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特許5731488癌のマーカーとしてのセセルニン‐１

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5731488

(24)【登録日】2015年4月17日

(45)【発行日】2015年6月10日

(54)【発明の名称】癌のマーカーとしてのセセルニン‐１

(51)【国際特許分類】

G01N 33/574 20060101AFI20150521BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

G01N33/574 E

G01N33/574 B

【請求項の数】12

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2012-512242(P2012-512242)

(86)(22)【出願日】2010年5月21日

(65)【公表番号】特表2012-528303(P2012-528303A)

(43)【公表日】2012年11月12日

(86)【国際出願番号】EP2010003139

(87)【国際公開番号】WO2010136163

(87)【国際公開日】20101202

【審査請求日】2013年3月12日

(31)【優先権主張番号】09161524.5

(32)【優先日】2009年5月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡＲＯＣＨＥＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村和美

(72)【発明者】

【氏名】ノルベルトビルト

(72)【発明者】

【氏名】マリー−ルイーゼハグマン

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンカール

(72)【発明者】

【氏名】ユリアリートリンガー

(72)【発明者】

【氏名】マルクスレスラー

(72)【発明者】

【氏名】ミヒャエルタッケ

【審査官】海野佳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００９／０１９３１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００８／１１６５９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 SABO EDMOND，EXPRESSION ANALYSIS OF BARRETT'S ESOPHAGUS-ASSOCIATED HIGH-GRADE DYSPLASIA IN LASER CAPTURE MICRODISSECTED ARCHIVAL TISSUE，CLINICAL CANCER RESEARCH，２００８年１０月１５日，V14 N20，P6440-6448

【文献】 SUDA TAKAKO，IDENTIFICATION OF SECERNIN 1 AS A NOVEL IMMUNOTHERAPY TARGET FOR GASTRIC CANCER USING THE EXPRESSION PROFILES OF CDNA MICROARRAY，CANCER SCIENCE，２００６年５月，V97 N5，P411-419

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌の危険性にある対象由来の体液サンプル中の癌をインビトロで評価する方法であって、
（ａ）体液中のセセルニン‐１タンパク質（ＳＣＲＮ１）および／またはその断片の濃度を計測し、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた結果を、正常個体由来の体液サンプルを用いて得られた結果と比較し、それによって、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度の増大が癌を示すと評価する、方法。

【請求項2】

前記体液中の１又は複数の他の癌マーカーの濃度を計測することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

サンドイッチ免疫アッセイである、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記癌が、肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓および前立腺の癌からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記の１もしくは複数の他の癌マーカーが、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

癌の危険性にある対象由来の体液サンプル中の癌をインビトロで評価する方法であって、
（ａ）ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片に対する抗体を用いて体液中のセセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）および／またはその断片の濃度を計測し、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた結果を、正常個体由来の体液サンプルを用いて得られた結果と比較し、それによって、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度の増大が癌を示すと評価する、方法。

【請求項7】

１もしくは複数の他のマーカーがさらに使用され、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記癌が、肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓および前立腺の癌からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片を特異的に計測するのに必要とされる試薬を含む、請求項１に記載の方法を実施するためのキット。

【請求項10】

１もしくは複数の他の癌マーカーを特異的に計測するのに必要とされる試薬をさらに含む、請求項９に記載のキット。

【請求項11】

（i）ＳＣＲＮ１、ならびに（ii）ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される１もしくは複数の他のマーカーを特異的に計測する請求項１に記載の方法を実施するための、ＳＣＲＮ１に対する抗体および該１以上のマーカーが固体支持体上に固定されているアレイ。

【請求項12】

前記計測を実施するための補助試薬をさらに含む、請求項１１に記載のアレイ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌の診断を助ける方法に関する。本発明は、異なる癌型に対する万能マーカーとしてのセセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）の使用を開示する。さらに、本発明は、特に、個体由来のサンプル中のＳＣＲＮ１を測定することによる液体サンプルからの癌の診断方法に関する。ＳＣＲＮ１の計測は、例えば癌の早期発見または手術を受ける患者のサーベイランスに使用され得る。

【背景技術】

【0002】

検出と治療法の進歩にもかかわらず、癌は依然として公衆衛生の大きな課題である。癌細胞は、癌関連マーカータンパク質の産生を特徴とする。癌関連タンパク質は、癌細胞を保有している個体の組織内および体液中の両方に見られる。それらのレベルは、通常、発癌進行の初期ステージでは低く、そして疾患の進行の間、増加するが、ごく稀に疾患進行の途中でレベル低下を示すタンパク質が観察される。これらのタンパク質の高感度検出は、癌の診断のために、特に癌の初期ステージ診断において有利、且つ、有望なアプローチである。最も有病率の高い癌型は、乳癌（ＢＣ）、肺癌（ＬＣ）および結腸直腸癌（ＣＲＣ）である。

【0003】

固形腫瘍に対する最も重要な治療アプローチは、以下の：
ａ）腫瘍の外科切除、
ｂ）化学療法、
ｃ）放射線療法、
ｄ）抗腫瘍抗体または抗血管形成性抗体のような生物製剤による処置、および
ｅ）上記の方法の組合せ、
である。
腫瘍の外科切除は、初期ステージの固形腫瘍の一次治療として広く受け入れられている。しかしながら、ほとんどの癌は、症状が出た場合、すなわち患者が既に疾患進行のかなり後期ステージにある場合にのみ検出される。
癌のステージ分類は、程度、進行、および重症度の点での疾患の分類である。これは、予後および治療法の選択に関して一般化が行われ得るように、癌患者を分類する。

【0004】

ＣＲＣの種々のステージがデュークスステージＡ〜Ｄによって分類されていた。今日、ＴＮＭシステムは、癌の解剖学的程度について最も広く使用される分類法である。これは、国際的に受け入れられた統一ステージ分類システムを表す。３つの基本変数：Ｔ（原発性腫瘍の程度）、Ｎ（限局的リンパ節の状態）およびＭ（遠位転移の存在または不存在）がある。ＴＮＭ基準は、ＵＩＣＣ（国際対癌連合）、Sobin, L.H., Wittekind, Ch (eds.), TNM Classification of Malignant Tumours, six edtion (2002)によって公表されている。ＴＮＭ状態がいったん決定されると、患者は、ＩＶが最も進行したステージとなるＩ〜ＩＶのローマ数字で示されるステージに分類される。ＴＮＭステージ分類およびＵＩＣＣステージは、Sobin and Wittekind (eds.)（前掲）から得られる以下の表中に示されているように互いに対応している。

【0005】

【表1】

【0006】

特に重要なことは、例えばＣＲＣの癌の早期診断が非常に良好な予後につながることである。ＣＲＣにおいて、結腸直腸の悪性腫瘍は、良性腫瘍、すなわち腺腫から生じる。そのため、最良の予後は、腺腫ステージで診断される患者にある。ステージＴ_is、Ｎ０、Ｍ０またはＴ１〜３；Ｎ０；Ｍ０ほどの早期で診断された患者は、適切に処理されると、遠隔転移が既に存在しているときに診断された患者でのわずか１０％の５年生存率と比べて、診断後の９０％を超える５年後の生存機会を有する。

【0007】

Ｘ線または核共鳴画像化などの画像化法を含めた現在の検出方法は、理論上、一般的なスクリーニング手段としての使用に関して少なくとも部分的には適当であり得る。しかしながら、これらは、非常に費用がかかり、多数の被験体、特になにも腫瘍症状のない被験体のマススクリーニングにおける一般的で広範な使用のための健康管理システムとしては手頃な費用ではない。
よって、本発明の目的は、例えば癌を患っていると疑われる個体を同定するための、簡単でコスト効率の高い腫瘍診断の手順を提供することである。このために、体液、例えば血液、血清もしくは血漿で検出可能な一般的な腫瘍マーカー、またはそういったマーカーのパネルが望ましい。

【0008】

多くの血清腫瘍マーカーが既に臨床使用にある。例えば、サイトケラチン１９の可溶性の３０ｋＤａ断片（ＣＹＦＲＡ２１‐１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、および扁平上皮癌抗原（ＳＣＣ）が最も代表的なＬＣマーカーである。しかしながら、それらのいずれもがスクリーニング手段に必要な感度および特異度の基準を満たしていない（Thomas, L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany (2000)）。

【0009】

臨床有用性のあるものであるためには、単一マーカーとしての新規診断マーカーが、当該技術分野で公知の他のマーカーに匹敵するか、または優れているべきである。すなわち、それぞれ単独でまたは１もしくは複数の他のマーカーと組合せて使用される場合のいずれかで、新規マーカーが診断感度および／または特異度における進歩をもたらすべきである。試験の診断感度および／または特異度は、その受診者動作特性によって最も評価されるので、これを以下で詳細に記載する。

【0010】

全血、血清または血漿は、臨床ルーチンで最も広く使用されるサンプルの供給源である。信頼性の高い癌検出を助けるか、または初期予後情報を提供する初期腫瘍マーカーの同定によって、この疾患の診断および管理を大きな助けとなる方法がもたらされる。そのため、癌、特にＬＣのインビトロ診断を改善するための緊急の臨床必要性が存在する。早期に診断される患者の生存機会が疾患の進行した段階で診断される患者と比べて非常に高いため、癌、例えばＬＣの早期診断を改善することが特に重要である。

【0011】

肺癌における生化学マーカーの臨床有用性が最近概説された（Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262）。

【0012】

ＣＹＦＲＡ２１‐１は、肺癌について現在公知の腫瘍マーカーのうちで最良のものであると現在のところみなされている。臓器特異的ではないが、これは主に肺組織で見られる。他の良性肺疾患に対して９５％の特異度において、肺癌に対するＣＹＦＲＡ２１‐１の感度は４６〜６１％であると記載されている。ＣＹＦＲＡ２１‐１の増大した血清レベルはさらに、顕著な良性肝臓疾患、腎臓機能不全および浸潤性膀胱癌とも関連している。ＣＹＦＲＡ２１‐１試験は、術後治療法サーベイランスに推奨されている。

【0013】

ＣＥＡは、癌胎児抗原群に属し、通常、胚発生中に産生される。ＣＥＡは、臓器特異的ではなく、結腸直腸癌のモニタリングに主に使用される。悪性疾患の他にも、いくつかの良性疾患、例えば肝硬変、気管支炎、膵臓炎および自己免疫疾患などがＣＥＡ血清レベルの増大と関連している。良性肺疾患に対する９５％の特異度において、肺癌の感度は２９〜４４％であると報告されている。ＣＥＡの好ましい使用は、肺癌の治療法サーベイランスである。

【0014】

ＮＳＥは、ＳＣＬＣの腫瘍マーカーである。一般的に、ＮＳＥ血清レベルの増大は、神経外胚葉腫瘍および神経内分泌腫瘍に関連していることが分かっている。また、増大した血清レベルが、良性肺疾患および脳疾患、例えば髄膜炎または脳の他の炎症疾患および頭部への外傷性損傷を患っている患者で見られる。ＳＣＬＣに関して９５％の特異度である一方で、感度は６０〜８７％であると報告されているが、ＮＳＣＬＣのＮＳＥ試験の性能は不良である（７〜２５％）。ＮＳＥは、ＳＣＬＣの治療サーベイランスに推奨される。

【0015】

糖脂質上のＣＡ１９‐９（（糖鎖抗原１９‐９）、シアリル化Ｌｅｗｉｓ（ａ）抗原）は消化器癌の腫瘍マーカーがある。これは胎児の胃、腸および膵臓の上皮に生じる。低濃度はまた、肝臓、肺、および膵臓の成体組織でも見られる。腫瘍質量とＣＡ１９‐９アッセイ値の間には相関関係が全くないので、そのためＣＡ１９‐９の測定は膵臓癌の早期検出に使用できない。ムチンは肝臓を介してのみ排出されるので、軽度の胆汁うっ滞でさえ場合によっては明らかに上昇したＣＡ１９‐９血清レベルにつながる。このマーカーは、確定された膵臓癌を患っている患者の疾患状態のモニタリングにおける補助がとして主に使用される（感度７０〜８７％）。３〜７％の人が、Ｌｅｗｉｓａ‐陰性／ｂ‐陰性血液型構造を持っており、反応決定部位ＣＡ１９‐９を有するムチンを発現することができない。このことは、前記知見を解釈するときに考慮されなければならない。

