特許 5726417 組み換え抗上皮成長因子受容体抗体組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726417

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年6月3日

(54)【発明の名称】組み換え抗上皮成長因子受容体抗体組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20150514BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150514BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150514BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150514BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150514BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28

   C12N15/00 AZNA

   C07K19/00

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   !C12P21/08

【請求項の数】22

【全頁数】106

(21)【出願番号】特願2009-551102(P2009-551102)

(86)(22)【出願日】2008年2月27日

(65)【公表番号】特表2010-535012(P2010-535012A)

(43)【公表日】2010年11月18日

(86)【国際出願番号】DK2008050047

(87)【国際公開番号】WO2008104183

(87)【国際公開日】20080904

【審査請求日】2011年2月22日

(31)【優先権主張番号】PA200700317

(32)【優先日】2007年3月1日

(33)【優先権主張国】DK

(31)【優先権主張番号】60/904,773

(32)【優先日】2007年3月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】PA200701016

(32)【優先日】2007年7月10日

(33)【優先権主張国】DK

(31)【優先権主張番号】60/929,727

(32)【優先日】2007年7月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】505257682

【氏名又は名称】シムフォゲン・アクティーゼルスカブ

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＭＰＨＯＧＥＮ Ａ／Ｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100156100

【弁理士】

【氏名又は名称】西野 満

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】ミッケル・ワンダール・ペダーセン

(72)【発明者】

【氏名】ルシーラ・ステイナー

(72)【発明者】

【氏名】アラン・イェンセン

(72)【発明者】

【氏名】クラウス・ケーフェーズ

(72)【発明者】

【氏名】ペール−ヨハン・メイヤー

(72)【発明者】

【氏名】ロベルト・カールソン

(72)【発明者】

【氏名】チャールズ・パイク

(72)【発明者】

【氏名】ラース・セゴー・ニールセン

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０５５４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／００５８７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／００９０６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ＢＢＲＣ，２００６年，Vol.349, p.816-824

【文献】 ＰＮＡＳ，２００５年，Vol.102, p.1915-1920

【文献】 Clinical cancer research，２００２年，Vol.8, p.1720-1730

【文献】 Clinical cancer research，２００５年，Vol.11，p.6390-6399

【文献】 BioTechniques ，２００３年，Vol.34 No.5 Page.968-970,972

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の抗−ヒトＥＧＦＲ抗体分子および第２の別個の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる抗体組成物であって、
ａ）該第１の抗−ＥＧＦＲ抗体分子が配列番号４０における重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号７２における軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、
ｂ）該第２の抗−ＥＧＦＲ抗体分子が配列番号４１における重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号７３における軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、組成物。

【請求項2】

請求項１記載の組成物であって、
ａ）第１の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、配列番号４０のアミノ酸３〜１２４を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および配列番号７２のアミノ酸３〜１０９を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、および
ｂ）第２の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、配列番号４１のアミノ酸３〜１２０を含むＶＨおよび配列番号７３のアミノ酸３〜１１４を含むＶＬを含む、組成物。

【請求項3】

請求項１記載の組成物であって、
ａ）第１の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、配列番号４０のアミノ酸３〜１２４を含むＶＨおよび配列番号９１のアミノ酸配列を含む定常領域を有する重鎖を含み、および配列番号７２のアミノ酸３〜２１６を含む軽鎖を有し；および
ｂ）第２の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、配列番号４１のアミノ酸３〜１２０を含むＶＨおよび配列番号９１のアミノ酸配列を含む定常領域を有する重鎖を含み、および配列番号７３のアミノ酸３〜２２１を含む軽鎖を有する、組成物。

【請求項4】

第１および第２の抗−ＥＧＦＲ抗体分子が各々のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害しない、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。

【請求項5】

抗体分子の少なくとも１つがヒトＥＧＦＲに関する他の抗体分子の最大結合能を増加させることができる、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。

【請求項6】

組成物中における第２の抗体分子に対する第１の抗体分子の割合が、４０〜６０％である、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。

【請求項7】

組成物中における第２の抗体分子に対する第１の抗体分子の割合が１：１である、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。

【請求項8】

第１および第２の抗体分子がアイソタイプサブタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２である、請求項１、２および４〜７のいずれか１項記載の組成物。

【請求項9】

受容体内在化をもたらすことができる、請求項１〜８のいずれか１項記載の組成物。

【請求項10】

イン・ビボでＡ４３１ＮＳ腫瘍の退行をもたらすことができる、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。

【請求項11】

イン・ビボでＡ４３１ＮＳ細胞の最終分化を誘導することができる、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。

【請求項12】

イン・ビボで腫瘍インボルクリン発現を上方調節することができる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物。

【請求項13】

配列番号４０における重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号７２における軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列、および配列番号４１における重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに配列番号７３における軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、ヒトＥＧＦＲの２つの別個のエピトープに結合する二重特異性結合分子。

【請求項14】

二重可変ドメイン抗体、二重特異性Ｆａｂフラグメント、または二重特異性ｓｃＦｖである、請求項１３記載の二重特異性結合分子。

【請求項15】

ヒトにおける癌に関連した１以上の症状の治療、改善または予防のための医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物。

【請求項16】

ＥＧＦＲシグナリングを減少させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導するための、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害するための、イン・ビボで腫瘍細胞の分化を誘導するための、および／またはＥＧＦＲの内在化を誘導するための医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物。

【請求項17】

ヒトにおける癌に関連した１以上の症状の治療、改善または予防のための医薬として使用するための、請求項１３または１４記載の二重特異性結合分子。

【請求項18】

ＥＧＦＲシグナリングを減少させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導するための、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害するための、イン・ビボで腫瘍細胞の分化を誘導するための、および／またはＥＧＦＲの内在化を誘導するための医薬として使用するための、請求項１３または１４記載の二重特異性結合分子。

【請求項19】

請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物または請求項１３または１４記載の二重特異性結合分子、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項20】

ヒトにおける癌に関連した１以上の症状の治療、改善または予防のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物、または請求項１３または１４記載の二重特異性結合分子を含む医薬組成物。

【請求項21】

ＥＧＦＲシグナリングを減少させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させるための、ＥＧＦＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導するための、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害するための、イン・ビボで腫瘍細胞の分化を誘導するための、および／またはＥＧＦＲの内在化を誘導するための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物、または請求項１３または１４記載の二重特異性結合分子を含む医薬組成物。

【請求項22】

請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体組成物を含むキットであって、同時、連続的または別々に投与するために、該抗体分子が１つの容器または別々の容器に処方されている、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト癌療法に使用するための組み換え抗体の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、細胞増殖、ならびにアポトーシス、血管新生および転移、腫瘍の進行に極めて重要なプロセスにおいて重要な役割を果たす（非特許文献１〜５）。実際に、研究により、ＥＧＦＲ仲介細胞増殖が、非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および頭頚部の腫瘍を含む多様な固形腫瘍において増加することが示されている（非特許文献１）。さらに加えて、癌細胞表面におけるＥＧＦＲの過度の活性化は、進行疾患、転移性表現型の進展、および癌患者の予後不良に関連することが現在知られている（非特許文献１）。

【0003】

さらに加えて、ＥＧＦＲ発現は、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞によるＥＧＦＲ−リガンド、ＴＧＦ−αおよびＥＧＦの産生によって頻回に達成され、これは、自己分泌ループがこれらの細胞の進行に加わることを示唆する（非特許文献６および７）。従って、そのようなＥＧＦＲリガンドとＥＧＦＲとの間の相互作用を遮断すると、腫瘍の増殖および生存を阻害することができる（非特許文献６）。

【0004】

ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤａの分子量を伴う膜結合性糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、短い２３アミノ酸膜貫通リンカーによって接続されたグリコシル化外部リガンド結合ドメイン（６２１残基）および細胞質ドメイン（５４２残基）よりなる。ＥＧＦＲの細胞外部分は、２５個のジスルフィド結合および１２個のＮ−結合型グリコシル化部位を含有し、一般的に、４つのサブドメインよりなると考えられる。ＥＧＦＲのＸ線結晶構造により、受容体は、ＥＧＦに結合することができない自己阻害型繋留型コンホメーション（非特許文献８）ならびにＥＧＦリガンド結合および受容体二量体形成を仲介する活性なコンホメーション（非特許文献９および１０）の両方を採用することが示唆されている。特に、ドメインＩおよびドメインＩＩＩは、高いアフィニティーのリガンド結合部位の形成のための付加的な寄与を提供することが示唆されている。ドメインＩＩおよびＩＶは、タンパク質フォールディングを安定化し、そして可能なＥＧＦＲ二量体化形成面を含有するシステインリッチラミニン様領域である。

【0005】

ＥＧＦＲは、細胞表面の異なる多くのコンホメーションに存在することが公知であり、ここで、繋留またはロックされたコンホメーションが最も頻繁に認められる。繋留型コンホメーションは、二量体形成することができず、従って、不活性である。治療用抗体Erbituxは、ドメインＩＩＩに結合し、そして受容体が非繋留状態に到達することを立体的に妨げることによって、繋留型コンホメーションを安定化することが公知である。しかし、いくつかの受容体はなお、非繋留型コンホメーションを採用し、リガンドに結合し、そして二量体形成することが可能であり得る。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、典型的に、コンホメーションのうちの１つに対する結合においてのみ効果的であり、従って、他のコンホメーションを呈する癌細胞または多様なコンホメーションを呈する癌細胞を効果的に標的にすることができない。

【0006】

ＥＧＦＲのリガンド結合ドメインに対して指向されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ＥＧＦＲリガンドとの相互作用、同時に、得られる細胞内シグナル伝達経路を遮断することができる。

【0007】

Erbitux^TM（セツキシマブ）は、ヒト（ＥＧＦＲ）の細胞外ドメインに特異的に結合する組み換え、ヒト／マウスキメラモノクローナル抗体である。Erbituxは、ヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖定常領域を伴うマウス抗ＥＧＦＲ抗体のＦｖ領域からなり、そして約１５２ｋＤａの分子量を有する。Erbituxは、哺乳動物細胞培養物（マウス骨髄腫）において産生される。Erbituxは、転移性大腸癌を患い、その腫瘍がＥＧＦＲを発現する患者の治療に関して承認されている。加えて、Erbituxは、手術によって取り出すことができない頭頚部の扁平細胞癌を伴う患者を処置するための照射療法との組み合わせで、または標準的な白金に基づく療法が奏効していない頭頚部の扁平細胞癌の第２選択治療として、使用される。

【0008】

Vectibix^TM（パニツムマブ）は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する組み換えヒトＩｇＧ２κモノクローナル抗体である。Vectibixは、約１４７ｋＤａの分子量を有する。パニツムマブは、遺伝子操作された哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣）において産生される。Vectibixは、フルオロピリミジン含有、オキサリプラチン含有、およびイリノテカン含有化学療法レジメン時または後に疾患の進行を伴う転移性大腸癌を伴う患者（その腫瘍はＥＧＦＲを発現する）の治療に関して承認されている。

【0009】

多くの変異ＥＧＦ受容体が、ヒト腫瘍細胞において同定されている。これらは、受容体活性をリガンド結合から非依存的にし（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、増強された腫瘍形成能をもたらしうる。変異ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体を作製してもよいが、そのようなモノクローナル抗体は、非変異型ＥＧＦＲに対して必ずしも効果的ではない。

【0010】

ＥＧＦＲに対して指向された化学療法に対する応答に影響するＥＧＦＲの変異がヒト癌患者において同定されている。特許文献１（Novartis）は、ＥＧＦＲオープンリーディングフレームにおける４３個の変異ならびに１８個のＳＮＰを開示した。いくつかのミスセンス変異が、腫瘍タイプのうち２つもしくはそれ以上のタイプにおいて同定されている。特許文献２（Amgen）は、様々な癌細胞において同定されたさらなる８つの変異を開示した。これらの変異のうち１つもしくはそれ以上は、エピトープに局在し得るか、または現在承認されているモノクローナル抗体のうちの１つに結合するエピトープの構造に影響を及ぼし得る。そのような変異を保有する患者は、モノクローナル抗体で治療することができない。

【0011】

さらに加えて、グリコシル化部位のうち少なくとも１つのグリコシル化における異質性を示す文献の報告がある（非特許文献１１および１２）。そのような異質性は、腫瘍細胞の間で変動するエピトープの異なる暴露における直接的または間接的結果であり得る。

【0012】

抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）は、抗体が腫瘍細胞の死滅を仲介する代替的機構である。ＡＤＣＣのレベルは、ＩｇＧサブタイプ（ＩｇＭ＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２）、標的細胞に対する抗体密度、抗体グリコシル化パターン、ならびに標的自体の特性を含むいくらかの因子に依存する。

【0013】

Friedmannら（非特許文献１３）は、別々のＥＧＦＲエピトープに結合することによってＥＧＦＲに結合するＥＧＦを阻害するそれらの能力について選択される２つのマウスモノクローナル抗体が、ＥＧＦＲを一過的に発現するＫＢ細胞およびＣＨＯ細胞において受容体発現を相乗的に下方調節することが可能であることを示している。交差競合的ＥＧＦ阻害抗体は、何ら相乗効果を示さなかった。

【0014】

Modjtahediら（非特許文献１４）は、重複しないエピトープを有するいくつかのラット抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせを試験した。抗体は異なるアイソタイプからなる。すべての場合において、２つの抗体を使用する効果は、類似量の２つのモノクローナル抗体を単独で使用する効果の中間であった。これは、インビボおよびインビトロの両方において確認された。

【0015】

特許文献３（Merck Patent）は、２つのモノクローナル抗体、Ｍａｂ４２５およびＭａｂ２２５（セツキシマブ）の併用は、類似量のモノクローナル抗体単独のそれぞれと比較して、ＥＧＦＲ発現癌細胞の表面に結合した抗体の増加量を生じることを開示する。この刊行物はまた、２つのモノクローナル抗体と比較して抗体の組み合わせを用いる場合、ＥＧＦＲの下方調節の増加を開示する。

【0016】

Pereraら（非特許文献１５）は、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７異種移植片を保有するマウスを、２つのマウスモノクローナル抗体の組み合わせで処置することの相乗効果について開示した。抗体のうちの１つ（ｍＡｂ５２８）は、セツキシマブに類似の特異性で、全てのＥＧＦＲサブタイプに結合する。もう１つの抗体（ｍＡＢ８０６）は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲにのみ結合する。Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７細胞系統は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲがトランスフェクトされた細胞系統である。Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ細胞系統は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲのキナーゼ不活性変種を発現する。Ｕ８７ＭＧ．ＤＫ異種移植片を保有するマウスに対して２つの抗体が用いられた場合、相乗効果は観察されなかった。野生型ＥＧＦＲを発現するＡ４３１細胞系統を有する異種移植モデルでは、著者らは、相乗効果の証拠を提供しなかった。ｄｅ２−７ＥＧＦＲは、神経膠腫、ある程度で乳癌および肺癌のごとく限られた数の癌タイプにおいてのみ存在する。

【0017】

これらの研究は、場合により、相乗効果が２つのマウスモノクローナル抗体間に存在し得ることを示した一方、それらはまた、多くの場合、相乗効果が認めらないことを示す。この研究はまた、広範な臨床に関連する癌細胞系統に対して有効な抗ＥＧＦＲ抗体組成物を提供していない。

【0018】

従って、低用量で投与した場合、ＥＧＦＲの過剰発現に関連する疾患を治療および／または防止するのに有効なＥＧＦＲに対する治療用抗体の改善の必要性が存在する。問題の癌細胞によって発現されるＥＧＦＲの構造について熟知していなくても使用することができる広範に適用可能な治療用癌−抗体の必要性も存在する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【特許文献1】WO 2006/110478

【特許文献2】WO 2006/091899

【特許文献3】WO 2004/032960

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Salomon DS et al, Critical Reviews in Oncology/Haematology, 19:183-232 (1995)

【非特許文献2】Wu et al, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)

【非特許文献3】Karnes et al, Gastroenterology, 114:930-939 (1998)

【非特許文献4】Woodburn et al, Pharmacol. Therap. 82: 241-250 (1999)

【非特許文献5】Price et al, Eur. J. Cancer, 32A:1977-1982 (1996)

【非特許文献6】Baselga, etal.(1994) Pharmac. Therapeut. 64: 127-154

【非特許文献7】Modjtahedi, et al. (1994) Int. J. Oncology. 4: 277-296

【非特許文献8】Ferguson et al, Mol Cell, 2003, vol 11: 507-517

【非特許文献9】Garret et al, Cell 2002, vol 110:763-773

【非特許文献10】Ogiso et al, Cell, 2002, vol 110:775-787

【非特許文献11】Whitson et al., 2005 Biochemistry 44:14920-31

【非特許文献12】Zhen et al. 2003 Biochemistry 42; 5478-92

【非特許文献13】PNAS 2005, 102:1915-20

【非特許文献14】Cell Biophysics vol 22, 1993, 129-146

【非特許文献15】Clin Cancer Res 2005;11(17):6390-99

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0021】

一態様では、本発明は、抗体がＥＧＦＲの別々の第１、第２および第３のエピトープに結合する、少なくとも３つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる組み換え抗体組成物に関する。

【0022】

さらなる態様では、本発明は、１つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体：９９２、１０２４、１０３０、１０４２、１２０８、１２２９、１２５４、１２５７、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４、１３０８、１３２０、１３４４、および１３４７、またはこれらの抗体のＣＤＲを有する抗体よりなる群から選択される、少なくとも２つの別々のＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる組み換え抗体組成物に関する。

【0023】

好ましくは、少なくとも１つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体９９２、１０３０、１０２４、１３４７、１２７７、１２５４、１３２０、１２６０、１２６１、および１２８４またはこれらの抗体のＣＤＲを有する抗体よりなる群から選択される。本発明の特定の好適な実施形態では、抗体組成物は、抗体９９２および１０２４、またはそれらのＣＤＲ３配列、もしくはそれらのＶＬおよびＶＨ配列に基づく２つの抗体を含んでなるか、あるいは、本質的に同じ結合特異性を伴う２つの抗体を含んでなる。

【0024】

本発明の代表的な抗体組成物は、代表的な癌細胞系統の増殖の阻害において有効であることを証明し、癌の治療においてインビボ使用を示す。これらの結果は、癌細胞が腫瘍を形成するインビボでの状況をさらに表現し得る癌細胞スフェロイドを用いるアッセイにおいて確認された。さらに加えて、本発明の抗体組成物は、癌スフェロイドからの細胞運動性を減少させ、それにより転移する傾向を減少させるようである。異種移植モデルにおけるインビボでの効力もまた、代表的な抗体組成物によって実証した。これらの結果は、抗体９９２および１０２４よりなる特に好適な抗体組成物によって確認された。

【0025】

マウスにおけるヒト癌の異種移植モデルでは、本発明の代表的な抗体組成物は、市販のモノクローナル抗体、VectibixおよびErbituxと比較して、腫瘍細胞のより高い程度の最終分化を有意に生じた。本発明の好適な抗体組成物は、本発明の抗体組成物による処置の終結後、腫瘍の再生が観察されなかったので、モノクローナル抗体と比較して、異なる作用機序を介して作用するようである。モノクローナル抗体による処置の終結後、腫瘍の再生が観察される。

【0026】

結合性実験では、本発明者らは、本出願によって提供される抗体のいくつかは、さらなる抗体の結合を容易にし、それによって、受容体に結合する抗体の総量を増加させるようであることを実証した。３つのドメインＩＩＩ抗体への結合がさらなる抗体の後の結合を容易にすることも実証した。これらの観察は、抗体がＥＧＦＲの別々の第１、第２および第３のエピトープに結合する、少なくとも３つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を伴う組成物を使用する概念を明確に支持する。この効果はまた、この特定の効果を提供する抗体を選択することによる本発明の２つの抗体の特定の組み合わせを使用することによっても得ることができる。そのような抗体は、他の抗体と混合するための好適な候補である。

【0027】

本発明の組成物は、いくつかのさらなる利点を提供し得る。癌細胞は、多様なＥＧＦＲを発現する。コンホメーション、グリコシル化ならびに一次構造（変異およびＳＮＰ）の変動が認められる。単一のモノクローナル抗体は、これらのＥＧＦＲ変動のうちのすべてではないがいくつかを標的とし得る。ＥＧＦＲ変異は、モノクローナル抗体に対するエスケープ変異であってもよい。本発明の２つの抗体または別々のＥＧＦＲエピトープに結合する３つもしくはそれ以上の別々の抗体を含んでなる抗体は、変異、ＳＮＰ、欠失変異およびグリコシル化の変動の影響をそれほど受けない。これは、多様なＥＧＦＲコンホメーションおよび変動を表すヒト癌細胞系統のパネルに対する本発明の抗体混合物の広範な効力によって立証される。

【0028】

１つのモノクローナル抗体の投与もまた、ＥＧＦＲのキナーゼ活性を完全には抑制することができない。シグナリングのより効率的な阻害は、抗体の組み合わせによって達成され得る。

【0029】

従って、抗体混合物において異なるＥＧＦＲコンホメーション（例えば、非繋留型コンホメーションおよび受容体二量体）に結合する抗体を含むことは有益であり得る。かかる抗体の混合物は、コンホメーションのうちただ１つにのみ結合するモノクローナル抗体よりＥＧＦＲ活性を阻害するのにより強力であり得る。

【0030】

さらに、組成物中の３つもしくはそれ以上の抗ＥＧＦＲ抗体によるアプローチを使用することによって、腫瘍細胞表面に対する抗体の密度を上昇させ、それによって、モノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＣを介する死滅を増加させることが可能であり得る。

【0031】

さらなる態様において、本発明は、以下の工程を含む抗体組成物を製造するための方法に関する：
ａ）第１の別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の第１の同族ペアを含んでなる第１の抗体をコードする第１の発現構築物で真核細胞の第１の集団をトランスフェクトすること；
ｂ）第２の別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の第２の同族ペアを含んでなる第２の抗体をコードする第２の発現構築物で真核細胞の第２の集団をトランスフェクトすること；
ｃ）任意選択的に、第３のまたはさらなる集団、発現構築物、同族ペア、およびＥＧＦＲエピトープについて工程ｂ）を反復すること；
ｄ）トランスフェクトされた第１、第２集団および任意選択的にさらなる細胞集団を選択すること；
ｅ）トランスフェクトされた集団を１つのポット中で混合して細胞バンクを得ること；
ｆ）抗体の発現を可能にする条件下で細胞バンク由来の細胞を培養すること；次いで
ｇ）上清から抗体組成物を回収し、精製すること。

【0032】

製造、下流プロセシングおよび特徴付けの容易のために、すべての抗体は、同じ重鎖定常領域を含んでなる。

【0033】

さらなる態様では、本発明は、真核細胞の少なくとも２つのサブ集団を含む細胞バンクに関し、各サブ集団は、別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の同族ペアを含んでなる抗体をコードする１つの発現構築物でトランスフェクトまたは形質導入される。好ましくは、細胞は、部位特異的組み込みを使用してトランスフェクトされる。

【0034】

さらに加えて、本発明は、ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、本発明の抗体組成物を投与し、次いでＥＧＦＲシグナリングを減少させることを含んでなる、ＥＧＦＲシグナリングを減少させる方法に関する。

【0035】

本発明はまた、ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、本発明の抗体組成物を投与し、次いでＥＧＦＲ発現細胞を死滅させることを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させる方法に関する。

【0036】

ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に本発明の抗体組成物を投与し、それによって、アポトーシスを誘導することを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する方法もまた、提供される。

【0037】

さらなる態様は、ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に本発明の抗体組成物を投与し、それによって、増殖を阻害することを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する方法に関する。

【0038】

本発明は、癌を患う個体に本発明の抗体組成物を投与し、それによって、腫瘍細胞の分化を誘導することを含んでなる、インビボで腫瘍細胞の分化を誘導する方法に関する。本態様は、本発明の抗体組成物に暴露される場合の癌細胞のインビボでの最終分化に対して観察される効果に基づく。

【0039】

さらなる態様では、本発明は、癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして、本発明の抗体組成物、および癌細胞の分化を誘導することが可能な少なくとも１つの化合物を含んでなる医薬物品に関する。本発明の抗体組成物と、癌細胞の最終分化を誘導することが公知の薬剤とを組み合わせることによって、さらに効果を改善することができる。

【0040】

なおさらなる態様では、本発明は、癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして、本発明の抗体組成物、および少なくとも１つの化学療法化合物または抗悪性腫瘍化合物を含んでなる医薬物品に関する。本発明の抗体組成物は、第２選択治療、即ち、従来の化学療法剤もしくは抗悪性腫瘍剤を使用する治療の後または同時に、あるいは照射療法および／または手術の後または同時に使用することができる可能性がある。

【0041】

別の態様では、図２３に示す核酸配列（配列番号１００）を有する核酸；図２３に示すアミノ酸配列（配列番号１０１）を有するポリペプチドをコードする核酸；図３４Ａに示す核酸配列（配列番号１０２）を有する核酸；および図３４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１０３）を有するポリペプチドをコードする核酸よりなる群から選択されるポリヌクレオチドが提供される。さらに加えて、図２３に示すアミノ酸配列（配列番号１０１）を含んでなるポリペプチド、および図３４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号１０３）を含んでなるポリペプチド、前記核酸の発現を指令することが可能なプロモーター配列に作動可能に連結された上記で規定した前記核酸を含んでなる発現ベクター、ならびに前記発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞が提供される。

【0042】

これらの配列は、カニクイザルＥＧＦＲ（即ちカニクイザル（Macaca fascicularis）由来）のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を構成する。この種のサルは、毒物学研究のために広範に使用されている動物である。ヒト自己抗原に対する抗体に関与する毒物学研究において重要であるべき動物種では、抗体はまた、好ましくは、ほぼ同じアフィニティーを伴ってｔｏｘ−動物の標的タンパク質に結合することが必須である。カニクイザルＥＧＦＲへの結合について抗体を試験することが、本発明者らの寄与によって、今回可能になった。カニクイザルおよびヒトＥＧＦＲは、高度に相同なタンパク質であるが、驚くべきことに、ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲに対して非常に異なるアフィニティーを有する多くの抗体が見出されている。このことは、本発明者らによって提供されているスクリーニングのための正確なカニクイザルＥＧＦＲタンパク質を使用することの重要性を強調している。

【0043】

さらに、以下の工程を含んでなる、カニクイザルＥＧＦＲへの結合について抗体をスクリーニングするための方法が提供される。
−少なくとも１つの試験抗体を提供すること；
−カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメイン（図２３、配列番号１０１））もしくは全長カニクイザルＥＧＦＲ（図３４Ｂ、配列番号１０３））；またはカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを発現するか、もしくは全長カニクイザルＥＧＦＲを発現する細胞の表面に結合する抗体を決定するためのアッセイを実施すること；
−次いで、カニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する少なくとも１つの抗体を選択すること。

【0044】

本発明は、ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合またはヒトＥＧＦＲを発現する細胞への結合についてスクリーニングすることをさらに含んでなり得る。

【0045】

さらなる態様では、本発明は、ＥＧＦＲに対する別の抗ＥＧＦＲ抗体の同時結合を増強することが可能な抗ＥＧＦＲ抗体を同定するための方法に関し、前記方法は以下を含んでなる。
ａ．第１のアッセイにおいて、一定量のＥＧＦＲ抗原に関して第１の抗体の最大結合能を決定すること、
ｂ．第２のアッセイにおいて、一定量のＥＧＦＲ抗原を第２の抗ＥＧＦＲ抗体で飽和すること、
ｃ．ＥＧＦＲ−抗体複合体と、前記第１の抗体とを接触させ、最大結合能を決定すること、次いで
ｄ．結合能を比較して、工程ｃの最大結合能が工程ａの最大結合能を超えるかどうかを決定すること。

【0046】

このアッセイを使用して、抗体９９２および１０２４の特性に類似の特性を有する抗体のさらなる組み合わせを同定してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】脾細胞の選別（詳細については、実施例１を参照のこと）。以下のゲートが作製される（図示されている）：・ゲート１：生存細胞（ＦＳＣ／ヨウ化プロピジウムプロット）。（左下のパネル）・ゲート２：形質細胞は、ＣＤ４３ポジティブ／ＣＤ１３８ポジティブとしてゲートされる。（右下のパネル）・ゲート３：ダブレット識別（右上のパネル）

【図2】マウス−mSymplex^TMＰＣＲ。単一細胞由来の重鎖および軽鎖抗体遺伝子の増幅ならびに同族連結のための多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ。詳細については、実施例１を参照のこと。

【図3】マウスレパートリークローニング。単一の形質細胞由来のＶＨ／ＶＬ遺伝子対をコードするmSymplex^TMＰＣＲ産物のプールを、重複伸長によるスプライシングによりヒトκ定常軽鎖をコードする遺伝子にスプライシングした。完全なヒト−マウスキメラ抗体をコードする遺伝子のプールを、発現ベクターに挿入し、続いて、両方向性プロモーターカセット（２×ＣＭＶ）を挿入した。

【図4】哺乳動物の全長抗体発現ベクター００−ＶＰ−００２の模式図。ＡｍｐおよびＡｍｐ ｐｒｏ、アンピシリン耐性遺伝子およびそのプロモーター；ｐＵＣ起点、ｐＵＣの複製開始点；ＣＭＶ、軽鎖および重鎖の発現を誘導する哺乳動物プロモーター；ＩＧＨＶリーダー、ゲノムヒト重鎖リーダー、Ｈスタッファー、重鎖可変領域をコードする配列のために交換される挿入物；ＩＧＨＧ１、ゲノム免疫グロブリンアイソタイプＧ１重鎖定常領域（配列を付録２に示す）をコードする配列；ウサギβ−グロビンＡ、ウサギβ−グロビンポリＡ配列；ＩＧＫＶリーダー、マウスκリーダー；Ｌスタッファー、軽鎖をコードする配列のために交換される挿入物；ＳＶ４０ｔｅｒｍ、シミアンウイルス４０ターミネーター配列；ＦＲＴ、Ｆｌｐ認識標的部位；Ｎｅｏ、ネオマイシン耐性遺伝子；ＳＶ４０ポリＡ、シミアンウイルス４０ポリＡシグナル配列。

【図5】４５０〜６２０ｎｍにおける吸光度差のクラスター分析。クローン番号の後の数字（１〜４）によって示される反応性によって、上清をクラスター化する。暗灰色は、代謝活性細胞の数の減少を示すが、一方、明灰色は、代謝活性細胞の数の増加を示す。黒色は、代謝活性細胞の数に影響を及ぼさない上清を示す。

【図6】競合ＥＬＩＳＡにおいて決定される特異的ＥＧＦＲドメインに対して指向される掲載された対照抗体による抗ＥＧＦＲ抗体の阻害の程度。Ａ）阻害の計算。Ｂ）阻害の評価は次のとおりである：２５〜４９％：中程度の競合（＋）；５０〜７４％：強い競合（＋＋）；７５〜１００％：極めて強い競合（＋＋＋）。有意な阻害（５０〜１００％）を示すボックスに灰色の影を付す。ＥｒｂｉｔｕｘおよびＶｅｃｔｉｂｉｘを繰り返し測定（４回の独立した実験）で示してアッセイの再現性を例示する。Ａｂ２（２２５）は、Erbituxをもたらすマウス前駆体である。

【図7】Biacore 3000 SPR機器において実施される１回のエピトープマッピングサイクルの例示であって、ここで、サンプルｍＡｂは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインへの結合について、異なる４つの対照抗体と競合する。

【図8】ＳＰＲ技術による競合分析によって決定される特異的ＥＧＦＲドメインに対して指向される掲載された対照抗体による抗ＥＧＦＲ抗体の阻害の程度。Ａ）阻害の計算。Ｂ）阻害の評価は次のとおりである：２５〜４９％：中程度の競合（＋）；５０〜７４％：強い競合（＋＋）；７５〜１００％：極めて強い競合（＋＋＋）。有意な阻害（５０〜１００％）を示す細胞に灰色の影を付す。^＊で印を付したクローン１２２９は、Biacoreアッセイにおいて結合しなかった。

【図9】抗ＥＧＦＲ抗体ペアのＳＰＲ競合分析による抗ＥＧＦＲ抗体レパートリー内のエピトープクラスターの決定。抗体を、推定されるＥＧＦＲドメイン認識に従ってグループに分類する。抗体の組み合わせが重複するエピトープに結合し、５０％を超える阻害を生じた細胞に、灰色の影を付す。決定が行われなかった細胞を黒色で着色する。Ａ）阻害の計算。Ｂ）阻害の評価は次のとおりである：２５〜４９％：中程度の競合（＋）；５０〜７４％：強い競合（＋＋）；７５〜１００％：極めて強い競合（＋＋＋）。

【図10】Biacore分析によって決定される対照抗体およびＥＧＦＲの細胞外ドメインに対して指向された抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープマップ。Ａ）ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のドメインＩまたはドメインＩ／ＩＩに対して指向された抗体のエピトープマップ。Ｂ）ＥＧＦＲ ＥＣＤのドメインＩＩＩに対して指向された抗体のエピトープマップ。

【図11】ＥＧＦＲ上の非重複エピトープに対して指向された抗体のオリゴクローナル混合物の同時結合の調査。Ａ）ドメインＩＩＩ、ドメインＩまたは未知の特異性に対する抗体の逐次付加。異なるｍＡｂ混合物または単一のｍＡｂに対して試験した単一サンプルのｍＡｂの阻害値を、影を付したボックス内に示す。阻害を計算するために使用したＲｕ最大値も示す。Ｂ）ＥＧＦＲ上の非重複エピトープに対して指向された６つの別々のサンプルｍＡｂおよび６つの試験した抗体を含有する抗体混合物の競合分析。試験したサンプル抗体が含まれない抗体混合物は、ポジティブコントロールとしての役割を果たした。異なるｍＡｂ混合物に対して試験した単一サンプルｍＡｂの阻害値を、影を付したボックス内に示す。阻害を計算するために使用したＲｕ最大値も示す。Ｃ）結合の抗体遮断および場合によって抗体増強を示すＢにおける分析からの対応するセンサーグラム。Ｄ）ドメインＩ、Ｉ／ＩＩおよび６個のｍＡｂ抗体混合物に対する未知の特異性に対して指向されたさらなる抗体の試験。

