特許 5726432 マイコプラズマ・ニューモニエ抗原測定の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726432

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年6月3日

(54)【発明の名称】マイコプラズマ・ニューモニエ抗原測定の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20150514BHJP

   C07K 16/14 20060101ALI20150514BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20150514BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 F

   C07K16/14

   C12N15/00 C

【請求項の数】5

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2010-92341(P2010-92341)

(22)【出願日】2010年4月13日

(65)【公開番号】特開2011-220931(P2011-220931A)

(43)【公開日】2011年11月4日

【審査請求日】2013年3月11日

【微生物の受託番号】FERM  P-21944

【微生物の受託番号】FERM  P-21945

(73)【特許権者】

【識別番号】390037327

【氏名又は名称】積水メディカル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100068700

【弁理士】

【氏名又は名称】有賀 三幸

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】小林 幸司

(72)【発明者】

【氏名】森田 元喜

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６３−０００２９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−１９２２２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００９−２３６６８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０１−２５７２６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第９２／００１８０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開昭４８−０１３５２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５０３２０３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

Ｃ０７Ｋ １６／１４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動するとき、分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体とし、前記分画を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、分離される７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体を不溶性メンブレン固定化抗体とすることを特徴とするサンドイッチイムノクロマト法による、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。

【請求項2】

前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であり、前記７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である請求項１記載のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。

【請求項3】

マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動するとき、分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体とし、前記分画を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、分離される７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体を不溶性メンブレン固定化抗体とする、マイコプラズマ・ニューモニエ検出用サンドイッチイムノクロマト測定試薬。

【請求項4】

前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であり、前記７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である請求項３記載のイムノクロマト測定試薬。

【請求項5】

ＦＥＲＭ Ｐ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生するモノクローナル抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエに対するモノクローナル抗体及びそれを用いたサンドイッチイムノクロマト測定試薬に関する。

【背景技術】

【0002】

感染性肺炎には、主にウイルス性、マイコプラズマ性、及び細菌性の３つのタイプがあり、それぞれ治療法（薬剤の選択など）が異なるため、マイコプラズマ性肺炎を感染初期に診断することは大変重要である。マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、マイコプラズマ性肺炎の主な起因菌である。既存のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原検査には、培養法、蛍光抗体法及びＰＣＲ法がある。しかし、何れの方法も熟練した技術が必要であり、検査に時間がかかる。そのため、簡単な操作で、短時間に検査可能なマイコプラズマ・ニューモニエ抗原検査法とその試薬の開発が求められている。

【0003】

マイコプラズマ・ニューモニエに対するモノクローナル抗体については、これまで多くの報告がある。例えば、マイコプラズマ・ニューモニエの赤血球への結合阻害活性を有するＰ１蛋白質（接着蛋白質：ａｄｈｅｓｉｎ又は１６８ＫＤ蛋白質）に対するモノクローナル抗体が報告されている（非特許文献１）。また、特許文献１には、約４３ＫＤのマイコプラズマ・ニューモニエの膜抗原蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法をベースとする免疫検出法が記載されている。しかしながら、この方法では結果が判るまでに少なくとも５時間以上かかるという問題点があった。また、特許文献２には、分子量約１３ＫＤの蛋白質、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体が報告され、マイコプラズマ・ニューモニエを含む種々の微生物感染症の診断に利用できることが開示されている。

【0004】

近年、特に感染症の分野においては、インフルエンザ感染に代表されるように、患者を診察している間に感染の有無がわかる診断薬に対するニーズが大きくなっている。このような、Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＰＯＣＴ）が可能な検査薬の代表例は、イムノクロマト法を原理とする試薬である。しかしながら、これまで、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原を検出できるイムノクロマト試薬は実用化されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開昭６３−２９８号公報

【特許文献2】再公表特許ＷＯ００／０６６０３号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】：Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１３６，４７１−６（１９９０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、迅速かつ正確にマイコプラズマ・ニューモニエ抗原を検出可能な、サンドイッチ法を原理とするマイコプラズマ・ニューモニエ抗原検出イムノクロマト試薬を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

そこで本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究した結果、マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法で捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画中のタンパク質を免疫原として得られるモノクローナル抗体のうち、当該免疫原を電気泳動により分離される一定のタンパクバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体及び不溶性メンブレン固定化抗体とするか、これを標識体固定化抗体とし、他のタンパクバンドと反応するモノクローナル抗体を不溶性メンブレン固定化抗体とすれば、サンドイッチイムノクロマトにより、迅速かつ正確にマイコプラズマ・ニューモニエ抗体を検出できることを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画中のタンパク質を免疫原として得られるモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体及び不溶性メンブレン固定化抗体とすることを特徴とするサンドイッチイムノクロマト法によるマイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。
（２）モノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である（１）記載のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。
（３）マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画中のタンパク質を免疫原として得られるモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体及び不溶性メンブレン固定化抗体とするマイコプラズマ・ニューモニエ抗原検出用サンドイッチイムノクロマト測定試薬。
（４）モノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である（３）記載のイムノクロマト測定試薬。
（５）ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生するモノクローナル抗体。
（６）マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ電気泳動するとき、分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体とし、前記抗原を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体であって、前記抗原を２−メルカプトエタノール存在下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、分離される７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体を不溶性メンブレン固定化抗体とすることを特徴とするサンドイッチイムノクロマト法による、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。
（７）前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であり、前記７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である（６）記載のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法。
（８）マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心法にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画を免疫原として得られるマウスモノクローナル抗体であって、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ電気泳動するとき、分離される４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を標識体固定化抗体とし、前記抗原を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体であって、前記抗原を２−メルカプトエタノール存在下ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、分離される７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体を不溶性メンブレン固定化抗体とする、マイコプラズマ・ニューモニエ検出用サンドイッチイムノクロマト測定試薬。
（９）前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマ８４２０９が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であり、前記４５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生する抗体、又は当該抗体と同一の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体である（８）記載のイムノクロマト測定試薬。
（１０）ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマ８４２１３が産生するモノクローナル抗体。