【0016】

ＣＡ１２５は、上皮起源の非粘液性卵巣腫瘍の高い割合で見られ、そして血清中で検出され得る。卵巣癌は婦人科腫瘍のうちの約２０％を占める。最も高いＣＡ１２５値は卵巣癌に罹患している患者で起こるが、明らかに増大した値はさらに、子宮内膜、乳房、胃腸管の悪性腫瘍、および他の様々な悪性腫瘍で観察される。増大した値は、卵巣嚢腫、卵巣の化生、子宮内膜症、筋腫性子宮または子宮頚管炎などの様々な良性婦人科疾患において時々見られる。このマーカーのわずかな増大はさらに、早期妊娠や様々な良性疾患（例えば急性および慢性膵炎、良性の胃腸疾患、腎臓機能不全、自己免疫疾患および他の疾患）でも起こることがある。顕著に増大したレベルは、肝臓硬変症や肝炎などの良性肝臓疾患に見られた。極端な増大は、悪性および良性の疾患によるあらゆる種類の腹水でも起こり得る。ＣＡ１２５は比較的に非特異的なマーカーではあるが、今日、それが、漿液性卵巣癌を患っている患者の治療法と経過を観察するための最も重要な腫瘍マーカーである。６９〜７９％の感度が、８２〜９３％の特異度に対して報告されている。

【0017】

ＰＳＡ（「前立腺関連抗原」）は、血液試験に使用される一般的に試験される腫瘍マーカーである。ＰＳＡは高い組織特異度を有するようである；糖タンパク質は、正常な前立腺上皮および分泌物に見られるが、他の組織には見られない。ＰＳＡは、前立腺の癌の存在に関して感度が高い。その上昇はステージおよび腫瘍体積と相関する。それは再発や治療に対する反応を予測する。そして、この抗原は、手術前に非常に高い値を有する患者が再発する可能性が高いという点で予後的重要性がある。

【0018】

ＮＮＭＴ（ニコチンアミドＮ‐メチルトランスフェラーゼ；Ｓｗｉｓｓ‐ＰＲＯＴ：Ｐ４０２６１）は、２９．６ｋＤａの見かけ分子量および５．５６の等電点を有する。ＮＮＭＴは、ニコチンアミドおよび他のピリジンのＮ‐メチル化を触媒する。この活性は、多くの薬物および生体異物化合物の生体内変化に重要である。このタンパク質は、主に肝臓内で発現され、細胞質内に位置することが報告されている。ＮＮＭＴは、ヒト肝臓由来のｃＤＮＡからクローン化され、２９．６ｋＤａの計算上の分子量を有する２６４個のアミノ酸のタンパク質をコードする７９２個のヌクレオチドのオープンリーティングフレームを含んでいる（Aksoy, S. et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840）。ヒト癌における該酵素の潜在的役割については、文献ではほとんど知られていない。ある論文では、肝臓ＮＮＭＴの酵素活性の増大が、マウスにおける癌悪液質のマーカーであると報告された（Okamura, A. et al., Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656）。最近の報告では、放射線感受性細胞株において放射線に応答したＮＮＭＴ遺伝子の下方制御が示された（Kassem, H.S. et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460）。ＮＭＭＴがＣＲＣの評価に重要であろうことが最近わかった（WO 2004/057336）。

【0019】

ＰｒｏＧＲＰは腫瘍マーカーであり、ＳＣＬＣの検出やモニタリングに有用である。増大した血清レベルはさらに、特発性肺線維症またはサルコイドーシスなどの非悪性肺／胸膜疾患の患者でも見られる。ＳＣＬＣの分野におけるｐｒｏＧＲＰの感度が（９５％の特異度にて）４７〜８６％であると報告されるとはいえ、感度が１０％未満であると報告されることから、ＮＳＣＬＣの分野におけるｐｒｏＧＲＰ試験の性能は低い。
ＳＣＣは元々、子宮頚部の扁平上皮細胞ＣＡで同定された。ＬＣに関するＳＣＣの感度は一般的に低い（１８〜２７％）。そのため、ＳＣＣ試験はスクリーニングに好適ではないとされている。しかしながら、ＣＹＦＲＡ２１‐１のほうが一般により性能が高いとはいえ、扁平上皮細胞ＣＡに対する高感度のため、ＳＣＣの好ましい使用は治療サーベイランスである。

【0020】

ｐ５３（ＴＰ５３、細胞腫瘍抗原ｐ５３、腫瘍サプレッサーｐ５３またはリン酸化タンパク質ｐ５３）は、細胞増殖停止またはアポトーシスを誘導する転写因子である（Appella, E. et al., Pathol. Biol. 48 (2000) 227-245）である。ｐ５３は多くの腫瘍型で腫瘍抑制物質として働いているので、この遺伝子の不活性化突然変異がヒトの癌発生を促進する最も一般的な遺伝的事象である（Olivier, M. and Petitjean, A., Cancer Gene Ther. 16 (2009) 1-12；Petitjean, A. et al., Oncogene 26 (2007) 2157-2165において概説されている）。ｐ５３突然変異は、結腸直腸癌腫の４０〜５０％で観察されており、癌腫の攻撃性に関連する（Soussi, T.s Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788）。ｐ５３遺伝子における突然変異は、タンパク質機能の障害につながるだけではなく、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現、自己免疫性応答の開始、および癌患者の血清中での特異的な抗ｐ５３自家抗体の産生にもつながる（hang, J.Y. et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143；Soussi, T., Cancer Res. 60 (2000) 1777-1788）。ヒト血清中の抗ｐ５３自家抗体の検出は癌の診断とマネジメントのための新たなツールである。癌型によって、血清中の抗ｐ５３自家抗体の頻度は、１７．８％（ＣＲＣ）〜１６．１％（ＬＣ）および７．８％（乳癌）に及ぶ（Tan, E.M. and Zhang, J., Immunological Reviews 222 (2008) 328-340；Zhang, J.Y. et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 12 (2003) 136-143）。

【0021】

セプラーゼ、別名線維芽細胞活性化タンパク質（＝ＦＡＰ）は、２つの同一の単量体セプラーゼユニットから成る、ゼラチナーゼおよびジペプチジルペプチダーゼ活性を有する１７０ｋＤａの糖タンパク質として存在する（Pineiro-Sanchez, M.L. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 7595-7601；Park, J.E. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 36505-36512）。ヒト膜結合セプラーゼタンパク質の単量体は７６０個のアミノ酸を含んでなる。ヒト・セプラーゼは、繊維芽細胞の細胞質中にその最初の４つのＮ末端残基、続いて２１残基の膜貫通ドメイン、次いで７３４残基の細胞外Ｃ末端触媒ドメインを持っていると予測される（Goldstein et al., Biochim Biophys Acta. 1361 (1997) 11-19；Scanlan, M.L et al., Proc Natl Acad Sci USA 91 (1994) 5657-5661）。ヒト・セプラーゼタンパク質のより短い形態は、可溶性セプラーゼまたは循環抗プラスミン開裂酵素（＝ＡＰＣＥ）として当業者に知られており（Lee, K.N. et al., Blood 103 (2004) 3783-3788；Lee, K.N. et al., Blood 107 (2006) 1397-1404）、Swissprotデータベース受入番号Q12884の第２６〜７６０位アミノ酸を含んでなる。可溶性セプラーゼの二量体は、２つの同一の単量体可溶性セプラーゼタンパク質ユニットから成る１６０ｋＤａの糖タンパク質である。Pineiro-Sanchezら（前掲）は、セプラーゼの発現増大がヒト黒色腫および癌腫細胞の浸潤性表現型と相関することを発見した。Henry, L.R. et al., Clin. Cancer Res. 13 (2007) 1736-1741では、高レベルの間質セプラーゼを生じるヒト結腸腫瘍患者には攻撃的な疾患進行および転移または再発の潜在的発生がある可能性がより高いことを説明している。

【0022】

ヒト・ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（＝ＤＰＰＩＶ）、別名ＣＤ２６は、１１０ｋＤａの細胞表面分子である。ヒトＤＰＰＩＶタンパク質のアミノ酸配列は７６６個のアミノ酸を含んでなる。ヒトＤＰＰＩＶには、３番目のアミノ酸位置にプロリンまたはアラニンを持つペプチドからＮ末端ジペプチドを選択的に取り外す固有のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性がある。ヒトＤＰＰＩＶは、様々な細胞外分子と相互作用し、さらに細胞内情報伝達カスケードにも関与している。ヒトＤＰＰＩＶの多機能活性は、タンパク質分解酵素、細胞表面受容体、共刺激相互作用タンパク質およびシグナル伝達メディエーターとしてのその役割に影響を及ぼす細胞型および細胞内または細胞外の状況に依存している。ヒトＤＰＰＩＶは、短い細胞質ドメインである第１〜６位のアミノ酸、膜貫通領域である第７〜２８位のアミノ酸、および固有のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）活性を有する細胞外ドメインである第２９〜７６６位のアミノ酸を持つ。ヒト可溶性ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（＝可溶性ＤＰＰＩＶ）は、Swissprotデータベース受入番号P27487の第２９〜７６６位アミノ酸を含んでなる。可溶性ＤＰＰＩＶの二量体は、２つの同一の単量体可溶性ＤＰＰＩＶユニットから成る１７０ｋＤａの糖タンパク質である。

【0023】

可溶性ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ複合体（＝ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ）とは、３３０ｋＤａの分子量を持つ可溶性ＤＰＰＩＶホモ二量体（１７０ｋＤａ）と可溶性セプラーゼ・ホモ二量体（１６０ｋＤａ）により形成された可溶性複合体を指す。一定の条件下で、この複合体は６６０ｋＤａの分子量を持つ二重複合体を形成することができる。

【0024】

マーカーのプロファイリングに関して、および肺癌の診断の改善を目的として、ＣＹＦＲＡ２１‐１、ＮＳＥおよび一般的な炎症マーカーであるＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の血清レベルを組合せるファジー論理型分類アルゴリズムを使用する方法が公表された（Schneider, J., et al., Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151）。筆者らは、９５％の特異性で９２％の感度を報告している。しかしながら、この研究で、例えば単一腫瘍マーカーとしてのＣＹＦＲＡ２１‐１の感度は、９５％の特異性で７２％であると報告されており、これは多くの他の報告された研究よりも有意に高い。Duffy, M.J.は、Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262において、４６％〜６１％の感度を報告している。Schneiderらによって達成されたこの異常な高性能は、ある疑いを生じ、且つ、いくつかの事実に起因するものであり得る。第一に、対照患者の集団が患者集団よりも若いように思われる、すなわち両方の集団は年齢で十分適合しておらず、患者集団は多くが後期ステージを含む。第二に、そしてさらにより重要なことには、アルゴリズムの性能がファジー論理型限定子の決定に使用された訓練集団のサンプルにより確認されている。そのため、これらの限定子は、厳密に言うとこの集団のために「オーダーメイドされたもの」であって、独立した確認集団には適用されない。通常の状況下で、大きく、独立し、且つ、十分にバランスがとれた確認集団に適用される同じアルゴリズムが有意に減少した全体性能につながるであろうことが予測されるはずである。

【発明の概要】

【0025】

発明の概要
本発明の目的は、癌疾患の診断に使用され得る生化学マーカーが同定され得るかどうかを調べることであった。特に、本発明の発明者らは、体液中で、肺、乳房、結腸、前立腺および腎臓の癌などの種々の癌型を診断するための生化学マーカーが同定され得るかどうかを調べた。本発明の非常に好ましい態様において、肺癌（ＬＣ）の診断のための生化学マーカーの同定が調べられた。

【0026】

驚いたことに、セセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）の使用が、当該技術分野の水準で現在公知のマーカーの問題のいくつかを少なくとも部分的に克服し得ることが見出された。
驚いたことに、試験サンプル中のＳＣＲＮ１の濃度の増大は、癌の発生と関連することが見出された。ＳＣＲＮ１が、単一型の癌に特異的なマーカーではなく、様々な型の癌のマーカー、すなわち汎用腫瘍マーカーであることが見出された。ＳＣＲＮ１は腫瘍形成プロセスにかなり特異的であるように思われるために、新規腫瘍マーカーＳＣＲＮ１は、様々なクラスの腫瘍型について臨床上有用なものである可能性が高い。