【図12】全長ＥＧＦＲにおける抗体力価による抗体により介在されるＥＧＦリガンド遮断の決定、およびストレプトアビジンＨＲＰ試薬と結合するビオチン化ＥＧＦリガンドの検出。Erbitux、VectibixおよびSynagis IgG（パリビズマブ）を、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして使用した。試験した抗体による認識された抗体エピトープの遮断後、０．１μｇ／ｍｌビオチン化ＥＧＦリガンド、および検出のための第２のストレプトアビジン−ＨＲＰ抱合の添加によって、ＥＧＦリガンド競合の程度を可視化した。

【図13】ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）における示された抗体による前処置の効果は、ＨＮ５細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を誘導した。グラフ中において命名された抗体（１０μｇ／ｍｌ）を、７．５分間のＥＧＦの添加の前に、３０分間細胞と共にインキュベートした。^＊で印を付したデータのセットは、コントロール（（−）ｃｔｒｌ）データのセットとは有意に異なった（ｐ＜０．０５）。Ａ．１２０８はＥＧＦＲリン酸化において有意な保護効果を有した。Ｂ．１２７７および１３２０は、ＥＧＦ誘導性リン酸化に対して有意に保護する。エラーバーは、３回の独立した実験の標準偏差を表す。

【図14】ＨＮ５細胞におけるリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）およびＥＧＦＲのin cell western分析。混合物は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度の９９２、１０３０および１０４２抗体の等モル混合物であり、その他の抗体を、それぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。５０μｇ／ｍｌのＥＧＦを、固定化前に７．５分間添加してＥＧＦＲのリン酸化を刺激した。エラーバーは、６つの別々の（ｃｔｌｒ−）、または３つの別々のデータポイント（９９２、１０３０、１０４２、混合物もしくはerbitux）の標準偏差を表す。９９２、１０３０、混合物およびerbituxは、リン酸化における有意な（^＊＝ｐ＜０．０５）保護効果を有した。

【図15】ＥＧＦＲの内在化における抗体のインキュベーションの影響。データを、細胞表面から取り出された受容体の初期染色に対するパーセントとして表す。エラーバーはＳＥＭに対応する。

【図16】非処置コントロールと比較した、代謝活性細胞パーセントによって測定される様々な濃度の抗体９９２、１０３０および１０４２ならびにそれらの混合物の存在下におけるＡ４３１−ＮＳ細胞の増殖曲線。１００１は、ネガティブコントロールとして使用した類似のアイソタイプを有する非機能的抗体である。

【図17】４５０ｎｍでの吸光度によって測定される１０μｇ／ｍｌの抗体９９２、１０３０および１０４２ならびにそれらの混合物、ならびに様々な濃度のＥＧＦＲリガンドＥＧＦの存在下におけるＡ４３１−ＮＳ細胞の増殖曲線。１００１は、ネガティブコントロールとして使用した類似のアイソタイプを有する非機能的抗体である。

【図18】様々な濃度の抗体９９２、および９９２とドメインＩ、ＩＩまたはＩＩＩに存在する非重複エピトープを伴う抗体との混合物の存在下におけるＡ４３１−ＮＳ細胞の増殖曲線。１００１は、ネガティブコントロールとして使用した類似のアイソタイプを有する非機能的抗体である。

【図19】Ａ４３１ＮＳ細胞におけるアポトーシス。ＥＧＦＲ−混合物、個々のモノクローナル抗体、ErbituxおよびVectibixを１０倍希釈で試験した。アポトーシス細胞由来のヒストン−ＤＮＡ複合体を、Roche製ELISAキットを使用して測定した。

【図20】１０匹のヌードＢａｌｂ／Ｃ Ｎｕ／Ｎｕマウスの４つのグループに、１×１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を播種した。腫瘍が約１００ｍｍ^３となった場合に、処置を開始した。矢印で示すように、実験中、グループに１ｍｇ／ｍｌの抗体を５回注入した。腫瘍の直径を、デジタルカリパスで測定した。結果を、平均腫瘍容積（＋／−ＳＥＭ）として示す。

【図21】図２０に示す実験において個々のマウスを屠殺した場合、腫瘍を摘出し、そして秤量した。平均値＋／−ＳＥＭを示す。星印は、Ｐ＜０．０５における有意性を示す。

【図22】１０μｇ／ｍｌの抗体１００１、Erbitux、Vectibixおよび非重複エピトープ９９２＋１０３０＋１０４２を伴う３つの抗体の混合物の存在下におけるＡ４３１−ＮＳスフェロイドの増殖。１００１は、ネガティブコントロールとして使用した類似のアイソタイプを有する非機能的抗体である。

【図23】カニクイザルの皮膚上皮に由来するｃＤＮＡからクローニングしたカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインのＤＮＡ（配列番号１００）およびタンパク質配列（配列番号１０１）。

【図24】カニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤ（配列番号１０１）の得られたタンパク質配列と、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ００５８８から得られたヒトＥＧＦＲ ＥＣＤ（配列番号１０８）とのアラインメント。また、コンセンサス配列（配列番号１０９）も示す。

【図25】ヒトもしくはカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤのいずれか一方または両方に結合する交差反応性および種特異的抗体間のＥＬＩＳＡアッセイ識別の例。

【図26】異種移植されたマウスの４つの実験グループのそれぞれに由来する代表的な腫瘍切片の顕微鏡写真。２００×の倍率において、矢印はインビボにおけるＡ４３１細胞の最終分化の病巣を指す。３つの抗ＥＧＦＲクローン（９９２＋１０３０＋１０４２）の混合物で処置した腫瘍における最終分化の顕著により大きくかつより多数の病巣に留意すること（上の２つのパネル）。

【図27】Ａ）１０μｇ／ｍｌのコントロール抗体の添加２４時間後のＨＮ５スフェロイドの４０×倍率で撮影した画像。（リツキシマブ、抗ＣＤ−２０）または９９２および１０２４の抗ＥＧＦＲ抗体混合物。Ｂ）ソフトウェアImage Jを用いた細胞に覆われた面積の定量（^＊ｐ＜０．０１）。

【図28】非処置コントロールグループのパーセントとして４つの処置グループにおけるインボルクリンレベルを示す線図（それぞれErbitux、Vectibixおよびネガティブコントロールグループと比較した＃ ｐ＜０．００５）。

【図29】Ａ）１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−４８８標識Erbituxまたは９９２＋１０２４と共に２時間インキュベートしたＨＮ５およびＡ４３１ＮＳ細胞の６０×倍率で撮影した画像。Ｂ）１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−４８８標識Erbituxまたは９９２＋１０２４と共に２時間インキュベートしたＡ４３１ＮＳ細胞の小ピンホールにより６０×倍率で撮影した画像。

【図30】Ａ）１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ−４８８標識Erbituxまたは９９２＋１０２４と共に示した期間インキュベートしたＨＮ５細胞の６０×倍率で撮影した画像。

【図31】ＥＬＩＳＡにおけるＡ４３１−ＮＳ細胞および精製された全長ＥＧＦＲに対する逐次的な抗体力価によるＦａｂ９９２、１０２４および１０３０の抗原提示特異性の決定。結合したＦａｂ抗体を、二次ヤギ抗ヒトＦａｂ特異的ＨＲＰ抱合によって可視化した。Ａ）Ｆａｂ抗体をＡ４３１細胞から精製された全長ＥＧＦＲに対して試験した。Ｂ）Ｆａｂ抗体をＡ４３１−ＮＳ細胞の表面上に発現されたＥＧＦＲに対して試験した。

【図32】ＥＬＩＳＡにおけるパラホルムアルデヒドで固定したＡ４３１−ＮＳ細胞に対する系列滴定による抗体９９２、１０２４、１０３０、ErbituxならびにVectibixのＩｇＧおよびＦａｂフラグメントの機能的アフィニティーの決定。結合したＦａｂおよびＩｇＧ抗体を、二次ヤギ抗ヒトＦａｂ特異的ＨＲＰ抱合によって可視化した。抗ＲＳＶタンパク質Ｆ抗体Synagisをネガティブコントロール抗体として用い、そして用いたＥＬＩＳＡアッセイでは、何ら結合を示さなかった。Ａ）Ａ４３１−ＮＳ細胞へのＩｇＧ抗体の機能的結合。Ｂ）Ａ４３１−ＮＳ細胞へのＦａｂ抗体の機能的結合。

【図33】非重複エピトープに結合するＦａｂフラグメントによる受容体飽和前のＡ４３１−ＮＳ細胞上のＥＧＦＲに結合するＩｇＧの増強の決定。示したＦａｂフラグメントで、Ａ４３１−ＮＳ細胞上の認識されたＥＧＦＲエピトープを３０分間飽和させ、その後、特定されたＩｇＧ抗体を系列滴定し、次いでＦａｂ添加を伴うまたは伴わない結合したＩｇＧを、二次マウス抗ヒトＦｃ ＨＲＰ抱合によって可視化した。Ａ）示したＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和を伴うまたは伴わないＩｇＧ９９２のＡ４３１−ＮＳ細胞への結合特徴。Ｂ）示したＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和を伴うまたは伴わないＩｇＧ１０２４のＡ４３１−ＮＳ細胞への結合特徴。Ｃ）示したＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和を伴うまたは伴わないＩｇＧ１０３０のＡ４３１−ＮＳ細胞への結合特徴。

【図34】カニクイザル全長ＥＧＦＲ ｃＤＮＡ（図３４Ａ；配列番号１０２）およびコードされたタンパク質（図３４Ｂ；配列番号１０３）。

【図35】１μｇ／ｍｌの示された抗体／組み合わせによってＡ４３１ＮＳで生じたアポトーシス。ヒストン−ＤＮＡ複合体を、Roche製ＥＬＩＳＡキットで検出した。アポトーシスのレベルを、ポジティブコントロール（最大アポトーシス）と比較した。

【図36】Ｂａｌｂ／Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに１×１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を注入した。腫瘍が平均で約１００ｍｍ^３である場合、処置を開始した。マウスに、抗体を１７回注入した。８日目に最初の処置を開始し、３４日目に最後の処置を行った。抗体／組成物を、０．５ｍｇ／用量または０．１７ｍｇ／用量で注入した。腫瘍容積の平均値＋／−ＳＥＭを示す。

【図37】Ａ４３１ＮＳの増殖の阻害。Ｘ軸は、本発明の３つの抗体の異なる代表的な組み合わせを示す。Ｙ軸は、代謝活性を非処置コントロール（コントロール）に対する割合として示す。エラーバーは＋／−ＳＥＭを表す。さらなる詳細については、実施例６を参照のこと。

【図38】Ａ４３１ＮＳヒト腫瘍異種移植片におけるErbituxと比較した２つの異なる用量の９９２＋１０２４混合物の増殖阻害効果。ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスに１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を播種した。腫瘍が１００ｍｍ^３の平均サイズ（８日目）に到達した時に、マウスを無作為に９匹からなるグループに分け、処置を開始した。示された抗体を、０．５ｍｇ／用量または１ｍｇ／用量で１週間に２回、合計９回の注入で注入した。グラフ上の明灰色領域は、処置期間を示す。点線の開始部は、過度の腫瘍サイズのために一定のグループにおいて最初にマウスを安楽死させた時点を示す。２ｍｇ／週９９２＋１０２４対２ｍｇ／週Erbituxおよび１ｍｇ／週９９２＋１０２４対２ｍｇ／週Erbituxとの間の統計的な有意差を６０日目に計算し、ここで、９９２＋１０２４の２ｍｇ／週グループ以外のすべてを終結させた。それ故、６０日目より以前に排除した動物の腫瘍サイズも存続させた；グラフは、一定のグループにおけるすべてのマウスの蓄積した腫瘍容積を示す。平均値＋／−ＳＥＭを示す。

【図39】９９２＋１０２４抗体混合物、Erbituxまたはコントロール抗体で処置したマウスの生存率のKaplan−Meyerプロット（図３８に示すものと同じ実験）。結果を処置したマウスの生存パーセントとして示す。９９２＋１０２４とErbituxとを比較した場合の高用量（２ｍｇ／週、Ｐ＝０．０００８））および低用量（１ｍｇ／週、Ｐ＝０．０００４）グループにおけるマウスの生存パーセントの間の有意差を観察した。また、高用量のErbituxと比較した場合、低用量の９９２＋１０２４は有意に良好であった（Ｐ＝０．００８７）。統計的差異をログランク（Mantel−Cox）検定を用いて算出した。

【図40】ＦＡＣＳ分析による全長ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に対するＩｇＧ９９２、１０２４および１３２０の交差反応性分析。結合した抗体をＰＥで標識したヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇＧ ＦＣで検出した。ＥＧＦＲを発現する均質な細胞（ＳＣＣ／ＦＣＳ特性）においてゲーティングを実施した。結合を、１ｎＭ濃度で結合する最大抗体％として表す。

【図41】９９２（Ａ）ならびに１０２４（Ｂ）の重鎖および軽鎖の両方のマウス（ｃｈｉ）およびヒト化（ｈｕ）候補可変領域の可変領域のアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌｗ２アラインメント。ＩＭＧＴによって定義されるＣＤＲ領域に下線を付す；ギャップを（−）、同一アミノ酸を（^＊）、保存的変異を（：）、半保存的変異を（．）で示す。太字のアミノ酸は、全ヒトフレームワーク変種が結合アフィニティーの減少を示す場合、本来の同定されたマウス残基への復帰変異が行われるアミノ酸位置を示す。配列番号は次のとおりである：ヒト化９９２ＶＨ（配列番号１０４）。ヒト化９９２ＶＬ（配列番号１０５）。ヒト化１０２４ＶＨ（配列番号１０６）。ヒト化１０２４ＶＬ（配列番号１０７）。キメラ９９２ＶＨ（配列番号４０のａａ３〜１２４）。キメラ９９２ＶＬ（配列番号７２のａａ３〜１０９）。キメラ１０２４ＶＨ（配列番号４１のａａ３〜１２０）。キメラ１０２４ＶＬ（配列番号７３のａａ３〜１１４）。

【図42A】９９２Ｌ１０２４に関する二重可変ドメインをコードする遺伝子の略図；９９２Ｌ１０２４ＩＧＨＶ（７５１ｂｐ）は、５’ＡｓｃＩ制限部位から表示され、９９２ＩＧＨＶ、ＡＳＴＫＧＰリンカー、１０２４ＩＧＨＶと続き、３’ＸｈｏＩ制限部位で終了し、９９２Ｌ１０２４ＩＧＫＶ（１０７１ｂｐ）は、５’ＮｈｅＩ制限部位から表示され、９９２ＩＧＫＶ、ＴＶＡＡＰリンカー、１０２４ＩＧＫＶ、ＩＧＫＣと続き、３’ＮｏｔＩ制限部位で終了する。

【図42B】１０２４Ｌ９９２について二重可変ドメインをコードする遺伝子の略図；１０２４Ｌ９９２ＩＧＨＶ（７５１ｂｐ）は、５’ＡｓｃＩ制限部位から表示され、１０２４ＩＧＨＶ、ＡＳＴＫＧＰリンカー、９９２ＩＧＨＶと続き、そして３’ＸｈｏＩ制限部位で終了し、１０２４Ｌ９９２ＩＧＫＶ（１０７１ｂｐ）は、５’ＮｈｅＩ制限部位から表示され、１０２４ＩＧＫＶ、ＴＶＡＡＰリンカー、９９２ＩＧＫＶ、ＩＧＫＣと続き、そして３’ＮｏｔＩ制限部位で終了する。

【発明を実施するための形態】

【0048】

定義
用語「抗体」は、血清の機能的成分を説明し、そしてしばしば、分子のコレクション（抗体もしくは免疫グロブリン）または１つの分子（抗体分子もしくは免疫グロブリン分子）のいずれかをいう。抗体分子は、特異的抗原決定基（抗原もしくは抗原エピトープ）に結合するか、または反応することが可能であり、次いで、免疫学的エフェクター機構の誘導をもたらし得る。個々の抗体分子は、通常、単一特異性として認識され、そして抗体分子の組成物は、モノクローナル（即ち、同一の抗体分子よりなる）であってもよく、あるいはポリクローナル（即ち、同じ抗原またはなお別々の異なる抗原上の同じもしくは異なるエピトープと反応する２つもしくはそれ以上の異なる抗体分子よりなる）であってもよい。各抗体分子は、それが、その対応する抗原に特異的に結合することを可能にする独特な構造を有し、そしてすべての天然の抗体分子は、２つの同一な軽鎖および２つの同一な重鎖の全体的に同じ基本構造を有する。抗体はまた、集合的に免疫グロブリンとしても公知である。本明細書において使用する際、用語、抗体または抗体はまた、キメラおよび一本鎖抗体、ならびにＦａｂ、ＦｖフラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントのような抗体の結合性フラグメント、ならびに二量体ＩｇＡ分子または五価ＩｇＭのような多量体形態を含むことが意図される。抗体は、ヒト、マウス、キメラ、ヒト化、または再構成であってもよい。

【0049】

用語「同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペア」は、同じ抗体を産生する細胞内に含有されるかまたはそれらに由来するＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列の元々のペアを説明する。それゆえ、同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌペアは、そのような細胞が由来するドナーに元々存在するＶ_ＨおよびＶ_Ｌペア形成を表す。用語「Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアから発現される抗体」は、抗体または抗体フラグメントが、ベクター、プラスミド、もしくはＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列を含有する類似物から産生されることを示す。同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアが完全抗体またはその安定なフラグメントのいずれかとして発現される場合、それらは、それらが由来する細胞から元々発現される抗体の結合アフィニティーおよび特異性を保持する。同族ペアのライブラリーはまた、同族ペアのレパートリーまたはコレクションとも呼ばれ、そして個々に維持されてもよく、またはプールされてもよい。

【0050】

用語「ＣＤＲ」−相補性決定領域は、Lefranc et al (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77において定義されるとおりである。

【0051】

用語「組み換えポリクローナルタンパク質の別々のメンバー」は、異なるが相同なタンパク質分子を含んでなるタンパク質組成物の１つのタンパク質分子をいい、ここで、各タンパク質分子は、組成物の他の分子に相同であるが、しかしまた、可変ポリペプチド配列の１つもしくはそれ以上のストレッチを含有し、前記ストレッチはポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる。

【0052】

用語「ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーター」は、プロモーターによって誘導される２つの遺伝子フラグメントの転写が対向する方向で生じるように近接に配置されているプロモーターペアをいう。ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーターはまた、２つのプロモーター間の関連しない核酸からなるスタッファーで構築することもできる。そのようなスタッファーフラグメントは、５００を超えるヌクレオチドを容易に含有することができる。ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄプロモーターはまた、両方向性プロモーターと呼ぶこともできる。

【0053】

用語「免疫グロブリン」は、一般に、血液または血清において見出される抗体の混合物の総称として使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すために使用されてもよい。

【0054】

用語「免疫グロブリン分子」は、例えば、免疫グロブリンの一部、または任意のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体組成物の部分である個々の抗体分子を示す。

【0055】

用語「目的の変種核酸分子のライブラリー」は、「目的の組み換えポリクローナルタンパク質」を集合的にコードする核酸分子のコレクションを説明するために使用される。トランスフェクションについて使用する場合、目的の変種核酸分子のライブラリーは、発現ベクターのライブラリーに含有される。そのようなライブラリーは、典型的に、少なくとも２、３、５、１０、２０、５０、１０００、１０^４、１０^５もしくは１０^６の個の個々のメンバーを有する。

【0056】

用語「物質移動」は、ベクターの１つの集団からベクターの別の集団への目的の核酸配列の移動、および各ＤＮＡについてそれを行うことであって、同時に、目的の個々のＤＮＡの単離を用いないことを説明するために使用される。ベクターのそのような集団は、例えば、可変領域、プロモーター、リーダーを含有するか、または目的のエレメントを増強するライブラリーであり得る。次いで、これらの配列は、例えば、ファージベクターからの事前の単離を伴わずに、哺乳動物発現ベクターに移動させることができる。特に、抗体配列では、この技術は、例えば、選択ベクター（例えば、ファージディスプレイベクター）から哺乳動物発現ベクターへライブラリーを移動させる間、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ多様性の間の連結が失われないことを確実にする。それによって、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの本来のペア形成が保持される。

【0057】

本明細書において使用する際、用語「作動可能に連結する」は、他のセグメントと機能的関係に配置される場合、別のセグメントに連結されるセグメントをいう。例えば、シグナル配列をコードするＤＮＡは、それが、ポリペプチドの小胞体への移動に関与するリーダーとして発現される場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。また、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合、コーディング配列に作動可能に連結される。

【0058】

用語「ポリクローナル抗体」は、同じもしくは異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基に結合または反応することが可能な異なる抗体分子の組成物を説明する。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、ポリクローナル抗体のいわゆる可変領域に局在すると考えられる。しかし、本発明に関して、ポリクローン性はまた、例えば、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、またはマウスアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＡのような２つもしくはそれ以上の抗体アイソタイプを含有する抗体の混合物の場合におけるようないわゆる定常領域に存在する個々の抗体分子間の差異を説明するものと理解することができる。本発明の目的のために、そのようなポリクローナル抗体はまた、「抗体組成物」とも呼ばれ得る。

【0059】

用語「エピトープ」は、一般に、動物、好ましくは、哺乳動物、および最も好ましくは、ヒトにおいて抗原もしくは免疫原活性を有するより大きな分子またはより大きな分子の一部（例えば、抗原もしくは抗原部位）の部分を説明するために使用される。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するより大きな分子の一部である。抗原活性を有するエピトープは、抗体が免疫特異的に結合するより大きな分子の一部であって、当該分野において周知の任意の方法、例えば、本明細書に記載のイムノアッセイによって決定される。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原は、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する物質、例えば、毒素、ウイルス、細菌、タンパク質もしくはＤＮＡである。抗原または抗原部位は、それらが極めて小さく、そしてしばしば、免疫応答を刺激することが可能でない場合に限り、しばしば、１を超えるエピトープを有する。エピトープは、線状であってもよく、または高次構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）であってもよい。線状エピトープは、抗体によって認識されるタンパク質分子における約６〜１０個の隣接アミノ酸よりなる。対照的に、高次構造エピトープは、連続的に配置されていないアミノ酸よりなる。ここで、抗体は３次元構造のみを認識する。タンパク質分子が３次元構造にフォールディングされる場合、エピトープを形成するアミノ酸が並列され、抗体が配列を認識することを可能にする。変性されたタンパク質では、線状エピトープのみが認識され得る。高次構造エピトープは、定義上、フォールディングされたタンパク質の外側に存在しなければならない。高次構造エピトープを認識する抗体は、軽度の変性しない手順においてのみ結合し得る。同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体は、エピトープの局在に依存して結合する抗原の活性に様々な影響を及ぼすことができる。抗原の活性部位のエピトープに結合する抗体は、抗原の機能を完全に遮断し得るが、一方、異なるエピトープに結合する別の抗体は、抗原単独の活性に全くもしくはほとんど影響を及ぼし得ない。しかし、そのような抗体は、相補体をなお活性化し、それによって抗原の排除を生じ得、そして同じ抗原上の異なるエピトープに結合する１つもしくはそれ以上の抗体と組み合わせた場合、相乗効果を生じ得る。本発明では、エピトープは、好ましくは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインの部分である。本発明の抗原は、好ましくは、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合する細胞外ドメインＥＧＦＲタンパク質、それらのポリペプチドまたはフラグメントである。ＥＧＦＲ関連抗原はまた、抗体または抗体フラグメントが免疫特異的に結合するＥＧＦＲポリペプチドまたはそのフラグメントの細胞外ドメインのアナログもしくは誘導体であってもよい。

【0060】

同じ抗原への結合について相互に競合することが可能な抗体は、同じもしくは重複エピトープに結合するか、または相互の極めて近くに結合部位を有し、結果として主に立体障害によって競合が生じうる。抗体の間の競合を決定するための方法については、実施例において説明する。

【0061】

本明細書において使用する際、用語「ポリクローナルタンパク質」または「多クローン性」は、異なるが相同なタンパク質分子を含んでなるタンパク質組成物を指し、好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される。それ故、それぞれのタンパク質分子は、組成物の他の分子に相同であるが、しかしまた、可変ポリペプチド配列の１つもしくはそれ以上のストレッチを含有し、前記ストレッチは、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列の差異によって特徴付けられる。そのようなポリクローナルタンパク質の既知の例として、抗体または免疫グロブリン分子、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体が挙げられる。ポリクローナルタンパク質は、タンパク質分子の定義されたサブセットよりなっていてもよく、それらは、例えば、所望される標的抗原に対するポリクローナル抗体の場合、所望される標的に対する共有された結合活性のような共通の特徴によって定義されている。

【0062】

「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾に係らず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。タンパク質は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、もしくはペプチドの２つもしくはそれ以上の集成されたポリペプチド鎖、フラグメントを含んでなる単量体または多量体として存在することができる。

【0063】

用語「ＲＦＬＰ」は、「制限酵素断片長多型」を指し、制限酵素による切断後、核酸分子フラグメントの泳動ゲルパターンが分析される方法である。

【0064】

用語「スクランブル」は、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー由来の異なる２つのポリペプチド鎖からなるポリクローナルタンパク質の２つもしくはそれ以上の別々のメンバーが個々の細胞から発現される状況を説明している。この状況は、個々の細胞が、ゲノム、１ペアを超える遺伝子セグメントに組み込まれる場合に生じ得、ここで、遺伝子セグメントの各ペアは、ポリクローナルタンパク質の別々のメンバーをコードする。そのような状況では、遺伝子セグメントから発現されるポリペプチド鎖の意図されない組み合わせが作製され得る。これらの意図されない組み合わせのポリペプチド鎖は、何ら治療効果を有し得ない。

【0065】

用語「Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ鎖スクランブル」は、上記で定義したスクランブルの例である。この例では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする遺伝子セグメントは、１対の遺伝子セグメントを構成する。スクランブルは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌポリペプチドの意図されない組み合わせが細胞から産生される場合に生じ、ここで、異なる２つのＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする遺伝子セグメントペアが同じ細胞に組み込まれる。そのようなスクランブル化された抗体分子は、本来の特異性を保持しない可能性があり、それゆえ何ら治療効果を有し得ない。

【0066】

用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡを細胞に導入するための広範な用語として、本明細書において使用する。この用語はまた、例えば、形質転換、感染、形質導入またはドナー細胞とアクセプター細胞との融合のような外来ＤＮＡを細胞に導入するための他の機能的に同等な方法を含むことを意味する。

【0067】

用語「可変ポリペプチド配列」および「可変領域」は同じ意味で用いられる。。

【0068】

用語「別々のエピトープ」は、異なる２つの抗体が別々のエピトープに結合する場合、抗原結合に対し１００％未満の競合が存在し、好ましくは、抗原結合に対し５０％未満の競合が存在し、より好ましくは、抗原結合に対し本質的に競合が認められないことを意味する。抗体ペアの「別々のエピトープ」に関する解析は、典型的に、実施例に記載されるごとく、ＥＧＦＲを発現する細胞および個々の蛍光標識抗体に対するＦＡＣＳ分析、またはフローセル表面に捕捉もしくは抱合されたＥＧＦＲ抗原を使用する表面プラズモン共鳴のいずれかを用いる飽和抗体条件下の結合実験により調べられる。

【0069】

「ＥＧＦ結合を阻害する」ことができる用語は、１つの抗体分子に適用される場合、抗体分子が、１０ｎＭ未満、好ましくは、８ｎＭ未満、より好ましくは、７ｎＭ未満、より好ましくは、５ｎＭ未満、より好ましくは、４ｎＭ未満、より好ましくは、３ｎＭ未満、より好ましくは、２ｎＭ未満、より好ましくは、２ｎＭ未満、より好ましくは、１ｎＭ未満のＥＧＦＲに結合するＥＧＦに関するＩＣ５０値を示すことを意味する。

【0070】

用語「上皮成長因子受容体」、「ＥＧＦＲ」、および「ＥＧＦＲ抗原」は、本明細書において同じ意味として使用され、そしてヒトＥＧＦＲの変異種、アイソフォームおよび種ホモログを含む。好適な実施形態では、本発明の抗体のＥＧＦＲ−抗原への結合は、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲへの結合を阻害または遮断することによって、ＥＧＦＲを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）の増殖を阻害する。用語「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦＲに対するすべての（例えば、生理学的）リガンドを包含し、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ヘパリン結合性ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ヘレグリン、β−セルリン、およびエピレグリン（ＥＰＩ）を含むが、これらに限定されない。別の好適な実施形態では、本発明の抗体のＥＧＦＲ−抗原への結合は、エフェクター細胞の食作用および／またはＥＧＦＲを発現する細胞の死滅を仲介する。

【0071】

ＥＧＦＲドメイン構造：成熟ＥＧＦＲの細胞外部分（SwissProt acc.#P00533）は、６２１個のアミノ酸からなり、４つの受容体ドメイン：ドメインＩは残基１〜１６５を、ドメインＩＩは残基１６６〜３１２を、ドメインＩＩＩは残基３１３〜４８１を、そしてドメインＩＶは４８２〜６２１を包含する（Cochran et al. 2004 J immunol. Methods 287, 147-158）。ドメインＩおよびＩＩＩは、リガンドに対する高アフィニティー結合部位の形成に寄与することが示唆されている。ドメインＩＩおよびＩＶは、タンパク質フォールディングを安定化し、そして可能なＥＧＦＲ二量体化形成面を含有するシステインリッチのラミニン様領域である。

【0072】

本明細書において使用する際、用語「増殖を阻害する」（例えば、細胞を指す）は、抗ＥＧＦＲ抗体と接触していない同じ細胞の増殖と比較して、抗ＥＧＦＲ抗体と接触した場合の細胞の増殖（細胞数の増加）または代謝における任意の測定可能な減少、例えば、細胞培養の増殖の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、もしくは１００％の阻害を含むことが意図される。

【0073】

本明細書において使用する際、用語「結合を阻害する」および「結合を遮断する」（例えば、ＥＧＦＲリガンドのＥＧＦＲへの結合の阻害／遮断を指す）は、同じ意味として使用され、そして部分的および完全な阻害／遮断の両方を包含する。ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの阻害／遮断は、好ましくは、阻害もしくは遮断を伴わずにＥＧＦＲリガンドがＥＧＦＲに結合する場合に生じる細胞シグナリングの正常なレベルまたはタイプを減少させるか、または変更する。阻害および遮断はまた、抗ＥＧＦＲ抗体と接触していないリガンドと比較して、抗ＥＧＦＲ抗体と接触した場合のＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合アフィニティーにおける任意の測定可能な減少、例えば、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、もしくは１００％の遮断を含むことが意図される。

【0074】

用語「組み換え抗体」は、細胞を自然に会合する抗体のコーディング配列を含んでなる発現ベクターでトランスフェクトされた細胞または細胞系統から発現される抗体分子またはいくらかの分子を説明するために使用される。

【0075】

（発明の詳細な説明）
抗体混合物
一実施形態では、本発明は、少なくとも３つの別々のＥＧＦＲエピトープ、好ましくは、３つの非重複ＥＧＦＲエピトープに結合することが可能な抗体分子を含んでなる抗体組成物に関する。抗体の非重複性は、好ましくは、ＥＧＦＲ発現細胞を用いるＦＡＣＳ分析において様々に標識された抗体を使用して、またはフローセル表面に捕捉もしくは抱合されたＥＧＦＲ抗原を使用する表面プラズモン共鳴を使用することによって、決定される。実施例に記載されるＥＬＩＳＡに基づく方法が用いられてもよい。３つの非重複ＥＧＦＲエピトープに結合する組成物は、１つもしくは２つのエピトープを標的にするモノクローナル抗体の組成物と比較して、ＥＧＦＲコンホメーションにおける差異に対してそれほど過敏ではあり得ず、そして変異に対してそれほど過敏ではあり得ないため、それは、広範なＥＧＦＲ依存的癌タイプに対して使用することができる。さらに加えて、３つの非重複ＥＧＦＲエピトープに結合する抗体組成物は、より少ないエピトープを標的にする組成物と比較してより優れた効力を提供し得る。特に、抗体組成物は、癌細胞の最終分化に関して、インビボでより優れた効力を提供し得る。図３７はその考察の一般的な適用を例示する３つの別々のｈＥＧＦＲエピトープに結合する強力な抗体組成物の多数の例を示す。

【0076】

モノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体療法では、一定の割合の患者は、抗体処置に対して有効に応答しない。いずれかの患者においては、これは抗体の迅速な浄化によるものであり得、あるいは、抗体が抗体に対する患者の免疫応答を生じるためである。ある患者においては、応答の欠如は、それらの特定のＥＧＦＲ依存性癌が、モノクローナル抗体がそのエピトープに結合することができないコンホメーションでＥＧＦＲを発現するためであり得る。これは、グリコシル化の差異のためか、ドメイン欠失のためか、あるいは変異および／またはＳＮＰのためであり得る。

【0077】

また、いずれかの癌では、リガンドの癌細胞の産生によって生じる自己分泌ＥＧＦＲ−刺激が重要である一方、他の場合では、癌細胞によって発現されるＥＧＦＲがリガンド刺激を必要としない。後者の癌タイプでは、リガンド結合を阻害することが可能な抗体は有効ではないかもしれない。

【0078】

抗体がＥＧＦＲ上の少なくとも３つの別々のエピトープに結合することが可能である抗体組成物は、複数の抗体によって認識されるエピトープと比較して３つのすべてのエピトープが変化する可能性が低いため、より広範に適用可能である。さらに加えて、すべての抗体がいずれも患者によって浄化される可能性は極めて低い。最終的に、実施例は、機能アッセイにおいて、別々のエピトープに結合する３つの抗体を含んでなる混合物が、モノクローナル抗体および２つの抗体を含んでなる混合物より優れていることを示す。非重複エピトープを有する３つのドメインＩＩＩ抗体を使用して、癌細胞の最終分化の誘導に関する優位性が明確に示された。癌細胞のそのような効率的な抗体誘導性最終分化は、これまで報告されておらず、そして効率的な抗体に基づく癌療法の設計における著しい前進を表す。後者の結果は、２つの抗体の特定の組み合わせで類似またはなおより優れた結果を得ることができることを示している。

