特許 5730211 ウイルスのアルギニン不活化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5730211

(24)【登録日】2015年4月17日

(45)【発行日】2015年6月3日

(54)【発明の名称】ウイルスのアルギニン不活化

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/06 20060101AFI20150514BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150514BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20150514BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20150514BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20150514BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/06

   A61K37/02

   A61K39/395 V

   A61P37/00

   A61K37/465

   A61P7/00

   A61K37/12

   A61K37/475

   A61K37/547

   A61K37/47

   A61K45/00

【請求項の数】36

【全頁数】47

(21)【出願番号】特願2011-537425(P2011-537425)

(86)(22)【出願日】2009年11月20日

(65)【公表番号】特表2012-509081(P2012-509081A)

(43)【公表日】2012年4月19日

(86)【国際出願番号】US2009006221

(87)【国際公開番号】WO2010059232

(87)【国際公開日】20100527

【審査請求日】2012年11月19日

(31)【優先権主張番号】61/116,534

(32)【優先日】2008年11月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398050098

【氏名又は名称】バイオジェン アイデック エムエー インコーポレイティド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100062409

【弁理士】

【氏名又は名称】安村 高明

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】セルビテリ， ケイス

(72)【発明者】

【氏名】マキュー， ジャスティン

【審査官】 上條 肇

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００７−０３９３９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３２８０３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２８８０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５１４６７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平０９−５０３２１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０１９５８６２６（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 Int J Pharm.，２００８年 ９月，Vol.366，p.99-102

【文献】 日本ウイルス学会学術集会，２００８年１０月，Vol.56，p.383

【文献】 山崎尚 他，ウイルスの熱不活化温度に対するアルギニンの効果，第56回日本ウイルス学会学術集会ポスターセッションポスター，２００８年１０月，2P076

【文献】 J Pharmaceut Sci，２００８年 ８月，Vol.97, No.8，p.3067-3073

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／０７ − ５／１０

Ｃ１２Ｎ ７／００ − ７／０８

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

エンベロープウイルスを不活化またはその感染力価を低減する方法であって、前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含み、前記接触は、０．１Ｍ〜１．０Ｍの濃度のアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液のｐＨは、６．０〜８．５であり、温度が２℃〜１８℃である、方法。

【請求項2】

治療用生物学的製剤を汚染するエンベロープウイルスを不活化またはその感染力価を低減する方法であって、前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含み、前記接触は、少なくとも０．１Ｍ〜１．０Ｍの濃度のアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液のｐＨは、６．０〜８．５であり、温度が２℃〜１８℃である、方法。

【請求項3】

前記ｐＨは、６．０〜８．５である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記アルギニンの濃度は、
ａ）０．１Ｍ、
ｂ）０．２Ｍ、
ｃ）０．３Ｍ、
ｄ）０．４Ｍ、
ｅ）０．５Ｍ、
ｆ）０．６Ｍ、
ｇ）０．７Ｍ、
ｈ）０．８Ｍ、
ｉ）０．９Ｍ、および
ｊ）１．０Ｍ、
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記ウイルスは、グリコール化合物をさらに含む前記溶液と接触される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記グリコール化合物は、５０％（容量に対する重量）以下の濃度で存在する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記グリコール化合物は、
ａ）プロピレングリコール、
ｂ）ポリプロピレングリコール、
ｃ）エチレングリコール、
ｄ）ポリエチレングリコール、
ｅ）ヘキシレングリコール、および
ｆ）ポリヘキシレングリコールからなる群から選択される、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

前記不活化または低減は、製剤精製工程の一部として実施される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項9】

前記不活化または低減は、細胞培養物採取手順中に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記不活化または低減は、細胞培養物清澄手順中に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の後で実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記不活化または低減は、１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の後であるが、別の１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記不活化または低減は、前記生物学的製剤の調製に使用される全てのクロマトグラフィー精製手順の後に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の前に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項16】

前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項17】

前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後、かつ限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項18】

前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項19】

前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の後に実施される、請求項８に記載の方法。

【請求項20】

前記治療用生物学的製剤は、組み換えタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項21】

前記治療用生物学的製剤は、自然に生じるかまたは組み換えの免疫グロブリンを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項22】

前記治療用生物学的製剤は、自然に生じるかまたは組み換えの血液凝固因子を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項23】

前記血液凝固因子は、
ａ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、
ｂ）フィブリン、
ｃ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、
ｄ）トロンビン、
ｅ）抗トロンビン、
ｆ）ＶＩＩａの組織因子補助因子（第ＩＩＩ因子）、
ｇ）プロテインＣ、
ｈ）プロテインＳ、
ｉ）プロテインＺ；
ｊ）プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤
ｋ）ヘパリン補因子ＩＩ、
ｌ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、
ｍ）第ＶＩＩ因子、
ｎ）第ＶＩＩＩ因子、
ｏ）第ＩＸ因子、
ｐ）第Ｘ因子、
ｑ）第ＸＩ因子、
ｒ）第ＸＩＩ因子、
ｓ）第ＸＩＩＩ因子、
ｔ）フォンビルブランド因子、
ｕ）プレカリクレイン、
ｖ）高分子キニノーゲン、
ｗ）プラスミノーゲン、
ｘ）プラスミン、
ｙ）組織プラスミノーゲン活性化因子、
ｚ）ウロキナーゼ、
ａａ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、および
ａｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記生物学的製剤は、真核細胞により産生される、請求項２に記載の方法。

【請求項25】

前記生物学的製剤は、哺乳類細胞によって産生される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記生物学的製剤は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記生物学的製剤は、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞によって産生される、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記生物学的製剤は、ヒト細胞によって産生される、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記アルギニンの濃度は、段階的勾配または連続勾配を使用して、０．１Ｍ〜１．０Ｍのアルギニンの最終濃度まで徐々に増加される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項30】

前記アルギニンの最終濃度は、１分当り約２０％以下の速度で、段階的勾配または連続勾配により増加される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記ｐＨは６．０〜８．５である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項32】

前記ｐＨは６．５〜８．０である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ｐＨは６．５〜７．５である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ｐＨは７．０〜８．０である、請求項３２に記載の方法。

【請求項35】

前記ｐＨは７．０〜７．５である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ｐＨは６．０、６．５、７．０、７．５、８．０および８．５からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ウイルスの不活化または感染ウイルス力価の低減に関する。より具体的には、本発明は、アルギニンまたはその塩を用いた処理による、感染ウイルス力価の不活化または低減に関する。本発明は、治療用製剤の調製および精製レジメンの構成要素としての感染ウイルス力価の不活化または低減にも関する。

【背景技術】

【0002】

組み換えＤＮＡ技術の出現は、多くのタンパク質を主体とする生物学的治療を可能にした。大半の状況において、これらのタンパク質治療薬は、細胞によって産生され、高度に精製され、患者へ投与するように調製される。多くの場合、治療用タンパク質をコードする組み換えＤＮＡを、タンパク質産生細胞の中に形質移入する必要がある。ウイルスは、形質移入後、培養物中に残留し、タンパク質試料を汚染し得る。加えて、関心のタンパク質の発現に使用される細胞は、それらのＤＮＡでウイルスゲノムをコードするか、または内因性ウイルスを含有し得、これは細胞由来の治療製剤への別の潜在的な汚染源である。したがって、生物学的に誘導された治療薬は、活性ウイルスが患者に投与されないことを確実にするために、ＦＤＡ等の規制機関の安全要件を満たすように、少なくとも２つの確実なウイルス精製ステップを経なければならない。

【0003】

ウイルスを不活化するためのいくつかの方法が、当該分野において知られている。低ｐＨでの処理、洗剤の使用、塩、および熱不活化の全てが、タンパク質調製物中のウイルスを不活化するために使用されているが、各方法にはそれぞれ欠点があり、以下にさらに詳細に説明されるように、いくつかのタンパク質に適切または最適ではない場合がある。

【0004】

特許文献１のように、ウイルスを不活化するために低ｐＨが使用されているが、これは、タンパク質を沈殿させ、製剤の凝集を生じ、かつ／または製剤の損失を引き起こし得る特定のタンパク質の立体構造を変更する可能性がある。

【0005】

特許文献２は、不安定タンパク質を含有する組成物中の脂質被覆ウイルスの不活化の方法を記載する。特許文献２に記載される方法は、不安定タンパク質を含有する組成物に脂質含有ウイルスを含まないようにさせるのに十分な時間、不安定タンパク質を含有する組成物を有効量のリン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルと接触させることからなる。