【0027】

驚いたことに、サンプルおよび／または体液中のＳＣＲＮ１の濃度の測定が、例えば肺、卵巣、子宮内膜の癌、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌の診断を可能にすることが見出された。よりいっそう驚いたことに、正常対照と比べて、サンプルおよび／または体液中のＳＣＲＮ１またはその断片の濃度の増大が、癌のリスクまたは発生を示すことが見出された。

【0028】

本発明は、免疫学的検出方法によってＳＣＲＮ１の濃度をサンプル中で測定し、そして癌の診断において測定結果、特に測定した濃度を使用するステップを含む、インビトロでの癌の診断方法に関する。

【0029】

一実施形態では、本発明は、（ａ）セセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）および／またはその断片の濃度、（ｂ）場合により１もしくは複数の他の癌マーカーの濃度を液体サンプル中で計測し、そして（ｃ）癌の診断においてステップ（ａ）の測定結果および場合によりステップ（ｂ）の測定結果を使用するステップを含み、ここで、ＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌を示す、インビトロでの癌の診断方法に関する。

【0030】

さらに、本発明は、癌の診断におけるＳＣＲＮ１の使用に関する。
さらに、本発明は、癌の診断におけるＳＣＲＮ１に対する抗体の組合せの使用に関し、ここで、ＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌を示す。
さらに、本発明は、癌の診断におけるＳＣＲＮ１および場合により１もしくは複数の他の癌マーカーを含むマーカーパネルの使用方法であって、ここで、ＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌を示す使用方法を開示する。

【0031】

さらに、本発明は、（ａ）セセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）および／またはその断片の濃度、（ｂ）場合により１もしくは複数の他の癌マーカーの濃度を液体サンプル中で計測し、そして（ｃ）癌の診断においてステップ（ａ）の測定結果および場合によりステップ（ｂ）の測定結果を使用するステップを含み、ここで、ＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌を示す、インビトロでの癌の診断方法を実施するためのキットであって、ＳＣＲＮ１を特異的に計測するのに必要な試薬、および場合により１若しくは複数の他の癌マーカーを特異的に測定するのに必要な試薬を含むものに関する。

【0032】

驚いたことに、試験サンプル中のＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度の増大は、癌の発生と関連することが見出された。ＳＣＲＮ１が、単一型の癌に特異的なマーカーではなく、様々な型の癌のマーカー、すなわち汎用腫瘍マーカーであることが見出された。ＳＣＲＮ１は腫瘍形成プロセスにかなり特異的であるように思われるために、新規腫瘍マーカーＳＣＲＮ１は、様々なクラスの腫瘍型について臨床上有用なものである可能性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】図１は、２０個の肺癌組織溶解物のウェスタンブロット分析を示す。癌（ＣＡ）の組織溶解物と対応する対照組織溶解物の１５μｇの総タンパク質を、実施例３に記載のとおり分析した。Ｍ＝分子量マーカー；Ｔ＝腫瘍組織溶解物；Ｎ＝対応する対照組織溶解物；ｒｅｃａｇ＝遺伝子組み換えにより作製したセセルニン‐１（＝ＳＣＲＮ１）；矢印はセセルニン‐１（＝ＳＣＲＮ１）の位置を示す。

【図2】図２は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、ＬＣを患っている患者から採取した３６５個のサンプルの診断に関して０．８５のＡＵＣを有する、ＬＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図3】図３は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、頭部／頚部癌を患っている患者から採取した３０個のサンプルの診断に関して０．８６のＡＵＣを有する、Ｈ／ＮＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図4】図４は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、子宮内膜癌を患っている患者から採取した２３個のサンプルの診断に関して０．８４のＡＵＣを有する、ＥＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図5】図５は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、卵巣癌を患っている患者から採取した４２個のサンプルの診断に関して０．８３のＡＵＣを有する、ＯＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図6】図６は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、悪性黒色腫を患っている患者から採取した１６個のサンプルの診断に関して０．８２のＡＵＣを有する、ＭＭサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図7】図７は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、乳癌を患っている患者から採取した４７個のサンプルの診断に関して０．７７のＡＵＣを有する、ＢＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図8】図８は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、子宮頚癌を患っている患者から採取した２０個のサンプルの診断に関して０．７４のＡＵＣを有する、ＣＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図9】図９は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、膵臓癌を患っている患者から採取した４９個のサンプルの診断に関して０．７０のＡＵＣを有する、ＰＡＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図10】図１０は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、結腸直腸癌を患っている患者から採取した５０個のサンプルの診断に関して０．６７のＡＵＣを有する、ＣＲＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図11】図１１は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、卵巣癌を患っている患者から採取した５０個のサンプルの診断に関して０．６５のＡＵＣを有する、ＢＬＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図12】図１２は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、腎臓癌を患っている患者から採取した２５個のサンプルの診断に関して０．６０のＡＵＣを有する、ＫＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図13】図１３は、明らかな健常者から採取した５０個の対照サンプルと比較した場合に、前立腺癌を患っている患者から採取した５０個のサンプルの診断に関して０．５８のＡＵＣを有する、ＰＣサンプルにおけるＳＣＲＮ１の受診者動作特性に関するプロット（ＲＯＣ‐プロット）を示す。

【図14】図１４は、ヒトＳＣＲＮ１タンパク質；SwissProtデータベース受入番号：Q12765（配列番号１）のアミノ酸配列に示す。

【発明を実施するための形態】

【0034】

発明の詳細な説明
好ましい実施形態では、本発明は、ＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度をサンプル中で計測し、そしてその測定結果、特に癌の診断で測定した濃度を使用することを含む、インビトロでの癌の診断方法に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、（ａ）ＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度、（ｂ）場合により１もしくは複数の他の癌マーカーの濃度を液体サンプル中で計測し、そして（ｃ）癌の診断においてステップ（ａ）の測定結果および場合によりステップ（ｂ）の測定結果を使用するステップを含み、ここで、ＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌を示す、インビトロでの癌の診断方法に関する。

【0035】

本発明の方法は多くの異なった型の癌の診断に好適である。正常対照と比べた場合に、サンプル中のＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度の増大は、それぞれ例えば肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌のような特定の癌型において見られた。

【0036】

本発明の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度は、インビトロで癌を診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度は、インビトロで特定の癌型、例えば肺癌（ＬＣ）、卵巣癌（ＯＣ）、子宮内膜癌（ＥＣ）、黒色腫（ＭＭ）、乳癌（ＢＣ）、頭頚部癌（Ｈ／ＮＣ）、膀胱癌（ＢＬＣ）、膵臓癌（ＰＡＣ）、結腸癌（ＣＲＣ）、子宮頚癌（ＣＣ）、腎臓癌（ＫＣ）または前立腺癌（ＰＣ）などを診断するためにサンプル中で計測される。

【0037】

本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば肺、結腸、前立腺、膀胱、卵巣、または乳房の癌などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば肺癌（ＬＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば卵巣癌（ＯＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば子宮内膜癌（ＥＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。

【0038】

本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば黒色腫癌（ＭＭ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば乳癌（ＢＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば頭頚部癌（Ｈ／ＮＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば膀胱癌（ＢＬＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。

【0039】

本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば膵臓癌（ＰＡＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば結腸直腸癌（ＣＲＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば子宮頚癌（ＣＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば腎臓癌（ＫＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。
本発明の別の好ましい実施形態によると、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が、癌、例えば前立腺癌（ＰＣ）などをインビトロで診断するためにサンプル中で計測される。

【0040】

本発明の一実施形態は、おそらく癌のない個体と、「疑わしい」症例として分類され得る個体とを区別するための集団のマススクリーニングに関する。後者の群の個体は、次いで、例えば画像化方法または他の好適な手段によって、さらなる診断手順を受け得る。
本発明のさらなる実施形態は、一般的な癌の診断に好適である腫瘍マーカーパネル、または特定の腫瘍型、例えば肺癌の診断に好適な腫瘍マーカーパネルの改善に関する。

【0041】

本発明はさらに、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度、ならびに癌に特異的な１もしくは複数の他のマーカーの濃度をサンプル中で計測し、そして癌の診断において測定結果、特に測定した濃度を使用するステップを含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌の診断方法に関する。ＳＣＲＮ１と組合せた使用に好ましいマーカーは、一方で、汎用腫瘍マーカー（すなわち、単一腫瘍型に特異的ではないマーカー）のマーカーであり、他方で、特異的腫瘍マーカー（単一腫瘍型に特異的なマーカー）のマーカーである。癌、例えば肺癌または結腸癌の診断に好ましいマーカーは、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよび可溶性ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ複合体（＝ＤＰＰＩＶ／セプラーゼ）である。これらのマーカーは、個々にそれぞれまたはＳＣＲＮ１と共にいずれかの組合せで使用され得る。

【0042】

本発明はさらに、ＤＰＰＩＶ／セプラーゼの濃度および１もしくは複数の他の癌マーカー、例えば１若しくは複数の肺または結腸癌の他のマーカーの濃度をサンプル中で計測し、そして癌の診断において測定結果、特に測定した濃度を使用するステップを含む、インビトロでの生化学的マーカーによる癌、例えば肺癌または結腸癌などの診断方法をも対象とする。前記１もしくは複数の他のマーカーが、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択されることが好ましい。

【0043】

本発明はさらに、癌、例えばＬＣの診断における、少なくともマーカーＳＣＲＮ１、ならびに以下の：Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される少なくとも１つの他の腫瘍マーカーを含むマーカーパネルの使用をも対象とする。

【0044】

好ましくは、本発明はさらに、ＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度および１もしくは複数の他の癌マーカー、例えば１若しくは複数の肺または結腸癌の他のマーカーの濃度をサンプル中で計測し、そして癌の診断において測定結果、特に測定した濃度を使用するステップを含む、インビトロでの生化学的マーカーによる癌、例えば肺癌または結腸癌などの診断方法をも対象とする。前記１もしくは複数の他のマーカーが、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択されることが好ましい。

【0045】

本発明はさらに、ＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度の増大が癌を示す、癌の診断におけるＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の使用に関する。
本発明はさらに、サンプルが血清または血漿である、インビトロでの癌の診断におけるＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の使用に関する。
本発明はさらに、いくつかの特定の型の癌、特に肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌の診断におけるＳＣＲＮ１の使用に関する。
本発明はさらに、いくつかの特定の型の癌、特に肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓または結腸の癌の診断におけるＳＣＲＮ１の使用に関する。
本発明はさらに、いくつかの特定の型の癌、特に肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房または頭頚部の癌の診断におけるＳＣＲＮ１の使用に関する。
本発明はさらに、ＳＣＲＮ１および／またはその断片の濃度の増大が癌を示す、癌の診断におけるＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片に対する抗体の使用に関する。

【0046】

好ましくは、ＳＣＲＮ１は、サンドイッチ型免疫学的アッセイ形式（＝サンドイッチ免疫アッセイ）で検出される。
本発明はさらに、少なくとも、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片を特異的に計測するのに必要とされる試薬ならびに１若しくは複数の他の癌マーカーを含む、本発明による方法を実施するためのキットを提供する。
本発明はさらに、少なくとも、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片を特異的に計測するのに必要とされる試薬、ならびに場合により１若しくは複数の先に記載の他の癌マーカー、例えば肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌のマーカーを含み、ここで、前記他のマーカーを個別にまたはそれらのいずれかの組合せでそれぞれ使用できる、本発明による方法を実施するためのキットを提供する。

【0047】

本発明はさらに、少なくとも、ＳＣＲＮ１を特異的に計測するのに必要とされる試薬、ならびにＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される１若しくは複数の他のマーカー、そして場合によりその計測を実施するための補助試薬を含む本発明の方法を実施するためのキットを提供する。

