特許 5736176 細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ＲＧＤに特異的なヒト化抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5736176

(24)【登録日】2015年4月24日

(45)【発行日】2015年6月17日

(54)【発明の名称】細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ＲＧＤに特異的なヒト化抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150528BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20150528BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20150528BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20150528BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150528BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150528BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150528BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20150528BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20150528BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20150528BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K16/18

   C07K16/46

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 101

   C12P21/08

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   A61P29/00

   A61P37/00

   A61P19/00

   A61P31/04

【請求項の数】25

【全頁数】62

(21)【出願番号】特願2010-542452(P2010-542452)

(86)(22)【出願日】2009年4月24日

(65)【公表番号】特表2011-519547(P2011-519547A)

(43)【公表日】2011年7月14日

(86)【国際出願番号】JP2009058604

(87)【国際公開番号】WO2009131256

(87)【国際公開日】20091029

【審査請求日】2012年4月19日

(31)【優先権主張番号】61/047,604

(32)【優先日】2008年4月24日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10440

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10441

(73)【特許権者】

【識別番号】501416243

【氏名又は名称】株式会社ジーンテクノサイエンス

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100126354

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 尚

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】クマー，シャンカー

(72)【発明者】

【氏名】ツォウ，ジェイ．ユン

(72)【発明者】

【氏名】鶴下 直也

(72)【発明者】

【氏名】今 重之

(72)【発明者】

【氏名】上出 利光

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００３／０２７１５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００２／０８１５２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０３２７１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００８−００５８３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Int. Immunopharmacol., 2007, Vol. 7, No. 11, pp. 1460-1470

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントであ
って、
配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨ鎖、および、
配列番号２６のアミノ酸配列を含むＬ鎖、
を含むヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。

【請求項2】

ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントであ
って、
配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨ鎖、および、
配列番号３０のアミノ酸配列を含むＬ鎖、
を含むヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメント。

【請求項3】

請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸分子。

【請求項4】

請求項３に記載の核酸分子であって、配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。

【請求項5】

前記ヌクレオチド配列が配列番号２３のヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の
核酸分子。

【請求項6】

シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４に記載の核酸
分子。

【請求項7】

前記シグナルペプチドが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の核酸
分子。

【請求項8】

請求項３に記載の核酸分子であって、配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。

【請求項9】

前記ヌクレオチド配列が配列番号２５のヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載
の核酸分子。

【請求項10】

シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載の核
酸分子。

【請求項11】

前記シグナルペプチドが配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子。

【請求項12】

請求項３に記載の核酸分子であって、配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。

【請求項13】

前記ヌクレオチド配列が配列番号２７のヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載
の核酸分子。

【請求項14】

シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１２に記載の核
酸分子。

【請求項15】

前記シグナルペプチドが配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の核酸
分子。

【請求項16】

請求項３に記載の核酸分子であって、配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。

【請求項17】

前記ヌクレオチド配列が配列番号２９のヌクレオチド配列を有する、請求項１６に記載
の核酸分子。

【請求項18】

シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載の核
酸分子。

【請求項19】

前記シグナルペプチドが配列番号３８のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の核酸
分子。

【請求項20】

１つまたは複数の調節エレメントに作動可能に連結している、請求項４もしくは１９に記載の核酸分子またはその両方を含むベクター。

【請求項21】

請求項２０に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。

【請求項22】

ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを調製するための方法であって、請求項２１に記載の宿主細胞をヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが発現される条件下で培養すること、および発現されたヒト化抗体を収集することを含む方法。

【請求項23】

請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項24】

ＲＧＤタンパク質に関連する障害または疾患を予防または治療するための方法（ヒトを除く）であって、有効量の請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする対象（ヒトを除く）に投与することを含む方法。

【請求項25】

ＲＧＤタンパク質に関連する障害または疾患をｉｎ ｖｉｖｏで診断するための方法（ヒトを除く）であって、有効量の請求項１または２に記載のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを被検対象（ヒトを除く）に投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．発明の分野
本発明は、細胞外マトリックスタンパク質のアミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を免疫特異的に認識するヒト化抗体、ならびに癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、感染症、骨疾患などを含めた種々の疾患または障害に対するその治療および診断的使用に関する。

【0002】

本仮出願を通じて、いくつかの刊行物（特許および特許出願を含む）を参考文献として本明細書に引用する。これらの刊行物の開示はその全体が、本発明が属する分野の技術をより十分に説明するために、参照により本仮出願に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

２．発明の背景
細胞接着は、多細胞生物の生命維持に重要な役割を果たしている。多細胞生物の細胞接着は、細胞−細胞外マトリックス（以下「ＥＣＭ」と略記する）間接着と細胞間接着に分類される。細胞−ＥＣＭ間接着はインテグリンによって媒介され、細胞間接着はカドヘリン、クローディンおよびネクチンによって媒介されることが解明されている。

【0004】

インテグリンなどの膜貫通型接着タンパク質が細胞−ＥＣＭ間接着を構成している。インテグリンは、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体を形成する。少なくとも１８種類のα鎖、８種類のβ鎖および２４種類のαβヘテロ二量体がこれまで同定され、確認されている。インテグリンのそれぞれの種類が、特異的なリガンドを認識する。インテグリンを含めた膜貫通型接着タンパク質は、細胞接着に加えて、ＥＣＭから細胞中への細胞内シグナル伝達ならびに増殖、移動および分化の調節に関連する（Ｆ．Ｇ．Ｇｉａｎｃｏｔｔｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１０２８〜１０３２、１９９９）。

【0005】

ＥＣＭタンパク質として多数のタンパク質が知られており、これらはコラーゲン群（Ｉ型〜ＸＩＸ型など）、非コラーゲン性糖タンパク質群（オステオポンチン（ＯＰＮ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンウィルブランド因子、ラミニン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジンなど）、エラスチン群およびプロテオグリカン群に分類される。これらのＥＣＭタンパク質は対応するインテグリンに結合し、細胞内シグナル伝達経路を活性化して細胞骨格形成、移動、増殖、分化などを調節する。ＥＣＭタンパク質が結合したインテグリンは、ＥＣＭタンパク質の種類によって特異的なシグナルを伝達することにより、これらのシグナル活性化経路を調節する。多数のＥＣＭタンパク質の細胞接着領域にＲＧＤ配列が共通に認められ、インテグリンと結合することによって様々な機能を発揮する。このＥＣＭタンパク質のＲＧＤ配列は薬物の可能な標的と考えられており、いくつもの小分子化合物や人工ペプチドが提供されている。

