特許 5726529 単一試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5726529

(24)【登録日】2015年4月10日

(45)【発行日】2015年6月3日

(54)【発明の名称】単一試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20150514BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20150514BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20150514BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 G

   C12P21/00 B

   C12P19/34 Z

【請求項の数】16

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2010-536114(P2010-536114)

(86)(22)【出願日】2008年11月25日

(65)【公表番号】特表2011-505139(P2011-505139A)

(43)【公表日】2011年2月24日

(86)【国際出願番号】US2008084616

(87)【国際公開番号】WO2009070558

(87)【国際公開日】20090604

【審査請求日】2011年10月12日

(31)【優先権主張番号】60/991,337

(32)【優先日】2007年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/097,604

(32)【優先日】2008年9月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】598041463

【氏名又は名称】ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100089705

【弁理士】

【氏名又は名称】社本 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100080137

【弁理士】

【氏名又は名称】千葉 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(72)【発明者】

【氏名】ジアーン，ミヤオ

(72)【発明者】

【氏名】ブリッグス，マーク・エス

(72)【発明者】

【氏名】デュリパラ，ロヒニ

(72)【発明者】

【氏名】カイ，ユーヤン・クリスティン

(72)【発明者】

【氏名】ブルーノ，レニー・イー

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００５−１３７２９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−３６０２４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 AllPrep(R) DNA/RNA/Protein Mini，プロトコールとトラブルシューティング（英語版April 2007に対応）[online]，２００７年 ４月，pp.1-28，<http://www.qiagen.com/resources/Download.aspx?id={06ECFBA6-1AFB-4F09-8ACE-A549F725D250}&lang=ja-JP&ver=1>, [retrieved on 2013-07-12]

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／００

Ｃ０７Ｈ ２１／００−２１／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質より選択される少なくとも二つの細胞性成分の分離および／または精製方法であって、
（ａ）生物学的試料をグアニジンＨＣｌおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌの混合物を含むｐＨ５から７の溶解溶液で溶解することによって、該細胞性成分を含有する水溶液を生成し；
（ｂ）該水溶液を、ゲノムＤＮＡが第一鉱物支持体に結合するような条件下において第一鉱物支持体に加え；
（ｃ）未結合ＲＮＡおよびタンパク質を含有するフロースルーを集め；
（ｄ）工程（ｃ）からの該フロースルーを、アセトンまたはアセトニトリルと混合して混合物を形成させた後、該混合物を、ＲＮＡが第二鉱物支持体に結合するような条件下において第二鉱物支持体に加え；
（ｅ）タンパク質を含有するフロースルーを集めること
を含む方法。

【請求項2】

前記第一鉱物支持体を洗浄し、そして該第一鉱物支持体からゲノムＤＮＡを溶離することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第二鉱物支持体を洗浄し、そして該第二鉱物支持体からＲＮＡを溶離することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

工程（ｅ）のフロースルーからタンパク質を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記タンパク質を、沈殿、ゲル濾過または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記溶解溶液が、さらに、非イオン性洗剤および還元剤を包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記非イオン性洗剤が、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール、ソルビタリモノラウレート（Sorbitari Monolaurate）、Ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０およびポリソルベート８０またはその組合せより選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記非イオン性洗剤またはその組合せが、０．１〜１０％の範囲内である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記溶解溶液が、１〜１０ＭグアニジンＨＣｌ、０．１〜１０％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０および０．１〜１０％ＮＰ−４０を包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が、多孔質または非多孔質であり、そして金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカメンブラン、ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタンまたは二酸化ジルコニウムを含んで成る、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が各々、シリカメンブランである、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記生物学的試料が、培養細胞、微生物、植物、動物、または酵素反応による混合物より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

マイクロＲＮＡを単離する方法であって、請求項３に記載の方法により溶離された全ＲＮＡに、一つまたはそれを超える追加の分離工程を施して、マイクロＲＮＡを精製することを含む方法。

【請求項14】

単一生物学的試料からのゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の分離および／または精製のためのキットであって、
（ａ）生物学的試料を溶解するためのグアニジンＨＣｌおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌの混合物を含むｐＨ５から７の溶解溶液；
（ｂ）ゲノムＤＮＡを結合するための第一鉱物支持体；
（ｃ）ＲＮＡを結合するための第二鉱物支持体；
（ｄ）アセトンまたはアセトニトリル；
（ｅ）第一鉱物支持体からゲノムＤＮＡを溶離するための溶離溶液；
（ｆ）第二鉱物支持体からＲＮＡを溶離するための溶離溶液、
を含み；場合により、該キットが、更に、
ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが、それぞれの鉱物支持体に結合後に、フロースルーからタンパク質を単離するための手段を包含するキット。

【請求項15】

前記溶解溶液が、さらに、非イオン性洗剤および還元剤を包含する、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が各々、シリカメンブランである、請求項１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願のクロス・リファレンス
本出願は、２００７年１１月３０日出願の米国予備特許出願第６０／９９１，３３７号および２００８年９月１７日出願の同第６１／０９７，６０４号に優先権を主張し；それらの開示は、本明細書中にそのまま援用される。

【0002】

本発明は、ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の単離方法に関する。より詳しくは、それは、単一試料からのゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の抽出および精製のための簡単且つ迅速なシステムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ここ３０年間には、生物学的源からの核酸およびタンパク質の単離および精製のための改良方法の開発にかなりの努力がなされた。これは、主として、医学および生物科学における核酸およびタンパク質の増加しつつある用途のためであった。血液、組織または培養細胞から単離されたゲノムＤＮＡは、いくつかの用途を有するが、それには、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーションおよびサザンブロッティングが含まれる。プラスミドＤＮＡは、配列決定、ＰＣＲ、ワクチンの開発および遺伝子治療に利用されてきた。単離されたＲＮＡは、in vitro 翻訳、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲおよびマイクロアレイ遺伝子発現分析用を含めたいろいろな下流の用途を有する。タンパク質分野において、ウェスタンブロッティングによるタンパク質の識別は、ウイルスタンパク質検出によって示されたように、診断目的用の特定のタンパク質の基本的研究および識別において遺伝子発現を研究する場合の重要な手段になった。

【0004】

核酸およびタンパク質の分析および in vitro 操作に先だって、引き続きのプロセシング手順を妨げるかもしれない望ましくない混入物から試料を分離するために、典型的に、単離工程を行う。研究および診断的分子生物学双方における極めて多数の手順について、抽出された核酸およびタンパク質は、最初の工程として必要とされる。

【0005】

ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の増加した使用は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を単離するための急速で簡単且つ信頼できる方法および試薬への要求を生じた。多数の用途において、生物学的材料試料を集めることおよび引き続きのその分析は、それら三つの細胞性成分（ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質）が、単一試料から同時に単離されうるならば、実質的に単純化されると考えられる。同時単離は、試料サイズが、生検の場合のように、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質について別々の単離プロトコルを行うことが、一層小さい試料へのその分離を妨げるように小さい場合、特に重要である。

