特許 5732452 ＶＦＴドメイン膜タンパク質のダイマーを調節する化合物の検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5732452

(24)【登録日】2015年4月17日

(45)【発行日】2015年6月10日

(54)【発明の名称】ＶＦＴドメイン膜タンパク質のダイマーを調節する化合物の検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/542 20060101AFI20150521BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20150521BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20150521BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20150521BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20150521BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150521BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/542 A

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   G01N21/64 B

   G01N21/64 F

   C12Q1/02ZNA

   !C12N15/00 A

【請求項の数】13

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2012-507805(P2012-507805)

(86)(22)【出願日】2010年4月29日

(65)【公表番号】特表2012-525574(P2012-525574A)

(43)【公表日】2012年10月22日

(86)【国際出願番号】FR2010050814

(87)【国際公開番号】WO2010125314

(87)【国際公開日】20101104

【審査請求日】2013年4月19日

(31)【優先権主張番号】0952908

(32)【優先日】2009年4月30日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】511262256

【氏名又は名称】セイエス ビオ アンテルナショナル

(73)【特許権者】

【識別番号】508106611

【氏名又は名称】サントル ナシオナル ド ラ ルシェルシュ シアンティフィック （セーエヌエールエス）

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドゥマザン， エティエンヌ

(72)【発明者】

【氏名】ツヴィア， ユリアーン

(72)【発明者】

【氏名】トランケ， エリック

(72)【発明者】

【氏名】パン， ジャン−フィリップ

【審査官】 藤田 都志行

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０６３３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１４１３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００１−５０２０５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−１５３６３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Damien Maurel et al.，"Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization"，Nature Methods，英国，２００８年 ６月，Vol. 5, No. 6，p. 561-567

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５４２

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

測定媒体中に存在する細胞膜で発現するＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの活性状態を調節する効果を有する化合物を選択する方法であって、ここで前記ダイマーは、同一か又は異なる第一タンパク質及び第二タンパク質で構成されており、第一タンパク質及び第二タンパク質はそれぞれＶＦＴドメインを有しており、
前記方法は以下の工程：
（ａ）前記第一タンパク質をそのＶＦＴドメインのＮ末端部で１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識する工程；
（ｂ）前記第二タンパク質をそのＶＦＴドメインのＮ末端部でその１対のＦＲＥＴパートナーの他方のメンバーにより標識する工程；
（ｃ）前記ＦＲＥＴパートナーを励起し、試験化合物の非存在下及び存在下、ＦＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験化合物の非存在下とその存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルに差異がある場合に、その試験化合物を調節化合物として選択する工程
を含み、ここで工程（ｃ）において前記ＦＲＥＴシグナルは、参照化合物の存在下とその非存在下で測定されたシグナルが異なるものとなる時間窓内で測定され、前記参照化合物が前記ダイマーのアゴニスト又はアンタゴニストである、方法。

【請求項2】

工程（ｃ）において前記シグナルは、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜１０００μ秒の積分時間で測定される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｉ）前記ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター半径（Ｒ_０）は２０〜５５Åであり、かつ、工程（ｃ）において前記ＦＲＥＴシグナルは、励起してから２０〜１００μ秒の遅延時間、及び１００〜５００μ秒の積分時間で測定されるか；又は、
（ｉｉ）前記対のフェルスター半径（Ｒ_０）は５５Åよりも大きく、かつ、工程（ｃ）において前記ＦＲＥＴシグナルは、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜１０００μ秒の積分時間で測定される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記試験化合物の存在下及び非存在下でのＦＲＥＴ測定は、前記ダイマーの公知のアゴニストの存在下で行われる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第一タンパク質及び第二タンパク質は、ＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧタンパク質共役受容体である
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーは、代謝型グルタミン酸受容体、γ−アミノ酪酸受容体、甘味知覚関連受容体、旨味知覚関連受容体、細胞外カルシウム感知受容体、又は塩基性アミノ酸受容体から選択される
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーは、代謝型グルタミン酸受容体であるか、又は、ＴＡＳ１Ｒ２−ＴＡＳ１Ｒ３、若しくはＴＡＳ１Ｒ１−ＴＡＳ１Ｒ３から選択される
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記第一タンパク質及び第二タンパク質の前記ＦＲＥＴパートナー対のメンバーによる標識は、１対の結合パートナーによる間接標識か、又は共有結合による直接標識のいずれかである
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第一タンパク質及び第二タンパク質はそれぞれ自殺酵素との融合タンパク質の形態で発現し、前記第一タンパク質及び第二タンパク質の標識は、前記自殺酵素の基質にそれぞれ共有結合している前記ＦＲＥＴパートナー対の各メンバーを前記測定媒体に添加することにより行われる
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記第一タンパク質及び第二タンパク質はそれぞれ、異なる自殺酵素との融合タンパク質の形態で発現する
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記第一タンパク質及び第二タンパク質はそれぞれ、同一の自殺酵素との融合タンパク質の形態で発現する
ことを特徴とする請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記自殺酵素は、Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ変異体、デハロゲナーゼ変異体、又はアシルキャリアタンパク質フラグメントから選択される
ことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＦＲＥＴパートナー対は、
（ｉ）一方は、ユーロピウムキレート、テルビウムキレート、ユーロピウムクリプテート、及びテルビウムクリプテートから選択される蛍光ドナー化合物、
（ｉｉ）もう一方は、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、ニトロベンゾオキサジアゾール、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色・赤色蛍光タンパク質、及び近赤外領域で蛍光性を有するタンパク質から選択される蛍光性有機分子であるアクセプター蛍光化合物
で構成される
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新薬及び新規味覚モジュレータの探索並びに農業において有用な、膜受容体を調節する化合物に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ゲノムの３．４％を占めており、哺乳類膜受容体の最も大きなファミリーとなっている。ＧＰＣＲの単離及びその後のクローニングにより、ヒトにおいて約９００の遺伝子を同定することができた。そのうち約５００の遺伝子は嗅覚及び味覚の受容体に相当し、約４００の遺伝子は内在性リガンドに結合可能な受容体に相当する。このように、これら受容体の異種性により外部シグナル（臭い、光、味覚分子）及び内部シグナル（ホルモン、神経伝達物質）のいずれをも非常に幅広く認識できる。

【0003】

ＧＰＣＲとして以下の３つの主要なクラスが挙げられる。

【0004】

原型であるロドプシンを含むクラスＡは最も幅広く存在するクラスである。これらの受容体のリガンドの結合部位は主に膜貫通ドメインを含み、さらにＧＰＣＲの細胞外ループも含む。

【0005】

ＧＰＣＲのクラスＢは、ジスルフィド架橋に関与する保存されたシステインを含む広域な細胞外Ｎ末端ドメイン（１００〜５００個のアミノ酸）により特徴付けられる。これら受容体のリガンドは細胞外ドメイン（Ｎ末端ドメイン及びＧＰＣＲ細胞外ループ）のみに結合する。

【0006】

クラスＣ受容体は、ＶＦＴ（Ｖｅｎｕｓ ＦｌｙＴｒａｐの頭字語）ドメインと称され、アミノ酸類、糖類及びイオン類の輸送に関与する、細菌ペリプラズムタンパク質に類似した非常に大きな細胞外ドメイン（〜６００個のアミノ酸）により特徴付けられる。これらの受容体として、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、及びｍＧｌｕＲ８受容体）、γ-アミノ酪酸受容体又はＧＡＢＡ受容体（ＧＡＢＡ_Ｂ受容体）、甘味受容体及び旨味受容体、細胞外カルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）、並びに塩基性アミノ酸受容体（ＧＰＲＣ６ａ）が含まれる。他のクラスＣのＧＰＣＲとしては、動物界に存在するＶＦＴドメイン、特にＶ２Ｒフェロモン受容体が含まれる。

【0007】

ＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧＰＣＲは全てダイマーからなる、すなわち、２つのサブユニットで構成されており、その２つのサブユニットの会合が受容体の機能発現に必須であることが一般的に認められている。２つの同一なサブユニットからなるホモダイマー型（ｍＧｌｕＲ、ＣａＳＲ、及びＧＰＲＣ６ａ受容体）の他、異なる遺伝子の発現により形成されるサブユニットからなるヘテロダイマー型（２つのサブユニットＧＢ１及びＧＢ２を含むＧＡＢＡ_Ｂ受容体、ＴＡＳ１Ｒ２及びＴＡＳ１Ｒ３を含む甘味受容体、ＴＡＳ１Ｒ１及びＴＡＳ１Ｒ３を含む旨味受容体）がある。

【0008】

ＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧＰＣＲの場合、各サブユニットはそのＮ末端部に、“Ｖｅｎｕｓ ＦｌｙＴｒａｐ”ドメインすなわちＶＦＴドメインと称され、オルソステリックリガンドの結合に関与する広域な細胞外ドメインを有する。ＶＦＴドメインは、クラスＣのＧＰＣＲ内や、他の受容体内、特に、ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、又はカイニン酸受容体と一般的に称されるイオンチャンネル型グルタミン酸受容体、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリーの各受容体（ＮＰＲ−Ａ及びＮＰＲ−Ｂ）、及び昆虫に存在するビーナスキナーゼ受容体（ＶＫＲ）内に存在する、保存されたタンパク質ドメインである。

【0009】

これらの受容体の各ＶＦＴドメインは、ヒンジを軸にして配置された２つのローブを有し、割れ目が形成されているクラムシェルの形態の特徴的な構造を共有しており、その割れ目にはオルソステリックリガンドが結合する。ヒンジが柔軟であるため、活性化リガンドが結合すると２つのローブ間は閉じられる。オルソステリックリガンドによりＶＦＴドメインが閉じることが、受容体の活性化に必須の第一段階である。逆に、アンタゴニストリガンドはＶＦＴドメインを開いた位置に保持し、受容体を不活性状態に保つ。

【0010】

ダイマー型受容体である場合、２つのサブユニットのＶＦＴドメインは、ＧｌｕＲ１受容体のＶＦＴドメインのダイマーに対して得られるＸ線結晶構造に示されるように、ＶＦＴドメインのダイマーとして構成される（非特許文献１及び２）。ＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧＰＣＲの活性化モデルによって、活性化リガンドの結合により少なくとも１つのＶＦＴが閉じるだけでなく、一方のＶＦＴに対してもう一方のＶＦＴの向きが変化することも示唆される。この相対移動によりＶＦＴの２つのＣ末端が互いに接近するが、この接近自体が、Ｇタンパク質の補充及びシグナル変換に必要な膜ドメインの立体構造の変化に影響を及ぼしていることは明らかである。

【0011】

ＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧＰＣＲは、新薬の探索において極めて重要な標的である。ｍＧｌｕＲ受容体は特にパーキンソン病、統合失調症、痛みに関係しており、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体は癲癇や薬物依存性現象に関係しており、ＣａＳＲ受容体は骨粗鬆症に関係している。また、これらの受容体は、新規甘味分子（甘味受容体）や他の新規調味料（旨味受容体）の探索に有用である。また、Ｖ２Ｒフェロモン受容体モジュレータの探索は農業分野で有用である。

【0012】

リガンドの結合及び／又はそのリガンド結合後のＧＰＣＲの活性化の追跡を可能にするスクリーニング法がある：ＧＴＰγＳ（放射性）、電気生理学、放射性リガンドの使用。これらのスクリーニング法は大きな規模では採用できない。

