特許 5731568 肝癌への罹患リスクを評価する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5731568

(24)【登録日】2015年4月17日

(45)【発行日】2015年6月10日

(54)【発明の名称】肝癌への罹患リスクを評価する方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150521BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150521BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

【請求項の数】7

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2013-95755(P2013-95755)

(22)【出願日】2013年4月30日

(65)【公開番号】特開2013-230147(P2013-230147A)

(43)【公開日】2013年11月14日

【審査請求日】2013年4月30日

(31)【優先権主張番号】61/640,512

(32)【優先日】2012年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/685,551

(32)【優先日】2012年11月26日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】390023582

【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100075409

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久一

(74)【代理人】

【識別番号】100129757

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久彦

(74)【代理人】

【識別番号】100115082

【弁理士】

【氏名又は名称】菅河 忠志

(74)【代理人】

【識別番号】100125243

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 浩彰

(72)【発明者】

【氏名】呂 長益

(72)【発明者】

【氏名】田 孟崇

(72)【発明者】

【氏名】呉 政道

(72)【発明者】

【氏名】温 義輝

(72)【発明者】

【氏名】林 凱元

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０２８１２６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１０６１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 欧州特許出願公開第０２１９６５４３（ＥＰ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０７６１４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０５５４８８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 CHEN,X. et al.，Epigenetic repression of miR-129-2 upregulates SOX4 expression in hepatocellular carcinoma.，Hepatol. Int.，２０１２年 １月，Vol.6, No.1，p.207，PP16-006

【文献】 ALPINI,G. et al.，Regulation of placenta growth factor by microRNA-125b in hepatocellular cancer.，J. Hepatol.，２０１１年１２月，Vol.55, No.6，pp.1339-45

【文献】 LU,C.Y. et al.，Frequent DNA methylation of MiR-129-2 and its potential clinical implication in hepatocellular carcinoma.，Genes Chromosmes Cancer，２０１３年 ７月，Vol.52, No.7，pp.636-43

【文献】 CHEN,X. et al.，Methylation-mediated repression of microRNA 129-2 enhances oncogenic SOX4 expression in HCC.，Liver Int.，２０１３年 ３月，Vol.33, No.3，pp.476-86

【文献】 ANWAR,S.L. et al.，Concordant hypermethylation of intergenic microRNA genes in human hepatocellular carcinoma as new diagnostic and prognostic marker.，Int. J. Cancer，２０１３年 ８月 １日，Vol.133, No.3，pp.660-70

【文献】 DATTA,J. et al.，Methylation mediated silencing of MicroRNA-1 gene and its role in hepatocellular carcinogenesis.，Cancer Res.，２００８年 ７月 １日，Vol.68, No.13，pp.5049-58

【文献】 FURUTA,M. et al.，miR-124 and miR-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma.，Carcinogenesis，２０１０年 ５月，Vol.31, No.5，pp.766-76

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡＰｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者における肝癌への罹患リスクを評価する方法であって、
前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを検出する工程を含み、
前記ＤＮＡメチル化レベルが、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、または定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑ−ＭＳＰ）の方法によって検出され、
前記ＣＯＢＲＡによるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルの前記検出が、配列番号４および５に記載されるプライマー対を用いて行われ、
前記定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑ−ＭＳＰ）が、配列番号８および９に記載されるプライマー対を用いて行われ、
前記生体試料中の前記ｍｉｒ−１２９−２の前記ＤＮＡメチル化レベルが対照試料中の対応するｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルに比べて高いことが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法。

【請求項2】

前記ｍｉｒ−１２９−２が配列番号１に示される塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＤＮＡメチル化が前記ｍｉｒ−１２９−２の１または複数のＣｐＧ部位で起こる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記生体試料が肝細胞、血液、血清または血漿を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

被験者における肝癌への罹患リスクを評価する方法であって、
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２の発現により生じるマイクロＲＮＡの量を測定する工程を含み、
前記定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）が配列番号６および７に示されるプライマー対を用いて行われ、
前記生体試料中のマイクロＲＮＡの前記測定量が対照試料中の対応するマイクロＲＮＡの前記測定量に比べて低いということが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法。

【請求項6】

前記ｍｉｒ−１２９−２が配列番号１に示される塩基配列を有する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記生体試料が肝細胞、血液、血清または血漿を含む、請求項５または６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本技術分野は、肝癌への罹患リスクを評価する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２２ヌクレオチドの短い多数の内在性ＲＮＡクラスである。それらの標的ｍＲＮＡとの塩基対合により、ｍｉＲＮＡは遺伝子発現の転写後調節因子（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）として機能し、これによって標的ｍＲＮＡが分解される、または標的ｍＲＮＡ発現が抑制されることになる。

【0003】

いくつかの研究により、癌細胞においてｍｉＲＮＡの発現が異常であるということが示されている。癌に関連するヘテロ接合性の消失が認められる染色体領域にｍｉＲＮＡが存在することが、ゲノム規模での研究からも明らかとされている。いくつかの癌細胞株においてｍｉＲＮＡの発現が抑制されることが観察されている。ｍｉＲＮＡは、癌遺伝子の発現を阻害すること、および細胞アポトーシスまたは分化に関与する遺伝子を調節することによって、腫瘍形成を抑制するということが示唆されている。かかる腫瘍抑制遺伝子のように機能するｍｉＲＮＡは“腫瘍抑制ｍｉＲＮＡ”とも称されている。慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の６８％はそのｍｉＲ−１５およびｍｉＲ−１６が欠失しているか、または抑制されており、また対応する正常な組織に比べ結腸および肺癌組織においてｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５はより低い発現量を示し、さらにｍｉＲＮＡ ｌｅｔ−７が肺癌細胞において抑制され、かつｍｉＲＮＡ ｌｅｔ−７のダウンレギュレーションによって肺癌の予後不良が検出され得ることが報告されている。