【発明の効果】

【0010】

本発明のマイコプラズマ・ニューモニエに対する１種類のモノクローナル抗体又は２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチイムノクロマト測定試薬を用いることによって、簡単な操作で、短時間にマイコプラズマ抗原検査が可能になる。そして、肺炎患者がマイコプラズマ性肺炎であるかを判別することによって、的確な治療法（薬剤の選択など）が選択できるようになり大変有用である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】マイコプラズマ・ニューモニエ抗原のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動像を示す図である。

【図2】モノクローナル抗体８４２０６固定化プレートでのサンドイッチＥＬＩＳＡの検討結果を示す図である。

【図3】モノクローナル抗体８４２０７固定化プレートでのサンドイッチＥＬＩＳＡの検討結果を示す図である。

【図4】モノクローナル抗体８４２０９固定化プレートでのサンドイッチＥＬＩＳＡの検討結果を示す図である。

【図5】モノクローナル抗体８４２１２固定化プレートでのサンドイッチＥＬＩＳＡの検討結果を示す図である。

【図6】モノクローナル抗体８４２１３固定化プレートでのサンドイッチＥＬＩＳＡの検討結果を示す図である。

【図7】テストストリップの模式構成図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のサンドイッチイムノクロマト法に用いるモノクローナル抗体は、（１）マイコプラズマ・ニューモニエを超遠心にて捕集し、エーテル抽出分画を除去した水相分画中のタンパク質を抗原とするモノクローナル抗体であり、該抗原を免疫原として得られる。ここで、超遠心によるマイコプラズマ・ニューモニエの捕集は、例えばマイコプラズマ・ニューモニエ菌体を含有する培養液を１００００〜３００００ｇ×３０ｍｉｎの超遠心に付することにより行うことができる。捕集されたマイコプラズマ・ニューモニエ菌体を水に懸濁し、エーテル（ジエチルエーテル）抽出分画を除去した水相分画を得る。得られた水相分画からタンパク質を得るには、窒素ガスをバブリングし残留するエーテルを除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）に透析する等を行えばよい。

【0013】

上記の方法により得られたマイコプラズマ・ニューモニエ由来のタンパク質を免疫原としてモノクローナル抗体を得るには、一般的には、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照）に準じ、上記抗原で免疫した動物の脾臓細胞と同種のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを細胞融合して作製したハイブリドーマを利用するのが好ましい。

【0014】

（免疫）
動物の免疫は、一般的な手法に従って行うが、一例を挙げると、上記抗原をリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物の皮下、皮内、腹腔などに投与することにより容易に行うことができる。免疫に用いる動物としては哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラットが好適である。必要に応じて、前記の溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンとして免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなど、汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やムラミルジペプチドのようなペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどは好適である。投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一次刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。

【0015】

（細胞融合）
細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３〜４日後に摘出した脾臓細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては、既に確立されている公知の各種細胞株が好ましく、例えばマウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ−Ａｇ４−１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４［Ｎａｔｕｒｅ ２７６：２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ．１［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１（１９７８）］等や、ラットにおけるＹ３−Ａｇ１．２．３．［Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１３１−１３３（１９７９）］、ＹＢ２／Ｏ（ＹＢ２／３ＨＬ／Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０）［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３Ｂ：１（１９８１）］等が挙げられる。
細胞融合には、通常用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合の手法は公知の方法を用いることができ、例えば上記の骨髄腫細胞と骨髄腫細胞に対して約１〜１０倍の免疫細胞との混合ペレットに、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコールを３０〜６０％の濃度で滴下し混合することによって達成できる。
上記の方法によって得られた免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブリドーマは、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）にて増殖するかどうかによって選択される。目的ハイブリドーマは、前記の中から、抗マイコプラズマ・ニューモニエモノクローナル抗体を産生しているかどうかについてスクリーニングされた後、限界希釈法によりクローニングされて、樹立される。