【0013】

ハイスループット・スクリーニング・プラットホームでは、通常、安定的又は一時的にトランスフェクトすることで対象の受容体を発現するようにした哺乳類細胞を使用する。試験化合物の作用は、上記受容体と結合したＧタンパク質の活性化後に細胞内に現れる二次メッセンジャーの細胞内濃度の変化を検出するという機能試験により確認される。測定される二次メッセンジャーは、対象の受容体に結合するＧタンパク質の種類によって変わる。その受容体としては、以下のものが挙げられる。

【0014】

・Ｇｓタンパク質共役受容体：Ｇｓタンパク質に結合したＧＰＣＲの薬理学的作用の特性を決定するために二次メッセンジャーｃＡＭＰの蓄積を測定する。

【0015】

・Ｇｑタンパク質共役受容体（グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５、細胞外カルシウム感知受容体ＣａＳＲ、並びに塩基性アミノ酸受容体ＧＰＲＣ６ａの場合）：ＩＰ３代謝産物、例えばＩＰ１などの蓄積。または、細胞に蛍光性カルシウムプローブを取り込ませることにより、細胞内カルシウム濃度の一時的上昇を可視化することができる。

【0016】

・Ｇｉタンパク質共役受容体（例：グルタミン酸受容体ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、及びｍＧｌｕＲ８、ＧＡＢＡ受容体ＧＡＢＡ_Ｂ、並びに甘味受容体及び旨味受容体）：間接的に、受容体がホルスコリン又はイソプロテレノールで刺激されることで、ｃＡＭＰ濃度が上昇する。この上昇が試験化合物により阻害されれば、受容体がＧｉタンパク質と結合しているということになる。他に考えられるものでスクリーニングに通常好ましいのは、活性化された状態でＧＰＣＲを認識可能なＧｉタンパク質の一部と、ＩＰ３／Ｃａ^２＋経路をトリガー可能なＧｑタンパク質の一部とを融合して形成されるキメラＧタンパク質とともに対象の受容体を共発現させることである。この条件において、受容体の活性化は、一時的に生じるカルシウムシグナルにより検出できる。

【0017】

既存の方法は、ダイマー性クラスＣのＧＰＣＲの活性化を調節可能な化合物を明らかにするのにあまり適していない。なぜなら、受容体のその天然リガンド（ｍＧｌｕ受容体の場合）に対する親和性が低いとアゴニスト作用が非常に検出しにくく、また、細胞内のシグナル変換により生じる二次メッセージ（ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＩＰ１）の測定に基づく機能試験も、比較的実施しにくいことや、ダイマーである受容体と共役したエフェクター経路が複雑であることから適していないためである。また、その細胞内（Ｃ末端）ドメインで蛍光タンパク質と融合したＧＰＣＲの発現に基づくＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ））法も、細胞内区画に存在するダイマー由来のバックグラウンドノイズが大きいため適していない。特許文献１には、概して、ダイマーを形成可能なＧＰＣＲをエネルギードナー化合物及びエネルギーアクセプター化合物、特に蛍光タンパク質で標識し、ＦＲＥＴ変化を測定するというＧＰＣＲのダイマー化を調べる方法が開示されている。この特許文献には、クラスＣのＧＰＣＲダイマーを調節する化合物を選択できる技術的手段は開示されていない。さらに、実質的に、種々の細胞内区画に存在するダイマーにより生じるバックグラウンドノイズが大きいために本件にはあまり適していない蛍光タンパク質を用いて説明しているものである。

【0018】

非特許文献３では、ＧＡＢＡ受容体ダイマーの研究にＦＲＥＴ法が適用されている。そこでは、ＧＡＢＡ_Ｂ受容体のＧＡＢＡ_Ｂ１サブユニット及びＧＡＢＡ_Ｂ２サブユニットのそれぞれがユーロピウムクリプテート（Ｅｕピリジン−ビス−ビピリジン）及びアクセプター蛍光団（ｄ２）で標識されている。上記研究では、受容体がそのアゴニスト、すなわちＧＡＢＡにより活性化される場合にＦＲＥＴシグナルの変化を観察することはできず、よって、この手法は上記ダイマーを調べるのに適していないことが示唆される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0019】

【特許文献1】米国特許第６８２４９９０号明細書

【非特許文献】

【0020】

【非特許文献1】Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００ Ｏｃｔ ２６；４０７（６８０７）：９７１−７

【非特許文献2】Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００２ Ｍａｒ ５；９９（５）：２６６０−５

【非特許文献3】Ｍａｕｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｊｕｎｅ ２００８；５（６）：５６１−７

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0021】

本発明は、ＶＦＴドメインを含む膜タンパク質、特にクラスＣのＧＰＣＲのダイマーの活性状態を調節する効果を有する化合物を明らかにする方法及び物質を提供するものであり、これにより試験化合物がこれらの受容体に薬理学的作用を示すかどうかを決定できる。

【0022】

現在、新薬の発見のためにこの種のダイマー型受容体を効率よくかつ容易にスクリーニングできる方法は存在しないため、本発明は特に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】グルタミン酸塩濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図2】グルタミン酸塩の存在下又は非存在下での、ＬＹ３４１４９５アンタゴニストの濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図3】グルタミン酸塩又はＤＣＧ−ＩＶ（部分的アゴニスト）の濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図4】４−ＭＰＰＴＳ（ポジティブアロステリックモジュレータ）の存在下又は非存在下での、グルタミン酸塩濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図5】グルタミン酸塩又はＤＧＣ−ＩＶの濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマー（各サブユニットをＳｎａｐ−ｔａｇ標識）により放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図6】グルタミン酸塩濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマー、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ダイマー、及びｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図7】ＬＹ３４１４９５濃度に対する、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図8】グルタミン酸塩濃度に対する、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマー、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ダイマー、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ダイマー、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ３ダイマー、及びｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ４ダイマーにより放射されるＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【図9】グルタミン酸塩若しくはＬＹ３４１４９５の存在下、又はそれらの化合物の非存在下での、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ１ダイマー、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマー、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ダイマー、及びｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマーにより放射されるＦＲＥＴの比の変化を示す。

【図10】グルタミン酸塩若しくはＬＹ３４１４９５の存在下、又はそれらの化合物の非存在下での、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ１ダイマー、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマー、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ダイマー、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ダイマー、ｍＧｌｕＲ５−ｍＧｌｕＲ５ダイマー、及びｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマーにより放射されるＦＲＥＴの比の変化を示す。

【図11】グルタミン酸塩若しくはＬＹ３４１４９５の存在下、又はそれらの化合物の非存在下での、時間窓に対する、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマーにより放射されるＦＲＥＴの比の変化を示す。

【図12】グルタミン酸塩若しくはＬＹ３４１４９５の存在下、又はそれらの化合物の非存在下での、時間窓に対する、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマー及びｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにより放射されるＦＲＥＴの比の変化を示す。

【図13】図１３Ａは、各々がＳｎａｐ−ｔａｇ酵素（Ｓ）と結合しており、かつＧタンパク質との結合を防ぐＦ７５６Ｐ変異を含んでいるｍＧｌｕＲ２のダイマーを表す。図１３Ｂは、各々がＳｎａｐ−ｔａｇ酵素（Ｓ）と結合しており、Ｇタンパク質との結合を防ぐＦ７５６Ｐ変異を含んでおり、かつこのタンパク質がアロステリックモジュレータに反応しないようにするＣ２３４Ａ変異も含んでいるｍＧｌｕＲ２のダイマーを表す。図１３Ｃは、各々がアミノ酸５９７（第一細胞内ループｉ１の中間）から端が欠失しており、Ｓｎａｐ−ｔａｇ酵素（Ｓ）と融合しており、従って１つの膜貫通ドメイン、ＣＲＤドメイン及びＶＦＴドメインしか含んでいないｍＧｌｕＲ２のダイマーを表す。図１３Ｄは、各々がアミノ酸５６１から端が欠失しており（従ってＶＦＴドメイン及びＣＲＤドメインのみを含む）、Ｓｎａｐ−ｔａｇ酵素（Ｓ）と融合しており、かつＧＰＩアンカーシグナルペプチド（ＲＲＳＳＳＴＶＬＦＳＳＰＶＩＬＬＩＳＦＬＩＦＬＩＶＧ−配列番号７）がシステイン豊富ドメインの後（ＣＲＤ、すなわちアミノ酸ＬＰＱＥＹの後）に挿入されているｍＧｌｕＲ２のダイマーを表す。図１３Ｅは、各々がアミノ酸４９９から端が欠失しており（従ってＶＦＴドメインのみを含む）、Ｓｎａｐ−ｔａｇ酵素（Ｓ）と融合しており、かつＧＰＩアンカーシグナルペプチド（ＲＲＳＳＳＴＶＬＦＳＳＰＶＩＬＬＩＳＦＬＩＦＬＩＶＧ−配列番号７）がＶＦＴドメインの後（すなわちアミノ酸ＧＰＬＰＡＳの後）に挿入されているｍＧｌｕＲ２のダイマーを表す。図１３Ｆは、各々が（ｉ）ｍＧｌｕＲ２の最初の５６１個のアミノ酸（ＶＦＴ＋ＣＲＤドメイン、アミノ酸ＬＰＱＥＹの後で終止）を含んでおり、Ｓｎａｐ−ｔａｇタンパク質（Ｓ）と融合しており、かつ（ｉｉ）膜貫通ドメインに相当する、Ｄ２ドーパミン作動性受容体の短い変異体の最初の４１４個のアミノ酸（メチオニン１は含まず）を含んでいるキメラ受容体のダイマーを表す。

【図14】時間に対するＦＲＥＴシグナルの変化を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、測定媒体中に存在する細胞膜で発現するＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの活性状態を調節する効果を有する化合物を選択する方法であって、ここで、上記ダイマーは、同一か又は異なる第一タンパク質及び第二タンパク質で構成されており、以下の工程：
（ａ）上記第一タンパク質及び第二タンパク質をそれらのＶＦＴドメインのＮ末端部で１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識する工程；
（ｂ）上記ＦＲＥＴパートナーを励起し、試験化合物の非存在下及び存在下、上記ＦＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において上記試験化合物の非存在下とその存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルに差異がある場合に、その試験化合物を調節化合物として選択する工程
を含む方法に関する。

【0025】

驚くべきことに、本発明者らは、Ｍａｕｒｅｌらによる先行技術において観察されたように、ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの活性のモジュレータの存在下でＦＲＥＴシグナルの変化がみられなかったのは、シグナルが測定された時間窓の選択に関係があることを明らかにした。従来、ＦＲＥＴシグナルは、測定媒体を光励起してからある遅延時間が経過した後、所定期間（積分時間）の間、測定されてきた。ＦＲＥＴシグナル測定に基づく生物学的アッセイを行うのに利用できる物質及び装置は、使用者がこのシグナル測定時間窓を変えることができないように設計されている。

【0026】

ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの場合、本発明者らは、参照アゴニスト化合物の存在下又は非存在下で測定されるＦＲＥＴシグナルが経時的に減少するならば、逆転点、すなわち、励起後のある時間において、この参照アゴニスト化合物の存在下とその非存在下でのＦＲＥＴ値が同一である点が観察されることを見いだした。

【0027】

本発明者らは、この逆転点の前では、参照アゴニスト化合物の非存在下でのＦＲＥＴシグナル（図１４の灰色曲線）は、アゴニストの存在下で測定されるもの（図１４の黒色曲線）よりも大きいことを確認した。逆転点から先は、反対に、アゴニストの非存在下で観察されるＦＲＥＴシグナルは、アゴニストの存在下で測定されるものよりも小さくなる。