【0004】

ＤＮＡメチル化が腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの調節において重要な役割を果たすことが、研究によって示されている。ＤＮＡメチル化とは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによりＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが５−メチルシトシンに変わることをいう。ＣｐＧジヌクレオチドは通常５’末端領域に多く出現し、“ＣｐＧ部位”とも呼ばれる。約７０％のヒト遺伝子でプロモーター領域にＣｐＧ部位が見られることが研究により示されている。プロモーター領域におけるＣｐＧ部位が高度ＤＮＡメチル化されると、下流におけるコードされた遺伝子の転写の進行が抑制され得るため、遺伝子が発現しないということが示唆されている。よって、いくつかのメチル結合タンパク質（ｍｅｔｈｙｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ならびにヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）およびコリプレッサーによって高度ＤＮＡメチル化されたＣｐＧ部位が認識され、これにより染色体構造が変化すると共に、不活性なヘテロクロマチンが形成されるということが示唆されている。いくつかの研究によれば、異常なＤＮＡメチル化は癌の早期の段階において起こり、このことが腫瘍抑制遺伝子を発現させないようにしている可能性がある。最近の研究からは、ＤＮＡメチル化は腫瘍抑制遺伝子の発現を阻害するだけでなく、腫瘍抑制ｍｉＲＮＡの発現を減少させることも分かっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００６／０１０５３６０号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１０／０１９７７７０号明細書

【特許文献3】米国特許出願公開第２０１１／０２２３６０７号明細書

【特許文献4】中国特許出願公開第１０２０８００８２号明細書

【特許文献5】国際公開第２００９／１３２２７３号パンフレット

【特許文献6】国際公開第２００９／１３７８０７号パンフレット

【特許文献7】国際公開第２００９／１５３７７５号パンフレット

【特許文献8】国際公開第２０１０／０４２８３１号パンフレット

【特許文献9】国際公開第２０１０／０６２７０６号パンフレット

【特許文献10】国際公開第２０１０／０９８８６２号パンフレット

【特許文献11】国際公開第２０１０／０２６３７０号パンフレット

【特許文献12】欧州特許第２３３６３５３号明細書

【特許文献13】欧州特許第２３４１１４５号明細書

【特許文献14】台湾特許出願公開第２０１１１８１７８号明細書

【特許文献15】欧州特許第２３５４２４６号明細書

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Xueden Chen et al., “CpG island methylation status of miRNAs in esophageal squamous cell carcinoma” , Int. J. Cancer: 130, 2012, pages 1607-1613

【非特許文献2】Yi-Wen Huang et al., “Epigenetic repression of micorRNA-129-2 leads to overexpression of SOX4 oncogene in endometrical cancer”, Cancer Res 2009; 69: pages 9038-9046

【非特許文献3】Ruizhe Shen et al., “Epigenetic repression of microRNA-129-2 leads to overexpression of SOX4 ingastric cancer”, Biochemical and Biophysical Research Communication 394 (2010) pages 1047-1052

【非特許文献4】Eva Bandres et al., “Epigenetic regulation of microRNA expression in colorectal cancer”, Int. J. Cancer:125, pages 2737-2743 (2009)

【非特許文献5】Jharna Datta et al., “Methylation mediated of silencing of microRNA-1 gene and its role in hepatocellular carcinogenesis”, Cancer Res 2008;68:pages 5049-5058

【非特許文献6】Mayuko Furuta et al., “miR-124 and miR-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma”, Carcinogenesis vol. 31 no.5 pp.766-776, 2010.

【非特許文献7】Jinfeng Huang et al., “Down-regulated microRNA-152 induces aberrant DNA methylation in hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma by targeting DNA methyltransferase 1”, HEPATOLOGY, vol. 52, NO. 1, 2010, pages 60-70

【非特許文献8】Hiromu Suzuki et al., “Methylation-associated silencing of microRNA-34b/c in gastric cancer and its involvement in an epigenetic field defect”, Carcinogenesis vol. 31 no. 12 pp.2066-2073. 2010

【非特許文献9】Minoru Toyota et al., “Epigenetic silencing of microRNA-34b/c and B-cell translocation gene 4 is associated with CpG island methylation in colorectal Cancer”, Cancer Res 2008;68:pages 4123-4132

【非特許文献10】Jin Hou et al., “Identification of miRNomes in human liver and hepatocellular carcinoma reveals miR-199a/b-3p as therapeutic target for hepatocellular carcinoma”, Cancer Cell 19, 232-243

