブチル（Ｅ）ブタ−２−エノエート（１０ｇ、７０．３２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（７５ｍＬ）溶液を２０分間かけて前記反応混合物に添加する。７５分間後、ＮＨ_４Ｃｌ飽和溶液（１７５ｍＬ）及びＮａＣｌ飽和水溶液（ブライン、１００ｍＬ）を添加することにより、反応をクエンチする。層を分離し、水層をジエチルエーテル（２×１２５ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、黄色の油状物を得る。粗生成物をヘキサン（２５０ｍＬ）に溶解させ、１０％クエン酸水溶液（３×７５ｍＬ）で洗浄する。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、黄色の油状物（２４．１２ｇ、９７％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３５４（Ｍ＋１）．

【0032】

調製物２
（３Ｓ）−３−［ベンジル−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ］ブタン−１−オール

【化7】

ｔｅｒｔ−ブチル（３Ｓ）−３−［ベンジル−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ］ブタノエート（２４ｇ、６７．９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２３７ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下で０℃まで冷却する。ＴＨＦ（２３７ｍＬ、２３７ｍｍｏｌ）中１Ｍの水素化アルミニウムリチウムを１０分間かけて滴下する。反応混合物を０℃で１時間、次いで、６０℃で１時間撹拌する。混合物を室温（ＲＴ）まで冷却し、ジエチルエーテル（５００ｍＬ）で希釈する。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）とＮａ_２ＳＯ_４との混合物で反応をクエンチする。１０Ｈ_２Ｏ（１：１）を１５分間かけて少しずつを添加する。前記混合物を濾過し、真空下で濃縮して、無色の油状物（１７．５４ｇ、９０％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２８４（Ｍ＋１）．

【0033】

調製物３
（２Ｓ）−Ｎ−ベンジル−４−メトキシ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］ブタン−２−アミン

【化8】

（３Ｓ）−３−［ベンジル−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］アミノ］ブタン−１−オール（１７．５４ｇ、６１．９ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（１８６ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下で０℃まで冷却する。水素化ナトリウム（４．９５ｇ、鉱油中６０％懸濁液、１２３．８ｍｍｏｌ）を１０分間かけて少しずつ添加する。混合物を０℃で１５分間撹拌し、次いで、室温まで加温する。ヨウ化メチル（１０．５４ｇ、７４．２８ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下する。更に３０分間撹拌した後、ＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液を添加することによって反応をクエンチする。層を分離し、水層をジエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮し、粗物質を順相クロマトグラフィー（１２０ｇシリカゲルカートリッジ２個、ヘキサン中１０％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル）によって精製して、無色の油状物（１４．９６ｇ、８１％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２９８（Ｍ＋１）．

【0034】

調製物４
（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミン塩酸塩

【化9】

（２Ｓ）−Ｎ−ベンジル−４−メトキシ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−フェニルエチル］ブタン−２−アミン（１４．９６ｇ、５０．２９ｍｍｏｌ）をメタノール（４００ｍＬ）に溶解させる。窒素を吹き込むことによって溶液から酸素を除去する。前記溶液に２０％水酸化パラジウム／炭素（１．５０ｇ）を添加し、得られる懸濁液を水素で飽和させ、水素雰囲気下で１６時間撹拌する。この時点で存在する主生成物は、モノ脱ベンジル化生成物である。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドを通して前記懸濁液を濾過し、得られる溶液に２０％水酸化パラジウム／炭素１．１ｇを添加する。水素雰囲気下で２４時間、前記懸濁液を撹拌する。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドを通して前記懸濁液を濾過し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）中ＨＣｌの２Ｎ溶液を混合物に添加し、３０分間撹拌する。前記溶液を減圧下で濃縮して、白色の固体（７．０１ｇ、９９％）として表題化合物を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ１．４８（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．８−１．９（１Ｈ，ｍ），２．０−２．１（１Ｈ，ｍ），３．３７（３Ｈ，ｓ），３．５−３．７（３Ｈ，ｍ），８．３（３Ｈ，ｂｒ）．

【0035】

調製物５
（Ｒ）−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド

【化10】

以下の手順の出典は、Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７年，７２，６２６−６２９である。

【0036】

ＨＣｌ（７．０ｍＬ、７．００ｍｍｏｌ）の１Ｎ溶液に、１，３，３−トリメトキシブタン（５３．１９ｍＬ、３３７．３８ｍｍｏｌ）を滴下し、得られる溶液を５０℃まで加熱し、３０分間撹拌する。重炭酸ナトリウム（１６．５０ｇ、１９６．４１ｍｍｏｌ）を予め室温まで冷却しておいた混合物に添加し、次いで、ジエチルエーテル及びＭｇＳＯ_４を添加する。濾過した後、溶媒を蒸発させて、黄色の油状物としてケト−エーテル中間体である４−メトキシブタン−２−オンを得る。２５℃の（Ｒ）−（＋）−２−メチル−２−プロパンスルフィンアミド（３６．８０ｇ、３０３．６４ｍｍｏｌ）及びチタン（ＩＶ）エトキシド（１２３．１４ｇ、５３９．８０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４８２ｍＬ）溶液に、窒素雰囲気下で前記油状物を添加する。得られる黄色の懸濁液を６０℃まで加熱し、その温度で１６時間撹拌する。反応混合物を室温、次いで−４８℃まで冷却する。ＴＨＦ（５３９．８０ｍＬ、５３９．８０ｍｍｏｌ）中１．０Ｍのリチウムトリ（ｓｅｃ−ブチル）ホウ化水素を滴下する。反応混合物を室温まで加温する。１時間後、反応混合物を０℃まで冷却し、ガスの発生がみられなくなるまで急速に撹拌しながらメタノール（１１００ｍＬ）を添加する。得られる懸濁液をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のプラグを通して濾過し、濾過ケーキを酢酸エチルで洗浄する。濾液をブラインで洗浄し、ブライン層を酢酸エチルで２回抽出する。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、黄色の油状物を得る。

【0037】

粗物質をシリカゲルに吸着させ、ヘキサン／酢酸エチル勾配（７：１から１００％酢酸エチルまで）を使用してシリカゲルカラムを通して精製して、所望の生成物を得る。無極性不純物及び所望の生成物を含有している他の画分を回収し、シリカゲルクロマトグラフィーによって再度精製する。ヘキサン／酢酸エチル（４：１）で無極性不純物を除去する。ジクロロメタン／メタノール（９５：５）で所望の生成物を溶出して、更なる物質を得る。２バッチの物質を合わせて、ＬＣＭＳによって確認したところ約３：１の比率の所望の／不所望のジアステレオマー３８ｇ（５４％）を得る。

【0038】

前記物質（３８ｇ）を、同じ一般手順を使用して作製される別のロットの物質（２３ｇ）と合わせ、ジアステレオマー（比率３：１、６１ｇ）をキラル相高速液体クロマトグラフィー（固定相：ＯＤ−Ｈ；カラムサイズ：（２０μｍ、８０×２５０ｍｍ）；溶出モード：定組成；移動相：ヘキサン／イソプロパノール；流速：３００ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１５．１６ｎｍ；ロード：４ｇ／６分間）によって分離する。第１の溶出ピークは、少ない方のジアステレオマー（Ｔ_Ｒ＝４．７５分間）である。第２の溶出ピークは、多い方のジアステレオマー（表題化合物）（Ｔ_Ｒ＝６．６１分間）である。キラルクロマトグラフィーから、僅かに黄色の油状物（４３．５ｇ）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２０８（Ｍ＋１）；＞９８％ ｅｅ。

【0039】

調製物６
（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミン塩酸塩

【化11】

塩化水素、ジオキサン（１１０．１５ｇ、４１９．６１ｍｍｏｌ）中４．０Ｍを、０℃の（Ｒ）−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド（４３．５ｇ、２０９．８０ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１０９ｍＬ）溶液に添加し、反応混合物を室温で１時間撹拌する。溶媒を減圧下で濃縮し、残渣をトルエンに再懸濁させ、溶媒を減圧下で蒸発させる。残渣を１５分間真空下で乾燥させる。ＴＨＦを添加し、白色の固体を沈殿させる。白色の固体を濾取し、ＴＨＦで洗浄し、乾燥させ、回収して、表題化合物（２５．４ｇ、８７％）を得る。

【0040】

アミンの絶対的立体配置は、（Ｓ）−（−）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル−酢酸を用いて誘導体化し、キラル経路から得られる調製物４の（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミンの同じ誘導体とＮＭＲによって比較することにより確認することができる。

【0041】

調製物７
（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン

【化12】

（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミン塩酸塩（２５．４ｇ、１８１．９２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６０９ｍＬ）に懸濁させ、トリエチルアミン（ＴＥＡ、３２．１７ｍＬ、２３０．７８ｍｍｏｌ）を添加する。１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（４６．７４ｇ、２５１．７６ｍｍｏｌ）を白色の懸濁液に添加し（僅かに発熱反応）、得られる黄色の懸濁液を窒素雰囲気下で一晩撹拌する。前記黄色の懸濁液に酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加し、次いで、１ＮのＨＣｌ（５００ｍＬ）を添加する。有機相を分離し、１ＮのＨＣｌ（３×２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）及びブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、黄色の油状物として表題化合物（２５．３ｇ、８３％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．３７（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．８３（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．６−３．４（２Ｈ，ｍ），３．９９（１Ｈ，ｓｉｘ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）．

【0042】

調製物８
メチル２，２−ジメチル−３−オキソ−プロパノエート

【化13】

メチル３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−プロパノエート（５２．４ｇ、３９６．４９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（４９５ｍＬ）に溶解させ、混合物を氷水浴で冷却する。トリクロロイソシアヌル酸（１０１．３６ｇ、４３６．１４ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、次いで、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−Ｎ−オキシド（６．２０ｇ、３９．６５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１５分間０℃で撹拌し、次いで、室温まで加温し、更に６０分間撹拌する。次いで、ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）を通して固体を濾過し、ジクロロメタン（３００ｍＬ）ですすぐ。Ｎａ_２ＣＯ_３飽和水溶液で濾液を洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、緑色がかった油状物として表題化合物（４１．２４ｇ、８０％）を得る。生成物を、更に精製することなく次の反応工程で使用する。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．３４（６Ｈ，ｓ），１．３４（６Ｈ，ｓ），３．７４（３Ｈ，ｓ），９．６４（１Ｈ，ｓ）．

【0043】

調製物９
６−［２−（２，４−ジフルオロフェニル）エチニル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン

【化14】

６−クロロ−３−ニトロ−ピリジン−２−イルアミン（１２５４ｇ、７．２３ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１５１０ｍＬ、１０．８４ｍｏｌ）及びアセトニトリル（１０Ｌ）を、窒素下で機械的撹拌機を備える２０Ｌの４つ口丸底フラスコに充填する。得られる黄色の懸濁液に、銅（Ｉ）ヨウ化物（１３．９ｇ、７２．３ｍｍｏｌ）及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（５０．７２ｇ、７２．３ｍｍｏｌ）を添加する。得られる淡い橙色の懸濁液を０〜５℃まで冷却し、次いで、窒素で１０分間脱気する。アセトニトリル（２．５Ｌ）に溶解している１−エチニル−２，４−ジフルオロ−ベンゼン（１１００ｇ、７．９５ｍｏｌ）の溶液を６０分間かけて滴下する。得られる混合物を一晩室温（３０℃）で撹拌しながら放置する。前記混合物を０〜５℃まで冷却する。前記懸濁液にトルエン（６Ｌ）を添加し、４５分間混合物を撹拌し、フリットを通して濾過する。トルエン（３×３Ｌ）、水（２×３Ｌ）で固体を洗浄し、真空オーブン内で一晩乾燥させて、黄色の固体として表題化合物（１７５０ｇ、９２％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２７６（Ｍ＋１）．

【0044】

調製物１０
１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン

【化15】

６−［２−（２，４−ジフルオロフェニル）エチニル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン（５００ｇ、１．８２ｍｏｌ）のアセトン（１０Ｌ）冷懸濁液（０〜１０℃）に、冷バッファ［ＮａＨ_２ＰＯ_４（０．８Ｍ）／Ｎａ_２ＨＰＯ_４（０．８Ｍ）＝８５／１５（Ｖ／Ｖ）］（ｐＨ＝６．０；０〜１０℃；１０Ｌ）を添加する。温度を１５℃で維持する。過マンガン酸カリウム（１０３５ｇ、６．５５ｍｏｌ）を（３回に分けて）少しずつ添加する。混合物を１５℃で４時間撹拌する。ｐＨをｐＨ＝５．０に調整し、温度を１５℃未満で維持する。温度を１５℃未満且つｐＨを７．５未満で維持しながら、２８％チオ硫酸ナトリウム溶液（２０５４ｍＬ、３．６４ｍｏｌ）をゆっくり添加する。ブライン（７．５Ｌ）、及びメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３．７５Ｌ）と酢酸エチル（３．７５Ｌ）との混合物を懸濁液に添加する。混合物を１３℃で１５分間撹拌する。２相を分離し、水性の茶色の懸濁液をメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３．５Ｌ）で２回抽出する。合わせた有機層を回収し、ブライン（２×３Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で溶媒を蒸発させて、黄色の固体（３７５ｇ）として表題化合物を得る。同じ条件下で実験を更に２回繰り返す。得られるバッチを合わせて１０８０ｇを得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３０８（Ｍ＋１）．

【0045】

調製物１１
メチル２−［４−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化16】

還流冷却器を備える丸底フラスコに、１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン（５０ｇ、１６２．７５ｍｍｏｌ）、酢酸アンモニウム（１２６．７２ｇ、１．６３ｍｏｌ）、メチル２，２−ジメチル−３−オキソ−プロパノエート（４２．３６ｇ、３２５．５１ｍｍｏｌ）及び１，４ジオキサン（１６３ｍＬ）を添加する。反応混合物を１．５時間かけて８０℃に加熱する。最初は橙色である溶液が、加熱と共に濃い色になる。反応混合物を減圧下で濃縮して、ジオキサンを除去し、残渣を高真空下で一晩乾燥させる。残渣を酢酸エチル（８００ｍＬ）に再度溶解させ、２ＭのＮａ_２ＣＯ_３水溶液で抽出する。有機相をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮し、高真空下で一晩乾燥させて、橙色の粗固体（８０ｇ）として表題化合物を得、これを更に精製することなく次の工程で用いる。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１８（Ｍ＋１）．

【0046】

調製物１２
メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−（６−ヒドロキシ−５−ニトロ−２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化17】

メチル２−［４−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（５６ｇ、１３４．１７ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、４００ｍＬ）及び水（３２０ｍＬ）溶液に、硫酸９５〜９７％（８０ｍＬ）を滴下する。次いで、混合物を０℃まで冷却する。上記混合物に、亜硝酸ナトリウム（１８．７０ｇ、２６８．３５ｍｍｏｌ）の水（８０ｍＬ）溶液を０℃で１５分間かけて滴下する。反応混合物をその温度で２０分間撹拌し、次いで、冷却浴を取り除き、温度を室温まで昇温する。前記反応混合物に、緩衝されたリン酸二水素ナトリウム（１２００ｍＬ、ｐＨ＝６）の０．８Ｍ水溶液を添加する。黄色の懸濁液が生じる。この懸濁液を１時間室温で撹拌する。固体を濾過し、水で洗浄し、オーブン内で乾燥させて、橙色の固体（４９．５ｇ、８８％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４１９（Ｍ＋１）．

【0047】

調製物１３
メチル２−［４−（５−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化18】

メタノール（１．１８Ｌ）中メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−（６−ヒドロキシ−５−ニトロ−２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（４９．５ｇ、１１８．３２ｍｍｏｌ）と５重量％（乾燥量基準）パラジウム／活性炭（４．９５ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）との混合物を室温で一晩水素雰囲気（バルーン）下にて撹拌する。懸濁液をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）を通して濾過し、メタノールですすぎ、濾液を減圧下で濃縮して、茶色の固体として粗表題化合物（３９ｇ）を得る。

【0048】

複数回実行して得られる粗物質（９０ｇ、２３１．７４ｍｍｏｌ）を、以下の通り精製する。物質をジクロロメタン（４５０ｍＬ）及び酢酸エチル（４５０ｍＬ）の１：１混合物に懸濁させる。懸濁液を室温で一晩撹拌する。懸濁液を濾取し、ジクロロメタン／酢酸エチルの１：１混合物で固体を洗浄する。茶色の固体を乾燥させ、回収して、液体クロマトグラフィー−質量分析によって＞９８％の純度を有する表題化合物を６７ｇ得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３８９（Ｍ＋１）．

【0049】

調製物１４
メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化19】

室温のメチル２−［４−（５−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（５５ｇ、１４１．６２ｍｍｏｌ）のエタノール（５５０ｍＬ）懸濁液に、（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン（２４．６８ｇ、１６９．９４ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を還流下で一晩撹拌し、次いで、５０℃まで冷却する。ジシクロヘキシルカルボジイミド（３７．９９ｇ、１８４．１０ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、得られる懸濁液を２０時間還流下で撹拌する。反応物を室温にし、減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣をシリカゲルに吸収させ、シリカゲルカラムを通して精製して（溶出剤としてまずジクロロメタンを使用して大部分の無極性不純物を除去し、次いで、ジクロロメタン／メタノール９５：５を用いて所望の生成物を溶出する）、濃茶色の泡状物として表題化合物（５２ｇ、７４％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５００（Ｍ＋１）．

【0050】

調製物１５
２−［（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチル］イソインドリン−１，３−ジオン

【化20】

（２Ｓ）−２−アミノプロパン−１−オール（２６ｍＬ、３３３ｍｍｏｌ）及び無水フタル酸（５１．７ｇ、３４９．４ｍｍｏｌ）の混合物を１４０℃で一晩加熱する。この間に、固体は橙色の液体になる。反応物を室温まで冷却し、酢酸エチル（１０ｍＬ／ｇ）で希釈する。有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３及び１０％クエン酸で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、白色の固体として表題化合物（６８．３ｇ、９８％）を得、これを更に精製することなく用いる。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２０６（Ｍ＋１）．

【0051】

調製物１６
２−［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］イソインドリン−１，３−ジオン

【化21】

２−［（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−エチル］イソインドリン−１，３−ジオン（４７ｇ、２２９ｍｍｏｌ）及びヨードエタン（８９．３ｇ、５７２．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３７６ｍＬ）溶液に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（６４．２５ｇ、５７２．５ｍｍｏｌ）を１度に添加する。混合物を１５時間窒素雰囲気下で撹拌する。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄する。水相を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、次いで、高真空下で乾燥させて、橙色の固体として表題化合物（３９．４ｇ、７４％）を得、これを更に精製することなく用いる。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ２３４（Ｍ＋１）．

【0052】

調製物１７
（２Ｓ）−１−エトキシプロパン−２−アミン塩酸塩

【化22】

２−［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］イソインドリン−１，３−ジオン（１２．８４ｇ、５５ｍｍｏｌ）をメタノール（１２０ｍＬ）に溶解させる。ヒドラジン一水和物（６．９ｍＬ、１３８ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、混合物を４０℃で４時間撹拌する（白色の固体が形成される）。ＮａＯＨ（１ｍＬ）を添加し、ｐＨを１３〜１４に上昇させる。固体を濾過し、ジクロロメタンで洗浄する。濾液の層を分離し、水層をジクロロメタンで更に抽出する。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過する。エーテル（７０ｍＬ、１４０ｍｍｏｌ）中２ＮのＨＣｌを溶液に添加する。混合物を１５分間撹拌し、減圧下で溶媒を蒸発させて、白色の固体（６．６１ｇ、８６％）として表題化合物を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）；δ１．２２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０２Ｈｚ），１．２８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．５２Ｈｚ），３．４２（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｍ，３Ｈ）．

【0053】

調製物１８
（２Ｓ）−１−エトキシ−２−イソチオシアナト−プロパン

【化23】

（２Ｓ）−１−エトキシプロパン−２−アミン塩酸塩（２ｇ、１２．０３ｍｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０ｍＬ）及びＴＥＡ（１．８５ｍＬ、１３．２４ｍｍｏｌ）溶液に、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（２．３６ｇ、１３．２４ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を１６時間窒素雰囲気下で撹拌する。前記混合物を酢酸エチルで希釈し、１ＮのＨＣｌ、水及びブラインで十分洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、減圧下で濃縮して（生成物の蒸発を避けるために浴の温度が２０℃を超えないようにする）、表題化合物を含有する粗物質（１．８４ｇ）を得、これを更に精製することなく用いる。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．２６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１３Ｈｚ），１．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．６３Ｈｚ），３．４６（ｄｄ，Ｊ＝５．８６，１．６２Ｈｚ，２Ｈ），３．５５（ｄｄ，Ｊ＝１３．９８，６．９７Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｍ，１Ｈ）．

【0054】

調製物１９
３−メチルオキセタン−３−カルバルデヒド

【化24】

（３−メチルオキセタン−３−イル）メタノール（６．０ｇ、５８．７５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１１７ｍＬ）に溶解させる。トリクロロイソシアヌル酸（１３．９３ｇ、５９．９２ｍｍｏｌ）を−５℃で少しずつ添加し、次いで、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）（０．９２ｇ、５．８７ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２０分間−５℃で撹拌し、室温まで加温し、更に２０分間撹拌する。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドを通して濾過し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、Ｎａ_２ＣＯ_３飽和水溶液（１００ｍＬ）、１ＮのＨＣｌ（１００ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄する。有機部分を濃縮して、橙色の油状物（４．１７ｇ、７１％）として表題化合物を得、これを更に精製することなく用いる。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．４８（ｓ，３Ｈ），４．５０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３４Ｈｚ），４．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．３４Ｈｚ），９．９５（ｓ，１Ｈ）．