【0006】

特許文献３は、トリ−ｎ−リン酸ブチルおよびＴｗｅｅｎ、またはコール酸ナトリウム／ＴＮＢＰ（トリ−ｎ−リン酸ブチル）および他の緩衝剤、洗剤、ならびに／または界面活性剤の組み合わせを使用するウイルスの不活化の方法を記載するが、ショ糖等の高濃度の補助剤の使用を必要とし、および特定のタンパク質を変性し、製剤の損失をもたらす分解に導く可能性がある、５５℃〜６７℃の範囲の熱不活化も必要とする。

【0007】

ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）等の他の洗剤は、ウイルスを不活化するために使用されているが、工業規模で使用される際、大量の廃棄産物の問題が存在する。国際公開第ＷＯ９４／２６２８７号の例において、「洗剤／塩析」法が、トランスフェリン、抗トロンビンＩＩＩ、およびアルブミンの３つの単離されたタンパク質含有溶液に適用される。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００法が、標的タンパク質の収率が実質的に影響を受けないような条件下で適用される場合、しばしば、産物中のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）の濃度は、それでも非常に高い。特許文献４の実施例４において、発明者は、９５％のアルブミンを回収したが、２５０ｐｐｍのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００および３５ｐｐｍのＴＮＢＰを含む産物を得た。特に、医療調製物を産生する時、５０ｐｐｍを越える、またはたとえ１０ｐｐｍさえをも越えるＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００の濃度は、好ましくは避けられ、洗剤含有量をできるだけ低減することが、一般的に望ましい。加えて、いくつかの治療用タンパク質は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００によって不活化され、したがって、ウイルス不活化のこの方法は、多くのタンパク質製剤に最適ではない。

【0008】

したがって、当該分野において、タンパク質製剤の一体性、生物学的、および／または治療活性を維持しながら、感染ウイルス力価を安価にかつ安全に不活化または低減することが必要とされる。

【0009】

アルギニンは、実質的にタンパク質の立体構造を変更することなく、タンパク質凝集を阻害し、タンパク質相互作用を抑制することが判明しているという点で、自然に生じるアミノ酸の中で独特である。これらの属性を考えて、０．１Ｍから１Ｍのアルギニンが、封入体から可溶化した組み換えタンパク質の再折り畳みを促進するために使用され、０．５〜から２Ｍのアルギニンが、大腸菌の組み換え産物として発現される不溶性ペレット化材料から活性の折り畳まれたタンパク質を抽出するために使用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。アルギニンは、タンパク質Ａ、ゲル透過、および染色性クロマトグラフィー等の種々の種類のクロマトグラフィー媒体からのタンパク質の回収を強化するためにも使用されている（非特許文献４、非特許文献５）。アルギニンは、例えば、熱処理手順中にタンパク質が不活化されるのを保護するために、タンパク質安定化製剤の一構成要素としても使用されている（Ｍｉｙａｎｏら、特許文献５、１９９２年５月２６日発行）。

【0010】

Ｋｏｚｌｏｆｆらは、０．２Ｍアルギニンの使用が、いくつかのバクテリオファージのＴ偶数株の調製物（Ｔ２Ｌ、非エンベロープウイルス）を不可逆的に不活化したことを観察している。Ｋｏｚｌｏｆｆらは、このウイルスの特異的な不活化が、３０℃、かつ６．５から８．２５のｐＨ範囲で最も効果的であり、０．０３３から０．２Ｍのアルギニンで達成され得ることも発見した。しかしながら、Ｔ２Ｌのアルギニン不活化は、０．４Ｍを超える濃度で、徐々に効果がなくなった。Ｋｏｚｌｏｆｆらは、アルギニンが、バクテリオファージのＴ奇数株を不活化しなかったことも観察した。この相違は、おそらく、Ｔ偶数とＴ奇数のバクテリオファージの尾構造の相違によるものである（アルギニンは、おそらく、Ｔ偶数不活化をもたらすように特異的に相互作用する）。非特許文献６）。

【0011】

Ｙａｍａｓａｋｉらは、低（酸性）ｐＨおよび低温（試料は氷上）で、アルギニンが、エンベロープ単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）およびインフルエンザウイルスを不活化できることを観察している。しかしながら、より中性ｐＨレベル（すなわち、ｐＨ５．０からｐＨ７．０）で、Ｙａｍａｓａｋｉらは、アルギニンがこれらのウイルスの不活化に効果がないことを発見した。Ｙａｍａｓａｋｉらは、アルギニンが、非エンベロープ型ポリオウイルスの不活化に効果がないことも発見した（非特許文献７）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】米国特許第６，９５５，９１７号明細書

【特許文献2】欧州特許第０１３１７４０ Ｂ１号明細書

【特許文献3】米国特許第６，５２８，２４６ Ｂ２号明細書

【特許文献4】国際公開第９４／２６２８７号

【特許文献5】米国特許第５，１１６，９５０号明細書

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．，２０，１３０１−１３０８（２００４）

【非特許文献2】Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，４２，１−６ （２００５）

【非特許文献3】Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２７，１−８（２００８）

【非特許文献4】Ａｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，５４，１１０−１１６（２００７）

【非特許文献5】Ｅｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４５，２５０−２５７（２００５）

【非特許文献6】Ｋｏｚｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｖｉｒｏｌ．，３（２），２１７−２２７（１９６９

【非特許文献7】Ｙａｍａｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｊａｎ．１０，２００８）９７（８），３０６７−３０７３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、モノクローナル抗体または他の治療用タンパク質等の、生物学的製剤の産生中に存在する場合がある脂質被覆（エンベロープ）ウイルスを不活化またはその感染力価を効果的に低減する、高濃度のアルギニンの使用を可能にする。

【0015】

一実施形態において、ウイルス不活化または感染ウイルス力価の低減は、中性（ｐＨ約７）環境で生じる。

【0016】

他の実施形態において、ウイルス不活化または感染ウイルス力価の低減は２℃から４２℃の範囲の温度で生じる。

【0017】

一実施形態において、本発明は、生存対象への投与に適した程度に、好ましくは、治療的に有用な化合物として精製されるタンパク質調製物を得る工程における、構成要素を提供する。例えば、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フィブリノーゲン、γグロブリン、抗体、および抗体断片等の治療的に有用なタンパク質の調製における工程の一部として使用されてもよいが、これに限定されない。また、例えば、本発明は、哺乳類または鳥類の白血病ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルス、およびレオウイルス等のエンベロープウイルスを不活化、または感染ウイルス力価を低減するために使用されてもよいが、これに限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】０．１０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００によるＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。

【図2】０．２０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００によるＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。

【図3】ｐＨ３．７でのＦｃγ−Ｆｃε（ＢＩＩＢ−０１６）のＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。開始時点（ｔ＝０分）のウイルス力価は、ウイルス対照から得た。

【図4】ｐＨ３．９でのＦｃγ−Ｆｃε（ＢＩＩＢ−０１６）のＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。開始時点（ｔ＝０分）のウイルス力価は、ウイルス対照から得た。

【図5】１Ｍアルギニンの中性ｐＨでのＦｃγ−Ｆｃε（ＢＩＩＢ−０１６）のＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。ＬＣ０＝負荷対照（時間０）。

【図6】Ｆｃγ−Ｆｃεを伴う１Ｍアルギニンの中性ｐＨでのＦｃγ−Ｆｃε（ＢＩＩＢ−０１６）のＸ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。ＬＣ０＝負荷対照（時間０）。

【図7】（ａ）０．１Ｍアルギニン、（ｂ）０．５Ｍアルギニン、および（ｃ）１．０Ｍアルギニン含有５ｍＭトリス（ｐＨ７．０）緩衝剤を使用した、Ｘ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。

【図8】１．０Ｍアルギニン緩衝剤を使用した、ＳｕＨＶ−１不活化の動態を示す。

【図9】１．０Ｍアルギニン緩衝剤を使用した、ＭＭＶ不活化の動態を示す。

【図10】１．０Ｍアルギニン緩衝剤および５０％プロピレングリコールを使用した、Ｘ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。