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、本発明者らは、肝癌に罹患している患者、および肝癌に罹患していない被験者におけるいくつかのマイクロＲＮＡの発現およびマイクロＲＮＡをコードする遺伝子のＤＮＡメチル化について研究を行い、患者の肝癌の検出および被験者の肝癌への罹患リスクを評価する方法を得た。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、被験者における肝癌への罹患リスクを評価する方法であって、前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを検出する工程を含み、前記ＤＮＡメチル化レベルが、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑ−ＭＳＰ）、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、およびＤＮＡメチル化解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）からなる群より選ばれる一つの方法によって検出され、前記生体試料中の前記ｍｉｒ−１２９−２の前記ＤＮＡメチル化レベルが対照試料中の対応するｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルに比べて高いことが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法を提供する。

【0009】

また、本発明は、被験者における肝癌への罹患リスクを評価する方法であって、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはｍｉＲＮＡアレイにより、前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２の発現により生じるマイクロＲＮＡの量を測定する工程を含み、前記生体試料中のマイクロＲＮＡの前記測定量が対照試料中の対応するマイクロＲＮＡの前記測定量に比べて低いということが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法を提供する。

【0010】

本発明は、被験者における肝癌への罹患リスクを評価するためにデータを収集する方法であって、前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを検出する工程を含み、前記ＤＮＡメチル化レベルが、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑ−ＭＳＰ）、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、およびＤＮＡメチル化解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）からなる群より選ばれる一つの方法によって検出され、前記生体試料中の前記ｍｉｒ−１２９−２の前記ＤＮＡメチル化レベルが対照試料中の対応するｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルに比べて高いことが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法を提供する。

【0011】

また、本発明は、被験者における肝癌への罹患リスクを評価するためにデータを収集する方法であって、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはｍｉＲＮＡアレイにより、前記被験者からの生体試料中のｍｉｒ−１２９−２の発現により生じるマイクロＲＮＡの量を測定する工程を含み、前記生体試料中のマイクロＲＮＡの前記測定量が対照試料中の対応するマイクロＲＮＡの前記測定量に比べて低いということが、前記被験者が肝癌にかかりやすいことを示す指標となる、方法を提供する。

【0012】

さらに本発明は、配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列に対応するＲＮＡ塩基配列を有するマイクロＲＮＡを含む肝癌マーカーを提供する。

【0013】

また、本発明は、配列番号１に示されるＤＮＡ塩基配列に対応するＲＮＡ塩基配列を有するマイクロＲＮＡの断片を含む肝癌マーカーを提供する。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば、侵襲的手術を行うことなく、信頼性の高い検出によって、被験者において、将来、肝癌が発生するリスクと、患者が肝癌に罹患している率を容易に決定することができる。また、そのリスクを評価するためのデータを収集することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

添付の図面を参考としながら以下の詳細な説明および実施例を見ることによって、本発明をより十分に理解することができる。

【図1】図１は、本発明の実施形態による、ＣＯＢＲＡで検出した正常肝組織、正常肝細胞（ＨＨ）および６種のＨＣＣ細胞（肝癌細胞）におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化を示している。

【図2A】図２Ａは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出した正常肝組織におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図2B】図２Ｂは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出した正常肝細胞（ＨＨ）におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図2C】図２Ｃは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出したＨＣＣ細胞におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図2D】図２Ｄは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出したＨＣＣ細胞におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図2E】図２Ｅは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出したＨＣＣ細胞におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図2F】図２Ｆは、本発明の実施形態による、重亜硫酸シークエンシングで検出したＨＣＣ細胞におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図3A】図３Ａは本発明の実施形態による正常肝細胞（ＨＨ）およびＨＣＣ細胞におけるｍｉｒ−１２９−２の発現量（ｍｉＲ−１２９−２の生成量）を示している。

【図3B】図３Ｂは本発明の実施形態による正常肝組織およびＨＣＣ組織におけるｍｉｒ−１２９−２の発現量を示している。

【図3C】図３Ｃは本発明の実施形態による５−アザ−シチジン処理を行ったか、または行っていないＨＣＣ細胞中のｍｉｒ−１２９−２の発現量を示している。

【図4A】図４Ａは本発明の実施形態による、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したか、または感染していないＨｕＨ７およびＪ７細胞におけるｍｉｒ−１２９−２の発現量を示している。

【図4B】図４Ｂは本発明の実施形態による、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したか、または感染していないＨｕＨ７およびＪ７細胞におけるｍｉｒ−１２９−２の発現量を示している。

【図4C】図４Ｃは本発明の実施形態による、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したか、または感染していないＪ７細胞のコロニー形成を示している。

【図4D】図４Ｄは本発明の実施形態による、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したか、または感染していないＨｕＨ７のコロニー形成を示している。

【図5A】図５Ａは本発明の実施形態による、ＣＯＢＲＡで検出した組織試料（４２対のＨＣＣ）からのｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化の状態を示している。

【図5B】図５Ｂは本発明の実施形態による、ＣＯＢＲＡで検出した組織試料（４２対のＨＣＣ）からのｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率を示している。

【図5C】図５Ｃは本発明の実施形態による、ｑ−ＭＳＰ法で検出した組織試料からのｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを示している。

【図5D】図５Ｄは本発明の実施形態によるＨＣＣおよび隣接する正常組織におけるＤＮＡメチル化レベルの箱ひげ図である。

【図6A】図６Ａは本発明の実施形態による、ｑＲＴ−ＰＣＲ法で検出した組織試料からのｍｉｒ−１２９−２の発現量（ｍｉＲ−１２９−２の生成量）を示している。

【図6B】図６Ｂは本発明の実施形態による、ＨＣＣ組織および隣接する正常組織におけるｍｉｒ−１２９−２の発現の割合を示している。

【図7A】図７Ａは本発明の実施形態による、ｑ−ＭＳＰ法で検出したＨＣＣ血漿、肝硬変血漿および正常血漿におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを示している。