【0048】

本発明はさらに、ＳＣＲＮ１、ならびにＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される１若しくは複数の他のマーカーを特異的に計測するための本発明による方法を実施するためのバイオチップ・アレイ、そして場合により当該計測を実施するための補助試薬を提供する。

【0049】

本発明はさらに、癌の診断において、ＳＣＲＮ１、ならびにＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される１若しくは複数の他のマーカーを特異的に計測するための本発明による方法を実施するためのバイオチップ・アレイを提供する。

【0050】

【0051】

用語「計測」は、好ましくはサンプル中のＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の定性的、半定量的、または定量的計測を含む。好ましい実施形態では、計測は、半定量的計測である、すなわち、ＳＣＲＮ１の濃度がカットオフ値より高いか低いかを計測する。当業者に認識されるように、イエス‐（存在）またはノー‐（非存在）アッセイでは、アッセイ感度は、通常、カットオフ値に適合するように設定される。カットオフ値は、例えば健常個体の群の試験から決定され得る。好ましくは、カットオフは９０％の特異性をもたらすように設定され、また好ましくはカットオフは９５％の特異性をもたらすように設定され、あるいはまた好ましくはカットオフは９８％の特異性をもたらすように設定される。カットオフ値より高い値は、例えば癌の存在を示し得る。特に、カットオフ値より高い値は、例えば肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚部、頭頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌の存在を示し得る。さらに好ましい実施形態では、ＳＣＲＮ１の計測は、定量的計測である。さらなる実施形態では、ＳＣＲＮ１の濃度は、根本的な診断的疑問、例えば疾患のステージ、疾患進行、または治療への応答などに相関する。

【0052】

別の好ましい実施形態では、カットオフは９０％の感度をもたらすように設定され、また好ましくはカットオフは９５％の感度をもたらすように設定され、あるいはまた好ましくはカットオフは９８％の感度をもたらすように設定される。
カットオフ値より低い値は、例えば癌の不存在を示し得る。特に、カットオフ値より低い値は、例えば肺、結腸、乳房、卵巣、子宮頚部、頭頚部、子宮内膜、黒色腫、膀胱、腎臓、膵臓、前立腺、食道、胃および／または胆管の癌の不存在を示し得る。
さらに好ましい実施形態では、ＳＣＲＮ１の計測は、定量的計測である。さらなる実施形態では、ＳＣＲＮ１の濃度は、根本的な診断に関する問題、例えば疾患のステージ、疾患進行、または治療への応答などに相関する。

【0053】

セセルニン‐１タンパク質（＝ＳＣＲＮ１）、Swiss PROT ID:Q12765は、配列番号１（図１４）に示された配列を特徴とする４６．４ｋＤａの分子量を有する４１４個のアミノ酸から成るサイトゾルタンパク質である。ＳＣＲＮ１のコード配列は、骨髄由来のｃＤＮＡクローンの分析によってNagase, T.らにより１９９６年に予測された（Nagase, T. et al., DNA Res. 3 (1996) 17-24）。最近になって、それぞれの遺伝子が第７染色体上に位置していることや、遺伝子構造が解明された（Hillier, L.N. et al., Nature 424 (2003) 157-164）。現在、遺伝子は十分に特徴づけられているが、ＳＣＲＮ１の生物学的役割と機能は部分的にしか理解されていない。ＳＣＲＮ１は、マスト細胞の分泌を調節し、そしてカルシウムでの刺激に対する細胞の感度を増強する（Way, G. et al., Mol. Biol. Cell 13 (2002) 3344-3354）。ＳＣＲＮ１はまた、そのタンパク質の機能が定義されていないにもかかわらず、プロテオミックス法によって血小板中で検出された（O'Neill, E.E. et al., Proteomics 2 (2002) 288-305）。最近の刊行物では、ＲＮＡ発現のレベルが胃癌に関係していた（Yamashita, S. et al., Cancer Sci. 97 (2006) 64-71、Suda, T. et al., Cancer Sci. 97 (2006) 411-419）。レーザーキャプチャー顕微解剖によって単離され、続いてｃＤＮＡを作製した細胞を、アフィメトリックスマイクロアレイを使用して分析すると、発現増加はまた、前癌状態であるバレット食道においても見られた（Sabo, E. et al., Clin. Cancer. Res. 14 (2008) 6440-6448）。しかしながら、これらの研究のいずれもタンパク質レベルに対する確認を示さなかった。今までのところ、癌の診断マーカーとしての体液中のタンパク質ＳＣＲＮ１の検出は文献に記載されていない。

【0054】

本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、本項のものと関連する意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）の冠詞の文法的対象物を示すために本明細書中で使用される。例として、「マーカー（a marker）」は、１つのマーカーまたは２つ以上のマーカーを意味する。用語「少なくとも」は、場合により１もしくは複数のさらなる対象物が存在し得ることを示すために使用される。例として、少なくとも（マーカー）ＳＣＲＮ１およびＣＹＦＲＡ２１‐１を含むマーカーパネルは、場合により１もしくは複数の他のマーカーを含み得る。

【0055】

表現「１もしくは複数」は、１〜５０、好ましくは１〜２０、また好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または１５を示す。
用語「チップ」、「バイオチップ」、「ポリマーチップ」または「タンパク質チップ」は、互換的に使用されて、ケイ素ウエハー、ナイロン片、プラスチック片、またはガラススライドの一部であり得る共用基板上に配置された多数のプローブ、マーカーまたは生化学的マーカーの集合体を指す。

【0056】

「アレイ」、「マクロアレイ」または「マイクロアレイ」は、基板または固体表面、例えばガラス、プラスチック、シリコンチップまたはアレイを形成する他の材料に取り付けられたかまたはそれらの上に組立てられた物質、例えば分子、マーカー、開口部、マイクロコイル、検出装置および／またはセンサーなどの意図的に作製された集合体である。アレイは、同時に多数、例えば数十個、数千個または数百万個の反応または組合せのレベルを計測するのに使用される。アレイはさらに、例えば少数、１個、数個または１ダースの物質を含むこともできる。アレイ内の物質は、互いに同一であってもまたは異なっていてもよい。アレイは、様々な形式、例えば可溶性分子に関するライブラリー、固定化分子に関するライブラリー、固定化抗体に関するライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップまたは他の固体支持体につながれた化合物に関するライブラリーを想定している。アレイは、アレイ上のパッドのサイズによってマクロアレイまたはマイクロアレイのいずれかであり得る。マクロアレイは、一般に、約３００ミクロン（μｍ）以上のパッドサイズを含み、ゲルやブロットスキャナによって容易に画像化できる。マイクロアレイは、一般に、３００ミクロン（μｍ）未満のパッドサイズを含むであるだろう。

【0057】

「固体支持体」は、ライブラリーメンバーまたは試薬が固定化されるように、または（濾過、遠心分離、洗浄などによって）それらを過剰な試薬、可溶性の反応副産物、もしくは溶媒から容易に分離できるように、そこに取り付けられうるか、または（多くの場合リンカーを介して）共有結合させる不溶性の官能化された重合物質である。

【0058】

用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用される場合、患者の試験サンプルを分析するための標的として使用される分子を指す。かかる分子標的の例は、タンパク質またはポリペプチドである。本発明でマーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前述のタンパク質の天然の変異体、ならびに前述のタンパク質または前述の変異体の断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことが考えられる。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは前述のマーカーポリペプチドの少なくとも６、７、８、１０、１２、１５または２０個の連続したアミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるタンパク質または細胞外マトリックスに存在するタンパク質が、例えば炎症中に損傷され得、かかる断片に分解または切断され得ることを理解する。特定のマーカーは不活性形態で合成され、その後タンパク質分解によって活性化され得る。当業者に認識されるように、タンパク質またはその断片が複合体の一部としても存在し得る。また、かかる複合体は、本発明の意味でのマーカーとして使用され得る。マーカーポリペプチドの変異体は、同じ遺伝子によってコードされるが、例えば選択的ｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡのプロセッシングの結果として等電点（＝ＰＩ）または分子量（＝ＭＷ）あるいはその両方で異なり得る。変異体のアミノ酸配列は、対応するマーカー配列と９５％以上同一である。加えて、もしくはあるいは、マーカーポリペプチドまたはその変異体は、翻訳後修飾を有し得る。翻訳後修飾の制限されることのない例は、グリコシル化、アシル化、および／またはリン酸化である。

【0059】

ＳＣＲＮ１タンパク質、特に可溶性形態のＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片は、適切なサンプル中で検出される。好ましいサンプルは、組織サンプル、組織溶解物または体液、例えば血液、血漿、血清、尿、気管支肺胞洗浄液（＝ＢＬＡ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）または上皮内層液（＝ＥＬＦ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）などである。好ましくは、サンプルは、ヒト被験体、例えば腫瘍患者または腫瘍のリスクがあるヒトあるいは腫瘍を患っていると疑われるヒトに由来する。

【0060】

本発明による好ましい実施形態では、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度が測定される。一実施形態では、マーカーＳＣＲＮ１は、特異的結合物質の使用によってサンプルから特異的に測定される。
特異的結合物質は、例えばＳＣＲＮ１のレセプター、ＳＣＲＮ１に結合するレクチン、またはＳＣＲＮ１と反応する抗体である。特異的結合物質は、その対応する標的分子に対して少なくとも１０⁷ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。特異的結合物質は、好ましくはその標的分子に対して１０⁸ｌ／ｍｏｌあるいはまた好ましくは１０⁹ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。

【0061】

当業者に認識されるように、特異的という用語はサンプル中に存在する他の生体分子がＳＣＲＮ１に特異的な結合物質と有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子と結合するレベルは、それぞれ標的分子に対する結合親和性のせいぜい１０％以下だけ、５％以下だけ、２％以下だけ、または１％以下だけの結合親和性である。好ましい特異的結合物質は、親和性ならびに特異性の先の最小基準の両方を満たす。

【0062】

特異的結合物質は、好ましくはＳＣＲＮ１と反応する抗体である。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の抗原結合フラグメント、単鎖抗体ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物を指す。

【0063】

特異的結合物質の先の基準を満たす任意の抗体断片が使用され得る。抗体は、当該技術の水準の方法によって、例えばTijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdamの本全体、特に４３〜７８頁）に記載されるように作製される。加えて、当業者は、抗体の特異的単離に使用され得る免疫吸着剤に基づく方法を知っている。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の質が高められ得、従って免疫アッセイの性能が高められ得る（Tijssen, P.、前掲、１０８〜１１５頁）。

【0064】

本発明に開示される成果のために、ウサギにおいて惹起されたポリクローナル抗体が使用され得る。しかし、明らかに、異なる種、例えばヒツジまたはヤギ由来のポリクローナル抗体、ならびにモノクローナル抗体も使用され得る。モノクローナル抗体は任意の必要量で一定した性質で産生され得るために、これらは臨床ルーチンのアッセイの開発において理想的なツールとなる。本発明による方法におけるＳＣＲＮ１に対するモノクローナル抗体の作製および使用のそれぞれを、さらに他の好ましい実施形態にして表す。

【0065】

免疫学的アッセイは、当業者にとって周知である。かかるアッセイ、ならびに実用適用や手順を実施するための方法は関連する教本にまとめられている。関連する教本の例は、Tijssen, P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates, In: Practice and theory of enzyme immunoassays, pp. 221-278、Burden, R.H. and v. Knippenberg, P.H. (eds.), Elsevier, Amsterdam (1990)、および免疫学的検出法を扱っているMethods in Enzymology, Colowick, S.P., and Caplan, N.O. (eds.), Academic Pressの様々な巻、特に７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻である。

【0066】

ここで、当業者に認識されるように、ＳＣＲＮ１は、癌、好ましくは肺癌の診断において有用なマーカーとして同定された。本発明の成果に匹敵する結果に達するために様々な免疫診断手順が使用され得る。例えば、抗体を作製するための代替的戦略が使用され得る。かかる戦略は、中でも免疫化のためのＳＣＲＮ１のエピトープを提示する合成ペプチドの使用を含む。あるいは、ＤＮＡワクチン接種としても知られるＤＮＡ免疫化が使用され得る。