【図11】１．０Ｍアルギニン緩衝剤および５０％プロピレングリコールを使用した、ＳｕＨＶ１不活化の動態を示す。

【図12】１．０Ｍグリシン緩衝剤を使用した、Ｘ−ＭＬＶ不活化の動態を示す。

【図13】タンパク質の精製およびウイルスのアルギニン不活化についての工程フローチャートを示す。

【図14】対照溶液と比較した、低ｐＨ（３．７）または高アルギニン濃度（１．０Ｍ）で、２４時間のインキュベート期間にわたり残存したＧＥ２タンパク質モノマーのパーセンテージを示す。

【図15】対照溶液と比較した、低ｐＨ（３．７）または高アルギニン濃度（１．０Ｍ）で、２４時間のインキュベート期間にわたり残存したＬｉｎｇｏタンパク質モノマーのパーセンテージを示す。

【図16】対照溶液と比較した、低ｐＨ（３．７）または高アルギニン濃度（１．０Ｍ）で、ＧＥ２タンパク質の２４時間のインキュベート期間にわたる高分子量タンパク質の凝集を示す。矢印は、高分子量種の形成を指す。

【図17】制御されたアルギニンの滴下添加と比較した、０．５Ｍまたは１．０Ｍの最終濃度までアルギニンをボーラス添加した後の、２４時間のインキュベート期間にわたり残存したＦＩＸタンパク質モノマーのパーセンテージを示す。

【発明を実施するための形態】

【0019】

定義
用語は、本明細書で別途特に明示的に定義または記載されない限り、関連分野において一般的に使用され、理解されるように、本明細書および特許請求の範囲において使用される。当該分野内で使用される、および／または許容される用語において、２つ以上の定義が存在する場合、本明細書において使用される用語の定義は、明示的にそれとは反対に記載されない限り、そのような全ての意味を包含するものとする。

【0020】

本明細書に使用される、「洗浄溶液」という用語は、標的タンパク質、および分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他のクロマトグラフィー媒体等の固定相培養物からの工程関連不純物等の、汚染物を分離するために使用される溶液を指す。塩に加え、洗浄溶液は、緩衝剤、洗剤、溶媒、重合体、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において洗浄溶液は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、または３．０Ｍアルギニンもしくはその塩を含んでもよい。

【0021】

「緩衝剤」という用語は、その酸−塩基共役構成要素の作用により、ｐＨの変化に耐える溶液を指す。

【0022】

「溶出試薬」という用語は、ＳＥＣ、ＩＥＣ、アフィニティーまたは他のクロマトグラフィー媒体等の固定相培養物から治療用タンパク質を溶出、または解離するために使用される試薬を指す。アルギニンに加え、溶出溶液は、緩衝剤、塩、洗剤、溶媒、重合体、グリコール化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。

【0023】

本発明の方法に有用な「グリコール」の例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本明細書に使用される、「工程関連不純物」という用語は、産生、単離、および／または精製の工程から、またはそれらの工程中に生じる、ウイルス、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、非標的タンパク質（宿主細胞タンパク質、ＨＣＰ等）、他の細胞構成要素（脂質および糖脂質等）、および任意の他の汚染物等の、生物学的調製物中の任意の望ましくない構成要素を指す。

【0025】

「組み換え的に産生された」という用語は、タンパク質に関して使用される時、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生されたそのタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、組み換え的に産生されたタンパク質は、哺乳類細胞により産生される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。他の実施形態において、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞等の、ヒト以外の細胞である。細胞の種類は、本発明の方法に従う組み換えタンパク質を産生するための、任意の適切な細胞であり得る。

【0026】

本明細書に使用される、「融合タンパク質」という用語は、「Ｆｃ融合」タンパク質等のポリペプチドに関して使用される時、個別の遺伝子（遺伝子が、同じ、または異なる種の生物で生じるかどうかに関わらず）によりコードされるタンパク質の一部分等の、２つ以上の異種ポリペプチドに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指すか、または融合タンパク質は、人工的もしくは非天然に生じるペプチドまたはポリペプチドと共有結合的に連結される自然に生じる遺伝子（またはその誘導体もしくは変形）の一部分を含むポリペプチドを指す。

【0027】

本明細書に使用される、「不活化する」またはこの単語の他の形態（例えば、不活化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、不活化された（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）、不活化する（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｓ）等）は、ウイルスに関して使用される時、完全なウイルスの不活化（すなわち、検出可能な感染ウイルスがない）だけでなく、検出可能な感染ウイルス力価を低減させること、またはその減少（すなわち、検出可能な感染ウイルスを低下させること、もしくはその低下されたレベル）を表すものとする。したがって、感染ウイルス力価を低減させること、またはその減少は、そのような低減させること、または減少が、本明細書において明示的に記載されているかどうかに関わらず、「ウイルス不活化」（およびこの用語の他の形態）の意味内に含まれる。

【0028】

「治療用タンパク質」調製物とは、組み換えタンパク質または非組み換えタンパク質を含んでもよい。非組み換えタンパク質の例としては、全血、血漿、血漿濃縮、血漿の任意の画分からの沈殿物、血漿の任意の画分からの上澄み、血清、寒冷沈降物、細胞可溶化物、または類似の供給源から単離されたタンパク質が挙げられる。

【0029】

本発明に従って調製された治療用タンパク質は、いかなる治療的に有用なペプチド、ポリペプチド、糖ペプチド、またはタンパク質をも含む。

【0030】

「Ｆｃ領域」という用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す。特定の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を指す。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界は、わずかに変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、天然ポリペプチドの位置Ｃｙｓ^２２６のアミノ酸残基からカルボキシル末端にわたると定義される。

【0031】

本明細書に使用される、「質量濃度」という用語は、工程関連不純物の除去に関して使用される時、治療用タンパク質の質量に対する工程関連不純物の質量の比率を指す。例えば、比率は、質量濃度が百万分率（ｐｐｍ）である時、１ミリグラムの治療用タンパク質当りナノグラム単位の工程関連不純物として計算されてもよく、比率は、質量濃度が十億分率（ｐｐｂ）である時、１ミリグラムの治療用タンパク質当りピコグラム単位の工程関連不純物として計算されてもよい。

【0032】

本明細書に使用される、「回収パーセント」および「純度パーセント」という用語は、精製ステップまたは手順前の試料中の標的化合物の量または純度と比較して、標的化合物（例えば、タンパク質）が、精製ステップまたは手順を通して媒介される時に達成される回収率または純度を意味するものとする。試料が精製ステップまたは手順の前と後に比較される時、純度パーセントにおける増加の達成は、減少レベルの汚染物（標的化合物に比例して）を含む産物を得ることを伴う。上に定義される回復パーセントおよび純度パーセントの意味範囲に含まれる好適なパーセンテージは、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％を含むが、これらに限定されない。

【0033】

「ａ」または「ａｎ」という用語は、用語の単数形および複数形の両方を指し、例えば、「治療用タンパク質（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、１つ以上の治療タンパク質を表すように理解されることに留意する。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。

【0034】

いくつかの実施形態において、本発明は、ウイルスを、少なくとも約０．２Ｍアルギニンを含む溶液と接触させることを含む、ウイルスを不活化する方法を提供し、該溶液は、約５．０を超えるｐＨであり、ウイルスは、バクテリオファージまたは他の非エンベロープウイルスではない。

【0035】

いくつかの実施形態において、本発明は、治療用タンパク質調製物を、少なくとも約０．２Ｍアルギニンの最終濃度、および約５．０を超えるｐＨを有する溶液に曝露することを含み、該ウイルスは、バクテリオファージまたは他の非エンベロープウイルスではない、治療用タンパク質調製物中の感染ウイルスの力価を低減する方法に関する。

【0036】

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、組み換えタンパク質である。他の実施形態において、組み換えタンパク質は、免疫グロブリン（抗体）またはその断片であってもよい。また他の実施形態において、タンパク質調製物は、血液凝固因子を含んでもよい。

【0037】

本発明の血液凝固因子は、第Ｉ因子（フィブリノーゲン）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）、組織因子、第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子（安定因子）、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）、第ＩＸ因子（クリスマス病因子）、第Ｘ因子（スチュワート−プロワー因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆体）、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンウィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ１）、およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤２（ＰＡＩ２）等の血液凝固因子であり得るが、これらに限定されない。

【0038】

いくつかの実施形態において、本発明の方法により調製される治療用タンパク質は、真核細胞により産生される。いくつかの実施形態において、本発明の真核細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態において、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。また別の実施形態において、哺乳類細胞は、ヒト細胞である。他の実施形態において、細胞は、（２つ以上の細胞）が一緒に縮合した多ハイブリッド（例えば、マウス、ヒトハイブリドーマ細胞）である。