【図7B】図７Ｂは本発明の実施形態によるＨＣＣ血漿、肝硬変血漿および正常血漿試料におけるＤＮＡメチル化レベルの箱ひげ図を示している。

【図7C】図７Ｃは本発明の実施形態による、２つの群の間のｍｉｒ−１２９−２ＤＮＡメチル化レベルの感度および特異度を計算するためのＲＯＣ曲線を示しており、１つの群はＨＣＣ血漿試料を含み、他方の群は正常な血漿および肝硬変血漿試料からなる。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下の詳細な実施形態では、説明の目的で、開示された実施形態が十分理解されるよう、多くの具体的詳細を記載する。しかしながら、１つまたは複数の実施形態はこれら具体的詳細がなくとも実施可能であるということは明らかであろう。また、図面を簡潔にするため、既知の構造および装置は概略的に示す。

【0017】

本発明の実施形態は、患者のヒト肝癌を検出することと、被験者において、将来、肝癌が発生するリスクを評価することに用いるバイオマーカーとしての新規なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を提供する。本発明者らは、ハイスループットＣｐＧマイクロアレイプラットフォームに基づいて、肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞において、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子であってＤＮＡメチル化された遺伝子を複数スクリーニングし、患者の肝癌の検出および被験者において、将来、肝癌が発生する率を測定することに用いるものとして潜在性のある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）１つのｍｉｒ−１２９−２と、このｍｉｒ−１２９−２がコードするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２９−２）を見出した。なお、本発明においては、肝臓に何らかの腫瘍を有するなど、肝癌に罹患している又は肝癌の疑いがあり、本発明により肝癌に罹患しているか否かを決定したり、肝癌の罹患率を測定すべき者を「患者」といい、現在、肝癌に罹患していたりその疑いは無いが、将来において肝癌に罹患する傾向の有無やその確率を測定すべき者を「被験者」というものとする。

【0018】

本明細書において述べられるｍｉＲＮＡとは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）のマイクロＲＮＡのことをいい、ｍｉＲＢａｓｅｓデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）またはＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において入手可能である。ｍｉＲＮＡはステムループの前駆体形態、および切断されかつプロセシングされた成熟形態を含み、５’末端（つまり“５ｐ”）および３’末端（つまり“３ｐ”）を有する２つの活性断片を産出し得る。本発明によれば、ｍｉｒ−１２９−２によりコードされているマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２９−２）は、配列番号１に記載される約１００ｂｐの直鎖状ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を有する前駆体の形態である。また、ｍｉｒ−１２９−２は、配列番号１に記載される塩基配列を有する遺伝子であり、ｍｉＲ−１２９−２をコードする遺伝子である。

【0019】

本明細書において述べられる肝癌とは、肝内に発生する悪性腫瘍をいい、肝臓で原発性に発生する肝細胞癌と、肝外臓器で発生して肝内に転移した肝転移肝癌を意味する。肝癌への罹患リスクとは、本発明の方法による測定から一定の期間内、例えば５年以内に被験者に肝癌が発生する確率を意味するが、期間はこれに限定されない。肝癌への罹患リスクを評価するためにデータを収集する方法とは、被験者の生体試料のｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベル、またはｍｉＲ−１２９−２の発現を測定することである。ＤＮＡメチル化レベルとはＤＮＡメチルトランスフェラーゼによりＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが５−メチルシトシンに変わるレベルのことをいう。

【0020】

本発明の方法により、被験者が、将来、肝癌に罹患しやすいか、または患者が肝癌に罹患しているか否かを、当該被験者または患者からの生体試料におけるｍｉＲＮＡをコードするｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルまたはｍｉｒ−１２９−２の発現により生成するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２９−２）の量が対照試料における対応するそれらに比べて高いことにより判断することができる。本明細書において、肝癌にかかりやすいとは、被験者が本発明の方法による測定から一定の期間内に肝癌にかかる可能性があることを意味する。検出に用いる生体試料は、新鮮または凍結肝癌組織、肝細胞、血液、血清または血漿から得られるものであってよいが、これらに限定はされない。対照試料は、無病であると診断された健康な者からの同じ組織型（ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｅ）の正常組織、肝細胞、血液、血清もしくは血漿、または腫瘍ができた組織に隣接する同じ組織型の正常組織由来のものであってよい。

【0021】

本発明で用いる血液は、被験者または患者から通常用いられる採血法により採血すればよく、例えば静脈採血、動脈採血が挙げられる。血清または血漿は、採血した全血から分離されたものであり、全血から遠心分離等の方法により血球成分を除去する通常用いられる操作を経て得られる。本発明において、患者の肝癌組織または肝細胞の採取方法は、外科手術的方法または患者の腹部に針を穿刺して採取する方法が挙げられる。被験者から肝臓細胞を採取する方法は、被験者の腹部に針を穿刺して採取する方法が挙げられるが、これに限定されない。