【0067】

計測のために、個体から得られたサンプルは、結合物質ＳＣＲＮ１複合体の形成に適切な条件下でＳＣＲＮ１に特異的結合物質とインキュベートされる。当業者はいかなる発明的努力なしに、かかる適切なインキュベーション条件を容易に同定し得るため、かかる条件は特定される必要はない。結合物質ＳＣＲＮ１複合体の量が計測され、そして癌、好ましくは肺癌の診断に使用される。当業者に認識されるように、特異的結合物質ＳＣＲＮ１複合体の量を計測する多くの方法が存在し、そのすべててが関連の教本に詳細に記載されている（例えば、Tijssen P.、前掲またはDiamandis, E.P. and Christopoulos, T.K. (eds.), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)を参照のこと）。

【0068】

好ましくは、ＳＣＲＮ１は、サンドイッチ型アッセイ形式（＝サンドイッチ免疫アッセイ）で検出される。かかるアッセイにおいて、一方でＳＣＲＮ１を捕捉するために第一の特異的結合物質が使用され、他方で直接的または間接的に検出可能に標識される第二の特異的結合物質が使用される。サンドイッチ型アッセイ形式で使用される特異的結合物質は、ＳＣＲＮ１に対して特異的な抗体であり得る。

【0069】

本発明の意味において「癌のマーカー」は、マーカーＳＣＲＮ１と組合せた場合に、癌疾患の診断において、一般的な癌の診断または特定の癌の型の診断において、例えばＬＣ、ＰＲＯ、ＢＬＣ、ＯＣ、ＢＣまたはＣＲＣの診断において関連する情報を付加する任意のマーカーである。癌の診断に対して、所定の特異性での感度または所定の感度での特異性それぞれが、マーカーＳＣＲＮ１を既に含むマーカー組合せに前述のマーカーを含めることによって改善され得る場合に、情報は関連するまたは付加的な価値とみなされる。癌診断の好ましい実施形態では、感度または特異性それぞれの改善は、ｐ＝．０５、．０２、．０１またはそれ以下の有意性のレベルにて統計学的に有意である。好ましくは、１もしくは複数の他の腫瘍マーカーは、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される。

【0070】

用語「サンプル」は、本明細書で使用される場合、インビトロでの診断の目的で得られる生物学的サンプルを指す。本発明の方法において、サンプルまたは患者サンプルは、好ましくは任意の体液を含み得る。好ましいサンプルは、組織サンプル、組織溶解物または体液、例えば全血、血漿、血清、尿、気管支肺胞洗浄液（＝ＢＬＡ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）または上皮内層液（＝ＥＬＦ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）などであり、血漿または血清が最も好ましい。

【0071】

「組織サンプル」および／または「組織切片」という用語は、本明細書中では、インビトロでの診断の目的のために細胞または組織の取り出しにかかわる手術、治療的な切除または生検（例えば、切開生検、切除生検、コア生検または細針吸引生検）中に患者から取り出された生物学的サンプルを指す。本発明による分析を実施するとき、組織サンプル物質はそのまま使用されるかまたは「組織溶解物」として使用される。「組織サンプル」はまた、本明細書中で使用される場合、通常、ミクロトームの使用によって達成される薄い組織切片も指す。生物学的サンプルにかかわるいずれの開示された方法の実施形態でも、かかる生物学的サンプルは、顕微鏡用スライド上に封入されることができ（しかし必ずというわけではない）、組織切片（ホルマリン固定化やパラフィン包埋組織切片など）であり、および／または新生物組織（肺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、胃癌、または神経膠芽腫）である。

【0072】

「細胞溶解物」、「組織溶解物」、「溶解物」、「溶解サンプル」、「組織抽出物」または「細胞抽出物」は、本明細書中で使用される場合、溶解した組織または細胞を含むサンプルおよび／または生物学的サンプル物質を指す、すなわち、このなかでは、組織または細胞の構造完全性は失われている。細胞または組織サンプルの内容物を放出するために、材料は、通常、かかる組織または細胞の細胞壁や細胞膜を溶解、分解または破壊するために酵素および／または化学物質で処理される。当業者は、溶解物を得るための適当な方法を完全に熟知している。この工程は「溶解」という用語によって網羅される。

【0073】

用語「癌の診断」、特に「肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌の診断」は、本発明の方法が（単独または他のマーカーもしくは変数、例えばＵＩＣＣ（前記参照）に示される基準と共に）、例えば医師が癌、特にＬＣまたはＣＲＣの不存在または存在を確立または確認することを補助し、あるいは予後、再発の検出（手術後の患者の追跡）および／または処置のモニタリング、特に化学療法のモニタリングにおいて医師を補助することを示すために使用される。

【0074】

当業者に認識されるように、任意のかかる診断はインビトロで行われる。患者サンプルは後で廃棄される。患者サンプルは、本発明のインビトロ診断方法だけに使用され、患者サンプルの物質は、患者の体内に戻されない。典型的には、サンプルは、液体サンプル、例えば全血、血清、または血漿である。

【0075】

別段の注意がない限り、専門用語は慣例的用法に従って使用される。細胞および分子生物学における一般用語の定義は、Lewin, B., Genes V（Oxford University Pressにより刊行（1994）、ISBN 0-19-854287 9）；Kendrew, J. et al.（編）、The Encyclopedia of Molecular Biology（Blackwell Science Ltd.により刊行（1994）、ISBN 0-632-02182-9）；およびMeyers, R.A.（編）、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference（VCH Publishers, Inc.により刊行（1995）、ISBN 1-56081-569 8)の中に見ることができる。

【0076】

好ましい実施形態では、本発明は、ＳＣＲＮ１の濃度をサンプル中で計測し、そして計測した濃度を癌、例えばＬＣの診断において使用するステップを含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌、例えばＬＣの診断方法に関する。

【0077】

他の好ましい実施形態では、本発明は、ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片の濃度をサンプル中で計測し、そして計測した濃度をＬＣの診断において使用するステップを含む、生化学マーカーによるインビトロでのＬＣの診断方法に関する。

【0078】

本発明の発明者らは、驚いたことに、癌、特に肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌を患っている患者に由来するサンプルから有意な確率でマーカーＳＣＲＮ１の濃度の増大を検出できた。さらにより驚いたことに、発明者らは、個体から得られたかかるサンプル中のＳＣＲＮ１の濃度の増大が癌、特に先に触れた癌疾患の診断に使用され得ることを示すことができた。

【0079】

診断の理想的なシナリオは、単一の事象またはプロセスがそれぞれの疾患、例えば感染性疾患を引き起こす状況である。すべてての他の症例において、正確な診断は、特に疾患の病因が、多くの癌型、例えばＬＣの症例のように十分に理解されていない場合に非常に困難であり得る。当業者が理解するように、所定の多要因疾患、例えばＬＣについて１００％特異性および同時に１００％感度で診断する生化学マーカーはない。むしろ、生化学マーカー、例えばＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、または本明細書に示されるＳＣＲＮ１は、特定の可能性または予測値で、例えば疾患の存在、不存在または重症度を診断するために使用され得る。したがって、日常的な臨床診断において、一般的に様々な臨床症状および生物学的マーカーは、根本的な疾患の診断、治療および管理において共に考慮される。

【0080】

生化学マーカーは、個々に計測され得るか、または本発明の好ましい実施形態では、これらはチップまたはビーズベースのアレイ技術の使用によって同時に計測され得る。生物マーカーの濃度は、次いで、例えば各マーカーのそれぞれのカットオフを使用して独立して解釈されるか、またはこれらが解釈のために組合せられるかのいずれかである。

【0081】

さらに好ましい実施形態では、本発明による癌の診断は、ａ）ＳＣＲＮ１タンパク質および／またはその断片、およびｂ）１もしくは複数の他の癌マーカーの濃度をサンプル中で計測し、そしてｃ）癌の診断においてステップ（ａ）およびステップ（ｂ）のそれぞれで計測した計測結果、例えば濃度を使用するステップを含む方法により実施される。

【0082】

癌の診断において、マーカーＳＣＲＮ１は以下の態様：スクリーニング；診断補助；予後；化学療法、放射線療法、および免疫療法などの療法のモニタリングの１もしくは複数で有利である。

【0083】

スクリーニング：
スクリーニングは、疾患の指標、例えば癌の存在について、個体、例えばリスクのある個体を同定するための試験の体系的な適用と規定される。好ましくは、スクリーニング集団は、癌のリスクが平均より高いことが知られた個体で構成される。例えば、肺癌のスクリーニング集団は、喫煙者、元喫煙者、およびウラン、石英またはアスベストに晒された労働者などの肺癌のリスクが平均より高いことが知られた個体で構成される。

【0084】

好ましい実施形態では、組織サンプル、組織溶解物またはいずれかの体液、例えば全血、血漿、血清、尿、気管支肺胞洗浄液（＝ＢＬＡ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）または上皮内層液（＝ＥＬＦ；ＬＣが疑わしい症例において好ましい）などが、癌、例えば肺癌のスクリーニングにおけるサンプルとして使用される。

【0085】

多くの疾患について、スクリーニング目的に必要な感度および特異性の基準を常に満たす、循環中の単一生化学マーカーはない。このことは癌、特に肺癌についてもいえると思われる。複数のマーカーを含むマーカーパネルが癌のスクリーニングに使用されなければならないことが予想されるはずである。本発明において確立されたデータは、マーカーＳＣＲＮ１がスクリーニング目的に適したマーカーパネルの不可欠な部分を形成することを示唆している。したがって、本発明は、癌マーカーパネル、すなわち、ＳＣＲＮ１および癌スクリーニング目的のための１もしくは複数のさらなるマーカーを含むマーカーパネルのマーカーの１つとしてのＳＣＲＮ１の使用に関する。特に、本発明は、一般的な癌マーカーパネルのマーカーの１つとしてのＳＣＲＮ１の使用に関する。かかるマーカーパネルは、マーカーＳＣＲＮ１および１もしくは複数のさらなるマーカー、例えば、一般的な癌マーカーおよび／または先に触れた癌型のマーカーを含む。

【0086】

マーカーの組合せは、分子アッセイの値を有意に改善する。第一に、マーカーパネルを使用するアッセイの感度が有意に改善される。第二に、精巧な統計モデルが多マーカーアッセイのＲＯＣ曲線分析を可能にするため、その結果は、最良の個々のマーカーと比較して診断精度が有意に増強されたことを裏付けている。

【0087】

ＳＣＲＮ１はさらに、ある種の特定の癌型、例えば肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌のマーカーパネルに寄与する可能性がある。
ＳＣＲＮ１を含むマーカーパネルで診断される他の好ましい癌型は、肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓または結腸の癌である。
ＳＣＲＮ１を含むマーカーパネルで診断される他の好ましい癌型は、肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房または頭頚部の癌である。
ＳＣＲＮ１を含むマーカーパネルで診断される他の好ましい癌型は、肺癌（ＬＣ）または結腸癌（ＣＲＣ）である。
ＳＣＲＮ１を含むマーカーパネルで診断される癌の好ましい型は肺癌（ＬＣ）である。

【0088】

当該データは、さらに、マーカーの特定の組合せが癌のスクリーニングに有利であることを示唆している。
例えば、癌のスクリーニングの好ましい実施形態に関して、本発明はさらに、ＳＣＲＮ１、ならびにＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される少なくとも１つもしくは複数のマーカーを含むマーカーパネルの使用にも関する。

【0089】

診断補助：
マーカーは、特定の臓器の良性疾患対悪性疾患の鑑別診断を補助するか、異なる組織学的腫瘍型の識別を補助するか、または手術前のベースラインマーカー値を確立するかのいずれかであり得る。

【0090】

今日、肺癌の検出に使用される重要な方法は、放射線学および／またはコンピューター連動断層撮影（ＣＴ）スキャンである。小結節、すなわち、疑わしい組織の小領域は、これらの方法によって可視化され得る。しかしながら、これらの結節の多く‐ＣＴで９０％超‐は良性組織変化を示し、少数の結節のみが癌性組織を示す。マーカーＳＣＲＮ１の使用は、良性対悪性疾患の識別を補助し得る。