【0016】

（目的抗体の産生細胞）
上記目的の抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体を産生しているかどうかをスクリーニングする方法としては、公知のＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｂｉａｃｏｒｅ法等により行うことができる。例えば、培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化した上記抗原と反応させ、次に標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、上記抗原と高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
本発明に用いられるモノクローナル抗体は、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体としては、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４として寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（以下、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体ということがある）が好ましい。また、他の本発明に用いられるモノクローナル抗体は、前記免疫原を２−メルカプトエタノール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動したとき、７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体としては、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５として寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体（以下、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体ということがある）が好ましい。具体的には、培養上清中のモノクローナル抗体を実施例に詳述したＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により選択できる

【0017】

（本発明で使用するモノクローナル抗体）
このようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を作製することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。

【0018】

本発明の検出方法及び測定試薬においては、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体及びＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体だけでなく、これら２種類のモノクローナル抗体と同一の抗原決定基を認識する抗体であれば使用可能である。
本発明のＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体と同一の抗原決定基を認識する抗体及びＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体と同一の抗原決定基を認識する抗体とは、それぞれ、上記のＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｂｉａｃｏｒｅ法等による抗体スクリーニングテストにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体またはＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体に対する競合反応性を有するか否かで判定できる。それぞれの抗体と同一の抗原決定基を有する場合には、上記のスクリーニングテストにおいて、被験抗体を添加することによって、濃度依存性に反応量の低下が起こることから容易に判定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法を用いる場合には、西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（ＨＲＰ）で標識したＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体またはＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体と被験抗体とを同時にマイコプラズマ・ニューモニエ抗原を固定化したプレートに添加し、該抗原に結合していない分子を洗浄後、ＨＲＰの酵素活性を測定する方法などを挙げることができる。
本発明では、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体またはＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体及びこれらと同一の抗原決定基を有する抗体を用いる際、その分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものや、キメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）
₂、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記の抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。

【0019】

本発明のサンドイッチイムノクロマト法によるマイコプラズマ・ニューモニエ抗原の検出方法には、（１）標識体固定化抗体及び不溶性メンブレン固定化抗体の両方に、前記の４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を使用する方法［方法（１）］；及び（２）標識体固定化抗体として前記の４５ＫＤバンドと反応するモノクローナル抗体を使用し、不溶性メンブレン固定化抗体として前記の７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を使用する方法［方法（２）］がある。このうち、方法（１）のように、標識体固定化抗体及び不溶性メンブレン固定化抗体の両方に、前記の４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体を使用することによって、サンドイッチイムノクロマト測定系が成立することは、全く予想外であった。

【0020】

本発明のサンドイッチイムノクロマト測定試薬は、例えば基本的に図７に示すように、サンプルパッド、標識体固定化抗体を含むコンシンゲートパット、及び抗体固相化メンブレンにより構成される。以下、サンドイッチイムノクロマト法について説明する。

【0021】

（サンプルパッド）
本発明において、「サンプルパッド」とは、測定試料を受け入れる部位であり、パッドに成型された状態で液体の測定試料を吸収し、液体と測定対象の成分とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。サンプルパッドに適した材料の具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。該サンプルパッドは、後述するコンジュゲートパッドの機能を併せ持たせることも出来る。また、サンプルパッドには、抗体固定化不溶性メンブレンにおける非特異的反応（吸着）を防止・抑制する目的で、通常使用されるブロッキング剤等を含ませることができる。該ブロッキング剤としては、例えばＮＥＯ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＡＶＥＲ（東洋紡績株式会社）、イムノブロック^TM（大日本製薬株式会社）、Ａｐｐｌｉｅ Ｂｌｏｃｋ（生化学バイオビジネス株式会社）、ＳＥＡ ＢＬＯＣＫ^TM/ＥＩＡ/ＷＢ（Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社）、ＢＳＡ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡績株式会社）、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ^TM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ^TM(ＣＡＮＤＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 社)、ＨｅｔｅｒｏＢｌｏｃｋ(ＯＭＥＧＡ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社)、等から、反応系に影響のないものを適宜選択可能である。

【0022】

（標識体）
標識体としては、通常、イムノクロマト法における抗体の固定化担体として知られる公知の材料を用いることができる。例えば、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子などが好ましく、特に金コロイド粒子が好ましい。
金コロイド粒子の粒径はイムノクロマト試薬の感度に大きく影響することが知られているが、本発明における金コロイド粒子の粒径としては２０〜６０ｎｍが好ましく、特に４０ｎｍが好ましい。上記の金コロイドは一般に知られている方法、例えば、加熱したテトラクロロ金（III）酸水溶液にクエン酸三ナトリウム水溶液を滴下攪拌することによって製造することができる。
以下、金コロイド粒子を用いた場合について詳述する。

【0023】

（標識体への抗体の感作）
上記抗体の金コロイドへの固定化は、通常物理吸着によって行うが、この際、抗体濃度は１μｇ／ｍＬ〜５μｇ／ｍＬに調製されるのが好ましく、緩衝液及びｐＨは、２ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６−７）又は２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８−９）が好ましく、さらに好ましくは２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９）である。また、金コロイド上の抗体が結合していない領域は、ＢＳＡなどを結合させブロッキングするのが好適である。本明細書では、上記のような標識体に抗マイコプラズマ・ニューモニエモノクローナル抗体あるいはコントロール用抗体が固定化されたものを「コンジュゲート」という。このようにして作製された金コロイド標識抗体は、変性を阻止するための保存試薬中に分散され保存される。この変性阻止剤としては、ＢＳＡなどの蛋白質、グリセリン、糖などが用いられる。
本発明においては、当該標識体固定化抗体として前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体が用いられる。