【0022】

ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子（ｍｉｒ−１２９−２）のＤＮＡメチル化状態は、ＣＯＢＲＡ（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、定量的ＤＮＡメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｑ−ＭＳＰ）、重亜硫酸シークエンシング（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、またはＤＮＡメチル化解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｒｒａｙ）によって確認することができる。

【0023】

ＣＯＢＲＡとは、ＰＣＲ増幅した重亜硫酸処理ＤＮＡの制限酵素分析によってＤＮＡメチル化を調べるための解析のことをいう。ＣＯＢＲＡプロトコールの詳細は、ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ^ＴＭ，ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ｖｏｌ．２００，ｐ．７１−８６にて見ることができる。

【0024】

ｍｉｒ−１２９−２のＣＯＢＲＡによる解析に用いるプライマー対は、配列番号４および５に記載される塩基配列を含む。しかしながら、ＣＯＢＲＡによるｍｉＲＮＡをコードする遺伝子（ｍｉｒ−１２９−２）のＤＮＡメチル化解析に用いるプライマーはこれらに限定されない。当業者は、本発明に基づいて、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子（ｍｉｒ−１２９−２）のＣＯＢＲＡによる解析に用いる適したプライマー対を設計することができ、よってｍｉＲＮＡをコードする遺伝子（ｍｉｒ−１２９−２）のＣＯＢＲＡによる解析に適したプライマーもまた本発明に含まれる。

【0025】

重亜硫酸シークエンシングおよび定量的ＤＮＡメチル化特異的ＰＣＲ（ｑ−ＭＳＰ）によりｍｉＲＮＡをコードする遺伝子のＤＮＡメチル化プロファイルをさらに解析することができる。重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）で処理すると、ＤＮＡ配列中のシトシン（Ｃ）はウラシル（Ｕ）に変換されるが、５−メチルシトシン（ｍＣ）は影響を受けない。したがって、重亜硫酸処理はＤＮＡ配列に特異的な変化をもたらし、ＤＮＡメチル化状態についての情報を示す。本発明の１例では、ｑ−ＭＳＰにおいてｍｉｒ−１２９−２に用いるプライマー対は、配列番号８および９に記載される塩基配列を含み得るが、これらに限定はされない。重亜硫酸シークエンシングプロトコールの詳細は、ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＴＭ， ＨＵＭＡＮＡ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ｖｏｌ． ２００， ｐ． １４３−１５４に見ることができる。

【0026】

パイロシークエンシングは、酵素と基質試薬を使用して、ポリメラーゼ塩基伸長反応によるルシフェラーゼ発光反応を検出することで塩基配列を解読する方法であり、ＣＯＢＲＡよりも優れた検出が可能である。パイロシークエンシングは、重亜硫酸処理を行ったＤＮＡのＣｐＧサイトのＴとＣの比率を解読してＤＮＡメチル化比率を決定することができる。本発明の１例では、ｍｉｒ−１２９−２に用いるプライマー対は、配列番号１０や配列番号１１に記載される塩基配列を含み得るものであり、プローブは配列番号１２を含み得るが、これらに限定はされない。

【0027】

次世代シークエンシングは、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、蛍光・発光など光検出により、超並列的に塩基配列を決定する；逐次ＤＮＡ合成・光検出法を用いた超並列シークエンシング、ＤＮＡ１分子を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を行い、１塩基ごとの反応を蛍光・発光などの光で検出することにより、リアルタイムで塩基配列を決定する；１分子リアルタイム・シークエンシング、蛍光・発光など光検出以外の検出方法により、超並列的に塩基配列を決定する；Ｐｏｓｔ−ｌｉｇｈｔシークエンシングが挙げられる。次世代シークエンシングにより、重亜硫酸処理を行ったＤＮＡのメチル化率を高い精度で決定することができるが、ＤＮＡの処理は重亜硫酸処理に限られない。

【0028】

ＤＮＡメチル化解析は、メチル化ＤＮＡを濃縮する方法が挙げられる。本発明の１例では、ＤＮＡメチル化ＣｐＧに結合するタンパク質（ＭＢＤ２）を利用してＤＮＡメチル化領域を濃縮し解析することができる。その手順の詳細に示すと、抽出したＤＮＡを、適当なサイズに断片化し、ビーズに結合させたＭＢＤ２にメチル化ＤＮＡを結合させ、その後、塩濃度の調整により、ＣｐＧメチル化頻度に応じメチル化ＤＮＡを分画する。その後、ターゲット部位を鋳型化し、リアルタイムＰＣＲ等によりＤＮＡメチル化レベルを解析することができるが、これに限られない。

【0029】

さらに、本発明の１実施形態は、被験者において、将来、肝癌が発生する率、または患者が肝癌に罹患している率を決定する方法であって、被験者または患者からの生体試料中のマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１２９−２の発現量を検出する工程を含み、生体試料中のマイクロＲＮＡの発現量が対照試料中の対応するマイクロＲＮＡの発現量に比べて低いということが、その被験者が肝癌にかかりやすいか、または患者が肝癌にかかっていることを示す、方法を提供する。