【0079】

より広範なＥＧＦＲ依存性癌タイプに対する改善された臨床効力およびより広範な有用性のために、組成物における抗体の数を増加させることができる。それ故、組成物は、４つの非重複エピトープに結合することが可能な抗体を含んでなり得る。組成物は、５つの非重複エピトープに結合することが可能な抗体を含んでなり得る。組成物は、６つの非重複エピトープに結合することが可能な抗体を含んでなり得る。本出願の実施例は、少なくとも６つの別々の抗体が、１回でＥＧＦＲに結合することができることを示す（実施例３）。このことは、抗体を注意深く選択することによって、６を超える、例えば、７もしくは８つの非重複エピトープに結合することが可能な抗体を含んでなる組成物を設計することが可能であるか、またはなお有利であることを排除しない。

【0080】

別の実施形態では、組成物は、異なるが重複するエピトープに結合する２つの抗体のごとく、１つのエピトープに結合する１つより多い抗体分子を含んでなる。これは、エピトープが結合する可能性を大きくするため、重複するエピトープを伴う抗体を含む利点が存在し得る。これに対する１つの理論的根拠は、コンホメーション変化または変異もしくはＳＮＰにより、いずれかの患者および／またはいずれかの癌細胞におけるエピトープが変化し得ることである。このことは１つの抗体の結合に影響を及ぼし得る一方、それは、重複するエピトープに結合する別の抗体の結合に影響を及ぼし得ない。さらに加えて、その抗体の１つは、抗原とみなされるため、患者によって浄化される危険性が存在する。異なるが重複するエピトープに結合する２つの抗体を含むことにより、２つの抗体のうちの１つのクリアランスの結果およびエピトープにおける変異の結果が低減される。

【0081】

それ故、一実施形態では、組成物は、異なるが重複するエピトープに結合する２つの抗体を含んでなる。別の実施形態では、組成物は、同じエピトープに結合する２つの別々の抗体分子を含んでなる。同じまたは重複するエピトープに結合する抗体は、同じまたは異なるアイソタイプであり得る。

【0082】

それ故、３つの非重複エピトープに対して指向された抗体を含んでなる抗体組成物は、２つの抗体が２つの重複エピトープまたは同じ第１のエピトープに結合し、他の２つの抗体が他の２つの重複エピトープまたは同じ第２のエピトープに結合し、そして２つの抗体がさらなる他の２つの重複エピトープまたは同じ第３のエピトープに結合するように、４、５もしくは６つの別々の抗体分子を含んでなり得る。当然、組成物は、重複エピトープに結合することが可能であるか、または同じエピトープに結合することが可能である２を超える、例えば、３または４つの抗体分子を含んでなり得る。それ故、組成物に含まれる抗体の総数は、各エピトープについて１を超える抗体を有することによるか、または重複エピトープを有するいくつかの抗体を有することにより６を超え得る。組成物に含まれるさらなる各抗体について、抗体定常部（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）の総用量を保持すると、各抗体の濃度が減少する。従って、許容可能な効力を維持する一方、組成物に含まれ得る抗体の数が制限されることが期待される。表面プラズモン共鳴結合実験および増殖アッセイからの観察に基づき、そして製造の課題を正当に考慮すると、抗体の数を６から７、８、９、１０個もしくはそれ以上に増加することにより、限定された（存在するならば）さらなる利点が入手可能であることが期待される。当然、これは、組成物が、１０を超える抗体、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の抗体もしくはそれ以上、例えば、２５個の抗体もしくはそれ以上、例えば、３０個の抗体もしくはそれ以上、例えば、４０個の抗体もしくはそれ以上、例えば、５０個の抗体もしくはそれ以上を含んでなることを排除しない。

【0083】

本発明の抗体組成物に、少なくとも３つの非重複ＥＧＦＲエピトープに結合することが可能な抗体が含まれることが好適である一方、２つの非重複ＥＧＦＲエピトープに結合することが可能な抗体の特定の組み合わせによってもまた、より優れた結果が得られている。これらの好適な「２抗体」組成物については、本発明の抗体組成物の設計の仕方に関する指針と共に、以下により詳細に説明する。わずか２つの抗体：９９２および１０２４を伴う組成物を使用する場合、抗体９９２、１０３０、および１０４２を含んでなる３抗体組成物と比較して、同様またはより改善された効力が入手され得ることがわかっている。抗体１０２４および１０４２は、同じクラスターに属し、それゆえ同じ結合特異性を有するため、実際には、最終分化における効果を含む３抗体組成物について観察される結果は、組成物における２つのみの結合特異性（９９２および１０２４／１０４２）に帰することができる。

【0084】

一実施形態では、組成物中の少なくとも１つの抗体は、ドメインＩＩＩエピトープに結合し、より好ましくは、組成物は、ドメインＩＩＩエピトープに結合する少なくとも２つの抗体を含んでなり、そして組成物はまた、ドメインＩＩＩエピトープに結合する３つの抗体を含んでなり得る。

【0085】

好ましくは、組成物は、ドメインＩエピトープに結合する少なくとも１つの抗体を含んでなり、そしてそれは、ドメインＩエピトープに結合する少なくとも２つの抗体結合を含んでなり得る。

【0086】

好ましくは、組成物は、ドメインＩＩエピトープに結合する少なくとも１つの抗体を含んでなり、そして２つのドメインＩＩエピトープに結合する抗体を含んでなり得る。

【0087】

組成物はまた、本明細書において定義されるように、ドメインＩ／ＩＩエピトープに結合する抗体を含んでなり得る。

【0088】

組成物は、ドメインＩＶエピトープに結合することが可能な抗体を含んでなり得る。

【0089】

好ましくは、組成物は、ＥＧＦ結合を阻害することが可能な少なくとも１つの抗体分子を含んでなり得る。

【0090】

別の好適な実施形態では、組成物は、ＥＧＦＲのリン酸化を防止することが可能な抗体を含んでなり得る。

【0091】

さらに加えて、組成物は、ＥＧＦＲの内在化／分解を増強することが可能な抗体を含んでなり得る。

【0092】

好適な実施形態では、組成物は、少なくとも１つのドメインＩＩＩ抗体および少なくとも１つのドメインＩ／ＩＩ抗体を含んでなる。別の好適な実施形態では、組成物は、少なくとも２つのドメインＩＩＩ抗体および１つのドメインＩ抗体を含んでなる。

【0093】

さらに好適な実施形態では、組成物は、少なくとも２つのドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも３つのドメインＩＩＩ抗体を含んでなる。

【0094】

組成物の抗体は、非ヒト可変鎖およびヒト定常鎖を伴うキメラ抗体であってもよい。非ヒト可変鎖は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、非ヒト霊長類または他の適切な動物由来であってもよい。完全なヒト抗体を得るために、抗体は、ヒト抗体遺伝子を有するトランスジェニック動物において作製することができる。抗体はまた、いわゆるヒト化抗体であってもよく、非ヒトＣＤＲ配列は、ヒトフレームワーク配列にグラフト化されている。

【0095】

好ましくは、ヒト定常鎖はＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプである。より好ましくは、組成物中のすべての抗体は、製造が容易であるため同じアイソタイプを有する。しかし、組成物中に異なるアイソタイプの抗体を含むことが有利であり得る。

【0096】

好ましくは、本発明の抗体組成物は、ヒトＥＧＦＲ、変異型ヒトＥＧＦＲ、およびヒトＥＧＦＲの欠失変種よりなる群から選択されるＥＧＦＲに結合することが可能な抗体を含んでなる。好ましくは、抗体は、それらが臨床実験前の関連毒物学実験において試験されうるように、ヒトおよび非ヒト霊長類ＥＧＦＲの両方に結合することが可能である。好ましくは、非ヒト霊長類はカニクイザル（Macaca fascicularis）である。

【0097】

より別々のエピトープのうち３つに結合する抗体を使用して、ＥＧＦＲ依存的癌を治療する上記で同定された概念を支持するために、本発明者らは、ＥＧＦＲに対して指向された一連のキメラマウス／ヒト抗体を同定、製造、および特徴付けた。これらのキメラ抗体を、個々におよび混合物中において、Erbitux^TMおよびVectibix^TMによって例示される最新技術のモノクローナル抗体と比較した。

【0098】

表１は、個々のキメラ抗体およびこれらに関連する特徴の概要を示す。抗体番号は、本出願全体をとおして使用される参照番号である。特異性は、実施例３において立証されるように、抗体が結合するＥＧＦＲドメインである。ΔＥＧＦＲは、実施例１に記載のような、ＥＧＦＲ変異体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に結合する抗体の能力である。カニクイザルＥＧＦＲは、カニクイザルＥＧＦＲに結合する抗体の能力である（実施例１０）。ＥＧＦ ｉｎｈｉｂは、ＥＧＦ結合を阻害する抗体の能力である（実施例４）。増殖は、癌細胞系統、Ａ４３１およびＨＮ−５の増殖を阻害する抗体の能力である（実施例６）。

【0099】

表１．本発明の抗体

【表1】

【0100】

試験したキメラ抗体単独で、ならびに増殖、結合、受容体分解／不活化、および運動アッセイ、および動物モデルでの組み合わせにおいて作製されたデータから、多くの結論を導き出すことができる。

【0101】

２つの癌細胞系統、ＨＮ−５およびＡ４３１により得られた結果（実施例６）は、異なる癌細胞系統（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、乳癌細胞系統；ＤＵ１４５−前立腺癌細胞系統）でも反復されている。これらの実験から明らかなことは、本発明者らによって提供される抗体の組み合わせが、極めて広範な癌細胞系統に対して効力を示し、ある範囲のＥＧＦＲコンホメーションに対する抗体組成物の効力を支持する。

【0102】

また、生理学的濃度のリガンド（ＥＧＦ）が増殖培地に添加される増殖アッセイでは、ＥＧＦが添加されない場合より抗体混合物の優位性が高いことも示されている（図１７）。文献（Hayashi and Sakamoto 1998 J Pharmacobiodyn 11;146-51）に従えば、血清は、約１〜１．８ｎｇ／ｍｌまたは０．２〜０．３ｎＭのＥＧＦを含有する一方、胃液（ｇａｓｔｉｃ ｊｕｉｃｅ）は、０．３ｎｇ／ｍｌ（約０．０５ｎＭ）を含有することが報告されている（Pessonen et al. 1987 Life Sci. 40; 2489-94）。インビボ状況では、ＥＧＦおよび他のＥＧＦＲリガンドも存在する可能性があり、従って、ＥＧＦＲリガンドの存在下で有効であるべき抗体混合物の能力は、本発明の抗体混合物の重要な特徴である。

【0103】

本発明のキメラマウス／ヒト抗体は、組み合わせて使用する場合、単独で使用する場合より良好な結果を提供する。これは、いくつかの実験（例えば、実施例６を参照のこと））で例示されており、ここで、単独で使用した場合、抗体は、癌細胞系統（Ａ４３１−ＮＳ）において中程度の抗増殖効果しか示さないが、いずれかの組み合わせで使用する場合、顕著により優れた結果を示す。これらの結果は、本発明のキメラ抗体の多くの組み合わせで確認された。特に優れた結果は、抗体９９２および１０２４を含んでなる組成物によって得られた。

【0104】

例えば、いくつかの抗体は、抗体９９２、１２０８、１２５４、および１２７７のいずれかと一緒にＡ４３１−ＮＳおよびＨＮ−５による抗増殖アッセイにおいて試験されている。

【0105】

受容体結合実験は、いずれかの抗体が実際にさらなる抗体の結合を刺激し、その結果、特定の抗体が１つもしくはいくつかの抗体による受容体飽和後により多くの量で受容体に結合しうることを示した。ドメインＩＩＩに対して指向された抗体９９２の結合は、非重複エピトープに結合する１つもしくはそれ以上の抗体による事前の受容体飽和によって得られるこの相乗効果から明らかに利益を得る。この協同効果の別の例は、未知のエピトープに対して指向された抗体１３９６が非重複エピトープに結合する抗体で飽和されたＥＧＦＲに対して試験される場合に認められる。

【0106】

受容体結合実験はまた、少なくとも６つの抗体がＥＧＦＲの細胞外ドメインに同時に結合することができることを示した。これらの６つの抗体は、３つのドメインＩＩＩ抗体、１つのドメインＩ抗体、１つのドメインＩ／ＩＩ抗体、および未知のエピトープに結合する１つの抗体を表す。興味深いことに、３つのドメインＩＩＩ抗体の結合は、さらなる抗体の以後の結合を容易にすると思われる。このことは、別々のエピトープに結合するいくつかの抗体を有する抗体組成物を提供するという概念を明確に支持する。

【0107】

ＥＧＦＲに対する抗体組成物の組成物を設計する場合、非重複エピトープを有する抗体はより高い相乗効果を提供するものとして好適に使用される。

【0108】

また、混合物の抗体の少なくとも１つ（単独で試験する場合）は、ＥＧＦＲへのリガンド結合を阻害することが可能であり、例えば、ＥＧＦ結合を阻害することが可能であり、および／またはＴＧＦα結合を阻害することが可能であり、および／またはアンフィレグリン結合を阻害することが可能であることが好ましい。好ましくは、ＥＧＦ結合を阻害することが可能な抗体は、抗体９９２、１０３０、１０２４、１０４２、１２０８、１２５４、１２７７、１２８４、１３２０、および１４２８よりなる群から、より好ましくは、抗体１２０８、１２６０、１２７７、および１３２０よりなる群から選択される。

【0109】

抗体混合物における少なくとも１つの抗体メンバーは、ＥＧＦＲリン酸化を減少させることが可能であることも同様に好ましい。この特性を伴う本発明の抗体の例として：９９２、１０３０、１０４２、１２０８、１２７７、および１３２０が挙げられる。

【0110】

ＥＧＦＲのドメインＩＩＩは、受容体に結合するリガンドに重要である。さらに加えて、ドメインＩＩＩに結合する抗体は、ＥＧＦＲを、受容体シグナリングを誘導しない繋留型単量体コンホメーションで安定化し得る。これらの理由のため、抗体組成物は、ドメインＩＩＩに対する特異性を伴う少なくとも１つの抗体を含有することが好ましい。好適なドメインＩＩＩ抗体として、抗体９９２、１０２４、１０３０、１２０８、１２５４、１２７７、および１３２０が挙げられる。より好ましくは、少なくともドメインＩＩＩ抗体は、抗体９９２、１２５４、１２７７、１２０８、および１３２０よりなる群から選択される。抗体組成物は、好ましくは、１を超えるドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも３つのドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも４つのドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも５つのドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも６つのドメインＩＩＩ抗体を含んでなり得る。

【0111】

別の好適な実施形態では、抗体組成物は、少なくとも１つのドメインＩ抗体を含んでなる。好ましくは、少なくとも１つのドメインＩ抗体は、抗体１２８４、１３０８、１３４４、および１３４７よりなる群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つのドメインＩ抗体は、抗体１２８４、および１３４７よりなる群から選択される。

【0112】

別の好適な実施形態では、抗体組成物は、少なくとも１つのドメインＩ／ＩＩ抗体を含んでなる。好ましくは、少なくとも１つのドメインＩ／ＩＩ抗体は、抗体１２５７、１２６０、１２６１、１４２８、および１４３４よりなる群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つのドメインＩ／ＩＩ抗体は、抗体１２６１および１２６０よりなる群から選択される。

【0113】

本発明に由来する２つの抗体の効率的な特定の組み合わせとして、以下のものが挙げられる：
１０２４、１３２０、１３０８、１２８４、１２６０、または１０３０、好ましくは、１３２０、または１２８４を伴う抗体１２８０。
１０２４、１０３０、１２６０、１２８４、１３０８、または１３２０、好ましくは、１３２０、１２８４、または１２６０を伴う抗体１２５４。
１０２４、１０３０、１２６０、１２８４、１３０８、または１３２０、好ましくは、１３２０、１２８４、または１２６０を伴う抗体１２７７。
１０３０、１２６０、１２８４、１３０８、１３２０、または１０２４、好ましくは、１３２０、１０２４、または１２８４を伴う抗体９９２。

【0114】

２つの抗体のより優れたおよび好適な混合物の例として、９９２＋１０２４；９９２＋１３２０；９９２＋１０４２；１２７７＋１３２０；１２０８＋１３２０が挙げられる。９９２＋１０２４が特に好適である。

【0115】

３つの抗体を伴う好適な混合物として、次のものが挙げられる：抗体９９２＋１０３０＋１０４２；９９２＋１３２０＋１０２４；９９２＋１０２４＋１０３０；１３２０＋１２８４＋１２６１；１３２０＋１２１４＋１３２０；９９２＋１２８４＋１３２０；９９２＋１２５５＋１０２４；９９２＋１０３０＋１３２０；９９２＋１０２４＋１２１４；９９２＋１２６１＋１３２０；９９２＋１０２４＋１２８４；９９２＋１０２４＋１２１１；９９２＋１０２４＋１０３０；１２６０＋１２１４＋１２５４；９９２＋１２５５＋１３２０；９９２＋１２１１＋１３２０；９９２＋１０３０＋１２６１；９９２＋１２６０＋１０３０；９９２＋１２６０＋１３２０；９９２＋１０３０＋１２１４。

【0116】

４つの抗体を伴う好適な混合物として、次のものが挙げられる：抗体９９２＋１３２０＋１０２４＋１０３０；９９２＋１０２４＋１０３０＋１２８４；１２７７＋１３２０＋１２６０＋１３４７；１２７７＋１３２０＋１２６１＋１３４７；１２７７＋１３２０＋１２６１＋１２８４；１２５４＋１３２０＋１２６０＋１３４７；１２５４＋１３２０＋１２６１＋１３４７；１２５４＋１３２０＋１２６１＋１２８４；１２５４＋１０２４＋１２６０＋１３４７；１２５４＋１０２４＋１２６１＋１３４７；１２５４＋１０２４＋１２６１＋１２８４；１２７７＋１０２４＋１２６０＋１３４７；１２７７＋１０２４＋１２６１＋１３４７；１２７７＋１０２４＋１２６１＋１２８４。

【0117】

５つの抗体を伴う好適な混合物として、次のものが挙げられる：９９２＋１０３０＋１０２４＋１２６０＋１３４７；９９２＋１０３０＋１０２４＋１２６１＋１３４７；９９２＋１０３０＋１０２４＋１２６１＋１２８４；９９２＋１０３０＋１３２０＋１２６０＋１３４７；９９２＋１０３０＋１３２０＋１２６１＋１３４７；９９２＋１０３０＋１３２０＋１２６１＋１２８４；

【0118】

８つの抗体を伴う１つの好適な混合物として、次のものが挙げられる：９９２＋１０３０＋１０２４＋１２７７＋１２５４＋１３２０＋１２６０＋１２６１＋１２８４＋１３４７；

【0119】

さらに加えて、非ヒト霊長類における毒物学研究を実施することを可能にするために、組成物中のすべての抗体が、ヒトならびに少なくとも１つのさらなる霊長類ＥＧＦＲ、例えば、チンパンジー、マカカ・ムラタ（Macaca mulatta）、アカゲザルおよび他のサル、またはカニクイザルサル由来のＥＧＦＲに結合することが好適である。カニクイザルは、比較的小さな動物であり、そして毒物学研究について極めて適当である。従って、さらなる霊長類ＥＧＦＲは、好ましくは、カニクイザルＥＧＦＲである。好ましくは、抗体は、ほぼ同じアフィニティーでヒトおよび非ヒト霊長類ＥＧＦＲに結合する。

【0120】

本発明は、１つの組成物において２、３、４、５、６、７、および８つの抗体を組み合わせる場合、１つもしくはそれ以上の機能アッセイにおいてより優れた結果を示した。これらのデータが組成物における抗体の数の選択に対する指針を提供する一方、それらは決して限定的に解釈されるべきではない。実験データが６つの抗体の同時結合のみを示しても、組成物は８を超える抗体を含んでなり得る。例えば、抗体メンバーの浄化速度の差異のような組成物において６を超える抗体を含むための他の理由が存在し得る。

【0121】

組成物の抗体のさらなる好適な特徴は、抗体を容易に精製することができるようなタンパク質均質性である。個々の抗体メンバーについて、１つの別々のピークを伴うイオン交換クロマトグラフィープロファイルが特徴付けを容易にするために好適である。明確なイオン交換クロマトグラフィープロファイルもまた、最終的な抗体組成物の特徴付けを容易にするために好適である。イオン交換クロマトグラフィーを用いて区別することができる抗体を組み合わせる場合も、１回の実行ですべての抗体を伴う組成物を特徴付けすることができるので好適である。

【0122】

抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ラマ、ヒツジのようないずれの起源由来であってもよい。抗体はまた、実施例に記載のようなキメラであってもよく、あるいは当該分野で記載される周知の方法を用いるヒト化、超ヒト化（ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｓｅｄ）またはそれらの再構成バージョンであってもよい。

【0123】

好適な抗体組成物
添付の実施例に示されるように、抗体９９２および１０２４に基づく抗ＥＧＦＲ組成物は、独特で別々の特性を有する。抗体９９２の結合は、１０２４を含む他の抗体の結合によって増強される。市販の抗体とは対照的に、９９２および１０２４の両方は、好ましくは、細胞上に提示された高次構造エピトープに結合する（実施例１４および１５）。９９２および１０２４のエピトープは、両方ともErbituxおよびVectibixエピトープと重複するが、それらとは異なる。個々の抗体が非重複エピトープに結合する他の多くの２抗体組成物とは対照的に、抗体９９２および１０２４の結合特異性に基づく組成物は、迅速かつ効果的に受容体内在化を誘発する。インボルクリン発現の増加および癌真珠の出現によって達成される最終分化に関与する新規の作用機序が、抗体９９２および１０２４に基づく抗体組成物による処置後の動物モデルにおいて観察される。この独特な作用機序は、インビトロおよびインビボでより効果的で継続的な増殖阻害を導く。これは、処置の終了後、腫瘍が継続して低減するインビボでの実施例で最も明確に認められる。Ｅｒｂｉｔｕｘを受けたコントロールグループでは、腫瘍は、処置の終結後直ぐに増殖し始める。このことは明確に異なる作用機序を示す。

【0124】

新規の作用機序は、１つの抗体組成物における抗体９９２および１０２４によって示される２つの結合特異性の組み合わせを用いることにより行われると考えられる。この作用機序は、例えば、抗体９９２、１０２４、および１０３０の三重の組み合わせにおいて抗体９９２および１０２４と競合しない第３の抗体を使用する場合にも認められる。

【0125】

これらの観察は、少なくとも２つの別々の抗ヒトＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる抗体組成物の設計をもたらし、ここで、第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体９９２、抗体９９２のＶＬ（配列番号７２のアミノ酸３〜１０９）およびＶＨ（配列番号４０のアミノ酸３〜１２４）配列を含んでなる抗体、抗体９９２のＣＤＲ３（配列番号１１６および１１１）を有する抗体、抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体、ならびに抗体９９２のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択され；ここで、第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬ（配列番号７３のアミノ酸３〜１１４）およびＶＨ（配列番号４１のアミノ酸３〜１２０）配列を含んでなる抗体、抗体１０２４のＣＤＲ３（配列番号１２０および１１４）を有する抗体、抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体、ならびに抗体１０２４のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択される。

【0126】

好ましくは、前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体９９２、抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、抗体９９２のＣＤＲ３を有する抗体、および抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体よりなる群から選択され；そして前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、抗体１０２４のＣＤＲ３を有する抗体、および抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体よりなる群から選択される。

【0127】

本発明は、抗体に同じ結合特異性を提供するための抗体９９２および１０２４のＣＤＲ３配列における変異を考慮する。従って、一実施形態では、抗体９９２と同じ結合特異性を有する抗体は、次式：ＣＴＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３Ｘ_１４Ｘ_１５Ｗ（ここで、Ｘ_１〜Ｘ_１５は、以下に列挙するアミノ酸の群から個々に選択される
Ｘ_１＝ＲまたはＫ；
Ｘ_２＝Ｎ、Ｄ、ＥまたはＱ；
Ｘ_３＝Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＳ；
Ｘ_４＝Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱ；
Ｘ_５＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_６＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_７＝Ｖ、Ｉ、ＬまたはＡ；
Ｘ_８＝Ｓ、Ｔ、ＧまたはＡ；
Ｘ_９＝Ｓ、Ｔ、ＧまたはＡ；
Ｘ_１０＝Ｇ、Ａ、Ｖ、またはＳ；
Ｘ_１１＝Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱ；
Ｘ_１２＝Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＳ；
Ｘ_１３＝Ｍ、Ｌ、ＩまたはＶ
Ｘ_１４＝ＤまたはＥ；および
Ｘ_１５＝Ｙ、またはＦ）
を有するＣＤＲＨ３、ならびに次式：ＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＰＰＴＦ（ここで、Ｘ_１〜Ｘ_６は、以下に列挙するアミノ酸の群から個々に選択される
Ｘ_１＝ＱまたはＨ；
Ｘ_２＝Ｈ、ＥまたはＱ；
Ｘ_３＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_４＝Ｎ、ＱまたはＨ；
Ｘ_５＝Ｔ、Ｓ、ＧまたはＡ；および
Ｘ_６＝Ｖ、Ｉ、ＬまたはＡ）
によって記載されるＣＤＲＬ３を含んでなる。

【0128】

一実施形態では、抗体１０２４と同じ結合特異性を有する抗体は、次式：ＣＶＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｗ（ここで、Ｘ_１〜Ｘ_１１は、以下に列挙するアミノ酸の群から個々に選択される
Ｘ_１＝ＲまたはＫ；
Ｘ_２＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_３＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_４＝Ｇ、Ａ、Ｖ，またはＳ；
Ｘ_５＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ；
Ｘ_６＝Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱ；
Ｘ_７＝ＥまたはＤ；
Ｘ_８＝Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＳ；
Ｘ_９＝Ｍ、Ｌ、ＩまたはＶ；
Ｘ_１０＝Ｄ、Ｅ、ＮまたはＱ；および
Ｘ_１１＝Ｙ、またはＦ）
を有するＣＤＲＨ３、ならびに次式：ＣＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＰＸ_７ＴＦ（ここで、Ｘ_１〜Ｘ_７は、以下に列挙するアミノ酸の群から個々に選択される
Ｘ_１＝Ａ、Ｇ，またはＶ；
Ｘ_２＝ＱまたはＨ；
Ｘ_３＝Ｎ、ＱまたはＨ；
Ｘ_４＝Ｌ、Ｉ、ＭまたはＶ；
Ｘ_５＝Ｅ、Ｄ、ＮまたはＱ；
Ｘ_６＝Ｌ、Ｉ、ＭまたはＶ；および
Ｘ_７＝Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ）
によって記載されるＣＤＲＬ３を含んでなる。

【0129】

変異型ＣＤＲ３を伴う抗体は、一般的な技術を用いて作製され、本明細書に記載の方法を使用して発現され、結合について試験することができる。

【0130】

本発明のこの態様による抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、再構成または超ヒト化であってもよい。これは、当該技術分野において公知の方法を用いることにより行うことができる。例えば、抗体９９２および１０２４は、実施例１８に記載の方法を用いてヒト化されてもよい。「超ヒト化」の方法は、US 6,881,557に記載される。

【0131】

より好ましくは、前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体９９２、抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、ならびに抗体９９２のＣＤＲ３を有する抗体よりなる群から選択され；前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、ならびに抗体１０２４のＣＤＲ３を有する抗体よりなる群から選択される。

【0132】

より好ましくは、前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体９９２、ならびに抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体よりなる群から選択され；前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体１０２４、ならびに抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体よりなる群から選択される。

【0133】

最も好ましくは、組成物は、抗体９９２および１０２４を含んでなる。

【0134】

記載されるように、第１および第２の抗ＥＧＦＲ抗体は、好ましくは、ヒトＥＧＦＲへの結合を相互に阻害しない。さらにより好ましくは、抗体の少なくとも１つは、ヒトＥＧＦＲに関する他の抗体の最大結合能を増加させることが可能である。この効果は、抗体９９２および１０２４について観察される（実施例１６）。

【0135】

２つの抗体の間の比は、正確に１：１の割合である必要はない。結果的に、組成物における第２の抗体に対する第１の抗体の割合は、５〜９５％の間、例えば、１０〜９０％の間、好ましくは、２０〜８０％の間、より好ましくは、３０〜７０の間、より好ましくは、４０〜６０の間、例えば、４５〜５５の間、例えば、約５０％であり得る。

【0136】

好ましくは、第１および第２の抗体は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ２である。

【0137】

本発明者らによって同定された抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体の例は、クローン１２０９、１２０４、９９２、９９６、１０３３、および１２２０を含んでなる抗体クラスター由来の抗体である。

【0138】

本発明者らによって同定された抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体の例は、クローン１０３１、１０３６、１０４２、９８４、１０２４、１２１０、１２１７、１２２１、および１２１８を含んでなる抗体クラスター由来の抗体である。

【0139】

ＣＤＲ３は、抗体の結合特異性を決定する。好適な実施形態では、抗体９９２のＣＤＲ３を含んでなる抗体は、抗体９９２のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなる。同様に、抗体１０２４のＣＤＲ３を含んでなる抗体は、好ましくは、抗体１０２４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなる。抗体のＣＤＲ配列は、実施例１７の表１２に見出すことができる。

【0140】

他の実施形態では、抗体９９２と競合する抗体は、抗体１２０８、１２５４、および１２７７よりなる群から選択される。同様に、抗体１０２４と競合する抗体は、抗体１０４２および１３２０よりなる群から選択され得る。

【0141】

一実施形態では、組成物は、前記第１および第２の抗体の他にさらなる抗体を含有せず、より好ましくは、さらなる抗ＥＧＦＲ抗体を含有しない。

【0142】

他の実施形態では、組成物は、第３の別々の抗ＥＧＦＲ抗体を含んでなり、ここで、前記第３の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子は、抗体１０３０、抗体１０３０のＶＬ（配列番号７４のアミノ酸３〜１１３）およびＶＨ（配列番号４２のアミノ酸３〜１２０）配列を含んでなる抗体、抗体１０３０のＣＤＲ３（配列番号１１２および１１９）を有する抗体、抗体１０３０と同じエピトープに結合する抗体、ならびに抗体１０３０のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択される。前記第３の抗体は、好ましくは、前記第１および／または第２の抗体のヒトＥＧＦＲへの増強された結合を生じる。一実施形態では、組成物は、前記第１、第２および第３の抗体の他にさらなる抗体を含有せず、より好ましくは、さらなる抗ＥＧＦＲ抗体を含有しない。

【0143】

抗体１０３０と同じエピトープに結合する抗体は、クローン１１９５、１０３０、１０３４、１１９４、９８０、９８１、１２４６、および１２２３からなる抗体クラスターから選択され得る。

【0144】

抗体１０３０のＣＤＲ３を含んでなる抗体は、抗体１０３０のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなり得る。

【0145】

抗体は、投与のために１つの容器に処方されてもよい。しかし、それらは、個々に製造、精製および特徴付けされ得、そして各容器中の１つの抗体と共に、１つのキットの部品として、２つもしくは３つの別々の容器で提供され得る。このように、それらは、同時、連続的または別々に投与され得る。

【0146】

さらなる態様では、抗体９９２および１０２４の２つの結合特異性は、１つの二重特異性結合分子に組み合わせられる。好ましくは、二重特異性結合分子は、抗体９９２および１０２４のＣＤＲ、より好ましくは、抗体９９２および１０２４のＶＨおよびＶＬ配列を含んでなる。二重特異性結合分子は、実施例１９に記載のように、二重可変ドメイン抗体であってもよい。二重特異性結合分子はまた、文献に記載のような二重特異性Ｆａｂフラグメント、二重特異性ｓｃＦＶ、またはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）の形態で設計されてもよい。

【0147】

結合特異性ｐｆ抗体９９２および１０２４に基づく抗体組成物は、好ましくは、１回もしくはそれ以上の受容体内在化、インビボでのＡ４３１ＮＳ腫瘍の退行、インビボでのＡ４３１ＮＳ細胞の最終分化の誘導、およびインビボでの腫瘍インボルクリン発現の上方調節を誘導する。

【0148】

本出願は、抗体９９２および１０２４の組み合わせと同一または類似の効果を及ぼす抗体のいくつかの例を提供する。これらの例として、同じ免疫化から入手され、そして同じクラスターに属する抗体、および２つの抗体のうちの１つと個々に競合する抗体が挙げられる。同一または類似の効果を伴う抗体組成物は、抗体９９２および１０２４のＶＬおよびＶＨ配列に基づいて、ならびにまたこれらの抗体のＣＤＲ、特に、２つの抗体のＣＤＲ３に基づいて設計され得る。

【0149】

同一または類似の効果を伴うさらなる抗体組成物は、実施例に記載のように、基本的に、免疫化およびスクリーニングを行うことにより作製し得る。抗体９９２および１０２４と同じ結合特異性を伴う抗体は、本明細書に記載される２つの別々の競合アッセイにおいて同定され得る。最終的に、１つの抗体が他の抗体の結合を増強する抗体組成物は、実施例１６に記載のように、基本的に、結合実験を行うことによって同定され得る。抗体組成物は、受容体内在化、インビトロおよびインビボでの効力、結合アフィニティーなどにおける効果に関して、実施例において記載のようにさらにスクリーニングされ得る。

【0150】

本発明の抗体組成物の使用
ＥＧＦＲ発現に関連する疾患（例えば、過剰発現）のインビボでの治療および防止に使用するために、本発明の抗体は、抗体に基づく臨床的製品に関する分野で公知の注入および他の投与経路のごとく、いずれかの適切な投与経路を用いて、治療上有効な量（例えば、増殖阻害、食作用、運動性の減少、最終分化、および／またはＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞の死滅を生じる用量）で患者（例えば、ヒト被験体）に投与される。

【0151】

本発明の抗体を用いて治療、改善および／または防止することができる典型的なＥＧＦＲ関連疾患として、自己免疫疾患および癌が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、処置、改善、および／または防止することができる癌として、膀胱、胸部、子宮／頚部、結腸、腎臓、卵巣、前立腺、腎細胞、膵臓、結腸、直腸、胃、扁平細胞、肺（非小細胞）、食道、頭頚部、皮膚の癌が挙げられる。処置し得る自己免疫疾患として、例えば、乾癬が挙げられる。