【0028】

さらに、逆転点を含む特定の時間窓（例えばｆ１、図１４参照）でシグナルが測定される場合、調節化合物の存在下であっても非存在下であっでもＦＲＥＴシグナルの変化は観察されない。換言すれば、本発明者らは、先行技術においてＦＲＥＴシグナルの変化が観察されなかった理由となる問題点、すなわち、従来使用されてきた時間窓に逆転点が存在することを明らかにした。

【0029】

上記所見に基づけば、逆転点の前後に位置する時間窓（ｆ２、ｆ４、図１４参照）においてＦＲＥＴシグナルを測定する場合、参照アゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されるＦＲＥＴシグナルは常に異なるということになる。逆転点を含む時間窓（ｆ３、図１４参照）を選択することは可能だが、この場合、参照アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されるシグナルが異なることを確認する必要があるであろう。

【0030】

従って、本発明は、測定媒体中に存在する細胞膜で発現するＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの活性状態を調節する効果を有する化合物を選択する方法であって、ここで上記ダイマーは、同一か又は異なる第一タンパク質及び第二タンパク質で構成されており、上記方法は以下の工程：
（ａ）上記第一タンパク質及び第二タンパク質をそれらのＶＦＴドメインのＮ末端部で１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識する工程；
（ｂ）上記ＦＲＥＴパートナーを励起し、試験化合物の非存在下及び存在下、上記ＦＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）において上記試験化合物の非存在下とその存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルに差異がある場合に、その試験化合物を調節化合物として選択する工程
を含み、ここで工程（ｂ）において上記ＦＲＥＴシグナルは、参照アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されたシグナルが異なるものとなる時間窓内で測定される、方法から構成される。

【0031】

参照アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されるシグナルが異なるのは、以下の条件の１つが満たされる場合であると考えられる。
・参照アゴニスト化合物の存在下とその非存在下でのシグナル平均値の差異が２０％よりも大きい場合、又は
・アゴニスト化合物の存在下とその非存在下でのシグナル平均値が最大標準偏差（参照アゴニスト化合物の非存在下で測定されるシグナルの標準偏差か、又はその化合物の存在下で測定されるシグナルの標準偏差のいずれか）に対して３倍超異なる場合。

【0032】

シグナルを励起後に測定するまでの遅延時間、及びシグナルを測定する期間（積分時間）を変えることにより時間窓を実験的に決定することができる。これらのパラメータは市販の蛍光計において容易に変更可能である。

【0033】

特定の一実施態様において、本発明の方法は、工程（ｂ）において上記シグナルは、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜２０００μ秒の積分時間で測定されることを特徴とする。

【0034】

特定の別の実施態様において、本発明の方法は、
（ｉ）上記ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）半径（Ｒ_０）は２０〜５５Åであり、かつ、工程（ｂ）において上記シグナルは、励起してから１０〜１００μ秒の遅延時間、及び１００〜５００μ秒の積分時間で測定されるか；又は、
（ｉｉ）上記対のフェルスター半径（Ｒ_０）は５５Åよりも大きく、かつ、工程（ｂ）において上記シグナルは、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜２０００μ秒の積分時間で測定される
ことを特徴とする。

【0035】

本発明の方法により、特に新薬の発見において選択される標的であるＶＦＴドメインを含む膜タンパク質、特にＶＦＴドメインを含むクラスＣのＧＰＣＲへの影響を評価するために、大きなライブラリを構成する化合物を比較的単純にスクリーニングすることができる。

【0036】

従って、本発明の方法は、（ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ７、及びｍＧｌｕＲ８から選択されるサブユニットのダイマーで構成される）代謝型グルタミン酸受容体、γ-アミノ酪酸受容体すなわちＧＡＢＡ受容体（１つのＧＢ１サブユニットと１つのＧＢ２サブユニットからなるＧＡＢＡ_Ｂ受容体）、甘味知覚関連受容体（ＴＡＳ１Ｒ１−ＴＡＳ１Ｒ３ダイマー）、旨味知覚関連受容体（ＴＡＳ１Ｒ２−ＴＡＳ１Ｒ３ダイマー）、細胞外カルシウム感知受容体（ＣａＳＲサブユニットのホモダイマー）、及び塩基性アミノ酸受容体（ＧＰＲＣ６ａサブユニットのホモダイマー）の新規モジュレータを発見するために用いることができる。これらの用語は、以下で説明されるように、上記受容体の野生型、さらには変異型、欠失型、キメラ型及び組み換え型をも包含する。

【0037】

本発明の方法は代謝型グルタミン酸受容体又は味覚受容体を用いて行うのが好ましい。

【0038】

本発明の方法をグルタミン酸受容体で行う場合、その受容体は以下のダイマーで構成されてもよい：ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ５−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ５−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ５−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ６−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ６−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ７−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ５、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ６、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ７、ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８。特に好ましい一実施態様において、ダイマーは以下から選択される：ｍＧｌｕＲ１ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ２ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ３ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ４ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ５ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ８ホモダイマー、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ３ヘテロダイマー、及びｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ４ヘテロダイマー。

【0039】

味覚受容体に関して、ダイマーは、ダイマー：ＴＡＳ１Ｒ２−ＴＡＳ１Ｒ３、又はＴＡＳ１Ｒ１−ＴＡＳ１Ｒ３から選択されてもよい。

【0040】

本発明の方法は、欠失型ＧＰＣＲに相当するタンパク質、例えば、第一細胞内ループにおいて欠失しているため、１つの膜貫通ドメインしか含んでいないタンパク質（図１３）のダイマーを用いて行ってもよい。膜貫通ドメインを含んでいないＶＦＴドメインタンパク質のスプライスバリアント（Ｆｅｒｒａｇｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２００６ Ｎｏｖ；３２６（２）：４８３−５０４）を用いることもできるが、但し上記変異体が、検討するダイマーの一方のサブユニットを構成する場合、もう一方のサブユニットが少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むものとする。

【0041】

また、本発明の方法は、ＶＦＴドメイン受容体の細胞外ドメインと、他の受容体の１以上の膜貫通ドメインとを含むキメラ受容体（図１３Ｆ参照）を用いて行うこともできる。そのようなキメラ受容体は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースなどで入手可能な核酸配列を有する対象のドメインをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、このベクターを細胞にトランスフェクトするという従来の分子生物学的方法により作製することができる。Ｍａｌｉｔｓｃｈｅｋら（Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９ Ａｕｇ；５６（２）：４４８−５４）はそのようなキメラ受容体を開示している。

【0042】

また、本発明の方法は、ＶＦＴドメイン受容体の細胞外ドメインと、膜貫通ドメインの代わりとしてタンパク質部分を原形質膜の表面に繋ぎ止めることができるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（「ＧＰＩアンカー」）とを含むタンパク質構築物を用いて行うこともできる（図１３Ｄ及び図１３Ｅ参照）。そのようなタンパク質及び作製法は特にＬｉｕら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００４ Ａｐｒ １６；２７９（１６）：１５８２４−３）により開示されている。

【0043】

本発明の特定の別の実施態様において、使用するダイマーは、どんな細胞内シグナル経路とも共役していないＧＰＣＲ変異体である。このＧＰＣＲ変異体は公知であり、例えば、Ｇタンパク質との結合を防ぐ１以上の変異を含むＧＰＣＲ（ｍＧｌｕＲ２のＦ７５６Ｐ変異体（図１３Ａ参照）など）からなる。ダイマーが細胞で安定的に発現し、細胞毒性作用を示し得る場合にこの実施態様は好ましい。

【0044】

アロステリックモジュレータの作用を受けないようにする変異を含むＧＰＣＲ（ｍＧｌｕＲ２のＣ２３４Ａ変異体（図１３Ｂ）など）で構成されるダイマーを使用するのが有利な場合もある。上記変異体を使用して本発明を行うことで、アロステリックモジュレータではない調節化合物を発見することができる。

【0045】

また、本発明の方法は、クラスＣのＧＰＣＲではない他のＶＦＴドメイン受容体、特に、イオンチャンネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ、ＮＭＤＡ、又はカイニン酸受容体と一般的に称される）、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリーの各受容体（ＮＰＲ−Ａ及びＮＰＲ−Ｂ）、及び昆虫に存在するビーナスキナーゼ受容体（ＶＫＲ）を使用して行うこともできる。

【0046】

定義
「ＦＲＥＴパートナー対」：この表現は、エネルギードナー蛍光化合物（以下「ドナー蛍光化合物」）とエネルギーアクセプター化合物（以下「アクセプター化合物」）とからなる対をいう。上記化合物が互いに接近していたり、ドナー蛍光化合物の励起波長で励起されていたりする場合、上記化合物はＦＲＥＴシグナルを放射する。２つの蛍光化合物をＦＲＥＴパートナーとするには、ドナー蛍光化合物の発光スペクトルがアクセプター化合物の励起スペクトルと部分的に重なっていなければならないことが知られている。

【0047】

「ＦＲＥＴシグナル」：ドナー蛍光化合物とアクセプター化合物の間のＦＲＥＴを表す測定可能なシグナルをいう。従って、ＦＲＥＴシグナルは、ドナー蛍光化合物の発光の強度や寿命の変化、又はアクセプター化合物が蛍光性であればその発光の強度や寿命の変化であってもよい。

【0048】

「時間窓」：測定媒体を光励起してからある遅延時間が経過した後にＦＲＥＴシグナルを測定する時から積分時間の終了時までの期間をいう。例えば、「５０〜４５０μ秒」の時間窓は、測定媒体を光励起してから５０μ秒の遅延時間で、かつ４００μ秒の期間（積分時間）、ＦＲＥＴシグナルが測定されることを意味する。

【0049】

「測定媒体」：本発明の実施に必要な試薬を細胞又は細胞膜と混合するのに好適な、プレートのウェルや試験管などの容器の中身をいう。

【0050】

「調節化合物」：「ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーの活性状態を調節する効果を有する化合物」という表現は、活性化作用又は不活性化作用を有する化合物を意味するものである。

【0051】

活性化化合物は、特に、アゴニスト化合物、部分的アゴニスト、又はポジティブアロステリックモジュレータであってもよい。ポジティブアロステリックモジュレータ化合物の作用は、その参照アゴニストの１つにより活性化されたダイマーに対してのみ視認できる。この場合、ポジティブアロステリックモジュレータにより受容体の活性が高まることとなる。参照アゴニストが存在しなければ、ポジティブアロステリックモジュレータの作用は視認できない。

【0052】

不活性化化合物は、ダイマーの活性を低下させるものである。不活性化化合物は、構成的活性型ダイマーに対して不活性化作用を有する場合はインバースアゴニストであり、その参照アゴニストの１つにより既に活性化されたダイマーを不活性化させる場合はネガティブアロステリックモジュレータ又はアンタゴニストである。

【0053】

調節化合物を測定媒体に添加すると、活性状態に対するその化合物の効果を本発明の方法により観察できる。これら調節化合物の化学的性質は限定されず、その作用形式も限定されない。実際、本発明によって、ＶＦＴドメインの立体構造の変化を検出することができる。この変化は、調節化合物がダイマーの構成サブユニットの一方又は両方に結合することにより生じるが、それ自体で対象のＶＦＴドメインダイマーに作用できる他の膜タンパク質に結合することによっても生じる。

【0054】

特定の一実施態様によれば、本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）上記第一タンパク質及び第二タンパク質をそれらのＶＦＴドメインのＮ末端部で１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識する工程、ここで上記対のフェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）半径（Ｒ_０）は２０〜５５Åである；
（ｂ）試験化合物の非存在下及び存在下、上記ＦＲＥＴシグナルを測定する工程；
（ｃ）上記試験化合物の存在下又は非存在下でのＦＲＥＴシグナルの変化と、上記ダイマーの公知の調節化合物の存在下又は非存在下で測定されたものとを比較することにより、上記試験化合物を調節化合物として選択する工程
を含む。