【0055】

代替調製物：
臭化カリウム（１１．６５ｇ、０．０９８ｍｏｌ）を、０℃のジクロロメタン（２Ｌ）中（３−メチルオキセタン−３−イル）メタノール（２００ｇ、１．９６ｍｏｌ）及びＴＥＭＰＯ（３．０６ｇ、０．０１９ｍｏｌ）の混合物に添加する。次いで、固体ＮａＨＣＯ_３を用いてｐＨ＝９に調整した１０％次亜塩素酸ナトリウム（１．６Ｌ、２．３５ｍｏｌ）水溶液を上記溶液に滴下する（３時間かけて添加、内部温度を＜１０℃に維持する）。得られる混合物を１５分間攪拌し、２相を分離する。薄層クロマトグラフィーによって水相中に生成物が検出できなくなるまで、１０％の２−プロパノール／ジクロロメタン混合物で水相を抽出する。合わせた有機相をチオ硫酸ナトリウム飽和溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、橙色の油状物（１１４ｇ、５８％）として表題化合物を得る。

【0056】

調製物２０
１−メトキシカルボニルシクロプロパンカルボン酸

【化25】

ジメチルシクロプロパン−１，１−ジカルボキシレート（２６．０８ｍＬ、１８９．８７ｍｍｏｌ）をメタノール（３１９ｍＬ）に溶解させ、溶液を０℃に冷却する。水中１ＮのＮａＯＨ（１９０ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を滴下する。得られる混合物を室温で一晩撹拌する。減圧下で溶液を濃縮して、メタノールを除去し、得られる水溶液をジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、１ＮのＨＣｌ（ｐＨ＝２〜３）で酸性化する。次いで、酢酸エチル（５×１００ｍＬ）及びジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で溶液を抽出する。合わせた有機部分をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物（１６．４ｇ、６０％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．９−１．７（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ）．

【0057】

調製物２１
メチル１−（ヒドロキシメチル）シクロプロパンカルボキシレート

【化26】

１−メトキシカルボニルシクロプロパンカルボン酸（１６．４ｇ、１１３．８９ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１７．６ｍＬ、１２７．５５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（３２５ｍＬ）を丸底フラスコに充填する。混合物を−１０℃に冷却し、クロロギ酸イソブチル（１６．５ｍＬ、１２７．５５ｍｍｏｌ）を滴下する。溶液を１時間撹拌する。別々のフラスコで、ＴＨＦ（１６５ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）の混合物に水素化ホウ素ナトリウム（１３ｇ、３４１．６７ｍｍｏｌ）を溶解させ、氷浴中で冷却する。第１の溶液から濾過することによって不溶性物質を除去する。ホウ化水素溶液に、上記１−メトキシカルボニルシクロプロパンカルボン酸溶液を１．５時間かけて滴下する。得られる溶液を１時間同じ温度で撹拌する。反応混合物を冷却した２０％クエン酸水溶液に注ぎ、酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１３．５ｇ、９１％）を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ０．９−０．８（ｍ，２Ｈ），１．３−１．２（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｓ，２Ｈ）３．６９（ｓ，３Ｈ）．

【0058】

調製物２２
メチル１−ホルミルシクロプロパンカルボキシレート

【化27】

メチル１−（ヒドロキシメチル）シクロプロパンカルボキシレート（１６．０ｇ、１２３．０７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３２０ｍＬ）に溶解させ、混合物を−５℃まで冷却する。トリクロロイソシアヌル酸（２９．１ｇ、１２５．５ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、次いで、ＴＥＭＰＯ（１．９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２０分間−５℃で撹拌し、室温まで加温し、２０分間撹拌する。混合物をＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドを通して濾過し、ジクロロメタン（５００ｍＬ）で希釈する。飽和Ｎａ_２ＣＯ_３（３００ｍＬ）、１ＮのＨＣｌ（３００ｍＬ）、ブライン（３００ｍＬ）及び飽和塩化アンモニウム（３×２００ｍＬ）で溶液を洗浄する。有機部分をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、依然としてジクロロメタンを含有する１９ｇの表題化合物（理論値１５．７５ｇ）を得る。物質を次の反応でそのまま使用する。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）；δ１．７−１．６（ｍ，４Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），１０．３８（ｓ，１Ｈ）．

【0059】

調製物２３
６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン

【化28】

１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン（５ｇ、１６．２８ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（５０ｍＬ）及び酢酸アンモニウム（６．２７ｇ、８１．３８ｍｍｏｌ）をＫＩＭＡＸ（登録商標）管に充填する。混合物にシクロプロパンカルバルデヒド（３．４２ｍＬ、４８．８３ｍｍｏｌ）を滴下する。得られる混合物を窒素でパージし、管を密閉し、８０℃で一晩加熱し；その後、前記混合物を室温まで冷却する。次いで、前記混合物を減圧下で濃縮乾固させる。酢酸エチル（７００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加する。有機層を分離し、ブライン（３×２５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濃縮して、粗表題化合物（５．５ｇ）を得、これを更に精製することなく次の工程で用いる。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３５８（Ｍ＋１）．

【0060】

出発物質として１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン及び適切なアルデヒドを使用して、本質的に調製物２３に記載の手順に従って、以下の表中の中間体を調製する。

【0061】

【表1】

^＊１．５時間９０℃で反応を実行させる。後処理中に、固体が沈殿し、重炭酸塩溶液を添加することによって回収される。前述の通り濾液を後処理して、赤色の油状物を得る。酢酸エチル／ヘキサンの４：１混合物中で油状物を超音波処理して懸濁液を得、これを濾過する。

【0062】

調製物２６
６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−３−ニトロ−ピリジン−２−オール

【化29】

ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、３２ｍＬ）、水（２５ｍＬ）、及び濃Ｈ_２ＳＯ_４（６ｍＬ）に６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン（５．５１ｇ、１５．４１ｍｍｏｌ）を懸濁させる。懸濁液を０℃で冷却し、温度が５℃未満で維持されるような速度で亜硝酸ナトリウム（２．１３ｇ、３０．８１ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。混合物を３０分間０℃で撹拌し、次いで、室温まで加温し、液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）が出発物質の完全な変換を示すまで（１時間）撹拌する。混合物にリン酸二水素ナトリウム（２００ｍＬ）の０．８Ｍ水溶液を添加する。黄色の懸濁液が形成される。次いで、ｐＨが８に上昇するまで、水性の１ＮのＮａＯＨを添加する。混合物を３０時間撹拌し、濾過し、固体を水ですすぎ、次いで、減圧下で乾燥させて、表題化合物（４．５３ｇ、８２％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３５８．９（Ｍ＋１）．

【0063】

出発物質として適切な３−ニトロ−ピリジン−２−アミンを使用して、本質的に調製物２６に記載の手順に従って、以下の表中の中間体を調製する。

【0064】

【表2】

【0065】

調製物２９
３−アミノ−６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン−２−オール

【化30】

６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−３−ニトロ−ピリジン−２−オール（４．５２５ｇ、１２．６３ｍｍｏｌ）をエタノール（６３ｍＬ）に溶解させる。窒素ガスを吹き込むことにより溶液を脱気する。混合物に１０％のＰｄ／Ｃ（９２０ｍｇ）を少しずつ添加し、混合物を水素で飽和させる。混合物を週末の間室温で水素雰囲気（バルーン）下にて撹拌し、そのとき、ＬＣ／ＭＳは完全な変換を示す。ＣＥＬＩＴＥ（登録商標）のパッドを通して懸濁液を濾過して触媒を除去し、溶液を減圧下で濃縮して、表題化合物（３．９７ｇ、８９％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２８．９（Ｍ＋１）．

【0066】

出発物質として適切な３−ニトロ−ピリジノールを使用して、本質的に調製物２９に記載の手順に従って、以下の表中の中間体を調製する。

【0067】

【表3】

【0068】

調製物３２
メチル１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロパンカルボキシレート

【化31】

メチル１−［４−（５−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロパンカルボキシレート（４ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ）及び（２Ｓ）−１−エトキシ−２−イソチオシアナト−プロパン（２．３７９ｇ、１５．５３ｍｍｏｌ）の混合物をエタノール（３４ｍＬ）に溶解させる。混合物を１６時間密閉したフラスコ内で８５℃まで加熱する。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２１ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を１６時間８５℃で撹拌し、その後、更に３ｇのジイソプロピルカルボジイミドを添加し、混合物を更に４時間８５℃で加熱する。溶媒を蒸発させ、順相クロマトグラフィー（１２０ｇのシリカゲルカートリッジ、ヘキサン−エタノール勾配を使用）によって残渣を精製して、表題化合物（１．１８０ｇ、２４％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４９８．１（Ｍ＋１）．

【0069】

実施例１代替物を合成するための調製物
調製物３３
（Ｓ）−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド

【化32】

Ｎ−ｔｅｒｔ−ブタンスルフィニルイミンの還元における水素化ホウ素ナトリウムに対するＬ−Ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅの比較については、Ｆａｕｌ，Ｍ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７１，６８５９−６８６２を参照されたい。

【0070】

１，３，３−トリメトキシブタン（１４５．４ｇ、０．９８ｍｏｌ）を１Ｎの水性塩酸（５０．０ｍＬ、０．０５ｍｏｌ）と合わせ、窒素雰囲気下で室温にて１〜２時間撹拌する。ＴＨＦ（１．５Ｌ）を添加し、溶媒を７０℃未満で標準大気圧にて２回蒸発させる。ＴＨＦ（１．５Ｌ）を添加して、４−メトキシブタン−２−オンのＴＨＦ溶液を調製する。（Ｓ）−（−）−２−メチル−２−プロパンスルフィンアミド（１２４．４ｇ、１．０３ｍｏｌ）及びチタン（ＩＶ）エトキシド（４４７．０ｇ、１．９６ｍｏｌ）を添加し、反応物を１６〜１７時間かけて６５〜７０℃まで加熱する。反応混合物を−１０〜０℃に冷却する。水素化ホウ素ナトリウム（３７．０ｇ、０．９８ｍｏｌ）を少しずつ添加し、次いで、混合物を同じ温度で１〜２時間撹拌する。反応混合物を室温まで加温し、１〜２時間撹拌する。次いで、１０〜２０℃まで冷却し、メタノール（１００ｍＬ）を１〜２時間かけて滴下する。２５％水性塩化ナトリウム（３００ｍＬ）を添加し、混合物を室温まで加温する。酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１〜２時間撹拌し、次いで、濾過する。濾過ケーキを更なる酢酸エチル（８０７ｍＬ）ですすぐ。層を分離し、有機相を２５％水性塩化ナトリウム（１．０Ｌ）で洗浄する。水相を酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出する。有機部分を合せ、７５℃未満にて大気圧（真空ではない）で溶媒を蒸留して、溶液の全体積を３００〜５００ｍＬにする。酢酸エチル（６００ｍＬ）及びチオ硫酸ナトリウム（１５０．０ｇ）を添加し、混合物を２０〜３０℃で１〜２時間撹拌する。混合物を濾過し、濾液を濃縮する。超臨界流体クロマトグラフィーによってジアステレオマーを分離して、黄色の油状物（２０５．０ｇ、６５％）として表題化合物を得る。カラム：ＣｈｉｒａｌＰａｋ（登録商標）ＡＤ １０μｍ、５０×３００ｍｍ；溶出モード：定組成；移動相：ＣＯ_２／エタノール；流速：２８０ｍＬ／分；ＵＶ検出：２１５．１６ｎｍ；ロード：３００ｍｇ／ｍＬ。第１の溶出ピークは、少ない方のジアステレオマー（Ｔ_Ｒ＝１５．１７分間）である。第２の溶出ピークは、表題化合物を表す多い方のジアステレオマーである（Ｔ_Ｒ＝１７．１１分間）。