【0006】

α３β１インテグリン、α５β１インテグリン、α８β１インテグリン、αｖβ１インテグリン、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、αｖβ６インテグリン、αｖβ８インテグリンなど、いくつかの種類のインテグリンがＲＧＤ配列に結合することが知られている。α５β１インテグリンとその特異的なリガンドであるフィブロネクチンの間の相互作用から、インテグリンを介したシグナル伝達の機序についての研究が盛んに行われている。このような研究から、α５β１インテグリンは細胞接着および細胞移動だけでなく、細胞分化および細胞死も調節することが示されている（Ｓ．Ｍ．Ｆｒｉｓｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９、７０１〜７０６、１９９７）。α５β１インテグリンは腫瘍細胞で高度に発現され、癌の悪性化に関連することも示されている。インテグリンを介したシグナルはそれぞれ、結合しているＥＣＭタンパク質によって異なり、例えば、増殖因子による刺激はフィブロネクチンが結合した内皮細胞の増殖を活性化するが、ラミニン−１が結合した内皮細胞の増殖を阻害する。また、ラミニン−１０／１１からα３β１インテグリンに伝達されるシグナルは、フィブロネクチンからα５β１インテグリンに伝達されるシグナルと異なり、癌性細胞の移動を著しく増強し（Ｊ．Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、２７０９０〜２７０９７、２００１）、血液飢餓（blood starvation）によるアポトーシスを大きく回避する（Ｊ．Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７、１９９２２〜１９９２８、２００２）。ＲＧＤ配列が結合したαｖインテグリンの高発現は、破骨細胞および新生血管において認められており、ＲＧＤ配列およびαｖインテグリンの阻害が、骨粗鬆症および癌の治療薬の標的であると考えられている。α５β１インテグリンは腫瘍細胞で高度に発現され、癌の悪性化に関連することが示されている。これらの知見から、インテグリンとＥＣＭタンパク質の相互作用を阻害する抗インテグリンアンタゴニスト抗体薬として、抗α５β１インテグリン抗体（ボロシマブ（Volocimab））、抗α４インテグリン抗体（ナタリズマブ（Natalizumab））および抗αｖβ３インテグリン抗体（ビタキシン（Vitaxin））が開発されている。

【0007】

一方、コラーゲン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンウィルブランド因子、ラミニン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジンなど、いくつかのＥＣＭタンパク質はＲＧＤ配列を含むことが知られている。また、一部のウイルスおよび一部の細菌も、細胞に付着するためのＲＧＤ配列を有することが知られている。ＯＰＮは、骨に豊富に含有されるカルシウムに対する結合特性を有する酸性糖タンパク質である。ＯＰＮは、細胞接着、細胞遊走、腫瘍形成、免疫応答および補体媒介性細胞溶解に重要な役割を果たすことが報告されている。ＯＰＮノックアウトマウスおよび抗ＯＰＮ中和抗体の結果から、ＯＰＮは肝炎、自己免疫疾患（関節リウマチなど）および癌の転移に関連することが示される。細胞に対するＥＣＭタンパク質の結合の阻害剤を骨粗鬆症または癌の治療に使用できることが知られている。したがって、インテグリンを標的とする上記の拮抗薬に加えて、インテグリンの結合パートナーであるＥＣＭタンパク質を標的とする拮抗薬が開発されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

３．発明の概要
ＲＧＤ配列を介したインテグリンとの相互作用を阻害する小分子、ＯＰＮに対する抗体、インテグリンに対する抗体などの薬物は報告されているが、ＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体に関する報告はまだない。ＲＧＤ配列はＥＣＭタンパク質の保存配列の１つであるので、ＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体は、ヒトと治療モデル動物の両方で効果を有する可能性があり、したがって治療薬の開発に非常に有用な有効成分とみなすこともできる。したがって、このようなＲＧＤ配列を特異的に認識する抗体が必要とされている。

【0009】

本発明者らは以前に、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識し、ハイブリドーマクローン３３Ｅ１０および３５Ｂ６（それぞれ寄託アクセッション番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４０およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４１）によって産生されるマウスモノクローナル抗体を単離した。本明細書では、ハイブリドーマクローンの名称は、そのクローンによって産生されるモノクローナル抗体の名称として互換的に使用する。これらのマウス抗ＲＧＤ抗体はすべて、ＩｇＧ１アイソタイプであった。こうしたモノクローナル抗体は、オステオポンチンなどのＥＣＭタンパク質のＲＧＤ配列に結合することにより、ＥＣＭと細胞の間のＲＧＤ配列を介した結合に干渉することが認められた。したがって、こうした抗ＲＧＤ抗体は、癌、例えば、癌細胞の増殖または転移、および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、感染症、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患、骨粗鬆症などのＲＧＤ配列に関連する疾患に対して治療効果または診断効果を発揮する可能性がある。

【0010】

しかし、これらのモノクローナル抗体はマウス起源であるので、ヒトにおけるその免疫原性が原因で生じる可能な有害作用が、ヒトにおける診断または治療的使用にこの抗体を直接利用することの妨げとなった。その免疫原性を低下させるために、本発明者らは、前記ヒト化抗体が由来する元のマウス抗ＲＧＤ抗体によって発揮される生物活性に相当する生物活性を有するヒト化抗体を調製した。

【課題を解決するための手段】

【0011】

したがって、本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、非ヒト起源に部分的に由来し、ヒト起源に部分的に由来する抗原結合性領域を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、３３Ｅ１０モノクローナル抗体、３５Ｂ６モノクローナル抗体などの非ヒト供給源（ドナー）に由来する相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」と略記する）およびヒト供給源（アクセプター）に由来するフレームワーク領域（以下「ＦＲ」と略記する）を含む。前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＧＤ配列とそのリガンドの間の結合を阻害することができる。

【0012】

特定の実施形態において、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）ヒト重鎖（以下「Ｈ鎖」と略記する）の可変領域（以下「Ｖ領域」と略記する）に由来する少なくとも１つのＨ鎖ＦＲ（以下「ＦＲＨ」と略記する）と、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＨ鎖ＣＤＲ（以下「ＣＤＲＨ」と略記する）のうちの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＨとを含むＨ鎖；または（ｉｉ）ヒト軽鎖（以下「Ｌ鎖」と略記する）のＶ領域に由来する少なくとも１つのＬ鎖ＦＲ（以下「ＦＲＬ」と略記する）と、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＬ鎖ＣＤＲ（以下「ＣＤＲＬ」と略記する）のうちの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＬとを含むＬ鎖；または上記の（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。一実施形態において、本発明のヒト化抗体のＣＤＲＨのうちの少なくとも１つおよび／またはＣＤＲＬのうちの少なくとも１つは、寄託アクセッション番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４０およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４１からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体に由来するものとすることができる。好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨに由来する少なくとも１つのＦＲＨ、ならびに配列番号１、２および３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲＨ；または（ｉｉ）ヒトＦＲＬに由来する少なくとも１つのＦＲＬ、ならびに配列番号４、５および６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲＬ；または（ｉｉｉ）上記の（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。一部の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＨ１に配列番号１、ＣＤＲＨ２に配列番号２、およびＣＤＲＨ３に配列番号３を含むこともできる。一部の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１に配列番号４、ＣＤＲＬ２に配列番号５、およびＣＤＲＬ３に配列番号６を含むこともできる。好ましくは、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＨ１に配列番号１、ＣＤＲＨ２に配列番号２、ＣＤＲＨ３に配列番号３、ＣＤＲＬ１に配列番号４、ＣＤＲＬ２に配列番号５、およびＣＤＲＬ３に配列番号６を含む。