【0055】

この特定の実施態様では、ＦＲＥＴシグナルが、（ｂ）工程において、励起してから５０μ秒の遅延時間、及び４５０μ秒の積分時間で測定されるのか有利である。

【0056】

ダイマーの公知のモジュレータの性質や、試験化合物の存在下又は非存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルの変化と上記公知の調節化合物の存在下又は非存在下で観察されたものとの比較に応じて、試験化合物の性質が決定される。

【0057】

例えば、ダイマーの公知のモジュレータがアゴニストである場合、試験化合物の存在下とその非存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルの変化量が、公知のアゴニスト化合物の存在下で観察されたものと同じ方向であるならば、試験化合物は活性化化合物であると推測され、上記ＦＲＥＴシグナルの変化量が、上記公知のアゴニスト化合物の存在下とその非存在下で観察されたものと反対方向であるならば、不活性化化合物であると推測される。

【0058】

同様に、ダイマーのモジュレータがそのダイマーの公知のアンタゴニストである場合、試験化合物の存在下とその非存在下で測定されたＦＲＥＴシグナルの変化量が、上記公知のアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で観察されたものと反対方向であるならば、試験化合物は活性化化合物であると推測され、上記ＦＲＥＴシグナルの変化量が、上記公知のアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で観察されたものと同じ方向であるならば、活性化化合物であると推測される。

【0059】

実用的には、試験化合物の用量反応曲線は、公知のアゴニスト又はアンタゴニスト化合物を使用して得られたものと比較することができる。

【0060】

なお、所定量の参照アゴニスト化合物の存在下、試験化合物を使用して又は使用しないでＦＲＥＴシグナルを測定できる場合もある。これは特に、ポジティブ又はネガティブアロステリックモジュレータ又はアンタゴニストを得ようとする場合である。もちろん、アゴニスト化合物又は部分的アゴニスト化合物を得ようとする場合には必要ない。

【0061】

代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）のダイマーを使用し、励起してから５０μ秒の遅延時間、及び４５０μ秒の積分時間で上記シグナルを測定する、本発明の方法の特定の実施態様において、本発明者らは以下を見いだした。

【0062】

・検討するＧｌｕＲダイマーのアゴニストである化合物を測定媒体に添加すると、その化合物の非存在下で観察されるものと比較して放射されるＦＲＥＴシグナルが減少する。部分的アゴニストである場合、すなわち、その作用が「天然」アゴニストほど大きくない場合には、この減少は強度の低下によるものである。

【0063】

・検討するＧｌｕＲダイマーのアンタゴニストである化合物を測定媒体に添加すると、その化合物の非存在下で観察されるものと比較して放射されるＦＲＥＴシグナルが増加する。この作用は、構成的活性型ダイマー又はアゴニスト化合物により活性化されたダイマーにおいて観察できる。

【0064】

・ポジティブアロステリック作用を有するモジュレータを測定媒体に添加すると、そのモジュレータの非存在下で観察されるものと比較して放射されるＦＲＥＴシグナルが減少する。この作用は、測定媒体中にアゴニスト、例えば検討する受容体の天然アゴニストなどが存在する場合にのみ観察できる。

【0065】

・ネガティブアロステリック作用を有するモジュレータを測定媒体に添加すると、そのモジュレータの非存在下で観察されるものと比較して放射されるＦＲＥＴシグナルが増加する。この作用は、測定媒体中にアゴニスト、例えば検討する受容体の天然アゴニストなどが存在する場合にのみ観察できる。

【0066】

反対に、上記シグナルをさらに遅れて、例えば励起してから５００μ秒などの遅延時間、及び５００μ秒の積分時間で測定する場合、本発明者らは、ｍＧｌｕＲダイマーのアゴニストである化合物を測定媒体に添加した後に測定されるシグナルが、その化合物の非存在下で測定されるものよりも大きくなることを見いだした。

【0067】

本発明の方法により、トランス調節作用を有する化合物、すなわち、ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーに結合しないが、それ自体が対象のダイマーと相互作用する別の膜受容体には結合する化合物を明らかにすることもできることに言及しておくことは重要である。例えば、ｍＧｌｕＲ２受容体は５ＨＴ２Ａセロトニン受容体により調節可能であるが（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｅｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４５２，Ｍａｒｃｈ ２００８ ９３−９９）、本発明の方法により、このようなｍＧｌｕＲ２ダイマーの調節を明らかにすることができる。

【0068】

従って、本発明の方法により、検討するダイマーには結合しないが、上記受容体を調節（活性化又は阻害）する役割を果たす別の膜タンパク質には結合する化合物を明らかにすることができる。よって、上記受容体を間接的に活性化又は不活性化する作用を有する化合物を明らかにすることができる。

【0069】

ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーを含む細胞膜
本発明の方法は、ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーを含む細胞膜を含む測定媒体中で行われる。従って、測定媒体は、ＦＲＥＴパートナー化合物の添加時に、付着した状態若しくは懸濁した状態の無傷生細胞を含んでいるか、又は、細胞溶解や分画遠心分離などにより得た、懸濁した状態の細胞膜の調製物を含んでいる。膜懸濁物の調製法は当業者に公知である。本発明の方法は無傷生細胞について行うのが好ましい。

【0070】

ＶＦＴドメインを含む膜貫通タンパク質のダイマーは、細胞の細胞膜で自然発現させるか、又は、分子生物学的方法により、細胞に安定的若しくは一時的に導入された発現ベクターを介して発現させる。細胞中で異種ＤＮＡを安定的若しくは一時的に生成させるための試薬は市販されており、ＶＦＴドメインを含む膜貫通タンパク質をコードするＤＮＡ配列、特に上述のクラスＣのＧＰＣＲをコードするものは、Ｇｅｎｂａｎｋなどのデータベースで入手できる。上記の通り、ダイマーが細胞で安定的に発現する場合、考えられる細胞毒性作用を回避するために、どのようなＧタンパク質とも結合しないＧＰＣＲ変異体を用いるのが望ましい。

【0071】

ＦＲＥＴパートナー対
本発明の必須の特徴の１つは、検討するダイマーの構成タンパク質のそれぞれを１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識することである。

【0072】

本発明の方法の好ましい一実施態様では、上記ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）半径（Ｒ_０）は２０〜５５Åである。有利な別の実施態様では、上記半径は５５Åよりも大きい。

【0073】

当業者であれば、市販のＦＲＥＴパートナー化合物の中から、フェルスター半径が上記範囲に含まれるものを選択することができる。実際、フェルスターの理論には特定のＦＲＥＴパートナー対のＲ_０値の求め方が説明されている。

【0074】

この理論によれば、ＦＲＥＴは、エネルギードナーとエネルギーアクセプターの間の双極子−双極子相互作用により生じる非放射性エネルギーの移動と定義される。この物理現象には上記分子間のエネルギー互換性が必要である。これは、ドナーの発光スペクトルが、少なくとも部分的にアクセプターの吸収スペクトルと重なっていなければならないことを意味する。このスペクトルの重なりは、重なり積分Ｊ（λ）で規定される。

【0075】

【数1】

式中、ｆ_Ｄは、ドナーにより所定波長で放射される蛍光の強度であり、ε_Ａはアクセプターのモル吸光係数である。従って、係数Ｊは、１対の蛍光団が同じ波長でエネルギーを放射及び吸収する容量を反映する。フェルスターの理論によれば、ＦＲＥＴは、以下の式に示されるように、ドナーとアクセプターという２つの分子を隔てる距離に依存するプロセスである。

【0076】

【数2】

式中、Ｒは２つの分子を隔てる有効距離であり、Ｒ_０はフェルスター半径である。Ｒ_０は、エネルギー移動の効率が５０％であるドナー／アクセプター距離に相当する。この距離の計算の数学的表現は以下である。

【0077】

【数3】

式中、Ｊは重なり積分であり、ｎは媒体の屈折率（ｎ^−４は通常１／３〜１／５）であり、Ｑ_Ｄはアクセプターの非存在下でのドナーの量子収率であり、κ^２は、ドナー及びアクセプターの双極子の相対配向に依存する配向因子である。κ^２値が理論的には０〜４だとしても、Ｒ_０を決定するのに通常使用される値は２／３である。実際、ドナー及びアクセプターの自由度が空間でランダムに配向するのに十分な場合、κ^２は２／３であると考えられる。生体分子に付着する蛍光団は回転の自由度がある程度あるため、これら蛍光団において上記条件は通常満たされる。

【0078】

ユーロピウム ピリジン−ビス−ビピリジン−クリプテート及びｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売される蛍光団）対のＲ_０の計算例はＭａｕｒｅｌらにより詳述されている（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８、添付図及び本文）。この例では、Ｒ_０は６５．５Åである。多くのエネルギードナー又はアクセプター化合物が開示されており、市販されている。

【0079】

蛍光化合物は以下の群から選択できる：アロフィコシアニン、特に商品名ＸＬ６６５で知られているもの；発光性有機分子、例えば、ローダミン、シアニン、スクアライン、クマリン、プロフラビン、アクリジン、フルオレセイン、Ｂｏｄｉｐｙの名称で知られている蛍光団、Ａｔｔｏの名称で知られている蛍光団、Ｄｙの名称で知られている蛍光団、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒの名称で知られている化合物、ニトロベンゾオキサジアゾール、蛍光性金属錯体（希土類クリプテート、希土類キレート（特に、ユーロピウム、テルビウム、サマリウム、ジスプロシウム、又はネオジムのキレート及びクリプテート）など）；発光無機粒子（ナノ結晶（量子ドット）など）。これらの蛍光化合物は、ＦＲＥＴシステムにおいてドナー蛍光化合物としてもアクセプター蛍光化合物としても使用できる。

【0080】

蛍光タンパク質をアクセプター化合物として使用することもできる。一方、上記タンパク質は、原形質膜に向かわせられる前に上記タンパク質が発現している各種細胞区画に由来するバックグラウンドノイズを著しく増加させるため、ドナーとして使用するのは推奨されない。

【0081】

以下の蛍光タンパク質を本発明において使用できる：シアン蛍光タンパク質（ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ Ｃｙａｎ、ｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＰＨｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ｍＢａｎａｎａ）、オレンジ色・赤色蛍光タンパク質、（Ｏｒａｎｇｅ ｋｕｓｉｂａｒｉ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄｔｏｍａｔｏ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｓ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｉｍ、ＡＱ１４３）、及び近赤外領域で蛍光性を有するタンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｔｄＫａｔｕｓｈｋａ２）。

【0082】

長寿命（＞０．１ミリ秒、好ましくは０．５〜６ミリ秒）のエネルギードナー化合物、特に希土類キレート又はクリプテートは、測定媒体により放射されるバックグラウンドノイズの大部分を排除しつつ、時間分解測定、すなわちＴＲ−ＦＲＥＴシグナルを測定できるため有利である。この理由から、上記化合物は本発明の方法を行うのに通常好ましい。特に、ユーロピウムキレート若しくはクリプテート、又はテルビウムキレート若しくはクリプテートは、ＦＲＥＴ対のエネルギードナーメンバーとして特に好適である。