【0039】

本発明のアルギニンのウイルス不活化方法は、任意の精製手順（例えば、クロマトグラフィー手順）の前、１つ以上の精製手順中またはその間、および／または全ての精製手順後に実施されてもよい。

【0040】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法により産生されたタンパク質を含む。

【0041】

本発明のクロマトグラフィーステップは、任意の種類のクロマトグラフィー法を利用してもよい。例えば、このような方法は制限されないが、このようなクロマトグラフィー法は、例えば、気体クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡまたは抗体−抗原アフィニティークロマトグラフィー等）、超臨界液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー等）、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二次元クロマトグラフィー、疑似移動床式クロマトグラフィー、熱分解気体クロマトグラフィー、高速タンパク質（ＦＰＬＣ）クロマトグラフィー、向流クロマトグラフィー、キラルクロマトグラフィー、水性順相（ＡＮＰ）クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、および偽性アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。

【0042】

本発明のアルギニン不活化ステップに使用されるｐＨの範囲は、５．０を超えるかもしくは約５．０、５．５を超えるかもしくは約５．５、６．０を超えるかもしくは約６．０、６．５を超えるかもしくは約６．５、７．０を超えるかもしくは約７．０、８．０を超えるかもしくは約８．０、または９．０を超えるかまたは約９．０であり得る。いくつかの実施形態において、アルギニン不活化ステップは、約５．０から約９．０の範囲のｐＨで実行される。他の実施形態において、ｐＨの範囲は、約６．０から約８．５である。他の実施形態において、ｐＨの範囲は、約６．５から約７．５である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約７．０である。

【0043】

いくつかの実施形態において、アルギニンの濃度は、約０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、２．５Ｍ、または約３Ｍである。いくつかの実施形態において、本発明のウイルス不活化方法は、約０．２Ｍ〜約３Ｍのアルギニン濃度で行われる。いくつかの実施形態において、アルギニン濃度は、約０．５Ｍ〜約３Ｍの範囲内である。他の実施形態において、アルギニン濃度は、約１Ｍ〜約３Ｍの範囲内である。また他の実施形態において、アルギニン濃度は、約１Ｍ〜約２Ｍの範囲内である。

【0044】

本明細書に使用される、「アルギニン」とは、アルギニンおよびその塩を指すことを理解する。

【0045】

いくつかの実施形態において、アルギニンの使用を介したウイルス不活化は、約０℃〜約５５℃の温度で実行され、例えば、約０℃から約４℃、約０℃から８℃、約０℃から約１２℃、約０℃から約１８℃、約０℃から約２０℃、約０℃から約２５℃、約０℃から約３７℃、約０℃から約４０℃、約０℃から約４２℃、約２℃から約４℃、約２℃から約８℃、約２℃から約１２℃、約２℃から約１８℃、約２℃から約２０℃、約２℃から約２５℃、約２℃から約３７℃、約２℃から約４０℃、約２℃から約４２℃、約２℃から約５５℃、約４℃から約８℃、約４℃から約１２℃、約４℃から約１８℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約２５℃、約４℃から約３７℃、約４℃から約４０℃、約４℃から約４２℃、約４℃から約５５℃、約８℃から約１２℃、約８℃から約１８℃、約８℃から約２０℃、約８℃から約２５℃、約８℃から約３７℃、約８℃から約４０℃、約８℃から約４２℃、約８℃から約５５℃、約１２℃から約１８℃、約１２℃から約２０℃、約１２℃から約２５℃、約１２℃から約３７℃、約１２℃から約４０℃、約１２℃から約４２℃、約１２℃から約５５℃、約１８℃から約２０℃、約１８℃から約２５℃、約１８℃から約３７℃、約１８℃から約４０℃、約１８℃から約４２℃、約１８℃から約５５℃、約２０℃から約２５℃、約２０℃から約３７℃、約２０℃から約４０℃、約２０℃から約４２℃、約２０℃から約５５℃、約２５℃から約３７℃、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約４２℃、約２５℃から約５５℃、約３７℃から約４０℃、約３７℃から約４２℃、約３７℃から約５５℃、約４０℃から約４２℃、約４０℃から約５５℃、および約４２℃から約５５℃の温度範囲を含む。

【0046】

いくつかの実施形態において、アルギニンの使用を介したウイルス不活化は、０℃から５５℃の温度で実行され、例えば、０から４℃、０から８℃、０から１２℃、０から１８℃、０から２０℃、０から２５℃、０から３７℃、０から４０℃、０から４２℃、２から４℃、２から８℃、２から１２℃、２から１８℃、２から２０℃、２から２５℃、２から３７℃、２から４０℃、２から４２℃、２から５５℃、４から８℃、４から１２℃、４から１８℃、４から２０℃、４から２５℃、４から３７℃、４から４０℃、４から４２℃、４から５５℃、８から１２℃、８から１８℃、８から２０℃、８から２５℃、８から３７℃、８から４０℃、８から４２℃、８から５５℃、１２から１８℃、１２から２０℃、１２から２５℃、１２から３７℃、１２から４０℃、１２から４２℃、１２から５５℃、１８から２０℃、１８から２５℃、１８から３７℃、１８から４０℃、１８から４２℃、１８から５５℃、２０から２５℃、２０から３７℃、２０から４０℃、２０から４２℃、２０から５５℃、２５から３７℃、２５から４０℃、２５から４２℃、２５から５５℃、３７から４０℃、３７から４２℃、３７から５５℃、４０から４２℃、４０から５５℃、および４２から５５℃の温度範囲を含む。

【0047】

本発明は、ウイルス不活化が、治療製剤または治療製剤を含有する組成物をアルギニンと接触させることにより達成される、治療製剤（または薬物原料）調製レジメンの構成要素としての、ウイルスの不活化を含む。一実施形態において、ウイルスは、溶液中で、約０．１Ｍ以上の最終アルギニン濃度と接触される。特定の実施形態において、最終アルギニン濃度は、約０．５Ｍ以上、または約１．０Ｍ以上である。特定の実施形態において、ウイルス不活化は、溶液が、中性（約ｐＨ７）または中性に近い（約ｐＨ６から約ｐＨ８．５）ｐＨ値である、アルギニンを有する溶液中で達成される。特定の実施形態において、中性または中性に近いｐＨ値は、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、および約８．５である。一実施形態において、アルギニンによるウイルス不活化は、任意の前治療製剤精製ステップまたは手順前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、細胞培養物採取手順の一部として実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、細胞培養物採取手順後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、細胞培養物上澄み清澄手順の一部として実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、細胞培養物上澄み清澄手順後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、前治療製剤精製ステップまたは手順中（その一部として）、またはその間に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、１つ以上の治療産物精製ステップまたは手順後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、クロマトグラフィーの使用を含む、１つ以上の治療製剤精製ステップ後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー（またはプロテインＡまたはプロテインＧ誘導体もしくは類似体を伴うクロマトグラフィー）等の、アフィニティークロマトグラフィーの使用を含む、１つ以上の治療製剤精製ステップ後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、クロマトグラフィー精製ステップまたは手順の間に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、ウイルス濾過ステップまたは手順前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、ウイルス濾過ステップまたは手順後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、クロマトグラフィー精製ステップまたは手順後、およびウイルス濾過ステップまたは手順前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、限外濾過もしくは透析濾過ステップまたは手順前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、限外濾過もしくは透析濾過ステップまたは手順後に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、ウイルス濾過ステップまたは手順後、および限外濾過もしくは透析濾過ステップまたは手順前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、全ての治療製剤精製ステップもしくは手順後、および最終治療製剤調合前に実施される。一実施形態において、ウイルス不活化は、最終治療製剤調合工程の一部として実施される。

【0048】

本発明の方法は、広範なエンベロープウイルスを不活化するために有用である。本発明の実施形態により不活化されてもよいウイルスは、エンベロープウイルスに分類される、例えば、哺乳類もしくは鳥類の白血病ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、肝炎ウイルス、レトロウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルス、およびレオウイルス等を含むが、これらに限定されない。「ウイルス」および「ウイルス粒子」という用語は、本明細書に互換的に使用される場合がある。