【0091】

好ましい実施形態では、マーカーＳＣＲＮ１は、異なった組織学的癌型を確立するかまたは確認するための免疫組織学的方法において使用される。
単独マーカーとしてのＳＣＲＮ１は、例えばＬＣの場合において、ＣＥＡまたはＮＳＥなどの他のマーカーを超越し得るため、ＳＣＲＮ１は、特に、手術前のベースライン値を確立することにより診断補助として使用されることが予測されるはずである。よって、本発明はさらに、手術前の癌のベースライン値を確立するためのＳＣＲＮ１の使用にも関する。

【0092】

予後：
診断指標は、一定の尤度で疾患転帰を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的、または生化学的特徴と定義され得る。それらの主な使用は、患者管理の合理的な計画、すなわち、それぞれ急性進行性疾患の過少処置および進行が遅い疾患の過剰処置の回避を補助すべきである。Molina, R. et al., Tumor Biol. 24 (2003) 209-218では、ＮＳＣＬＣにおいてＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＣＹＦＲＡ２１‐１、ＳＳＣおよびＮＳＥの予後値が診断された。彼らの研究では、マーカーＮＳＥ、ＣＥＡ、およびＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の異常血清レベルは、短い生存を示すようであった。

【0093】

ＳＣＲＮ１は単独で癌患者、例えば、ＬＣ患者と健常対照との識別に有意に寄与するので、癌、好ましくはＬＣを患っている患者の予後の診断を補助することが予測されるはずである。手術前のＳＣＲＮ１のレベルは、大抵、１もしくは複数の他の癌マーカーおよび／またはＴＮＭステージ分類システムと組み合わされる。好ましい実施形態では、ＳＣＲＮ１はＬＣを患っている患者の予後に使用される。

【0094】

化学療法のモニタリング：
Merle, P. et al., Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315では、導入化学療法で処置された局所進行ＮＳＣＬＣを患っている患者におけるＣＹＦＲＡ２１‐１血清レベルの変化が診断された。彼らは、ＣＹＦＲＡ２１‐１血清レベルの早期モニタリングがステージＩＩＩのＮＳＣＬＣ患者の腫瘍応答および生存の有用な予後ツールであり得ると結論づけた。加えて、報告により、ＬＣを患っている患者の処置のモニタリングにおけるＣＥＡの使用が記載された（Fukasawa, T. et al., Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867）。これらの研究のほとんどは、遡及的で、ランダムではなく、少数の患者しか含んでいなかった。ＣＹＦＲＡ２１‐１を用いた研究の場合のように、ＣＥＡ研究は、ａ）化学療法を受けている間にＣＥＡレベルが増大した患者は、大抵、ＣＥＡレベルが増大しなかった患者よりも良好な結果を有し、（ｂ）ほぼすべての患者で、ＣＥＡレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示した。

【0095】

ＳＣＲＮ１は、それぞれＣＹＦＲＡ２１‐１またはＣＥＡと少なくとも同程度に良好な化学療法のモニタリングのためのマーカーであることが予測される。そのため、本発明はさらに、療法下の癌患者、好ましくは肺癌（ＬＣ）患者のモニタリングにおけるＳＣＲＮ１の使用に関する。
処置のモニタリングにおいて、好ましい一実施形態では、ＳＣＲＮ１の計測値と、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される少なくとも１つのマーカーの計測値が、肺癌（ＬＣ）の診断において組み合わされ、そして使用される。

【0096】

追跡：
癌性組織の完全な除去を目的とした外科的切除を受けるＬＣ患者の大部分は、後に再発性または転移性の疾患を発症する（Wagner, H. Chest 117 (2000) 110-118；Buccheri, G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980）。これらの再発のほとんどは、手術後最初の２〜３年以内に起こる。再発性／転移性疾患は、検出が遅すぎた場合は常に致死的であるため、多数の研究が、その初期ひいては潜在的に処置可能なステージでの癌再発に焦点を当てている。

【0097】

その結果、多くの癌患者、例えばＬＣ患者は、多くの場合ＣＥＡの定期的モニタリングを含む、術後のサーベイランスプログラムを受ける。外科的切除後１年間のＣＥＡの連続モニタリングにより、再発性／転移性疾患が、疑わしい症状または徴候がない場合であっても、早期の術後再発性／転移性疾患がほぼ９７％の特異性でほぼ２９％の感度で検出されることが示された（Buccheri, G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980）。とって、手術後のＬＣを患っていた患者の追跡は、適切な生化学的マーカーの使用の最も重要な領域の１つである。調査したＬＣ患者におけるＳＣＲＮ１の高い感度のため、おそらく、ＳＣＲＮ１単独または１もしくは複数の他のマーカーとの組合せは、ＬＣ患者の追跡、特に手術後のＬＣ患者の追跡に非常に有用である。ＬＣ患者の追跡におけるＳＣＲＮ１およびＬＣの１もしくは複数の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらに好ましい実施形態を示す。

【0098】

本発明は、好ましい実施形態では、癌の診断分野におけるＳＣＲＮ１の使用に関する。好ましくは、ＳＣＲＮ１は、肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌のそれぞれの診断に使用される。

【0099】

またさらに好ましい実施形態では、本発明は、１もしくは複数のさらなる癌マーカー分子と組合せた、癌、例えば、一般的な癌または肺、卵巣、子宮内膜、黒色腫、乳房、頭頚部、膀胱、膵臓、結腸、子宮頚部、腎臓または前立腺の癌などの特定の癌型のマーカー分子としてのＳＣＲＮ１の使用に関する。さらなるマーカー分子は、癌型に非特異的な一般マーカー分子および／または癌型に特異的なマーカー分子、例えば、肺癌のマーカー分子であり得る。ＳＣＲＮ１および少なくとも１つのさらなるマーカーが、個体から得られた液体サンプルにおいて癌、例えば肺癌の診断に使用される。ＳＣＲＮ１の計測と組み合わされ得る、選択される好ましい他の癌マーカーは、Ｃｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼである。特に、ＳＣＲＮ１の計測と組み合わされ得る、選択される好ましい他のＬＣマーカーは、ＣＹＦＲＡ２１‐１、ＣＥＡ、ＣＡ１９‐９、ＳＣＣ、ＣＡ１２５、ｐｒｏＧＲＰおよび／またはＮＳＥである。またさらに好ましくは、癌、例えばＬＣの診断において使用されるマーカーパネルは、ＳＣＲＮ１、ならびにＣＹＦＲＡ２１‐１およびＣＥＡから成る群から選択される少なくとも１つの他のマーカー分子を含む。

【0100】

当業者に理解されるように、調査中の診断上の疑問を改善するために２種類以上のマーカーの計測値を使用する多くの方法がある。全く単純に、しかしながら、しばしば効果的なアプローチにおいて、調査された少なくとも１種類のマーカーについてサンプルが陽性である場合、陽性の結果が仮定される。このことは、例えばＡＩＤＳのような感染性疾患の診断の場合であり得る。

【0101】

しかしながら、頻繁にマーカーの組合せが評価される。好ましくは、マーカーパネルのマーカー、例えばＳＣＲＮ１およびＣＹＦＲＡ２１‐１についての計測値は、数学的に組合され、組合された値は診断的疑問の原因と相関される。マーカー値は、当該技術分野の技術水準の任意の適切な数学的方法により組合され得る。マーカーの組合せを疾患に相関させる周知の数学的方法には、判別分析（ＤＡ）（すなわち、一次、二次、標準化ＤＡ）、Ｋｅｒｎｅｌ法（すなわちＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（すなわちｋ‐最近接分類）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーベース法（すなわち論理回帰、ＣＡＲＴ、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング（Boosting/Bagging）法）、一般化線形モデル（すなわちロジスティック回帰）、主成分ベース法（すなわちＳＩＭＣＡ）、汎用付加モデル、ファジー理論ベースの方法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズムベースの方法のような方法を用いる。当業者は、本発明のマーカーの組合せを診断するための適切な方法の選択を問題としない。好ましくは、本発明のマーカーの組合せを、例えばＬＣの有無に相関させることに用いられる方法は、ＤＡ（すなわち一次、二次、標準化判別分析）、Ｋｅｒｎｅｌ法（すなわちＳＶＭ）、ノンパラメトリック法（すなわちｋ‐最近接分類）、ＰＬＳ（部分最小二乗）、ツリーベース法（すなわち論理回帰、ＣＡＲＴ，ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線形モデル（すなわちロジスティック回帰）から選ばれる。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献：Ruczinski, I., et al, J. of Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511；Friedman, J.H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175；Hastie, T. et al., The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001)；Breiman, L., et al., Classification and regression trees, California: Wadsworth (1984)；Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32；Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003)；およびDuda, R.O. et al., Pattern Classification, Wiley Interscience, 2nd edition (2001)中に見られる。

【0102】

生物学的マーカーの基礎的な組合せに対して最適な多変量カットオフを使用し、状態Ａを状態Ｂと、例えば、疾患状態を健常と区別することは、本発明の好ましい実施形態である。このタイプの解析では、マーカーは、もはや独立的ではなくマーカーパネルを形成する。

【0103】

診断方法の精度は、その受診者動作特性（ＲＯＣ）によって最もよく示される（特にZweig, M.H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照のこと）。ＲＯＣグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られるすべての感度／特異性ペアのプロットである。

【0104】

実験室での試験の臨床成績は、その診断の精度または被験体を臨床的に関連する亜群へと正確に分類する能力に依存している。診断の精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を診断するものである。かかる状態は、例えば健常と疾患または良性疾患対悪性疾患である。

【0105】

各場合において、ＲＯＣプロットは、判定閾値の全範囲について１‐特異性に対して感度をプロットすることにより２つの分布間の重複を示す。ｙ軸上は感度、すなわち真陽性の割合［（真陽性試験結果の数）／（真陽性の数＋偽陰性試験結果の数）と定義される］である。これはまた、疾患または状態の存在下での陽性と称されている。それは罹患した亜群単独から算出される。ｘ軸上は偽陽性の割合、すなわち１‐特異性［（偽陽性結果の数）／（真陰性の数＋偽陽性結果の数）と定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から算出される。真陽性および偽陽性の割合は、２つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ＲＯＣプロットはサンプル中の疾患の罹患率から独立している。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度／１‐特異性のペアを表している。完全な区別を伴う試験（結果の２つの分布に重複がない）は、左上の角を通るＲＯＣプロットを有し、この場合、真陽性の割合は１．０すなわち１００％（完全な感度）であり、偽陽性の割合は０（完全な特異性）である。区別を伴わない試験の理論的プロット（２つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かって４５°の斜め線となる。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ＲＯＣプロットが４５°の斜め線の下方に完全に含まれる場合、これは「陽性度」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。

【0106】

実験室での試験の診断の精度を定量化するための好ましい方法の１つは、単一の数によりその成績を表すことである。かかる全般的パラメータは、例えば、いわゆる「総誤差」あるいは「曲線下面積＝ＡＵＣ」である。最も一般的な世界的尺度はＲＯＣプロット下面積である。慣例により、この面積は常に≧０．５である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換えることができる）。数値は１．０（２群の試験値の完全な分離）と０．５（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の間の範囲である。この面積は、斜め線に最も近い点または９０％特異性での感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットにも依存する。これは、ＲＯＣプロットが完全なもの（面積＝１．０）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。

【0107】

ＳＣＲＮ１の測定値をＣｙｆｒａ２１‐１もしくはＣＥＡのような他のマーカーと、またはまだ発見されていないＬＣの他のマーカーと組合せることで、ＳＣＲＮ１は、それぞれＬＣの診断におけるさらなる改善をもたらすか、またはもたらすであろう。

【0108】

好ましい実施形態では、本発明は、サンプル中の少なくともＳＣＲＮ１の濃度、ならびにＣｙｆｒａ２１‐１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＣＡ１９‐９、ＣＡ１２５、ＰＳＡ、ｐｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＮＮＭＴ、抗ｐ５３自家抗体、セプラーゼおよびＤＰＰＩＶ／セプラーゼから成る群から選択される１若しくは複数の他の腫瘍マーカーの濃度をそれぞれ計測し、そして計測した濃度を癌、例えばＬＣの有無と相関させることによって、癌、例えばＬＣ対健常対照の診断の精度を改善するための方法であって、改善により、いずれかの単一マーカー単独での調査に基づいた分類と比べて、健常対照に対してより多くの患者が癌、例えばＬＣを患っていると正確に分類される方法に関する。