【0083】

ジスプロシウム（Ｄｙ３＋）、サマリウム（Ｓｍ３＋）、ネオジム（Ｎｄ３＋）、イッテルビウム（Ｙｂ３＋）、又はエルビウム（Ｅｒ３＋）の錯体は、本発明の目的に好適な希土類錯体であり、ユーロピウム（Ｅｕ３＋）錯体及びテルビウム（Ｔｂ３＋）錯体は特に好ましい。

【0084】

非常に多くの希土類錯体が開示されており、現在、幾つかのものが特にＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、及びＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社により商業的に開発されている。

【0085】

本発明の目的に好適な希土類キレート又はクリプテートの例として以下のものが挙げられる。

【0086】

・１以上のピリジン単位を含む希土類クリプテート。そのような希土類クリプテートは、例えば、欧州特許第０１８０４９２号明細書、欧州特許第０３２１３５３号明細書、欧州特許第０６０１１１３号明細書、及び国際公開第０１／９６８７７号などに開示されている。テルビウム（Ｔｂ３＋）クリプテート及びユーロピウム（Ｅｕ３＋）クリプテートは本発明の目的に特に好適である。希土類クリプテートはＣｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売されている。以下の式を有するユーロピウムクリプテート（反応基（この場合はＮＨＳ基など）を介して標識対象の化合物に結合できる）も挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0087】

【化1】

【0088】

【化2】

【0089】

Ｐｙ−ＢｉＰｙ−ｔｅｔｒａａｃｉｄ−Ｅｕユーロピウムクリプテートは、生物学的媒体中で蛍光消光耐性があることから、本発明の実施に特に好適である。

【0090】

・特に、米国特許第４７６１４８１号明細書、米国特許第５０３２６７７号明細書、米国特許第５０５５５７８号明細書、米国特許第５１０６９５７号明細書、米国特許第５１１６９８９号明細書、米国特許第４７６１４８１号明細書、米国特許第４８０１７２２号明細書、米国特許第４７９４１９１号明細書、米国特許第４６３７９８８号明細書、米国特許第４６７０５７２号明細書、米国特許第４８３７１６９号明細書、及び米国特許第４８５９７７７号明細書に開示されている希土類キレート。欧州特許第０４０３５９３号明細書、米国特許第５３２４８２５号明細書、米国特許第５２０２４２３号明細書、及び米国特許第５３１６９０９号明細書には、ターピリジンなどの九座（ｎｏｎａｄｅｎｔａｔｅ）リガンドで構成されるキレートが開示されている。これらの希土類キレートはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社から販売されている。

【0091】

・Ｐｏｏｌｅ Ｒ．ら（Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ，２００５，３，１０１３−１０２４“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｍｉｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ”）により開示されているものなど、芳香環を含む発色団で置換された、テトラアザシクロドデカンなどのキレート剤を構成する希土類錯体も使用できる。国際公開第２００９／１０５８０号に開示された錯体も使用できる。

【0092】

・以下の式を有するテルビウムクリプテートＴｂ（ＫＲ）（反応基（この場合はＮＨＳ基など）を介して標識対象の化合物に結合できる）：

【0093】

【化3】

【0094】

であって、その合成法が国際公開第２００８／０６３７２１号に開示されているものは、本発明の実施に最も好適なテルビウムクリプテートの一つである。

【0095】

・Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから販売されているＬｕｍｉｐｈｏｒｅ社製のテルビウムクリプテートＬｕｍｉ４−Ｔｂ。

【0096】

・以下の式を有するＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ社製の「ｑｕａｎｔｕｍ ｄｙｅ」（反応基（この場合はＮＣＳ基）を介して標識対象の化合物に結合できる）。

【0097】

【化4】

【0098】

・以下の式を有する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されているテルビウムキレートＤＴＰＡ−ｃｓ１２４ Ｔｂ（反応基Ｒを介して標識対象の化合物に結合できる）であって、その合成法が米国特許第５６２２８２１号明細書に開示されているもの。

【0099】

【化5】

【0100】

選択するドナーに応じて、上述のフェルスターの理論の原理を適用することにより、当業者であれば、本発明に従って使用されるＦＲＥＴパートナー対のフェルスター半径を決定することができる。

【0101】

下記表に、例として、フェルスター半径が２０〜５５ÅであるＦＲＥＴパートナー対を列挙するが、これに限定されるものではない。

【0102】

【表1】

【0103】

これらの対の中で、Ｔｂ（ＫＲ）／フルオレセイン対、及びＬｕｍｉ４−Ｔｂ／フルオレセイン対が好ましい。

【0104】

【表2】

【0105】

Ａｌｅｘａ化合物及びオレゴングリーン化合物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されており、Ａｔｔｏ化合物はＡｔｔｏｔｅｃ社から販売されており、Ｄｙ化合物はＤｙｏｍｉｃｓ社から販売されており、Ｃｙ化合物はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から販売されており、他の化合物は、Ｓｉｇｍａ社、Ａｌｄｒｉｃｈ社、又はＡｃｒｏｓ社などの化学試薬の多くの供給メーカーから販売されている。

【0106】

上記対の中で、Ｒ_０が２１〜４８である対が本発明の目的に好ましい。

【0107】

下記表に、例として、フェルスター半径が５５Åより大きく、そのため、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜２０００μ秒の積分時間でＦＲＥＴシグナルを読み取る必要があるＦＲＥＴパートナー対を列挙するが、これに限定されるものではない。

【0108】

【表3】

【0109】

【表4】

【0110】

Ｔｂ（ＫＲ）／Ｄｙ６４８対、Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ／Ｄｙ６４８対、Ｔｂ（ＫＲ）／Ｄｙ６４７対、及びＬｕｍｉ４−Ｔｂ／Ｄｙ６４７対が特に好ましい。

【0111】

１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーを用いた膜貫通タンパク質の標識
本発明の別の必須の特徴は、エネルギードナー又はエネルギーアクセプターによるＶＦＴドメインを含む膜貫通タンパク質の標識が、ダイマーを構成する２つのサブユニットそれぞれのＶＦＴドメインのＮ末端部で行われるということにある。

【0112】

ＶＦＴドメインタンパク質をドナー又はアクセプターにより標識するのに幾つかの方法を使用でき、特に以下の方法のいずれかを使用してもよい。

【0113】

（ａ）ＶＦＴドメインタンパク質とドナー又はアクセプターの間接的（非共有的）結合
ドナー又はアクセプターは、少なくとも１つがタンパク質性である１対の結合パートナーによりＶＦＴドメインタンパク質と結合させることができる。この手法では、ＶＦＴドメインタンパク質を、従来の分子生物学的方法によってタンパク質性の結合パートナーと融合させる（ＶＦＴドメインタンパク質をコードする核酸配列を含んでおり、タンパク質結合パートナーをコードする核酸配列と融合させた発現ベクターを構築し、その発現ベクターを細胞に導入する）。本発明において、結合パートナーは、ＶＦＴドメインタンパク質のＮ末端部、好ましくはその末端に存在する。

【0114】

ドナー又はアクセプターは、他の結合パートナー（本明細書では結合剤と称する）と共有結合しており、これがその後、細胞外媒体に添加される。結合パートナーが認識されると、ＶＦＴドメインタンパク質がドナー又はアクセプターにより間接的に標識される。

【0115】

本発明の実施に特に好適な結合パートナーとして例えば以下のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0116】

・システイン−システイン−Ｘ−Ｘ−システイン−システイン配列（配列番号１、Ｘは任意のアミノ酸）と二ヒ素化合物とからなる対。これら二ヒ素化合物は、フルオレセイン型又はローダミン型の有機分子により容易に標識できる（当該方法の詳細に関しては、Ｂ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８，２８１，２６９−２７１、及びＳ．Ａ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，６０６３−６０７６を参照）。

【0117】

・ブンガロトキシン（ＢＴＸ）により認識される、１３個のアミノ酸からなるＢＴＸ（ブンガロトキシン）ペプチドは、蛍光分子に結合させることができる（Ｃ．Ｍ．ＭｃＣａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（２００５），３８，９４５−９５２参照）。

【0118】

・ストレプトアビジン（又はアビジン）／ビオチン対：ストレプトアビジン結合配列（ＳＢＰ−Ｔａｇ）は、ドナー又はアクセプターを用いて事前に標識可能なビオチンに対する親和性が高い、３８個のアミノ酸からなる配列である（Ｃ．Ｍ．ＭｃＣａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（２００５），３８，９４５−９５２参照）。

【0119】

・特異的かつ高い親和性でトリメトプリムなどのリガンドに結合し、かつＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社の「Ｌｉｇａｎｄ ｌｉｎｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」として知られる方法によってドナー又はアクセプターがグラフト結合できる大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅＤＨＦＲ）の配列。

【0120】

・タグ／アンチタグ対は、タンパク質の標識に一般的に使用される結合パートナーである。「タグ（ｔａｇ）」という用語は、必須ではないものの通常は非常に短く（１５個未満のアミノ酸）、かつ、ＶＦＴドメインタンパク質と融合しているか、又はこのタンパク質中にもともと存在するアミノ酸配列からなる小さなタンパク質「標識」をいう。「アンチタグ（ａｎｔｉｔａｇ）」という用語は、上記「タグ」に特異的に結合する抗体をいう。これが行われる際は、「アンチタグ」抗体がドナー又はアクセプターに共有結合する。このように標識された抗体が細胞外媒体に添加されると、ＶＦＴドメインタンパク質と結合した「タグ」に結合し、「タグ／アンチタグ」相互作用より上記タンパク質はドナー又はアクセプターにより間接的に標識される。

【0121】

「タグ／アンチタグ」対として例えば以下の対が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの対のメンバーは市販されており、例えばＧＳＴ／アンチ−ＧＳＴ抗体（ＧＳＴはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ又はそのフラグメントを表す）、６ＨＩＳ／アンチ−６ＨＩＳ抗体（６ＨＩＳは６つのヒスチジンからなるペプチド）、Ｍｙｃ／アンチ−Ｍｙｃ抗体（Ｍｙｃは、ヒトＭｙｃタンパク質のアミノ酸４１０〜４１９からなるペプチド）、ＦＬＡＧ／アンチ−ＦＬＡＧ抗体（ＦＬＡＧは、８個のアミノ酸ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２）からなるペプチド）、ＨＡ／アンチ−ＨＡ抗体（ＨＡは、９個のアミノ酸ＹＰＹＤＶＰＦＹＡ（配列番号３）からなるインフルエンザヘマグルチニンエピトープ）などがある。明らかであるが、タグの正確な性質は本発明の実施に必須ではない。

【0122】

（ｂ）ＶＦＴドメインタンパク質とドナー又はアクセプターの直接的（共有的）結合
この手法では、ドナー又はアクセプターは、共有結合によりＶＦＴドメインタンパク質と結合する。幾つかの方法が開示されており、これを行うのに必要な試薬は市販されている。この結合に、以下の方法のいずれかを用いることができる。

【0123】

●ＶＦＴドメインタンパク質上に存在する反応基、特に以下の基の１つと共有結合を形成する：アミノ末端基、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボン酸基、リシンのアミン基、アルギニンのグアニジン基、システインのチオール基、チロシンのフェノール基、トリプトファンのインドール環、メチオニンのチオエーテル基、及びヒスチジンのイミダゾール基。

【0124】

これらのＶＦＴドメインタンパク質に存在する基は、ドナー又はアクセプターが担持する反応基と共有結合を形成できる。好適な反応基は当業者に公知である。例えば、マレイミド基の官能基を有するドナー又はアクセプターは、タンパク質のシステインが担持するチオール基と共有結合可能である。同様に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを担持するドナー／アクセプターは、ＶＦＴドメインタンパク質のアミンとの共有結合が可能である。