【0152】

なお別の実施形態では、本発明は、多型性神経膠芽腫を含む神経膠芽腫；小児期星細胞腫を含む星細胞腫；神経膠腫；神経芽腫；消化管の神経内分泌腫瘍；気管支肺胞癌；濾胞樹状細胞肉腫；唾液腺癌；エナメル上皮腫；悪性の末梢神経シート状腫瘍；膵内分泌腫瘍；または精上皮腫、胚性癌腫、卵黄嚢腫瘍、奇形腫および絨毛癌を含む精巣胚細胞腫瘍の治療、改善、および／または防止のための方法に関する。

【0153】

可変重鎖および可変軽鎖をコードするペアの単離および選択
抗ＥＧＦＲ組み換え抗体組成物を作製するプロセスは、適切な供給源に由来する可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）をコードする配列の単離に関し、それによりＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーが作製される。一般的に、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列を入手するのに適切な供給源は、ヒトＥＧＦＲポリペプチドもしくはペプチド、またはヒトＥＧＦＲを発現する細胞に由来するＥＧＦＲタンパク質、またはヒトＥＧＦＲを発現する細胞もしくはそのような細胞の画分を用いて免疫／ワクチン接種した非ヒト動物由来の血液、脾臓あるいは骨髄サンプルのような細胞画分を含有するリンパ球である。好ましくは、リンパ球を含有する画分は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を伴う非ヒト哺乳動物またはトランスジェニック動物から回収される。回収したリンパ球含有細胞画分は、さらに富化されて、一定のリンパ球集団、例えば、Ｂリンパ球系統由来の細胞が入手されてもよい。好ましくは、富化は、磁気ビーズ細胞選別（ＭＡＣＳ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて実施され、それらは、例えば、Ｂ細胞、血漿芽細胞および／または形質細胞などの系統特異的細胞表面マーカータンパク質を利用して行われる。好ましくは、リンパ球含有細胞画分は、Ｂ細胞、血漿芽細胞および／または形質細胞に関して富化または選別される。さらにより好ましくは、ＣＤ４３およびＣＤ１３８の高度の発現を伴う細胞は、脾臓または血液から単離される。これらの細胞は、時々、循環形質細胞、前駆形質細胞または血漿芽細胞と呼ばれる。便宜上、本発明において、単に形質細胞と呼ぶが、他の用語も同じ意味として使用され得る。

【0154】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列の単離は、いずれも、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列がベクターにおいて無作為に組み合わされることにより、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列ペアのコンビナトリアルライブラリーが作製される古典的方法で実施することができる。しかし、本発明では、ＥＧＦＲ免疫化時の液体性免疫応答で産生される抗体の多様性、アフィニティーおよび特異性を反映することが好ましい。これは、ドナーに元々存在するＶ_ＨおよびＶ_Ｌペア形成の保持に関与し、それにより配列ペアのレパートリーを作製し、ここで、各ペアは、配列が単離されるドナーにより産生される抗体に元々存在するＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアに対応する可変重鎖（Ｖ_Ｈ）および可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）をコードするものである。これはまた、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列の同族ペアとも呼ばれ、そして抗体は同族抗体と呼ばれる。好ましくは、本発明のＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペア（コンビナトリアルまたは同族）は、マウスドナーから得られ、それゆえ配列はマウス由来である。

【0155】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの同族ペアをコードする配列の作製のための異なるいくらかのアプローチが存在し、１つのアプローチは、リンパ球含有細胞画分から選別された単一の細胞由来のＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列の増幅および単離に関与する。ドナーにおけるＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列ペアの多様性を模倣するＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列ペアのレパートリーを入手するために、できる限り少ないＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアのスクランブル（無作為な組み合わせ）を伴うハイスループット方法は、例えば、本明細書に出典明示により援用されるWO 2005/042774に記載されるものが好ましい。

【0156】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列は別々に増幅され、第２の工程でペア形成されてもよく、あるいは増幅中にペア形成されてもよい（Coronella et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28: E85；Babcook et al 1996. PNAS 93: 7843-7848およびWO 2005/042774）。第２のアプローチは、細胞内増幅、ならびにＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードする配列のペア形成に関与する（Embleton et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837；Chapal et al. 1997. BioTechniques 23: 518-524）。第３のアプローチは、溶血プラークアッセイと、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬｃＤＮＡのクローニングとを組み合わせる選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ）（Babcook et al. 1996. PNAS 93:7843-7848）である。マウスと一緒に用いることができる別の方法は、標準的なハイブリドーマ技術、続いてリード候補のスクリーニングおよび選択、次いでコードされた抗体のクローニングである。

【0157】

本発明の好適な実施形態では、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーは、メンバーのペアがＥＧＦＲ免疫化から生じる体液性免疫応答を担う遺伝子ペアを反映し、次の工程を含んでなる方法に従って作製される：ｉ）ヒトＥＧＦＲで免疫した動物ドナー由来のリンパ球含有細胞画分を提供すること；ｉｉ）任意選択的に、前記細胞画分由来のＢ細胞または形質細胞を富化すること；ｉｉｉ）前記細胞画分由来の細胞を個々に複数の容器に分配することを含んでなる、単離された単一の細胞の集団を入手すること；ｉｖ）前記単離された単一の細胞に由来するテンプレートを用いる多重重複伸長ＲＴ−ＰＣＲ法において、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアを増幅し、それらの連結を行うこと、次いでｖ）任意選択的に、連結されたＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするペアのネステッドＰＣＲを実施すること。好ましくは、単離された同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアは、以下に記載のごとくスクリーニング手順に供される。

【0158】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列ペアが作製されると、ＥＧＦＲ関連抗原に対する結合反応性を伴うＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアをコードする配列を同定するためのスクリーニング手順が行われる。好ましくは、ＥＧＦＲ関連抗原は、ドメインＩＩＩ、ＩＩ、Ｉ、および／またはＩＶ、ドメインのフラグメントあるいは完全な細胞外ドメインのごときＥＧＦＲの細胞外部分を含んでなる。その他の抗原として、ＥＧＦＲの欠失変異もしくはＳＮＰ、またはそれらのフラグメントのような変異体が挙げられる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列ペアがコンビナトリアルである場合、ファージディスプレイ手順は、スクリーニング前にＥＧＦＲに結合する抗体フラグメントをコードするＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアを富化するのに適用することができる。

【0159】

ＥＧＦＲによる免疫化時に体液性免疫応答において産生される抗体の多様性、アフィニティーおよび特異性を反映させるために、本発明は、最も可能で広範な多様性を得るために、同族ペアのスクリーニング手順を開発した。スクリーニングのために、同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーは、適切な宿主細胞にトランスフェクトされた細菌または哺乳動物スクリーニングベクターのいずれかを使用して、抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖもしくはＦａｂ）または全長抗体としてのいずれかで個々に発現される。Ｆａｂ／抗体のレパートリーは、ＥＧＦＲに対する反応性、ＥＧＦＲを発現する癌細胞系統に対する抗増殖活性、およびＥＧＦＲに結合するリガンド（例えば、ＥＧＦ）を阻害する能力、リン酸化、アポトーシス誘導、ＥＧＦＲ内在化の阻害（これらに限定されるものではない）についてスクリーニングされてもよい。

【0160】

同時に、Ｆａｂ／抗体のレパートリーは、ヒト、場合によりカニクイザルまたはチンパンジーまたはアカゲザルのＥＧＦＲペプチドのような選択された抗原に対してスクリーニングされる。抗原性ペプチドは、例えば、ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン、ヒト変異ＥＧＦＲ細胞外ドメイン、およびカニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメインまたはそれらのフラグメントから選択することができる。ペプチドはビオチン化されることにより、スクリーニング時のビーズまたはプレート上への固定化が容易にされてもよい。代替的な固定化の手法がもちいられてもよい。抗原は、ＥＧＦＲ生物学の知見、ならびにこれらの抗原に結合することが可能な抗体が潜在的に提供できる予想される中和および／または保護効果に基づいて選択される。このスクリーニング手順は、同様にコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーに適用することができる。

【0161】

スクリーニングに用いられる組み換えＥＧＦＲタンパク質は、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞または別の適切な発現系で発現されてもよい。正確なプロセシング（グリコシル化を含む）のために、タンパク質は哺乳動物細胞で発現される。ＥＧＦＲ−ＥＣＤタンパク質は、（膜貫通および細胞内領域を含まない）可溶性タンパク質として発現されてもよく、あるいは第３のタンパク質に融合されて安定性が増加されてもよい。ＥＧＦＲタンパク質が融合タグを用いて発現される場合、融合パートナーはスクリーニング前に切り離されてもよい。上記の一次スクリーニングに加えて、選択された配列のいずれもが偽陽性をコードしないことを確実にするために、二次スクリーニングが実施されてもよい。

【0162】

一般的に、免疫学的アッセイは、本発明で実施されるスクリーニングに適切である。そのようなアッセイは当該分野において周知であり、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡ、膜アッセイ（例えば、ウエスタンブロット）、フィルターにおけるアッセイ、およびＦＡＣＳを構成する。アッセイは、いずれも事前の富化工程をなんら伴わずに、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌペアをコードする配列から産生されるポリペプチドを利用して実施することができる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーが同族ペアである場合、例えば、ファージディスプレイによる富化はスクリーニング前に必要ではない。しかし、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングでは、イムノアッセイは、好ましくは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌表面ディスプレイ、酵母ディスプレイ、真核生物ウイルスディスプレイ、ＲＮＡディスプレイもしくは共有結合ディスプレイのような富化方法と組み合わせて、またはそれらの後に実施される（FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258にて総説された）。

【0163】

スクリーニングで選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアをコードする配列は、一般的に、配列決定に供され、そして可変領域の多様性について分析される。特に、ＣＤＲ領域の多様性は興味深いが、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌファミリーの提示もまた興味深い。これらの分析に基づいて、１つもしくはそれ以上の動物ドナーから単離されたＥＧＦＲ結合抗体の全ての多様性を示すＶ_ＨおよびＶ_Ｌペアをコードする配列が選択される。好ましくは、すべてのＣＤＲ領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）における差異を有する配列が選択される。異なるＶ_ＨまたはＶ_Ｌファミリーに属する１つもしくはそれ以上の同一または極めて類似のＣＤＲ領域を有する配列が存在する場合、これらもまた選択される。好ましくは、少なくとも可変重鎖（ＣＤＲＨ３）のＣＤＲ３領域は、選択される配列ペア間で異なる。潜在的に、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列ペアの選択は、厳密に、ＣＤＲＨ３領域の可変性に基づき得る。配列のプライミングおよび増幅中、可変領域のフレームワーク領域、特に、第１のフレームワーク領域において、変異が生じてもよい。好ましくは、第１のフレームワーク領域で生じるエラーは、配列は、生殖系列由来のものに完全または少なくとも９８％相同であることを確実にするために補正され、例えば、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列は完全にマウスとする。

【0164】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌペアをコードする選択された配列のコレクションの全多様性が、ＥＧＦＲ免疫化に対する体液性応答における遺伝子レベルで認められる多様性の高度な提示であることが確実とされる場合、選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションから発現される抗体の全体の特異性もまた、ＥＧＦＲ免疫化動物で産生される抗体の特異性に関する提示であることが予想される。選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションから発現される抗体の特異性が、ドナーによって惹起される抗体の特異性の提示であるかどうかの指標は、ドナー血液の選択された抗原に対する抗体力価と、選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションから発現される抗体の特異性とを比較することにより得ることができる。さらに、選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションから発現される抗体の特異性はさらに分析されうる。特異性の程度は、結合反応性が検出され得る異なる抗原の数に相関する。本発明のさらなる実施形態では、選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションから発現される個々の抗体の特異性は、エピトープマッピングによって分析される。

【0165】

エピトープマッピングは、必ずしも相互に排他的でない多くの方法論によって実施され得る。抗体分子のエピトープ−特異性をマッピングするための１つの方法は、標的抗原の一次構造に由来する様々な長さのペプチドへの結合を測定することである。そのようなペプチドは、線状および高次構造の両方であってもよく、ＥＬＩＳＡ、ＦＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、Biacore、ＦＡＣＳ）を含む多くのアッセイ形式で用いられてもよい。さらに加えて、ペプチドは、利用可能な配列と構造データを用いて合理的に選択されて、例えば、標的抗原の細胞外領域もしくは保存領域が表されてもよく、あるいは抗原の選択された部分もしくはすべてを表す重複ペプチドのパネルとして設計されてもよい（Meloen RH, Puijk WC, Schaaper WMM. Epitope mapping by PEPSCAN. In: Immunology Methods Manual. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp 982-988)。抗体クローンと、１つもしくはそれ以上のそのようなペプチドとの特異的反応性は、一般的にエピトープ特異性の指標となる。しかし、ペプチドは、多くの場合、天然または特異的コンホメーションの欠落および抗体とペプチドで比較されるごとき抗体とタンパク質抗原との間の相互作用の一般的により大きく埋もれた表面領域の双方のため、タンパク質性抗原に対して惹起された抗体によって認識されるエピトープの質の悪い模倣品となる。エピトープマッピングのための第２の方法は、タンパク質抗原における直接的に特異性を定義することを可能にし、現存のよく定義された抗体を用いて遮蔽する選択性エピトープによるものである。遮断後の抗原に対する抗体をプローブする第２の結合の減少は、一般的に、エピトープの共有または重複を示す。選択的遮蔽によるエピトープマッピングは、当該技術分野において周知であるＥＬＩＳＡおよびBiacoreを含むが、これらに限定されない多くのイムノアッセイにより実施されてもよい（例えば、Ditzel et al. 1997. J. Mol. Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll et al. 2005. J. Virol. 79: 6260-6271）。抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープ特異性の決定のためのなお別の潜在的方法は、抗体の存在下におけるエスケープ変異の選択である。これは、例えば、アラニン−スキャンを用いて行うことができる。そのようなエスケープ変異由来の目的の遺伝子の配列決定は、一般的に、抗原中のどのアミノ酸が抗体による認識に重要であり、それ故、エピトープ（の部分）を構成するのかを示す。

【0166】

選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアに由来する抗ＥＧＦＲ抗体組成物の産生
本発明の抗体組成物は、１つまたは数個のバイオリアクターまたはそれらの同等物中のポリクローナル発現細胞系統から産生されてもよい。このアプローチ後、抗ＥＧＦＲ抗体は、プロセス中に抗ＥＧＦＲ抗体組成物を構成する個々のメンバーを分離する必要なく、単一調製物としてリアクターから精製することができる。抗体組成物が１を超えるバイオリアクターで産生される場合、精製された抗ＥＧＦＲ抗体組成物は、各バイオリアクター由来の個々に精製された上清から得られた抗体をプールすることにより得ることができる。

【0167】

組み換え抗体組成物を産生させる１つの方法は、WO 2004/061104およびWO 2006/007850（これらの参考文献は本明細書にて出典明示により援用される）に記載される。本明細書に記載される方法は、個々の宿主細胞のゲノムへの抗体をコードする配列の部位特異的組み込みに基づくものであって、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌタンパク質鎖が産生中の元々のペア形成で保持されることを確実にする。さらに加えて、部位特異的組み込みは位置効果を最小限にし、それゆえポリクローナル細胞系統における個々の細胞の増殖および発現特性が極めて類似することが期待される。一般的に、方法は以下を含む：ｉ）１つもしくはそれ以上のリコンビナーゼ認識部位を伴う宿主細胞；ｉｉ）宿主細胞に適合する少なくとも１つのリコンビナーゼ認識部位を伴う発現ベクター；ｉｉｉ）全長抗体または抗体フラグメントがベクターから発現され得るように、選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアをスクリーニングベクターから発現ベクターへ移すことによる発現ベクターのコレクションの作製（スクリーニングベクターが発現ベクターと同一である場合、かかる移行は必要でなくてもよい）；ｉｖ）宿主細胞のゲノムにおけるリコンビナーゼ認識部位と、ベクターおけるそれとを組み合わせることが可能なリコンビナーゼをコードする発現ベクターとベクターのコレクションを用いる宿主細胞のトランスフェクション；ｖ）トランスフェクトされた宿主細胞からポリクローナル細胞系統を入手／作製すること、次いでｖｉ）ポリクローナル細胞系統から抗体組成物を発現させ、回収すること。

【0168】

少数（２〜３もしくはそれ以上）の抗体が１つの組成物に使用される場合、これらは、例えば、WO 2004/085474に記載のモノクローナル抗体の製造と類似する方法で、個々的に発現され、精製されてもよい。精製された抗体は、精製後に混合することができるか、あるいは投与前に混合するもしくは個別に投与するために別々のバイアルに包装することができる。

【0169】

好ましくは、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０もしくはＮＳ０細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３のような繊維芽細胞、およびＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６のような不死化ヒト細胞が使用される。しかしまた、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのような非哺乳動物真核細胞または原核細胞を用いることもできる。適切な宿主細胞は、そのゲノムにおいて１つもしくはそれ以上の適切なリコンビナーゼ認識部位を含んでなる。宿主細胞はまた、組込み体（即ち、組み込み部位において抗ＥＧＦＲ Ａｂ発現ベクターまたは発現ベクターフラグメントの組み込まれたコピーを有する細胞）について選択できるために、組み込み部位に作動可能に連結される選択の様式を含有すべきである。ゲノムの予定された位置にＦＲＴ部位を有する細胞の調製は、例えば、US 5,677,177に記載された。好ましくは、宿主細胞は、唯一、組込み体の高い発現を可能にする部位（いわゆるホットスポット）に局在する単一の組み込み部位を有する。

【0170】

適切な発現ベクターは、宿主細胞のリコンビナーゼ認識部位に合致する組み換え認識部位を含んでなる。好ましくは、リコンビナーゼ認識部位は、宿主細胞の構築のために使用される選択遺伝子とは異なる適切な選択遺伝子に連結される。選択遺伝子は、当該技術分野において周知であり、グルタミンシンテターゼ遺伝子（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、およびネオマイシンを含み、ここで、ＧＳまたはＤＨＦＲは、挿入されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列の遺伝子増幅に使用されてもよい。ベクターはまた、ベクターの完全組み込みの代わりに、挿入された抗体をコードする配列のリコンビナーゼ仲介カセット交換（ＲＭＣＥ）を可能にする２つの異なるリコンビナーゼ認識部位を含有してもよい。ＲＭＣＥについては、（Langer et al 2002; Schlake and Bode 1994）に記載される。適切なリコンビナーゼ認識部位は当該技術分野において周知であり、ＦＲＴ、ｌｏｘおよびａｔｔＰ／ａｔｔＢ部位を含む。好ましくは、組み込みベクターは、アイソタイプをコードするベクターであり、ここで、定常領域（好ましくは、イントロンを含む）は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのスクリーニングベクターからの移行前にベクターに存在する（あるいは定常領域は、スクリーニングが全長抗体において実施される場合にスクリーニングベクターにすでに存在する）。ベクターに存在する定常領域は、重鎖定常領域全体（ＣＨ_１〜ＣＨ_３もしくは〜ＣＨ_４）または抗体のＦｃ部分をコードする定常領域（ＣＨ_２〜ＣＨ_３もしくは〜ＣＨ_４）のいずれかであり得る。軽鎖κまたはλ定常領域はまた、移行前に存在してもよい。定常領域の数の選択は、いずれにしても、使用するスクリーニングおよび移行システムに依存する。重鎖定常領域は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥから選択することができる。好適なアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、および／またはＩｇＧ３である。さらに、抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸の部位特異的組み込みのための発現ベクターは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖のそれぞれの高レベルの発現を指令する適切なプロモーターまたは同等な配列を含有する。図４は、発現ベクターを設計する１つの可能な方法を例示するが、他に多数の設計が可能である。

【0171】

選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのスクリーニングベクターからの移行は、各発現ベクター分子が１つのＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアを含有するように、コンビナトリアル制限酵素切断およびライゲーションによって実施することができる。好ましくは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアは個々に移行されるが、しかし、所望であれば、それらはまた、一括しておこうされてもよい。全ての選択されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアが発現ベクターに移行されると、発現ベクターのコレクションまたはライブラリーが得られる。また、所望であれば、移行の代替的方法が使用されてもよい。スクリーニングベクターが発現ベクターと同一である場合、発現ベクターのライブラリーは、スクリーニングの際に選択されるＶ_ＨおよびＶ_Ｌ配列ペアから構成され、スクリーニング／発現ベクター中にあることになる。

【0172】

核酸配列を宿主細胞にトランスフェクトする方法は、当該技術分野において公知である。部位特異的組み込みを確実にするために、適切なリコンビナーゼも宿主細胞に提供されなければならない。これは、好ましくは、リコンビナーゼをコードするプラスミドの共トランスフェクションによって達成される。適切なリコンビナーゼは、例えば、Ｆｌｐ、ＣｒｅまたはファージΦＣ３１インテグラーゼであり、対応するリコンビナーゼ認識部位を伴う宿主細胞／ベクター系と一緒に使用される。宿主細胞は、いずれも大量にトランスフェクトすることができ、発現ベクターのライブラリーが１回の単一反応で細胞系統にトランスフェクトされ、それによってポリクローナル細胞系統が得られることを意味する。あるいは、発現ベクターのコレクションは個々に宿主細胞にトランスフェクトすることができ、それによって個々の細胞系統のコレクションが作製される（各細胞系統は、特定の特異性を伴う抗体を産生する）。次いで、トランスフェクション（個々のまたはポリクローナル）により作製された細胞系統は、トランスフェクション前に未だこれらの特性を有していなかった場合、部位特異的組み込み体について選択され、懸濁および無血清培地で増殖するように適応される。トランスフェクションが個々に実施された場合、個々の細胞系統は、それらの増殖特性および抗体産生についてさらに分析される。好ましくは、同様の増殖速度および抗体発現レベルを伴う細胞系統は、ポリクローナル細胞系統の作製について選択される。次いで、ポリクローナル細胞系統は、所定の割合で個々の細胞系統を混合することにより作製される。一般的に、ポリクローナルマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）、ポリクローナルリサーチ細胞バンク（ｐＲＣＢ）および／またはポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）がポリクローナル細胞系統から樹立される。ポリクローナル細胞系統は、所定の割合で個々の細胞系統を混合することにより作製される。ポリクローナル細胞系統はアンプルに分配され、それによりポリクローナルリサーチ細胞バンク（ｐＲＣＢ）またはマスター細胞バンク（ｐＭＣＢ）が作製され、リサーチまたはマスター細胞バンクから細胞を拡大培養することによりポリクローナルワーキング細胞バンク（ｐＷＣＢ）を作製することができる。リサーチ細胞バンクは、主として、概念実証研究のためのものであり、そのなかでは、ポリクローナル細胞系統はマスター細胞バンクにおけるポリクローナル細胞系統と同じ数の個々の抗体を含まなくてもよい。通常、ｐＭＣＢはさらに拡大培養されて産生のためにｐＷＣＢが樹立される。ｐＷＣＢが使い果たされると、ｐＭＣＢ由来の新しいアンプルが拡大培養されて新たなｐＷＣＢが樹立され得る。

【0173】

本発明の一実施形態は、本発明の組み換え抗ＥＧＦＲ抗体組成物を発現することが可能なポリクローナル細胞系統である。

【0174】

本発明のさらなる実施形態はポリクローナル細胞系統であって、ここで、各個々の細胞は、単一のＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアを発現することが可能であり、全体としてポリクローナル細胞系統は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションを発現することが可能であり、ここで、各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌペアは抗ＥＧＦＲ抗体を発現する。好ましくは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのコレクションは、本発明の方法により作製される同族ペアである。

【0175】

本発明の組み換え抗体組成物は、ｐＷＣＢ由来の１つのアンプルを、適切な培地において、抗体の十分な発現を可能にする期間培養することにより製造することができ、ここで、ポリクローナル細胞系統は安定に保持する（期間は約１５日間〜５０日間の間である）。流加培養または還流のような培養方法が用いられてもよい。組み換え抗体組成物は、従来の精製技術により培養培地から入手され、精製される。イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用およびゲルろ過のような後の精製工程と組み合わせたアフィニティークロマトグラフィーがＩｇＧの精製のために頻繁に使用されている。精製後、ポリクローナル抗体組成物におけるすべての個々のメンバーの存在は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーによって評価される。そのような抗体組成物の特徴付けは、（本明細書において出典明示により援用される）WO 2006/007853に詳細に記載される。

【0176】

組み換え宿主において抗体の混合物を発現させる代替的方法は、WO 2004/009618に記載される。この方法は、単一の細胞系統由来の同じ軽鎖に結合する異なる重鎖を伴う抗体を産生する。このアプローチは、抗ＥＧＦＲ抗体組成物がコンビナトリアルライブラリーから産生される場合に適用可能であり得る。

【0177】

治療用組成物
本発明の別の態様は、有効成分として、抗ＥＧＦＲ抗体組成物または抗ＥＧＦＲ組み換えＦａｂもしくは別の抗ＥＧＦＲ組み換え抗体フラグメント組成物、あるいは本発明の二重特異性結合分子を含んでなる医薬組成物である。好ましくは、そのような組成物の有効成分は、本発明に記載のような抗ＥＧＦＲ組み換え抗体組成物である。そのような組成物は、癌の改善および／または防止および／または処置が意図される。好ましくは、医薬組成物は、ヒト、家畜、またはペットに投与される。

【0178】

医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなる。

【0179】

抗ＥＧＦＲ抗体組成物またはその抗体のフラグメントは、単位剤形において、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、または賦形剤内に投与されてもよい。従来の薬学的業務が用いられて癌を伴う患者に投与するための適切な処方物または組成物が提供されてもよい。好適な実施形態では、投与は治療的であり、治療的とは、癌病態が診断された後、それが投与されることを意味する。いずれの適切な投与経路が用いられてもよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、エアゾル、坐剤、または経口投与であってもよい。例えば、医薬処方物は、液体の溶液または懸濁液の形であってもよい。経口投与のためには、胃における分解に対して保護する必要がある。鼻腔内処方のために、抗体は、散剤、点鼻剤、またはエアゾルの形で投与されてもよい。

【0180】

本発明の医薬組成物は、例えば、従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒または調合プロセスによるそれ自体公知の様式で調製される。医薬組成物は、従来の薬学的業務に従って処方されてもよい（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NYを参照のこと）。

【0181】

好ましくは、有効成分の溶液または懸濁液、特に等張水溶液または懸濁液が本発明の医薬組成物を調製するのに用いられる。有効成分を単独で、またはキャリア、例えば、マンニトールを伴って含んでなる凍結乾燥された組成物の場合、そのような溶液または懸濁液は、できる限り使用前に産生されてもよい。医薬組成物は、滅菌されてもよく、および／または、賦形剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、溶解剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液を含んでいてもよく、それ自体公知の様式、例えば、従来の溶解もしくは凍結乾燥プロセスで調製される。前記溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンのような増粘物質を含んでもよい。

【0182】

注入組成物は、滅菌条件下、慣用の様式で調製され；同様のことが、組成物のアンプルまたはバイアルへの導入および容器の密封にも適用される。

【0183】

医薬組成物は、約１％〜約９５％、好ましくは、約２０％〜約９０％の有効成分を含んでなる。本発明による医薬組成物は、例えば、アンプル、バイアル、坐剤、錠剤、丸剤、またはカプセルの形態のごとく単位剤形であってもよい。処方物は、治療上または予防上有効な量（例えば、病理学的病態を防止、排除、もしくは減少させる量）でヒト個体に投与されて疾患もしくは病態の治療を提供することができる。投与されるべき治療用薬剤の好適な用量は、癌の重症度、特定の患者の総合的健康状態、化合物賦形剤の処方、およびその投与経路のような変化に依存する可能性がある。

【0184】

本発明による組成物の治療用途
本発明による医薬組成物は、哺乳動物における疾患の治療または改善に使用されてもよい。本医薬組成物によって治療または防止することができる状態は、患者の癌の予防、および処置を含み、好ましくは、本発明による医薬組成物を用いる治療処置に供され得る。

【0185】

本発明の一実施形態は、本発明の抗ＥＧＦＲ組み換え抗体組成物の有効量を前記哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における癌に関連する１つもしくはそれ以上の症状を防止、治療または改善する方法である。

【0186】

本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物における癌に関連する１つもしくはそれ以上の症状の治療、改善または防止のための組成物の調製のための本発明の抗ＥＧＦＲ組み換え抗体組成物の使用である。

【0187】

好ましくは、上記の実施形態における哺乳動物は、ヒト、家畜またはペットである。

【0188】

本発明に従う抗体は、一定の固形腫瘍の治療において適応される。ＥＧＦＲ発現レベルを含む多くの因子に基づいて、特に、次の腫瘍タイプが、好適な適応症として認められるようである：胸部、卵巣、結腸、直腸、前立腺、膀胱、膵臓、頭頚部、および非小細胞肺癌。これらの適応症に関連して、３つの臨床経路は、臨床的成功のための別々の可能性を付与するようである：

【0189】

補助療法：補助療法では、患者は、化学療法剤もしくは抗悪性腫瘍剤および／または放射線治療との組み合わせで本発明に従う抗体で処置される。上記で列挙した主な標的は、本発明の抗体の標準的な第１および第２選択療法への追加によるプロトコル下で処置される。プロトコルの設計は、腫瘍量の減少によって評価される有効性ならびに一般的な化学療法の通常用量を減少させるための能力に取り組む。これらの用量の減少は、化学療法剤の用量に付随する毒性を減少させることにより、治療の追加および／または延長を可能にする。先行技術の抗ＥＧＦＲ抗体は、化学療法剤または抗悪性腫瘍剤、アドリアマイシン（Erbitux：進行前立腺癌腫）、シスプラチン（Exbitux：進行頭頚部および肺癌腫）、タキソール（Erbitux：乳癌）、およびドキソルビシン（Erbitux）と組み合わせたいくつかの補助的臨床治験において利用されてきたか、または現在も利用されている。

【0190】

本発明は、癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして、本発明の抗体組成物、および癌細胞の分化を誘導することが可能な少なくとも１つの化合物を含んでなる医薬物品を提供する。本発明の抗体組成物と、癌細胞の最終分化を誘導することが公知の薬剤とを組み合わせることによって、さらに効果を改善することができる。

【0191】

少なくとも１つの化合物は、レチノイン酸、ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、ｃｉｓ−レチノイン酸、フェニル酪酸、神経成長因子、ジメチルスルホキシド、活性型ビタミンＤ（３）、ペルオキシソーム増殖因子−活性化受容体γ、１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート、ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド、形質転換増殖因子−β、酪酸、サイクリックＡＭＰ、およびベスナリノンよりなる群から選択され得る。好ましくは、化合物は、レチノイン酸、フェニル酪酸、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、活性型ビタミンＤよりなる群から選択される。

【0192】

本発明の抗体組成物および少なくとも１つの化学療法または抗悪性腫瘍化合物を含んでなる医薬物品は、癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして使用されてもよい。化学療法化合物は、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、トポテカン、フルオロピリミジン、オキサリプラチン、およびイリノテカンよりなる群から選択され得る。

【0193】

単剤療法：腫瘍の単剤療法における本発明に従う抗体の使用に関連して、抗体は、化学療法または抗悪性腫瘍剤を伴わずに患者に投与されてもよい。本発明による抗体の使用を通して作製され、本明細書において考察される前臨床結果は、独立型療法としてポジティブな結果を示した。

【0194】

造影剤：放射性核種（例えば、イットリウム（^９０Ｙ））を本発明に従う抗体に結合させることにより、本発明に従う放射性標識抗体は、診断用造影剤として利用することができることが予想される。そのような役割において、本発明の抗体は、固形腫瘍、ならびにＥＧＦＲを発現する細胞の転移性病巣の両方に局在する。造影剤としての本発明の抗体の使用に関連して、固形腫瘍の外科的処置を保持する際に、術前のスクリーニング、ならびにどの腫瘍が残留し、および／または回帰するかを決定するための術後追跡の両方として、抗体を使用することができる。（^１１１Ｉｎ）−Erbitux抗体は、切除不能な扁平細胞肺癌腫を有する患者の第Ｉ相のヒト臨床治験における造影剤として使用されている。（Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991）。患者は一般的な前後（ａｎｔｅｒｉｏｒ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）ガンマカメラで追跡された。予備データは、すべての原発性病巣および大きな転移性病巣が同定された一方、小さな転移性病巣（１ｃｍ未満）のわずか２分の１しか検出されなかったことを示した。

【0195】

チロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）は、合成の、主にキナゾリン誘導性の低分子量分子であり、受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインと相互作用し、細胞内Ｍｇ−ＡＴＰ結合部位について競合することによりリガンド誘導性受容体リン酸化を阻害する。Gefitinib（Iressa、ZD1839）、Erlobtinib（Tarceva、OSI-774）、Lapatinib、（Tykerb、GW572016）、Canertinib（CI-1033）、EKB-569およびPKI-166を含む臨床開発におけるいくつかのＴＫＩは、ＥＧＦＲを標的としている。ＴＫＩおよび抗ＥＧＦＲの組み合わせ処置は、ＥＧＦＲ依存性癌細胞に対するインビボおよびインビトロの両方で有益であることを示した。本発明の抗体組成物、およびＥＧＦＲを標的とする少なくとも１つのＴＫＩを含んでなる医薬物品は、癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして使用されてもよい。さらなる小分子インヒビターとして：Sorafinib（ｒａｆおよび複数のＲＴＫ）、Sunitinib（複数のＲＴＫ）、Temsirolimus（ｍＴＯＲ）、RAD001（ｍＴＯＲ）、ならびにAZD217（ＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。

【0196】

他の実施形態では、本発明の抗体組成物は、他の抗体療法と組み合わせて使用される。これらの例として、例えば、ＨＥＲ２（Herceptin）およびＶＥＧＦ（avastin）に対する抗体が挙げられる。なお別の実施形態では、本発明の抗体組成物は、免疫系の細胞を刺激することが公知の薬剤と組み合わせて使用され、そのような組み合わせ処置は、本発明の抗体組成物の効力の免疫仲介増強の上昇を導く。そのような免疫刺激剤の例として、組み換えインターロイキン（例えば、ＩＬ−２１およびＩＬ−２）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0197】