【0013】

一部の特定の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１（配列番号１３）によってコードされるヒトＨ鎖のＶ領域に由来するＦＲＨ、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１（配列番号１８）によってコードされるヒトκ−Ｌ鎖のＶ領域に由来するＦＲＬを含む。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体のＦＲＨは、配列番号１４、１５、１６および１７のアミノ酸配列（それぞれＸ６５８９１のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３およびＦＲＨ４のアミノ酸配列）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体のＦＲＬは、配列番号１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列（それぞれＸ７２４４１のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３およびＦＲＬ４のアミノ酸配列）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態の１つにおいて、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨ鎖のＶ領域（以下「ＶＨ」と略記する）；または（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＬ鎖のＶ領域（以下「ＶＬ」と略記する）；または（ｉｉｉ）上記の（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。

【0014】

他の実施形態において、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨに由来する少なくとも１つのＦＲＨ、ならびに配列番号７、８および９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲＨ；または（ｉｉ）ヒトＦＲＬに由来する少なくとも１つのＦＲＬ、ならびに配列番号１０、１１および１２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲＬ；または（ｉｉｉ）上記の（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。一部の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＨ１に配列番号７、ＣＤＲＨ２に配列番号８、およびＣＤＲＨ３に配列番号９を含むこともできる。一部の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＬ１に配列番号１０、ＣＤＲＬ２に配列番号１１、およびＣＤＲＬ３に配列番号１２を含む。好ましくは、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＣＤＲＨ１に配列番号７、ＣＤＲＨ２に配列番号８、ＣＤＲＨ３に配列番号９、ＣＤＲＬ１に配列番号１０、ＣＤＲＬ２に配列番号１１、およびＣＤＲＬ３に配列番号１２を含む。

【0015】

一部の特定の実施形態において、本発明の前記ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１（配列番号１３）によってコードされるヒトＨ鎖のＶ領域に由来するＦＲＨ、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１（配列番号１８）によってコードされるヒトκ−Ｌ鎖のＶ領域に由来するＦＲＬを含む。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体ＦＲＨは、配列番号１４、１５、１６および１７のアミノ酸配列（それぞれＸ６５８９１のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３およびＦＲＨ４のアミノ酸配列）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本発明のヒト化抗体のＦＲＬは、配列番号１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列（それぞれＸ７２４４１のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３およびＦＲＬ４のアミノ酸配列）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態の１つにおいて、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＨ；または（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ；または（ｉｉｉ）上記の（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。

【0016】

本発明はさらに、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。詳細には、本発明は、配列番号１、２、３、７、８および９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むヒト化Ｈ鎖、または配列番号４、５、６、１０、１１および１２からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むヒト化Ｌ鎖、または前記ヒト化Ｈ鎖と前記ヒト化Ｌ鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。好ましい特定の実施形態において、このような単離された核酸分子は、ＶＨをコードする配列番号２３のヌクレオチド配列、または配列番号２４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい特定の実施形態において、このような単離された核酸分子は、ＶＬをコードする配列番号２５のヌクレオチド配列、または配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２３と配列番号２５の両方のヌクレオチド配列を含む。好ましい特定の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号３２および３４のアミノ酸配列などのドナー起源のシグナルペプチド、または異種起源のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0017】

他の好ましい特定の実施形態において、このような単離された核酸分子は、ＶＨをコードする配列番号２７のヌクレオチド配列、または配列番号２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい特定の実施形態において、このような単離された核酸分子は、ＶＬをコードする配列番号２９のヌクレオチド配列、または配列番号３０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２７と配列番号２９の両方のヌクレオチド配列を含む。好ましい特定の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号３６および３８のアミノ酸配列などのドナー起源のシグナルペプチド、または異種起源のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0018】

本発明はさらに、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントのＨ鎖またはＬ鎖またはその両方をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、発現ベクターを提供する。このようなベクターにおいて、本発明のヌクレオチド配列を１つまたは複数の調節エレメントと作動可能に連結することもできる。本発明のヌクレオチド配列は、ＣＤＲが由来する非ヒトドナー抗体の天然のシグナルペプチド、または異種起源のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むこともできる。

【0019】

さらに、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターを含めた、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、本発明は、本発明のヒト化Ｈ鎖をコードする第１の核酸分子および本発明のヒト化Ｌ鎖をコードする第２の核酸分子を含む単離された宿主細胞を提供し、前記第１および第２の核酸分子はそれぞれ、本発明の生物学的機能を有するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが発現されるように調節エレメントと作動可能に連結している。

【0020】

したがって、本発明はさらに、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを調製するための方法であって、本発明の宿主細胞をヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントが発現されるような条件下で培養すること、および産生されたヒト化抗体を収集することを含む方法を提供する。

【0021】

本発明はさらに、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、ＲＧＤ−タンパク質に関連する障害または疾患を予防または治療するための医薬組成物であって、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。前記組成物はいずれも、障害または疾患を相加的または相乗的に寛解させることができる別の活性化合物をさらに含むことができる。前記活性化合物としては、それだけには限定されないが、抗炎症性化合物、化学療法化合物などが挙げられる。前記活性化合物としてさらに、ヒトα４インテグリン特異的抗体またはヒトα９インテグリン特異的抗体などの、小分子化合物および抗体またはその抗原結合性フラグメントが挙げられる。

【0022】

別の態様において、本発明は、ＲＧＤ−タンパク質に関連する、またはそれが関与する障害または疾患を予防または治療するための方法であって、予防または治療有効量の本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つを、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。このような使用のために、本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントの生物学的効果を増強する治療用成分とコンジュゲートすることもできる。このような治療用成分の例としては、別の抗体、細胞増殖抑制性もしくは細胞破壊性を示す細胞毒、放射性元素および／または抗炎症薬、抗生物質などを含めた他の治療薬が挙げられる。

【0023】

さらに別の態様において、本発明は、対象においてＲＧＤ−タンパク質に関連する、またはそれが関与する障害または疾患を診断するための方法であって、診断有効量の本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを被検対象に投与することを含む方法を提供する。このような診断的使用のために、本発明のヒト化抗体を放射性元素などの検出可能なマーカーで標識することもできる。

【0024】

３．１．定義
本明細書では、「抗体」という用語は、所望の抗原または所望の配列（ＲＧＤ配列など）に免疫特異的に結合することができる抗体分子を指し、抗体分子全体または抗原結合性フラグメントを含めたそのフラグメントを包含する。

【0025】

本明細書で使用する「抗原結合性フラグメント」という用語は、ＶＬおよび／もしくはＶＨまたは標的のポリペプチド、タンパク質もしくは配列に特異的に結合するＣＤＲのいずれかを含有する、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ジスルフィド結合したＦｖｓおよびフラグメントを含めた、標的のポリペプチド、タンパク質または配列、特にＲＧＤ配列に免疫特異的に結合する能力を保持する抗体の任意のフラグメントを指す。したがって、ヒト化抗体のこのような抗原結合性フラグメントは、部分または全長のヒト定常領域を含んでも含まなくてもよい。当技術分野では上記の抗体フラグメントを得るための様々な方法がよく知られている。