【0071】

調製物３４
（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン

【化33】

窒素雰囲気下で、メタノール（１８５ｍＬ）、ＴＨＦ（１．７６Ｌ）及びＮ−Ｓ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］−２−メチル−プロパン−２−スルフィンアミド（２２０．０ｇ、１．０６ｍｏｌ）を合わせ、−１０〜０℃まで冷却する。塩酸（１．２６Ｌ、５．３ｍｏｌ、ＴＨＦ中４．２Ｎ）を滴下し、温度を１０℃未満で維持する。反応混合物を０〜１０℃で３〜４時間撹拌し、４５℃未満で減圧下にて濃縮して、溶液の体積を４００．０〜６００．０ｍＬにする。ＴＨＦ（８８０ｍＬ）を添加し、反応混合物を４５℃未満で減圧下にて濃縮して、溶液体積を４００〜６００ｍＬにする。反応混合物を２０〜３０℃まで冷却し、０．５〜１時間撹拌する。（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミン、塩酸塩の種晶を添加する（５．０ｇ、３５．８ｍｍｏｌ）。（種晶は、調製物４又は６から得られる固体から作製してもよく、又は、少量のアリコートの再結晶化等の当業者に一般的な他の方法を使用して得てもよい。）また、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６６０ｍＬ）を添加し、混合物を２〜４時間２０〜２５℃で撹拌する。混合物を０〜５℃まで冷却し、２〜４時間撹拌する。固体を濾過によって回収し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１１０ｍＬ）で洗浄する。固体を反応容器に移し、室温でメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６６０ｍＬ）を添加する。チオ硫酸ナトリウム（２７０．０ｇ、１．９ｍｏｌ）及び水酸化ナトリウム（４２．５ｇ、１．０６ｍｏｌ）を添加し、１０〜２０℃で１〜２時間混合物を撹拌する。混合物を濾過し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（４４０ｍＬ）で洗浄して、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（８７．５ｇ）粗溶液として（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミンを得る。前記物質を以下の通り次の反応で使用する。

【0072】

窒素雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−チオカルボニルジイミダゾール（９７．０ｇ、０．５５ｍｏｌ）及びＴＨＦ（４７０ｍＬ）を添加し、混合物を１５〜３０分間撹拌する。前記混合物を−１０〜０℃まで冷却し、（Ｓ）−４−メトキシブタン−２−アミン（４６．９ｇ、０．４５５ｍｏｌ）のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（３８９ｍＬ）溶液を添加し、反応混合物を１０〜２０℃まで加温する。１５〜２０時間この温度で前記反応混合物を撹拌し、次いで、０〜１０℃まで冷却する。塩酸（２７５ｍＬ、水中４Ｎ）を添加して、ｐＨを１〜２にする。反応混合物を室温まで加温し、層を分離する。酢酸エチル（２３５ｍＬ）で水層を抽出し、有機層を合わせ、水（１４０ｍＬ）で洗浄する。有機溶液を４５℃未満で減圧下にて濃縮し、酢酸エチル（２１１．５ｍＬ）を添加し、４５℃未満で減圧下にて溶液を２回濃縮し、酢酸エチル（２３５ｍＬ）を添加する。チオ硫酸ナトリウム（３２．３ｇ、２２７．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を濾過し、濾過ケーキを酢酸エチル（１０４ｍＬ）で洗浄する。４５℃未満で減圧下にて濾液を濃縮して、黄色の油状物（５５．０ｇ、７７％）として表題化合物を得る。

【0073】

調製物３５
メチル２，２−ジメチル−３−オキソ−プロパノエート

【化34】

メチル３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−プロパノエート（２５．４ｋｇ、１９２．２ｍｏｌ）とジクロロメタン（２４１Ｌ）とを、撹拌しながら室温で窒素雰囲気下にて合わせる。（２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−イル）オキシル（０．６１ｋｇ、３．９ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０〜５℃まで冷却する。トリクロロイソシアヌル酸（３１．２ｋｇ、１３４．５ｍｏｌ）を０〜５℃で少しずつ添加し、反応混合物をこの温度で１６〜１８時間撹拌する。反応物を濾過し、濾過ケーキをジクロロメタン（２５．４Ｌ）で洗浄し、５０℃未満で減圧下にて濾液を濃縮する。１，４−ジオキサン（２５．４Ｌ）を添加し、有機相を６５℃未満で減圧下にて濃縮して、黄色の液体（１２７．８ｋｇ、７７％）として表題化合物を得、これを更に精製することなく用いる。

【0074】

調製物３６
６−［２−（２，４−ジフルオロフェニル）エチニル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン

【化35】

６−クロロ−３−ニトロ−ピリジン−２−イルアミン（１６．２ｋｇ、９３．３ｍｏｌ）、アセトニトリル（１３０．８Ｌ）、ヨウ化第一銅（０．１８ｋｇ、１．０ｍｏｌ）、及びビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）塩化物（０．６６ｋｇ、０．９ｍｏｌ）を、撹拌しながら２０〜２５℃で窒素雰囲気下にて合わせる。トリエチルアミン（１９．７Ｌ、１４１．３ｍｏｌ）を添加し、混合物を３０〜３５℃まで加熱する。１−エチニル−２，４−ジフルオロ−ベンゼン（１８．０ｋｇ、１３０．３ｍｏｌ）のアセトニトリル（３２．６Ｌ）溶液を３０〜３５℃で窒素雰囲気下にて添加する。前記混合物を２〜４時間１５〜２５℃にて撹拌する。トルエン（８０．０Ｌ）を添加し、前記混合物を０．５〜１時間撹拌し、次いで、０〜５℃まで冷却し、２〜４時間撹拌する。反応混合物を遠心分離し、濾過ケーキをトルエン（２×６４Ｌ）及び水（２×３２．４Ｌ）ですすぐ。固体を５０℃未満で減圧下にて乾燥させて、黄色の固体（２１．７ｇ、８３％）として表題化合物を得る。

【0075】

調製物３７
１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン

【化36】

６−［２−（２，４−ジフルオロフェニル）エチニル］−３−ニトロ−ピリジン−２−アミン（２．０ｋｇ、７．３ｍｏｌ）及びアセトン（４０．５Ｌ）を窒素雰囲気下で反応器に添加し、混合物を撹拌しながら０〜１０℃まで冷却する。水（３８．３Ｌ）、リン酸二水素ナトリウム（３．３ｋｇ）及びリン酸水素二ナトリウム（０．７ｋｇ）の緩衝溶液を０〜１５℃で添加する。混合物を３〜６℃まで冷却し、３〜６℃で固体の過マンガン酸カリウム（４．１ｋｇ、２５．９ｍｏｌ）を加える。混合物を３時間〜５時間撹拌し、次いで、反応混合物の一部を、１５〜２０℃の水（９．３Ｌ）及びチオ硫酸ナトリウム五水和物（３．６ｋｇ）を含有している容器に移す。混合物を１５〜２５℃で撹拌する。水（５０Ｌ）を添加し、混合物を０．５〜１時間撹拌し、濾過する。濾液を４５℃未満で減圧下にて濃縮する。溶媒の蒸留が完了したら、２０〜２５℃で水（４０Ｌ）を添加し、混合物を０．５〜１時間撹拌する。濾過によって固体を回収し、濾過ケーキを４０℃未満で乾燥させて、黄色の固体（１．７ｋｇ、７５％）として表題化合物を得る。

【0076】

調製物３８
メチル２−［４−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート、メタンスルホン酸塩

【化37】

酢酸アンモニウム（３０．０ｋｇ、３８９．２ｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（１９３．６Ｌ）及びメチル２，２−ジメチル−３−オキソ−プロパノエート（１０．２ｋｇ、７８．４ｍｏｌ）を、０．５〜１時間かけて２０〜２５℃で撹拌しながら窒素雰囲気下で合わせる。１−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−２−（２，４−ジフルオロフェニル）エタン−１，２−ジオン（１８．５ｋｇ、６０．２ｍｏｌ）を添加し、混合物を２０〜２５℃で１０〜１４時間撹拌する。トルエン（３６．９Ｌ）を添加し、溶液を６５℃未満で減圧下にて濃縮する。トルエン（７６．８Ｌ）を添加し、溶液を６５℃未満で減圧下にて濃縮する。トルエン（３６．９Ｌ）及び酢酸エチル（３７．１Ｌ）を添加し、混合物を濾過する。濾液を取り置き、濾過ケーキを別々の反応器に移し、酢酸エチル（３７．１Ｌ）を添加する。混合物を２０〜３０分間かけて撹拌しながら５０〜６０℃まで加熱する。混合物を２０〜２５℃まで冷却し、濾過し、濾液を前述の濾液と合わせる。合わせた濾液を６０℃未満で減圧下にて濃縮し、トルエン（７６．８Ｌ）を添加する。混合物を６５℃未満で減圧下にて濃縮する。酢酸エチル（１８．６Ｌ）及びトルエン（１８．３Ｌ）を添加し、溶液を５０〜７０℃まで加熱する。酢酸エチル（１８．６Ｌ）中メタンスルホン酸（４．３Ｌ、６６．２ｍｏｌ）を添加し、反応物を１〜２時間撹拌する。反応物を１０〜２５℃まで冷却し、２〜５時間撹拌する。固体を濾過によって回収し、濾過ケーキを酢酸エチル（１８．６Ｌ）で洗浄して、茶色の固体（１７．０ｋｇ、純度９６．２％、収率４６．２％）として表題化合物を得る。^１Ｈ ＮＭＲ（ｄ_６−ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ１．６９（ｓ，６Ｈ），２．３６（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），６．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．００（ｓ，１Ｈ），７．２５（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），７．２７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１．６Ｈｚ），７．４５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ，１０．０Ｈｚ，２．４Ｈｚ），７．８３−７．６８（ｍ，２Ｈ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）．

【0077】

調製物３９
メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−（６−ヒドロキシ−５−ニトロ−２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化38】