【0006】

更に、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の全３種類のレベルは、異なった理由について価値のある情報を与える。ＤＮＡまたは遺伝子型は、遺伝的素因および後天的突然変異／局所再配列についての情報を与える。ｍＲＮＡおよびタンパク質双方のプロフィールは、生物学的状態／ステージまたは疾患の「分子ポートレート」を生じ、そして更に、疾患進展および処置のステージ分類および監視に用いることができる。ＤＮＡとは反対に、ｍＲＮＡおよびタンパク質双方のプロフィールは、周囲環境に応答して絶えず変化しているので、それらは、細胞の生物学の「断片（snap shots）」である。転写レベル、翻訳レベルおよび翻訳後レベルで働いている調節機構ゆえに、ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、常に相関してはいない。したがって、同じ試料からのｍＲＮＡおよびタンパク質双方を研究することは、極めて重要である。

【0007】

したがって、上述のように、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの間には、しかしながら、必ずしも１：１の相関は存在しない。タンパク質レベルおよび相当するｍＲＮＡレベルを比較する場合、ｍＲＮＡおよびタンパク質の比率が１：１でない全てのタンパク質について、このタンパク質を、いくつかの形の興味深い転写後および／または翻訳後調節に供する。特定の遺伝子のｍＲＮＡ／タンパク質比率は、しばしば、疾患状態の間に移動する。調節機構を研究し且つｍＲＮＡ／タンパク質比率のこのような移動の裏にある理由を解明することを可能にするために、同じ試料からｍＲＮＡおよびタンパク質を単離することは、極めて重要である。

【0008】

更に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）調節遺伝子発現およびｍｉＲＮＡの調節異常は、多数の疾患または状態に関連していた。マイクロＲＮＡを、全タンパク質、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡと一緒に同じ試料から単離することができるならば、それらの間の相互作用および効果についての理解への明らかな利点が存在する。マイクロＲＮＡの単離に有効な手段は、特に、癌、神経学、心臓病学の分野において、マイクロＲＮＡに基づく診断法および治療法の開発をも助けると考えられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

同じ試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離を行うための新規な且つ好都合な方法を、本明細書中で与える。

【課題を解決するための手段】

【0010】

概して、本発明は、同じ試料からの二本鎖核酸および一本鎖核酸の迅速な分離および単離のための改良された方法、システムおよびキットを提供する。二本鎖核酸は、高濃度のカオトロピック塩の存在下において鉱物支持体に選択的に吸着する。一本鎖核酸を含有するフロースルーは、一本鎖核酸が第二鉱物支持体に吸着するように調整される。タンパク質は、第二鉱物支持体のフロースルーから精製することができるが、核酸は、各々の鉱物支持体からそれぞれ溶離される。

【0011】

したがって、本発明の一つの側面は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質より選択される少なくとも二つの細胞性成分の分離および／または精製の方法を提供する。その方法は、最初に、生物学的試料を溶解させて、細胞性成分を含有する水溶液を生成し；次に、その水溶液を、ゲノムＤＮＡが結合する条件下において第一鉱物支持体に加え；そして未結合ＲＮＡおよびタンパク質を含有するフロースルーを集めることを包含する。その方法は、更に、フロースルーを、ＲＮＡが結合する条件下において第二鉱物支持体に加え、そしてタンパク質を含有するフロースルーを集めることを包含する。

【0012】

本発明の特定の態様において、試料は、カオトロピック塩、非イオン性洗剤および還元剤を含有する溶解溶液を用いて溶解させる。好ましくは、カオトロピック塩は、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）である。更に好ましくは、非イオン性洗剤は、ＮＰ−４０であり、そして還元剤は、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）である。本発明の他の態様において、第一鉱物支持体からのフロースルーは、第二鉱物支持体へのＲＮＡの結合前に、有機物質と混合される。好ましい態様において、その有機物質は、極性または双極性非プロトン性溶媒である。最も好ましくは、有機物質は、アセトンである。

【0013】

特定の態様において、その方法は、更に、第一鉱物支持体を洗浄し、そしてそれからゲノムＤＮＡを溶離することを含む。他の態様において、その方法は、更に、第二鉱物支持体を洗浄し、そしてそれからＲＮＡを溶離することを包含する。また他の態様において、その方法は、更に、フロースルーからタンパク質を単離することを更に包含する。

【0014】

別の側面において、本発明は、二本鎖核酸、一本鎖核酸およびタンパク質を分離するおよび単離するためのキットを提供する。そのキットは、生物学的試料を溶解するための溶解溶液；二本鎖核酸を結合するための第一鉱物支持体；一本鎖核酸を結合するための第二鉱物支持体；第一鉱物支持体から二本鎖核酸を溶離するための溶離溶液；および第二鉱物支持体から一本鎖核酸を溶離するための溶離溶液を包含する。場合により、キットは、更に、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが、それぞれの鉱物支持体に結合後に、フロースルーからタンパク質を単離するための手段を包含する。

【0015】

好ましい態様において、溶解溶液は、カオトロピック塩、非イオン性洗剤および還元剤を包含する。また別の好ましい態様において、第一鉱物支持体および第二鉱物支持体は各々、シリカメンブランである。

【0016】

本発明の上のおよび追加の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲から一層明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、本発明の態様による、単一試料からのゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の単離方法の略図を示す。

【図2】図２は、本発明の一つの態様によって単離されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡのゲル画像を示す。

【図3】図３は、市販製品より得られたものと比較される、本発明の特定の態様によって単離されたゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ試料のゲル画像を示す。上部：全ＲＮＡ；下部：ゲノムＤＮＡ。左側パネルは、培養ＨｅＬａ細胞より単離された核酸試料を示す。右側パネルは、ラット肝組織より単離された核酸試料を示す。

【図4】図４は、市販製品よりのものと比較される、本発明の態様によってＨｅＬａ細胞培養物より単離された全ＲＮＡ試料の Agilent Bioanalyzer より得られた画像である。

【図5】図５は、市販製品を用いて得られたものを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、ＨｅＬａ細胞培養物からのゲノムＤＮＡ試料より得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示す。

【図6】図６は、市販製品を用いて得られたものを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、ＨｅＬａ細胞培養物からの全ＲＮＡ試料より得られたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を示す。

【図7】図７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色であり、本発明の態様によってＨｅＬａ細胞培養物より単離された全タンパク質、更には、市販製品より単離されたものを示す。

【図8】図８は、市販製品を用いて単離されたものと比較される、本発明の態様によって単離されたタンパク質試料のウェスタンブロッティング実験より得られた結果を示す。

【図9】図９は、市販製品よりのものと比較される、本発明の態様によってラット肝組織より単離された全ＲＮＡ試料の Agilent Bioanalyzer より得られた画像である。

【図10】図１０は、市販製品よりを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、ラット肝組織からのゲノムＤＮＡ試料より得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示す。

【図11】図１１は、市販製品を用いて得られたものを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、ラット肝組織からの全ＲＮＡ試料より得られたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅結果を示す。

【図12】図１２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色であり、本発明の特定の態様によってラット肝組織より単離された全タンパク質を示す。

【図13】図１３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色であり、本発明の態様によってラット肝組織より単離された全タンパク質、更には、市販製品より単離されたものを示す。