【0026】

本明細書で使用する「免疫特異的に認識する」という用語は、抗体またはその抗原結合性フラグメントが標的のポリペプチド、タンパク質または配列、特にヒトＲＧＤ配列に特異的に結合できることを指す。このような抗体は、他のポリペプチドまたはタンパク質に非特異的に結合しない。しかし、標的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＲＧＤ−タンパク質）に免疫特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、他の抗原と交差反応することもできる。例えば、ヒトＲＧＤ−タンパク質を免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスＲＧＤ−タンパク質と交差反応することもできる。好ましくは、ＲＧＤ−タンパク質を免疫特異的に認識する抗体またはその抗原結合性フラグメントは、他の抗原と交差反応しない。

【0027】

本明細書で使用する「ヒト供給源に由来する」または「非ヒト供給源に由来する」という用語は、そのアミノ酸配列がそれぞれヒト抗体または非ヒト抗体の対応する部分に由来する抗体部分を指す。

【0028】

本明細書で使用する「アクセプター配列」という用語は、通常非ヒト抗体であるドナー抗体由来のＣＤＲのアクセプターとなるヒト抗体ＶＨまたはＶＬ由来のＦＲのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】マウスＯＰＮの部分ペプチドを使用したモノクローナル抗体４Ｐ１１、１１Ｍ６、２５Ｈ１５および３５Ｂ６のエピトープ分析の結果を示す図である。

【図2】マウスＯＰＮおよびヒトＯＰＮの部分ペプチドを使用したモノクローナル抗体２９Ｒ５、３０Ｃ７、３３Ｅ１０および３８Ｉ８のエピトープ分析の結果を示す図である。

【図3】ＲＧＤ配列を含むマウスＯＰＮの部分ペプチドを使用したモノクローナル抗体３３Ｅ１０および３５Ｂ６のエピトープ分析の結果を示す図である。

【図4】マウスＯＰＮの部分ペプチドを使用したモノクローナル抗体３３Ｅ１０および３５Ｂ６のエピトープ分析の結果を示す図である。

【図5】マウスＯＰＮの部分ペプチド（ＣＧＤＳＬＡＹＧＬＲ；配列番号７９）を使用したモノクローナル抗体３３Ｅ１０および３５Ｂ６のエピトープ分析の結果を示す図である。

【図6】抗ＲＧＤモノクローナル抗体のＣＤＲＨ分析の結果を示す図である。この図で、３３Ｅ１０の９９位のアミノ酸（Ｆ）および３５Ｂ６の９８位のアミノ酸（Ｆ）は、ＫでもＲでもよい。

【図7】抗ＲＧＤモノクローナル抗体のＣＤＲＬ分析の結果を示す図である。

【図8】抗ＲＧＤ抗体とＲＧＤ配列を含む種々のＥＣＭタンパク質との結合親和性の結果を示す図である。

【図9】癌性細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）に対するｍＯＰＮのＮ半分（N half）の結合の抗ＲＧＤ抗体による阻害の結果を示す図である。

【図10A-10C】癌性細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）に対する種々のＥＣＭタンパク質の結合の抗ＲＧＤ抗体による阻害の結果を示す図である。

【図11】抗ＲＧＤ抗体の肝炎抑制効果の結果を示す図である。

【図12A-12B】実験的転移モデルにおける抗ＲＧＤ抗体の肺転移阻害効果の結果を示す図である。図１２Ａは転移細胞の数を示し、図１２Ｂは体重の変化を示す。

【図13A-13C】自然発症転移モデルにおける抗ＲＧＤ抗体の肺転移阻害効果の結果を示す図である。図１３Ａは癌のサイズを示し、図１３Ｂは転移細胞の数を示し、図１３Ｃは体重の変化を示す。

【図14】関節リウマチモデルにおける抗ＲＧＤ抗体の治療効果の試験の結果を示す図である。

【図15】マウス３３Ｅ１０ ＶＨ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ、第５版、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。

【図16】マウス３３Ｅ１０ ＶＬ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。

【図17】ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、設計された３３Ｅ１０ ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図18】ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、設計された３３Ｅ１０ ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図19】ｐＣｈ３３Ｅ１０およびｐＨｕ３３Ｅ１０（総称して発現ベクターとする）の概略構造を示す図である。頂点のＳａｌＩ部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターおよびエンハンサー（ＣＭＶプロモーター）から始まる重鎖転写単位を含有する。ＣＭＶプロモーターにＶＨエキソンが続き、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを介在性イントロンと共に含むヒトγ−１重鎖定常領域を含有するゲノム配列、さらにはＣＨ３エキソンの後にポリアデニル化部位がある。重鎖遺伝子配列の後に、軽鎖転写単位がＣＭＶプロモーターから始まり、続いてＶＬエキソン、およびヒトκ鎖定常領域エキソン（ＣＬ）をそれに先行するイントロンの部分と共に含有するゲノム配列、さらにはＣＬエキソンに続くポリアデニル化部位がある。次いで、軽鎖遺伝子に続いて、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、およびＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位）を含有するセグメントがある。最後に、プラスミドは、細菌の複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）およびβラクタマーゼ遺伝子（βラクタマーゼ）を含むプラスミドｐＵＣ１９の一部を含有する。

【図20】３３Ｅ１０ ＶＨ、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＨおよびヒトアクセプターＵ０３４００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ、第５版、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１）によって定義されるＣＤＲ配列は下線付きである。二重下線付きの残基はＣＤＲと接触すると予測され、マウス残基はこれらの位置においてヒト化された形で保持された。Ｕ０３４００中のＣＤＲ残基は図では省略する。

【図21】３３Ｅ１０ ＶＬ、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＬおよびヒトアクセプターＸ７２４５２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）によって定義されるＣＤＲ配列は下線付きである。Ｘ７２４５２中のＣＤＲ残基は図では省略する。

【図22】Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図23】Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図24】Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を表す。アミノ酸残基は１文字表記で示す。

【図25】Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を表す。アミノ酸残基は１文字表記で示す。

【図26】ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図27】ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図28】マウス３５Ｂ６ ＶＨ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ、第５版、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。

【図29】マウス３５Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。

【図30】ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、設計された３５Ｂ６ ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図31】ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、設計された３５Ｂ６ ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図32】ｐＣｈ３５Ｂ６およびｐＨｕ３５Ｂ６（総称して発現ベクターとする）の概略構造を示す図である。頂点のＳａｌＩ部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターおよびエンハンサー（ＣＭＶプロモーター）から始まる重鎖転写単位を含有する。ＣＭＶプロモーターにＶＨエキソンが続き、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを介在性イントロンと共に含むヒトγ−１重鎖定常領域を含有するゲノム配列、さらにはＣＨ３エキソンの後にポリアデニル化部位がある。重鎖遺伝子配列の後に、軽鎖転写単位がＣＭＶプロモーターから始まり、続いてＶＬエキソン、およびヒトκ鎖定常領域エキソン（ＣＬ）をそれに先行するイントロンの部分と共に含有するゲノム配列、さらにはＣＬエキソンに続くポリアデニル化部位がある。次いで、軽鎖遺伝子に続いて、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、およびＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位）を含有するセグメントがある。最後に、プラスミドは、細菌の複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）およびβラクタマーゼ遺伝子（βラクタマーゼ）を含むプラスミドｐＵＣ１９の一部を含有する。

【図33】３５Ｂ６ ＶＨ、ヒト化３５Ｂ６（Ｈｕ３５Ｂ６）ＶＨおよびヒトアクセプターＺ４７２３０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）によって定義されるＣＤＲ配列は下線付きである。二重下線付きの残基はＣＤＲと接触すると予測され、マウス残基はこれらの位置においてヒト化された形で保持された。Ｚ４７２３０中のＣＤＲ残基は図では省略する。