【実施例】

【0049】

実施例
以下のデータは、アルギニンへの曝露による、種々のエンベロープウイルスの不活化を実証する。比較目的のため、以下のデータは、低ｐＨおよび洗剤ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）への曝露によるウイルスの不活化も示す。また、比較のため、以下のデータは、高濃度のアミノ酸グリシンへの曝露による、ウイルス非活性化を示す。試験が行われた代表的なウイルスとしては、
ａ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（組み換えタンパク質を産生するために通常使用される細胞株）の細胞培養採取物中に存在する可能性がある、モデル内因性レトロウイルス（エンベロープ、ＲＮＡゲノムウイルス）である、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭＬＶ）、
ｂ）タンパク質産生／処理中に導入される可能性があるモデル外来ウイルス（非エンベロープ、ＤＮＡゲノム）としてのマウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、および
ｃ）物理的／化学的不活化に中程度の耐性を有するウイルスを含有するモデルエンベロープＤＮＡとしてのブタヘルペスウイルス１型（ＳｕＨＶ−１）が挙げられる。
表１５を参照のこと。

【0050】

実施例１
組み換え抗体ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεの調製試料におけるＸ−ＭＬＶのＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、低ｐＨ、およびアルギニン不活化
低ｐＨ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、およびアルギニンへの曝露により得られたウイルス不活化動態を、組み換え抗体指定されたＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεの試料工程中間体を使用して試験した。これらの不活化試験に使用された工程中間体を表１に示す。全ての試験は、２℃から８℃で実施した。

【0051】

ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００不活化試験において、０．１０％（ｖ／ｖ）および０．２０％（ｖ／ｖ）の濃度で、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００をＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃε清澄条件培地（ＣＣＭ）に添加した。低ｐＨウイルス不活化試験の開始材料として、ｐＨを３．７または３．９に調節した、ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεを含有するＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）プロテインＡクロマトグラフィー溶出物を使用した。追加の不活化試験の工程中間体として、中和されたＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標）溶出緩衝剤（１．０Ｍアルギニン−ＨＣｌ、約５ｍＭトリス、ｐＨ７．３（＋／−）０．５）およびＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεを含有する中和されたＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標）溶出緩衝剤も使用した。これらの試験に使用された工程中間体は、検証条件下で安定することが知られている。

【0052】

【表1】

Ａ） ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００ Ｘ−ＭＬＶ不活化実験
ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００不活化実験は、０．１０％または０．２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００含有ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃε清澄条件培地を使用して二重に実施された。表２は、これらの試験で実施された４つの実験のパラメータを示す。

【0053】

【表2】

ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００不活化試験のウイルスクリアランス結果の概要を表３および表４に示す。表３および表４は、種々の時間点でのＸ−ＭＬＶ減少係数（ＲＦ）を要約し、一方、表１３は、１２０分間、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００に曝露した後の、４つの実行のＲＦ値を要約する。図１および図２は、それぞれ、０．１０％および０．２０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００追加に対する、時間の関数としてのＸ−ＭＬＶ力価を示す。

【0054】

０．１０％および０．２０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００不活化試験の両方において、Ｘ−ＭＬＶは、５分間の洗剤への曝露後、検出限界以下であり、Ｘ−ＭＬＶの急速な不活化を示す（図１および図２）。０．１０％および０．２０％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００のＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃε清澄条件培地への添加により、Ｘ−ＭＬＶに対して、３．１以上および２．６以上の減少係数が、それぞれ達成された。これらの試験の結果は、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００が、ＧＥ２−Ｆｃγ−ＦｃεＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標）工程試料中のＸ−ＭＬＶを効果的に不活化するのに０．１０％以上の濃度で使用され得ることを示した。

【0055】

【表3】

【0056】

【表4】

Ｂ）低ｐＨ Ｘ−ＭＬＶ不活化実験
表５は、低ｐＨウイルス不活化試験のパラメータを示す。実験は、二重に実施された。

【0057】

【表5】

低ｐＨ試験において、ウイルス不活化データの要約を表６および表７に示す。表６および表７は、種々の時間点でのＸ−ＭＬＶ減少係数（ＲＦ）を要約し、一方、表１３は、１２０分間、低ｐＨ条件に曝露した後のＲＦ値を要約する。図３および図４は、それぞれ、ｐＨ３．７およびｐＨ３．９におけるＸ−ＭＬＶの不活化動態を示す。

【0058】

これらの低ｐＨ不活化試験において、負荷対照試料および保留対照試料（中性で保持）におけるＸ−ＭＬＶが不活化されたことに留意することが重要である。ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（登録商標）溶出物におけるアルギニンの存在が、中性の負荷対照および保留対照の不活化に関与した可能性がある。したがって、ウイルス対照試料を、これらの試験において、減少係数を計算するために使用した。中和状態にあるウイルス対照であるＰＧ−４検定培地（アルギニンなし）は、試験の時間経過中、いかなる有意な不活化をも示さなかった。

【0059】

ｐＨ３．７で、Ｘ−ＭＬＶは、５分の曝露後、有意に不活化され、４５分後、両方の実行において、検出可能レベル以下であった（表６、図３）。Ｘ−ＭＬＶは、いくつかの時間点のｐＨ３．７で、実行のうちの１つにおいて検出可能であったが（実行＃５）、５分以上の全ての時間点において検出以下であった、二重実行（実行＃６）の検定変動範囲内（＜１Ｌｏｇ_１０）であった。

【0060】

Ｘ−ＭＬＶが、二重実行の両方において、５分の曝露後に検出以下であるという同様の結果が、３．９の高いｐＨで得られた（表７および図４）。

【0061】

保留対照および負荷対照におけるＸ−ＭＬＶ不活化の結果により、低ｐＨ条件が、観察されたウイルス不活化に関与したかどうかは、分からなかった。１Ｍアルギニンの存在が、低ｐＨ試験中、Ｘ−ＭＬＶ不活化にも寄与した可能性がある。

【0062】

【表6】

【0063】

【表7】

Ｃ）アルギニンのＸ−ＭＬＶ不活化実験
アルギニン（中性ｐＨ）の存在下でのＸ−ＭＬＶの不活化を、ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεを用いて、および用いずに検証した。表８は、この実施例のアルギニン不活化実験のいくつかのパラメータを示す。実験は、二重に実施された。負荷対照および保留対照試験に使用された緩衝剤は、アルギニン（約５ｍＭトリス、ｐＨ７．０）を含有しなかった。

【0064】

【表8】

表１１および表１２は、種々の時間点でのＸ−ＭＬＶ減少係数（ＲＦ）を要約し、一方、表１３は、１２０分後の４つの実行のＲＦ値を要約する。図５および図６は、それぞれ、ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεの不在下および存在下における、Ｘ−ＭＬＶ含有１Ｍアルギニン緩衝剤の不活化動態を示す。この試験において、Ｘ−ＭＬＶは、１Ｍアルギニンを含有する中性溶液中で１５分後、検出可能レベル、またはそれ以下であった。しかしながら、ウイルスの検出可能なレベルが、５分間の曝露後、全ての試験において存在した（実行９〜１２）。アルギニン試験のＸ−ＭＬＶ不活化動態は、低ｐＨ試験中に測定された不活化動態と比較して、わずかに遅かった。しかしながら、両方の試験において、Ｘ−ＭＬＶレベルは、３０分の曝露後、検出、またはそれ以下であった。

【0065】

同様の不活化動態が、アルギニン緩衝剤中のＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεの存在下、および不在下で達成された（図５および図６）。結果は、ＧＥ２−Ｆｃγ−Ｆｃεが、試験中、Ｘ−ＭＬＶ不活化に影響を及ぼさなかったことを示す。アルギニンを含有しなかった負荷対照試料および保留対照試料が、１２０分間隔にわたっていかなるＸ−ＭＬＶ不活化も示さなかったことに留意することが重要である。Ｘ−ＭＬＶの見かけ上の不活化は、緩衝溶液中のアルギニンの存在によるものであった。４．１以上のＸ−ＭＬＶ減少係数が、１２０分の曝露後の全てのアルギニン試験で達成された（表１３）。

【0066】

【表9】

【0067】

【表10】

【0068】

【表11】

【0069】

【表12】

【0070】

【表13】

実施例２
Ｘ−ＭＬＶ、ＳｕＨＶ−１およびＭＭＶを用いたアルギニンおよびグリシンのウイルス不活化試験
アルギニンのウイルス不活化動態をさらに特徴付け、アルギニンによって不活化されるウイルスを同定するために、中性ｐＨの高濃度の２つのアミノ酸（アルギニンおよびグリシン）の存在下で、３つのウイルス（Ｘ−ＭＬＶ、ＳｕＨＶ−１、およびＭＭＶ）を試験した。全ての試験は、２℃〜８℃で実施された。これらの試験の実験パラメータを表１４に示す。各実験を二重に実施した。