【0024】

（検出試薬）
本発明において「検出試薬」とは、具体的には少なくともコンジュゲートを含有する試薬である。具体的には前記４５ＫＤのバンドと反応する抗マイコプラズマ・ニューモニエモノクローナル抗体が固定化された標識体を含有させて製されるものである。
検出試薬はコンジュゲートを安定な状態に保ち、測定試料と混合されたときに、コンジュゲートに固定化された抗体が抗原と特異的に反応するのを促進あるいは迅速かつ効果的に溶解、流動化する目的で、例えば１種類以上の安定化剤、溶解補助剤等を含み得る。該安定化剤、溶解補助剤等としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、スクロース、カゼイン、アミノ酸類などをあげることができる。また、検出試薬は、検出感度の向上を目的とし、必要に応じて2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等の公知の増感剤を含み得る。
尚、本明細書において、「検出」又は「測定」という用語は、検出対象物の存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。

【0025】

（コンジュゲートパッド）
本発明において、「コンジュゲートパッド」とは、抗原と特異的に反応するコンジュゲートを内在し、測定試料が該コンジュゲートパッドを通過する際、コンジュゲートと試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原とが複合体（凝集体）を形成する機能を有する部位をいう。該コンジュゲートパッドは、それ単独で抗体固定化メンブレンに接するように配置されていてもよいし、あるいは、前記サンプルパッドと接触して配置され、毛細管流によってサンプルパッドを通過した測定試料を受入れ、引き続き該測定試料を毛細管流によって前記サンプルパッドとは異なる面で接触する別のパッド（後述する３ｒｄ Ｐａｄ）へ移送するように配置してもよい。なお、サンプルパッド、コンジュゲートパッドの一種以上の部位の選択や、選択された部位を抗体固定化メンブレンにどのように配置するかは、適宜に変更可能である。
コンジュゲートパッドに適した材料としては、紙、セルロース混合物、ニトロセルロース、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、ガラス繊維又はレーヨンのような不織繊維が挙げられるが、これらに限定されない。好適には、グラスファイバー製パッドが用いられる。
後述の如く不溶性メンブレン担体に「コントロール捕捉試薬」を固定化する場合には、コンジュゲートパッドに、アッセイの信頼性を担保するための「コントロール試薬」、例えば、標識物質で標識された測定試料成分と反応しない抗体や標識物質で標識されたＫＬＨ（スカシ貝ヘモシアニン）などの高抗原性タンパク質などを含ませる。これらコントロール試薬は、測定試料中に存在する可能性が考えられない成分（物質）であり、後述する「コントロール捕捉試薬」と適切に対応するよう適宜に選択可能である。

【0026】

（３ｒｄ Ｐａｄ）
３ｒｄ Ｐａｄは、測定試料と検出試薬との反応成分のうち、マイコプラズマ・ニューモニエ抗原測定に不要な成分を除去し、必要な反応成分が抗体固定化不溶性メンブレンをスムーズに展開できるようにすることを目的として配置させることができる。例えば、全血又は全血を溶血させた試料を用いる場合には、血球や不溶性の血球破砕物などは、測定に不要な成分として除去することが望ましい。また、この３ｒｄ Ｐａｄには、抗原抗体反応により生成する凝集体のうち、抗体固定化不溶性メンブレンに移動し、スムーズに展開できない位に大きくなった凝集体をあらかじめ除去するという付加的な効果を併せ持たせることも可能である。３ｒｄ Ｐａｄとしては、液体と測定対象の成分とが通り抜けることができるどんな物質及び形態をも含む。具体例として、ガラス繊維（グラスファイバー）、アクリル繊維、親水性ポリエチレン材、乾燥紙、紙パルプ、織物等が含まれるが、これらに限定されない。好適には血球分離膜やそれに類する膜が用いられる。