【図34】３５Ｂ６ ＶＬ、ヒト化３５Ｂ６（Ｈｕ３５Ｂ６）ＶＬおよびヒトアクセプターＸ７２４７９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）によって定義されるＣＤＲ配列は下線付きである。二重下線付きの残基はＣＤＲと接触すると予測され、マウス残基はこれらの位置においてヒト化された形で保持された。Ｘ７２４７９中のＣＤＲ残基は図では省略する。

【図35】Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図36】Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図37】Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を表す。アミノ酸残基は１文字表記で示す。

【図38】Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す図である。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置および方向（５’から３’）を表す。アミノ酸残基は１文字表記で示す。

【図39】ＳｐｅＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図40】ＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位（下線付き）が両端に隣接する、Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒に示す図である。アミノ酸残基は１文字表記で示す。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は二重下線付きである。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列は下線付きである。イントロン配列はイタリック体である。

【図41A-41B】キメラおよびヒト化３５Ｂ６抗体とｈＯＰＮ−ＢＳＡの結合をＥＬＩＳＡによって分析した。各抗体を２．５μｇ／ｍｌ（図４１Ａ）または１．０μｇ／ｍｌ（図４１Ｂ）の出発濃度および連続２倍希釈で試験した。実験は３連で実施した。各抗体濃度での平均吸光度値と標準偏差を図４１Ａ〜４１Ｂに示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

５．発明の詳細な説明
５．１．ＲＧＤ配列に対する抗体の調製
ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する抗体は、当技術分野で知られている任意の適当な方法によって生成することができる。

【0031】

本発明における細胞接着性「ＲＧＤ」配列を含むＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチド（以下「ＲＧＤ−ペプチド」と略記する）は、（１）ＲＧＤ−タンパク質を発現するヒトＥＣＭまたはこれらのＥＣＭが存在するすべての組織に由来するもの、（２）細菌、酵母、動物細胞などの細胞系などにトランスフェクトすることによる、ＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）の発現によって得られる組換えタンパク質またはペプチド、または（３）合成タンパク質またはペプチドであってもよい。

【0032】

本発明において抗原として使用されるＲＧＤ−ペプチドは、免疫化によるＲＧＤ配列に対する抗体の産生が可能であり得る。ＲＧＤ−ペプチドは、マウスＥＣＭタンパク質の細胞接着性配列であるＲＧＤ−ペプチドアミノ酸配列ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７１）を含む。ＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドとしては、ＯＰＮ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、フォンウィルブランド因子、コラーゲン、ラミニン、テネイシン、フィブリノゲン、トロンボスポンジンおよびＲＧＤを含むその断片などが挙げられる。前記タンパク質または前記ペプチドがＲＧＤ配列を含む限り、タンパク質またはペプチドにアミノ酸の置換、欠失、改変、付加などの人工または天然の変異を適用することができる。変異タンパク質またはペプチドは、複数のアミノ酸、好ましくは１から１０個のアミノ酸、より好ましくは１から数個（例えば、１から５個）のアミノ酸が置換、欠失、改変、付加または挿入されたアミノ酸配列を含むこともできる。

【0033】

本明細書では、ＲＧＤ−ペプチドは、少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは約５から５０個のアミノ酸、より好ましくは約１０から２０個のアミノ酸を含む。本発明における抗原としてのＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドは、化学合成法、細胞培養法、遺伝子組換え法、その適切な改変などの当技術分野でよく知られている方法を使用することによって産生することができる。例えば、ＲＧＤ−ペプチドは、ＥＣＭタンパク質をタンパク質分解酵素で適切に切断することによって得ることができる。ＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物に由来するものであってもよい。当技術分野でよく知られている任意の方法を使用して、抗ＲＧＤ抗体の調製に使用することができるＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドを調製することができる。

【0034】

変異ポリペプチドを生成するための方法の例としては、合成オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発（ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法）、亜硝酸または亜硫酸の処理によって点突然変異をランダムに導入することを含む点突然変異誘発法、Ｂａｌ３１酵素または他の酵素で欠失変異体を調製することを含む方法、カセット変異導入法、リンカースキャニング法（linker scanning method）、ミスインコーポレーション法（miss incorporation method）、ミスマッチプライマー法（mismatch primer method）、ＤＮＡセグメント合成法などが挙げられる。

【0035】

ＲＧＤ−ペプチドは、サイログロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）またはウシグロブリンなど他の生体巨大分子、好ましくはサイログロブリンに結合させることができる。ＲＧＤ−ペプチドを生体巨大分子に結合させる方法は、活性エステル基およびマレイミド基を有する結合試薬などのカップリング試薬（活性エステル基はタンパク質またはペプチドのアミノ基に結合し、マレイミド基はタンパク質またはペプチドのチオール基に結合する。Ｓ．Ｙｏｓｈｉｒａｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０１、３９５〜３９９、１９７９）、混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３４、１０９０〜１０９４、１９５４）、または活性エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋａｒｕら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４２、３０１〜３０９、１９９４）を使用することによって実現することができる。ＲＧＤ−ペプチドを生体巨大分子に結合させるための方法は、カップリング試薬を使用することによって達成することが好ましい。

【0036】

抗原として、ＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドを過剰発現する細胞それ自体を使用することもできる。ＲＧＤ−タンパク質またはＲＧＤ−ペプチドを過剰発現する細胞は、当技術分野でよく知られている組換えＤＮＡ技術によって調製することができる。

【0037】

上記のとおり調製した適切な抗原を使用して、当技術分野でよく知られている様々な方法によってＲＧＤ配列に特異的な抗体を調製することができる。ＲＧＤ配列に対するポリクローナル抗体は、当技術分野でよく知られている様々な手順によって産生することができる。例えば、対象の抗原は、それだけには限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた、種々の宿主動物に投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する抗血清の産生を誘発することができる。様々なアジュバントを使用して宿主種に応じて免疫応答を増大させることができ、そのアジュバントとしては、それだけには限定されないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル（mineral gel）、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、コリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）などのヒトに潜在的に有用なアジュバントが挙げられる。このようなアジュバントも当技術分野でよく知られている。

【0038】

モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術およびファージディスプレイ技術、またはその組合せの使用を含めた、当技術分野で知られている多種多様な技法を使用することによって調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られており、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、５６３〜６８１ページ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１）（両文献ともその全体が参照により組み込まれる）に教示されているものを含めて、ハイブリドーマ技法を使用することによって産生することができる。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一のクローンに由来する抗体を指し、真核生物、原核生物またはファージの任意のクローンを含むが、それが産生される方法に限定されない。

【0039】

ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、常用されており当技術分野でよく知られている。非限定的な例において、マウスは、対象の抗原またはこのような抗原を発現する細胞で免疫することができる。免疫応答が検出される、例えば、マウス血清中で抗原に特異的な抗体が検出されると、マウス脾臓が採取され、脾細胞が単離される。次いで、脾細胞は、よく知られている技法によって任意の適当な骨髄腫細胞（例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３など）と融合される。ハイブリドーマは、限界希釈によって選択され、クローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンは、当技術分野で知られている方法により、抗原に結合することができる抗体を分泌する細胞についてアッセイされる。高レベルの抗体を通常含有する腹水は、マウスの腹腔内に陽性のハイブリドーマクローンを接種することによって生成することができる。