【0071】

【表14】

哺乳類細胞培養物で一般的に認められる内因性レトロウイルスの代表として、この試験にＸ−ＭＬＶをモデルレトロウイルスとして選択した。この試験に選択された追加のモデルウイルスは、広範なウイルス特徴を含む。評価されたウイルスは、異種指向性マウス白血病ウイルスＸ−（ＭＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＭＶ）、およびブタヘルペスウイルス１（ＳｕＨＶ−１）であった（表１５）。

【0072】

【表15】

Ａ）０．１Ｍアルギニン存在下のＸ−ＭＬＶ
０．１Ｍアルギニン（ｐＨ７．０）の存在下において（表１４）、ウイルス力価レベルが、評価時間にわたり有意に変化したかったため、Ｘ−ＭＬＶ不活化は、二重実行において、１２０分の曝露後、生じなかった（表１６、図７）。Ｘ−ＭＬＶ不活化動態のプロットを図７に示す。試験の結果は、中性ｐＨ（７．０）での０．１Ｍアルギニンの存在は、１２０分保持によりＸ−ＭＬＶを効果的に不活化するのに十分な濃度ではなかったことを示した。

【0073】

【表16】

Ｂ）０．５Ｍアルギニン存在下のＸ−ＭＬＶ
０．５Ｍアルギニン（ｐＨ７．０）の存在下において（表１４）、Ｘ−ＭＬＶウイルス力価は、１２０分の曝露時間にわたり減少した（表１７）。Ｘ−ＭＬＶ不活化動態のプロットを図７に示す。Ｘ−ＭＬＶの３．４および３．５の減少係数が、１２０分の曝露後の２つの実行で達成された。ウイルス力価は減少したが、検出レベルが、１２０分の曝露後に存在し、これは、ある程度の不活化が、０．５Ｍアルギニンの存在下で生じたことを示す。

【0074】

【表17】

Ｃ）１．０Ｍアルギニンの存在下のＳｕＨＶ−１
１．０Ｍアルギニン（ｐＨ７．０）の存在下において（表１４）、ＳｕＨＶ−１ウイルス力価は、二重実行において、３０分の曝露後、検出の検定限界以下であった（表１８）。ＳｕＨＶ−１不活化動態のプロットを図８に示す。ＳｕＨＶ−１の３．６８以上および３．４３以上の減少係数が、２４０分の曝露後の２つの実行で達成された。試験の結果は、中性ｐＨ（７．０）での、高濃度のアルギニン（１．０Ｍ）の存在が、比較的速い動態でＳｕＨＶ−１ウイルスを効果的に不活化するのに十分であったことを示した。

【0075】

【表18】

Ｄ）１．０Ｍアルギニンの存在下のＭＭＶ
ＭＭＶは、４時間にわたる１．０Ｍアルギニンの存在下（表１４）で不活化されなかった（表１９）。工程の経過にわたる種々の時間点で測定されたＭＭＶ力価は、負荷対照および保留対照と同様のレベルであった（図９）。結果は、非エンベロープウイルスであるＭＭＶが、ｐＨ７．０の１．０Ｍアルギニンの存在下で不活化されなかったことを示す。

【0076】

【表19】

Ｅ）１．０Ｍアルギニンおよび５０％プロピレングリコールの存在下のＸ−ＭＬＶ
１．０Ｍアルギニン（ｐＨ７．０）および５０％プロピレングリコール（表１４）の存在下において、Ｘ−ＭＬＶ力価は、二重実行において、２４０分の曝露後、検出の検定限界以下であった（表２０）。比較的遅いが安定した不活化が、工程中生じた（図１０）。Ｘ−ＭＬＶの１．８０以上および２．０５以上の減少係数（ＲＦ）が、２４０分の曝露後の２つの実行で達成された。ウイルス力価における相違が、負荷対照と保留対照の間で１．０ログ_１０超であったため、ＲＦ値は、保留対照試料からの入力ウイルス力価を使用して計算されたことに留意する。５０％プロピレングリコールの存在は、１．０Ｍアルギニンのみを含有する緩衝剤と比較して、ウイルス不活化の速度を遅延した可能性がある。

【0077】

【表20】

Ｆ）１．０Ｍアルギニンおよび５０％プロピレングリコールの存在下のＳｕＨＶ−１
１．０Ｍアルギニン（ｐＨ７．０）および５０％プロピレングリコール（表１４）の存在下において、ウイルスレベルが、１５分の曝露後に検出以下であったので、ＳｕＨＶ−１は、迅速に不活化された。保留対照におけるウイルス力価も検出以下であったため、プロピレングリコールの存在が不活化工程に起因した可能性があることに留意することが重要である。ＳｕＨＶ−１の２．５５以上の減少係数（ＲＦ）が、ＲＦ計算で負荷対照を使用して、２つの実行で達成された。保留対照のウイルス力価が検出以下であったため、ＲＦを計算するために、負荷対照が使用された。不活化動態のプロットを図１１に示す。

【0078】

【表21】

Ｇ）１．０Ｍグリシンの存在下のＸＭＬＶ
Ｘ−ＭＬＶは、１．０Ｍグリシンの存在下で不活化されなかった（表２２、図１２）。結果は、高濃度のグリシンが、エンベロープウイルス（Ｘ−ＭＬＶ等）の不活化に効果的ではなかったことを示す。

【0079】

【表22】

試験は、高アルギニン濃度（中性ｐＨ）を含有する緩衝剤が、Ｘ−ＭＬＶおよびＳｕＨＶ−１等のエンベロープウイルスを効果的に不活化する独特の特性を有することを示した。グリシンは、ウイルス不活化に効果的ではなかった。

【0080】

表２３は、ウイルス不活化（減少係数）を含む、試験の結果を要約する。試験で評価されたエンベロープウイルス（Ｘ−ＭＬＶおよびＳｕＨＶ−１）は、１．０Ｍアルギニンの存在下で不活化されたが、非エンベロープウイルス（ＭＭＶ）は、不活化されなかった。１．０Ｍグリシンの使用は、Ｘ−ＭＬＶを不活化しなかった。結果は、高濃度のアルギニン（１．０Ｍ）含有中性緩衝剤の使用が、エンベロープウイルスの効果的なウイルス不活化方法として有用であり得ることを示す。

【0081】

【表23】

実施例３
製剤品質におけるアルギニンウイルス不活化の効果
治療用生物学的の製剤品質におけるアルギニンウイルス不活化の効果を検証するために、４つのタンパク質製剤を、高濃度のアルギニンと共にインキュベートした。タンパク質製剤を最終工程の中間体として得、３．７の低ｐＨか、またはボーラス添加による１．０Ｍのアルギニン濃度のいずれかで、２４時間、インキュベートした。タンパク質製剤の凝集体を分子ふるいクロマトグラフィーで決定した。結果を表２４に示す。

【0082】

【表24】

タンパク質製剤であるＬｉｎｇｏ、ＧＥ２およびＴＷＥＡＫの凝集レベルは、２４時間、１．０Ｍアルギニンでインキュベートした後、対照と同じか、または対照より良かった。１．０Ｍアルギニンで２４時間インキュベートした後に残存したＦＩＸモノマーのパーセンテージは、対照よりわずかだけ低かった（表２４を参照のこと）。しかしながら、１．０Ｍアルギニンでのインキュベートと異なり、ｐＨ３．７での２４時間後のタンパク質製剤の安定性は、非常に可変であった。ＴＷＥＡＫのみが、２４時間後に残存したタンパク質モノマーの高パーセンテージを示し、一方ＧＥ２、ＦＩＸ、およびＬｉｎｇｏは、大量のタンパク質凝集体を示した（表２４ならびにＧＥ２およびＬｉｎｇｏにおいて、それぞれ、図１４および図１５を参照のこと）。低ｐＨでインキュベートされたタンパク質製剤試料における高分子量種のパーセンテージは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析により確認された。（ＧＥ２については、図１６を参照のこと、矢印は、高分子量種の増量を示す）。