【0109】

さらに好ましい実施形態では、本発明は、サンプル中の少なくともＳＣＲＮ１およびＣｙｆｒａ２１‐１の濃度、そして場合によりＣＥＡおよび／またはＮＳＥの濃度をそれぞれ計測し、そして計測した濃度を癌、例えばＬＣの有無と相関させることによって、癌、例えばＬＣ対健常対照の診断の精度を改善するための方法であって、改善により、いずれかの単一マーカー単独での調査に基づいた分類と比べて、健常対照に対してより多くの患者が癌、例えばＬＣを患っていると正確に分類される方法に関する。

【0110】

以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の要旨から逸脱することなく記載した手順において修飾が行われ得ることは理解されている。

【実施例】

【0111】

実施例１
肺癌に対する潜在的マーカーとしてのＳＣＲＮ１の同定
組織の起源：
肺癌に対する潜在的診断マーカーとしての腫瘍特異的タンパク質を同定するために、プロテオミックス法を使用して異なる２種類の組織の分析を実施する。
合計で、２０人の肺癌（ＬＣ）に罹患している患者から採取した組織標本を分析する。各患者からの２種類の異なった組織タイプ：腫瘍組織（＞８０％の腫瘍）（Ｔ）と隣接している健全な組織（Ｎ）を治療的な切除から採集する。後者は、対応する健常対照サンプルとしての役割を果たす。組織は、切除後すぐにスナップ冷凍し、加工まで−８０℃にて貯蔵する。腫瘍を組織病理学基準によって診断する。

【0112】

組織サンプル：
０．８〜１．２ｇの凍結組織を、小片に切断し、ミキサーボールミルの冷やした破砕ジャーに移し、そして液体窒素によって完全に凍らせる。組織を、ボールミルにより粉末にし、１０倍量の溶解バッファー（４０ｍＭのクエン酸Ｎａ、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、１％のＧｅｎａｐｏｌＸ‐０８０、０．０２％のアジ化Ｎａ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）ＥＤＴＡ不含［Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany、カタログ番号1 873 580］）を有する）中に溶かし、それに続いてＷｈｅａｔｏｎ（登録商標）ガラス・ホモジナイザーによりで均質化する（２０×ゆるい状態、２０×ぴったりの状態）。均質化したものを遠心分離にかけ（５，０００×ｇにて１０分間）、上清を別のバイアルに移し、そして再び遠心分離にかける（２０，０００×ｇにて１５分間）。得られた上清には可溶性タンパク質が含まれており、それをさらなる分析に使用する。

【0113】

分画電気泳動（ＩＥＦ）とＳＤＳ‐ＰＡＧＥ：
ＩＥＦのために、３ｍｌの懸濁液を、１２ｍｌのサンプルバッファー（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２％のＣＨＡＰＳ、０．４％のＩＰＧバッファーｐＨ４〜７、０．５％のＤＴＴ）と混合し、そして１時間インキュベートした。そのサンプルを、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ‐１５デバイス（Millipore GmbH、Schwalbach, Germany）により濃縮し、そしてタンパク質濃度を、供給業者の取扱説明書の指示に従ってＢｉｏ‐Ｒａｄ（登録商標）タンパク質アッセイ（カタログ番号500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH、Munchen, Germany）を使用して測定した。１．５ｍｇのタンパク質に相当する量に対して、サンプルバッファーを３５０μｌの終量まで加えた。この溶液を、ＩＰＧ片ｐＨ４〜７（Amersham Biosciences、Freiburg, Germany）を再水和するために一晩使用した。ＩＥＦを、以下のグラジエントプロトコールを使用して実施した：１．）１分で５００Ｖまで；２．）２時間で３５００Ｖまで；３．）２２時間一定した３５００Ｖにて８２ｋＶｈを生じる。ＩＥＦ後に、小片を−８０℃にて保存するか、またはＳＤＳ‐ＰＡＧＥにそのまま使用した。

【0114】

ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに先立ち、小片を、還元のためにＤＤＴを加えた（１５分間、＋５０ｍｇのＤＴＴ／１０ｍｌ）、およびアルキル化のためにＩＡＡを加えた（１５分間、＋２３５ｍｇのヨードアセトアミド／１０ｍｌ）を加えた、平衡バッファー（６Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．８、３０％のグリセロール、２％のＳＤＳ）中でインキュベートした。その小片を、１２．５％のポリアクリルアミドゲル上に乗せ、そして１Ｗ／ゲルにて１時間、その後１７Ｗ／ゲルにて電気泳動にかけた。それに続いて、そのゲルを固定し（５０％のメタノール、１０％のアセタート）、そしてNovex(商標)Colloidal Blue Staining Kit（Invitrogen、Karlsruhe, Germany、カタログ番号LC6025, 45-7101）を用いて一晩染色した。

【0115】

肺癌に対する潜在的マーカーとしてのＳＣＲＮ１の検出：
各患者を、ProteomeWeaver（登録商標）ソフトウェア（Definiens AG、Germany, Munchen）を用いた画像解析によって別々に分析した。加えて、ゲルのすべてのスポットをピッキングロボットによって切り出し、そしてスポット内に存在しているタンパク質をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析法（Ultraflex(商標)Tof/Tof、Bruker Daltonik GmbH、Bremen, Germany）によって同定した。各患者について、腫瘍サンプルからの３つのゲルを、隣接した正常組織からのそれぞれ３つのゲルと比較し、そして示差的な発現されたタンパク質に該当する特有のスポットについて分析した。ＳＣＲＮ１を、１６人の患者の腫瘍サンプルおよび１つの対照サンプルでのみ同定した。このようにして、タンパク質ＳＣＲＮ１が特異的に発現されるか、または腫瘍組織で強く過剰発現されることがそれぞれわかった。そのため、タンパク質ＳＣＲＮ１は、肺癌の診断における使用のための候補マーカーとしての資格を得た。以下のＳＣＲＮ１由来のトリプシンペプチドを同定した：

【0116】

【表2】

【0117】

実施例２
癌マーカータンパク質ＳＣＲＮ１に対する抗体の作出
肺癌マーカータンパク質ＳＣＲＮ１に対するポリクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡによるＳＣＲＮ１の血清および血漿レベルまたは他の体液中の濃度の計測におけるその抗体のさらなる使用のために作出する。

【0118】

Ｅ．コリ（E.coli）による組換タンパク質の発現：
ＳＣＲＮ１に対する抗体を作出するために、組換抗原をＥ．コリに産生される：そのため、ＳＣＲＮ１をコードする領域を、以下のプライマーを使用して、German Resource Center for Genome Research（RZPD、Berlin, Germany）から入手した完全長ｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した：

【0119】

順方向プライマー（配列番号３）：
５’‐ａｃｇｔｇａａｔｔｃａｔｔａａａｇａｇｇａｇａａａｔｔａａｃｔＡＴＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＴＡＣＴＧ‐３’
（ＥｃｏＲＩ部位に下線を引いた、コーディングヌクレオチドは大文字）。
逆方向プライマー（配列番号４）：
５’‐ａｃｇｔａａｇｃｔｔＴＣＡＴＴＡＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＣＴＣＣＧＴＧ‐３’
（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いた、コーディングヌクレオチドは大文字）。

【0120】

順方向プライマー（ＥｃｏＲＩクローニング部位とリボソーム結合部位以外）は、５’末端においてフレーム単位でＳＣＲＮ１遺伝子に融合したＮ末端ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲペプチド伸長物（配列番号２に示す）をコードしている。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したＰＣＲ断片を、ｐＱＥ８０Ｌベクター（Qiagen、Hilden, Germany)）内に連結する。それに続いて、Ｅ．コリＸＬ‐１ブルー・コンピテント細胞を、作出したプラスミドで形質転換する。配列分析後に、Ｅ．コリＣ６００コンピテント細胞を、製造業者の取扱説明書に従って、ｐＱＥベクターシリーズのＴ５プロモーターの制御下のＩＰＴＧ誘導発現のために作出したプラスミドで形質転換する。

【0121】

ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＩＥＧＲ‐ＳＣＲＮ１融合タンパク質の精製のために、１Ｌの一晩誘発した細菌培養物を遠心分離によってペレットにし、そしてその細胞ペレットを溶解バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４、５００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））中に再懸濁する。細胞を、１５００ｂａｒの圧力でフレンチプレスによって破壊する。不溶性物質を遠心分離（２５０００ｇ、１５分間、４℃）によってペレットにし、そして上清をＮｉ‐ニトリロ三酢酸（Ｎｉ‐ＮＴＡ）金属親和性カラムにかける。抗原の適用後に、カラム体積の数倍量の洗浄バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）で洗浄する。最後に、結合抗原を、２０ｍＭ‐５００ｍＭのイミダゾールによる線形勾配を含む洗浄バッファーを使用して溶出し、そして抗原を含む画分（それぞれ７ｍＬ）を紫外吸光検出器によりＯ．Ｄ．２８０にて特定する。抗原含有画分を、それぞれ貯留し、保管バッファー（７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、６．５％（ｗ／ｖ）のサッカロース）に対して透析し、そして４℃または−８０℃にて保存する。

【0122】

免疫化のためのペプチド免疫原の作出：
ＳＣＲＮ１に特異的なポリクローナル抗体を作製するために、他の既知のヒト・タンパク質に顕著な相同性を示さないペプチド配列を同定する。ＳＣＲＮ１のアミノ酸配列を、Swiss Institute of Bioinformaticsにてアクセス可能なヒト・タンパク質のデータバンクに対してソフトウェアＢｌａｓｔを使用して適用する。アミノ酸配列３９８〜４１３は、セセルニン‐２（＝ＳＣＲＮ２）または他のヒト・タンパク質に対して顕著な相同性を示さないため、それをＳＣＲＮ１特異的抗体を作製するために選択する。それぞれの配列を合成し、そして化学的にＫＬＨ（＝キーホールリンペットヘモシアニン）とコンジュゲートされた、免疫化のための免疫原を得る。

【0123】

ポリクローナル抗体の作出：
ａ）免疫化
免疫化のために、１：１の比率でタンパク質溶液（１００μｇ／ｍｌのタンパク質ＳＣＲＮ１または５００μｇ／ｍｌのＫＬＨをＳＣＲＮ１アミノ酸３９８〜４１３からのペプチドに結合させた）と完全フロイントアジュバントとの新しい乳濁液を調製する。各ウサギを、１、７、１４および３０、６０および９０日目にその乳濁液１ｍｌで免疫する。採血し、そして得られた抗ＳＣＲＮ１血清を実施例３および４に記載のとおりさらなる実験のために使用する。

【0124】

ｂ）カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続沈殿によるウサギ血清からのＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）の精製
１倍量のウサギ血清を、４倍量の酢酸バッファー（６０ｍＭ、ｐＨ４．０）で希釈する。ｐＨを２ＭのＴｒｉｓ塩基で４．５に調整する。カプリル酸（２５μｌ／ｍｌの希釈サンプル）を、激しく撹拌しながら滴下して加える。３０分後に、サンプルを遠心分離し（１３０００×ｇ、３０分間、４℃）、ペレットを捨て、そして上清を回収する。上清のｐＨを２ＭのＴｒｉｓ塩基の添加により７．５に調整し、そして濾過する（０．２μｍ）。

【0125】

２Ｍの終濃度までの４Ｍ硫酸アンモニウム溶液の滴下による添加によって、激しい撹拌下、上清中の免疫グロブリンを沈殿させる。沈殿した免疫グロブリンを、遠心分離（８０００×ｇ、１５分間、４℃）によって回収する。
上清を捨てる。ペレットを１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ中に溶解し、そして十分に透析する。透析液を遠心分離し（１３０００×ｇ、１５分間、４℃）、そして濾過する（０．２μｍ）。