【0040】

特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって生成することもできる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを産生するため）などの酵素を使用した、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって産生することもできる。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、完全Ｌ鎖、ならびにＨ鎖のＶ領域、ＣＨ１領域およびヒンジ領域を含有する。

【0041】

本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、当技術分野で知られている、抗体を合成するための任意の方法によって、特に、化学合成によって、または好ましくは組換え発現技法によって産生することもできる。

【0042】

抗体をコードするヌクレオチド配列は、当業者に利用可能な任意の情報から（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ、文献から、または常用のクローニングおよび配列解析によって）得ることもできる。特定の抗体またはそのエピトープ結合性フラグメントをコードする核酸を含有するクローンが利用可能でないが、抗体分子またはそのエピトープ結合性フラグメントの配列が知られている場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成するか、または配列の末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、もしくは例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリー由来ｃＤＮＡクローンを同定するための、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、適当な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製されるｃＤＮＡライブラリー、またはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、当技術分野でよく知られている任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることもできる。

【0043】

５．２．組換え抗体の調製
抗体のヌクレオチド配列は、当技術分野でよく知られている、ヌクレオチド配列を操作するための方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、両文献ともその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹに記載の技法を参照されたい）を使用することによって操作することもできる。抗体のエピトープ結合ドメイン領域に、または生物活性を増強もしくは低減する任意の部分にアミノ酸の置換、欠失および／または挿入などの突然変異を導入することもできる。

【0044】

抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを、抗体またはその抗原結合性フラグメントの組換え発現に使用することができる。抗体またはその抗原結合性フラグメントを産生するための、抗体分子、抗体のＨ鎖および／もしくはＬ鎖、またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、以前のセクションで検討したとおり、当技術分野でよく知られている技法を使用して、組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。当業者によく知られている方法を使用して、抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成的技法およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。抗体のＶＨ、ＶＬ、ＶＨとＶＬの両方、ＶＨおよび／またはＶＬの抗原結合性フラグメント、または１つもしくは複数のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は、このような発現用ベクター中にクローニングすることができる。このような配列は、元の抗体の天然のものであっても異種のものであってもよいシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合することもできる。次いで、このようにして調製された発現ベクターは、抗体を発現させるための適切な宿主細胞中に導入することができる。したがって、本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。

【0045】

宿主細胞には、第１のベクターがＨ鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターがＬ鎖由来のポリペプチドをコードする本発明の２つの発現ベクターを同時トランスフェクトすることもできる。２つのベクターは、Ｈ鎖およびＬ鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択マーカー、または両方のプラスミドの維持を確実にするための異なる選択マーカーを含有することもできる。あるいは、Ｈ鎖およびＬ鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一のベクターを使用することもできる。Ｈ鎖およびＬ鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むこともできる。

【0046】

別の実施形態において、抗体は、当技術分野で知られている種々のファージディスプレイ法を使用して作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特定の実施形態において、このようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現させた、ＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの抗原結合性ドメインを提示することができる。対象の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉した抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法に使用するファージは通常、ｆｄおよびＭ１３を含めた繊維状ファージである。抗原結合性ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換えによって融合したタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２：４１〜５０、１９９５；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４：１７７〜１８６、１９９５；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：９５２〜９５８、１９９４；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８、１９９７；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５７：１９１〜２８０、１９９４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公報ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号に開示されたものが挙げられ、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0047】

上記の参考文献に記載のとおり、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離および使用して、例えば、以下に詳細に記載のとおり、ヒト抗体または任意の他の所望のフラグメントを含めた全抗体を作製し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めた任意の所望の宿主中で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えによって産生するための技法は、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１２（６）：８６４〜８６９、１９９２；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲＩ、３４：２６〜３４、１９９５；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１〜１０４３、１９８８（それぞれその全体が参照により組み込まれる）に開示されているものなど、当技術分野で知られている方法を使用して採用することもできる。単鎖Ｆｖｓおよび抗体を産生するために使用することができる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６〜８８、１９９１；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ、９０：７９９５〜７９９９、１９９３；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３８〜１０４０、１９８８に記載のものが挙げられる。

【0048】

本発明の抗体分子は、上記の任意の方法によって産生させた後、当技術分野で知られている、免疫グロブリン分子を精製するための任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特に、プロテインＡまたはプロテインＧ精製後の特異的な抗原に対する親和性によって、およびサイジングカラムクロマトグラフィー（sizing column chromatography））、遠心分離、溶解度差（differential solubility）、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的な技法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書に記載のものか、そうでなければ当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列と融合させて精製を容易にすることもできる。

【0049】

ヒトにおける抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用およびｉｎ ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含めた一部の使用のために、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することが好ましいこともある。キメラ抗体およびヒト化抗体は、以下のセクション５．３で詳細に検討する。

【0050】

他の化合物または異種ポリペプチドと融合またはコンジュゲートした抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏイムノアッセイ、精製法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの治療または診断的使用で使用することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、３９：９１〜９９、１９９４；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ、８９：１４２８〜１４３２、１９９２；およびＦｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６：２４４６〜２４５２、１９９１を参照されたい。例えば、抗体は、既知の方法または市販のキット（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）を使用して様々な形で標識することができる。別の例として、抗体は、抗体の生物学的効果をｉｎ ｖｉｖｏで増強する治療用成分とコンジュゲートすることもできる。このような治療用成分の例としては、別の抗体、細胞増殖抑制性もしくは細胞破壊性を示す細胞毒、放射性元素および／または抗炎症薬を含めた他の治療薬、抗生物質などが挙げられる。本発明において、ヒト化抗ＲＧＤ抗体は、別の抗体とコンジュゲートして二重特異性抗体を形成することもできる。別の例として、本発明のヒト化抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断的使用のために放射性元素などの検出可能なマーカーで標識することもできる。

【0051】

５．３．キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来するＶ領域およびヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は当技術分野で知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１２０２、１９８５；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４ １９８６；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２５：１９１〜２０２、１９８９；米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７号を参照されたい。

【0052】

ヒト化抗体は、所望の抗原に結合し、非ヒト種に由来する１つまたは複数のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子に由来する１つまたは複数のＦＲを含有するＶ領域を含む分子である。非ヒト抗体をヒト化するための典型的な方法は、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９〜１００３３および米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３、１９８８；およびＴｓｕｒｕｓｈｉｔａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９〜８３、２００５の文献など、様々な参考文献に記載されており、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら（２００５、前掲；以下「Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ」とする）の参考文献では、元々Ｑｕｅｅｎら（１９８９、前掲）によって開発された抗体ヒト化方法に基づいてマウスモノクローナル抗体をヒト化するための実用的および指示的プロトコールが示されている。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａに開示されている一般的なプロトコールは以下に簡潔に要約する。