【図14】図１４は、本発明の特定の態様によってＨｅＬａ細胞より単離されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡのゲル画像および収量結果を示す。

【図15】図１５は、本発明の特定の態様によってラット肝組織より単離されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡのゲル画像および収量結果を示す。

【図16】図１６は、本発明の態様によって精製された全ＲＮＡより単離された低分子ＲＮＡ（レーン１、２、３）および対照試料（ＱおよびＱ）のゲル画像および収量結果を示す。全ＲＮＡ源材料を、別の対照として加えた（「投入」レーン）。

【図17】図１７は、４種類のマイクロＲＮＡについてのｑＲＴ−ＰＣＲグラフを示し、単離された低分子ＲＮＡ試料中の低コピー数および高コピー数双方のマイクロＲＮＡの存在が確かめられる。

【図18】図１８は、本方法によって単離された全ＲＮＡからの低分子ＲＮＡ単離と、二つの市販製品からのものとを比較する。低分子ＲＮＡは、下部パネル上に示され、「大型」ＲＮＡ（低分子ＲＮＡを奪われた全ＲＮＡ）は、上部パネル上である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、細胞、組織および体液などの単一の生物学的材料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の極めて有効で簡単な抽出のための組成物、方法およびキットを提供する。好都合には、これらは、毒性または腐食性の試薬の使用を伴うことなくおよび高価な超遠心分離装置の使用を伴うことなく達成することができる。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡは、本発明の試薬および方法を利用して、３０分もの短時間で、そしてタンパク質は４５分もの短時間で単離することができる。これら結果は、個々の成分の単離のための既存の方法よりも実質的に速い。

【0019】

本発明は、更に、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質またはこれら細胞性成分のいずれかの少なくとも二つの組合せの別々の単離に応用可能である。得られた単離されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡは、下流の用途に用いるのに適する高品質を有する。本発明者は、更に、他の市販プロトコルより単離された全ＲＮＡと比較したところ、本方法によって単離された全ＲＮＡは、はるかに高レベルの低分子ＲＮＡを含有するということを発見した。したがって、本発明は、更に、低分子ＲＮＡを単離する方法であって、本方法によって単離された全ＲＮＡを、既知の低分子ＲＮＡ単離手順のいずれか一つに供することによる方法を提供する。低分子ＲＮＡは、したがって、他の成分（すなわち、ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質）と一緒に、同じ出発試料から単離されうると考えられる。

【0020】

「生物学的材料」または「生物学的試料」という用語は、広い意味で用いられ、そして核酸およびタンパク質を含有するいろいろな生物学的源を包含する意味である。このような源には、制限されることなく、生検材料および吸引液を含めた全組織；一次および二次細胞、形質転換された細胞系、および組織および血液細胞を含めた in vitro 培養細胞；および尿、喀痰、精液、分泌物、洗眼液および吸引液、肺洗浄液および吸引液などの体液が含まれる。葉、根、幹およびカサなどの真菌および植物の組織も、本発明の範囲内である。生物学的試料上または中に存在するかもしれない微生物およびウイルスは、本発明の範囲内である。細菌細胞も、本発明の範囲内である。

【0021】

その最も広範な側面において、本発明は、組織、細胞および体液を含めた生物学的材料から実質的に純粋な且つ未分解の全ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびタンパク質を単離する方法を包含する。したがって、生物学的試料を、最初に溶解させて、細胞性成分を含有する水溶液を生成し；次に、その水溶液を、ゲノムＤＮＡが結合する条件下において第一鉱物支持体に加え；同時に、未結合ＲＮＡおよびタンパク質を含有するフロースルーを集める。そのフロースルーを、ＲＮＡが結合する条件下において第二鉱物支持体に加え；そしてタンパク質を含有するそのフロースルーを集める。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡは、それぞれ、第一および第二鉱物支持体より溶離する。本発明の一つの態様による作業の流れの一例を、図１に示す。

【0022】

好ましくは、生物学的試料または細胞を、最初に、カオトロピック物質および／または他の塩を含有する水性溶解系中に、最も簡単な場合は、それを細胞に加えることによって溶解させる。本明細書中で用いられる「カオトロープ（chaotrope）」または「カオトロピック塩」という用語は、例えば、これに制限されるわけではないが、タンパク質または核酸の二次、三次または四次構造を変化させるが、その一次構造を無傷のまま残すことで、タンパク質または核酸に障害を引き起こす物質を意味する。代表的なカオトロープには、グアニジン塩酸塩、グアニジニウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび尿素が含まれるが、これに制限されるわけではない。カオトロピック強さを減少させる順に示される典型的な陰イオン性カオトロピック系列には、ＣＣｌ_３ＣＯＯ⁻→ＣＮＳ⁻→ＣＦ_３ＣＯＯ⁻→ＣｌＯ_４⁻＞Ｉ⁻→ＣＨ_３ＣＯＯ⁻→Ｂｒ⁻、Ｃｌ⁻またはＣＨＯ_２⁻が含まれる。

【0023】

挙げられた出発材料のいくつか、例えば、細菌などは、それらの細胞壁の状態ゆえに、カオトロピック物質を含有する水性系中に直接的に溶解させることができない。したがって、これら出発材料は、本発明による方法で用いる前に、例えば、溶菌酵素で前処理されるべきである。

【0024】

ＲＮＡおよびタンパク質の単離における最も重要な側面の一つは、単離手順の際のそれらの分解を妨げることである。したがって、生物学的試料を溶解させるための本試薬は、好ましくは、大量のカオトロピックイオンを含有する溶液である。この溶解緩衝液は、ほとんど全ての酵素を直ちに失活させて、ＲＮＡおよびタンパク質の酵素的分解を妨げる。その溶解溶液は、カオトロピック物質を、１〜１０Ｍなどの０．１〜１０Ｍの濃度で含有する。これらカオトロピック物質として、具体的には、過塩素酸ナトリウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート／グアニジニウムチオシアネート、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムおよび／またはその組合せなどの塩が用いられてよい。

【0025】

好ましくは、溶解溶液は、更に、カオトロープでのＲＮアーゼの変性を容易にする且つ未分解のＲＮＡの単離を助ける還元剤を包含する。好ましくは、還元剤は、２−アミノエタンチオール、トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）またはβ−メルカプトエタノールである。

【0026】

場合により、溶解溶液は、更に、非イオン性界面活性剤（すなわち、洗剤）を包含する。洗剤の存在は、鉱物支持体へのゲノムＤＮＡの選択的結合を可能にする。代表的な非イオン性界面活性剤には、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００^ＴＭ）、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ^ＴＭＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ＢＲＩＪ^ＴＭ３０）、ソルビタリモノラウレート（Sorbitari Monolaurate）（ＳＰＡＮ^ＴＭ２０）、またはポリソルベート２０（すなわち、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０）などのポリソルベート系の化学薬品が含まれるが、これに制限されるわけではない。他の商業的に入手可能なポリソルベートには、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ４０、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ６０およびＴＷＥＥＮ^ＴＭ８０（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）が含まれる。これらおよび他の関連化学薬品はいずれも、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０の代替品として有効である。