【0125】

●自殺酵素の使用
自殺酵素は、基質と迅速に共有結合できるようにする特定の変異により酵素活性が変化したタンパク質である。上記酵素は、各々が１つの蛍光分子としか結合できず、基質の結合により酵素活性がブロックされるため、自殺酵素と呼ばれている。結果的に、この酵素は、１つのタンパク質に１つの蛍光分子の割合で対象のタンパク質を特異的に標識するのに選択される道具となる。例えば以下の酵素が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0126】

・Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）変異体。ＮＥＢ社から販売されているＳｎａｐ−ｔａｇ（Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０，３１３−３１７ Ａｐｒｉｌ ２００３）酵素、及びＣｌｉｐ−ｔａｇ（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｅｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，１２８−１３６，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８）酵素は、ヒトＡＧＴの変異体であり、基質はそれぞれ、Ｏ６−ベンジルグアニン（以下ＢＧと略す）、及びＯ２−ベンジルシトシン（以下ＢＣと略す）である。Ｎ−ＡＧＴ酵素（Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｄｅｓｉｇｎ＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．７，ｐｐ ３０９−３１６，２００６）は、上記酵素の別の変異体であり、そのＯ６−ベンジルグアニンとの反応性はＳｎａｐ−ｔａｇ酵素よりも高い。Ｏ６−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ変異体が自殺酵素として好ましい。

【0127】

・自殺型の酵素反応（国際公開第０４／０７２２３２号（Ａ２）参照）も起こす、デハロゲナーゼの変異体（Ｐｒｏｍｅｇａから販売されているＨａｌｏＴａｇ酵素など）。この変異体の基質の幾つかは、クロロアルカンファミリーの化合物であり、特に、−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_６−Ｃｌモチーフを含むクロロアルカンである。この場合、ドナー／アクセプターはこの種のモチーフと結合する。

【0128】

・ホスホパンテテイントランスフェラーゼの存在下、補酵素Ａの４’−ホスホパンテテイン残基がＡＣＰのセリン上に転移するＡＣＰタンパク質（アシルキャリアタンパク質）（Ｎ．Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ １２６（２００４）ｐ ８８９６−８８９７）。この手法を用いて、ドナー又はアクセプターによりＶＦＴドメインタンパク質を標識する場合、ホスホパンテテイントランスフェラーゼを反応媒体に添加する必要がある。ＮＥＢ社は、タンパク質標識用にＡＣＰフラグメントを商品名「ＡＣＰ−Ｔａｇ」として販売している。

【0129】

上記手法では、従来の分子生物学的方法によって、自殺酵素をＶＦＴドメインタンパク質とそのＮ末端部で融合させ（自殺酵素をコードする核酸配列とＶＦＴドメインタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを作製し、そのベクターを細胞に導入する）、ドナー／アクセプターと共有結合した酵素基質を細胞外媒体に導入する。酵素反応の結果、標識された基質と酵素が共有結合することで、ドナー又はアクセプターによりＶＦＴドメインタンパク質が標識される。

【0130】

自殺酵素の使用は、本発明の実施において特に好ましい。この場合、ＶＦＴドメインを含む膜タンパク質が、ＶＦＴドメインタンパク質を含み、かつ、Ｎ末端に、基質と共有結合可能な自殺酵素又は自殺酵素フラグメントを含む融合タンパク質の形態で発現する。その後、ＦＲＥＴパートナー対のメンバーであって、上記自殺酵素の基質と共有結合した化合物の１つを測定媒体に添加することにより、ＶＦＴドメインタンパク質を標識することができる。

【0131】

さらにより好ましい一実施態様では、ダイマーを構成するサブユニットはそれぞれ、自殺酵素との融合タンパク質の形態で発現する。この場合、各サブユニットに使用される自殺酵素は異なっていても、同一であってもよい。

【0132】

Ｍａｕｒｅｌらは、自殺酵素（Ｓｎａｐ−ｔａｇ）をＶＦＴドメインタンパク質（ＧＡＢＡ Ｂ１、ＧＡＢＡ Ｂ２、ｍＧｌｕ１）のＮ末端部に含む融合タンパク質をコードするプラスミドの作製法、及び上記プラスミドの細胞へのトランスフェクト法を説明している（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ）。使用された方法は一般的な分子生物学的方法である。

【0133】

ＦＲＥＴシグナルの測定
エネルギードナーの吸収波長で測定媒体を励起することができ、かつドナー化合物及び／又はアクセプター化合物（蛍光性を有する場合）の発光波長での測定媒体からの発光を測定することができる蛍光計を使用して従来法によりＦＲＥＴシグナルを測定する。

【0134】

上記媒体からの発光は、励起してからある遅延時間が経過した後、積分時間と呼ばれる期間で検出する。これら２つのパラメータは市販の蛍光計で調整可能である。

【0135】

好ましい一実施形態では、特に、ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター半径（Ｒ_０）が２０〜５５Åの範囲内に含まれる場合、シグナルは、励起してから２０〜１００μ秒の遅延時間、及び１００〜５００μ秒の積分時間で測定する。時間窓として以下の時間窓がそれぞれ好ましい：５０〜３００μ秒、５０〜４００μ秒、５０〜４５０μ秒、４０〜２５０μ秒、１００〜３００μ秒。

【0136】

好ましい別の実施形態では、ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター半径（Ｒ_０）に関わらず、シグナルは、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜２０００μ秒の積分時間で測定する。時間窓として以下の時間窓がそれぞれ好ましい：３００〜６５０μ秒、５００〜１０００μ秒、５００〜１５００μ秒、８００〜１８００μ秒。上述の通り、後者の実施形態は、ＦＲＥＴパートナー対のフェルスター半径（Ｒ_０）が５５Åよりも大きい場合には必須である。

【0137】

エネルギードナー化合物とアクセプター化合物が互いに接近することで、エネルギー移動量が増加（ＦＲＥＴが増加）し、結果として、
・アクセプター（蛍光性を有する場合）の発光波長の発光量が増加し、
・ドナーの発光波長の発光量が減少、すなわち、ドナー化合物の蛍光の寿命が減少する。

【0138】

従って、ＦＲＥＴシグナルの変化は、ドナーによる発光又はアクセプターによる発光を検出することにより測定できる。アクセプター化合物による発光を検出することによりＦＲＥＴシグナルを測定するのが好ましい。

【0139】

ドナー化合物によるその発光波長の発光、及びアクセプター化合物によるその発光波長の発光の両方（同時である必要はない）を検出してから、２つの値の比の計算などによりアクセプターで得たシグナルをドナーで得たシグナルで補正することによってＦＲＥＴの変化を測定するのがさらにより好ましい。この場合、「ＦＲＥＴの増加」はアクセプター／ドナー比の上昇に相当する。蛍光計は、通常、この種の読み取りが可能なモードを含むものである。また、ドナー化合物及びアクセプター化合物の発光は同じ時間窓で測定する必要はない。

【0140】

長寿命のエネルギードナー化合物を使用した場合に可能となる時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）によりＦＲＥＴ測定を行うのが特に有利であるが、これはこの種の測定では多くの干渉をなくすことができるためである。本発明の方法をＦＲＥＴモードで行うことができるとしても、ＴＲ−ＦＲＥＴモードが非常に好ましい。

【0141】

試薬キット
本発明は、本発明の方法を行うための構成要素のキット、すなわち、上述の試薬を、場合によっては本発明におけるその使用上の指示を伴って、含むキットにも関する。特に、上記キットは、
・同一か又は異なる第一タンパク質及び第二タンパク質で構成される、ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーを含む細胞膜、
・１対のＦＲＥＴパートナー、
・上記第一タンパク質のＶＦＴドメインのＮ末端部を上記ＦＲＥＴパートナー対の一方のメンバーにより標識する手段、及び、上記第二タンパク質のＶＦＴドメインのＮ末端部を上記ＦＲＥＴパートナー対のもう一方のメンバーにより標識する手段、
・上記ＦＲＥＴシグナルは、参照アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されたシグナルが異なるものとなる時間窓内で測定されなければならないという指示
を含む。

【0142】

後者の指示は、本発明の方法において上述したような適切な時間窓に言及するものであってもよい。

【0143】

特定の一実施形態では、上記キットは、
（ｉ）フェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）半径（Ｒ_０）が２０〜５５Åである１対のＦＲＥＴパートナーと、ＦＲＥＴシグナルが、励起してから２０〜１００μ秒の遅延時間、及び１００〜５００μ秒の積分時間で測定されなければならないという指示とを含むか；又は、
（ｉｉ）フェルスター半径（Ｒ_０）が５５Åよりも大きい１対のＦＲＥＴパートナーと、ＦＲＥＴシグナルが、励起してから１８０〜８００μ秒の遅延時間、及び２００〜２０００μ秒の積分時間で測定されなければならないという指示とを含む。

【0144】

特に好ましい一実施形態では、標識手段は、ダイマーの構成タンパク質を共有結合により標識するために自殺酵素を使用することによる。この実施形態では、上記第一タンパク質及び第二タンパク質はそれぞれ自殺酵素との融合タンパク質の形態で発現し、上記ＦＲＥＴパートナー対の各メンバーはそれぞれ上記自殺酵素の基質に共有結合している。

【0145】

例えば、検討するダイマーを構成する上記第一タンパク質及び第二タンパク質がそれぞれ上記ＦＲＥＴパートナー対のメンバーで標識されている場合などには、本発明のキットの構成要素がちょうど１つの製品を成すことも可能である。このように、本発明は、それぞれＶＦＴドメインのＮ末端部で１対のＦＲＥＴパートナーのメンバーにより標識されている同一か又は異なる第一タンパク質及び第二タンパク質で構成される、ＶＦＴドメインタンパク質のダイマーを含む細胞膜を含み、さらに、上記ＦＲＥＴシグナルは、参照アゴニスト又はアンタゴニスト化合物の存在下とその非存在下で測定されたシグナルが異なるものとなる時間窓内で測定されなければならないという指示も含むキットにも関する。

【実施例】

【0146】

以下の物質を実施例１〜１２で使用した。

【0147】

試薬
モジュレータ（アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレータ）：
ＤＣＧ ＩＶ、Ｌ−グルタミン酸、及びＬＹ３４１４９５は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログにおいて入手可能である。４−ＭＰＰＴＳ（ｍＧｌｕＲ２受容体のポジティブアロステリックモジュレータ、ＬＹ４８７３７９ともいう）はＡｄｄｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓより提供されたものであり、その合成法は米国特許第６８００６５１号明細書に記載されている。

【0148】

培地：
ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ、ＭＥＭ−ペニシリン／ストレプトマイシン、トリプシン／ＥＤＴＡはＧｉｂｃｏカタログで入手可能である。使用したウシ胎仔血清はＬｏｎｚａブランド（南アメリカ型（バッチ：７ＳＢ００１７））である。

【0149】

蛍光結合体：
ＢＧ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ：ベンジルグアニン−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ結合体（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから販売、Ｔａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ）。ＢＧはＳｎａｐ−ｔａｇ酵素の基質である。
ＢＣ−フルオレセイン：ベンジルシトシン−フルオレセイン結合体（ＮＥＢ社から商品名ＣＬＩＰ−Ｖｉｓｔａ Ｇｒｅｅｎで販売）。ＢＣはＣｌｉｐ−ｔａｇ酵素の基質である。
ＢＧ−フルオレセイン：ベンジルグアニン−フルオレセイン結合体（ＮＥＢ社から商品名ＳＮＡＰ−Ｖｉｓｔａ Ｇｒｅｅｎ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で販売）。
Ｔａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−Ｇｒｅｅｎ：ベンジルグアニン−フルオレセイン結合体（Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社から販売）。
Ｔａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−ｒｅｄ：ベンジルグアニン−シアニン誘導体結合体（発光ピーク：６７０ｎｍ、Ｃｉｓｂｉｏ Ｂｉｏａｓｓａｙｓから販売）。