窒素雰囲気下で、メチル２−［４−（６−アミノ−５−ニトロ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエートメタンスルホネート（６８．９ｇ、１３４．２ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（２７５．５ｍＬ）、ＴＨＦ（１１６．２ｍＬ）及び水（３０３．２ｍＬ）を添加し、混合物を２０〜２５℃で撹拌する。硫酸９５〜９７％（９３．６ｍＬ）を反応混合物に滴下し、温度を３０℃未満で維持する。前記反応混合物を０〜５℃まで冷却し、亜硝酸ナトリウム（１８．６ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の水（８２．７ｍＬ）溶液を０〜１０℃で添加する。反応混合物をこの温度で１〜２時間撹拌する。温度を２５℃未満で維持するように、１０％水性リン酸二水素ナトリウム（９３０．０ｍＬ）を滴下する。得られる混合物を１５〜２５℃で２〜３時間撹拌し、固体を濾過によって回収する。濾過ケーキを水（１３８ｍＬ）で洗浄し、固体を反応容器に移す。メタノール（５６６ｍＬ）を添加し、混合物を１〜２時間６０〜６５℃まで加熱する。水（８７ｍＬ）を添加し、混合物を１〜２時間６０〜６５℃で撹拌する。反応混合物を１５〜２５℃まで冷却し、混合物を２〜４時間１５〜２５℃で撹拌する。混合物を濾過し、メタノール（８７ｍＬ）でケーキを洗浄し、７０℃未満にて真空下で乾燥させて、黄色の固体（５３．２８ｇ、９３％）として表題化合物を得る。

【0078】

調製物４０
メチル２−［４−（５−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化39】

メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−（６−ヒドロキシ−５−ニトロ−２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（９０．０ｇ、０．２２ｍｏｌ）、湿潤１０％Ｐｄ／Ｃ（４．５ｇ）及びメタノール（１．７７Ｌ）を１５〜２５℃で合せる。反応物を３〜６時間２０〜２５ｐｓｉｇの水素雰囲気下で撹拌する。反応混合物を珪藻土で濾過し、濾過助剤をメタノール（２２７ｍＬ）で洗浄する。４０℃未満で減圧下にて濾液を濃縮し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７２９．３ｍＬ）を添加する。４０℃未満で減圧下にてＭＴＢＥを除去し、更なるメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７２９．３ｍＬ）を添加する。ＭＴＢＥを４０℃未満で減圧下にて除去する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１８２ｍＬ）及びメタノール（４６ｍＬ）を添加し、混合物を１〜２時間５０〜６０℃まで加熱する。混合物を１０〜１５℃まで冷却し、２〜４時間撹拌する。固体を濾過によって回収し、濾過ケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（６１ｍＬ）で洗浄する。固体を５０℃未満で真空下にて乾燥させて、黄色の固体（７５．０ｇ、８８％）として表題化合物を得る。

【0079】

調製物４１
メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート

【化40】

ジメチルスルホキシド（７１３ｍＬ）を窒素雰囲気下で０．５〜１時間２５〜３０℃にて窒素で脱気する。メチル２−［４−（５−アミノ−６−ヒドロキシ−２−ピリジル）−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（３５．０ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）及び（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン（１９．５８ｇ、０．１４ｍｏｌ）を添加し、反応物を６３〜６８℃まで加熱する。この温度で１８〜２４時間反応混合物を撹拌し、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１９．３ｇ、１００．７ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。反応混合物を６０〜６５℃で２〜４時間撹拌する。反応が完全変換に達しない場合、更に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１．９ｇ、９．９ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２０〜３０℃まで冷却し、珪藻土で濾過する。酢酸エチル（３５１ｍＬ）及び水（３５０ｍＬ）を濾液に添加する。層を分離し、酢酸エチル（３１２ｍＬ）で水相を抽出する。有機層を合わせ、水（２×２１０ｍＬ）で洗浄し、次いで、ヘプタン（６２６ｍＬ）を添加する。溶液を０．５〜１時間撹拌し、シリカゲルで濾過し、酢酸エチル（３５１ｍＬ）及びヘプタン（３４８ｍＬ）の混合物ですすぐ。４５℃未満で減圧下にて溶液を濃縮し、酢酸エチル（１５６ｍＬ）を添加する。活性炭（３．５ｇ）を添加し、混合物を０．５〜１時間撹拌しながら６０〜７０℃まで加熱する。混合物を２０〜３０℃まで冷却し、濾過し、濾液を４５℃未満で減圧下にて濃縮する。得られる残渣にトルエン（２４２ｍＬ）を加え、物質を４５℃未満で減圧下にて濃縮する。トルエン（４０ｍＬ）を添加し、混合物を０．５〜１時間撹拌しながら６０〜７０℃まで加熱する。混合物を２５〜３０℃まで冷却し、２〜４時間撹拌し、次いで、０〜５℃まで冷却する。前記混合物を２〜４時間０〜５℃で撹拌し、固体を濾過によって回収する。濾過ケーキをトルエン（４０ｍＬ）で洗浄し、６０℃未満で減圧下にて乾燥させて、オフホワイトの固体（３３．０ｇ、７１％）として表題化合物を得る。

【実施例】

【0080】

実施例１
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール

【化41】

メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（４９７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（５ｍＬ）及びＴＨＦ（２．５ｍＬ）の混合物に溶解させる。混合物を０℃まで冷却し、水素化ホウ素リチウム（４５．６ｍｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。次いで、反応混合物を２時間窒素雰囲気下で室温にて撹拌する。ｐＨ＝１になるまで１ＭのＨＣｌをゆっくり添加し、混合物を室温で１５分間撹拌する。混合物を固体ＮａＨＣＯ_３で塩基性化し、層を分離する。ジクロロメタンで水層を抽出し、合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。順相クロマトグラフィー（４０ｇのシリカゲルカートリッジ、ヘキサン中２０％のエタノール）によって粗物質を精製する。茶色の固体（２９８ｍｇ）を得、これを逆相クロマトグラフィー（ＸＢＲＩＤＧＥ（商標）カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）：炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ＝９）中３５〜３８％アセトニトリルの勾配。流速２５ｍＬ／分）によって更に精製して、１９３ｍｇ（４１％）の表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７２（Ｍ＋１）．［α］_Ｄ^２２ ＋３３．７９°（ｃ＝０．７２，メタノール）．

【0081】

実施例１代替物の精製
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール
メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（５０ｇ、１００．１ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル（１Ｌ）及びＴＨＦ（５００ｍＬ）の混合物に溶解させる。混合物を０℃まで冷却し、水素化ホウ素リチウム（４．３６ｇ、２００．１９ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を２時間窒素雰囲気下で室温にて撹拌する。１ＭのＨＣｌ（６００ｍＬ）をゆっくり添加し（ガス発生）、得られる混合物を室温で１．５時間撹拌する。層を分離し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで水相を抽出する。２ＭのＮａＯＨ（２００ｍＬ）を添加することによって水層を塩基性化し（ｐＨ＝８）、ジクロロメタン（３×４００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、茶色の泡状物を得る。粗物質をシリカゲルカラム（溶出剤：ジクロロメタン／メタノール中３ＮのＮＨ_３ ９５：５）を通して溶出して、紫色の泡状物（３５ｇ）として所望の生成物を得る。２：１ヘプタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルの混合物に固体を懸濁させ、超音波処理する。懸濁液を室温で一晩撹拌する。前記固体を濾過し、真空下で乾燥させて、結晶質のオフホワイトの固体（３０ｇ、６４％）として表題化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｚ）：４７２（Ｍ＋１）．

【0082】

実施例１：調製物３３〜４１の代替経路
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール

【化42】

２−メチルテトラヒドロフラン（１３５ｍＬ）を窒素下で−５〜０℃まで冷却し、１０℃未満の温度を維持しながら水素化ホウ素リチウム（４．９５ｇ、０．２３ｍｏｌ）を少しずつ添加する。メチル２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパノエート（４５．０ｇ、０．０９ｍｏｌ）の２−メチルテトラヒドロフラン（２２５ｍＬ）溶液を−５〜０℃で滴下し、１２〜１４時間撹拌する。２Ｍの水性塩酸（２０３ｍＬ）を−５〜０℃で滴下し、反応混合物を１〜２時間かけて撹拌しながら３０〜４０℃まで加熱する。反応混合物を１５〜２５℃まで冷却し、層を分離する。水（１３５ｍＬ）及び２Ｍの水性塩酸（４５ｍＬ）の混合物で有機相を抽出し、前記有機相を廃棄する。水層を合わせ、２５％水性水酸化ナトリウム（７５ｍＬ）を滴下して、ｐＨ＝８〜９に調整する。水性を室温にてジクロロメタン（２２５ｍＬ）で抽出し、層を分離する。有機部分を水（２×１８０ｍＬ）で洗浄し、次いで、４０℃未満で減圧下にて濃縮する。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（２３１ｍＬ）を添加し、溶液を４０℃未満で減圧下にて２回濃縮する。酢酸エチル（１０１ｍＬ）を添加し、混合物を１〜２時間かけて撹拌しながら５０〜６０℃まで加熱する。２〜４時間撹拌しながら溶液を０〜５℃まで冷却する。固体を濾過し、濾過ケーキをヘプタン（６６ｍＬ）で洗浄する。固体を反応容器に移し、酢酸エチル（１８１ｍＬ）を添加し、次いで、混合物を０．５〜１時間かけて撹拌しながら７０〜７５℃まで加熱する。混合物を５０〜６０℃まで冷却し、ヘプタン（１５７ｍＬ）を滴下し、２〜４時間撹拌する。次いで、混合物を２〜４時間撹拌しながら１０〜１５℃まで冷却する。固体を濾過し、濾過ケーキをヘプタン（６６ｍＬ）で洗浄する。前記固体を反応容器に移し、酢酸エチル（４０６ｍＬ）を添加する。混合物を０．５〜１時間かけて撹拌しながら６０〜７５℃まで加熱する。次いで、４０〜４５℃まで冷却し、溶液の全体積が約２００ｍＬになるように４５℃未満で減圧下にて濃縮する。混合物を０．５〜１時間かけて撹拌しながら７０〜７５℃まで加熱し、次いで、５０〜６０℃まで冷却する。ヘプタン（２６８ｍＬ）を添加し、次いで、種晶（２．２５ｇ）を添加する。（種晶は、実施例１の生成物の前述のロットから得られる固体から作製してもよく、又は、少量のアリコートの再結晶化等の当業者に一般的な他の方法を使用して得てもよい。）混合物を２〜４時間５０〜６０℃にて撹拌する。混合物を１０〜１５℃まで冷却し、２〜４時間撹拌する。固体を濾過によって回収し、酢酸エチル（１８ｍＬ）及びヘプタン（１６ｍＬ）の混合物で濾過ケーキを洗浄する。６５℃未満で減圧下にてケーキを乾燥させて、オフホワイトの固体（２７．５ｇ、６３％）として表題化合物を得る。ＨＰＬＣ方法：カラム：ＣｈｉｒａｌＰａｋ（登録商標）ＡＤ−Ｈ、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ；溶出モード：定組成；移動相：ヘキサン／イソプロパノール／ジエチルアミン（９２：８：０．１）；流速：１．０ｍＬ／分；ＵＶ検出：３３７ｎｍ。Ｔ_Ｒ＝２２．６分間。１００％ ｅｅ。