【0027】

二本鎖核酸の選択的結合のための有効量の非イオン性洗剤は、いろいろな洗剤の間で僅かに変化しうると考えられる。しかしながら、各々の洗剤（または洗剤組合せ）の最適濃度は、いくつかの簡単な実験で容易に決定することができる。概して、０．５％またはそれより大の最終洗剤濃度は、二本鎖核酸の選択的結合に有効であるということが知られている。特定の態様において、その有効濃度は、０．５％〜約１０％である。好ましい態様において、その濃度は、１％〜８％である。更に、洗剤の組合せ濃度が、０．５％〜約１０％の範囲内である限り、二つ以上の非イオン性洗剤を組み合わせることができるということが注目される。

【0028】

特定の濃度での洗剤の存在は、核酸回収率を改善するのみならず、精製された一本鎖核酸中の二本鎖核酸混入を減少させるということが知られている。これは、少なくとも一部分は、シリカメンブラン上の改善されたゲノムＤＮＡ結合によって達成される。

【0029】

好ましい態様において、溶解溶液は、ＮＰ−４０（ＩＧＥＰＡＬ^ＴＭＣＡ−６３０）を包含する。最も好ましい態様において、溶解溶液は、グアニジンＨＣｌ、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０、ＮＰ−４０およびβ−メルカプトエタノールを包含する。

【0030】

本発明の溶解溶液は、好ましくは、その溶液のｐＨを維持するのに十分な量の緩衝剤を更に含有する。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質の同時単離には、ｐＨは、約５〜８の範囲内で維持されるべきである。溶解溶液に用いるのに好ましい緩衝剤には、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Tris−ＨＣｌ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、テトラホウ酸ナトリウム・ホウ酸およびグリシン・水酸化ナトリウムが含まれる。

【0031】

生物学的試料がいったん溶解したら、細胞性成分を含有するその水溶液を、鉱物支持体に加える。溶解溶液（一定量の非イオン性洗剤を含む）の条件下において、ほとんど全部のゲノムＤＮＡは、その第一鉱物支持体に結合するが、全ＲＮＡおよびタンパク質は、結合しないので、簡単なスピンによってフロースルーとして集められるということが知られている。

【0032】

鉱物支持体は、好ましくは、多孔質または非多孔質の金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカメンブラン、主として、未変性ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、二酸化ジルコニウムなどのガラスから成る材料から成る。鉱物支持体材料の粒度は、０．１μｍ〜１０００μｍであり、そして細孔度は、２〜１０００μｍである。この多孔質または非多孔質支持体材料は、荒充填の形で存在してよいし、またはガラス、石英またはセラミックから作られるフィルター層；および／またはシリカゲルが配列されているメンブラン；および／または鉱物支持体から作られる粒子または繊維；および石英またはグラスウールの織物；更には、官能基を含むまたは不含のラテックス粒子；またはポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、特に、超高分子量ポリエチレン、高密度ポリエチレンから作られるフリット材料の形で具体化されてよい。

【0033】

第一鉱物支持体からのフロースルーは、全ＲＮＡおよびタンパク質を含有する。そのフロースルーを、有機溶媒と混合し、そして第二鉱物支持体に加える。特定の有機溶媒の存在下において、ＲＮＡは、その鉱物支持体に結合するが、タンパク質は結合しないということが知られている。簡単な遠心分離工程は、鉱物支持体に結合したＲＮＡを、フロースルー中のタンパク質から分離する。

【0034】

一例として、低級脂肪族アルコールなどの極性プロトン性溶媒は、適する有機溶媒である。好ましくは、有機溶媒は、双極性非プロトン性溶媒である。適する双極性非プロトン性溶媒には、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メチルエチルケトン、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が含まれるが、これに制限されるわけではない。最も好ましくは、有機溶媒は、アセトンまたはアセトニトリルである。

【0035】

ＲＮＡ結合のための第二鉱物支持体は、上記の第一鉱物支持体と類似の材料から成る。好ましくは、第一鉱物支持体および第二鉱物支持体は各々、シリカメンブランである。
特定の用途において、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ双方を、同じ鉱物カラムに一緒に結合させることは好都合であろうと考えられる。これは、第一カラムの充填前の、双極性非プロトン性溶媒などの有機溶媒の添加によって達成することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡの分離は、溶離条件を制御することによるなどの慣用的な技法によって実現することができる。或いは、一方の核酸を、酵素反応によって除去することができる。

【0036】

場合により行われる洗浄工程後、第一鉱物支持体上に吸着した二本鎖核酸および第二鉱物支持体上に吸着した一本鎖核酸は、それぞれ、低イオン強度の条件下においてまたは水で溶離することができる。

【0037】

場合により、洗浄工程は、それぞれの核酸（一本鎖核酸または二本鎖核酸）の溶離前に行ってもよい。二本鎖ゲノムＤＮＡを精製するために、第一鉱物支持体（すなわち、カラム）の溶解緩衝液での任意の洗浄は、残留量のＲＮＡを全て除去する。更に、低級脂肪族アルコールなどの高濃度の有機溶媒を含有する洗浄用緩衝液は、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ双方の精製に用いられて、所望の核酸以外の成分を急速遠心分離工程によって除去することができる。

【0038】

図１に示される作業の流れおよび下の実施例２および実施例３に更に記載の実験条件の後、ＤＮＡおよび全ＲＮＡは、生物学的試料から首尾よく精製された。表１は、培養細胞並びにラット肝組織を用いて得られたＤＮＡおよび全ＲＮＡ単離データを示す。良品質核酸は、これら実験から、本産業標準との比較によってまたは他の商業的に入手可能な精製キットによって得られる（下を参照されたい）。

【0039】

【表1】

【0040】

フロースルー中のタンパク質は、更に、沈殿、ゲル濾過または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）などの、それ自体は既知の方法で精製することができる。好ましくは、タンパク質は、沈殿によって精製される。より好ましくは、タンパク質は、二価の金属陽イオンの存在下での沈殿によって精製される。最も好ましくは、タンパク質は、ＺｎＳＯ_４の存在下での沈殿によって単離される。表２は、いろいろな下流のタンパク質単離方法を用いて入手可能なタンパク質収量を示す。

【0041】

【表2】

【0042】

本発明は、更に、同じ試料から低分子ＲＮＡを単離する方法を提供する。簡単にいうと、上の方法によって精製された全ＲＮＡは、他の市販プロトコルより単離された全ＲＮＡと比較して、はるかに高レベルの低分子ＲＮＡを含有するので、その精製された全ＲＮＡから、マイクロＲＮＡを含めた低分子ＲＮＡの単離を可能にする。本発明者は、市販のマイクロＲＮＡ単離キットが、本方法によって得られた全ＲＮＡ試料から低分子ＲＮＡを単離する場合に有効であるということを示している。単離された低分子ＲＮＡは、高コピー数並びに低コピー数双方のマイクロＲＮＡを包含する。