【0083】

これらの製剤品質試験は、高濃度のアルギニンが、製剤品質にほとんど、または全く有害な影響がなく、したがって、製造において潜在的な柔軟性を提供することを実証する。タンパク質濃度が、初期の試験の１０分の１の濃度である時にも、同様のタンパク質の凝集傾向が観察された（データ示さず）。したがって、タンパク質濃度は、タンパク質製剤が、高濃度のアルギニンに曝露される時、凝集体種形成に影響を与えなかった。しかしながら、試料へのアルギニン添加の速度は、凝集体種の形成に影響を与えるように思われた。

【0084】

例えば、アルギニン原液のボーラス添加は、試料に局所的な高濃度をもたらし、ある程度の凝集体形成をもたらす。しかしながら、アルギニン原液の滴下添加（５分後に最終アルギニン濃度に達する１ｍＬのアルギニン原液を滴下添加）は、ある程度の初期の凝集はそれでも生じるが、凝集体形成を軽減する（ＦＩＸ融合タンパク質の安定性を示す図１７を参照のこと）。アルギニン原液の速度は、製造環境で容易に制御され得るため、ウイルスの不活化またはその感染力価を低減するための高濃度のアルギニンの使用は、低ｐＨ等の厳しい条件を使用する現行の実践の効果的な代替としての機能を果たす。

【0085】

この実施例で実証されるように、融合タンパク質およびモノクローナル抗体等の治療用タンパク質は、高濃度のアルギニンの存在下で良好な製剤安定性を示す。したがって、いくつかの実施形態において、ウイルスをアルギニン接触させることを含むウイルスの不活化またはその感染力価を低減する方法は、治療用タンパク質の単離および／または産生中に適用される。このような治療用タンパク質のいくつかの実施例は、上述の第ＩＸ−Ｆｃ（ＦＩＸ−Ｆｃ）因子等の融合タンパク質、および凝固因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ−Ｆｃ因子融合タンパク質等のさらなるＦｃ融合タンパク質、ならびに例えば、それぞれが参照により本明細書に援用される、米国特許第７，３４８，００４号、第７，３８１，４０８号および第７，４０４，９５６号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００５／０１４７６１８ Ａ１号に開示されるもの等の、その他を含むが、これらに限定されない。治療用タンパク質は、これらに限定されないが、ＬＩＮＧＯ−１を結合する抗体、またはＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４）を結合する抗体等の抗体も含み、これらは、国際出願公開第ＷＯ２００７／００８５４７号および第ＷＯ２００８／０８６００６号、ならびにＬｉｎｇｏ抗体については、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３９９９号、またはＴＷＥＡＫ抗体については、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４３３８２号に記載され、それぞれ、参照により本明細書に援用される。
本発明（Ｅ）の実施形態は、Ｅ１〜Ｅ３１を含む。

【0086】

Ｅ１．前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含む、エンベロープウイルスを不活化またはその感染力価低減する方法であって、前記接触は、少なくとも約０．２Ｍのアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液は、約６．０を超えるｐＨである。

【0087】

Ｅ２．前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含む、治療用生物学的製剤を汚染するエンベロープウイルスを不活化またはその感染力価低減する方法であって、前記接触は、少なくとも約０．２Ｍのアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液は、約６．０を超えるｐＨである。

【0088】

Ｅ３．前記ｐＨは、
ａ）約６．０〜約８．５のｐＨ
ｂ）約６．５〜約８．０のｐＨ
ｃ）約６．５〜約７．５のＰＨ
ｄ）約６．０〜８．０のｐＨ
ｅ）約７．０〜約８．０のｐＨ
ｆ）約７．０〜約７．５のｐＨ
ｇ）約６．０のｐＨ
ｈ）約６．５のｐＨ
ｉ）約７．０のｐＨ
ｊ）約７．５のｐＨ
ｋ）約８．０のｐＨ、および
ｌ）約８．５のｐＨからなる群から選択される、Ｅ１またはＥ２に記載の方法。

【0089】

Ｅ４．前記アルギニンの濃度は、
ａ）約０．３Ｍ、
ｂ）約０．４Ｍ、
ｃ）約０．５Ｍ、
ｄ）約０．６Ｍ、
ｅ）約０．７Ｍ、
ｆ）約０．８Ｍ、
ｇ）約０．９Ｍ、
ｈ）約１．０Ｍ、
ｉ）約１．１Ｍ、
ｊ）約１．２Ｍ、
ｋ）約１．３Ｍ、
ｌ）約１．４Ｍ、
ｍ）約１．５Ｍ、
ｎ）約１．６Ｍ、
ｏ）約１．７Ｍ、
ｐ）約１．８Ｍ、
ｑ）約１．９Ｍ、
ｒ）約２．０Ｍ、
ｓ）約２．１Ｍ、
ｔ）約２．２Ｍ、
ｕ）約２．３Ｍ、
ｖ）約２．４Ｍ、
ｗ）約２．５Ｍ、
ｘ）約３Ｍ、
ｙ）約３．５Ｍ、
ｚ）約４Ｍ、
ａａ）約４．５Ｍ、
ａｂ）約５Ｍ、
ａｃ）約５．５Ｍ、
ａｄ）約６Ｍ、
ａｄ）約６．５Ｍ、
ａｄ）約７Ｍ、および
ａｅ）約７．５Ｍからなる群から選択される、Ｅ１〜Ｅ３のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0090】

Ｅ５．前記ウイルスは、グリコール化合物をさらに含む前記溶液と接触させられるＥ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。

【0091】

Ｅ６．前記グリコール化合物は、約５０％（容量に対する重量）以下の濃度で存在する、Ｅ５に記載の方法。

【0092】

Ｅ７．前記グリコール化合物は、
ａ）プロピレングリコール、
ｂ）ポリプロピレングリコール、
ｃ）エチレングリコール、
ｄ）ポリエチレングリコール、
ｅ）ヘキシレングリコール、および
ｆ）ポリヘキシレングリコールからなる群から選択される、Ｅ５またはＥ６に記載の方法。

【0093】

Ｅ８．前記不活化または低減は、製剤精製工程の一部として実施される、Ｅ１〜Ｅ７のいずれか１つに記載の方法。

【0094】

Ｅ９．前記不活化または低減は、細胞培養物採取手順中に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0095】

Ｅ１０．前記不活化または低減は、細胞培養物清澄手順中に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0096】

Ｅ１１．前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、Ｅ８に記載の方法。

【0097】

Ｅ１２． 前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の後に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、Ｅ８に記載の方法。

【0098】

Ｅ１３．前記不活化または低減は、１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の後であるが、別の１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、Ｅ８に記載の方法。

【0099】

Ｅ１４．前記不活化または低減は、前記生物学的製剤の調製に使用される全てのクロマトグラフィー精製手順の後に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0100】

Ｅ１５．前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の前に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0101】

Ｅ１６．前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後に実施される、 Ｅ８に記載の方法。

【0102】

Ｅ１７．前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後、および限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0103】

Ｅ１８．前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0104】

Ｅ１９．前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の後に実施される、Ｅ８に記載の方法。

【0105】

Ｅ２０．前記治療用生物学的製剤は、組み換えタンパク質を含む、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

Ｅ２１．前記治療用生物学的製剤は、自然に生じる、または組み換え免疫グロブリンを含む、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法。

【0107】

Ｅ２２．前記治療用生物学的製剤は、自然に生じる、または組み換え血液凝固因子である、Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか１つに記載の方法。

【0108】

Ｅ２３．前記血液凝固因子は、
ａ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、
ｂ）フィブリン、
ｃ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、
ｄ）トロンビン、
ｅ）抗トロンビン、
ｆ）ＶＩＩａの組織因子補因子（第ＩＩＩ因子）、
ｇ）プロテインＣ、
ｈ）プロテインＳ、
ｉ）プロテインＺ；
ｊ）プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤
ｋ）ヘパリン補因子ＩＩ、
ｌ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、
ｍ）第ＶＩＩ因子、
ｎ）第ＶＩＩＩ因子、
ｏ）第ＩＸ因子、
ｐ）第Ｘ因子、
ｑ）第ＸＩ因子、
ｒ）第ＸＩＩ因子、
ｓ）第ＸＩＩＩ因子、
ｔ）フォンビルブランド因子、
ｕ）プレカリクレイン、
ｖ）高分子キニノーゲン、
ｗ）プラスミノーゲン、
ｘ）プラスミン、
ｙ）組織プラスミノーゲン活性化因子、
ｚ）ウロキナーゼ、
ａａ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、および
ａｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２からなる群から選択される、請求項Ｅ２２に記載の方法。