【0027】

（抗体の不溶性メンブレン担体への固定化）
本発明においては、不溶性メンブレン担体に固定化される抗体が、方法（１）においては前記４５ＫＤのバンドと反応するモノクローナル抗体であり、方法（２）においては前記７５ＫＤ、５５ＫＤ及び４２ＫＤの何れのバンドとも反応するモノクローナル抗体である。
本発明のイムノクロマト試薬における抗体の不溶性メンブレン担体への固定化は、一般に周知の方法で実施することができる。例えば、フロースルー式の場合は、上記の抗体を所定の濃度に調製し、その液を一定量、点あるいは＋など特定のシンボル状に、不溶性メンブレン担体に塗布する。ラテラルフロー式の場合には、上記の抗体を所定の濃度に調製し、その液をノズルから一定の速度で吐出しながら水平方向に移動させることのできる機構を有する装置などを用いて、ライン状に不溶性メンブレン担体に塗布することにより行われる。この際、抗体の濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬがさらに好適である。また、抗体の不溶性メンブレン担体への固定化量は、フロースルー式の場合には不溶性メンブレン担体に滴下する塗付量を調節することによって最適化でき、ラテラルフロー式の場合には上記の装置のノズルからの吐出速度を調節することによって最適化できる。特に、ラテラルフロー式の場合、０．５μＬ〜２μＬ／ｃｍが好適である。なお、本発明において、「フロースルー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定対象の試料液を不溶性メンブレン担体に対して垂直に通過するように展開する方式を指し、「ラテラルフロー式メンブレンアッセイ」という場合は、測定対象の試料液が不溶性メンブレン担体に対して平行方向に移動するように展開する方式を指す。
また、上記の抗体は、通常所定の緩衝液を用いて調製することができる。その緩衝液の種類としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液など通常使用される緩衝液をあげることができる。緩衝液のｐＨは６．０〜９．５の範囲が好ましく、６．５〜８．５がより好ましく、７．０〜８．０がさらに好ましい。緩衝液には、さらにＮａＣｌなどの塩類、スクロースなどの安定剤や保存剤、プロクリンなどの防腐剤等を含んでもよい。塩類はＮａＣｌなどのようにイオン強度の調整のために含ませるもののほか、水酸化ナトリウムなど緩衝液のｐＨを調整する工程で存在するようになるものも含まれる。
不溶性メンブレン担体に抗体を固定化した後、さらに、通常使用されるブロッキング剤を溶液あるいは蒸気状にして該担体の抗体固定化部位以外を被覆し、ブロッキングを行うこともできる。
本明細書では、上記のように抗体が固定化された不溶性メンブレン担体を「抗体固定化メンブレン」ということがある。
なお、不溶性メンブレン担体には、「コントロール捕捉試薬」を固定化することができる。該コントロール捕捉試薬は、アッセイの信頼性を担保するための試薬であって、コンジュゲートパッドに含ませた対応する「コントロール試薬」を捕捉するものである。例えば、コンジュゲートパッドに標識されたＫＬＨをコントロール試薬として含む場合には、抗ＫＬＨ抗体などがコントロール捕捉試薬に該当する。コントロール捕捉試薬をメンブレンに固定化する位置は、アッセイ系の設計に適合するよう適宜選択することができる。

【0028】

（不溶性メンブレン担体）
本発明において、不溶性メンブレン担体（以下、単にメンブレンと記載することがある）としては、任意の材質ものが使用できる。例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン類、ガラス、セルロースやセルロース誘導体などの多糖類あるいはセラミックス等をメンブレン状にしたものが使用できる。具体的には、ミリポア社、東洋濾紙社、ワットマン社などより販売されているガラス繊維ろ紙やセルロースろ紙などをあげることができる。また、この不溶性メンブレン担体の孔径と構造を適宜選択することにより、コンジュゲートと検出対象物との免疫複合体が、該メンブレン担体中を流れる速度を制御することが可能である。メンブレン中を流れる速度の制御により、メンブレンに固定化された抗体（捕捉試薬）に結合するコンジュゲート量を調節することができるため、メンブレンの孔径と構造は、本発明のイムノクロマト試薬のほかの構成材料との組み合わせを考慮して最適化することが望ましい。本明細書において、「不溶性メンブレン担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。

【0029】

（吸収パッド）
本発明において、吸収パッドとは、不溶性メンブレン担体部を移動・通過した測定試料を吸収することにより、測定試料の展開を制御する液体吸収性を有する部位である。ラテラルフロー式においては、ストリップ構成の最下流に設ければよく、フロースルー式においては、例えば捕捉試薬を固定化した膜の下部に設ければよい。該吸収体としては、例えば、ろ紙を用いることができるが、これに限定されない。

【0030】

（ストリップ）
本発明において、「ストリップ」とは、抗体固定化不溶性メンブレンに、サンプルパッド、コンジュゲートパッド、吸収パッドの一以上が適宜に配置装着されたものをいう。該ストリップは、通常、プラスチック製粘着シートのような固相支持体上に配列させる。該固相支持体は、測定試料の毛管流を妨げない物質で構成されることはもとより、接着剤の成分が測定試料の毛管流を妨げない物質であることも同様である。なお、抗体固定化不溶性メンブレンの機械的強度を上げ且つアッセイ中の水分の蒸発（乾燥）を防ぐ目的でポリエステルフィルムなどをラミネートすることも可能である。該ストリップは、ストリップの大きさや、測定試料の添加方法・位置、捕捉試薬の固定化位置、シグナルの検出方法などを考慮した適当な容器（ハウジング）に格納・搭載して使用することができ、このように格納・搭載された状態を「デバイス」という。
また、本発明のマイコプラズマ・ニューモニエ測定用イムノクロマト試薬は、少なくとも、抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体固定化メンブレンおよび、抗マイコプラズマ・ニューモニエモノクローナル抗体が標識体に固定化されているコンジュゲートを含むものであればよく、測定条件、測定試料に応じて他の試薬や構成を含み得る。