【0043】

更に、生物学的試料からのゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の分離および／または精製のためのキットを提供する。そのキットは、生物学的試料を溶解するための溶解溶液；ゲノムＤＮＡを結合するための第一鉱物支持体；ＲＮＡを結合するための第二鉱物支持体；第一鉱物支持体からゲノムＤＮＡを溶離するための溶離溶液；第二鉱物支持体からＲＮＡを溶離するための溶離溶液、そしてアセトンなどの有機溶媒を含む。場合により、そのキットは、更に、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが、それぞれの鉱物支持体に結合後に、フロースルーからタンパク質を単離するための手段、更には、使用者手引書を包含する。

【0044】

好ましくは、キット中の溶解溶液は、カオトロピック塩、非イオン性洗剤および還元剤を包含する。最も好ましくは、溶解溶液は、グアニジンＨＣｌ、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０、ＮＰ−４０およびβ−メルカプトエタノールを包含する。

【0045】

鉱物支持体は、二つの手段の間に固定された荒充填で、またはカラムの中空体内に配列されているメンブランの形で存在してよい。好ましくは、第一鉱物支持体および第二鉱物支持体は各々、シリカメンブランである。

【0046】

本発明の他の特徴および利点は、次の実施例からおよび請求の範囲から明らかであろう。

【実施例】

【0047】

次の実施例は、本発明の態様による単一源からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離方法を詳しく説明するのに役立つが、制限するものではない。
溶液およびプロトコル
１．実施例に用いられる溶液およびカラム

【0048】

【表3】

【0049】

２．試料破壊および均一化
２．１ 細胞破壊および均一化：
ａ．１ｘ１０^６個の培養細胞を、１．５ｍｌミクロ遠心分離管中において８０００ｘｇで１分間の遠心分離によってペレットにする。

【0050】

ｂ．上澄みを吸引によって完全に除去する。
ｃ．３５０μｌの溶解緩衝液（β−ＭＥ含有）を加える。
ｄ．細胞ペレットを旋回させて再懸濁させる。

【0051】

ｅ．溶解産物を、ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼ不含シリンジに装着した２０ゲージ針を介して少なくとも５回通過させることによって、それを均一化する。
ｆ．工程３へ進める。

【0052】

２．２ ＰＯＬＹＴＲＯＮ^ＴＭホモジナイザー（Kinematica AG, Switzerland）を用いた組織破壊および均一化：
ａ．１０ｍｇの組織を、適当なサイズの試験管に入れる。

【0053】

ｂ．３５０μｌの溶解緩衝液（βＭＥ含有）を加える。
ｃ．ＰＯＬＹＴＲＯＮ^ＴＭの使用者手引書にしたがって組織を均一化する。
ｄ．調製されたホモジネートを目視検査し、そして完全な均一化を確かめる。

【0054】

ｅ．工程３へ進める。
２．３ 乳鉢および乳棒を用いた組織破壊後、針およびシリンジを用いた均一化：
ａ．秤量済み組織を直ちに液体窒素中に入れ、そして乳鉢および乳棒で完全に粉砕する。

【0055】

ｂ．組織粉末および液体窒素を、ＲＮアーゼ不含の、液体窒素で冷却された２ｍｌミクロ遠心分離管中に傾瀉する。
ｃ．液体窒素を蒸発させるが、組織を融解させない。

【0056】

ｄ．適当な容量の溶解緩衝液を加え、そして溶解産物を、ＲＮアーゼ不含シリンジに装着した２０ゲージ針を介して少なくとも５回通過させることによって均一化する。
３．ｇＤＮＡ精製
３．１ ｇＤＮＡ結合
ａ．新しいスピンカラムを新しい採集管中に入れる。

【0057】

ｂ．工程２による均一化された溶解産物（約３５０μｌ）をカラムに移す。
ｃ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｄ．そのフロースルーを、ＲＮＡおよびタンパク質の精製用に蓄える。

【0058】

ｅ．カラムを、新しい２ｍｌ採集管に移す。
３．２ カラム洗浄
ａ．５００μｌの溶解緩衝液をカラムに加える。

【0059】

ｂ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。フロースルーを捨てる。
ｃ．カラムを同じ採集管中に戻し入れる。
ｄ．５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに加える。

【0060】

ｅ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｆ．カラムを、ＤＮアーゼ不含の１．５ｍｌミクロ遠心分離管に移す。
３．３ ｇＤＮＡ溶離
ａ．１００μｌのｇＤＮＡ溶離緩衝液を、カラムの中央に加える。

【0061】

ｂ．８０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｃ．カラムを捨て、そして純粋なｇＤＮＡが入っている管を−２０℃で貯蔵する。
４．全ＲＮＡ精製
４．１ ＲＮＡ結合
ａ．新しいスピンカラムを新しい採集管中に入れる。

【0062】

ｂ．工程３．１．ｄ．によるフロースルーに、３５０μｌの１００％アセトンを加える。ピペットで数回上下することで十分に混合する。混合物全部をカラムに移す。
ｃ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。

【0063】

ｄ．そのフロースルーを、タンパク質精製用に蓄える。
ｅ．カラムを、新しい２ｍｌ採集管に移す。
４．２ カラム洗浄
ａ．５００μｌの洗浄緩衝液をカラムに加える。

【0064】

ｂ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｃ．カラムを、ＲＮアーゼ不含の１．５ｍｌミクロ遠心分離管に移す。
４．３ ＲＮＡ溶離
ａ．１００μｌの溶離緩衝液を、カラムの中央に加える。

【0065】

ｂ．８０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｃ．カラムを捨て、そして純粋なＲＮＡが入っている管を−８０℃で、必要とされるまで貯蔵する。

【0066】

５．２−Ｄ Clean-Up キット（GE Healthcare）を用いた全タンパク質精製
注記：全ての工程を、特に断らない限り、氷上で行うべきである。
５．１ タンパク質精製
ａ．工程４．１によるフロースルーを、タンパク質沈殿のための出発点として用いる。十分に混合し、そして１００μｌのフロースルーを、新しい１．５ｍｌミクロ遠心分離管に移す。

【0067】

ｂ．３００μｌの沈殿剤を加え、十分に混合する。氷上で１５分間インキュベートする。
ｃ．３００μｌの共沈殿剤を混合物に加える。短時間混合する。

【0068】

ｄ．管を、最大速度で５分間遠心分離する。
ｅ．上澄みを、ピペットで取るまたは傾瀉することによってできるだけ完全に除去する。

【0069】

ｆ．４００μｌの共沈殿剤をペレットの上に加え、氷上で１５分間インキュベートする。
ｇ．管を、最大速度で５分間遠心分離する。上澄みを注意深く取り出し且つ捨てる。

【0070】

５．２ タンパク質ペレット洗浄
ａ．２５μｌの脱イオン水をペレットにピペットで加える。管を５分間旋回させる。
ｂ．１ｍｌの予備冷却された洗浄緩衝液および５μｌの洗浄添加剤を、各々の管に加える。激しく旋回させる。（注記：ペレットは、洗浄緩衝液中に溶解しないであろう。）
ｃ．管を、−２０℃で３０分間インキュベートし、１０分毎に２０〜３０秒１回旋回させる。