【0083】

実施例１の化合物のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）
３５ｋＶ及び５０ｍＡで稼働する、ＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）及びＶａｎｔｅｃ検出器を備えるＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｒ Ｘ線粉末回折計で、結晶質固体のＸＲＰＤパターンを得る。ステップサイズ：２θにおいて０．００９°、スキャン速度：０．５秒／ステップ、分散：０．６ｍｍ、固定散乱防止：５．２８、及び検出器のスリット：９．５ｍｍで、サンプルを２θにおいて４〜４０°の範囲でスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダに充填し、スライドガラスを用いて平滑表面を得る。周囲温度及び相対湿度で結晶形の回折パターンを取得する。この場合、２θにおいて±０．２のピーク位置変動は、指定の結晶形の絶対的同定を妨げることのないこれらの電位変化を考慮に入れる。結晶形は、ピーク（単位：２θ）、典型的にはより顕著なピークを識別する任意の独自の組合せに基づいて画定することができる。周囲温度及び相対湿度で取得した結晶形の回折パターンを、８．８５３及び２６．７７４°２−θのＮＩＳＴ ６７５基準ピークに基いて調整する。

【0084】

【表4】

【0085】

したがって、本発明の結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールの形態１は、ＣｕＫ_α放射を用いるＸ線回折パターンによって、表１に記載する通りの回折ピーク（２−θ値）、具体的には、１５．０６におけるピークに加えて１９．９４、１０．３１及び２０．７８おけるピークのうちの１以上を有し；より具体的には１５．０６にピークを有し；回折角の許容差が０．２°であることを特徴とし得る。

【0086】

実施例１（遊離塩基形態ＩＩ）：
１２５ｍＬのフラスコ内の８．０１ｇの遊離塩基と１００ｍＬのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルとを混合して固体の茶色のスラリーを得ることによって実施例１の遊離塩基形態ＩＩを調製する。サンプルを３００ｒｐｍ及び５０℃で一晩スラリー化する。１８時間後、サンプルは、ワインレッド色の上清の下にオフホワイトの固体が存在するスラリーになる。体積が約半分になるまでサンプルを蒸発させ、吸引濾過によってオフホワイトの固体を回収する。オフホワイトの固体である得られるケーキを、６５℃の真空オーブン内で２時間乾燥させる。７．１５ｇの固体が回収される（８９％）。

【0087】

【表5】

【0088】

したがって、本発明の結晶質の２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オールの形態ＩＩは、ＣｕＫ_α放射を用いるＸ線回折パターンによって、表１に記載する通りの回折ピーク（２−θ値）、具体的には、１３．７３におけるピークに加えて、１６．５４、２２．８７及び１８．５７におけるピークのうちの１以上を有し；より具体的には１３．７３にピークを有し；回折角の許容差が０．２°であることを特徴とし得る。

【0089】

実施例２
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール、メタンスルホン酸塩
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール（３７．５ｍｇ、０．０８０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／メタノールの１：１混合物（合計１ｍＬ）に溶解させる。０．５Ｍのメタンスルホン酸のメタノール（０．１６ｍＬ）溶液を滴下する。混合物を３０分間室温で撹拌する。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られる残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて２回粉砕する。真空下で残渣を乾燥させて、表題化合物（４２ｍｇ、９３％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７２（Ｍ＋１）．

【0090】

実施例３
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール、塩酸塩
６０℃のメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（７７１ｍＬ）中２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール（２５．７ｇ、５４．５１ｍｍｏｌ）の僅かにピンク色の懸濁液に、４．０ＭのＨＣｌのジオキサン（１６．３５ｍＬ、６５．４１ｍｍｏｌ）溶液を添加する。得られる懸濁液を３０分間かけて６０℃まで加熱し、次いで、徐々に室温にする。固体が形成されると、窒素の不活性雰囲気下で濾過し、速やかに回収し、一晩６０℃で真空下にて乾燥させて、クリーム状の固体（２７ｇ、９８％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７２（Ｍ＋１）．

【0091】

実施例４
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｒ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール

【化43】

調製物１においてＳ鏡像異性体の代わりに（１Ｒ）−Ｎ−ベンジル−１−フェニル−エタンアミンを使用することを除いて、そのＳ鏡像異性体と本質的に同じ合成経路を使用して表題化合物を調製する。［α］_Ｄ^２２−３２．１１^ｏ，（ｃ＝０．５４，メタノール）．

【0092】

実施例５
２−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｒ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−２−メチル−プロパン−１−オール、メタンスルホン酸塩
そのＳ鏡像異性体について実施例２に記載した手順と本質的に同じ手順を使用して、表題化合物を調製する。

【0093】

実施例６
５−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミン

【化44】

３−アミノ−６−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン−２−オール（０．７ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）及びエタノール（７ｍＬ）をＫＩＭＡＸ（登録商標）管に充填する。（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン（０．４６ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコを密閉し、混合物を８５℃まで加熱する。１６時間後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボ−ジイミド（０．８８ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）を添加し、密閉した管内において８５℃で４時間混合物を撹拌する。この時間後、前記混合物に更なるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．４４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を添加する。８５℃で一晩加熱を続ける。この時間後、前記混合物に更なるＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（０．８８ｇ、４．２６ｍｍｏｌ）を添加し、４時間８５℃で加温を続ける。粗反応物を減圧下で濃縮し、順相クロマトグラフィー（１２０ｇのシリカゲルカートリッジ、ジクロロメタン−エタノール勾配）によって残渣を精製する。ＸＢＲＩＤＧＥ（商標）カラム（５μｍ、１９×１００ｍｍ）、及びＮＨ_４ＨＣＯ_３ ２０ｍＭ（ｐＨ９）中３６％アセトニトリルの定組成プログラムを使用して、２５ｍＬ／分の流速で５分間、半分取逆相高速（ＬＣ／ＭＳ）によって所望の化合物を含有する画分を更に精製して、表題化合物（０．１５ｇ、１６％）を得る。ＬＣＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４４０（Ｍ＋１）；［α］_Ｄ^２２＋５８．６０^ｏ，（ｃ＝０．５０，メタノール）．

【0094】

実施例７
５−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンメタンスルホン酸塩
５−［２−シクロプロピル−５−（２，４−ジフルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミン（０．０９０ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン及びメタノールの１：１混合物（合計３ｍＬ）に溶解させる。０．５Ｍのメタンスルホン酸のメタノール（０．４７ｍＬ）溶液を前記溶液に滴下する。３０分間室温で前記混合物を撹拌し、次いで、減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣をメタノールと混合し、２回濃縮して、表題化合物（０．１１１ｇ、８９％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４４０（Ｍ＋１）．

【0095】

実施例８
５−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミン

【化45】

３−アミノ−６−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン−２−オール（２．２８ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）及びエタノール（１８ｍＬ）をＫＩＭＡＸ（登録商標）管に充填する。（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン（１．３９ｇ、９．５４ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコを密閉し、混合物を８５℃まで加熱する。１６時間後、（３Ｓ）−３−イソチオシアナト−１−メトキシ−ブタン（７００ｍｇ）を添加し、密閉した管内において８５℃で４８時間混合物を撹拌する。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（１．０４ｇ）を添加し、密閉した管内において８５℃で３時間混合物を撹拌する。粗反応混合物を減圧下で濃縮し、順相クロマトグラフィー（１２０ｇのシリカゲルカートリッジ、ヘキサン−エタノール勾配）によって残渣を精製する。所望の化合物を３％エタノールで溶出して、茶色の固体（２．６１ｇ、８７％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７０（Ｍ＋１）；［α］_Ｄ^２２＋４２．２^ｏ，（ｃ＝０．５０，メタノール）．

【0096】

実施例９
５−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミンメタンスルホン酸塩
５−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−２−（３−メチルオキセタン−３−イル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］−Ｎ−［（１Ｓ）−３−メトキシ−１−メチル−プロピル］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−アミン（０．７２ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／メタノールの１：１混合物（合計１．５ｍＬ）に溶解させる。０．５Ｍのメタンスルホン酸のメタノール（３．０７ｍＬ）溶液を前記溶液に滴下する。３０分間室温で前記混合物を撹拌し、次いで、減圧下で溶媒を蒸発させる。残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを用いて粉砕して、茶色の固体（０．８４１ｇ、９７％）として表題化合物を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７０（Ｍ＋１）．

【0097】

実施例１０
［１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロピル］メタノール

【化46】

メチル１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロパンカルボキシレート（０．９ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で無水ジエチルエーテル（２０ｍＬ）及び無水ＴＨＦ（７ｍＬ）に溶解させ、０℃まで冷却する。水素化ホウ素リチウム（８７ｍｇ、３．９９ｍｍｏｌ）を少しずつ添加し、混合物を１時間０℃で撹拌する。ｐＨ＝１になるまで１ＮのＨＣｌを室温で３０分間かけて前記混合物に滴下することによって、残りの反応物質をクエンチする。前記混合物を酢酸エチルで洗浄し、水層を（ｐＨ＝８まで）ＮａＯＨで塩基性化し、ジクロロメタンで抽出する。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。ヘキサン−エタノールの勾配を使用して順相クロマトグラフィー（１２０ｇのシリカゲルカートリッジ）によって残渣を精製して、表題化合物（０．５６ｇ、６０％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７０．２（Ｍ＋１）；［α］_Ｄ^２２−１８．００^ｏ，（ｃ＝０．５０，ＭｅＯＨ）；［α］_Ｄ^２２−１８．０^ｏ，（ｃ＝０．５０，ＣＨＣｌ_３）．

【0098】

実施例１１
［１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロピル］メタノールメタンスルホン酸塩
［１−［５−（２，４−ジフルオロフェニル）−４−［２−［［（１Ｓ）−２−エトキシ−１−メチル−エチル］アミノ］オキサゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−５−イル］−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］シクロプロピル］メタノール（０．５６ｇ、１．１９ｇ）をジクロロメタン／メタノールの１：１混合物（合計１２ｍＬ）に溶解させる。０．５Ｍのメタンスルホン酸のメタノール（２．３７ｍＬ）溶液を前記溶液に滴下する。混合物を３０分間室温で撹拌し、次いで、溶媒を減圧下で蒸発させる。残渣をメタノールと混合し、２回濃縮して、表題化合物（０．６４ｇ、９６％）を得る。ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４７０．１（Ｍ＋１）．

【0099】

生物学的アッセイ
以下のアッセイは、本発明の例示化合物が、ｐ３８αＭＡＰキナーゼの強力な阻害剤であり、ｐ３８βＭＡＰキナーゼの強力な阻害剤であり、且つ癌細胞におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼシグナル伝達の強力な阻害剤であることを実証する。また、以下のアッセイは、実施例１又は実施例１の塩（実施例２又は３）がインビボで強力な活性を有し、且つ単独で及び／又は他の腫瘍崩壊剤と組合せて有効な抗癌剤であることを実証する。