【0031】

（測定試料）
本発明の方法における測定対象となる「試料」（「測定試料」とも言う）としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。具体的には、血液、血清、血漿、唾液、喀痰などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の測定対象は、測定試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ抗原である。本発明の方法又は測定試薬により、測定試料がマイコプラズマ・ニューモニエ抗原陽性であれば、当該測定試料を有する被験者がマイコプラズマ・ニューモニエに感染していると診断することができる。

【0032】

本発明のマイコプラズマ・ニューモニエ測定用イムノクロマト試薬の作製は実施例に記載の方法を適宜、修飾・改変して行うことができる。コンジュゲートに由来するシグナルを測定する方法としては、公知の方法に従って行えばよく、例えば、吸光度あるいは反射光の強度を測定すればよい。

【実施例】

【0033】

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

【0034】

〔参考実験例１〕使用したマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原による市販抗マイコプラズマ抗体検査薬（ＰＡ法）の阻害試験
ＴＲＩＮＡ ＢＩＯＲＥＡＣＴＩＶＥ ＡＧより入手したマイコプラズマ抗体陽性血漿４検体に対して、本発明で使用した後述のマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原を各々２０μｇ／ｍＬを添加し１０分間室温で反応させた。この混合液について、市販の抗マイコプラズマ抗体検査薬（セロディア−ＭＹＣＯ II、富士レビオ社製）にて反応性を評価した（表１）。

【0035】

その結果、本発明で使用したマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原は、陽性血漿中の抗マイコプラズマ抗体が市販の抗マイコプラズマ抗体検査薬の抗原と反応するのを完全に阻害し、該市販検査薬の抗原と同様の抗原性を有することが確認された。

【0036】

【表1】

【0037】

１．モノクローナル抗体の製造方法
１）免疫用抗原の調製方法
マイコプラズマ・ニューモニエ（以下、「Ｍ．Ｐ．」と略記することがある）抽出抗原（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社、＃３０−ＡＭ４０、１ｍｇ／ｍＬ）をコンプリートフロインドアジュバント（Ｇｉｂｃｏ社製）と１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製し、免疫用抗原とした。尚、該抽出抗原は、マイコプラズマ・ニューモニエ菌体を含有する培養液を１００００〜３００００ｇ×３０ｍｉｎの超遠心し、捕集されたマイコプラズマ・ニューモニエ菌体を水に懸濁し、エーテル（ジエチルエーテル）抽出分画を除去した水相分画中のタンパク質である。

【0038】

２）免疫及びハイブリドーマの作製方法
上記免疫用抗原を雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に注入した（１匹当たり５０〜１００μｇ）。この操作（免疫）を２週間毎に２回繰り返した。免疫開始５週間後、試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％−ＰＥＧ１４５０（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０⁶個／ｍＬになるようにＨＡＴ、１５％ウシ胎児血清及び１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて培養した。

【0039】

３）抗マイコプラズマ・ニューモニエに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング、クローニング及びモノクローナル抗体採取
細胞融合７〜１０日後に培養上清を用いて、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、抗原に対し高い反応性を示したｗｅｌｌを陽性ｗｅｌｌとして選別した。陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートを用いて継代した。
上記のスクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングし、所望のハイブリドーマを得た。次いで該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取するため、２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．４〜１．３×１０⁶個の量で腹腔内に投与した。投与後１週間目から１日おきに腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和後、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（以下、単にＰＢＳと表記する場合がある）で透析を行い、抗体を採取した。
また、クローニングされた各ハイブリドーマは１０％ＤＭＳＯ−ＦＣＳに約０．５−１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｖｉａｌになるように分注し、−８０℃に保存された。

【0040】

４）ハイブリドーマのスクリーニング：抗原固相化ＥＬＩＳＡ
４）−１ 抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で上記マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原を５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％プロクリン３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）（以下、ＰＢＳＴという）３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＵＬＴＲＡＢＬＯＣＫ（コスモバイオ社製，Ｎｏ．ＢＦＵ０３３Ｃ）を原液のまま上記の抗原固定化プレートの各ウェルに３００μＬずつ添加し、室温にて２時間静置した。次に、プレートを逆さまにしてブロッキング剤を廃棄した後、真空乾燥し、乾燥剤を入れヒートシーラーにてアルミ包装後冷蔵保存した。

【0041】

４）−２ 抗原固相化ＥＬＩＳＡ
（ｉ）抗原を固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより段階希釈した各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ（ＤＡＫＯ社製、Ｎｏ．Ｐ０４４７）をＢＳＡ−ＰＢＳＴにて５０００〜１００００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢ基質液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加した。室温にて１０〜３０分静置した後、１Ｎ硫酸を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加しＨＲＰ酵素反応を停止した。続いてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社製）にて４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度を測定した。
上記のスクリーニングの結果、抗原と反応性の高いクローンとして８株（＃８４２０６，＃８４２０７，＃８４２０８，＃８４２０９，＃８４２１０，＃８４２１１，＃８４２１２，＃８４２１３）を選択した。