用量および投与経路
本発明に従う抗体の特定の用量が未だ決定されていない一方、一定用量の判断は、承認されている類似の製品（ImClone C225（Erbitux））との比較により決定することができる。Ｃ２２５抗体は、典型的に、５〜４００ｍｇ／ｍ^２の範囲の用量、安全性研究に関してのみ使用されたより低い用量で投与されている。従って、本発明者らは、本発明に従う抗体による患者における用量は、この範囲内またはそれより低い、おそらく、５０〜３００ｍｇ／ｍ^２の範囲でなお効力が残存すると予想している。ｍｇ／ｍ^２での用量は、ｍｇ／ｋｇでの従来の用量測定と反対であり、表面積に基づく測定であり、そして小児から成人までのすべてのサイズの患者を含むように設計される利便的な用量測定である。

【0198】

Erbitux（セツキシマブ）に関する利用可能な処方情報は、４００ｍｇ／ｍ^２の初期の１２０分間のＩＶ輸注、それに続く、２５０ｍｇ／ｍ_２の毎週６０分間の輸注を含む。これらの用量は、標準的な単独処置ならびに放射線治療との組み合わせにおいて推奨される。Vectibix（パニツムマブ）では、推奨用量は、連日１４日間、６０分間をかけて６ｍｇ／ｋｇが投与されることである。

【0199】

Genmab製HuMaxEGFr抗体（ズムツムマブ（ｚｕｍｕｔｕｍｕｍａｂ））の予想される臨床用量は、８ｍｇ／ｋｇのHuMax-EGFrの初期用量、それに続く、疾患進行までの維持用量の毎週の注入である。維持用量は、患者が用量を制限する発疹を発症するまで必要に応じて、HuMax-EGFrの１６ｍｇ／ｋｇの維持用量（Genmab製製品説明から入手可能なピボタル第ＩＩＩ相研究の用量）まで調整される。

【0200】

本発明の抗体組成物の臨床用量は、現在診療所で使用されているモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体（ErbituxおよびVectibix）で観察された発疹の程度によって制限される可能性がある。カニクイザルにおける６週間の毒物学研究からのデータは、本発明の抗体組成物が診療所で使用されるモノクローナル抗体の１つによる処置に使用されるものと同等な用量で投与された場合、発疹の症状を示さなかった（実施例２０）。それ故、本発明の抗体組成物は、静脈内に、１週間で２５０ｍｇ／ｍ^２の用量（１．８ｍ^２の体表面で６０ｋｇの体重のヒトでは７．５ｍｇ／ｋｇに変換される用量）で投与することができる。さらに加えて、４００ｍｇ／ｍ^２の初回負荷量（１．８ｍ^２の体表面および６０ｋｇの体重のヒトでは１２ｍｇ／ｋｇに変換される量）は、その後の毎週の投薬前に付与されてもよい。

【0201】

３つの別々の送達アプローチは、本発明に従う抗体の送達に有用であることが予想される。従来の静脈内送達は、推定上、大部分の腫瘍に対する一般的な送達技術である。しかし、卵巣、胆管、その他の管などの腫瘍のごとき腹腔内の腫瘍に関連して、腹腔内投与は、腫瘍における高用量の抗体を獲得し、そして抗体クリアランスを最小限にするのに好都合であることが判明し得る。類似の様式において、一定の固形腫瘍は、局部還流に適する血管を有する。局所還流は、腫瘍部位における高用量の抗体の獲得を可能にし、抗体の短期間のクリアランスを最小限にする。

【0202】

任意のタンパク質または抗体輸注に基づく治療に関して、安全への懸念は、主に、（ｉ）サイトカイン放出症候群、即ち、低血圧、発熱、震え、悪寒、（ｉｉ）物質に対する免疫反応の発生（即ち、抗体治療に対する患者によるヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡもしくはＨＡＣＡ応答）、および（ｉｉｉ）ＥＧＦ受容体を発現する正常細胞、例えば、ＥＧＦＲを発現する肝細胞に対する毒性に関連する。一般的な試験および追跡は、これらの安全性への関心のそれぞれをモニターするために利用される。特に、存在するならば、肝臓への損傷を評価するために、肝機能は、臨床治験の間、頻繁にモニターされる。

【0203】

診断用途
本発明の別の実施形態は、診断キットに対するものである。本発明によるキットは、本発明に従って調製される抗ＥＧＦＲ抗体組成物を含んでなり、タンパク質は、検出可能な標識で標識されてもよく、または非標識検出のために標識されなくてもよい。キットは、ＥＧＦＲの過剰発現に関連する癌を患う個体を同定するのに用いられてもよい。

【実施例1】

【0204】

実施例１ 抗ＥＧＦＲ抗体のクローニング
免疫化
雌のＢＡＬＢ／ｃ、株Ａ、またはＣ５７Ｂ１６マウス（８〜１０週齢）を、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を加えた異なる精製タンパク質の注入による免疫化に使用した。

【0205】

市販のＥＧＦＲタンパク質（R&D systemsカタログ番号１０９５−ＥＲまたはＳｉｇｍａ番号Ｅ３６４１）を、いくつかの免疫化に使用した。他の免疫化では、ＥＧＦＲのＥＣＤまたはＥＧＦＲｖＩＩＩおよびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）よりなり、また、実施例１０ｂに記載のＨｉｓ−タグに加えてタバコＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）−切断部位を含む融合タンパク質として産生される組み換えヒトＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩを使用した。いくつかの場合、ＥＧＦＲのＥＣＤを、ＴＥＶ−プロテアーゼ切断および後のニッケルカラムによる精製によって単離した。

【0206】

約１０^７の受容体／細胞を発現するヒト頭頚部癌細胞系統、ＨＮ５（Easty DM, Easty GC, Carter RL, Monaghan P, Butler LJ. Br J Cancer. 1981 Jun;43(6):772-85. Ten human carcinoma cell lines derived from squamous carcinomas of the head and neck.）を、細胞に基づく免疫化に使用した。細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、３ｍＭグリセロール、５ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地において培養した。各免疫化の前に、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、TrypLEでトリプシン処理し、次いで増殖培地に再懸濁した。その後、細胞懸濁液を、２５０×ｇ、５分間の遠心分離、取り出し、そして１５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中の再懸濁により、ＰＢＳ中で２回洗浄した。

【0207】

細胞または抗原を、ＰＢＳ中に希釈し、次いで、フロイントのアジュバントと1：1で混合した。アジュバントを使用して、免疫応答を増強および調節した。一次免疫化のために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用する一方で、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を以後の免疫化に使用した。ＩＦＡは、鉱油からなる水中油型エマルジョンであり、ＣＦＡは、熱処理で死滅させ、乾燥したマイコバクテリウム（Mycobacterium）種が添加されるＩＦＡである。両方のアジュバントともデポー効果を有する。ＣＦＡは、免疫応答の長期間の持続を生じ、そして免疫応答を高めるための一次免疫化に使用され、そしてＩＦＡは、以後の免疫化に使用される。水の入ったガラスの表面上に滴下することによりエマルジョンを試験した。水滴が１滴として保持される場合、エマルジョンは安定であり、注入を実施することができる。安定なエマルジョンのみをマウスに投与した。

【0208】

スケジュール（表２を参照のこと）に従って、２５〜１００μｇの抗原または１０^７個の細胞を、各注入に使用した。合計で、マウスに４回の注入を行った。すべてのマウスに、３００μｌまたは２００μｌのいずれかのエマルジョンを注入した。スケジュールに従って、皮下（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）に注入を実施した。

【0209】

終了時、頚椎脱臼によりマウスを屠殺し、脾臓を取り出し、次いで７４μｍのセルストレーナー（Corning番号１３６３５０−３４７９）に移した。細胞を、フィルターを介して液体に浸し、１０％ＦＢＳを伴う冷RPMI 1640に再懸濁し、そして３００×ｇで５分間、遠心分離した。細胞ペレットを、１％ＦＢＳを含有するRPMI 1640に再懸濁し、５０μｍシリンジフィルター（BD番号３４０６０３）を介してろ過し、遠心分離により回収した。細胞ペレットを、１０％ＤＭＳＯを伴うＦＣＳへの再懸濁後、冷凍保存し、そして凍結した細胞を、ＦＡＣＳ選別まで−８０℃で保存した。

【0210】

マウス形質細胞のＦＡＣＳ選別
凍結した脾細胞をバイアルを３７℃で融解し、なお存在する氷と共に１５ｍｌチューブに移した。１０ｍｌの氷冷ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を、旋回させながらチューブに滴下した。１０ｍｌのＦＡＣＳ ＰＢＳにおいて１回洗浄後、５０μｍのＦｉｌｃｏｎを介して細胞をろ過する前に、５ｍｌのＦＣＳ ＰＢＳを添加する。次いで、細胞をペレット化し、そして２％ＦＢＳを含有する１ｍｌのＰＢＳ（最終容積）に再懸濁し、次いで約５μｇ／ｍｌの最終濃度までの特定の希釈に従って、抗−ＣＤ４３−ＦＩＴＣおよび抗−ＣＤ１３８−ＰＥで染色した。細胞を、４℃で、２０分間、暗所でインキュベートした。続いて、細胞を、２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。１５ｍｌまでＦＡＣＳ ＰＢＳを添加した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を、１：１００（１部のＰＩ対１００部のＦＡＣＳ ＰＢＳ緩衝液）で添加し、続いて、細胞を、ＰＣＲ反応緩衝液を含有する９６ウェルのＰＣＲ−プレートで選別し（下記を参照のこと）、次いでプレートを−８０℃で凍結する前に、２分間、４００×ｇでスピンした。図１に示すように、形質細胞をＣＤ４３−ポジティブ／ＣＤ−１３８ポジティブとしてゲートした。

【0211】

同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌペアの連結
Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌコーディング配列の連結を、形質細胞としてゲートした単一細胞に対して実施し、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌコーディング配列の同族ペア形成を容易にした。手順は、１工程の多重重複−伸長ＲＴ−ＰＣＲ、続いて、ネステッドＰＣＲに基づく２工程ＰＣＲ手順を利用した。本実施例で使用したプライマー混合物のみが、κ軽鎖を増幅した。しかし、λ軽鎖を増幅することが可能なプライマーは、所望であれば、多重プライマー混合物およびネステッドＰＣＲプライマーに添加し得る。λプライマーを添加する場合、選別手順は、λポジティブ細胞が排除されないように適応されるべきである。同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列の連結の原理を図２に示す。

【0212】

生成された９６ウェルＰＣＲプレートを融解し、選別した細胞は、多重重複−伸長ＲＴ−ＰＣＲのテンプレートとしての役割を果たした。単一細胞選別前に各ウェルに添加した選別用緩衝液は、反応緩衝液（OneStep RT-PCR Buffer；Qiagen）、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー（表３を参照のこと）およびＲＮａｓｅインヒビター（RNasin、Promega）を含有した。これに、OneStep RT-PCR Enzyme Mix（２５×希釈；Qiagen）およびｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）を補充して、２０μｌ反応容積において所定の最終濃度を得た。プレートを、３０分間、５５℃でインキュベートして、各細胞由来のＲＮＡの逆転写を可能にした。ＲＴ後、プレートを、次のＰＣＲサイクルに供した：９４℃で１０分間、３５×（９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、７２℃で５分間）、７２℃で１０分間。

【0213】

ＰＣＲ反応を、２４枚の９６−ウェルプレート（ABgene）についてPeel Seal Basket搭載のH20BIT Thermal cyclerにおいて実施してハイ−スループットを容易にした。サイクリング後、ＰＣＲプレートを−２０℃で保存した。

【0214】

ネステッドＰＣＲ工程では、９６−ウェルＰＣＲプレートを、各ウェルの次の混合物（２０μｌ反応液）で調製して、所定の最終濃度を得た：１×FastStart buffer（Roche）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ネステッドプライマー混合物（表４を参照のこと）、Phusion DNA Polymerase（０．０８Ｕ；Finnzymes）およびFastStart High Fidelity Enzyme Blend（０．８Ｕ；Roche）。ネステッドＰＣＲのテンプレートとして、１μｌを、多重重複−伸長ＰＣＲ反応から移した。ネステッドＰＣＲプレートを、次のサーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｉｎｇ）に供した：３５×（９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で９０秒間）、７２℃で１０分間。

【0215】

無作為に選択された反応物を、１％アガロースゲル上で分析して、約８９０塩基対（ｂｐ）の重複−伸長フラグメントの存在について確かめた。

【0216】

ＰＣＲフラグメントのさらなるプロセシングまで、プレートを−２０℃で保存した。

【0217】

ネステッドＰＣＲからの連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーを、異なるドナー由来のペアを混合せずにプールし、調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、連結されたＶ_ＨおよびＶ_ＬをコードするペアのプールされたＰＣＲ産物のＶ_Ｌコーディング領域に対する重複伸長によってスプライスした（図３）。ヒトκ定常軽鎖をコードする配列を、κ軽鎖を伴うヒト抗体のコーディング配列を含有するプラスミドから、次のものを含有する反応物において、増幅させた：５０μｌの全容積中Phusion Enzyme（２Ｕ；Finnzymes）、１×Phusion buffer、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ｈＫＣｆｏｒｗ−ｖ２プライマーおよびκ３’プライマー（表５）、ならびにプラスミドテンプレートｐＬＬ１３８（１０ｎｇ／μｌ）。反応物を、次のサーモサイクリングに供した：２５×（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）、７２℃で１０分間。得られたＰＣＲフラグメントを、調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0218】

各レパートリーのプールした精製ＰＣＲフラグメントを、以下のものを含有する重複伸長ＰＣＲ（５０μｌの全容積）による後のスプライシングによってスプライスして、ヒトκ定常部をコードする領域の増幅および精製されたＰＣＲフラグメント（付録２）とした：ヒトκ定常部をコードする領域フラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、プールした精製ＰＣＲフラグメント（１．４ｎｇ／μｌ）、Phusion DNA Polymerase（０．５Ｕ；Finnzymes）およびFastStart High Fidelity Enzyme Blend（０．２Ｕ；Roche）、１×FastStart buffer（Roche）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、ｍｈＫＣｒｅｖプライマーおよびｍＪＨセットプライマー（表５を参照のこと）。反応物を、次のサーモサイクリングに供した：９５℃で２分間、２５×（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、７２℃で１０分間。得られたＰＣＲフラグメント（約１０７０ｂｐ）を、調製用１％アガロースゲル電気泳動によって精製した。

【0219】

同族Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのスクリーニングベクターへの挿入
ＥＧＦＲに対する結合特異性を伴う抗体を同定するために、得られたＶ_ＨおよびＶ_Ｌコーディング配列を、全長抗体として発現させた。これは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーの発現ベクターへの挿入および宿主細胞へのトランスフェクションに関与した。

【0220】

２段階のクローニング手順を、連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアを含有する発現ベクターのレパートリーの作製に用いた。統計学的に、発現ベクターのレパートリーが、スクリーニングレパートリーの作製に使用された同族のペア形成したＶ_ＨおよびＶ_ＬＰＣＲ産物の数の１０倍の数の組み換えプラスミドを含有する場合、すべての独特な遺伝子ペアが示される可能性は９９％である。それ故、４００個の重複−伸長Ｖ−遺伝子フラグメントを得た場合、少なくとも４０００個のクローンのレパートリーをスクリーニングのために作製した。

【0221】

簡単に説明すると、連結Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌをコードするペアのレパートリーの精製ＰＣＲ産物を、ヒトκ定常コーディング領域にスプライスし、ＰＣＲ産物の末端に導入された認識部位において、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ ＤＮＡエンドヌクレアーゼによって切断した。切断および精製されたフラグメントを、標準的な連結手順によって、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化した哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター、ＯＯ−ＶＰ−００２に連結した（図４）。連結混合物を、大腸菌（E.coli）にエレクトロポレートし、次いで適切な抗生物質を含有する２×ＹＴプレートに添加し、次いで３７℃で１晩、インキュベートした。ベクターの増幅されたレパートリーを、標準的なＤＮＡ精製方法（Qiagen）を使用して、プレートから回収した細胞から精製した。プラスミドを、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩエンドヌクレアーゼによる切断によって、プロモーター−リーダーフラグメントのために調製した。これらの酵素のための制限部位は、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌコーディング遺伝子ペア間に局在した。ベクターの精製後、ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩで消化した両方向性哺乳動物プロモーター−リーダーフラグメントを、標準的な連結手順によって、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位に挿入した。連結されたベクターを、大腸菌（E.coli)において増幅させ、次いで標準的な方法を使用して、プラスミドを精製した。スクリーニングベクターの作製されたレパートリーを、従来の手順によって大腸菌（E.coli）に形質転換した。得られたコロニーを３８４−ウェルマスタープレートに集約し、貯蔵した。整列されたコロニーの数は、インプットＰＣＲ（ｉｎｐｕｔ ＰＣＲ）産物の数の少なくとも３倍を超え、それ故、得られたすべての独特なＶ−遺伝子ペアの存在に対して９５％パーセントの可能性を示した。

【0222】

ＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合のためのスクリーニング
一般に、スクリーニングを２段階の手順として作製した。抗体−ライブラリーを、ＥＬＩＳＡにおける組み換えＥＧＦＲタンパク質に対する反応性についてスクリーニングし、その後、ＦＭＡＴ（ＦＬＩＳＡ）を、細胞表面に発現されたＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲ−抗体の検出のために、ＮＲ６ｗｔＥＧＦＲ細胞系統による細胞に基づくアプローチとして使用した。１０１および１０８／１０９ライブラリー（表２）について、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを示す組み換えＥＧＦＲを用いてＥＬＩＳＡを実施した。

【0223】

簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡでは、Nunc maxisorb plate（カタログ番号４６４７１８）を、１μｇ／ｍｌタンパク質（施設内で生成した）で被覆し、ＰＢＳで４℃で１晩希釈した。５０μｌの２％−ミルク−ＰＢＳ−Ｔにおけるブロッキング前に、プレートを、ＰＢＳ＋０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）で１回洗浄した。プレートを、ＰＢＳ−Ｔ、２０μｌの２％−ミルク−ＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、次いでFreeStyle CHO-Sトランスフェクタント由来の５μｌ上清（下記を参照のこと）を添加し、続いてＲ．Ｔで１時間半インキュベートし、その後、プレートをＰＢＳ−Ｔ（１ウェルあたり２０μｌ）で１回洗浄した。２％ミルク−ＰＢＳ−Ｔにおいて１：１００００で希釈した第２の抗体（ＨＲＰ−ヤギ−抗ヒトＩｇＧ、Jackson、カタログ番号１０９−０３５−０９７）を添加して、ウェルに結合した抗体を検出し、次いで、室温で１時間インキュベートした。５分間インキュベートした２５μｌ基質（Kem-en-tec Diagnostics、カタログ番号４３９０）の添加前に、ＰＢＳ−Ｔにおいて、プレートを１回洗浄した。インキュベーション後、２５μｌの１Ｍ硫酸を添加して反応を停止させた。４５０ｎｍにおけるＥＬＩＳＡリーダーで特定のシグナルを検出した。

【0224】

抗ＥＧＦＲ抗体の細胞に基づくＦＭＡＴ検出では、上記のように、SKBR-3（ATCC番号ＨＴＢ−３０）またはNR6wtEGFR（Welsh et al, 1991, J Cell Biol, 114, 3, 533-543）細胞を増殖培地で維持した。細胞を計数し、次いで１：４０，０００に希釈したAlexa-647抱合ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ−Ｌ）抗体（Molecular probes No. A21445、ロット番号３４６８６Ａ）で１２５，０００個の細胞／ｍｌに希釈した。合計で２０μｌの上清を、３８４ウェルの透明底Ｎｕｎｃプレートに移した。続いて、１０μｌトランスフェクション上清を細胞に添加した。反応物由来のＦＭＡＴシグナルを６〜１０時間のインキュベーション後に測定した。

【0225】

スクリーニングからのデータは、全クローンのうち２２１個（４．８％）がＥＬＩＳＡにおいてポジティブであったことを示す。また、それらのクローンのうち９３個（２．０％）がＦＭＡＴにおいてポジティブであった。全体で、クローンのうち２２０個（４．８％）がＦＭＡＴでポジティブであり、そしてそれらのうち１２７個（２２０−９３）が、細胞表面抗原についてのみポジティブであった。１１１のライブラリーを類似の様式でスクリーニングしたが、免疫化手順を行って、欠失変異ＥＧＦＲ受容体ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的な抗体を作製したため、ＥＬＩＳＡスクリーニングに、野生型ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方を検出するためのアッセイを含めた。ＥＬＩＳＡでは、７個のクローンがＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的であると同定され、興味深いことに、それらのクローンは、ＦＭＡＴにおいてｗｔＥＧＦＲを発現する細胞の染色についてネガティブであった。１３個のコロニーが、ＦＭＡＴおよびＥＬＩＳＡにおいてｗｔＥＧＦＲについてポジティブであると同定されたが、ＥＧＦＲｖＩＩＩについてはポジティブでなく、これは、１０１および１０８／１０９のライブラリーと比較して、このライブラリーに独特であった。すべてのＥＬＩＳＡポジティブクローンをさらなる分析のために選択した。

【0226】

配列分析およびクローン選択
ＥＬＩＳＡにおいてＥＧＦＲ特異的として同定されたクローンを、本来のマスタープレート（３８４ウェル形式）から回収し、次いで新たなプレートに固化した。ＤＮＡをクローンから単離し、次いでＶ−遺伝子のＤＮＡ配列決定のために提出した。配列を整列し、すべての独特なクローンを選択した。得られた配列の複数のアラインメントは、各特定のクローンの独自性を表し、続いて独特の抗体の同定を可能にした。２２０個のクローンの配列分析後、７０個の一般的に別々の抗体配列クラスターを同定した。関連する配列の各クラスターは、おそらく、共通の前駆体クローンの体細胞超変異を介して誘導された。全体的に、配列および特異性の検証のために、各クラスターから１〜２個のクローンを選択した。選択された抗体可変配列の配列を、付録１に示す。ヌクレオチド配列は、両方の末端に制限部位を含む。結果的に、対応する翻訳されたアミノ酸配列（ＤＮＡ配列の第３のリーディングフレームを使用する）は、Ｎ末端において、ＩＭＧＴ定義に従ってＶＨおよびＶＬ配列の部分を形成しない２つのアミノ酸を含む（Lefranc et al (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev. Comp Immunol 27, 55-77）。示されたＶＬ配列は、すべて、アミノ酸−ＴＶＡＡＰ−で開始し、次いでＣ末端−ＮＲＧＥＣで終了する同じヒトκ定常領域を含む。本発明の目的のために、ＶＬ配列という用語は、特定の抗体をいう場合、κ定常領域および２つのＮ−末端アミノ酸(LA−)を含まない。ＶＨ配列という用語は、特定の抗体を指す場合、２つのＮ−末端アミノ酸（ＲＡ−）を含まない。

【0227】

配列および特異性の検証
抗体をコードするクローンを検証するために、ＤＮＡプラスミドを調製し、次いで２ｍｌスケールのFreeStyle CHO-S細胞（Invitrogen）のトランスフェクションを、発現のために実施した。上清を、トランスフェクションの９６時間後に回収した。発現レベルを、標準的な抗ＩｇＧ ＥＬＩＳＡで評価し、特異性を、ＥＧＦＲ−およびＥＧＦＲｖＩＩＩ−特異的ＥＬＩＳＡによって決定した。クローンの８５％が正確な特異性および配列を有することが示された。

【0228】

抗増殖効果のスクリーニング
細胞損傷は、必然的に、代謝細胞機能および増殖のためのエネルギーを維持および提供する細胞の能力の喪失を生じる。代謝活動アッセイは、この前提に基づく。通常、それらは、ミトコンドリア活性を測定する。Cell Proliferation Reagent WST-1（Rocheカタログ番号１１６４４８０７００１）は、生細胞の代謝活動を測定する即使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）基質である。次いで、代謝活動は、生細胞の数に相関すると想定される。本実施例では、WST-1アッセイを使用して、異なる抗ＥＧＦＲ抗体を含有する細胞培養上清による処置後の代謝活性細胞の数を測定した。

【0229】

WST-1アッセイを実施する前に、異なる容積の２ｍｌ上清（０、１０、２５、５０および１５０μｌ）を９６ウェルプレートの適切なウェルに移した。

【0230】

次いで、ＨＮ５細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、次いで３ｍｌトリプシン溶液によるトリプシン処理により剥離した。次いで、１７ｍｌの完全培地を添加し、細胞を、３００×ｇ（１２００ｒｃｆ）で５分間、スピンした。上清を取り出し、細胞を、ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳに再懸濁した。細胞を計数し、次いでそれらの濃度を調整し、各ウェルが合計で２００μｌの培地を含有するように、１５００個の細胞を添加した。プレートを、４日間、加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。次いで、２０μｌのＷＳＴ−１試薬を、１ウェルあたり（ｐｒ． ｗｅｌｌ）に添加し、そしてプレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、オービタルプレートシェーカーに移し、さらに１時間放置した。吸光度を、４５０および６２０ｎｍ（対照波長）において、ＥＬＩＳＡリーダー上で測定した。代謝活性細胞（ＭＡＣ）のレベルの差異を、以下のようにコントロール上清のパーセントとして計算した：

【表2】

次いで、これらの値を、フリーソフトウェアClusterおよびTreeViewを使用して実施される管理下の（ＥＬＩＳＡにおける反応性に基づいてクラスター化される）階層的クラスター分析の基礎として使用した。

【0231】

抗体選択プロセスの初期の段階において機能的抗体についてスクリーニングすることが可能であることが好適である。８３個の２ｍｌトランスフェクションからの培養上清を、０．５％ＦＢＳ中のＨＮ５細胞を用いて行った増殖アッセイにおける増殖阻害機能についてスクリーニングするのに用いた。結果を、簡単な階層的クラスター分析によって可視化した。クラスター分析（図５）において認められ得るように、多くの上清では、濃度依存的様式で代謝活性ＨＮ５細胞（暗灰色）の数が減少することが見出された（クラスター２）。同様に、いくつかの上清では、濃度依存的様式で代謝活性細胞ＨＮ５細胞（明灰色）の数が増加した（クラスター１、３および４）。代謝活性ＨＮ５細胞の数が減少した上清は反応性２（黒色矢印）を示したが、一方、代謝活性ＨＮ５細胞の数が増加した上清が反応性１（灰色矢印）を示したことは、興味深い観察である。反応性２を示す上清は、ｗｔＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩの両方のＥＬＩＳＡにおいてポジティブであった一方、反応性１を示す上清は、ｗｔＥＧＦＲに対する反応性のみを示した。それ故、そのようなアッセイは、ＥＬＩＳＡにおける抗体反応性と細胞アッセイにおける機能性間の関連性を提供し得る。

【0232】

クローン修復
多重ＰＣＲアプローチを使用する場合、プライマー縮重および高程度の相同性のため、一定程度のＶ−遺伝子ファミリー内およびＶ−遺伝子ファミリー間のクロスプライミングが予想される。クロスプライミングは、いくつかの潜在的結果、例えば、構造変化および免疫原性の増加を伴う、免疫グロブリンフレームワークに自然に存在しないアミノ酸を導入し、そのすべてが治療活性の減少を生じる。

【0233】

これらの欠点を排除し、選択されたクローンが自然の体液性免疫応答を反映することを確実にするために、かかるクロスプライミング変異は、クローン修復と呼ばれるプロセスで補正された。

【0234】

クローン修復手順の第１の工程では、Ｖ_Ｈ配列を、目的のクローンの起源であるＶ_Ｈ−遺伝子に対応する配列を含有するプライマーセットでＰＣＲ増幅し、それによって、クロスプライミングによって誘導された変異を補正した。ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩおよびＡｓｃＩで消化し、従来のライゲーション手法を使用して、ＸｈｏＩ／ＡｓｃＩで消化した哺乳動物発現ベクターに連結して戻した（図４）。連結されたベクターを、大腸菌で増幅し、標準的な方法によりプラスミドを精製した。Ｖ_Ｈ配列を、配列決定して、補正を確かめ、ベクターをＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化して、軽鎖の挿入用に調製した。

【0235】

クローン修復手順の第２の工程では、完全な軽鎖を、目的のクローンの起源であるＶ_Ｌ−遺伝子に対応する配列を含有するプライマーセットでＰＣＲ増幅し、それによって、クロスプライミングによって誘導される変異を補正した。ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩ／ＮｏｔＩで消化し、次いで上記で調製したベクターを含有するＶ_Ｈに連結した。連結した産物を、大腸菌で増幅し、標準的な方法によりプラスミドを精製した。続いて軽鎖を配列決定して補正を確かめた。

【0236】

選択されたクローンのκ定常領域が遺伝子の増幅中に導入された変異を含有する場合、それは、変異していない定常領域によって置き換えられる。これは、（定常領域なしで増幅した）修復されたＶ_Ｌ−遺伝子を（別々のＰＣＲで得られた）正確な配列を有する定常領域に融合した重複ＰＣＲにおいて行われる。配列全体を増幅し、上記のベクターを含有するＶ_Ｈにクローニングし、次いで修復された軽鎖を配列決定して補正を確かめる。

【0237】

表２ 抗ＥＧＦＲクローニングの出発物質を作製するのに用いた免疫化スケジュール

【表3】

【表4】

【0238】

表３ ＲＴ−ＰＣＲ多重重複−伸長プライマー混合物

【表5】

W=A/T, R=A/G, S=G/C, Y=C/T, K=G/T, M=A/C, H=ACT, B=GCT; 濃度―最終濃度.

【0239】

表４ ネステッドプライマーセット

【表6】

K=G/T, M=A/C,D=AGT; 濃度−最終濃度.