【0100】

ｐ３８αＭＡＰキナーゼ酵素活性の阻害
試薬の調製：
１Ｍの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．５）１４４０μＬ、１ＭのＭｇＣｌ_２ ２４０μＬ、１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）７２μＬ、１０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００ ２５μＬ、Ｈ_２Ｏ ４３２２３μＬを含有する原液としてキナーゼ反応バッファを調製する。以下を合わせることにより基質ミックスを調製する：キナーゼ反応バッファ２７７５μＬ、１０ｍＭのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）７５．０μＬ、４ｍＭ（９．１７ｍｇ／ｍＬ）のＥＧＦＲペプチド（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）２７０μＬ及び^３３Ｐ−ＡＴＰ１２．５μＬ。精製ヒトｐ３８αＭＡＰキナーゼの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液を反応バッファ３０００μＬで希釈することによって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ酵素原液を調製する。化合物を１０ｍＭで１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させることにより、試験化合物の原液を作製する。１９８μＬの２０％ＤＭＳＯで１０ｍＭ原液２μＬを希釈することにより、１００μＭ原液希釈平板を作製する。Ｔｅｃａｎ液体ハンドラーを使用して、１００μＭの原液から２０％ＤＭＳＯの１：３希釈液を作製する。

【0101】

キナーゼアッセイ：
キナーゼアッセイでは、希釈した化合物５μＬを反応プレートに移し、次いで、酵素原液１０μＬを（ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ（登録商標）液体ディスペンサを使用して）添加する。反応を開始させるために、ＭＵＬＴＩＤＲＯＰ（登録商標）を用いて基質ミックス１０μＬを添加し、３０秒間プレートを振盪させる。最終反応条件は以下の通りである：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４．２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．３０ｍＭのＤＴＴ、０．００４％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、１００μＭのＡＴＰ、１００μＭのＥＧＦＲペプチド、１１．８ｎＭのｐ３８αＭＡＰキナーゼ及び４％のＤＭＳＯ。６０分間室温で反応物をインキュベートし、次いで、（新たに調製した）５％酢酸７５μＬを添加することによって反応を停止させる。停止後、０．５％酢酸１００μＬで予め洗浄したホスホセルロース濾板（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＮＡＰＨ）に反応混合物１００μＬを移す。３０分間前記ホスホセルロース濾板上で前記反応混合物をインキュベートし、真空マニホールドを用いて濾過し、０．５％オルトリン酸３００μＬで１回、次いで、２００μＬで２回洗浄する。洗浄工程に続いて、８０μＬのＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（商標）２０を添加し、Ｔｒｉｌｕｘ ＭＩＣＲＯＢＥＴＡ（登録商標）で放射活性をカウントする。Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、ＩＣ_５０値を計算する。全ての例示化合物は、０．０５０μＭ未満のＩＣ_５０を有する。例えば、実施例１は、ＩＣ_５０＝０．００３μＭを有する。このアッセイは、実施例１の化合物がｐ３８αＭＡＰキナーゼの強力な阻害剤であることを実証する。

【0102】

ｐ３８βＭＡＰキナーゼ酵素活性の阻害
試薬の調製：
本質的に上記の通りキナーゼ反応バッファを調製する。以下を合わせることによって基質ミックスを調製する：キナーゼ反応バッファ２８４０μＬ、１０ｍＭのＡＴＰ１５．０μＬ、４ｍＭ（９．１７４ｍｇ／ｍＬ）のＥＧＦＲペプチド１２５μＬ、^３３Ｐ−ＡＴＰ１８．７５μＬ。市販のｐ３８βＭＡＰキナーゼ（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の０．５７ｍｇ／ｍＬ溶液２．２５μＬを２０００μＬの反応バッファで希釈することによって、ｐ３８βＭＡＰキナーゼ酵素原液を調製する。本質的に上記の通り試験化合物の原液を調製する。

【0103】

キナーゼアッセイ：
ｐ３８βＭＡＰキナーゼについて、本質的に上記の通りキナーゼアッセイを実施する。最終反応条件は、以下の通りである：２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、４．２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．３０ｍＭのＤＴＴ、０．００４％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、２０μＭのＡＴＰ、６５μＭのＥＧＦＲペプチド、０．２５ｎｇ／μＬのｐ３８βＭＡＰキナーゼ、４％のＤＭＳＯ。全ての例示化合物は、０．０５０μＭ未満のＩＣ_５０を有する。例えば、実施例１は、ＩＣ_５０＝０．００７μＭを有する。このアッセイは、実施例１の化合物がｐ３８βＭＡＰキナーゼの強力な阻害剤であることを実証する。

【0104】

細胞に基づくアッセイにおけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害
試験化合物の存在下にてＴＮＦαで刺激した後にｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２濃度を測定することによって、ＨｅＬａ細胞におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害をアッセイする。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）中で、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）を培養する。最終ＤＭＳＯ濃度が０．１％である、細胞培養培地における１：３希釈系列の試験化合物を調製する。アッセイでは、９６ウェルポリ−Ｄ−リシンプレートにおける１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地１００μＬに６０，０００細胞／ウェルをプレーティングする。５％ＣＯ_２インキュベータにおいて３７℃で細胞を一晩インキュベートする。次の日、プレートを反転させて培地を廃棄し、ＤＭＳＯ（対照ウェル）又は試験化合物希釈系列を含有する新鮮培地９０μＬを添加する。５％ＣＯ_２の存在下で３７℃にて１時間プレートをインキュベートする。１時間後、ヒトＴＮＦαの１００ｎｇ／ｍＬ溶液（ＤＭＥＭ／ＦＢＳで作製）２０μＬをウェルに添加し、最終濃度を１８．２ｎｇ／ｍＬにする。ＴＮＦαを受容しない対照最小シグナルウェルを除いて、全てのウェルをＴＮＦαで処理する。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ基質であるＭＡＰＫＡＰＫ−２のリン酸化を刺激するために、１５分間（３７℃／５％ＣＯ_２）ＴＮＦαと共に細胞をインキュベートする。

【0105】

ｃＥＬＩＳＡアッセイについては、プレートを反転させることにより培地を除去する。ＰＲＥＦＥＲ（登録商標）固定剤（Ａｎａｔｅｃｈ Ｌｔｄ）を添加することによって室温で３０分間細胞を固定する。０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬ（この混合物は、ＰＢＳＴであると同定される）で、細胞を各回５分間ずつ３回洗浄する。ＰＢＳＴ中０．６％のＨ_２Ｏ_２ １００μＬを１５分間かけて細胞に添加して、ペルオキシダーゼをクエンチし、次いで、再度ＰＢＳＴで各回５分間ずつ３回洗浄する。１時間かけて室温で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を添加することによって、細胞をブロックする。細胞をＰＢＳＴで各回５分間ずつ３回洗浄する。４℃で一晩、５％のＢＳＡを含有するＰＢＳＴにおいてｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ−２ Ｔｈｒ３３４に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の１／１０００希釈液と共に細胞をインキュベートする。細胞をＰＢＳＴで各回５分間ずつ３回洗浄する。二次抗体である、５％ＢＳＡを有するＰＢＳＴで１／１０００希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で細胞を室温にて１時間処理する。細胞をＰＢＳＴで各回５分間ずつ３回洗浄する。

【0106】

シグナルの検出については、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（登録商標）ＥＬＩＳＡ ｆｅｍｔｏキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用する。使用前に、等量のＦｅｍｔｏルミノール／エンハンサー及びペルオキシダーゼを混合する。各ウェルに混合物１００μＬを添加し、マイクロプレートミキサを使用して１分間振盪する。Ｖｉｃｔｏｒ １４２０照度計を使用して、相対光単位を測定する。Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｂａｓｅソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して、相対ＩＣ_５０値を測定する。全ての例示化合物は、０．０５０μＭ未満のＩＣ_５０を有する。例えば、実施例１は、ＩＣ_５０＝０．００１６μＭを有する。このアッセイは、実施例１の化合物が、癌細胞におけるｐ３８βＭＡＰキナーゼのシグナル伝達の強力な阻害剤であることを実証する。

【0107】

ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｐ３８ＭＡＰキナーゼのインビボ標的阻害（ＩＶＴＩ）
ｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ基質のためのフローサイトメトリーアッセイを使用して、試験化合物を経口投与したマウスの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のｐ３８ＭＡＰキナーゼのＩＶＴＩを測定する。

【0108】

生体相：
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）を４つの群に無作為化する。体積０．１ｍＬのビヒクル（１％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、０．２５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、０．０５％の消泡剤）を経口強制飼養することによって試験化合物を投与する。対照動物には、試験化合物を含まない０．１ｍＬのビヒクルを投与する。単回投与及び用量応答研究については、投与の２時間後に動物を屠殺する。経時的研究については、投与後の様々な時点、典型的には、１、２、４、６、１８及び２４時間後に動物を屠殺する。ＥＤＴＡでコーティングした管（ＡＱＵＩＳＥＬ）に全血を回収する。

【0109】

フローサイトメトリーによるＰＢＭＣ中のホスホ−ＭＡＰＫＡＰＫ２の検出：
１００μＬのマウス全血を各ＥＤＴＡ管に添加し、３７℃で１０分間インキュベートする。以下の染色／洗浄バッファで希釈して３つの抗体の混合物を調製する：ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＬｙ−６Ｇ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１：２５；ＡＰＣ結合ラット抗マウスＣＤ１１ｂ ｍＡｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１：１０；及びマウスＢＤ Ｆｃブロック（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１：１００。ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍＬの濃度のアニソマイシン（Ｓｉｇｍａ）原液を作製する。１５μＬのアニソマイシン原液を単一管に分注し、単回使用用に−２０℃で保存する。アッセイの日に、アニソマイシンを染色／洗浄バッファ（ＢＤ）で原液（５ｍｇ／ｍＬ）から１００μｇ／ｍＬに希釈する。等体積の希釈したアニソマイシンを抗体混合物と混合する。

【0110】

２０μＬの上記混合物を、２０秒間毎に１本、各全血管に添加する。サンプルを、穏やかに振盪しながらサーモミキサ内にて１５分間３７℃でインキュベートする。Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘバッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を水で５倍に希釈し、３７℃まで加温する。希釈したＬｙｓｅ／Ｆｉｘバッファ（＝１×作用濃度）１．６ｍＬを、上記と同じ順番で２０秒間毎に１本、各管に添加する。サンプルを振盪しながら１０分間３７℃でインキュベートする。次いで、室温で８分間６００×ｇで細胞をスピンダウンする。３ｍＬの洗浄／染色バッファ、ＰＢＳ及び５％補体除去（熱不活化）ＦＢＳで細胞を１回洗浄する。細胞ペレットの喪失を避けるために、上清を慎重に廃棄する。抗−ホスホ−ＭＡＰＫＡＰＫ−２（Ｔｈｒ３３４）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、クローン２７Ｂ）及びマウスＦｃブロックを、透過処理培地Ｂ（Ｃａｌｔａｇ）で希釈する（両方とも２５０×希釈）。２００μＬの希釈抗体ミックスを用いて細胞を再懸濁させる。