【0071】

ｄ．管を、最大速度で５分間遠心分離する。
ｅ．上澄みを注意深く取り出し且つ捨てる。白色ペレットは、この工程で目に見えるはずである。

【0072】

ｆ．蓋を開けたままにし、沈殿物を室温で最大５分間乾燥させる。
５．３ タンパク質ペレット再懸濁
ａ．１００μｌまでの５％ＳＤＳまたは７Ｍ尿素を加え、そして激しく混合して、タンパク質ペレットを溶解させる。ピペットの先端を用いてペレットを分散させる。

【0073】

ｂ．９５℃で３分間インキュベートして、タンパク質を完全に溶解させ且つ変性させる。次に、試料を室温に冷却させる。
ｃ．１１０００ｘｇで１分間遠心分離して、残留する不溶性材料を全てペレットにする。上澄みを、下流の用途、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングに用いる。試料は、−２０℃で数ヶ月間または４℃で数日間貯蔵することができる。

【0074】

６．全タンパク質単離（ＺｎＳＯ_４を用いた沈殿）
６．１ タンパク質沈殿
ａ．工程４．１．ｄによるフロースルーを、タンパク質沈殿のための出発点として用いる。

【0075】

ｂ．６００μｌの１０％ＺｎＳＯ_４溶液を加える。
ｃ．激しく混合し、そして室温で１０分間インキュベートして、タンパク質を沈殿させる。

【0076】

ｄ．１６０００ｘｇで１０分間遠心分離する。
ｅ．上澄みをピペットで取るまたは傾瀉することによって注意深く除去する。
６．２ タンパク質ペレット洗浄
ａ．５００μｌの５０％エタノールをタンパク質ペレットに加える。

【0077】

ｂ．１６０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｃ．上澄みを、ピペットを用いることによってまたはできるだけの液体を傾瀉することによって除去する。

【0078】

ｄ．蓋を開けたままにし、沈殿物を室温で５〜１０分間乾燥させる。
６．３ タンパク質ペレット再懸濁
ａ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前のタンパク質定量化のために、最低１００μｌの５％ＳＤＳ（または７Ｍ尿素）を加え、そして激しく混合して、タンパク質ペレットを溶解させる。ピペットの先端を用いてペレットを分散させる。

【0079】

ｂ．必要ならば、１ｍｌまでの５％ＳＤＳ（または７Ｍ尿素）を加えて、ペレットを完全に溶解させる。
ｃ．９５℃で５分間インキュベートして、タンパク質を完全に溶解させ且つ変性させる。激しく旋回させる。

【0080】

ｄ．試料を室温に５分間冷却させる。
ｅ．１６０００ｘｇで１分間遠心分離する。
ｆ．上澄みを、新しい１．５ｍｌミクロ遠心分離管に移す。

【0081】

ｇ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングのために、上澄みを用いる。
ｈ．試料を、−２０℃で数ヶ月間または４℃で数日間貯蔵する。
実施例１：作業の流れの最適化
最適の作業の流れを見出そうとして、本発明者は、ＨｅＬａ細胞培養物からのゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよび全タンパク質の抽出および精製についていろいろな溶液および添加剤を調べた。

【0082】

本発明者は、７ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７の（洗剤、例えば、５％ＮＰ−４０またはＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０を含むまたは不含）混合物を含有する溶解緩衝液が、還元剤（例えば、ＴＥＣＰまたはβ−ＭＥ）の存在下で十分に作用するということを発見した。或いは、７ＭグアニジンＨＣｌ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ５の（洗剤、例えば、５％ＮＰ−４０を含む）混合物を含有する溶解溶液も、還元剤（例えば、ＴＥＣＰまたはβ−ＭＥ）の存在下で十分に作用する。生物学的試料は、どちらかの溶液と混合した時に、上に与えられたプロトコルにしたがって均一化し、それをシリカメンブランカラム上に充填した。急速スピンで、フロースルーとしての混合物およびカラムに結合したゲノムＤＮＡを取り出した。ゲノムＤＮＡを含有するカラムを、上のプロトコルにしたがって更に処理して、純粋なゲノムＤＮＡを単離した。

【0083】

フロースルーは、全ＲＮＡ並びにタンパク質を含有する。全ＲＮＡのタンパク質からの更なる分離のために、０．７容量のアセトンは、全ＲＮＡをシリカメンブランカラムに選択的に結合させるのに有効であることが判明した。したがって、０．７容量のアセトンをフロースルーに加えた後、その混合物を、シリカメンブランカラムに充填した。急速スピンは、タンパク質を今のところ含有しているフロースルーとしての混合物と、ＲＮＡを上に結合した状態で含むカラムとを分離した。そのカラムを、上のプロトコルにしたがって更に処理して、純粋なＲＮＡを単離し、同時に、フロースルーをタンパク質精製用に用いた。

【0084】

本発明者は、更に、低級脂肪族アルコールなどの極性プロトン性溶媒、更には、双極性非プロトン性溶媒を調べた。予想されるように、低級脂肪族アルコールは、シリカメンブランカラムへのＲＮＡ結合を可能にする。本発明者は、多数の双極性非プロトン性溶媒が、この目的にも有用であるということを発見した。具体的には、アセトンおよびアセトニトリルは、調べられた他の双極性非プロトン性溶媒も同様に作用することが判明したとはいえ（データは示されていない）、他のものより好ましいことが判明した。

【0085】

図２は、この方法より単離されたゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡのゲル画像を示す。出発材料は、１００万個のＨｅＬａ細胞であった。溶解溶液は、７Ｍ ＧｕＨＣｌ、５０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、ｐＨ７、５％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０および１％ＴＥＣＰを含有した。第二鉱物支持体の充填前に、フロースルーを、アセトンまたはアセトニトリルと混合した。それ以外は、上のプロトコルにしたがった。ゲノムＤＮＡを、２００μｌの最終容量中で溶離した。全ＲＮＡは、１００μｌの最終容量中で溶離した。ゲルの各レーンは、１０μｌの溶離試料を含有した。ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ双方の単離および精製について、プロトコルが十分に作用したということは明らかである（レーン１〜３：アセトンを用いて単離された全ＲＮＡ；４〜５：アセトニトリルを用いて単離された全ＲＮＡ；Ｍ：λＨｉｎｄIIIマーカー）。

【0086】

実施例２：培養細胞からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離
培養細胞を、作業の流れの性能について更に調べた。本発明者は、更に、作業の流れを、市販製品、すなわち、AllPrep キット（Qiagen Inc., Valencia, CA）およびＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭＲＮＡ／Protein キット（ＤＮＡ溶離緩衝液セット付加、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬGmbH & Co. KG. Germany）と比較して調べた。多重試料を処理して、プロトコルの一貫性を評価した。製品の純度は、ＵＶ分光光度法でおよびゲル分析で評価した。得られた試料は、更に、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティング実験などの下流の用途において評価した。本発明者の結果は、上記のプロトコルが、培養細胞について一貫して且つ十分に作用するということを示している。