【0053】

５．３．１．ヒト化抗体を調製するための一般的なプロトコール
マウスＶ遺伝子のクローニングおよび配列決定
標的のマウスモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡのクローニングに様々な方法が利用可能である。例えば、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）またはＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を使用した５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法が一般に使用されている。５’ＲＡＣＥ用の遺伝子特異的プライマーは、ＶＨおよびＶＬのすぐ下流に結合するように、標的のモノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖のアイソタイプに基づいて調製することができる。したがって、５’ＲＡＣＥプライマーは、γ１、γ２ａ、γ２ｂまたはγ３など、マウスのそれぞれのサブタイプに特異的であるように設計することもできる。あるいは、すべてのサブタイプ用の一般的なプライマーは、サブタイプの中で共通のまたは高度に相同な領域に基づいて設計することもできる。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａでは、以下の５’ＲＡＣＥプライマーを例として開示する。
（ｉ）５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−（配列番号８２）（マウスγ１、γ２ａ、γ２ｂおよびγ３ Ｈ鎖のクローニング用）
（ｉｉ）５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−（配列番号８３）（マウスκＬ鎖のクローニング用）。

【0054】

ＰＣＲ増幅されたＶ領域遺伝子フラグメントを、例えば、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドベクター中に直接的にクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定することができる。得られた配列は、例えば、そのコードアミノ酸配列を、例えば、Ｍｏｄｅｌ ２４１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、ＣＡ）を使用したＮ末端アミノ酸配列決定によって決定された標的のモノクローナル抗体の配列と比較することによって確認すべきである。通常、例えば、エドマン分解による標的抗体のＮ末端の少なくとも１５〜２０アミノ酸残基の決定は、クローン化ＤＮＡ配列の確実性を確認するのに十分である。マウスにおいて２つの最も多くみられるＮ末端アミノ酸の１つであるグルタミンがＮ末端アミノ酸である場合、それはピログルタミンに変換される可能性があり、Ｎ末端における配列決定を阻止すると、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａは注意を促している。その場合は、配列を得るためにＮ末端での阻止を解除することが必要である。

【0055】

Ｖ領域の三次元モデリング
まず、ＶＨおよびＶＬの配列に基づいて、ＣＤＲの立体構造の維持において潜在的に重要である標的抗体のフレームワーク残基を、例えば、Ｒ．Ｌｅｖｙら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８：７１６８〜７１７５；およびＢ．Ｚｉｌｂｅｒら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９：１００３２〜１００４１に記載されている方法によって同定する。通常、ＶＨおよびＶＬはそれぞれ、構造的に意味ある１４のセグメントに分けられ、それは、免疫グロブリンスーパーファミリーのドメイン構造を構成するβ鎖およびループ様構造である。標的抗体由来のセグメントのそれぞれのアミノ酸配列は、ＰＤＢデータベース（Ｈ．Ｍ．Ｂｅｒｍａｎら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２３５〜３４２参照）における既知の構造を有する抗体の対応するセグメントとアラインメントする。複数の配列アライメントにより、標的セグメントのそれぞれの最高の配列相同性を有する対応するセグメントを選択し、Ｖ領域の三次元モデルを構築する。構造を最適化するために、モデルを複数サイクルの共役勾配エネルギー最小化（conjugate gradient energy minimization）に供する（例えば、ＥＮＣＡＤ、またはＰｒｅｓｓら、１９９０、「Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｒｅｃｉｐｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに記載；Ｗｅｉｎｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．２：２８７〜３０３によるＡＭＢＥＲ；ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｏｄｅｌｌｉｎｇで利用可能な３Ｄ−ＪＩＧ−ＳＡＷ、またはＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫによって運営される「ＢＭＭ」ウェブサイト；またはＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｇｅｎｅｖａによって運営されるＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒウェブサイトで利用可能なＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用）。

【0056】

ヒトフレームワークの選択
Ｖ領域の構造のモデリングと並行して、マウスＶＨおよびＶＬそれぞれのｃＤＮＡクローニングから推定されたアミノ酸配列をデータベース、例えば、Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００、Ｊｏｈｎｓｏｎら、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１４〜２１８を参照されたい）、ＧｅｎＢａｎｋなどにおいてヒトＶ領域配列と比較する。マウス配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％の同一性という全体にわたる配列同一性を有するヒトＦＲは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｇｕｓｆｉｅｌｄ、１９９７、「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｏｎ Ｓｔｒｉｎｇｓ， Ｔｒｅｅｓ， ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」掲載、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅによる）、またはＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４〜２２６８による）などを使用して検索ことができる。これらのヒト配列はｃＤＮＡベースの配列およびタンパク質由来の配列に基づくものであってもよいが、生殖系列の使用がしばしば好ましく、それは、この生殖系列は、ｃＤＮＡベースの配列、タンパク質由来の配列の体細胞超変異に関連する潜在的な免疫原性の排除に有用である可能性があるからである。別の方法では、Ｑｕｅｅｎら（１９８９、前掲）に記載のとおり、コンセンサスフレームワーク配列を使用することにより、ｃＤＮＡベースの配列またはタンパク質由来の配列から得られたフレームワーク中のこのような超変異残基を同定および除去することもできる。生殖系列ＶＨセグメントをアクセプターフレームワークとして使用する場合、第１４染色体上にコードされるＶＨセグメントだけが機能的ＶＨを産生するので、第１５染色体および第１６染色体ではなく第１４染色体上のものを使用すべきである。

【0057】

ヒト化Ｖ領域の設計
Ｑｕｅｅｎら（１９８９、前掲）によれば、ＣＤＲの約４〜６Å以内にあるフレームワークアミノ酸を同定することが必要であり、それは、これらの残基が正しいＣＤＲ構造を支持する潜在的な重要なフレームワーク残基であると考えられるからである。このようなプロセスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ）によって支援されるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｗａｒｅウェブサイトで利用可能な、原子座標から原子間距離を計算するＲＡＳＭＯＬなどのコンピュータプログラムを使用して、またはコンピュータモデルのマニュアル検査によって達成することができる。重要なフレームワーク位置のアミノ酸がマウスドナー配列とヒトアクセプター配列の間で異なる場合、通常ヒト残基がマウスドナーの残基によって置き換えられる。しかし、このような残基が、ＣＤＲ構造の支持への寄与がわずかしかない場合、対応するヒト残基を通常使用する。また、選択されたヒトアクセプターがＶ領域配列の約１０〜２０％未満に存在する「非定型的な（atypical）」アミノ酸を含有する場合、これらのアミノ酸は親和性成熟の間の体細胞超変異の結果である可能性があり、ヒトにおける潜在的な免疫原性を回避するためにドナー残基で置き換えるべきである。

【0058】

さらに、潜在的なＮ結合型グリコシル化シグナルの残基などの他の因子を、ヒト化Ｖ領域を設計するために慎重に考慮する必要がある（詳細についてはＴｓｕｒｕｓｈｉｔａを参照されたい）。

【0059】

ヒト化抗体は、治療的使用に必要とされる、または排除されるべきエフェクター機能に依存して、ヒト抗体またはその変異体のヒトκもしくはλＬ鎖、および／またはγ１、γ２、γ３、γ４、μ、α１、α２、δもしくはεＨ鎖由来のヒト定常領域またはその一部分を含有することができる。例えば、抗体とＦｃ受容体の結合が低減し、かつ／または補体を固定する抗体の能力が低減するように、突然変異を含有する定常領域Ｆｃ部分を本発明のキメラまたはヒト化抗体のＶ領域と融合することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、ＧＢ２，２０９，７５７Ｂ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＷＯ８９／０７１４２、Ｍｏｒｇａｎら、ＷＯ９４／２９３５１を参照されたい）。抗体分子のこのような操作は、セクション５．２に記載のとおり組換えＤＮＡ技術によって実施することができる。