【0150】

他の試薬：
ＤＭＳＯ、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ）、ＮａＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４、ＫＣｌ、及びＣａＣｌ_２はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログで入手可能である。

【0151】

ＧＰＣＲ１−ＧＰＣＲ２ダイマーの発現に使用するプラスミド
ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−［ＧＰＣＲ１］融合タンパク質、及びＦｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−［ＧＰＣＲ２］融合タンパク質（ＧＰＣＲ１及びＧＰＣＲ２は、細胞により発現させることを意図したＧＰＣＲを表す）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、従来の分子生物学的方法によりｐｒＫ５ベクターから作製し、その配列はシークエンシングにより確認した。４６６１塩基対を含む上記配列は配列番号４の配列である。このプラスミドの特徴的な制限部位の位置を以下に示す。

【0152】

【表5】

【0153】

上記ベクター（以下、ｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−［ＧＰＣＲ１］、又はｐｒＫ５−Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−［ＧＰＣＲ２］という）は、ＣＭＶプロモータ、ＡＴＧ開始コドン、ｍＧｌｕＲ５のシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、インフルエンザヘマグルチニンエピトープ（ＨＡ）又はＦＬＡＧエピトープ、Ｓｎａｐ−ｔａｇ酵素又はＣｌｉｐ−ｔａｇ酵素をコードするＤＮＡ配列、［ＧＰＣＲ１］又は［ＧＰＣＲ２］受容体をコードするＤＮＡ配列（その開始コドン、及びシグナルペプチドをコードする配列が存在する場合は、それらを除く）、最後に終止コドンを含む。

【0154】

実施例１で使用するＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ_２融合タンパク質及びＦｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ_２融合タンパク質をコードするプラスミドの配列は、配列番号５及び配列番号６の配列である。

【0155】

配列番号５の配列では、コード領域の位置はそれぞれ以下である。
・ｍＧｌｕＲ_５のシグナルペプチド ：９３７−１００２；
・ＨＡエピトープ ：１００９−１０３５；
・Ｓｎａｐ−ｔａｇ ：１０４２−１５９０；
・ｍＧｌｕＲ_２ ：１５９７−４１４９

【0156】

配列番号６の配列では、コード領域の位置はそれぞれ以下である。
・ｍＧｌｕＲ_５のシグナルペプチド ：９３７−１００２；
・ＦＬＡＧ ：１０１５−１０３８；
・Ｃｌｉｐ−ｔａｇ ：１０４５−１５９３；
・ｍＧｌｕＲ_２ ：１６００−４１５２

【0157】

他の受容体の配列を含むプラスミドは、対象の受容体をコードする領域を除けば同一なものである。使用した各種受容体の配列はＧｅｎｂａｎｋデータバンクで入手できる。

【0158】

当業者であれば、既に文献（Ｍａｕｒｅｌら、上記）に記載されているプラスミドからのサブクローニングか、又は直接、遺伝子合成により上記プラスミドを容易に構築できるであろう。

【0159】

細胞：Ｃｏｓ−７細胞系（市販品）を使用した。

【0160】

完全培地：ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清＋ＭＥＭ−ＮＥＡＡ＋ＭＥＭ−ペニシリン／ストレプトマイシン

【0161】

エレクトロポレーションバッファ：５０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＫ、２０ｍＭ ＫＯＨ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ_４

【0162】

標識バッファ：ＤＭＥＭ＋ｇｌｕｔａｍａｘ

【0163】

洗浄及び読み取りバッファ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１１８ｍＭ ＮａＣｌ、１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、４．７ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ_２；ｐＨは７．４に調整

【0164】

実施例１：ｍＧｌｕＲ_２−ｍＧｌｕＲ_２ダイマーにアゴニスト作用を示す活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0165】

プロトコル：
エレクトロポレーションによるトランスフェクト
Ｃｏｓ−７細胞を完全培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。コンフルエンス状態で、細胞をＰＢＳで一度洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液により１０分間３７℃で分離した。１０００万細胞の懸濁液を５μｇの全ＤＮＡ（ｐｒＫ５プラスミド（３．５μｇ）、ｐｒＫ５ Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２プラスミド（１．２μｇ）、及びｐｒＫ５ ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２プラスミド（０．３μｇ））と混合して最終体積３００μＬのエレクトロポレーションバッファとした後、４ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）中、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩエレクトロポレータ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用して２８０Ｖ、９００μＦの電気ショックを与えた。その後、細胞を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣｅｌｌＳｔａｒ ９６ウェルプレート）に１５０，０００細胞／ウェルで播種し、完全培地の最終体積を１００μＬ／ウェルとしてから、２４時間インキュベートした。

【0166】

標識
トランスフェクトしてから２４時間後、標識バッファ（５０μＬ）＋ＢＧ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（０．３μＭ）、及びＢＣ−フルオレセイン（１μＭ）の存在下、細胞を２時間、３７℃でインキュベートした。

【0167】

その後、細胞を洗浄バッファ（１００μＬ）を用いて４回洗浄し、洗浄バッファ（１００μＬ）中で読み取りを行った。

【0168】

読み取り
フルオレセイン（アクセプター）の波長で放射された蛍光をＡｎａｌｙｓｔ ＡＤマイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、ＴＲＦモード、遅延時間５０μ秒、積分時間４５０μ秒、励起フィルタ３２０ｎｍ帯域幅（ＢＷ）２５、ＢＢ／ＵＶダイクロイックミラー、蛍光フィルタ５２０ｎｍＢＷ１０で読み取った。以下、このＦＲＥＴシグナルをＴＲＦ５２０と称す。一回目は、プレートをグルタミン酸塩の非存在下で読み取った。

【0169】

次に、グルタミン酸塩溶液（２０μＬ）を読み取りバッファ（１００μＬ）に添加し、ウェル（全容積：１２０μＬ）中の最終濃度を３１６μＭ、１００μＭ、３１．６μＭ、１０μＭ、３．１６μＭ、１μＭ、又は０．３１６μＭとした。

【0170】

２回目は、グルタミン酸塩の添加後、プレートを読み取った。

【0171】

結果
図１は、グルタミン酸塩濃度に対するＴＲＦ５２０のシグナルを示す。このシグナルは、１回目の読み取り時、すなわちグルタミン酸塩の添加前に読み取られたＴＲＦ５２０の百分率として示されている。すなわち以下の式により算出されるものである。

【0172】

【数4】

【0173】

アゴニスト（グルタミン酸塩）の存在下では、ＴＲＦ５２０の減少がみられるが、クリプテートの蛍光の減少もアクセプターの蛍光の減少もその原因とはなり得ない。これは、ドナー化合物からアクセプター化合物へのエネルギー移動（ＦＲＥＴ）の効率が変化したことを示しており、特に蛍光団間の距離が変化したことによるものであると考えられる。

【0174】

この変化は用量依存的である、すなわち、グルタミン酸塩アゴニストの濃度に依存する。曲線はＳ字形曲線の形状である。ここで、ＴＲＦ５２０を最大変化量の半分まで変化させるのに必要な濃度は、ＧｌｕＲ２受容体に対するグルタミン酸塩の薬理学的ＥＣ_５０に非常に近い。これにより、ＴＲＦ５２０が変化する際に観察される現象が受容体の活性化であることが強く示唆される。

【0175】

この実施例から、本発明の方法によりダイマー活性化化合物、特にアゴニスト化合物を明らかにできることが示される。ｍＧｌｕＲ_２ホモダイマーの場合、活性化化合物はＴＲＦ５２０シグナルを減少させる。

【0176】

実施例２：ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーに競合的アンタゴニスト作用を示す不活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0177】

試薬及びプラスミド
実施例１の記載と同じ試薬及びプラスミドを使用した。公知のアンタゴニスト化合物ＬＹ３４１４９５（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。

【0178】

プロトコル
実施例１の記載と同じプロトコルを使用した。最終濃度は、［グルタミン酸塩］＝１００μＭ（全てのウェル）、［ＬＹ３４１４９５］＝１０００ｎＭ、３１６μＭ、１００ｎＭ、３１．６ｎＭ、１０ｎＭ、３．１６ｎＭ、又は１ｎＭ。

【0179】

結果
図２は、一定濃度のグルタミン酸塩の存在下での、ＬＹ３４１４９５アンタゴニスト濃度に対するＴＲＦ５２０のシグナルを示す（対照曲線：グルタミン酸塩の非存在下）。

【0180】

グルタミン酸塩の存在下、かつ競合的アンタゴニストＬＹ３４１４９５の非存在下では、受容体は活性化され、ＴＲＦ５２０は５０％まで変化する。アンタゴニストが存在すると、このグルタミン酸塩のＴＲＦ５２０に対する作用は妨げられ、アンタゴニスト濃度が上昇するにつれ測定されるシグナルは増大するが、これは、アゴニスト濃度が上昇する際にみられるものとは対照的である（実施例１）。アンタゴニスト濃度が最大（１μＭ）である場合、アゴニストによるＦＲＥＴの変化は完全に阻害される（１００％）。グルタミン酸塩によるＦＲＥＴの変化を５０％阻害するのに必要な濃度（この場合１５０ｎＭ）は、グルタミン酸塩の薬理学的作用を５０％阻害するのに必要な濃度（ＩＣ_５０）とあまり変わらない。

【0181】

この実施例から、本発明の方法が、公知のアンタゴニスト化合物の不活性化作用を明らかにするのに有効であることが示される。試験化合物を用いて同様に行うことで、当該化合物がアンタゴニスト作用を示すかどうかを決定できる。

【0182】

実施例３：ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーに部分的アゴニスト作用を示す活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0183】

試薬及びプラスミド
実施例１の記載と同じ試薬及びプラスミドを使用した。使用した公知の部分的アゴニスト化合物はＤＣＧ−ＩＶ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であり、参照完全アゴニストであるグルタミン酸塩と比較した。

【0184】

プロトコル
実施例１のプロトコルを使用した。［ＤＣＧ−ＩＶ］の最終濃度は以下である：１００μＭ、３１．６μＭ、１０μＭ、３．１６μＭ、１μＭ、０．３１６μＭ、又は０．１μＭ。

【0185】

結果
図３は、グルタミン酸塩（完全アゴニスト）又はＤＣＧ−ＩＶ（部分的アゴニスト）の濃度に対するＴＲＦ５２０のシグナルを示す。

【0186】

グルタミン酸塩と同様に、ＤＣＧ−ＩＶはＴＲＦ５２０シグナルを用量依存的に阻害することができる。最大変化量の半分まで変化させるのに必要な濃度は、ＤＣＧ−ＩＶの薬理学的ＥＣ_５０（０．４μＭ）に近い。しかしながら、ＤＣＧ−ＩＶで得た最大変化量は３０％であるのに対し、グルタミン酸塩では５０％である。この結果から、ＤＣＧ−ＩＶが部分的なアゴニスト性を示し、従ってＦＲＥＴの最大変化量が参照アゴニストで得たものより小さくなることが確認される。

【0187】

この実施例から、本発明の方法を用いて、ｍＧｌｕＲ_２ダイマーに対して部分的アゴニスト型活性化作用を示す化合物を選択できることが示される。

【0188】

実施例４：ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーにポジティブアロステリックモジュレータ（ＰＡＭ）作用を示す活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0189】