【0030】

ｍｉＲＮＡの発現量は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはｍｉＲＮＡアレイによって決定することができる。ｑＲＴ−ＰＣＲは、反応の進行中にリアルタイムで増幅したＤＮＡが検出されることに特徴を持つ改良ＰＣＲである。ｑＲＴ−ＰＣＲでは、指数増殖期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）において蛍光が検出可能となるサイクルはサイクル閾値（ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ，Ｃｔ）と呼ばれる。Ｃｔ値または参照遺伝子と比べたデルタＣｔ値（ΔＣｔ）は、標的ＤＮＡの定量に用いることができる。本発明の１例では、ｑＲＴ−ＰＣＲにおいてｍｉｒ−１２９−２に用いるプライマー対は、配列番号６および７に記載される塩基配列を含み得るが、これらに限定はされない。ｍｉＲＮＡのダウンレギュレーションされた発現量は、ヒト肝癌におけるｍｉＲＮＡをコードする遺伝子（ｍｉｒ−１２９−２）のＤＮＡメチル化状態に対応しており、このことはｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２９−２）、およびその後分解され産生されるｍｉＲＮＡの断片が肝癌の検出に用いる信頼性の高いバイオマーカー、即ち肝癌マーカーであることを示している。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１２９−２の断片としては、ｍｉＲ−１２９−２−５ｐ、ｍｉＲ−１２９−２−３ｐが挙げられる。

【0031】

ｍｉＲＮＡアレイを用いて、ｍｉＲＮＡを定量することができる。ｍｉＲＮＡアレイは成熟ｍｉＲＮＡの定量することができる方法であり、一般的に用いられている方法を用いればよい。

【0032】

肝癌におけるマイクロＲＮＡの機能はさらに、コロニー形成を利用することによって決定される。１例では、マイクロＲＮＡをコードする遺伝子をウイルス核酸に挿入し、かつウィルス感染によりＨＣＣ細胞に進入させることができる。ＨＣＣ細胞におけるｍｉＲＮＡの機能は細胞のコロニー数において明らかとなり、ｍｉＲＮＡがヒト肝癌において腫瘍抑制遺伝子として機能することが示される。

【実施例】

【0033】

材料および方法
被験者または患者試料、細胞培養、および５−アザ−シチジン（５−ａｚａＣ）処理
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、Ｊ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＫ−Ｈｅｐ−１を、加湿した５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃にてダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）でインキュベートした。処理を行う２４時間前に、ＨｕＨ７細胞（１×１０^５細胞／ウェル）およびその他の肝癌細胞（３×１０^５細胞／ウェル）を６ウェルプレート中に播種した。細胞を５μＭの５−ａｚａＣ（Ｓｉｇｍａ社製）で３日間処理した。培地を２４時間ごとに５−ａｚａＣを含む新鮮な培地に交換した。腫瘍組織および隣接する正常組織を含む４２対のＨＣＣ臨床試料、４１個の血漿試料、８個の肝硬変血漿および１０個の健常な試料をＣｈｉ Ｍｅｉメディカルセンター（台湾、台南）から入手した。重亜硫酸シークエンシングおよびＤＮＡメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）に用いる正常な成人の肝ゲノムＤＮＡ（対照）はＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した。ＣｐＧｅｎｏｍｅ ユニバーサルメチル化ＤＮＡ（ＣｐＧｅｎｏｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ）をＣｈｅｍｉｃｏｎ社から購入し、ＭＳＰの陽性対照群とした。

【0034】

ＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）および重亜硫酸シークエンシング
ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いてＨＣＣ臨床試料、肝癌細胞および成人の正常肝臓からのゲノムＤＮＡ（１μｇ）を重亜硫酸変換し（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ）、ＰＣＲ増幅に用いた。ＣＯＢＲＡにおいて、ＰＣＲ産物を６０℃にてＤＮＡメチル化感受性（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）エンドヌクレアーゼＢｓｔＵＩで一晩消化した。消化されたＤＮＡ断片を１．５％（ｗ／ｖ）エチジウムブロマイド染色アガロースゲル上で可視化した。重亜硫酸シークエンシングに用いるＰＣＲ産物は、ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔクローニングベクター中にクローニングした。大腸菌の形質転換の後、ＡＢＩシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて約１０個のクローンを選び、シークエンシングを行った。

【0035】

リアルタイム定量的ＤＮＡメチル化解析
サイバーグリーン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ）を用い蛍光ベースのリアルタイムＤＮＡメチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によって上記の重亜硫酸変換したＤＮＡを増幅した。各反応液は、１×ＰＣＲバッファー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２５μＭのフォワードプライマーおよび０．２５μＭのリバースプライマー、１．５ＵのＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社製）、ならびに１μＬのサイバーグリーン（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）を、全量２０μＬとし、１０００倍に希釈してなるものとした。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７０００シークエンス検出システムにて、９４℃で７分、続いて９４℃で３０秒、６２℃で３０秒および７２℃で３０秒を４０サイクルという熱サイクル条件で増幅を行った。上述の記載に基づき、次の式により、β−アクチンとｍｉｒ−１２９−２の間のＣｔ値の差からＤＮＡメチル化レベルを算出した。

【0036】

２^{[Ct(β-actin)-Ct(miR-129-2)]}×１００ （組織試料の場合）
または
２^{[Ct(β-actin)-Ct(miR-129-2)]} ×１０００（血漿試料の場合）

【0037】

リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて肝癌細胞およびＨＣＣ臨床試料の全ＲＮＡを抽出した。メーカーの使用説明書に従い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）でｃＤＮＡの合成を行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００シークエンス検出システム上でリアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行った。成熟ｍｉＲＮＡの発現の解析では、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）をメーカーの使用説明書どおりに使用した。ΔΔＣｔ法により相対発現量を解析し、Ｕ６およびＲＮＵ４４を内在対照（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いた。