【0087】

本発明者は、１ｘ１０^７個のＨｅＬａ細胞培養物より出発した。それら細胞をペレットにし、そして１ｘ１０^６個のアリコートへ希釈後、調製を開始した。３人の作業者が各々、アリコートの一つについて上のまたは製造者からの同じプロトコルにしたがった。各々のプロトコルにおいて任意の工程は行わなかった。ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、初日に単離した。タンパク質フロースルーは、その翌日に、３種類の異なった方法、すなわち、２−Ｄ Clean-Up Kit（GE Healthcare, Piscataway, NJ）、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭ Protein Pecipitator キット（Macherey-Nagel）および AllPrep Protein Precipitation キット（Qiagen）で更に精製した。

【0088】

ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ単離収量結果は、上の表１に示されている。タンパク質精製収量結果は、上の表２に示されている。ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質を単離する場合に、プロトコルが、一貫した高品質の結果を生じるということは理解されうる。

【0089】

ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの純度も、アガロースゲル分析によって調べた。図３は、市販製品と比較される、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ試料のゲル画像を示す。上部：全ＲＮＡ；下部：ゲノムＤＮＡ。左側パネルは、培養ＨｅＬａ細胞より単離された核酸試料を示す。右側パネルは、ラット肝組織より単離された核酸試料を示す（実施例３を参照されたい）。Ｍ：マーカーλ／ＨｉｎｄIII（１００ｎｇ）；Ｄ：ラットゲノムＤＮＡ対照（４００ｎｇ）；Ｒ：ラット肝全ＲＮＡ対照（６００ｎｇ）。ゲノムＤＮＡについて、本方法およびＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭには、ウェルにつき２μｌを充填したが、AllPrep には、４μｌを充填した。全ＲＮＡについて、本方法および AllPrep には、ウェルにつき５μｌを充填したが、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭには３μｌを充填した。単離されたゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが、純粋であり且つ交差混入がほとんどないということは、それらゲル画像から明らかである。

【0090】

本発明者は、更に、単離された全ＲＮＡを、Agilent Bioanalyzer（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）を用いて分析した。再度、それら画像は、異なったプロトコルによる類似の結果を示している（図４）。

【0091】

精製されたゲノムＤＮＡの品質は、リアルタイムＰＣＲ検定で評価した。リアルタイムＰＣＲ反応は、１００ｎｇ／試料の精製ゲノムＤＮＡを用い、ＰｕＲｅＴａｑＲＥＡＤＹ−ＴＯ−ＧＯ^ＴＭＰＣＲビーズ（GE Healthcare, Piscataway, NJ）をＧＥＬＳＴＡＲ^ＴＭ染料（Cambrex, Baltimore, MD）の存在下で用い、ＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを用いて設定した。

【0092】

リアルタイムＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ鋳型を、水中２０ｎｇ／μｌに希釈する。

【0093】

【表4】

【0094】

増幅は、以下のこれらサイクリング条件にしたがって、ＡＢＩ７９００ＨＴ Fast Real-time ＰＣＲ System（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）で監視した。

【0095】

【表5】

【0096】

シグナルの量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅に相関する。シグナルが、バックグラウンド閾値より上に上昇する地点を、増幅のＣｔ値として定義する。調べられた試料は全て、極めて類似の増幅プロフィールを示す（図５）。

【0097】

同様に、全ＲＮＡを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。図６は、市販製品によるものを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、得られた増幅結果を示す。

【0098】

単離されたタンパク質を、クーマシー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。ＲＮＡカラムからのフロースルーを、修飾２−Ｄ Clean-Up Kit プロトコルを用いて処理した。沈殿したタンパク質を、５０μｌの５％ＳＤＳで再構成させた。各々のウェルに、５μｌの試料タンパク質を充填した。図７は、ＨｅＬａ細胞培養物より単離された全タンパク質が、本発明によるプロトコルと、市販製品（AllPrep）のものとの間で比較しうるということを示す。

【0099】

それらタンパク質試料を、更に、抗β−アクチン抗体でのウェスタンブロッティング実験を用いて分析し、そして市販製品と比較した。結果を、図８に示す。Ｍ：Full-Range Rainbow Molecular Weigt Markers（GE Healthcare）。レーン１〜２、６〜７および１０：２−Ｄ Clean-Up Kit での本プロトコルによるフロースルー。レーン３〜４および８〜９，AllPrep Protein ppt。レーン５，Macherey-Nagel Protein Pecipitator でのＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭフロースルー。ＨｅＬａ細胞より単離されたタンパク質には、ウェルにつき５μｇを用い、組織より単離されたタンパク質には、１０μｇを用いた（実施例３を参照されたい）。

【0100】

精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の分析は、作業の流れが、培養細胞について十分に作用するということを明らかに示している。
実施例３：組織試料からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離
本発明者は、作業の流れの性能について、ラット肝、脾臓および肺を含めたいろいろな組織源を調べた。本発明者は、更に、作業の流れを、市販製品、すなわち、AllPrep キットおよびＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭＲＮＡ／Protein キット（ＤＮＡ溶離緩衝液セット付加）と比較して調べた。多重試料を処理して、プロトコルの一貫性を評価した。製品の純度は、ＵＶ分光光度法でおよびゲル分析で測定した。得られたゲノムＤＮＡは、更に、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロッティング実験などの下流の用途において評価した。本発明者の結果は、上記のプロトコルが、組織試料について一貫して且つ十分に作用するということを示している。

【0101】

一例として、ここで、ラット肝からのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の単離についての詳細を与える。１０ｍｇのラット肝組織を、ＰＯＬＹＴＲＯＮ^ＴＭホモジナイザーを用いて均一化した。それら実験は、実施例２の場合と同様に設計する。簡単にいうと、３人の作業者が各々、上のまたは製造者からの同じプロトコルにしたがって、溶解産物のアリコートを処理する。各々のプロトコルにおいて任意の工程は行わなかった。ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡは、初日に単離した。タンパク質フロースルーは、その翌日に、２−Ｄ Clean-Up キット、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭProtein Pecipitator キットおよび AllPrep Protein Precipitation キットを含めた異なった方法で更に精製した。

【0102】

ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ単離結果は、上の表１に示されている。タンパク質単離結果は、上の表２に示されている。プロトコルが、一貫した高品質ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質を生じるということは理解されうる。

【0103】

ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの純度も、アガロースゲル分析によって調べた。図３は、単離されたゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ試料のゲル画像を示す（詳細は、実施例２を参照されたい）。単離されたゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが、純粋であり且つ交差混入がほとんどないということは、それらゲル画像から明らかである。本発明者は、更に、単離された全ＲＮＡを、Agilent Bioanalyzer を用いて分析した。再度、それら画像は、異なったプロトコルの間で類似の結果を示している（図９）。

【0104】

精製されたゲノムＤＮＡの品質は、リアルタイムＰＣＲ検定で評価した。リアルタイム反応は、実施例２のプロトコルにしたがって、１００ｎｇ／試料の精製ゲノムＤＮＡを用いて設定した。調べられた試料は全て、極めて類似の増幅プロフィールを示す（図１０）。同様に、全ＲＮＡを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。図１１は、市販製品によるものを含めた、試料の間で認められる極めて類似の増幅プロフィールを有する、得られた増幅結果を示す。