試薬及びプラスミド
実施例１の試薬及びプラスミドを使用した。公知のポジティブアロステリックモジュレータ化合物である４−ＭＰＰＴＳ（＝ｍＧｌｕＲ２ ＰＡＭ、ＬＹ４８７３７９ともいう）を使用した。

【0190】

プロトコル
実施例１に記載のプロトコルを使用した。

【0191】

最終濃度は、［４−ＭＰＰＴＳ］＝１０μＭ、［グルタミン酸塩］＝１０００μＭ、３１６μＭ、１００μＭ、３１．６μＭ、１０μＭ、３．１６μＭ、又は１μＭ。

【0192】

結果
図４は、４−ＭＰＰＴＳの存在下又は非存在下（対照）での、グルタミン酸塩濃度に対するＴＲＦ５２０のシグナルの変化を示す。

【0193】

所定のグルタミン酸塩濃度では、４−ＭＰＰＴＳの非存在下よりもその存在下でシグナルが大幅に減少する。

【0194】

この実施例から、本発明の方法を用いて、ポジティブアロステリック調節作用を示す化合物を明らかにできることが示される。

【0195】

実施例５：２つの異なる自殺酵素で標識する必要はない（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0196】

この実施例では、シグナルプラスミドであるｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２を使用してｍＧｌｕＲ２ホモダイマーを発現させた。プロトコルは、トランスフェクトしたＤＮＡ量が４μｇ（ｐｒＫ５）＋１μｇ（ｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ２）である点が異なるだけで、あとは実施例３で使用したものと同じである。

【0197】

以下の蛍光結合体を使用した：標識媒体中、０．１μＭの濃度のＢＧ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ、及び０．０２μＭのＢＧ−フルオレセイン。

【0198】

図５は、グルタミン酸塩及びＤＣＧ−ＩＶの濃度の上昇に対するＦＲＥＴシグナルの変化を示し、ダイマーを構成する各タンパク質（この場合、ホモダイマーを構成する各ｍＧｌｕＲ２）が同じ方法（この場合、ＢＧ／Ｓｎａｐ−ｔａｇ法）で標識できることを示す。従って、２つの異なる自殺酵素の使用は必須ではない。

【0199】

実施例６：ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３、又はｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ホモダイマーにアゴニスト作用を示す活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0200】

ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３ホモダイマー、又はｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ホモダイマーのいずれかを発現可能なプラスミドを使用して実施例１を再現した。ｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕ３、ｐｒＫ５−Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕ３、ｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕ４、及びｐｒＫ５−Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕ４の各プラスミドを得る手順は、「使用するプラスミド」部に記載した。以下の点のみ異なるが、あとは実施例１に記載のプロトコルに従った：トランスフェクトしたＤＮＡ量が、
・ｍＧｌｕ２の場合、実施例１と同じ、
・ｍＧｌｕ３の場合、３．５μｇ（ｐｒＫ５プラスミド）、１．２μｇ（ｐｒＫ５ Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ３プラスミド）、及び０．３μｇ（ｐｒＫ５ ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ３プラスミド）、
・ｍＧｌｕ４の場合、３．５μｇ（ｐｒＫ５プラスミド）、１．２μｇ（ｐｒＫ５ Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ４プラスミド）、及び０．３μｇ（ｐｒＫ５ ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ４プラスミド）である点。

【0201】

得た用量反応曲線を図６に示す。ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３受容体で観察されたシグナルの変化は他の場合で測定されたもの程大きくはないものの、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ホモダイマーを使用して実施例１で得た結果は、ｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４及びｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３を使用した場合にも確認できる。

【0202】

この実施例から、各種の代謝型グルタミン酸受容体を使用して本発明の方法を行うことができることが示される。

【0203】

実施例７：ｍＧｌｕ３センサの場合：アンタゴニスト感受性であるが、アゴニスト感受性はあまり高くない（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0204】

この実施例では、以下に示したプラスミド及びそれらの量を使用して実施例１のプロトコルを用いた。
・標識されたｍＧｌｕＲ３ホモダイマーを発現させるため、３．５μｇ（ｐｒＫ５プラスミド）、１．２μｇ（ｐｒＫ５ Ｆｌａｇ−Ｃｌｉｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ３プラスミド）、及び０．３μｇ（ｐｒＫ５−ＨＡ−Ｓｎａｐｔａｇ−ｍＧｌｕＲ３プラスミド）を使用した。
・ＬＹ３４１４９５アンタゴニストの濃度を上昇させて、最終濃度：１μＭ、３２０ｎＭ、１００ｎＭ、３２ｎＭ、１０ｎＭ、３．２ｎＭ、及び１ｎＭとした。

【0205】

結果
図７は、ＬＹ３４１４９５濃度に対してＴＲＦ５２０シグナルを示す。

【0206】

アンタゴニストを添加すると、ＴＲＦ５２０シグナルが用量依存的に増大する。

【0207】

この実施例から、本発明の方法を行って、対象の受容体を不活性化する分子をスクリーニングできることが示される。

【0208】

実施例８：ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３、及びｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４の各ホモダイマー、並びにｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ３、及びｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ４の各ヘテロダイマーにアゴニスト作用を示す活性化化合物の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0209】

ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３、若しくはｍＧｌｕＲ４−ｍＧｌｕＲ４ホモダイマー、又はｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ３、若しくはｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ４ヘテロダイマーを発現可能なプラスミドを使用して実施例１を再現した。得た用量反応曲線を図８に示す。実施例１及び６で得た結果を確認できる。

【0210】

この実施例から、代謝型グルタミン酸受容体のホモダイマーを使用した場合だけでなく、そのサブタイプ間ヘテロダイマーを使用した場合にも本発明の方法を行うことができることが示される。

【0211】

実施例９：ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ１ホモダイマー、及びｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ホモダイマーに対する調節化合物の作用の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0212】

ｍＧｌｕＲ１−ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３−ｍＧｌｕＲ３、及びｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８の各ホモダイマーを発現する細胞を、実施例５の記載と同様な手法により調製し、各ｍＧｌｕＲ受容体をＳｎａｐ−ｔａｇ酵素との融合タンパク質の形態で発現させた。

【0213】

以下の蛍光結合体を使用して標識を行った：標識媒体中、０．１μＭの濃度のＢＧ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（ドナー）、及び０．１μＭのＢＧ−フルオレセイン（アクセプター）。

【0214】

フルオレセインの波長（５２０ｎｍ）で放射された蛍光と、テルビウムの波長（６２０ｎｍ）で放射された蛍光を、Ｉｎｆｉｎｉｔ５００マイクロプレートリーダにより、５０μ秒の遅延時間、及び４００μ秒の積分時間で測定した。

【0215】

標識バッファ、又はアゴニスト（１ｍＭのグルタミン酸塩）、又はアンタゴニスト（０．１ｍＭのＬＹ３４１４９５）の存在下で上記測定を行った。

【0216】

５２０ｎｍ及び６２０ｎｍで放射されたシグナルの比を算出した。以下、この比を「ＦＲＥＴ比」という。

【0217】

図９は、アゴニスト（グルタミン酸塩）若しくはアンタゴニスト（ＬＹ３４１４９５）の存在下、又はそれらの化合物の非存在下（バッファ）で観察されたＦＲＥＴ比の変化を示す。アンタゴニストの存在下で観察されたものに対して１００％値を任意に選択する。

【0218】

本結果により、上記実施例においてｍＧｌｕＲ２ホモダイマー及びｍＧｌｕＲ３ホモダイマーで得た結果を確認でき、本発明の方法により、ｍＧｌｕＲ８ホモダイマー及びｍＧｌｕＲ１ホモダイマーをアゴニスト又はアンタゴニストと接触させるとＦＲＥＴシグナルを変化させることができることが示される。

【0219】

実施例１０：ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、及びｍＧｌｕＲ８の各ホモダイマーに対する調節化合物の作用の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：４８Å）

【0220】

ｍＧｌｕＲ１、ｍＧｌｕＲ２、ｍＧｌｕＲ３、ｍＧｌｕＲ４、ｍＧｌｕＲ５、及びｍＧｌｕＲ８の各ホモダイマーを使用して実施例９を再現し、今回は、５００μ秒の遅延時間、及び１０００μ秒の積分時間で蛍光を測定した。

【0221】

図１０の結果から、上記実施例で観察された結果、すなわち、本発明の方法がほとんどのｍＧｌｕＲ受容体を調節する化合物を明らかにするのに好適であることを確認できる。

【0222】

実施例１１：ｍＧｌｕＲ８ホモダイマーに対する調節化合物の作用の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：５８Å）

【0223】

ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマーを発現する細胞を使用し、Ｒ_０＞５５Åの蛍光化合物を使用して実施例９を再現した。この場合、ＢＧ−Ｌｕｍｉ４−Ｔｂ（ドナー、０．１μＭ）、及びＴａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−ｒｅｄ（アクセプター、０．２５μＭ）を使用して標識を行った。

【0224】

Ｒｕｂｙｓｔａｒリーダにより６６５ｎｍ（アクセプター）及び６２０ｎｍ（ドナー）で以下の時間窓：５０〜４５０μ秒内、５０〜１５０μ秒内、及び５００〜１５００μ秒内、蛍光を測定した（図１１）。

【0225】

従来使用されてきた時間窓内、すなわち５０〜４５０μ秒内でシグナルが測定される場合、調節（アゴニスト又はアンタゴニスト）化合物の存在下、シグナルに著しい変化はみられない。５０〜１５０μ秒の時間窓内で蛍光が測定される場合、アゴニストの存在下、著しい変化がみられる。５００〜１５００μ秒の時間窓内で蛍光が測定される場合、アゴニスト又はアンタゴニストの存在下、非常に著しい変化がみられる。

【0226】

実施例１２：Ｒ_０＞５５Åの１対のＦＲＥＴパートナー：ＢＧ−ＴｒｉｓＢｉＰｙ−ｐｅｎｔａａｃｉｄ−Ｅｕ及びＴａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−Ｒｅｄを使用した場合のｍＧｌｕＲ８ホモダイマー及びｍＧｌｕＲ２ホモダイマーに対する調節化合物の作用の検出（使用したＦＲＥＴパートナー対のＲ_０：５８Å）

【0227】

ｍＧｌｕＲ８−ｍＧｌｕＲ８ダイマー又はｍＧｌｕＲ２−ｍＧｌｕＲ２ダイマーを発現する細胞を使用し、Ｒ_０＞５５Åの蛍光化合物を使用して実施例９を再現した。この場合、ベンジルグアニンと結合したユーロピウムクリプテート（ＢＧ−ＴｒｉｓＢｉＰｙ−ｐｅｎｔａａｃｉｄ−Ｅｕ、ドナー、０．２μＭ）、及びＴａｇ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＳＮＡＰ−ｒｅｄ（アクセプター、０．２５μＭ）を使用して標識を行った。

【0228】

Ｒｕｂｙｓｔａｒリーダにより６６５（アクセプター）及び６２０（ドナー）で以下の時間窓：５０〜４５０μ秒内、及び３００〜６５０μ秒内、蛍光を測定した（図１２）。

【0229】

従来使用されてきた時間窓内、すなわち５０〜４５０μ秒内でシグナルが測定される場合、調節（アゴニスト又はアンタゴニスト）化合物の存在下、シグナルに著しい変化はみられない。３００〜６５０μ秒の時間窓内で蛍光が測定される場合、アゴニスト又はアンタゴニストの存在下、著しい変化がみられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]