【0042】

５）ハイブリドーマのスクリーニング：Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原（５μｇ／ｌａｎｅ）及び分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｌｌ Ｂｌｕｅ、５μＬ／ｌａｎｅ）を定法に従って、１．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動後、ドライ式ブロッティング装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後のＰＶＤＦ膜を１％ＢＳＡ、ＰＢＳＴに室温で３０分〜１時間浸漬し撹拌した。このブロッキング済み抗原転写ＰＶＤＦ膜を抗マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原陽性８クローンの５倍希釈培養上清又は精製抗体（１μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬ）に室温で３０分〜１時間浸漬し撹拌した。
次に、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ，ＰＢＳＴにて５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇヤギポリクローナル抗体に室温で３０分〜１時間浸漬し撹拌した。
次に、ＰＢＳＴにて３回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）５０ｍＬにＤＡＢタブレット１個と５％過酸化水素水５０μＬを添加した基質液に浸漬し、バンドが確認できたところで過剰の精製水で洗浄した。
上記８クローンについて、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇでそれぞれの抗体が反応したバンドを（表２）にまとめた。各抗体の反応性から下記の５つのグループに分類した。

【0043】

【表2】

【0044】

尚、参考のため、マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原（５μｇ／ｌａｎｅ）及びタンパク質分子量マーカー「第一」・II（第一化学薬品株式会社製、５μＬ／ｌａｎｅ）を定法に従って、１．３ｍＭ ２−メルカプトエタノール存在下、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（４−２０％）電気泳動した際の泳動像を図１に示した。マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原の各タンパクバンドの分子量（ＫＤ）は、常法に従い、前記分子量マーカーの各タンパクのバンドの移動度と分子量を基に算出した。尚、タンパク質分子量マーカー「第一」・IIは表３の６種のタンパク質より構成されたものである。

【0045】

【表3】

【0046】

６）ハイブリドーマ産生抗体のクラス及びサブクラス判定ＥＬＩＳＡ
上記４）−１で作製したマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原固定化プレートに上記５）で分類した５つのグループから代表的なクローン（＃８４２０６，＃８４２０７，＃８４２０９，＃８４２１２，＃８４２１３）の培養上清を希釈液（２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含むＰＢＳＴ）にて５倍希釈し、各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて３回洗浄した。
検体との反応後、マウスモノクローナル抗体Ｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔの各抗体を２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含む ＰＢＳＴにて１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて３回洗浄した。
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含むＰＢＳＴにて１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて３０分静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて洗浄した。
ＴＭＢ基質液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加した。室温にて１０〜３０分静置した後、１Ｎ硫酸を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加しＨＲＰ酵素反応をストップした。続いてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、５クローンの抗体のクラス及びサブクラスはそれぞれ＃８４２０６：ＩｇＧ１（κ），＃８４２０７：ＩｇＧ１（κ），＃８４２０９：ＩｇＧ１（κ），＃８４２１２：ＩｇＧ２ａ（κ），＃８４２１３：ＩｇＧ１（κ）であることが判明した。

【0047】

７）サンドイッチＥＬＩＳＡの実施方法
７）−１ 抗マイコプラズマ・ニューモニエモノクローナル抗体固定化プレートの作製
上記３）で得たＰｒｏｔｅｉｎ Ａ精製抗体（＃８４２０６，＃８４２０７，＃８４２０９，＃８４２１２，＃８４２１３）をＰＢＳにて１０μｇ／ｍＬになるように希釈し、５０μＬずつマイクロプレートの各ウェルに添加し、冷蔵にて一昼夜（約１６時間）静置した。５０％ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製、Ｎｏ．０３９５３−９５）を含むＰＢＳを前記プレートの各ウェルに３００μＬずつ添加し室温にて２時間静置した。次に、プレートを逆さまにしてブロッキング剤を廃棄した後、真空乾燥し、乾燥剤を入れヒートシーラーにてアルミ包装後冷蔵保存した。

【0048】

７）−２ サンドイッチＥＬＩＳＡ
マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原を２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含むＰＢＳＴにて１０μｇ／ｍＬから５倍ずつ段階希釈して各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて３回洗浄した。
ビオチン標識抗Ｍ．Ｐ．抗原モノクローナル抗体（クローン＃８４２０６，＃８４２０７，＃８４２０９，＃８４２１２，＃８４２１３）を２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含むＰＢＳＴにて１μｇ／ｍＬに希釈して各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて２時間静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて３回洗浄した。
ＨＲＰ標識ストレプトアビジンを２０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅを含むＰＢＳＴにて１０００倍に希釈し、各ウェルに５０μＬずつ添加した。室温にて３０分静置した後、ＰＢＳＴにてプレートウォッシャーを用いて３回洗浄した。
ＴＭＢ基質液を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加した。室温にて１０〜３０分静置した後、１Ｎ硫酸を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ添加しＨＲＰ酵素反応をストップした。続いてマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて４５０ｎｍ／６５０ｎｍの吸光度を測定した。
５クローン（＃８４２０６，＃８４２０７，＃８４２０９，＃８４２１２，＃８４２１３）の抗体を固定化したプレートを用い、５クローンのビオチン標識抗体とのサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系が成立するかどうかを検討したところ、図２〜図６に示すように、＃８４２０９と＃８４２１３の組合せのみサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系が成立した。