【0038】

コロニー形成
ＨｕＨ７およびＪ７細胞を９６−ウェルプレート上に２×１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。メーカーの使用説明書に従って、ｍｉｒ−１２９−２前駆体を持つ組み換えレンチウィルスまたは対照レンチウィルスを細胞に感染させた。感染２４時間後、細胞を０．７％トップアガーと混合し、各ウェルが１％ボトムアガーを含む６−ウェルプレートに移した。ピューロマイシン５μｇ／ｍｌで４週間、トランスフェクタントを選別した。ＰＢＳでコロニーを洗浄し、無水メタノール（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ）で固定し、クリスタルバイオレット溶液（０．５％）で１時間染色した。

【0039】

［実施例１］ＤＮＡメチル化により調節された潜在性のある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ｍｉＲＮＡの確認
配列番号４および５に記載される塩基配列を含むプライマー対を用いたＣＯＢＲＡにより、正常肝組織および細胞（ＨＨ）と６種のＨＣＣ細胞（ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、Ｊ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＫ−Ｈｅｐ１）におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化状態を確認した。図１に示される結果は、６種のＨＣＣ細胞においてｍｉｒ−１２９−２はＤＮＡメチル化されていたが、正常肝組織および細胞においてはＤＮＡメチル化されていないことを示した。

【0040】

さらに重亜硫酸シークエンシングを用いてＨＣＣおよび正常肝細胞におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化状態を調べた。全部で３３個のＣｐＧ部位を調べた。２種類の正常肝細胞（ＨＨ）および、正常肝組織における各１０個の異なるクローンを観察した結果、総じて、正常肝細胞（ＨＨ）および組織の両方に低ＤＮＡメチル化が観察された（図２Ａ〜２Ｂ）。正常肝組織ＮＬ−１６６３およびＮＬ−４１４９、ならびに正常肝細胞ＨＨにおけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化率はそれぞれ２．１％および３．３％、ならびに０．６％であった。これに対し、ＨＣＣ細胞ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ７、Ｊ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＭａｈｌａｖｕおよびＳＫ−Ｈｅｐ１におけるＤＮＡメチル化率を各細胞株の各１０個の異なるクローンを観察した結果はそれぞれ６４．５％、５８．８％、７１．５％、７９．７％、７２．７％および９４．５％であった（図２Ｃ〜２Ｆ）。これら結果から、正常肝細胞に比べ、ＨＣＣ細胞においてｍｉｒ−１２９−２の高度ＤＮＡメチル化は頻繁に生じる現象であることが示された。

【0041】

［実施例２］ＤＮＡメチル化が調節するＨＣＣ細胞におけるｍｉＲ−１２９−２の発現
ｍｉＲ−１２９−２の発現がＤＮＡメチル化によって調節されたかを評価するため、定量的逆転写ＰＣＲにより正常肝細胞とＨＣＣ細胞のｍｉＲ−１２９−２の発現量を調べた。正常肝細胞、ＨＨに比べ、ＨＣＣ細胞の全てにおいてｍｉＲ−１２９−２の発現は減少した（図３Ａ）。同様に、ＨＣＣ組織試料におけるｍｉＲ−１２９−２の発現量は、正常肝試料プールにおけるそれよりも１６倍低かった（図３Ｂ）。さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害因子である５−アザ−シチジンの処理後では、未処理の細胞に比べＨｕＨ７細胞において２．５倍、Ｊ７細胞において１６倍と、ｍｉＲ−１２９−２の発現量が著しく増加した（図３Ｃ）。これらの結果は、ＤＮＡメチル化がｍｉＲ−１２９−２の発現を調節し、かつＨＣＣ細胞におけるｍｉＲ−１２９−２の発現の低下をもたらすことを示唆した。

【0042】

［実施例３］ＨＣＣにおいて腫瘍抑制ｍｉＲＮＡとして機能するｍｉＲ−１２９−２
ＨＣＣにおけるｍｉＲ−１２９−２の機能を評価するため、先ず、ｍｉＲ−１２９−２前駆体をコードする遺伝子を持つレンチウィルス（ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２）の感染によってｍｉＲ−１２９−２を発現するＨＣＣ細胞を作製した。Ｔａｑｍａｎアッセイを用い、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したＨＣＣ細胞中の成熟ｍｉＲ−１２９−２の発現を確認した。ＨｕＨ７細胞において、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２の感染は、強制発現したｍｉＲ−１２９−２が、細胞内で分解され産生されるｍｉＲ−１２９−２−５ｐ（配列番号２に記載されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ塩基配列を有するｍｉＲＮＡ）およびｍｉＲ−１２９−２−３ｐ（配列番号３に記載されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ塩基配列を有するｍｉＲＮＡ）を対照感染細胞に比べてそれぞれ約２０００倍および１０００倍過剰発現させた（図４Ａ〜４Ｂ）。同様に、ｌｅｎｔｉ−ｍｉｒ−１２９−２に感染したＪ７細胞は、対照感染細胞に比べ、ｍｉＲ−１２９−２−５ｐが約５００倍以上、ｍｉＲ−１２９−２−３ｐが１０００倍以上発現した。ｍｉＲ−１２９−２はＨＣＣ細胞の足場非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ）を低下させる能力を備えることが分かった。対照感染細胞と対比して、ｍｉＲ−１２９−２を発現するＪ７に観察された細胞コロニーはわずか３分の１であった（図４Ｃ）。同じように、対照レンチウィルスに感染したＨｕＨ７では、ウェルにつき平均で４７個のコロニーがあった（図４Ｄ）。これに対し、対照ｍｉＲＮＡを発現するＨｕＨ７にはコロニーはほとんど検出されなかった。これらの結果から、ｍｉＲ−１２９−２がＨＣＣにおいて腫瘍抑制ｍｉＲＮＡとして機能し得るということが示された。