【0126】

ポリクローナル・ウサギＩｇＧのビオチン化：
ポリクローナル・ウサギＩｇＧを、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ中で１０ｍｇ／ｍｌにする。１ｍｌのＩｇＧにつき、５０μｌの溶液ビオチン‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＤＭＳＯ中、３．６ｍｇ／ｍｌ）を加える。室温にて３０分後に、サンプルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ）によりクロマトグラフィー処理する。ビオチン化ＩｇＧを含有している画分を回収する。モノクローナル抗体を、同じ手順によりビオチン化した。

【0127】

ポリクローナル・ウサギＩｇＧのジゴキシゲニン化：
ポリクローナル・ウサギＩｇＧを、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨ、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中で１０ｍｇ／ｍｌにする。１ｍｌのＩｇＧ溶液につき、５０μｌのジゴキシゲニン‐３‐Ｏ‐メチルカルボニル‐ε‐アミノカプロン酸‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル、（Roche Diagnostics、Mannheim,Germany、カタログ番号1 333 054）（ＤＭＳＯ中、３．８ｍｇ／ｍｌ）を加える。室温にて３０分後に、サンプルを、ＳｕｐｅｒｄｅｘＲ２００（１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄／ＮａＯＨ、ｐＨ７．５、３０ｍＭのＮａＣｌ）によりクロマトグラフィー処理する。ジゴキシゲニン化ＩｇＧを含有している画分を回収する。モノクローナル抗体を、同じ手順によりジゴキシゲニンで標識した。

【0128】

実施例３
実施例２で作出したポリクローナル抗体を使用したヒト肺癌（ＬＣ）組織におけるＳＣＲＮ１の検出のためのウエスタンブロッティング
腫瘍サンプルと健康対照サンプルからの組織溶解物を、実施例１の「組織サンプル」に記載のとおり調製する。

【0129】

ＳＤＳ‐ＰＡＧＥそしてウエスタンブロッティングを、Invitrogen、Karlsruhe, Germanyの試薬と装置を使用して実施する。試験した各組織サンプルに関しては、１５μｇの組織溶解物を、還元ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）（Invitrogen）ＳＤＳサンプルバッファー中に希釈し、そして９５℃にて１０分間加熱する。サンプルを、ＭＥＳランニングバッファー系中、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｔｒｉｓ‐グリシン）上で泳動する。ゲルで切り出したタンパク質混合物を、Invitrogen XCell II(商標)Blot Module（Invitrogen）およびNuPAGE（登録商標）転写バッファー系を使用してニトロセルロース膜上にブロットする。その膜を、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０中で３回洗浄し、そしてＲｏｔｉ（登録商標）‐Ｂｌｏｃｋブロッキングバッファー（Ａ１５１．１；Carl Roth GmbH、Karlsruhe Germany）で２時間ブロッキングする。一次抗体であるポリクローナル・ウサギ抗ＳＣＲＮ１血清（作出は実施例２に記載した）を、Ｒｏｔｉ（登録商標）‐Ｂｌｏｃｋ中に１：１０，０００で希釈し、そして膜と一緒に１時間インキュベートした。膜を、ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０中で６回洗浄する。特異的に結合した一次ウサギ抗体を、０．５×Ｒｏｔｉ（登録商標）‐Ｂｌｏｃｋブロッキングバッファー中で１０ｍＵ／ｍｌに希釈したＰＯＤコンジュゲートポリクローナル・ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体で標識する。１時間のインキュベーション後に、膜をＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０中で６回洗浄する。結合したＰＯＤコンジュゲート抗ウサギ抗体の検出のために、膜を、Lumi‐Light^PLUS Western Blotting Substrate（注文番号2015196、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim, Germany）と一緒にインキュベートし、そしてオートラジオグラフィーフィルムに感光させる。

【0130】

ＳＣＲＮ１のシグナル強度は、２０人の異なったＬＣ患者から採取した２０個の腫瘍組織溶解物のうちの１９個で増大している（図１）。よって、実施例１でＭＡＬＤＩによって検出した腫瘍組織中のＳＣＲＮ１の増大した存在量は、ウエスタンブロッティング分析によって明確に確認される。

【0131】

実施例４
ヒト血清および血漿サンプルまたは他の体液中のＳＣＲＮ１の計測のためのＥＬＩＳＡ
ヒト血清または血漿中のＳＣＲＮ１の検出のために、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施例２の抗体を使用して開発する。抗原の捕獲のために、ペプチド３９８〜４１３に対する抗体をビオチンとコンジュゲートさせ、その一方で、ＳＣＲＮ１完全長配列に対する抗体をジゴキシゲニンとコンジュゲートさせる。
アッセイの較正のために、米国立癌研究所のＮＣＩ６０腫瘍細胞株に含まれるヒト黒色腫細胞株であるＬＯＸＩＭＶＩ細胞を増殖させ、そして細胞溶解物を較正に使用する。前記溶解物の１：２５００希釈物（タンパク質濃度＝７．７ｍｇ／ｍｌ）を、場合により１Ｕ／ｍｌに設定した。

【0132】

ストレプトアビジンでコートした９６ウェルマイクロタイタープレートに１０ｍＭのホスファート、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡ、０、９％のＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０中、１０μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＳＣＲＮ１、ａａ３９８〜４１３、ポリクローナル抗体１００μｌを入れて６０分間インキュベートする。インキュベーション後に、プレートを０．９％のＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。次いで、ウェルに、基準抗原としての組み換えタンパク質（実施例２を参照のこと）の希釈系列または希釈した患者からの血清／血漿／ＥＬＦサンプルを入れて一晩インキュベートする。
ＳＣＲＮ１の結合後に、プレートを０．９％のＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄する。結合したＳＣＲＮ１の特異的検出のために、ウェルに１０ｍＭのホスファート、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡ、０、９％のＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０中、１０μｇ／ｍｌのジゴキシゲニン化抗ＳＣＲＮ１ポリクローナル抗体１００μｌを入れて６０分間インキュベートする。その後、プレートを３回洗浄して、非結合抗体を取り除いた。次のステップで、ウェルに１０ｍＭのホスファート、ｐＨ７．４、１％のＢＳＡ、０．９％のＮａＣｌおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０中、５０ｍＵ／ｍｌの抗ジゴキシゲニン‐ＰＯＤコンジュゲート（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim, Germany、カタログ番号1633716）を入れて６０分間インキュベートする。それに続いて、プレートを同じバッファーで３回洗浄する。抗原‐抗体複合体の検出のために、ウェルに１００μｌのＡＢＴＳ溶液（Roche Diagnostics GmbH、Mannheim, Germany、カタログ番号11685767）を入れてインキュベートし、そしてＯＤを、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて３０〜６０分後に４０５ｎｍにて計測する。

【0133】

実施例５
肺癌（ＬＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表３に示したＵＩＣＣ分類を有する３６５人の十分に特徴づけされた肺癌患者（１４６人がアデノＣＡ、８７人が扁平上皮細胞ＣＡ、４４人が小細胞ＣＡ、８８人が肺の他のＣＡ）から採取したサンプルを使用する。

【0134】

【表3】

【0135】

表３のＬＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．８５のＡＵＣを有する（図２）。

【0136】

実施例６
頭部／頚部癌（Ｈ／ＮＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表４に示したＵＩＣＣ分類を有する３０人の十分に特徴づけされた頭部／頚部癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0137】

【表4】

【0138】

表６のＨ／ＮＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．８６のＡＵＣという結果をもたらす（図３）。

【0139】

実施例７
子宮内膜癌（ＥＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表５に示したＵＩＣＣ分類を有する２３人の十分に特徴づけされた子宮内膜癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0140】

【表5】

【0141】

表６のＥＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．８４のＡＵＣという結果をもたらす（図４）。

【0142】

実施例８
卵巣癌（ＯＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表６に示したＵＩＣＣ分類を有する４２人の十分に特徴づけされた卵巣癌（ＯＣ）患者から採取したサンプルを使用する。

【0143】

【表6】

【0144】

表６のＯＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．８３のＡＵＣという結果をもたらす（図５）。

【0145】

実施例９
悪性黒色腫（ＭＭ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表７に示したＵＩＣＣ分類を有する１６人の十分に特徴づけされた悪性黒色腫患者から採取したサンプルを使用する。

【0146】

【表7】

【0147】

表６のＭＭサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．８２のＡＵＣという結果をもたらす（図６）。

【0148】

実施例１０
乳癌（ＢＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表８に示したＵＩＣＣ分類を有する４７人の十分に特徴づけされた乳癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0149】

【表8】

【0150】

表５のＢＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．７７のＡＵＣという結果をもたらす（図６）。

【0151】

実施例１１
子宮頚癌（ＣＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表９に示したＵＩＣＣ分類を有する２０人の十分に特徴づけされた子宮頚癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0152】

【表9】

【0153】

表６のＣＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．７４のＡＵＣという結果をもたらす（図８）。

【0154】

実施例１２
膵臓癌（ＰＡＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表１０に示したＵＩＣＣ分類を有する４９人の十分に特徴づけされた膵臓癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0155】

【表10】

【0156】

表６のＰＡＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．７０のＡＵＣという結果をもたらす（図９）。

【0157】

実施例１３
結腸直腸癌（ＣＲＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表１１に示したＵＩＣＣ分類を有する５０人の十分に特徴づけされた大腸癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0158】

【表11】

【0159】

表４のＣＲＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．６７のＡＵＣという結果をもたらす（図１０）。

【0160】

実施例１４
膀胱癌（ＢＬＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表１２に示したＵＩＣＣ分類を有する５０人の十分に特徴づけされた膀胱癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0161】

【表12】

【0162】

表６のＰＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．６５のＡＵＣという結果をもたらす（図１１）。

【0163】

実施例１５
腎臓癌（ＫＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表１３に示したＵＩＣＣ分類を有する２５人の十分に特徴づけされた子宮内膜癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0164】

【表13】

【0165】

表６のＫＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．６０のＡＵＣという結果をもたらす（図１２）。

【0166】

実施例１６
前立腺癌（ＰＣ）に対する血清マーカーとしてのＳＣＲＮ１
表１４に示したＵＩＣＣ分類を有する５０人の十分に特徴づけされた前立腺癌患者から採取したサンプルを使用する。

【0167】

【表14】

【0168】

表６のＰＣサンプルのＳＣＲＮ１のレベルは、明らかな健常者（＝対照コホート）から採取した５０個の対照サンプルとの比較により評価され、そして０．５８のＡＵＣという結果をもたらす（図１３）。

【0169】

実施例１７
上皮内層液（ＥＬＦ）中のＳＣＲＮ１‐気管支鏡によるマイクロサンプリング
気管支鏡によるマイクロサンプリング（ＢＭＳ）は、主に非侵襲性の様式による小さな肺結節付近での上皮内層体液（ＥＬＦ）の回収の可能性を提供する。それに続いて、悪性小結節を特定するために、ＥＬＦ中の腫瘍マーカーの濃度を計測することが可能である。患者に特有のそれぞれの腫瘍マーカーのベースライン濃度は、対側肺におけるＥＬＦのサンプリングによって得られる。

【0170】

ＢＭＳプローブ（Olympus Medical Systems Corp.、Tokyo, Japan、カタログ番号：BC-402C）は、気管支鏡を通して肺の中に挿入され、ステンレス製のガイドに取り付けられた外側のポリエチレン製のさやおよび内側のコットンプローブから成る。内側のプローブを小結節の近くまで進め、そしてＢＭＳを数秒間実施する。その後、内側のプローブを外側にさやの中に引っ込め、そして両デバイスを同時に引っ込める。コットンチップを切取り、そして−８０℃にてそのまま冷凍する。測定のために、ＥＬＦを、コットンチップから溶出し、その後に分析することができた。ＳＣＲＮ１の濃度を、実施例４に記載のＥＬＩＳＡを用いてＥＬＦ中で測定する。

【0171】

ＳＣＲＮ１は、コンピューター断層撮影によって検出される肺腫瘤がある患者からのＥＬＦ中で検出できた。表１５で使用している略語は、ＰＭ（＝肺腫瘤のある肺）およびＣｌ（＝対側肺）である。最終的には、癌に対する診断は、表中に示されているものが得られた。

【0172】

【表15】