【0049】

８）サンドイッチイムノクロマト測定の実施方法
イムノクロマトデバイスの作製
ｉ）金コロイド標識抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体（コンジュゲート）の作製
本発明の２種類のマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原に対するモノクローナル抗体（クローン＃８４２０９，＃８４２１３）をそれぞれ８０μｇ／ｍＬ（ｐＨ９．０）に調製し、１ＯＤ／ｍＬの金コロイド（粒径５０ｎｍ）溶液２０ｍＬに対し、各１ｍＬ添加し室温で１０分間撹拌した。この混合液に１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を１．５ｍＬ添加し、さらに５分間撹拌後、１０℃にて、１０，０００ｒｐｍで４５分間遠心し、沈渣（コンジュゲート）を得た。得られたコンジュゲートに対し、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｒｉｐｐｓ社製）を１．２ｍＬ添加しコンジュゲートを懸濁させた。各コンジュゲートの吸光度を５３１ｎｍ（使用した金コロイドの最大吸収波長）で測定した（吸光度の測定は、以下の試験においても同様に行った）。

【0050】

ii）コンジュゲートパッドの作製
上記ｉ）で調製したコンジュゲートを、１５ＯＤ／ｍＬとなるように、カゼインバッファーと混合してコンジュゲート溶液を作製し、一定体積のグラスファイバー製パッド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＧＦＣＰ２０３０００）に該パッド体積の１．２倍容量含浸させた。ドライオーブン内で７０℃、３０分間加温することにより乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。

【0051】

iii）抗マイコプラズマ・ニューモニエ抗体固定化メンブレンの作製
マイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原に対するモノクローナル抗体（クローン８４２０９，８４２１３）及び抗マウスＩｇＧ抗体を２．５％スクロースを含む１０ｍＭＰＢＳにて１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＸＹＺ３０００（ＢＩＯＤＯＴ）を用いてメンブレン（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、ＵｎｉＳａｒｔ−ＣＮ１４０）に塗布した（１μＬ／ｃｍ）。塗布後、該メンブレンはドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、抗体固定化メンブレンとした。

【0052】

iv）サンプルパッドの作製
２４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％スクロース及び３０ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を、一定体積に切断したグラスファイバー製パッド（Ｌｙｄａｌｌ社）に該パッド体積の１．１５倍容量滲みこませた。ドライオーブン内で７０℃、４５分乾燥し、サンプルパッドとした。

【0053】

ｖ）テストストリップの作製
プラスチック製粘着シート（ａ）に上記のマイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．Ｐ．）抽出抗原に対するモノクローナル抗体を固定化したメンブレン（ｂ）を貼り、該メンブレンの抗Ｍ．Ｐ．抗体（ｃ）を塗布部の展開上流部側に配置し、次いで、上記ii）で作製したコンジュゲートパッド（ｄ）を配置装着し、さらにこのコンジュゲートパッドに重なるようにサンプルパッド（ｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を配置装着し、反対側の端には吸収パッド（ｆ）（Ｌｙｄａｌｌ社製）を配置装着した。また、最後に抗体固定化メンブレン及び吸収パッドを被覆するように上面にポリエステルフィルム（ｇ）を配置装着しラミネートした。このように各構成要素を重ね合わせた構造物を５ｍｍ幅に切断してテストストリップを作製した。図７にテストストリップの模式構成図を示した。

【0054】

〔実施例１−２及び比較例１−２〕
１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、及びＰＡ法陰性血漿のそれぞれにマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原を１０μｇ／ｍＬになるように添加して調製した被験液、及び１％ＢＳＡ−ＰＢＳにマイコプラズマ・ニューモニエ抽出抗原を０．０１、０．１、１、および１０μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ添加して調製した被験液、各１３５μＬに、上記８）v）に示した作製方法に従い作製した下記表４の４種類のテストストリップを挿入し、１０分後、０．２５〜４．０の数値をつけた発色見本（カラーチャート）と比較して発色強度を判定した。陰性対照としては抗原非添加について試験した。

【0055】

【表4】

【0056】

その結果を表５に示す。表５に示すように、サンドイッチイムノクロマト測定法では、サンドイッチＥＬＩＳＡ法と比較して驚くべき結果が得られた。すなわち、サンドイッチＥＬＩＳＡ法では同一抗体の組合せでは測定が成立しなかったのに対して、サンドイッチイムノクロマト測定法では「＃８４２０９コンジュゲート−＃８４２０９メンブレン」の同一抗体の組合せで測定が成立した。また、「＃８４２０９−＃８４２１３の組合せ」では、サンドイッチＥＬＩＳＡ法ではコンジュゲート側とメンブレン側の抗体を入れ替えても測定が成立したのに対し、サンドイッチイムノクロマト測定法では「＃８４２０９コンジュゲート−＃８４２１３メンブレンの組合せ」でのみ測定が成立した。
＃０８４２０９産生ハイブリドーマ及び＃０８４２１３産生ハイブリドーマは、出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託手続がされ、受託番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５が付与されている。＃０８４２０９を特にＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４４抗体、＃０８４２１３を特にＦＥＲＭ ＡＰ−２１９４５抗体ということがある。

【0057】

【表5】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図1】

【図7】