【0105】

単離されたタンパク質を、クーマシー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。本プロトコルによるタンパク質フロースルーを、異なった量のＺｎＳＯ_４またはＴＣＡを用いた沈殿を含めたいろいろな方法を用いて処理した。沈殿したタンパク質を、７００μｌの５％ＳＤＳで再構成させた。各々のウェルに、１０μｌの試料を充填した。図１２は、ラット肝より単離された全タンパク質のプロフィールが、異なった沈殿プロトコルの間で比較しうるということを示す。図１３は、本プロトコルによるタンパク質フロースルーを、２−Ｄ Clean-Up Kit、更には、Macherey-Nagel Protein Pecipitator キットを用いて更に精製することができるということを示す。収量は、市販の AllPrep キットまたはＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ^ＴＭキットの場合と同様である（図１３）。

【0106】

それらタンパク質試料を、更に、ウェスタンブロッティング実験を用いて分析し、そして市販製品と比較した（図８、詳細については、実施例２を参照されたい）。
精製されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の分析は、作業の流れが、組織試料について十分に作用するということを明らかに示している。

【0107】

実施例４：増加量の非イオン性洗剤は、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ双方の収量を改善する
実施例２および実施例３で詳しく説明されたように、２％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０を含む本発明者の標準溶解緩衝液は、十分に作用する。しかしながら、本発明者は、増加量の非イオン性洗剤が、第一の場合のシリカメンブランへのゲノムＤＮＡの結合を改善し、それによって、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ双方の回収率を増加させるということを発見した。したがって、実施例１を、溶解緩衝液中の５％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０で行った。増加した洗剤レベルでの追加の利点は、少なくとも一部分は、第一の場合のシリカメンブランへのゲノムＤＮＡの改善された結合ゆえの、単離された全ＲＮＡ中のゲノムＤＮＡ交差混入の減少である。

【0108】

本発明者は、多数の非イオン性洗剤（例えば、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０、ＮＰ−４０、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００^ＴＭ）はいずれも、この効果を達成しうるということを発見した。これら洗剤のいろいろな組合せも有効である。更に、この増加量の洗剤は、溶解溶液の一部分でありうると考えられる、またはそれは、シリカメンブランカラムへの試料の結合直前に加えうると考えられる。本発明者は、ここで、ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０およびＮＰ−４０の最適の組合せで得られた結果を与える。すなわち、溶解緩衝液中において、２％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０および５％ＮＰ−４０の組合せを、２％ＴＷＥＥＮ^ＴＭ２０の代わりに用いた。他の溶液およびプロトコルは、それら実施例の初めの部分に述べられたようにしたがったが、洗剤組合せおよびレベルのこの調整は、単離された全ＲＮＡ中のゲノムＤＮＡ混入を大きく減少させた。更に、ゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡ双方の収量も増加した。全タンパク質の単離は、溶解緩衝液中のこの洗剤レベル増加によって悪影響を受けなかった（デーは示されていない）。図１４は、１００万個の細胞各々のＨｅＬａ細胞試料によるゲル画像および収量結果を示す。図１５は、各々１０ｍｇのラット肝試料より得られたものを示す。

【0109】

実施例５：単離された全ＲＮＡは、高レベルの低分子ＲＮＡを含有する
単離された全ＲＮＡ中において、本発明者は、高濃度の低分子ＲＮＡ分子を認めた（図１４および図１５を参照されたい）。ここで、本発明者は、上のプロトコルより精製された全ＲＮＡ試料からの低分子ＲＮＡ（２００ｎｔ未満長さ）の豊富化および単離を示すデータを示し、そしてその単離された低分子ＲＮＡを、市販のマイクロＲＮＡ単離キットを用いて単離されたものと比較する。

【0110】

本発明者は、最初に、Qiagen 製の市販キット（ｍｉＲＮｅａｓｙ Mini Kit Qiagen, Cat＃２１７００４）を用いて、本発明によって単離された全ＲＮＡから低分子ＲＮＡを精製した。簡単にいうと、３０μｇの上で単離された全ＲＮＡ（１０ｍｇのラット肝組織より単離された全ＲＮＡの約３分の２に相当する）を用いて、市販キットのプロトコルにしたがって低分子ＲＮＡを精製した。対照として、更に、低分子ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ Mini Kit に与えられたプロトコルを用いて、１０ｍｇのラット肝組織より直接的に単離した。図１６は、それら結果を示す。レーン１、２、３は、本プロトコルにしたがって単離された全ＲＮＡより精製された低分子ＲＮＡである。Ｃと標識されたレーンは、ラット肝組織より直接的に単離された対照低分子ＲＮＡを示す。本発明者は、更に、単離された全ＲＮＡを別の対照（例えば、「投入」と標識されたレーン）として実験する。組織試料から直接的によりも多くの低分子ＲＮＡを、本方法にしたがって単離することができるということは明らかである。

【0111】

単離された低分子ＲＮＡが、マイクロＲＮＡを含有するということを確かめるために、本発明者は、いろいろなコピー数の４種類の異なったマイクロＲＮＡを用いてｑＲＴ−ＰＣＲ検定を行った。本発明者は、試料中の全４種類のマイクロＲＮＡを検出することに成功した（図１７）。したがって、本発明者は、商業的に入手可能なキットを用いて、本方法より精製された全ＲＮＡからマイクロＲＮＡを首尾よく単離した。

【0112】

本発明者は、更に、単離された全ＲＮＡ中の低分子ＲＮＡの存在および存在量に関して、本発明者のプロトコルを市販の製品と比較した。本発明者は、Qiagen 製の AllPrep および Norgen 製のＲＮＡ／ＤＮＡ／Protein 精製キットを選択している。双方とも、ゲノムＤＮＡ、全ＲＮＡおよびタンパク質の同時単離用に奨励される。本発明者は、これらキット並びに本発明者自身のプロトコルを用いて、全ＲＮＡを単離した。次に、本発明者は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Mini Kit を用いて、全ＲＮＡから低分子ＲＮＡを単離することを試みた。結果を、図１８に示す。低分子ＲＮＡは、下部パネル上に示され、「大型」ＲＮＡ（低分子ＲＮＡを奪われた全ＲＮＡ）は、上部パネル上である。本方法による全ＲＮＡ投入（ｃｍ）および AllPrep キット（Ｑ）を、対照として示す。本発明者は、本発明者のプロトコルを用いて単離された全ＲＮＡが、１０％を超える低分子ＲＮＡを含有し、他のキットより単離された全ＲＮＡが、３％未満の低分子ＲＮＡを含有すると予測している。

【0113】

本明細書中に挙げられている特許、特許公報および他の公開参考文献は全て、各々が本明細書中に個々に且つ具体的に援用されたかのように、本明細書中にそのまま援用される。本発明の好ましい代表的な態様を記載しているが、当業者は、本発明が、単に例示の目的であって且つ制限としてではなく与えられているそれら記載の態様以外で実施されうるということを理解するであろう。本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。

【図1】

【図12】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】