【0111】

次いで、３０分間室温で細胞をインキュベートする。次いで、３ｍＬの染色／洗浄バッファを添加し、上記の通り細胞をスピンダウンする。３ｍＬの染色／洗浄バッファを用いて洗浄を繰り返す。ヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギ免疫グロブリンＰＥコンジュゲート（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を染色／洗浄バッファで希釈する（２５０×希釈）。次いで、２００μＬの希釈抗体を各管に添加する。

【0112】

サンプルを３０分間室温でインキュベートする。次いで、３ｍＬの染色／洗浄バッファを添加し、細胞をスピンダウンする。３ｍＬの染色／洗浄バッファを用いて洗浄を繰り返す。最後に、２５０μＬのＰＢＳ＋１％補体除去（熱不活化）ＦＢＳに細胞を再懸濁させる。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ、ＢＤ）によってサンプルを分析する。側方及び前方散乱により生存可能な単一細胞集団を画定した後、ＣＤ１１ｂ^ｈｉＬｙ６Ｇ⁻によって画定（ゲート化）した単球集団におけるｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２濃度を測定する。

【0113】

データ解析：
単球細胞における中央蛍光強度を分析して、ｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２の濃度を求める。ビヒクル対照動物に由来するアニソマイシンで刺激したｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２（ｐＭＫ２）濃度から刺激されていない単球のｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２（ｐＭＫ２）濃度を減じて、シグナルウインドウを求める。以下の等式を使用することによって、試験化合物による阻害率（％）を求める：

【数1】

【0114】

このプロトコールを使用したところ、実施例１の化合物に関する７０％阻害の閾値有効用量（ＴＥＤ_７０）は、投与後２時間において５．１ｍｇ／ｋｇである。同じアッセイにおいて血漿中を循環している化合物を測定することにより求められる７０％阻害の閾値有効用量（ＴＥＤ_７０）は、投与後２時間において３９．４ｎｇ／ｍＬ（０．０８４μＭ）である。このアッセイは、実施例１の化合物がインビボで強力な活性を有することを実証する。

【0115】

腫瘍を有するマウスにおけるｐ３８ＭＡＰキナーゼのインビボ阻害
ヒト腫瘍細胞株Ｕ８７ＭＧを利用するマウス異種移植モデルを、腫瘍におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの阻害の評価に使用する。

【0116】

生体相：
雌の無胸腺ヌードマウス（２４〜２６ｇ、Ｈａｒｌａｎ）に、動物１匹当たり５×１０^６個のＵ８７ＭＧ細胞をひ腹に皮下注射する。細胞培養培地及びＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリクスの１：１混合物（体積０．２ｍＬ）を細胞に注入する。移植の７日後に、ノギスを使用して腫瘍を測定し、データを記録する。その後１週間に２回腫瘍を測定し、腫瘍サイズを記録する。腫瘍の平均体積が約２５０ｍｍ^３に達したら（通常、移植後１０〜１５日）、動物を処理のために８〜１０群に無作為化する。次いで、０．２ｍＬのビヒクル（１％のＨＥＣ、０．２５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、０．０５％の消泡剤）のみ又は試験化合物を含有するビヒクルを動物に経口投与する。投与の２時間後に、動物を安楽死させる。腫瘍を切除し、完全プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤のカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｔａｂｌｅｔｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ．カタログ番号１１８７３５８０００１）を含む１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００溶液中でホモジナイズすることによって直ちに処理する。更に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）でコーティングした管に血液を回収し、曝露分析用の９６ウェルプレートフォーマット中で血漿を生じさせる。

【0117】

腫瘍溶解物におけるｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２アッセイ：
Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）捕捉ＥＬＩＳＡキット（２ホスホ−ＭＡＰＫＡＰＫ−２（Ｔｈｒ３３４））を使用して、腫瘍溶解物におけるｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２濃度を測定する。ＢｉｏＲａｄ ＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、溶解物におけるタンパク質の濃度を測定する。１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００溶液を使用して、各腫瘍溶解物由来のタンパク質サンプルを２ｍｇ／ｍＬに調整する。ｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２のメソスケール検出については、捕捉抗体（＝全ＭＡＰＫＡＰＫ２タンパク質に対する抗体）を予めスポットした炭素電極を含有する９６ウェルプレートに腫瘍溶解物５０μｇを添加する。ルテニウム標識抗ｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２検出抗体を使用して、ｐ−ＭＡＰＫＡＰＫ２濃度を調べる。検出抗体と共にインキュベートした後、ＭＳＤプレートを洗浄し、次いで、ＭＳＤ読取りバッファを添加する。電極に電流を流した後、電気化学発光により光を発生させ、これをＭＳＤセクター６０００機器を使用して定量する。各研究について、ビヒクル対照群に対して阻害率（％）を計算し、統計的有意差を求めるためにＪＭＰソフトウェアパッケージを使用して分散分析（分散の統計分析を計算する手段）を実施する。例示的な研究においてイムノブロットによって分析を検証する。この研究から、実施例１の化合物は、腫瘍におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼ標的阻害のＴＥＤ_７０が２．９ｍｇ／ｋｇであり、ＴＥＣ_７０が３１．３ｎｇ／ｍＬであると求められる。このデータは、実施例１の化合物については、腫瘍における標的阻害効力が、ＰＢＭＣにおける標的阻害効力と同程度であることを実証する。

【0118】

異種移植モデルにおけるインビボ有効性の決定
Ａ２７８０異種移植モデル：
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから約２２〜２５ｇの雌のＣＤ１ ｎｕ／ｎｕマウスを入手する。１週間の環境順化後、細胞培養培地及びＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリクスの１：１混合物（体積０．２ｍＬ）中２×１０^６個のＡ２７８０ヒト卵巣癌細胞を各マウスのひ腹に皮下注射する。１週間に２回ノギスで測定することによって、腫瘍サイズをモニタする。平均腫瘍サイズが１５０ｍｍ^３に達したら、動物を１０群に無作為化する。無作為化後、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤処理を開始する。１％のＨＥＣ、０．２５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、０．０５％の消泡剤（ＨＥＣ／ＴＷＥＥＮ（登録商標））（体積０．２ｍＬ）中の実施例２を経口投与する。１、３及び１０ｍｇ／ｋｇの用量で化合物を投与する。４日間投与し、３日間投与しないというスケジュールで１日３回（ＴＩＤ）投与を行う。３サイクルの投与を行う。投与期間中１週間に２回腫瘍体積をモニタし、ビヒクル対照群（ｎ＝１０動物）に対する有効性（腫瘍増殖阻害）をモニタする。最後にｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を投与した１、２及び８時間後、動物から血漿を採取して、動物における化合物の血中濃度を測定する。

【0119】

【表6】

【0120】

ＯＰＭ−２多発性骨髄腫異種移植モデル：
Ｔａｃｏｎｉｃから体重２０〜２２ｇの雌のＣＢ−１７ ＳＣＩＤマウスを入手する。１週間の環境順化後、２．５グレイの線量をマウスに照射する。照射後２４時間以内に、細胞培養培地及びＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリクスの１：１混合物（体積０．２ｍＬ）中１．０×１０^７個のＯＰＭ−２細胞をマウスのひ腹に皮下注射する。１週間に２回ノギスで測定することによって、腫瘍サイズをモニタする。平均腫瘍サイズが１００〜１５０ｍｍ^３に達したら、動物を用量群に無作為化する。無作為化後に化合物処理を開始する。１％のＨＥＣ、０．２５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、０．０５％の消泡剤（ＨＥＣ／ＴＷＥＥＮ（登録商標））（体積０．２ｍＬ）中の実施例２を経口投与する。１５及び３０ｍｇ／ｋｇの用量で化合物を投与する。２８日間の処理期間にわたって、１日２回（ＢＩＤ）投与を行う。投与期間中１週間に２回腫瘍体積をモニタし、ビヒクル対照群（ｎ＝１０動物）に対する有効性（腫瘍増殖阻害）をモニタする。

【0121】

【表7】

【0122】

スニチニブと組合せた７８６−Ｏ異種移植モデル：
Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓから体重２４〜２６ｇの雌の無胸腺ヌードマウスを入手する。１週間の環境順化後、細胞培養培地及びＢＤ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリクスの１：１混合物（体積０．２ｍＬ）５×１０^６個の７８６−Ｏヒト腎臓細胞癌細胞を各マウスのひ腹に皮下注射する。１週間に２回ノギスで測定することによって、腫瘍サイズをモニタする。平均腫瘍体積が１５０〜２００ｍｍ^３に達したら、動物を８〜１０群に無作為化する。無作為化後、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤処理を開始する。１％のＨＥＣ、０．２５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、０．０５％の消泡剤（ＨＥＣ／ＴＷＥＥＮ（登録商標））（体積０．２ｍＬ）中において化合物を経口投与する。単独で又は１０ｍｇ／ｋｇ若しくは２０ｍｇ／ｋｇのスニチニブと組み合わせて１５ｍｇ／ｋｇで１日２回（ＢＩＤ）投与を行い、また、同じビヒクルをＢＩＤで経口投与する。１週間に２回腫瘍体積をモニタし、ビヒクル処理対照動物と有効性（腫瘍増殖阻害）を比較する。

【0123】

【表8】

【0124】

この研究から得られるデータは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害（１５ｍｇ／ｋｇをＢＩＤ）が、２０ｍｇ／ｋｇで投与したスニチニブの抗腫瘍効果を増強することを実証する。対数腫瘍体積対時間において二元配置反復測定分散分析を使用して、相乗効果の統計評価を行った。この分析は、１５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤのｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤と２０ｍｇ／ｋｇのＢＩＤのスニチニブとの間の全体的に有意な相乗効果（ｐ＞０．０００１）を実証した。

【0125】

本発明の化合物は、様々な経路で投与される医薬組成物として処方されることが好ましい。最も好ましくは、このような組成物は、経口又は静脈内投与用である。このような医薬組成物及びそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ｄ．Ｔｒｏｙら編，第２１版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５年）を参照されたい。

【0126】

本発明の化合物は、一般的に、広い用量域にわたって有効である。例えば、１日当たりの投与量は、通常約１４〜１５５ｍｇの範囲内である。場合によっては、前述の範囲の下限よりも少ない投与量レベルがより適切である場合もあるが、他の場合、任意の有害な副作用を引き起こさずに更に多い投与量を使用する場合もあるので、上記投与量範囲は、いかなる方法であっても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。実際に投与される化合物の量は、治療される状態、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、並びに患者の症状の重篤度を含む関連状況を鑑みて医師によって決定されることが理解されるであろう。