【0240】

表５ κ定常スプライシングプライマーセット

【表7】

【0241】

実施例２ 哺乳動物抗ＥＧＦＲ抗体の産生
FreeStyle MAX CHO発現系（Invitrogen）を抗ＥＧＦＲ抗体の一過性発現に使用した。抗体を２００〜２０００ｍｌ体積で発現させた。

【0242】

トランスフェクションの約２４時間前に、ＣＨＯ−Ｓ細胞を継代培養して０．５×１０^６個の細胞／ｍｌの細胞濃度に到達させた。プラスミド（１ｍｌ細胞培養培地あたり１．２５μｇ）を、OptiPro無血清培地に希釈し、次いで製造業者によって推奨されるようにFreeStyle MAXトランスフェクション試薬の溶液と混合した。トランスフェクション試薬を細胞培養に移し、上清を６日後に回収した。

【0243】

ＩｇＧ１分子の精製のためのProtein A-Sepharoseカラム（MabSelect Sure, GE Health Care）を用いるアフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、培養上清から発現した抗体を精製した。０．１Ｍグリシン、２．７を使用して、カラムから抗体を溶出させた。２８０ｎｍにおける吸光測定値によって決定された抗体を含有する画分をプールし、次いで５ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５に対して透析した。精製した抗体サンプルを、ＬＡＬアッセイによってエンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｔｏｘｉｎ）の存在について試験した。

【0244】

実施例３ エピトープ特異性の決定
対照抗体との競合ELISA
（J.R. Cochran et. al., JIM 2004: 287; 147-158）で公開されるように、ＥＧＦＲの既知のドメインに結合する対照抗体を使用することにより、抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＦｃ領域に特異的であり、マウスまたはラットＩｇＧ Ｆｃに対して交差反応性を示さない第２の試薬とのインキュベーションにより抗ＥＧＦＲ抗体の結合性エピトープ間を識別し得る競合ＥＬＩＳＡを開発した。このＥＬＩＳＡを、Ditzel et al, 1995, The Journal of Immunology, Vol 154, Issue 2 893-906に記載された説明から採用した。

【0245】

エピトープを遮断するＥＬＩＳＡを、全長ＥＧＦＲ受容体抗原をＰＢＳで０．５μｇ／ｍｌに希釈し；５０μｌ／ＥＬＩＳＡウェルを４℃で１晩被覆することにより実施した。翌朝、ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡで室温にて１時間ブロックし、続いてＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次に、２５μｌのマウスまたはラット対照ｍＡｂを、先の実験から公知の希釈で独立したＥＬＩＳＡウェルに添加して２００倍の最大抗原結合性を得た。１５分間後、２５μｌの抗ＥＧＦＲ抗体を、対照抗体と共にプレインキュベートしたウェルまたは２５μｌのＰＢＳを含有するウェルに２μｇ／ｍｌの濃度で添加した。これにより、混合後、１μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲ抗体の最終濃度および対照抗体の１００倍の最大抗原結合性を得た。抗体を室温で４５分間インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。第２のヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抱合体を１：３０００に希釈し、次いで５０μｌを各ウェルに添加し、続いて室温で３０分間のインキュベーションを行った。最終的に、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、次いでプレートに５０μｌ／ウェルのＴＭＢを添加することにより発色させ、続いて５〜１５〜３０分ごとに６２０ｎｍで読み取った。阻害の程度を、次の式から計算した：阻害％＝（１−（ＯＤ競合／ＯＤ競合なし（ＰＢＳ）））×１００。

【0246】

ＥＬＩＳＡ試薬：
１）コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ；Gibcoカタログ番号２００１２−０１９
２）抗原：Ａ４３１細胞から精製された野生型全長ＥＧＦＲ；Sigma E3641
３）ＥＬＩＳＡプレート：NUNC Maxisorp；カタログ番号４４２４０４
４）ブロッキング／希釈緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡ）
５）洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ／０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）
６）ポジティブコントロール：Erbitux（Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany、カタログ番号０１８９６４；セツキシマブ）、Vectibix（Amgen Inc, One Amgen Center Drive, Thousand Oaks CA 91320-1799, USA、カタログ番号３２４１４００；パニツムマブ）
７）対照抗体：
・ＩＣＲ１０（ラット）、Ａｂｃａｍ、Ａｂ２３１
・１９９．１２（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−１１、ＭＳ−３９６−ＰＡＢＸ
・ＥＧＦＲ．１（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−３、ＭＳ−３１１−ＰＡＢＸ
・Ｈ１１（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−５、ＭＳ−３１６−ＰＡＢＸ
・Ｂ１Ｄ８（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−１６、ＭＳ−６６６−ＰＡＢＸ
・１１１．６（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−１０、ＭＳ−３７８−ＰＡＢＸ
・２２５（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−２、ＭＳ−２６９−ＰＡＢＸ
・５２８（マウス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ａｂ−１、ＭＳ−２６８−ＰＡＢＸ
８）ヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抱合；Serotec, Star 106P
９）TMB Plus；KemEnTec、カタログ番号４３９０Ｌ
１０）１ＭのＨ_２ＳＯ_４

【0247】

競合ＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。ＥＬＩＳＡ競合アッセイを用いて、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対して惹起された使用した対照抗体のドメイン特異性に従って、抗ＥＧＦＲ抗体上清を格付けした。５０〜１００％の阻害値を、重複エピトープまたは抗原における近傍のエピトープに結合する抗体ペア間の有意な競合の指標とみなした一方、５０％未満の阻害値は、抗体ペアによって認識されたエピトープが近傍には存在せず、立体障害の減少を生じたことを示した。抗ＥＧＦＲ抗体は、ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含むＥＧＦＲ ＥＣＤ上の多様なエピトープに結合することを見出した。いくつかの抗体では、この分析は、特定のｍＡｂがドメインＩまたはドメインＩＩのいずれに対して指向されたかを区別することはできなかった。そのような特異性をドメインＩ／ＩＩと標識した。さらに、いくつかの抗体は、用いた競合ＥＬＩＳＡにおいてさらに推定することができなかった独特なエピトープに結合するようであった（例えば、クローン１２２９および１３２０、図６）。これらの抗体のいくつかは、本発明者らがなんら対照抗体の反応性を認めていないドメインＩＶに対して指向されている可能性がある。興味深いことに、ドメインＩＩＩ抗体は、さらに、このドメインに対する試験されたマウス対照抗体によって得られた異なる競合パターンに基づき４つのサブグループに分けることができた。グループＩは、対照抗体Ａｂ１およびＡｂ２との結合に競合することが見出されたｍＡｂ９９２のみからなった。グループＩＩは、両方ともが同じＩｇリアレンジメントから誘導され、結果的に、ＤＮＡおよびアミノ酸レベルにおいて極めて緊密な配列相同性を示したｍＡｂ１０２４および１０４２からなった。これらの２つの抗体は、Ａｂ２との結合のみに競合することを見出した。グループＩＩＩは、対照抗体Ａｂ１、Ａｂ５およびＡｂ１０との結合について競合したｍＡｂ１０３０、１２０８および１２７７からなった。最後に、グループＩＶは、使用したすべてのドメインＩＩＩ対照抗体Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ５およびＡｂ１０との結合について競合したｍＡｂ１２５４よりなった。

【0248】

表面プラズモン共鳴技術を使用する対照または同一種の抗体との別々のエピトープの競合分析
ＳＰＲ分析を、４つのフローセルを含有するBiacore 3000機器において実施した。製造業者の説明書に従って、CM5 Biacoreチップを、10,000 Resonanceユニット（Ｒｕ）ポリクローナル抗Ｈｉｓ抗体と共に、フローセル１〜４に抱合した。５μｌ／分の流速を使用して、２０μｇ／ｍｌの濃度の６×Ｈｉｓ ＥＧＦＲ ＥＣＤの１５μｌを注入し、次いで抗Ｈｉｓポリクローナル抗体を抱合させた４つのすべてのフローセル上で捕捉した。抗原注入の直後、競合を伴わない抗ＥＧＦＲｍＡｂの最大結合性を、対照の実行中に各フローセルで確立させた。簡単に説明すると、４０μｇ／ｍｌの濃度の５μｌ抗体を、ＥＧＦＲを捕捉したすべてのフローセルに注入し、続いて、低ｐＨ酸性洗浄（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２との１０秒間の接触時間）による抗体／抗原複合体のストリッピングを行った。各フローセルに対する抗ＥＧＦＲ抗体最大結合性の決定後、同じBiacoreサイクル中に、競合の実行を実施した。フローセルを、最初にＥＧＦＲ ＥＣＤ抗原で飽和し、続いて、上記で概説した同じ抗原飽和条件を使用して、異なる対照抗体または抗ＥＧＦＲ抗体の別々のフローセルへの注入を行った。この工程の直後に、ＥＧＦＲ抗原および競合抗体で飽和したフローセルへの抗ＥＧＦＲ抗体の第２の注入を行い、抗原または遮断抗体のどちらかの解離を最小限にした。次いで、抗体／抗原複合体を、低ｐＨ酸性洗浄（１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２との１０秒間の接触時間）でストリッピングし、対照の実行で開始した全サイクルを、新たな抗ＥＧＦＲ抗体で繰り返した。試験した抗ＥＧＦＲ抗体の阻害の程度を、各サンプルの注入の２秒前および２秒後の記録された報告ポイントを導入することによって、競合の前および後の個々の抗ＥＧＦＲ抗体のＲｕ最大値を比較することによって、決定した。１つのBiacoreサイクルの例を図７に示す。

【0249】

試薬：
１．CM5チップ；Biacore、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４
２．NHS；Biacore BR-1000-50
３．EDC；Biacore BR-1000-50
４．１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４，５；Biacore、カタログ番号ＢＲ−１００３−５０
５．Tetra-His抗体（ＢＳＡを含有しない）；Qiagen、カタログ番号３４６７０
６．エタノールアミン、１．０Ｍ ｐＨ８．５；Biacore BR-1000-50
７．１０×HBS-EPランニング緩衝液：０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖのSurfactant P20
８．抗原：施設内で産生された６×Ｈｉｓを伴う組み換えヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン
９．１０ｍＭグリシンＨＣｌ ｐＨ２．０
10．対照抗体：
・ICR10(ラット)、Abcam、Ab231
・199.12（マウス）、Lab Vision Ab-11、MS-396-PABX
・EGFR.1（マウス）、Lab Vision Ab-3、MS-311-PABX
・H11（マウス）、Lab Vision Ab-5、MS-316-PABX
・B1D8（マウス）、Lab Vision Ab-16、MS-666-PABX
・111.6（マウス）、Lab Vision Ab-10、MS-378-PABX
・225（マウス）、Lab Vision Ab-2、MS-269-PABX
・528（マウス）、Lab Vision Ab-1、MS-268-PABX

【0250】

競合ＥＬＩＳＡにおいて得られたエピトープ分析を確認し、同一種の抗ＥＧＦＲ抗体ペア間の競合によるさらなるエピトープ分析を実施するために、表面プラズモン共鳴によるリアルタイムで測定される抗体結合性に基づく競合アッセイを確立した。対照抗体のパネルに対して試験した抗ＥＧＦＲクローンの得られたエピトープマップを、以下の図８に示す。５０〜１００％の阻害値を、重複エピトープまたは抗原における近傍のエピトープに結合する抗体対間の有意な競合の指標とみなした一方、５０％未満の阻害値は、抗体対によって認識されたエピトープが、近傍には存在せず、立体障害の減少を生じたことを示した。２５％未満の阻害値は有意でない阻害を表すと判断されたため、それらは、重複エピトープの分析には含めなかった。１３２０を除く試験したすべての抗体は、用いた対照抗体の１つもしくはそれ以上と競合することを見出したが、１３２０は、本発明者らが未だ対照抗体反応性を認めていない未知のエピトープに対して指向されたことを示す。完全なヒトまたはヒト化抗体VectibixおよびErbituxを分析に含め、次いで重複エピトープに結合することを見出した。競合ＥＬＩＳＡおよび競合ＳＰＲ分析の両方から得られるデータは、一般的に、抗ＥＧＦＲ抗体の確立されたドメイン特異性に関して良好に相関する。しかし、おそらく、ＥＬＩＳＡ競合アッセイが完全長のＥＧＦＲ受容体抗原を用いた一方、ＳＰＲ競合アッセイは組み換え細胞外ドメインＥＧＦＲを使用したという事実のため、時々、２つのアッセイにおいて個々の対照抗体間の競合パターンにわずかな相違が観察された。

【0251】

抗ＥＧＦＲ抗体のエピトープマッピングを異なる２つの競合アッセイにおいて確認した後、抗ＥＧＦＲ抗体ペアの同一種の組み合わせの競合分析について調べて、どの抗体ペアが別々のエピトープを認識していたか、および重複エピトープを認識する抗体ペアがエピトープクラスターにさらに分けられ得るかどうかについて解明した。この分析の結果を図９に示す。さらに、この分析において、５０〜１００％の阻害値を、重複エピトープに結合する抗体ペア間の有意な競合の指標とみなした。それら自体に対して試験し、次いで結果的に完全な重複エピトープを認識する抗体は、図９に示されるように、７０％〜１００％阻害の間の値を生じたため、この基準は有効と思われた。さらに、この観察は、分析の時間枠内の抗原または抗体対のいずれの解離も、試験した抗体の実験の結果に影響を及ぼさなかったようであることを示した。先のセクションで調べて推定されたＥＧＦＲ ＥＣＤドメイン特異性に従って抗体をグループに分類することによって、ドメインＩ、またはドメインＩもしくはＩＩ（Ｉ／ＩＩ）のいずれかに排他的に結合する抗体は、主に、同じ特異性を伴う抗体メンバーとクラスター化し、ドメインＩＩＩを認識する抗体メンバーとはクラスター化しないことを見出した。同様に、ドメインＩＩＩ抗体は、結合性についてドメインＩＩＩを認識する抗体メンバーとのみ競合し、ＥＧＦＲドメインＩまたはＩ／ＩＩを認識する抗体とは競合しないことを見出した。同じＩｇリアレンジメントから誘導される２つのドメインＩＩＩ抗体１０２４および１０４２は、重複エピトープを認識することを見出した一方、１０２４または１０４２のいずれかと、９９２または１０３０のいずれかとのペア単位の組み合わせは、重要なことに、有意な競合を生じないことを見出した。結果的に、抗体９９２、１０３０および１０２４／１０４２は、ＥＧＦＲ ＥＣＤのドメインＩＩＩ上の３つの非重複エピトープを認識していたことが結論付けられた。最後に、ｍＡｂ１３２０は、結合性について、両方ともがドメインＩＩＩに対して指向されたｍＡｂ１０２４および１４４９と競合し、試験した他のドメインＩＩＩ抗体とは競合しないことを見出した（１３２０と１０４２との競合については決定されていない）。結果的に、ｍＡｂ１３２０は、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン上のドメインＩＩＩの周辺で結合していたことが想定された。エピトープ特異性の概観は、図１０で見られ、ＥＧＦＲ ＥＣＤドメインＩ、Ｉ／ＩＩまたはＩＩＩに対して指向される抗体のエピトープマップを示す。

【0252】

９９２、１０３０および１０２４／１０４２のペア単位の組み合わせが、ＳＰＲによって決定されるように、有意な抗体競合を生じなかったことを見出した後、新たなＢｉａｃｏｒｅ実験を設計して、どれだけ多くの抗体が受容体抗原に同時に結合し得るについて調べた。最初に、３つの抗体９９２、１０２４および１０３０によるドメインＩＩＩの飽和が、ドメインＩＩＩではない他のＥＧＦＲ特異性に対して指向された抗体の結合に対してどのような影響を及ぼしたかについて調べた。この分析からの結果を図１１Ａに示す。単一の抗体か、または各Ｂｉａｃｏｒｅサイクル中に余った１つの抗体を逐次的に追加するとによって作製される３つまでの抗体の抗体混合物のいずれかとの組み合わせでそれらを試験することによって、単一抗体の阻害を確立した。認識されたエピトープの完全な遮断を評価するために、４０μｇ／ｍｌの個々の濃度で抗体を試験した。図１１Ａに示されるように、３つのドメインＩＩＩ抗体９９２、１０２４および１０３０は、結合の阻害を何ら伴うことなく、受容体に結合することを見出した。添加した各抗体について増加している観察されたネガティブ阻害値は、さらに、追加された次の抗体の結合における相乗効果を示唆した。重要なことに、一旦、ドメインＩＩＩを３つの抗体と共にインキュベートすると、ドメインＩ／ＩＩ（ｍＡｂ１２６１）、ドメインＩ（１３４７）または未知の特異性（１３６１）に対する非重複エピトープに対して指向された他の抗体は、３つのｍＡｂ混合物からのエピトープ遮断を伴わずに結合するようである。さらに、これらの試験した抗体は、小さなネガティブの阻害値を有し、それらが、３つのｍＡｂ混合物による受容体飽和後により良好に結合していたことを示す。結果的に、この実験は、６つの試験した抗体がＥＧＦＲのＥＣＤに同時に結合し得たことを示唆した。この観察された現象をさらに試験するために、試験したすべての抗体（１２６１、１３４７、９９２、１０２４、１０３０および１３６１）よりなる抗体混合物を作製し、次いで混合物中の各それぞれのサンプル抗体の阻害について試験した。また、試験するサンプル抗体が含まれていない抗体を試験することによりポジティブコントロールを供した。図１１Ｂ／Ｃで示されるように、試験したすべての６つの抗体は、抗体のすべての混合物と共にインキュベートしたＥＧＦ受容体への結合について試験した場合、８０〜１１６％が阻害されることを見出した。しかし、この混合物から個々のサンプル抗体を取り出した場合、特定のサンプル抗体の有意な阻害は認められず、これは、混合物中の抗体が、それ自体のＥＧＦ受容体への結合についてのみ遮断されたことを示す。この実験は、非重複エピトープを認識する少なくとも６つの抗体が同時にＥＧＦＲに結合することができることを明確に示した。最後の実験として、ドメインＩ（１２８４）、Ｉ／ＩＩ（１２５７）または未知の特異性クラスター（１１８３、１２５５）に対して指向された他の抗体が、６抗体混合物に含まれた場合、ＥＧＦＲに結合し得るかどうかについて調べた。図１１Ｄに示すように、試験した抗体のいずれもが、６抗体混合物との事前のインキュベーション時にＥＧＦＲに有意に結合することができなかった。これは、抗体のコレクションが、６つの結合抗体によって占領されている部位のいずれに対する抗体も含まないためであり得る。あるいは、実際には、試験されたドメイン上のすべての部位が抗体によって遮断された可能性もある。

【0253】

表６ ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する特異性が立証された市販の抗体

【表8】

【0254】

実施例４ ＥＧＦＲ活性化阻害
競合ＥＬＩＳＡによるＥＧＦＲ受容体に結合するＥＧＦリガンドの抗体仲介遮断の決定
試験した抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲ受容体に結合し、同時にビオチン化ＥＧＦリガンドの結合を遮断したことを検証するために、ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌの濃度にて８０μｌ／ウェルの全長ＥＧＦＲで４℃において一晩被覆した。翌朝、ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、１５０μｌのＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡにより室温で１時間ブロックし、続いてＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した。次に、８０μｌの系列希釈した抗ＥＧＦＲ抗体およびコントロール抗体をウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。抗体インキュベーション後、０．５μｇ／ｍｌの濃度の２０μＬのビオチン化ＥＧＦリガンドを、抗ＥＧＦＲ抗体希釈液を含有するすべてのウェルまたはＰＢＳ−Ｔ１％ＢＳＡのみを含有するウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。続いて、ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、次いでブロッキング緩衝液中１：１０００に希釈した１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ第２試薬とのインキュベーションおよび室温で３０分間のインキュベーションを行った。最後に、ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、次いでプレートを１００μＬ／ウェルのTMB基質を添加することにより発色させ、続いて６０分間インキュベートした。インキュベーション後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４、１００μｌ／ウェルの添加によって、反応を停止し、プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。

【0255】

ＥＬＩＳＡ試薬：
１）コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ；Gibcoカタログ番号：２００１２−０１９
２）抗原：A431細胞から精製された野生型全長EGFR；Sigma E2645
３）ELISAプレート：NUNC Maxisorp；カタログ番号：４４２４０４
４）ブロッキング／希釈緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡ）
５）洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ／０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）
６）ポジティブコントロール：Erbitux、Vectibix
７）ネガティブコントロール：Synagis（Medimmune Inc、パリビズマブ、カタログ番号ＮＤＣ６０５７４−４１１１−１）
８）ビオチン化ＥＧＦリガンド；Invitrogen、カタログ番号E3477
９）ストレプトアビジン−ＨＲＰ、超高感度：Sigma S 2438
１０）TMB Plus；KemEnTec、カタログ番号４３９０Ｌ
１１）１ＭのＨ_２ＳＯ_４

【0256】

ＥＬＩＳＡ競合アッセイを用いて、抗ＥＧＦＲ抗体が、ビオチン化ＥＧＦリガンドのＥＬＩＳＡウェルに被覆した完全長ＥＧＦＲ受容体への結合を阻害する能力を格付けした。図１２に示すように、ErbituxおよびVectibixの両方とも、ＥＧＦリガンド結合を極めて強力に遮断するようである一方、ＥＧＦＲに対して指向されていないネガティブコントロール抗体Synagisは、ＥＧＦリガンド結合を阻害しなかった。図１２Ａに示すように、ドメインＩＩＩに対して指向され、非重複エピトープを認識する３つの抗体９９２、１０３０および１０４２を、単独または等モル混合物で、ＥＧＦリガンド結合を阻害するそれらの能力について試験した。試験した３つの抗体のうち、ｍＡｂ１０３０のみは、ErbituxおよびVectibixと比較した場合、中程度のＥＧＦリガンド阻害活性を示した。ｍＡｂ９９２、１０３０および１０４２の等モル混合物は、単独で試験した単一の抗体より、ＥＧＦリガンド結合の阻害においてより効果的であるようである。１μｇ／ｍｌの全ＩｇＧ濃度において、等モル混合物は、ｍＡｂ１０３０より約２倍の効率で、および単独で試験したｍＡｂ９９２および１０４２より４倍の効率で、ＥＧＦリガンド結合を阻害することが見出され、これは、非重複エピトープを認識する３つのドメインＩＩＩ抗体を混合することの相乗効果を示す。図１２Ｂに示すように、抗ＥＧＦＲクローン１２０８、１２６０、１２７７および１３２０についてもまた、このアッセイで試験した。これらの４つのクローンは、Erbituxコントロールと比較した場合、クローン９９２、１０３０および１０４２について観察されるより効果的であった用量依存的様式で、ＥＧＦリガンド結合を阻害することが可能であった。０．３３μｇ／ｍｌを超える濃度では、抗ＥＧＦＲクローン１２０８、１２６０、１２７７および１３２０は、同じ濃度で試験したErbituxと同じような効率でEGFリガンド結合を遮断するようである。

【0257】

ＨＮ５細胞におけるＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害する能力
抗ＥＧＦＲ抗体を、in cell western分析において、ＥＧＦＲリン酸化に対する反応性について試験した。in cell western手順は、同じサンプル由来のＥＧＦＲおよびリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）の検出を可能にし、これは、次いで、各抗体処置およびデータセットについて、ＥＧＦＲ対ｐＥＧＦＲ発現の比を比較することを可能にする。ＨＮ５細胞を、ＡＴＣＣにより供された説明書に従って、１０％ＦＣＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭにおいて培養した。４３，０００個のＨＮ５細胞を、飢餓２４時間前に、Nunc（カタログ番号１６７００８）製の９６ウェルプレートに播種した。細胞を、抗体の添加１６時間前に、ＤＭＥＭで飢餓状態にした。抗体を２００μｌのＤＭＥＭ中１０μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、混合物を少なくとも５回ピペッティングして混合した。抗体処置３０分後、ＥＧＦを、５０μｇ／ｍｌの濃度で適切なウェルに添加し、７．５分間放置した。in cell westernを、基本的に、in-cell western kit（Odyssey、LI-COR biosciences）の製造者によって提供された説明書のとおりに実施した。

【0258】

ＥＧＦ刺激後、細胞を３．７％ホルムアルデヒド（Sigma F-8775、ロット番号７１Ｋ５００、約１％メタノールを含有する）で２０分間固定した。LI-CORブロッキング緩衝液（９２７−４００００）によるブロッキング前に細胞膜を透明にするため、５回のＰＢＳ−Triton X-100（０．１％）での５分間の洗浄を使用した。第１の抗体を、提供された説明書に対応する濃度で添加し、ＲＴにおいて２．５時間、穏やかな振盪しながらインキュベートした（全ＥＧＦＲマウス、１：５００希釈、biosource international、カタログ番号ＡＨＲ５０６２およびPhospho-EGFR Tyr1173、ウサギ１：１００希釈、biosource、カタログ番号４４−７９４Ｇ）。

【0259】

第１の抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ−Ｔ（０．１％tween-20）で５分間、５回洗浄し、その後、第２の抗体を添加し（ヤギ−抗ウサギ、IRDye 680、１：２００希釈、LI-CORカタログ番号９２６−３２２２１およびヤギ−抗マウス、IRDye 800CW、１：８００希釈；LI-CORカタログ番号９２６−３２２１０）、アルミホイルにおいて被覆したプレートを穏やかに振盪しながらＲＴで１時間インキュベートした。

【0260】

Tecan蛍光リーダーにおける測定前に、プレートをＰＢＳ−Ｔで５回、５分間洗浄した。プレートの開口部を下に向け、勢いよく振って洗浄溶液を飛ばし、続いてペーパータオル上でプレートを叩くことによって、すべての洗浄を終結させた。（ＥＬＩＳＡプレートの処置と全く同様に、重要なことは、この処置の間、細胞がプレート上に保持されること、および細胞単層の完全性を破壊する吸引ではなく、むしろこの手順によって洗浄液を取り出すことができることに留意することである）。最後の洗浄で残った任意の残留洗浄溶液を、マルチチャンネルピペットによりウェルの側面から穏やかに吸引することによって取り出す。蛍光シグナルを、６８０ｎｍチャンネル（励起６７５ｎｍおよび蛍光７０５ｎｍ、両方とも１０ｎｍのバンド幅）および８００ｎｍチャンネル（励起７６２ｎｍおよび蛍光７９８ｎｍ、両方とも１０ｎｍのバンド幅）で測定した。

【0261】

in-cell Western分析を使用して、３つの抗体が、ＨＮ５細胞のｐＥＧＦＲ状態に有意に（ｐ＜０．０５）影響を及ぼしていることが明らかとなる；１２０８、１２７７および１３２０抗体（図１３）。

【0262】

抗ＥＧＦＲ抗体の抗ＥＧＦＲ混合物（９９２、１０３０および１０４２）およびその中の個々の抗体を、ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化の阻害のin cell western分析における影響について試験した。図１４に見られるように、９９２および１０３０ならびに抗ＥＧＦＲ抗体混合物は、ＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を有意に阻害した（ｐ＜０．０５）。

【0263】

実施例５ Ａ４３１ＮＳ細胞におけるＥＧＦ受容体の内在化
Ａ４３１ＮＳ細胞（ATCC番号ＣＲＬ−２５９２）を、TrypLEを使用して、８０〜９０％コンフルエントのＴ１７５培養フラスコからトリプシン処理した。剥離された細胞を、ＰＢＳで洗浄し、血清なしのＤＭＥＭで再懸濁した。細胞を１〜２ｍｌの部分に分け、試験する抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。抗体濃度は１０μｇ／ｍｌであった。細胞をＤＭＥＭ（２５０ｇ、４分間、４℃）で３回洗浄し、次いで１．８ｍｌのＤＭＥＭで再懸濁した。各部分を、各３００μｌ細胞懸濁液を含有する６本のＦＡＣＳチューブに分けた。各部分の３本のチューブを、３７℃の水浴に正確に４０分間配置し、他方の３本をすぐに氷上に置く。インキュベーション後、細胞を（２５０ｇ、４分間、４℃）で２回洗浄し、ペレットをＤＭＥＭ中１００μｌのウサギ抗ヒトＩｇＧ ＦｃγＦ（ａｂ’）２−ＦＩＴＣに再溶解する。４℃のＤＭＥＭで３回洗浄し、FACSCalibur上で分析する前に、細胞を４℃で３０分間インキュベートする。

【0264】

結果を図１５に示す。ErbituxおよびVectibixとのインキュベーションは、約３０％の等レベルの受容体の内在化を示し、７０％の初期表面染色を残した。９９２単独でのインキュベーションは、約４５％の受容体における下方調節を導く。非重複エピトープを伴うさらなる２つの抗体を含有する抗体混合物とのインキュベーションは、受容体下方調節における増加を導く：９９２＋１０２４、７４％；９９２＋１０２４＋１０３０、８３％。

【0265】

さらなる抗体の添加は、受容体内在化のさらなる増加をもたらさなかった。それ故、少なくとも３つの抗体は、Ａ４３１細胞における最大レベルの内在化を達成する必要があるようである。

【0266】

実施例６−増殖アッセイ
細胞損傷は、必然的に、代謝細胞機能および増殖のためのエネルギーを維持および提供するための細胞の能力の消失を生じる。代謝活動アッセイはこの前提に基づく。通常、それらは、ミトコンドリア活性を測定する。Cell Proliferation Reagent WST-1（Rocheカタログ番号１１６４４８０７００１）は、生細胞の代謝活動を測定する即使用可能な（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）基質である。次いで、代謝活動は、生細胞の数に相関すると想定される。本実施例では、WST-1アッセイを使用して、異なる濃度の異なる抗体による処置後の代謝活性細胞の数を測定した。

【0267】

WST-1アッセイを実施する前に、適切な抗体および抗体混合物を、０．５％のＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを補充したＤＭＥＭ中２０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈し、最も高い抗体濃度のウェルにおいて１０μｇ／ｍｌの最終抗体濃度を得た。次いで、これらの溶液の１５０μｌを、９６−ウェルプレートのカラム２のウェルに添加し、各ウェルが１００μｌの抗体溶液を含有するように、３倍系列希釈をカラム９まで漸減させながら作製した。１００μｌの培地をカラム１１に添加した。実験ウェルにおける培地蒸発を減少させる効果のため、２００μｌの培地を列１および８ならびにカラム１および１２に添加した。

【0268】

次いで、Ａ４３１−ＮＳ細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、３ｍｌトリプシン溶液によるトリプシン処理によって剥離する。次いで、１７ｍｌの完全培地を添加し、細胞を３００×ｇ（１２００ｒｃｆ）で５分間スピンする。上清を取り出し、細胞をＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳに再懸濁する。細胞を計数し、それらの濃度を１５，０００個の細胞／ｍｌに調整する。次いで、１００μｌの細胞懸濁液（１５００個の細胞／ウェル）をカラム２〜１１の実験ウェルに添加する。プレートを、加湿インキュベーターにおいて３７℃で４日間インキュベートする。次いで、１ウェルあたり（ｐｒ． ｗｅｌｌ）２０μｌのWST-1試薬を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートをオービタルプレートシェーカーに移し、さらに１時間放置する。吸光度を４５０および６２０ｎｍ（対照波長）にてＥＬＩＳＡリーダー上で測定する。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、以下のように、非処置コントロールのパーセントとして計算する：

【表9】

【0269】

ＥＧＦ滴定研究では、リガンドをＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ中２０ｎＭ／ｍｌの濃度に希釈し、最も高いＥＧＦ濃度のウェルで１０ｎＭ／ｍｌの最終濃度を得た。次いで、この溶液の１５０μｌを、９６−ウェルプレートのカラム２のウェルに添加し、各ウェルが１００μｌの抗体溶液を含有するように、３倍系列希釈をカラム９まで漸減させながら作製した。１００μｌの培地をカラム１１に添加した。実験用ウェル培地の蒸発の減少効果のため、２００μｌの培地を列１および８ならびにカラム１および１２に添加した。適切な抗体および抗体混合物を、０．５％のＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを補充したＤＭＥＭ中４０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈し、ウェルにおいて１０μｇ／ｍｌの最終抗体濃度を得た。次いで、５０μｌのこれらの溶液を、９６−ウェルプレートのカラム２〜９のウェルに添加した。

【0270】

次いで、Ａ４３１−ＮＳ細胞を、１×ＰＢＳで洗浄し、３ｍｌトリプシン溶液によるトリプシン処理によって、剥離する。次いで、１７ｍｌの完全培地を添加し、細胞を３００×ｇ（１２００ｒｃｆ）で５分間スピンする。上清を取り出し、細胞をＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳに再懸濁する。細胞を計数し、それらの濃度を４０，０００個の細胞／ｍｌに調整する。次いで、５０μｌの細胞懸濁液（２０００個の細胞／ウェル）をカラム２〜１１の実験ウェルに添加する。プレートを、加湿インキュベーターにおいて３７℃で４日間インキュベートする。次いで、１ウェルあたり（ｐｒ． ｗｅｌｌ）２０μｌのＷＳＴ−１試薬を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。次いで、プレートを、オービタルプレートシェーカーに移し、さらに１時間放置する。吸光度を、４５０および６２０ｎｍ（対照波長）にてＥＬＩＳＡリーダー上で測定する。４５０ｎｍにおける吸光度から６２０ｎｍの対照波長における吸光度を差し引くことによって、代謝活性細胞の量を示す。

【0271】

代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、以下のように、非処置コントロールのパーセントとして計算する：

【表10】

【0272】

結果
ドメインＩＩＩ内に非重複エピトープを伴う３つの抗ＥＧＦＲ抗体の混合物が抗体単独よりも優れていることを示すために、Ａ４３１−ＮＳ増殖の阻害について調べる実験を実施した。図１６Ａで認めることができるように、抗体は、単独ではＡ４３１−ＮＳ増殖の不良なインヒビターであるが、組み合わせた場合、４３１−ＮＳ増殖に対する相乗的な阻害効果が得られる。９９２と１０４２または１０３０のいずれかとの混合物もまた、極めて強力であるが、３つ全ての混合物は全ての抗体濃度範囲にわたってこれらより優れている。

【0273】

様々な濃度のＥＧＦで刺激したＡ４３１−ＮＳ細胞の増殖に対する個々の抗体および抗体混合物の効果について調べ、その結果を図１７に示す。図１７で認められうるように、抗体の非存在下における０．１ｎＭを超えるＥＧＦ濃度は、細胞に対して毒性である。しかし、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩ内の非重複エピトープを伴う３つの抗体（９９２、１０３０および１０４２）の混合物は、少なくとも０．３ｎＭまでのＥＧＦを試験した場合、相乗的に作用して、ＥＧＦの存在下でＡ４３１−ＮＳ細胞の増殖を阻害し、混合物はすべてのモノクローナル抗体より優れていることが明白である。

【0274】

次に、本発明者らは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩにおいて非重複エピトープを伴う２つの抗体とＥＧＦＲのドメインＩまたはＩＩ内のいずれかにエピトープを伴う抗体とを組み合わせることによっても、Ａ４３１−ＮＳ増殖に対する相乗的阻害効果を得ることができることを実証する。図１８において認められ得るように、両方ともＥＧＦＲのドメインＩＩＩである抗体９９２および１０２４と、ＥＧＦＲのドメインＩ（１２８４）またはドメインＩ／ＩＩ（１４３４）のいずれかと反応性である抗体との組み合わせは、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩ内の非重複エピトープと反応する３つの抗体（９９２＋１０２４＋１０３０）と同程度に強力である。加えて、抗体のこれらの混合物は、Ａ４３１−ＮＳの増殖の阻害において、治療用抗ＥＧＦＲ抗体ErbituxおよびVectibixより強力である。

【0275】

他の２つの癌細胞系統ＤＵ１４５（ATCC番号ＨＴＢ−８１）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ATCC番号ＨＴＢ−１３２）を使用して、同様のアッセイを実施した。これらの増殖アッセイからの結果を、図１６Ｂおよび１６Ｃに示す。両方の場合とも、３つの抗体（９９２、１０３０および１０４２）の混合物は、２つの抗体の混合物および単一の抗体より優れていた。ＤＵ１４５細胞では、３つの抗体の混合物は、すべての濃度において、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８では、高濃度において、Ｖｅｃｔｉｂｉｘより優れていた。

【0276】

上記の方法と類似の方法を使用して、本発明者らは、異なる濃度の３つの抗ＥＧＦＲ抗体を試験した。

【0277】

結果
異なる濃度の３つの抗体の効果を、Ａ４３１ＮＳ細胞系統において調べた。これらのうち最も強力な２０の増殖阻害活性を図３７に示す。全ての組み合わせは、Ａ４３１ＮＳ細胞系統の増殖を、非処置コントロールと比較して６０％より大きく阻害した。別の興味深い観察は、組み合わせ（９９２＋１０２４＋１２５４および９９２＋１０２４＋１３２０および９９２＋１２７７＋１３２０）以外の組み合わせが非重複エピトープを伴う抗体を含有することである。これは、別々のエピトープに結合する３つの抗体のいくつかの組み合わせを設計することが可能であることを示す。

【0278】

実施例７−アポトーシス
アポトーシスは、細胞死を引き起こす生物学的機構である。この機構は、Erbituxのような抗ＥＧＦＲ抗体を用いることにより以前に報告されている（Baselga J. The EGFR as a target for anticancer therapy - focus on cetuximab. Eur J Cancer. 2001 Sep:37, Suppl 4:S16-22）。従って、個々の抗ＥＧＦＲ抗体９９２、１０４２、および１０３０ならびに（９９２＋１０４２＋１０３０）がどの程度アポトーシスを誘導することが可能であるかについて調べた。

【0279】

１×１０^４個のＡ４３１ＮＳ細胞を、０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のＥＧＦＲ混合物（等量の９９２、１０３０、１０４２）、９９２、１０３０、１０４２、ＥｒｂｉｔｕｘまたはＶｅｃｔｉｂｉｘの存在下、９６ウェル培養プレート中、３回反復測定で、０．５％のＦＢＳおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭにてインキュベートした。細胞および抗体を２２時間インキュベートした。次いで、上清を回収し、次いでRoche、カタログ番号１１７７４４２５００１（Basel、Switzerland）製ＥＬＩＳＡ−キットでヒストン−ＤＮＡ複合体の存在について測定した。

【0280】

混合物の効果を、Ａ４３１ＮＳ細胞を使用して、モノクローナル抗体単独のそれぞれならびに対照抗体VectibixおよびErbituxと比較した（図１９の結果）。抗体を、１０倍希釈で試験した。混合物は、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度で試験した場合、個々のモノクローナル抗体ならびにVectibixと比較して、有意に（Ｐ＜０．０５）より効率的である。混合物は、１μｇ／ｍｌのErbituxと比較して、統計的に有意（ｐ＜０．０５）にアポトーシスを増加した。