【0043】

［実施例４］ＨＣＣ臨床試料におけるｍｉｒ−１２９−２の高度ＤＮＡメチル化およびダウンレギュレーション
臨床試料におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化状態を評価するため、配列番号４および５に記載される塩基配列を含むプライマー対を用いたＣＯＢＲＡを用いて４２対のＨＣＣ腫瘍および隣接する正常組織を解析した（図５Ａ）。４２のうち３０（〜７１％）のＨＣＣ組織がｍｉｒ−１２９−２の高度ＤＮＡメチル化を示した（図５Ｂ）。これに対し、ｍｉｒ−１２９−２の高度ＤＮＡメチル化は、１の隣接する正常組織のみで観察されただけだった。ＤＮＡメチル化レベルをさらに定量化するべく、配列番号８および９に記載される塩基配列を含むプライマー対を用いた定量的ＤＮＡメチル化特異的ＰＣＲを行った。３例（患者番号１１１１、２０００および２７５６）を除き、隣接する正常組織に対比して、ほぼ全ての臨床試料がＨＣＣ組織においてより高いｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを示した（図５Ｃ〜５Ｄ）。加えて、ｑ−ＭＳＰの結果とＣＯＢＲＡの結果は有意に相関していた。これらの結果がＨＣＣ臨床試料においてｍｉｒ−１２９−２が高度ＤＮＡメチル化されたことを示しており、ＨＣＣ細胞における結果と一致するものであった。

【0044】

また、ｍｉＲ−１２９−２の発現がＤＮＡメチル化によって下方制御されたかを確認するため、ｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ｑＲＴ−ＰＣＲにおいてｍｉｒ−１２９−２に用いるプライマー対は、配列番号６および７に記載される塩基配列を含むプライマー対を用いた。隣接する正常組織に比べ、４２個のＨＣＣ臨床試料のうち２９個（〜６９％）のＨＣＣ試料でｍｉＲ−１２９−２の発現が抑えられた（図６Ａ〜６Ｂ）。

【0045】

これらの結果は、ＨＣＣ試料においてｍｉｒ−１２９−２は高度ＤＮＡメチル化および下方制御されたが、隣接する正常組織ではこれらが生じなかったことを示し、このことは、ｍｉＲ−１２９−２の差次的発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）および／またはＤＮＡメチル化レベルがＨＣＣ診断のためのマーカーおよび被験者の将来肝癌が発生する率を測定するためのマーカーとなり得ることを表している。

【0046】

［実施例５］ＨＣＣ血漿試料におけるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベル
４１個のＨＣＣ血漿試料、８個の肝硬変血漿試料および１０個の健常な血漿試料をＣｈｉ Ｍｅｉ メディカルセンター（台湾、台南）から入手した。これらの試料に対して配列番号８および９に記載される塩基配列を含むプライマー対を用いた定量的ＤＮＡメチル化特異的ＰＣＲ、ｑ−ＭＳＰを行いｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルを確認した。４１個のＨＣＣ血漿試料のうち３７個（９０％）においてＤＮＡメチル化レベルが０．１を超えていた（図７Ａ）。これに対し、血漿試料において０．０５を超えるｍｉｒ−１２９−２のＤＮＡメチル化レベルが検出された健康なドナーは１人もおらず、かつ２個の肝硬変血漿試料のみで０．１を超えただけであった（図７Ａ）。さらなる統計的解析のために、ＤＮＡメチル化レベルをｌｏｇ２値に変換した。統計的解析により、健常な血漿または肝硬変血漿に比して、ＨＣＣ血漿のｍｉｒ−１２９−２ＤＮＡメチル化レベルは有意に高いことが分かった（Ｐ＜０．０１）（図７Ｂ）。ＲＯＣ（受信者動作特性曲線）解析を用い、ｍｉｒ−１２９−２ＤＮＡメチル化レベルの感度、特異度、ＡＵＣ（曲線下面積）およびカットオフ値を決定した。カットオフ値−２．３６でＨＣＣを健康な者および肝硬変と分けることができ、感度および特異度はそれぞれ８８％および１００％であった（ＡＵＣ＝０．９２、ＳＥ＝０．０３９、９５％ ＣＩ＝０．８４３-０．９９７、Ｐ＜０．００１）（図７Ｃ）。ＲＯＣ解析から、ＨＣＣ診断におけるｍｉｒ−１２９−２ＤＮＡメチル化の利用の正確度が高いということが明らかとなった。

【0047】

当業者には、開示した実施形態に様々な変更および修飾を加えられるということが明らかであろう。明細書および実施例は単なる例示であると見なされ、本発明の真の範囲は以下の特許請求の範囲およびその同等物により示されることが意図されている。

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

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