【0109】

Ｅ２４．前記生物学的製剤は、真核細胞により産生される、Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

Ｅ２５．前記生物学的製剤は、哺乳類細胞によって産生される、Ｅ２４に記載の方法。

【0111】

Ｅ２６．前記生物学的製剤は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される、Ｅ２５に記載の方法。

【0112】

Ｅ２７．前記生物学的製剤は、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞によって産生される、Ｅ２５に記載の方法。

【0113】

Ｅ２８．前記生物学的製剤は、ヒト細胞によって産生される、Ｅ２５に記載の方法。

【0114】

Ｅ２９．前記治療用タンパク質は、融合タンパク質である、Ｅ１〜Ｅ２８のうちのいずれか１つに記載の方法。

【0115】

Ｅ３０．前記融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質である、Ｅ２９に記載の方法。

【0116】

Ｅ３１．前記自然に生じる、または組み換え免疫グロブリンは、ＬＩＮＧＯ−１に結合する抗体、またはＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４）に結合する抗体である、Ｅ２１に記載の方法。

【0117】

これらの実施例は、本発明の可能な実施形態を図示する。本発明は、そのいくつかの実施形態を参照して特に示され、説明されたが、これらは例として提示されたに過ぎず、限定するものではなく、形態および詳細の種々の変更が、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、そこになされ得ることを、当業者は理解するであろう。したがって、本発明の幅および範囲は、上述の代表的な実施形態のいずれによっても制限されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの等価物のみに従い定義されるべきである。本発明は以下をも提供する。
（１）エンベロープウイルスを不活化またはその感染力価を低減する方法であって、前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含み、前記接触は、少なくとも約０．２Ｍのアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液のｐＨは、約６．０よりも高い、方法。
（２）治療用生物学的製剤を汚染するエンベロープウイルスを不活化またはその感染力価を低減する方法であって、前記ウイルスをアルギニンと接触させることを含み、前記接触は、少なくとも約０．２Ｍのアルギニンを含む溶液中で生じ、前記溶液のｐＨは、約６．０よりも高い、方法。
（３）前記ｐＨは、
ａ）約６．０〜約８．５のｐＨ
ｂ）約６．５〜約８．０のｐＨ
ｃ）約６．５〜約７．５のｐＨ
ｄ）約６．０〜８．０のｐＨ
ｅ）約７．０〜約８．０のｐＨ
ｆ）約７．０〜約７．５のｐＨ
ｇ）約６．０のｐＨ
ｈ）約６．５のｐＨ
ｉ）約７．０のｐＨ
ｊ）約７．５のｐＨ
ｋ）約８．０のｐＨ、および
ｌ）約８．５のｐＨからなる群から選択される、項目１または２に記載の方法。
（４）前記アルギニンの濃度は、
ａ）約０．３Ｍ、
ｂ）約０．４Ｍ、
ｃ）約０．５Ｍ、
ｄ）約０．６Ｍ、
ｅ）約０．７Ｍ、
ｆ）約０．８Ｍ、
ｇ）約０．９Ｍ、
ｈ）約１．０Ｍ、
ｉ）約１．１Ｍ、
ｊ）約１．２Ｍ、
ｋ）約１．３Ｍ、
ｌ）約１．４Ｍ、
ｍ）約１．５Ｍ、
ｎ）約１．６Ｍ、
ｏ）約１．７Ｍ、
ｐ）約１．８Ｍ、
ｑ）約１．９Ｍ、
ｒ）約２．０Ｍ、
ｓ）約２．１Ｍ、
ｔ）約２．２Ｍ、
ｕ）約２．３Ｍ、
ｖ）約２．４Ｍ、
ｗ）約２．５Ｍ、
ｘ）約３Ｍ、
ｙ）約３．５Ｍ、
ｚ）約４Ｍ、
ａａ）約４．５Ｍ、
ａｂ）約５Ｍ、
ａｃ）約５．５Ｍ、
ａｄ）約６Ｍ、
ａｄ）約６．５Ｍ、
ａｄ）約７Ｍ、および
ａｅ）約７．５Ｍからなる群から選択される、項目１または２に記載の方法。
（５）前記ウイルスは、グリコール化合物をさらに含む前記溶液と接触される、項目１または２に記載の方法。
（６）前記グリコール化合物は、約５０％（容量に対する重量）以下の濃度で存在する、項目５に記載の方法。
（７）前記グリコール化合物は、
ａ）プロピレングリコール、
ｂ）ポリプロピレングリコール、
ｃ）エチレングリコール、
ｄ）ポリエチレングリコール、
ｅ）ヘキシレングリコール、および
ｆ）ポリヘキシレングリコールからなる群から選択される、項目５または６に記載の方法。
（８）前記不活化または低減は、製剤精製工程の一部として実施される、項目１または２に記載の方法。
（９）前記不活化または低減は、細胞培養物採取手順中に実施される、項目８に記載の方法。
（１０）前記不活化または低減は、細胞培養物清澄手順中に実施される、項目８に記載の方法。
（１１）前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、項目８に記載の方法。
（１２）前記不活化または低減は、クロマトグラフィー精製手順の後で実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、項目８に記載の方法。
（１３）前記不活化または低減は、１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の後であるが、別の１つ以上のクロマトグラフィー精製手順の前に実施され、前記手順は、前記治療用生物学的製剤をクロマトグラフィー媒体と接触させることを含む、項目８に記載の方法。
（１４）前記不活化または低減は、前記生物学的製剤の調製に使用される全てのクロマトグラフィー精製手順の後に実施される、項目８に記載の方法。
（１５）前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の前に実施される、項目８に記載の方法。
（１６）前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後に実施される、項目８に記載の方法。
（１７）前記不活化または低減は、ウイルス濾過手順の後、かつ限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、項目８に記載の方法。
（１８）前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の前に実施される、項目８に記載の方法。
（１９）前記不活化または低減は、限外濾過または透析濾過手順の後に実施される、項目８に記載の方法。
（２０）前記治療用生物学的製剤は、組み換えタンパク質を含む、項目２に記載の方法。
（２１）前記治療用生物学的製剤は、自然に生じるかまたは組み換えの免疫グロブリンを含む、項目２に記載の方法。
（２２）前記治療用生物学的製剤は、自然に生じるかまたは組み換えの血液凝固因子を含む、項目２に記載の方法。
（２３）前記血液凝固因子は、
ａ）フィブリノーゲン（第Ｉ因子）、
ｂ）フィブリン、
ｃ）プロトロンビン（第ＩＩ因子）、
ｄ）トロンビン、
ｅ）抗トロンビン、
ｆ）ＶＩＩａの組織因子補助因子（第ＩＩＩ因子）、
ｇ）プロテインＣ、
ｈ）プロテインＳ、
ｉ）プロテインＺ；
ｊ）プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤
ｋ）ヘパリン補因子ＩＩ、
ｌ）第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子）、
ｍ）第ＶＩＩ因子、
ｎ）第ＶＩＩＩ因子、
ｏ）第ＩＸ因子、
ｐ）第Ｘ因子、
ｑ）第ＸＩ因子、
ｒ）第ＸＩＩ因子、
ｓ）第ＸＩＩＩ因子、
ｔ）フォンビルブランド因子、
ｕ）プレカリクレイン、
ｖ）高分子キニノーゲン、
ｗ）プラスミノーゲン、
ｘ）プラスミン、
ｙ）組織プラスミノーゲン活性化因子、
ｚ）ウロキナーゼ、
ａａ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、および
ａｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤２からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
（２４）前記生物学的製剤は、真核細胞により産生される、項目２に記載の方法。
（２５）前記生物学的製剤は、哺乳類細胞によって産生される、項目２４に記載の方法。
（２６）前記生物学的製剤は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される、項目２５に記載の方法。
（２７）前記生物学的製剤は、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞によって産生される、項目２５に記載の方法。
（２８）前記生物学的製剤は、ヒト細胞によって産生される、項目２５に記載の方法。
（２９）前記アルギニンの濃度は、段階的勾配または連続勾配を使用して、少なくとも約０．２Ｍのアルギニンの最終濃度まで徐々に増加される、項目１または２に記載の方法。
（３０）前記アルギニンの最終濃度は、１分当り約２０％以下の速度で、段階的勾配または連続勾配により増加される、項目２９に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】