【0281】

実施例 ７ｂ
実施例７に加えて、９９２＋１０２４の混合物ならびに９９２＋１０２４＋１０３０の混合物を、実施例７に記載のような同じ方法に従ってアポトーシス活性について調べた（図３５）。アポトーシスの実際のレベルを、最大ポジティブコントロールに関連付けた。２つの混合物の両方を、Ａ４３１ＮＳ細胞を使用して、１μｇ／ｍｌにおいてErbituxおよび個々のモノクローナル抗体９９２、１０２４および１０３０ならびにコントロール抗体と比較した。９９２＋１０２４の混合物は、Erbituxおよび個々のモノクローナル抗体より有意に良好であった（すべてＰ＜０．０５）。

【0282】

実施例８ インビボでの効果
抗体９９２、１０３０および１０４２よりなる抗ＥＧＦＲ混合物を、Ａ４３１ＮＳを使用して、ヌードマウス異種移植モデルにおけるインビボでの効果について調べた。これは、抗ＥＧＦＲ抗体を含むモノクローナル抗癌抗体の有効性を調べるために広範に使用されるモデルである。ヌードマウスは、免疫不全であり、Ｔ細胞を欠く。これは、マウスにおけるヒト細胞の増殖を可能にする。

【0283】

６〜８週齢のヌードマウスの２つのグループに、１×１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を皮下に注入した。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に到達した場合、処置を開始した。マウスに、１ｍｇの抗体の腹腔内への５回の注入を２〜３日間隔で行った。腫瘍サイズを、デジタルカリパスを使用して、２つの直径について測定し、次の式を使用して容積を計算した：腫瘍容積（ｍｍ^３）＝Ｌ×Ｗ^２×０．５、ここで、Ｌは最も長い直径であり、Ｗは最も短い直径である（Teicher BA, Tumor Models in Cancer Research. Humana Press, NJ, USA 2002, p596）。実験の終了時までに腫瘍を摘出し、秤量した。

【0284】

Synagisをコントロール抗体として使用した。この実験にはまた、抗ＥＧＦＲ混合物（抗体９９２、１０３０、および１０２４）の場合と同じスケジュールを使用するErbituxおよびVectibixによる処置を含めた。

【0285】

図２０に見られるように、９９２、１０３０および１０４２の混合物は、Ａ４３１ＮＳの腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。平均重量を図２１に示す。結果は、測定した腫瘍サイズに相関した。処置グループとコントロールグループとの間に有意差が存在する。

【0286】

実施例８ｂ インビボでの効力
実施例８の上記のインビボ実験に加えて、９９２＋１０２４および９９２＋１０２４＋１０３０の混合物を、上記のＡ４３１ＮＳ異種移植モデルにおいて調べた（図３６）。６〜８週齢のそれぞれ９匹のヌードマウスの４つのグループに、１×１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を皮下で注入した。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ^３に到達したら、マウスに第１回の抗体注入を行った。３つのグループに、９９２＋１０２４、９９２＋１０２４＋１０３０の混合物、Erbituxまたはコントロール抗体、Synagisのいずれかを投与した。全てにおいて、マウスに、１週間に４回、０．５ｍｇの１７回の注入を行った。最初の注入を８日目に行い、最後の注入を３４日目に行った。腫瘍サイズを、５６日間測定した。抗体処置の終結後、Erbituxを投与したマウスの腫瘍は、サイズが拡大し始めたが、一方、９９２＋１０２４または９９２＋１０２４＋１０３０のいずれかの混合物を投与した２つのグループのマウスでは、腫瘍のサイズが減少し続けた。９１日目（処置の終結の５７日後）の９９２＋１０２４グループでは、腫瘍サイズの拡大は観察されなかった。５６日目では、９９２＋１０２４の組み合わせの平均腫瘍サイズは、Erbituxを投与したマウスの平均腫瘍サイズより有意に小さかった（Ｐ＜０．０１）。

【0287】

実験でのマウスの生存についてもモニターした。腫瘍が許可される最大サイズに到達した場合に死亡とマウスを評価した。以下の表は、腫瘍細胞の播種５６日後に生存したマウスの数を示す。Erbituxと比較して、組み合わせの両方について生存数の改善が認められる。

【0288】

【表11】

【0289】

さらなる実験
実施例８に記載の異種移植実験からの腫瘍溶解物に関する予備データは、９９２＋１０４２＋１０３０の組み合わせが、Ａ４３１ＮＳによるＶＥＧＦ産生の強力な下方調節を誘導し、前者が血管新生の重要なメディエーターであることを示す。血管の形成の増加は、多くの固形腫瘍に認められる現象であって、この現象は、栄養物などの持続した供給に参加し、それによって、生存条件に影響を及ぼす機構である。

【0290】

さらに加えて、他の予備データは、９９２＋１０４２＋１０３０の抗体の組み合わせのレベルの増加が、ErbituxおよびVectibixと比較した場合、実施例８に記載の異種移植実験由来の腫瘍融解物で観察することができることを示す。

【0291】

実施例８ｃ．インビボでの腫瘍細胞分化の増強
細胞の最終分化は、多段階プロセスでそれらの増殖能の不可逆的な喪失を導く細胞型特異的遺伝子発現プログラムの活性化を含む複雑なプロセスである。悪性疾患では、癌細胞は、しばしば、増殖速度の増加によって特徴付けられる脱分化状態にあり、癌細胞の最終分化を誘導することが可能な薬物は、悪性細胞を排除し、正常細胞の恒常性を回復することが可能であることが示唆されている（Pierce GB, Speers WC: Tumors as caricatures of the process of tissue renewal: prospects for therapy by directing differentiation. Cancer Res 48:1996-2004, 1988）。一定の実験条件下において、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、免疫不全マウスにおける異種移植腫瘍として増殖するヒト扁平癌細胞の最終分化の速度を増加させることができることが以前に報告されている（Milas L, Mason K, Hunter N, Petersen S, Yamakawa M, Ang K, Mendelsohn J, Fan Z: In vivo enhancement of tumor radioresponse by C225 antiepidermal growth factor receptor antibody. Clin Cancer Res 6:701-8, 2000；Modjtahedi H, Eccles S, Sandle J, Box G, Titley J, Dean C: Differentiation or immune destruction: two pathways for therapy of squamous cell carcinomas with antibodies to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res 54:1695-701, 1994）。

【0292】

本発明者らは、マウスにおいて異種移植片として増殖する抗ＥＧＦＲで処置したＡ４３１ＮＳ細胞の最終分化の程度を組織学的に調べた。組織学的研究には、実施例８に記載の実験由来の４つの実験グループのそれぞれから無作為に選択した３つのマウス異種移植腫瘍を含めた。

【0293】

組織を切開し、急速に凍結し、次いで凍結ミクロトーム（Leitz、モデル１７２０）上のTissue-Tekで包埋し、５μｍ切片に切断し、superfrost plus slides上にサンプル調製し、次いでヘマトキシリン/エオシン染色のために処理した。次いで、２つの独立した観察者が盲検様式ですべての組織切片の顕微鏡検査を行い、最終分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｏｎ）の程度の測定として角化領域（「癌真珠」）を評価した（Modjtahedi et al., 1994）。表７は得られた結果を列挙する。３つの抗ＥＧＦＲ抗体の混合物（９９２＋１０２４＋１０３０、グループ１）で処置したマウスは、対照抗体ErbituxおよびVectibix（それぞれグループ２および３）で処置したマウスと比較して、顕著により大きなかつより多数の最終分化した癌細胞の病巣を有した。抗体の代わりにＰＢＳを投与したコントロールグループ（グループ４）では、最終分化は検出されなかった。

【0294】

デジタルカメラを搭載した顕微鏡を使用して代表的な顕微鏡画像を得た（図２６を参照のこと）。

【0295】

結論として、ドメインＩＩＩ内に非重複エピトープを伴う３つの抗ＥＧＦＲ抗体（クローン９９２、１０３０および１０４２）の組み合わせは、ErbituxおよびVectibixモノクローナル抗体と比較して、インビボで腫瘍細胞に対して予想外の増強された分化誘導効果を示した。最終分化において観察された効果は、本発明の抗体組成物が、レチノイン酸、４−フェニルブチレートのような薬剤を含むその他の分化を伴う組み合わせの療法で使用することができるといる結論を導く。

【0296】

表７

【表12】

【0297】

実施例８ｄ．本発明の抗体組成物の増殖阻害効果の維持
実施例８および８ｂに示した腫瘍異種移植実験の反復を実施して、９９２＋１０２４抗体混合物のインビボでの効力について調べた。簡単に説明すると、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に、１０^６個のＡ４３１ＮＳ細胞を皮下注入した。腫瘍異種移植片を１００ｍｍ^３の平均腫瘍サイズまで増殖させ（７日目）、この時点で、マウスを９匹の動物よりなる５つのグループに無作為に分け、抗体処置を開始した。５つのグループに、高（２ｍｇ／週）もしくは低（１ｍｇ／週）用量の９９２＋１０２４混合物または対照抗体Erbitux、あるいは高用量（２ｍｇ／週）のコントロール抗体Synagisのいずれかを投与した。すべてのマウスに、０．５または１ｍｇの抗体の合計で９回の注入（１週間に２回の注入を７日目に開始して、３３日目に終了する）を行った。

【0298】

高用量（２ｍｇ／週）の９９２＋１０２４混合物は、Erbituxと比較すると、初期の腫瘍増殖を制御し、長期の腫瘍退行を誘導するのに極めて効率的である（Ｐ＝０．０００２、図３８）。２ｍｇ／週の９９２＋１０２４混合物を投与した動物のうち、研究期間（研究の開始後１１８日間、図３８および３９）中に死亡した動物はなく、６０日目に９匹の動物のうち１匹のみが生存した高用量のErbituxの２ｍｇ／週グループより有意に良好な結果が認められた（Ｐ＝０．０００８、図３９）。これは、長期間の生存に対する９９２＋１０２４処置の持続効果を示す。高用量のものより低い効率であるが、低用量の９９２＋１０２４混合物（１ｍｇ／週）もまた、腫瘍増殖を制御することができ、腫瘍抑制（Ｐ＝０．０１３５、図３８）および生存率（Ｐ＝０．００８７、図３９）の両方を見た場合、高用量の２ｍｇ／週のErbituxと比較して有意に良好であった。これらの結果は、低用量であったとしても、Erbituxと比較して、９９２＋１０２４の組み合わせがより優れた効力を有することを示す。結果はまた、承認されたモノクローナル抗体と比較した、９９２＋１０２４の組み合わせによって生じる増殖阻害の持続性を示す。

【0299】

実施例９ スフェロイド増殖
スフェロイド研究では、丸底９６−ウェルプレートに３５μｌの１２０ｍｇ／ｍｌのポリ−ＨＥＭＡ溶液を添加し、フローフードで一晩放置して蒸発させた。ポリ−ＨＥＭＡは細胞接着を防止する。Ａ４３１−ＮＳ細胞を上記のように処理し、計数し、次いでそれらの濃度を１００，０００細胞／ｍｌに調整する。次いで、５０μｌの細胞懸濁液（５，０００個の細胞／ウェル）を、５０μｌの５％matrigel溶液と共に、カラム２〜１１の実験ウェルに添加する。実験用ウェルの培地蒸発の減少効果のため、２００μｌの培地を、列１および８ならびにカラム１および１２に添加した。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離し、次いで加湿インキュベーターにて３７℃で一晩放置した。翌日、適切な抗体および抗体混合物を、空の９６−ウェルプレートにおいて２０μｇ／ｍｌの最終全抗体濃度に希釈した。これを、０．５％のＦＢＳおよび１％のＰ／Ｓを補充したＤＭＥＭで行い、最も高い抗体濃度のウェルで１０μｇ／ｍｌの最終抗体濃度を得る。次いで、１５０μｌのこれらの溶液を、９６−ウェルプレートのカラム２のウェルに添加し、各ウェルが１００μｌの抗体溶液を含有するように、３倍系列希釈をカラム９まで漸減させながら作製した。１００μｌの培地をカラム１１に添加した。次いで、これらの溶液の１００μｌを、スフェロイドを含有するプレートに移し、７日間インキュベートした。次いで、２０μｌのWST-1試薬を、１ウェルあたり（ｐｒ． ｗｅｌｌ）に添加し、次いでプレートを、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、オービタルプレートシェーカーに移し、さらに１時間放置した。吸光度を４５０および６２０ｎｍ（対照波長）においてＥＬＩＳＡリーダー上で測定する。代謝活性細胞（ＭＡＣ）の量を、以下のように非処置コントロールのパーセントとして計算する：

【表13】

【0300】

ドメインＩＩＩ内の非重複エピトープを伴う３つの抗体の混合物（９９２＋１０３０＋１０４２）は、Ａ４３１−ＮＳスフェロイドの増殖を効果的に阻害し、モノクローナル治療用抗ＥＧＦＲ抗体ErbituxおよびVectibixよりさらに強力である（図２２）。

【0301】

実施例１０． カニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤへの結合
カニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメインのクローニング
シグナルペプチドを含まないカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインを、ネステッドＰＣＲ、および全長ヒトＥＧＦＲの公開された配列(GENBANK X00588, Ullrich,A. et. al. Nature 309(5967),418-425 (1984))に由来する配列特異的プライマーを使用することによって表皮から単離したカニクイザルｃＤＮＡからクローニングした。

【0302】

ＰＣＲ試薬：
正常な皮膚表皮から単離されたカニクイザルｃＤＮＡ：
CytoMol Unimed、カタログ番号：ｃｃｙ３４２１８、ロット番号：Ａ７１１０５４。
Phusion反応緩衝液（５×）：Finnzymes、カタログ番号：Ｆ−５１８、ロット番号：１１。
Phusion酵素：Finnzymes、Ｆ−５３０Ｓ（２Ｕ／μＬ）。
ｄＮＴＰ ２５ｍＭ：Bioline、カタログ番号：ＢＩＯ−３９０２９、ロット番号：ＤＭ−１０３Ｆ。
部分的シグナル配列および膜貫通ドメインを含むカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤの増幅のためのプライマー：
５’ＡＴＧプライマー：５’−ＴＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１３５）
３’Ｔｍ２プライマー：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧＡＧ−３’（配列番号１３６）
カニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤ Ｂｐ１〜１８６３を増幅し、膜貫通ドメインの前にＸｂａＩ、ＭＩｕＩ制限部位および終止コドンを組み入れるネステッドＰＣＲのためのプライマー：
５’ＥＧＦＲ ＸｂａＩ：５’−ＡＴＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１３７）
３’ＥＧＦＲ ＭＩｕＩ：５’−ＴＡＣＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＧＴＴＴＡＧＧＡＴＧＧＧＡＴＣＴＴＡＧＧＣＣＣＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１３８）

【0303】

ＰＣＲ条件：
３０サイクル：９８℃／３０秒間の融解、５５℃／３０秒間のアニーリング、７２℃／６０秒間の伸長。３０サイクル後、ＰＣＲ産物をさらに５分間伸長させた。

【0304】

ＰＣＲ反応を、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭプライマーを含有する５０μＬの合計容積の反応緩衝液中の１μｌテンプレートおよび２単位のＰｈｕｓｉｏｎ酵素によって実施した。

【0305】

見かけの長さが約１８００〜１９００Ｂｐの最終ＰＣＲバンドを入手し、発現ベクターにクローニングした。クローニングしたカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメインのＤＮＡおよびタンパク質配列を図２３に示し、ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤに対して整列させたカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤのタンパク質配列を図２４に示す。ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤおよびカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤ ＤＮＡ配列のアラインメントは９７．６％の配列同一性を示した一方、対応するタンパク質配列のアラインメントは９８．６％の配列同一性を示した。

【0306】

ＥＬＩＳＡにおけるヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメイン間の抗体交差反応性の実証
試験した抗ＥＧＦＲ抗体が、ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤの両方に良好に等しく結合したことを確かめ、それによりカニクイザルにおける毒物学研究を保障するため、１μｇ／ｍｌから開始した抗体の４倍系列希釈を、ＥＬＩＳＡによって、組み換えヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲ ＥＣＤタンパク質への結合について試験した。このアッセイにおいて同一結合プロファイルを示す抗体を、良好な種のＥＧＦＲ交差反応性の指標とみなした。ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度において５０μｌ／ウェルの全長ＥＧＦＲにおいて４℃で一晩被覆した。翌朝、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで１００μｌのＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡにより、室温で１時間ブロックし、続いて、ＰＢＳ−Ｔにおいて２回洗浄した。次に、５０μｌの系列希釈した抗ＥＧＦＲ抗体およびコントロール抗体をウェルに添加し、次いで室温で１時間インキュベートした。抗体インキュベーション後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、続いてブロッキング緩衝液中１：３０００に希釈した５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ二次試薬とのインキュベーションおよび室温で３０分間のインキュベーションを行った。最後に、ウェルを、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄し、プレートを、５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加することによって発色させ、室温でインキュベートした。インキュベーション後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４、１００μｌ／ウェルの添加によって反応を停止し、プレートをＯＤ４５０ｎｍで読み取った。

【0307】

ＥＬＩＳＡ試薬：
１．ＥＬＩＳＡプレート；NUNC Maxisorp；カタログ番号：４４２４０４
２．抗原：ヒトｒＥＧＦＲ ＥＣＤ；カニクイザルｒＥＧＦＲ ＥＣＤ
３．コーティング緩衝液：１×ＰＢＳ；Gibcoカタログ番号：２００１２−０１９
４．洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ／０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）
５．ブロッキング／希釈緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中１％ＢＳＡ
６．ヤギ−抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ抱合：Serotec、Star 106P
７．TMB Plus（KemEnTecカタログ番号４３９０Ｌ）
８．（１ＭのＨ_２ＳＯ_４）

【0308】

図２５に示すように、記載のＥＬＩＳＡアッセイは、交差反応性ヒトおよびカニクイザル抗ＥＧＦＲ ＥＣＤ抗体（図２５Ａ）と、マウス免疫化に使用したヒトＥＧＦＲＥＣＤのみを認識する種特異的抗体（図２５Ｂ）との間を識別することができた。

【0309】

実施例１１．運動性の阻害
ほとんどの癌による死は、腫瘍細胞の転移および遠位局在におけるその後の増殖から生じる。隣接する正常組織の局所侵入は、恒常性機能を損なわず、腫瘍の外科的または放射線的切除を妨害する。最近の研究では、誘導された運動性がこのような広がりを促進するのに中心的な役割を果たすことが注目されている。ＥＧＦＲは、細胞運動性および拡大を容易にすることが公知であり、従ってＥＧＦＲ仲介運動性の阻害はＥＧＦＲを標的にする薬物の重要な機構である。

【0310】

頭頚部癌腫細胞系統の運動性に対する２つの抗体９９２および１０２４の混合物の効果について調べた。１０，０００個の細胞からなるスフェロイドを、実施例９に記載のように、一晩調製した。次いで、スフェロイドを、ＮＵＮＣ Ｔ２５細胞培養フラスコに移し、一晩接着させた。次いで、１０μｇ／ｍｌの抗体混合物９９２＋１０２４またはネガティブコントロール抗体を添加し、スフェロイドをさらに２４時間インキュベートした。次いで、４０×の倍率で画像を撮影し、software Image Jを使用して、細胞で覆われた表面積を測定した。

【0311】

結果：図２７Ａに認められ得るように、ＥＧＦＲ特異的抗体９９２および１０２４の添加は、腫瘍細胞で覆われた表面積の顕著な減少をもたらす。運動性を図２７Ｂにおいて定量し、これは、をネガティブコントロール抗体と比較して、運動性が約６０％減少することを示す。この運動性の減少は極めて有意ｐ＜０．０１である。

【0312】

それ故、抗体９９２および１０２４の組み合わせは、潜在的にＥＧＦＲ仲介腫瘍細胞運動性を阻害し、これは、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせが転移した疾患の治療に使用され得ることを示す。

【0313】

実施例１２．Ｓｙｍ００４抗体組成物によるインボルクリンの上方調節
インボルクリンは、早期の扁平細胞分化のマーカーであって、角化膜の形成に関与するタンパク質である。従って、インボルクリンレベルは、分化した腫瘍細胞の数を測定するのに使用することができる。インボルクリンのレベルは、市販のインボルクリンＥＬＩＳＡキット（Biomedical Technologies）を使用して、Erbitux、Vectibixもしくは抗体９９２＋１０３０＋１０４２の混合物で処置しなかったまたは処置したいずれかのＡ４３１ＮＳ異種移植腫瘍由来のタンパク質溶解物中で推定した。Qiagen製TissueLyzerを使用して、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中３０〜４０ｍｇの腫瘍組織を均質化することにより腫瘍溶解物を調製した。各澄明化された溶解物中のタンパク質濃度を、Pierce製BCAタンパク質アッセイキットを使用して調べ、各サンプル由来の０．４μｇのタンパク質においてＥＬＩＳＡアッセイを使用してインボルクリンレベルを推定した。

【0314】

結果：図２７で認められ得るように、インボルクリンは、ネガティブコントロールおよびErbituxまたはVectibix処置グループと比較して、９９２＋１０３０＋１０４２処置グループにおいて有意に高いレベルで認められる。それ故、抗体９９２、１０３０および１０４２の組み合わせは、Ａ４３１ＮＳ異種移植腫瘍におけるインボルクリンのレベルを増加させ、従って、おそらく、より高い程度のＡ４３１ＮＳ分化を誘導する。多量の癌真珠と良好に相関する結果は、この特定の処置グループで見出される（実施例８を参照のこと）。

【0315】

実施例１３．Ｓｙｍ００４抗体組成物によるＥＧＦＲの内在化
いくつかの抗体は、それらの表面標的の内在化を誘導することによって機能する。ＥＧＦのようなリガンドによって活性化される場合、ＥＧＦＲは、内在化を経験することが公知である。

【0316】

２つの抗体９９２および１０２４の混合物がＥＧＦＲ内在化を誘導する能力を、共焦点顕微鏡を使用して調べた。Ａ４３１ＮＳおよびＨＮ５細胞を、LabTek由来の８ウェルチャンバスライドに播種し、０．５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて一晩インキュベートした。次いで、細胞に、１０μｇ／ｍｌの９９２＋１０２４のAlexa-488標識抗体混合物またはコントロール抗体Erbituxを添加し、次いで、異なる期間インキュベートした。次いで、大ピンホールまたは小ピンホールのいずれかを伴うBiorad共焦点顕微鏡を使用して、６０×倍率で画像を撮影した。

【0317】

結果：図２９Ａに示すように、Alexa-488標識ＥＧＦＲ特異的抗体９９２および１０２４の２時間の添加は、Ａ４３１ＮＳおよびＨＮ５細胞系統の両方の細胞内小胞における抗体の蓄積を引き起こす。対照的に、Erbituxは、主に細胞表面に見出される。図２９Ｂは、より薄い細胞切片の画像を生じる小さい方のピンホールを使用するＡ４３１ＮＳ細胞の画像を示す。これらの画像から、抗体９９２＋１０２４は細胞内に局在するが、一方、Erbituxは主に細胞表面で見出されることが明らかである。図３０は、９９２＋１０２４仲介の内在化の時間枠を示し、抗体の添加後の３０分間の短い時間で、それらが、細胞内小胞において見出され得ることを示す。４時間後、ほぼすべての抗体９９２＋１０２４が、低いまたは極めて弱い表面染色で、細胞内に見出される。対照的に、Erbituxは細胞表面に残存する。９９２＋１０２４によって誘導される内在化が細胞内のＥＧＦＲの持続的な分解および除去を引き起こすことを示す証拠もまた、得られている。

【0318】

それ故、抗体９９２および１０２４の組み合わせは、迅速かつ強力にＥＧＦＲ内在化を誘導するが、一方でErbituxは誘導しない。

【0319】

実施例１４ 表面プラズモン共鳴による抗体アフィニティーの測定
組み換え可溶性ＥＧＦＲ ＥＣＤに対するＳｙｍ００４ ＩｇＧ抗体の一価のアフィニティーの測定

【0320】

可溶性抗原に対するＩｇＧ分子全体の一価のアフィニティーの測定を可能にする（Canziani, Klakamp, et al. 2004, Anal. Biochem, 325:301-307）に記載のアッセイを用いて、本発明の全長ＩｇＧ抗体の速度論的分析を、BIAcore 2000上で実施した。簡単に説明すると、約１０，０００Ｒｕのポリクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体を、製造業者の説明書に従ってＣＭ５チップ表面に抱合し、続いて、抗Ｆｃチップ表面上での２５μｇの本発明の個々の抗ＥＧＦＲ抗体またはSynagisネガティブコントロールの捕捉を行った。アッセイにおいて用いた最も高い抗原濃度の結合が２５Ｒｕを超えないように、各クローンについて、捕捉されたＩｇＧの密度を最適化した。次に、ゲル排除クロマトグラフィーによって一価のタンパク質のみを含有することが予め示された２５０μＬの可溶性ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤを、２５μＬ／分の流速、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液での２倍希釈系列で注入して、応答曲線を作成した。捕捉された抗体／抗原複合体を、１００ｍＭのＨ_３ＰＯ_４の１０秒間注入でストリッピングすることによって、サイクル間で、チップ表面を再生した。まず、ネガティブコントロール抗体Synagisを含有するフローセルの応答を差し引き、続いて、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液のみの注入によって作成された応答を差し引く（「二重参照法」）ことによって、速度論的分析を実施した。解離速度定数（ｋａ）および解離定数（ｋｄ）を、製造業者によって提供されたBIA evaluation software 4.1により作成されたセンサーグラムから総合的に評価した。

【0321】

試薬：
１．ＣＭ５チップ：Biacore、カタログ番号ＢＲ−１０００−１４
２．ＮＨＳ：Biacore BR-1000-50
３．ＥＤＣ：Biacore BR-1000-50
４．１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ４．５：Biacore、カタログ番号ＢＲ−１００３−５０
５．ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ：Caltag、カタログ番号Ｈ１０５００
６．エタノールアミン、１．０Ｍ ｐＨ８．５：Biacore BR-1000-50
７．１０×ＨＢＳ−ＥＰランニング緩衝液：０．０１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％ｖ／ｖのSurfactant P20
８．抗原：６×Ｈｉｓを伴うヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン
９．１００ｍＭのＨ_３ＰＯ_４

【0322】

可溶性ヒトＥＧＦＲＥＣＤに対する本発明の全長ＩｇＧの計算された一価のアフィニティーを、以下の表８に示す。

【0323】

【表14】

表８．可溶性受容体に対する抗ＥＧＦＲＩｇＧ抗体の測定されたアフィニティー。抗体測定を、製造者によって提供された評価ソフトウェアを用いるBIAcore 2000における表面プラズモン共鳴によって実施した。^＊992のアフィニティーを、Scatchard分析によって決定した。ＮＡ．適用しなかった。

【0324】

それぞれ４．２ｎＭ、０．４ｎＭ、および４．６ｎＭのより高いアフィニティーを有した１２６０、１２７７、および１２８４を除いて、試験したほとんどのＳｙｍ００４抗体は、１０〜２０ｎＭの範囲のアフィニティーで可溶性ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤを認識した。最終的に、９９２が試験した他の抗体よりかなり低いアフィニティーで可溶性ＥＧＦＲ ＥＣＤに結合することを見出した。結果的に、この抗体の速度論的分析は、Scatchard分析によって決定すべきであり、これにより、可溶性ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤに対して１７０ｎＭのアフィニティーが示された。

【0325】

固定化された組み換えＥＧＦＲ ＥＣＤに対するＳｙｍ００４ Ｆａｂ抗体のアフィニティーの測定

【0326】

可溶性および固定化形態で示されるＥＧＦＲ ＥＣＤ間の抗原提示における可能な差異を調べるために、ヒトＩｇＧ Ｆｃに融合されたヒトＥＧＦＲ ＥＣＤよりなるEGFR-Fc（R&D Systems、344-ER）と呼ばれる固定化されたキメラＥＧＦＲ受容体抗原に対する新たなアフィニティー測定を実施した。この目的のために、ＩｇＧ抗体９９２、１０２４および１０３０のＦａｂフラグメントを作製して、一価のアフィニティーの測定を可能にした。

【0327】

Ｆａｂ生成：
９９２、１０２４および１０３０のＦａｂフラグメントを、Pierce製Fab preparation Kitを使用し、製造業者の説明書に従ってパパイン消化によって生成した。簡単に説明すると、２ｍｇの各ＩｇＧ抗体を、製造業者の説明書に従い、２０ｍＭシステイン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０を含有する新たに調製した消化緩衝液を伴うNAP-5カラム（Amersham Biosciences）上で緩衝液交換を行った。次いで、ビーズをスピンし、上清を捨てる前に、パパインビーズの３５０μｌスラリーを、同じ消化緩衝液で２回洗浄した。１ｍｌの緩衝液を交換したＩｇＧ抗体をビーズに添加し、次いで１０００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩インキュベートすることにより抗体を消化した。翌朝、HiTrap Protein Aカラム（Ge Healthcare）上での全長ＩｇＧの枯渇によって、粗Ｆａｂから未消化のＩｇＧを分離した。生成されたＦａｂを、ＰＢＳに対して一晩十分に透析し、還元および非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。非還元条件下の約５０ｋＤａのタンパク質のバンドを、成功したＦａｂ生成の指標とみなした。

【0328】

試薬：
１．ImmunoPure Fab preparation Kit；Pierce；カタログ番号４４８８５
２．NAP5脱塩カラム；Amersham、カタログ番号１７−０８５３−０２
３．ＰＢＳ ｐＨ７．２；Gibco；番号２００１２−０１９
４．HiTrap Protein A HP、１ｍｌカラム；GE Healthcare；番号１７−０４０２−０１
５．NuPAGE 4-12% Novex Bis-Tris Gel；Invitrogen；番号ＮＰ０３２２ＢＯＸ
６．分子量マーカー；Seeblue Plus 2、；Invitrogen；番号ＬＣ５９２５
７．抗ＥＧＦＲ抗体−それぞれ２．０ｍｇ

【0329】

本発明のＦａｂ抗体の速度論的分析を、物質輸送における制限を回避するために極めて低い密度でセンサー表面上に固定化された組み換え抗原を使用し、Biacore 2000上で実施した。簡単に説明すると、合計で２８５Ｒｕの組み換えＥＧＦＲ ＥＣＤ−Ｆｃキメラ（R&D Systems、カタログ番号３４４−ＥＲ）を、製造業者の説明書に従って、CM5チップ表面に抱合した。次いで、固定化されたＥＧＦＲを伴うチップ上で試験した場合、２５を超えるＲｕ最大値を生じなかった最適化された濃度で開始する２倍系列希釈で、本発明の抗体に由来するＦａｂフラグメントを試験した。まず、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液のみの注入によって作成された応答を差し引くことによって、速度論的分析を実施した。解離速度定数（ｋａ）および解離定数（ｋｄ）を、製造業者によって提供されたBIA evaluation software 4.1により作成されたセンサーグラムから総合的に評価した。

【0330】

固定化されたヒトＥＧＦＲＥＣＤに対する本発明の試験したＦａｂフラグメントの計算されたアフィニティーを、以下の表９に示す。

【0331】

【表15】

表９：固定化された受容体に対する抗ＥＧＦＲ Ｆａｂ抗体の測定されたアフィニティー抗体測定を、製造業者によって提供された評価ソフトウェアを用いるＢＩＡｃｏｒｅ ２０００における表面プラズモン共鳴によって実施した。^＊９９２のアフィニティーをＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定した。ＮＡ．適用しなかった。

【0332】

上記の表９に示すように、９９２および１０２４のＦａｂフラグメントは、左記の実施例に示すアフィニティーと一致して、それぞれ、１５０ｎＭおよび２６ｎＭのアフィニティーを有することが見出され、これは、これらの２つの抗体について、可溶なおよび固定化されたＥＧＦＲに対する抗体認識における軽微な差異を示した。しかし、抗体１０３０は、可溶性受容体と比較して、固定化された抗原に対して２．３ｎＭの１０倍高いアフィニティーを示し、結果的に、固定化された抗原上に暴露されたエピトープを好適に認識した。

【0333】

実施例１５：ＥＧＦＲ抗原提示の調査およびＡ４３１−ＮＳ細胞に対する機能的アフィニティーの格付け。
Ａ４３１−ＮＳ細胞における抗原提示および精製された全長ＥＧＦＲ受容体間の比較。

【0334】

速度論的分析は、抗体９９２が、１５０〜１７０ｎＭの間のアフィニティーで組み換えＥＧＦＲ ＥＣＤを認識したことを示したため、このような弱いアフィニティーが認められるのは、ｍＡｂ９９２が、組み換えＥＧＦＲ ＥＣＤまたはＡ４３１細胞から精製された完全長ＥＧＦＲにおいて示されるコンホメーションとは対照的に、Ａ４３１−ＮＳ細胞上に発現されるＥＧＦＲの元々のコンホメーションに好適に結合した事実によるかどうかについて調べた。ＥＧＦ受容体抗原提示における差異を調べるために、本発明の抗体のサブ集団の同時ＥＬＩＳＡ結合研究をＦａｂフラグメントで実施し、試験したＡ４３１−ＮＳ細胞、および同じ細胞から精製した全長ＥＧＦＲに対するアビディティの効果を回避した。

【0335】

Ｆａｂ生成：Ｆａｂフラグメントの生成を、実施例１４に記載のとおりに実施した。

【0336】

間接ＥＬＩＳＡ：間接ＥＬＩＳＡでは、全長ＥＧＦＲ（Sigma E2645）を、炭酸緩衝液（５０μｌ／ウェル）中１μｇ／ｍｌにおいて４℃で一晩被覆した。翌朝、ウェルをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、次いで１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ−Ｔにより、室温で１時間ブロッキングし、続いて、ＰＢＳ−Ｔにおいて２回洗浄した。次に、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭにおけるＦａｂ抗体の５０μｌ系列希釈を、独立したＥＬＩＳＡウェルに添加し、次いで室温で１時間インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。次に、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭにおいて１：５０００に希釈した５０μｌの第２のヤギ−抗ヒト（Ｆａｂ特異的）ＨＲＰ抱合を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。最終的に、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、次いで５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を添加することによりプレートを発色させ、続いて５〜１５〜３０分ごとに６２０ｎｍで読み取った。基質とのインキュベーション後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。

【0337】

試薬、間接ＥＬＩＳＡ：
１）コーティング緩衝液：５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ９．８
２）抗原：Ａ４３１細胞から精製した野生型全長ＥＧＦＲ；Sigma E2645
３）ＥＬＩＳＡプレート：NUNC Maxisorp；カタログ番号：４４２４０４
４）洗浄緩衝液：１×ＰＢＳ／０．０５％Tween 20（ＰＢＳ−Ｔ）
５）ブロッキング／希釈緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ中１％ＢＳＡ（ＰＢＳ−Ｔ−１％ＢＳＡ）
６）抗体希釈緩衝液：１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ
７）ヤギ−抗Ｈｕｍａｎ（Ｆａｂ特異的）ＨＲＰ抱合：Jackson、カタログ番号１０９−０３５−０９７
８）TMB Plus基質：KemEnTec、カタログ番号４３９０Ｌ
９）１ＭのＨ_２ＳＯ_４

【0338】

細胞ＥＬＩＳＡ：最大半量ＯＤ（ＥＤ５０）を生じるモル濃度として定義される相対的結合アフィニティーを、Ａ４３１−ＮＳ細胞に対する抗体滴定によって決定した。簡単に説明すると、１０，０００個のＡ４３１−ＮＳ細胞を、０．５％ＦＣＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭを含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩増殖させた。翌朝、コンフルエント細胞（約２０，０００個／ウェル）を、ＰＢＳで２回洗浄し、室温での１％パラホルムアルデヒド溶液との１５分間のインキュベーションにより固定し、続いて、ＰＢＳにより４回洗浄を行った。次に、試験するＥＧＦＲ抗体およびネガティブコントロール抗体Synagisを、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭにおいて系列希釈し、５０μｌの各希釈をウェルに添加し、次いで室温で１時間インキュベートし、その後、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。次いで、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭにおいて１：５０００に希釈した５０μｌの二次ヤギ−抗ヒト（Ｆａｂ特異的）ＨＲＰ抱合を添加し、次いで氷上で３０分間インキュベートした。最終的に、ウェルをＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルのTMB Plus基質を添加することによって、プレートを発色させ、次いで５〜１５〜３０分ごとに６２０ｎｍで読み取った。基質とのインキュベーション後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。二次試薬とのみ結合する平均のバックグランドを差し引き、続いて、試験した各抗体に対して最大結合％をプロットすることにより結合曲線を標準化することによって、ＥＤ５０値として表される機能的アフィニティーを計算した。

【0339】

試薬、細胞ＥＬＩＳＡ：
１）ＤＭＥＭ培地：Gibco、カタログ番号４１９６６−０２９
２）ＦＣＳ：Gibco、カタログ番号１００９９−１４１
３）Pen strep (P/S)：Gibco、カタログ番号１５１４０−１２２
４）ＥＬＩＳＡプレート：Costar、カタログ番号３５９５
５）洗浄緩衝液（ＰＢＳ）：Gibcoカタログ番号２００１２−０１９
６）抗体希釈緩衝液：１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ
７）細胞固定化溶液：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３４０１８１
８）ヤギ−抗ヒト（Ｆａｂ特異的）ＨＲＰ抱合：Jackson、カタログ番号１０９−０３５−０９７
９）TMB Plus基質：KemEnTec、カタログ番号４３９０Ｌ
１０）１ＭのＨ_２ＳＯ_４

【0340】

Ａ４３１−ＮＳ細胞に対して発現されたＥＧＦ受容体および同じ細胞から精製された受容体に対する抗原提示における差異を、同じ二次抗体試薬およびインキュベーション時間を用いる同時ＥＬＩＳＡ結合研究で決定した。結果を図３１に示す。実験は、同じ濃度のＦａｂ１０３０の結合と比較した場合、Ｆａｂ抗体９９２および１０２４がＥＬＩＳＡウェルに対して被覆された精製された全長ＥＧＦＲに弱く結合したことを明らかに示した。しかし、３つのすべてのＦａｂが強い結合活性を示したＡ４３１−ＮＳ細胞に対して、抗体を試験した場合、９９２および１０２４のこの弱い結合活性が回復した。異なる２つのＥＬＩＳＡの比較は、ＥＬＩＳＡウェルにおいて精製された抗原に対して示されるコンホメーションとは対照的に、細胞表面において発現される元々のＥＧＦＲコンホメーションへの結合に対するＦａｂ９９２および１０２４の選好性が明確に示した。結果はまた、組み換え可溶性および固定化ＥＧＦＲ ＥＣＤに対する表面プラズモン共鳴によって測定される９９２の見かけ上弱いアフィニティーが、試験した系における９９２抗体エピトープの不都合な提示によるものであることを示唆した。

【0341】

Ａ４３１−ＮＳ細胞に対する機能的アフィニティーの格付け。
上記のように実施した細胞ＥＬＩＳＡを使用して、ＥＤ５０値として表される最大半量ＯＤ値の計算によって、９９２、１０２４、１０３０、VectibixならびにErbituxのＩｇＧおよびＦａｂフラグメントの機能的アフィニティーを格付けた。この分析の結果を図３２に示し、そして計算したＥＤ５０値を以下の表１０に示す。

【0342】

【表16】

表１０：ＩｇＧのアビディティー効果またはＦａｂの一価のアフィニティーに基づくＥＤ５０値として表される機能的アフィニティーの格付け。ＥＤ５０値を、Ａ４３１−ＮＳ細胞に対する系列抗体滴定によって決定した。ＳＤ：適合曲線の標準偏差。

【0343】

実験は、アビディティー効果を考慮した場合、ＩｇＧ９９２および１０２４はErbituxおよびVectibixの両方より高いアビディティーでＡ４３１−ＮＳ細胞に結合するようであった一方、ＩｇＧ１０３０が試験したＩｇＧ抗体のうち最も低いアフィニティーを有したことを明確に示す。しかし、細胞に対する一価のアフィニティーを、Ｆａｂフラグメントを使用して決定した場合、９９２は、約１０ｎＭの最も低いアフィニティーを有した。それにもかかわらず、この一価の機能的アフィニティーはなお、BIAcoreで試験したものより少なくとも１５倍低かった。

【0344】

実施例１６：抗体により誘導される結合性増強の試験。
本発明の抗体ペアに対して実施したBIAcore競合実験は、これらの抗体を両方の方向で相互に試験した場合、９９２および１０２４の結合は、それぞれ約５５％および５８％増強される（図９Ａ）ことを示した。この現象についてさらに調べるために、非固定細胞を使用する細胞ＥＬＩＳＡを設計して、非重複エピトープに結合する抗体のＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和時の１つの抗体クローンのＩｇＧ結合性の効果について調べた。

【0345】

細胞ＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡを、変更を伴った基本的に実施例１５に記載のとおりに実施した。細胞を非固定のままとし、抗体添加後も高次構造ＥＧＦＲの可撓性を可能にした。簡単に説明すると、１０，０００個のＡ４３１−ＮＳ細胞を、０．５％ＦＣＳおよび１％Ｐ／Ｓを添加したＤＭＥＭを含有する９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおいて、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩増殖させた。翌朝、コンフルエント細胞（約２０，０００／ウェル）をＰＢＳで２回洗浄し、次いで抗体により誘導される結合性増強について調べるためのウェルを、９９２、１０２４もしくは１０３０のいずれかの４０ｎＭの単一のＦａｂフラグメントの２５μｌ、または８０ｎＭの各単一のＦａｂの１２．５μｌと共に、飽和された結合を付与することが先に示された二重の組み合わせでプレインキュベーションした。１％ＢＳＡを含有する２５μｌのＤＭＥＭを、Ｆａｂフラグメントの添加を伴わないＩｇＧ抗体の試験に使用されるウェルに添加した。Ｆａｂおよび培地添加後、ＥＬＩＳＡウェルを、３０分間、室温でインキュベートし、その後、２５μｌの３６０ｎＭの濃度から開始する本発明のＩｇＧまたはSynagisネガティブコントロールの３倍系列希釈をウェルに添加し、氷上で１時間インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳで４回洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭにおいて１：５０００に希釈した５０μｌの二次モノクローナルマウス−抗ヒト（Ｆｃ特異的）ＨＲＰ抱合を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。最終的に、ウェルをＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルのTMB基質を添加することによりプレートを発色させ、５〜１５〜３０分ごとに６２０ｎｍで読み取った。基質とのインキュベーション後、１ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加によって、反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。二次試薬とのみ結合する平均のバックグランドを差し引き、続いて、試験した各抗体に対して最大結合％をプロットすることにより結合曲線を標準化することによって、ＥＤ５０値として表される機能的親和性を計算した。

【0346】

試薬、細胞ＥＬＩＳＡ：
１）ＤＭＥＭ培地：Gibco、カタログ番号４１９６６−０２９
２）ＦＣＳ：Gibco、カタログ番号１００９９−１４１
３）Pen strep (P/S)：Gibco、カタログ番号１５１４０−１２２
４）ＥＬＩＳＡプレート：Costar、カタログ番号３５９５
５）洗浄緩衝液（ＰＢＳ）：Gibcoカタログ番号２００１２−０１９
６）抗体希釈緩衝液：１％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ
７）マウス−抗ヒト（Ｆｃ特異的）ＨＲＰ抱合：Ab-direct、カタログ番号ＭＣＡ６４７Ｐ
８）TMB Plus基質：KemEnTec、カタログ番号４３９０Ｌ
９）１ＭのＨ_２ＳＯ_４

【0347】

抗体により誘導される結合性増強の検査を、同じ第２の抗体試薬およびインキュベーション時間を用いる同時ELISA結合研究によって、決定した。この研究の結果を図３３に示し、そして計算したＥＤ５０値を以下の表１１に示す。

【0348】

【表17】

表１１：列挙したＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和を伴うまたは伴わないＩｇＧのアビディティー効果に基づくＥＤ５０値として表される機能的アフィニティーの格付け。ＥＤ５０値を、Ａ４３１−ＮＳ細胞に対する系列抗体ＩｇＧ滴定によって決定した。ＳＤ：適合曲線の標準偏差。

【0349】

図３３および上記の表１１に示すように、ＩｇＧ９９２は、１０３０と共に、１０２４または１０３０または１０２４のいずれかのＦａｂフラグメントによる先の受容体飽和時の結合の明らかな増強を示した。Ｆａｂフラグメントとのインキュベーションは、ＩｇＧ９９２を単独で試験した場合、０．６ｎＭと比較して、それぞれ、０．５；０．４および０．５ｎＭのＥＤ５０値の減少を生じた。同様に、ＩｇＧ１０２４および１０３０もまた、Ｆａｂ９９２および１０２４のみで細胞を最初に飽和した場合、ＩｇＧの前にＦａｂ９９２および１０３０の両方を細胞に添加した場合、結合性の増加を示した。この結果は、同じ標的受容体上の非重複エピトープに対して１を超える抗体を有する有益性を明確に示した。

【0350】

実施例２と比較して、この実験では僅かに低い機能的アフィニティーを調べた。この結果は、おそらく、異なる第２の試薬を本実施例において使用したため、および試験したＩｇＧを非固定細胞と共にインキュベートして内在化を回避したためである。

【0351】

実施例１６Ｂ．全長カニクイザルＥＧＦＲのクローニング。
シグナルペプチドを含む全長カニクイザルＥＧＦＲを、ネステッドＰＣＲ、および全長ヒトＥＧＦＲの公開された配列（GENBANK X00588, Ullrich,A. et. al. Nature 309(5967),418-425 (1984)）に由来する配列特異的プライマーを使用することによって表皮から単離したカニクイザルｃＤＮＡからクローニングした。

【0352】

ＰＣＲ試薬：
正常な皮膚表皮から単離されたカニクイザルｃＤＮＡ：
CytoMol Unimed、カタログ番号：ｃｃｙ３４２１８、ロット番号：Ａ７１１０５４。
FastStart反応緩衝液（１０×）：Roche、カタログ番号：０３５５３３６１００１
FastStart酵素：Roche、Roche、カタログ番号：０３５５３３６１００１
Phusion酵素：Finnzymes、Ｆ−５３０Ｓ（２Ｕ／μＬ）。
ｄＮＴＰ ２５ｍＭ：Ｂｉｏｌｉｎｅ、カタログ番号：ＢＩＯ−３９０２９
シグナル配列を含む全長カニクイザルＥＧＦＲの増幅のためのプライマー：
５’ＡＴＧプライマー：５’−ＴＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣ−３’（配列番号１３５）
３’ＳＴＯＰプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１３９）

【0353】

ＰＣＲ条件：
９５℃／２分間、４０サイクル：９５℃／３０秒間、５５℃／３０秒間、７２℃／３分間、７２℃で５分間の最終インキュベーションを伴う３０秒間。

【0354】

全長カニクイザルＥＧＦＲを増幅し、そしてＮｏｔおよびＸｈｏ制限部位を組み入れるネステッドＰＣＲのためのプライマー：
Ｅ５７９ Ｃｙｎ Ｎｏｔ５’ ５’−ＧＧＡＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣＣＧＧＧＡＣＧＧ−３（配列番号１４０）
Ｅ５８０ Ｃｙｎ Ｘｈｏ５’ ５’−ＧＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＴＧＣ−３（配列番号１４１）

【0355】

ＰＣＲ条件：
９５℃／２分間、次いで、３０サイクル：９５℃／３０秒間の融解、５５℃／３０秒間のアニーリング、７２℃／３分間の伸長。３０サイクル後、ＰＣＲ産物をさらに１０分間伸長させた。

【0356】

ＰＣＲ反応を、最終濃度で１×FastStart緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび０．２μＭの各プライマーを伴う合計容積で５０μＬの反応緩衝液中０．５μｌテンプレートおよび０．１μｌのPhusion酵素、０．４μｌのFastStart酵素で実施した。

【0357】

約４０００ｂｐの見かけの長さを伴うＰＣＲフラグメントを入手し、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Invitrogen、パート番号４５０６−４１）を使用してクローニングし、配列決定した。クローニングしたカニクイザルＥＧＦＲのＤＮＡおよびタンパク質配列を図３４に示す。ヒトＥＧＦＲおよびカニクイザルＥＧＦＲタンパク質配列のアラインメントは、９９．２％の配列同一性を示した。

【0358】

ＦＡＣＳ分析による全長ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲ間の抗体交差反応性の決定

【0359】

全長ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲを、安定なトランスフェクションによってＣＨＯ細胞の表面上に発現させ、そしてＦＡＣＳ分析によって、系列希釈したＥＧＦＲ抗体のパネルへの結合について、細胞を試験した。すべての抗体希釈系列における一定数の細胞の細胞表面上において発現されたＥＧＦＲ抗原分子の数より少なくとも５倍多いモル過剰量の抗体を保持することによって、ＫＤ依存的条件下で、決定を行った。この設定は、試験したすべての抗体濃度について、完全な受容体飽和における抗体結合性のＦＡＣＳ分析を可能にした。

【0360】

簡単に説明すると、定量的ＦＡＣＳ分析を、BD FACSアレイBioanalyzer System上で実施して、ヒトまたはカニクイザル全長ＥＧＦＲのいずれかでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の表面上に発現されたＥＧＦＲ分子の数を決定した。細胞上のＰＥ標識ErbituxＩｇＧを滴定し、次いで既知のＰＥ密度を伴うRainbow calibration particlesから作成した標準曲線との比較によって、等価なＰＥの分子数を決定することによって、分析を実施した。定量分析は、ＥＧＦＲでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が、各細胞の表面上に約３５０，０００分子を示すことを表した。次に、１０，０００個のＥＧＦＲトランスフェクトしたＣＨＯ細胞と共に、漸増体積においてインキュベートし、各決定において、表面に示されるＥＧＦＲ抗原を超える少なくとも５倍モル過剰の抗体を可能にすることによって、５ｎＭから開始する本発明の抗体の５倍系列希釈を比較した。抗体を、シェーカー上で細胞と共に１４時間インキュベートして、試験したすべての抗体濃度において、完全な抗原飽和を促進する一方、ＦＡＣＳ緩衝液に０．０２％ＮａＮ_３を添加し、次いで温度を４℃に保持して受容体内在化を防止した。インキュベーション後、細胞を、４℃で５分間の１２００ＲＰＭでペレット化して、次いで２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。次に、細胞を、１：５００に希釈した二次ヤギＦ（ａｂ’）_２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ ＰＥで染色し、シェーカー上において４℃で３０分間インキュベートした。最終的に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで均質な前方／側方散乱特性を示すＥＧＦＲ発現ＣＨＯ細胞に対するゲーティングを伴うBD FACSアレイBioanalyzer System上で分析した。

【0361】

ＦＡＣＳ試薬：
Rainbow calibration particles： BD、カタログ番号：５５９１２３
ＦＡＣＳ緩衝液：１×ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ＋０．０２％ＮａＮ３
ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ ＰＥ： Jackson ImmunoResearch、カタログ番号１０９−１１６−１７０

【0362】

記載のＦＡＣＳ結合アッセイを、ＥＧＦＲ抗体ＩｇＧ９９２および１０２４の交差反応性の決定に使用し、カニクイザルＥＧＦＲと交差反応しなかったコントロール抗体ＩｇＧ１３２０と比較した。以下の図４０に示すように、記載のＦＡＣＳアッセイは、ヒトおよびカニクイザル全長ＥＧＦＲの間に良好な交差反応性を示す抗体（図４０Ａ、ＩｇＧ９９２および図４０Ｂ、ＩｇＧ１０２４）、および全長ヒトＥＧＦＲのみを認識する種特異的抗体（図４０Ｃ、ＩｇＧ１３２０）を識別するのにきわめて良好であった。この分析は、ＩｇＧ９９２および１０２４の両方ともが、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の表面上に発現されるヒトおよびカニクイザル全長ＥＧＦＲの両方に対して極めて優れた交差反応性を示したことを結論付けた。カニクイザルおよびヒトＥＧＦＲの間の結合性の差異は、高い程度の配列類似性から考慮して驚くべきことであり、前臨床毒物学研究に使用される動物において正確な標的配列に結合するために試験する抗体の重要性を強調する。

【0363】

実施例１７．９９２、１０２４および１０３０に相同なクローン
免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡおよび細胞に基づくアッセイ）に基づくＥＧＦＲ−結合性抗体−クローンのスクリーニングは、先の実施例に記載のように、クローン９９２、１０２４、１０３０の同定をもたらした。９９２、１０２４、１０３０に相同なＥＧＦＲ特異的クローンもまた同定された（表１２）。

【0364】

同じクラスターに属するクローンは、同じ結合特異性を有することが予想されるが、異なるアフィニティーで結合し得る。従って、クラスター内のクローンは、クローンの結合アフィニティーにそれほど大きな違いがなければ、本発明の抗体組成物において相互に置き換えることができる。

【表18】

【表19】

【0365】

実施例１８：抗体９２２および１０２４のヒト化
すべての抗体は、ヒト抗抗体応答を誘発する能力を含有する。応答は、用いられる治療用抗体の「ヒトらしさ」の程度とある程度まで相関する。免疫原性、それによるヒト抗抗体を予測することは不可能であるが、臨床用途のために、高い程度のヒトらしさを伴う抗体を選好する傾向が存在する。本発明に記載の抗体のヒトらしさは、ヒト化プロセスによって、増加させることができる［Reichert JM. Monoclonal antibodies in the clinic. Nature Biotechnol, 2001;19:819-822；Reichert JM, Rosensweig CJ, Faden LB and Dewitz MC. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnol, 2005;23:1073-1078］。

【0366】

マウスｍＡｂのヒト化は、原則として、一般にＣＤＲグラフティングと称される手順によって、緊密に関連する配列を伴うＩＧＨＶおよびＩＧＫＶドメインのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）上に相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフト化することによって、達成される（Jones PT, Dear PH, Foote J, Neuberger MS and Winter G. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature, 1986;321:522-525）。しかし、超可変領域のみの単純なＣＤＲグラフティングは、いくつかのフレームワークアミノ酸または領域が抗原への接触に必須になるか、または抗原結合性ＣＤＲループのコンホメーションを支持するため、アフィニティーの減少を生じ得る［Queen C, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP and Waldmann TA. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989;86:10029-10033；Al-Lazikani B, Lesk AM and Chothia C. Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol, 1997;273:927-948］。結果的に、抗体のヒト化は、マウス由来可変領域のＣＤＲループを、密接に相同なヒトフレームワーク上へグラフト化すること、また同時に、抗原結合活性に対する立証された影響を伴う重要なマウスフレームワーク残基を保持することの両方に関与すべきである（Winter, G. and W. J. Harris. "Humanized antibodies." Immunol.Today 14.6 (1993): 243-46）。いくつかの方法が開発され、抗体アフィニティーと機能を保持しつつのヒト化への応用を達成することに成功している（Almagro, J. C. and J. Fransson. "Humanization of antibodies." Front Biosci. 13 (2008): 1619-33においてレビューされた）。ヒト化は、合理的な方法、例えば、ＣＤＲグラフティング、リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）、超ヒト化、ヒトのストリング・コンテント（ｓｔｒｉｎｇ ｃｏｎｔｅｎｔ）最適化により達成することができ、これらは全て、少数のヒト化抗体候補の構築によるものである。候補のアミノ酸配列は、抗体構造の洞察および予測、ならびに直接的および間接的の両方で抗原相互作用領域の全体的構造を安定化することを介する抗原結合性への個々のアミノ酸の寄与に基づく。各抗体はいくつかの予想されない個々の制限を有するため、通常、候補は精査されなければならず、いくつかのアミノ酸は元々のマウス残基に復帰変異される。方法に共通することは、いくらかの連続する回数の設計、試験および再設計が、アフィニティーおよび機能を保持するのに必要であり得ることである。代替的には、より経験的な方法であって、ここで、大きなコンビナトリアルライブラリーが作製され、所望の特徴を伴う抗体が、酵母もしくはファージディスプレイのような方法、または代替的スクリーニング方法による選択によって、変種のプールから富化されることである。

【0367】

本発明に記載の抗ＥＧＦＲ抗体は、ヒトＶ領域へのＣＤＲグラフティングによって、ヒト化してもよい。好適なシナリオでは、ヒトＶ領域は、元々のマウスＶ領域に対する相同性に基づいて選択される。低免疫原性のような他の所望の特徴を伴うヒトＶ遺伝子領域もまた、使用され得る。本実施例は、９９２および１０２４抗ＥＧＦＲキメラ抗体のヒト化に使用される方法について説明する。図４１Ａに示されるヒト化配列は、ＩＭＧＴにより定義されたＣＤＲ領域を、９９２ＩＧＨＶからＩＧＨＶ１−４６／ＩＧＨＪ４へ、および９９２ＩＧＫＶからＩＧＫＶ１−２７／ＩＧＫＪ１−０１へグラフト化することによって、作製されている。図４１Ｂに示されるアミノ酸配列は、ＩＭＧＴにより定義されたＣＤＲ領域を、１０２４ＩＧＨＶからＩＧＨＶ１−２^＊０２／ＩＧＨＪ６^＊０２へ、および１０２４ＩＧＫＶからＩＧＫＶ２−２８^＊０１／ＩＧＫＪ２^＊０１へグラフト化することによって、作製されている。特定されたヒト化抗体をコードする人工遺伝子を合成し、そして哺乳動物発現ベクターに挿入する。実施例３に記載のように、抗体を発現させ、精製し、活性について試験する。初期の試験後、ヒト化抗体の結合反応速度を、実施例１４に記載のように、表面プラズモン共鳴によって決定してもよい。同様に、細胞の表面上に発現されるｈＥＧＦＲへの結合を、実施例１５に記載のように決定することができる。

【0368】

ヒト化アミノ酸の結合活性が、元々の抗体について観察される活性より著しく低い場合、連続的な復帰変異スキームが、アフィニティーの再生に用いられ、Vernierゾーンに局在するヒト化フレームワーク残基、またはＣＤＲ領域である場合に構造を支持することが提唱される残基から開始される（Foote, J. and G. Winter. "Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops." J Mol.Biol. 224.2 (1992): 487-99；Padlan, E. A. "Anatomy of the antibody molecule." Mol.Immunol 31.3 (1994): 169-217.）。これらの残基は、ＩＭＧＴ番号付けでは、９９２ＩＧＨＶアミノ酸番号１３、４５、および８０；９９２ＩＧＫＶアミノ酸２５、１０２４ＩＧＨＶアミノ酸１３、４５、８０および８２；１０２４ＩＧＫＬアミノ酸７８である。これらの変異は、一般的な分子生物学的な方法を用いるＰＣＲ介在の部位特異的変異誘発を使用することにより構築することができる。構築された変異は、上記のように試験される。これらの候補セットは、保持された抗原結合特性を伴うヒト化抗体を生じることが予想される。しかし、部位特異的変異誘発によってＣＤＲ領域へアミノ酸置換を導入することによるさらなる復帰変異またはアフィニティー変異を排除することはできない。

【0369】

実施例１９ 二重可変ドメイン抗体
二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体タンパク質を、６アミノ酸リンカー（ＡＳＴＫＧＰ）によってタンデムで９９２および１０２４のＩＧＨＶドメインを、ならびに５アミノ酸リンカー（ＴＶＡＡＰ）によって９９２および１０２４のＩＧＫＶドメインを融合することにより改変する［Wu C, Ying H, Grinnell C, Bryant S, Miller R, Clabbers A, Bose S, McCarthy D, Zhu RR, Santora L, vis-Taber R, Kunes Y, Fung E, Schwartz A, Sakorafas P, Gu J, Tarcsa E, Murtaza A and Ghayur T. Simultaneous targeting of multiple disease mediators by a dual-variable-domain immunoglobulin. Nature Biotechnol, 2007;25:1290-1297］。二重のＩＧＨＶおよびＩＧＫＶドメイン融合物は、後に、それぞれ、ＩＧＨＣおよびＩＧＫＣドメインが続く。１つの完全長ＤＶＤ抗体（９９２Ｌ１０２４）では、９９２ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶはＮ末端であり、後に、リンカーならびにそれぞれ、１０２４ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶが続く。第２の完全長ＤＶＤ抗体（１０２４Ｌ９９２）では、１０２４ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶはＮ末端であり、後に、リンカー、ならびにそれぞれ９９２ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶが続く。９９２および１０２４抗体をコードするプラスミドＤＮＡを、ＤＶＤをコードする遺伝子の２工程のＰＣＲ仲介構築のためのテンプレートとして使用する。ＩＧＨＶおよびＩＧＫＶの２つの可変ドメインをコードする領域を、リンカーをコードする領域（テンプレートおよびプライマーの組み合わせのため、表１３および表１４を参照のこと）の位置において重複伸長領域を含有するように、最初にそれらを別々に増幅する。ヒト軽鎖定常ドメインをコードする遺伝子（ＩＧＫＣ）がコーディング配列に含まれるように、Ｃ末端近くの可変ドメインをコードするＩＧＫＶ遺伝子を増幅する。二重可変ドメイン抗体のサブユニットのコーディング配列およびアミノ酸配列を付録３に示す。

【0370】

第１のＰＣＲを、各チューブ（５０μｌ反応）中で以下の混合物で調製し、所定の最終濃度を得る：１×FastStart緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、プライマー（各１０ｐｍｏｌ）（表１４を参照のこと）、FastStart High Fidelity Enzyme Blend（２．２Ｕ；Roche）および１００ｎｇプラスミドテンプレート（表１４を参照のこと）。ＰＣＲを、次のサーモサイクルに供する：９５℃で２分間、２０×（９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間）、７２℃で１０分間。第１のＰＣＲ反応からの正確なサイズを伴って得られたＰＣＲ産物（表１４を参照のこと）を、調製用アガロースゲル電気泳動によって精製し、次いで２つの可変ドメインが、重複伸長ＰＣＲによってスプライスされる第２の工程において使用する。第２のＰＣＲは、重複伸長ＰＣＲによりＤＮＡフラグメントのスプライシングし、各チューブ（５０μｌ反応）中の以下の混合物によって調製して、所定の最終濃度を得る：１×FastStart緩衝液（Roche）、ｄＮＴＰ混合物（各２００μＭ）、プライマー（各１０ｐｍｏｌ、表１５を参照のこと）、FastStart High Fidelity Enzyme Blend（２．２Ｕ；Roche）およびテンプレート（１００ｎｇＰＣＲフラグメント、表１５を参照のこと）。ＰＣＲを、上記で定めたサーモサイクルに供する。第２のＰＣＲ工程から得られた産物を、調製用アガロースゲル電気泳動によって精製し、制限酵素、二重ＩＧＨＶに対しＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ、ならびに（ＩＧＫＣが含まれる）二重ＩＧＫＶに対しＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで処理する。フラグメントを、一般的な制限酵素消化およびライゲーション手順により、連続して哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター００−ＶＰ−００２に連結する（図４）。得られた発現プラスミドベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で増幅し、次いでプラスミド調製物を一般的な方法によって精製する。ＤＶＤ抗体を、実施例２におけるように、発現させ、精製し、次いで実施例３−１３におけるように、活性について特徴付けを行う。

【0371】

得られた抗体が標的ｈＥＧＦｒに対する結合が減少する、または全く認められない場合、他のリンカーを試験することができる。

【0372】

表１３ ９９２および１０２４からＤＶＤ抗体を構築するためのプライマー

【表20】

【0373】

表１４ ９９２および１０２４由来のＤＶＤをコードする遺伝子を構築するための第１の
ＰＣＲ工程のためのプライマーおよびテンプレートの組み合わせ

【表21】

^＊増幅されたコーディング配列は、ＩＧＫＣ−遺伝子を含む。

【0374】

表１５ ９９２および１０２４由来のＤＶＤをコードする遺伝子を構築するための第２のＰＣＲ工程、重複伸長によるスプライシングのためのプライマーおよびテンプレートの組み合わせ

【表22】

【0375】

実施例２０：カニクイザルにおけるErbituxとの組み合わせにおける６週間の静脈内投与毒性研究
研究の目的：研究の目的は、１週間に１回、６週間のカニクイザルへの静脈内投与後の試験物品、９９２＋１０２４の毒性を決定することであった。

【0376】

毒性は、ErbituxおよびVectibixのようなＥＧＦＲインヒビターによる臨床実施において用量を制限する因子であるため、臨床関連用量における９９２＋１０２４の忍容性を評価することが、早期段階において重要であると思われた。これは、９９２＋１０２４が、他のＥＧＦＲ標的産物とは異なる機構によって作用すると思われるという事実によって、強調される。これは、潜在的に、新たな有害作用、または他のＥＧＦＲインヒビターで認められる効果の悪化をもたらし得る。

【0377】

これらの雌性カニクイザルのグループを、１週間に１度、ＩＶ用量の４／２．７および１２／８ｍｇ／ｋｇの９９２＋１０２４、ならびに１２／８ｍｇ／ｋｇのErbituxで６週間処置した。負荷量である第１の用量の４および１２ｍｇ／ｋｇ、ならびに維持用量である２．７および８ｍｇ／ｋｇを５回投与した。１２／８ｍｇ／ｋｇの用量は、臨床実施において投与されるErbituxのヒト臨床用量と同等である。

【0378】

実験設計

【表23】

♯第１の用量レベルは負荷量であり、第２の用量レベルは、８日目以降の投与である。

【0379】

研究中、以下のパラメータを追跡した：死亡率、臨床徴候、体重、食物摂取、血液学、臨床化学、臓器の重量、顕微鏡所見。

【0380】

結果
死亡率：研究経過中、予定されていない死亡は存在しなかった。

【0381】

臨床徴候：有害な臨床的観察に関連する処置はなかった。

【0382】

体重：体重における９９２＋１０２４またはErbituxのいずれかによる処置の効果は存在しなかった。

【0383】

食物摂取：食物摂取における明確な効果は存在しなかった。

【0384】

血液学：９９２＋１０２４またはErbituxのいずれかの処置の効果を示唆するような血液学的パラメータの変化は存在しなかった。

【0385】

臨床化学：いずれかの試験物品による処置の効果を示唆する臨床化学的パラメータの変化は存在しなかった。

【0386】

４週目、４．２／２．７ｍｇ／ｋｇの９９２＋１０２４／日を投与した１匹の動物は、処置前の値と比較して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアラニンアミノトランスフェラーゼレベルの増加を示した。これらのレベルは、６週目までに正常な範囲に回復した。他の処置動物においては同様の効果が認められなかったため、肝臓酵素におけるこの増加の毒性学的有意性は不明である。

【0387】

臓器の重量：処置およびコントロール動物間の臓器の重量において、毒性学的有意差は認められなかった。

【0388】

顕微鏡所見：９９２＋１０２４またはErbituxの効果を示唆するような剖検で特筆されるべき一致する観察は存在しなかった。

【0389】

予備的結論：予備データは、９９２＋１０２４が、試験した用量で良好に忍容性であり、治療に関連する有害作用が観察されなかったことを示す。

【0390】

実施例２１．肺細胞癌系統の増殖阻害
肺癌細胞系統は、チロシンキナーゼドメインの変異を伴うＥＧＦＲを発現することが公知である（Steiner et al. Clin Cancer Res 13.5 (2007): 1540-51）。実施例６において使用した方法と同様な方法により、２つの抗体９９２および１０２４の組み合わせが異なるＥＧＦＲ変異を有する肺癌細胞系統ＨＣＣ８２７およびＨ１９７５を阻害する能力について調べた。

【0391】

結果
表１６および表１７に認められ得るように、９９２および１０２４の組み合わせは、両方の細胞系統の増殖を阻害することができる。組み合わせは、モノクローナル抗体９９２および１０２４ならびにVectibixより優れている。

【0392】

表１６ ＨＣＣ８２７細胞系統に対する表示抗体のＩＣ５０値および最大増殖阻害

【表24】

【0393】

表１７ Ｈ１９７５細胞系統に対する表示抗体のＩＣ５０値および最大増殖阻害

【表25】

【0394】

【表26】

【0395】

【表27】

【0396】

【表28】

【0397】

【表29】

【0398】

【表30】

【0399】

【表31】

【0400】

【表32】

【0401】

【表33】

【0402】

【表34】

【0403】

【表35】

【0404】

【表36】

【0405】

【表37】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図34A-1】

【図34A-2】

【図34B】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40-1】

【図40-2】

【図40-3】

【図41A】

【図41B】

【図42-1】

【図42-2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]