【0060】

好ましくは、得られたキメラまたはヒト化抗体は、非ヒトドナー抗体と同一の特異性、および非ヒトドナー抗体の親和性に類似する、またはそれの少なくとも約１／３、少なくとも約１／２もしくは少なくとも約２／３の親和性を有する。別の態様において、得られたキメラまたはヒト化抗体は、少なくとも約１×１０^７Ｍ^−１、好ましくは少なくとも約１×１０^８Ｍ^−１、最も好ましくは少なくとも約１×１０^９Ｍ^−１の親和性定数を有する。

【0061】

上記の一般的なプロトコールに加えて、抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９〜４９８、１９９１；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５〜８１４、１９９４；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９６９〜９７３、１９９４）、およびチェインシャッフリング（chain shuffling）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた当技術分野で知られている種々の技法を使用してヒト化することができ、すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0062】

５．３．２．ヒト化抗体を医薬品として調製するための追加の考慮事項
ヒト化抗体を医薬品として提供するために、したがって、効率的で一貫した産生系を調製する必要がある。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖配列を挿入することによってヒト化抗体に適切な発現ベクターを調製し、発現ベクターをトランスフェクトした高生産性細胞株をマスターセルバンク（master cell bank）（ＭＣＢ）の種細胞として得ることができ、それはワーキングセルバンク（working cell bank）（ＷＣＢ）の安定で半永久的な供給源となる。次いで、ＷＣＢ由来のワーキングセル（working cell）を培養し、培地を収集することによってヒト化抗体を調製することができる。

【0063】

適切な制御遺伝子を有する種々の発現ベクターをこのような産生細胞株の調製に使用することができる。宿主細胞として、哺乳動物タンパク質を発現させるのに一般に使用されるものをヒト化抗体の発現に使用することができる。このような宿主細胞の例としては、それだけには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２／０−Ａｇ１４．１９細胞、ＮＳＯ細胞などが挙げられる。ヒト化抗体の生産性は、発現ベクターと宿主細胞の最良の組合せを選択することによって最大化することができる。さらに、宿主細胞によるヒト化抗体の発現が最適化されるように、適した培地を選択するために種々の無血清培地および補充物質から培地の組成を検討すべきである。

【0064】

効率および最終収率に基づいて、宿主細胞によって産生されたヒト化抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィーなどを含めた当技術分野でよく知られている様々な方法を使用して、培養上清から精製することができる。

【0065】

５．４．医薬組成物および治療的使用
本発明は、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識する上記のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。本発明のヒト化抗体を有効成分として含む医薬組成物は、それだけには限定されないが、癌、例えば、癌細胞の増殖または転移、および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患などを含めた、ＲＧＤタンパク質に関連する障害または疾患の予防薬および／または治療薬として使用することができる。

【0066】

本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物を使用して、臓器移植後の慢性拒否反応、および全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患を治療することもできる。

【0067】

本発明のヒト化抗体を含む、上記の障害または疾患を予防または治療するための予防薬および／または治療薬は、低い毒性を有し、適当な溶媒中に混合することによる液体製剤として、または適切な剤形の医薬組成物として直接的にヒトに経口または非経口投与することができる。

【0068】

上記の投与に使用される医薬組成物は、前記の抗体またはその塩および薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を含有する。このような組成物は、経口または非経口投与に適した剤形で提供される。

【0069】

用量は、投与される対象の年齢およびサイズ、標的の疾患、条件、投与経路などによって様々であってよい。抗体を、例えば、成人患者の関節リウマチの予防および／または治療に使用する場合、本発明の抗体を静脈内に通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇ体重の単回用量で、１日に約１〜５回、好ましくは１日に約１〜３回投与することが有利である。他の非経口投与および経口投与においても、抗体を上記で示される用量に相当する用量で投与することができる。状態が特に重い場合、用量を状態に従って増加させることもできる。

【0070】

様々なデリバリーシステムが知られており、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中への封入、突然変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体を介したエンドサイトーシスがある（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９ ４４３２を参照されたい）。導入方法としては、それだけには限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられる。これらの化合物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮層または皮膚粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を通した吸収によって投与することができ、他の生物活性を有する作用物質と一緒に投与することもできる。投与は全身でも局所でもよい。例えば、吸入器またはネブライザーおよびエアロゾル化剤との配合の使用によって肺への投与を採用することもできる。

【0071】

特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましいことがあり、これは、例えば、限定的なものではないが、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷包帯と組み合わせた外用塗布により、注射により、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、鼻内噴霧を用いて、またはシアラスティック（sialastic）膜などの膜、または繊維を含めた、多孔性、非多孔性またはゼラチン状の材料のインプラントを用いて実現することができる。一実施形態において、感染組織の部位（または以前の部位）への直接注射によって投与することができる。

【0072】

別の実施形態において、医薬組成物は、小胞、特にリポソームとして送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ掲載、Ｌｏｐｅｚ ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３５３〜３６５ページ（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、３１７〜３２７ページを参照されたい；同書を全体として参照されたい）。

【0073】

さらに別の実施形態では、医薬組成物を制御放出システムにおいて送達することができる。一実施形態において、ポンプを使用することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ８８：５０７；およびＳａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたい；Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御放出システムを組成物の標的の近くに配置することができ、したがって全身用量の一部しか必要とされない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、前掲、２巻、１１５〜１３８ページ（１９８４）を参照されたい）。他の制御放出システムはＬａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０））による総説において検討されている。

【0074】

経口投与用の組成物の例としては、固形または液体の剤形、詳細には、錠剤（糖衣錠およびフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、粉末状の製剤、カプセル剤（軟カプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。このような組成物は、公知の方法によって製造され、医薬製剤の分野で従来使用されているビヒクル、希釈剤または添加剤を含有する。錠剤のビヒクルまたは添加剤の例は、乳糖、デンプン、ショ糖、ステアリン酸マグネシウムなどである。

【0075】

注射用製剤としては、静脈内、皮下、皮内および筋肉内の注射、点滴注入などの剤形が挙げられる。これらの注射用製剤は、公知の方法によって調製することができる。注射用製剤は、例えば、上記の抗体またはその塩を、従来より注射剤に使用されている無菌水媒体または油性媒体に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射剤の水媒体としては、例えば、生理的食塩水、ブドウ糖および他の助剤（auxiliary agent）などを含有する等張液などがあり、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な溶解補助剤（solubilizing agent）と組み合わせて使用することもできる。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが採用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの溶解補助剤と組み合わせて使用することもできる。このようにして調製される注射剤は、好ましくは、適切なアンプルに充填される。直腸投与に使用される坐剤は、前記の抗体またはその塩を坐剤用の常用の塩基とブレンドすることによって調製することができる。

【0076】

有利には、上記の経口または非経口用の医薬組成物は、有効成分の用量に適合するのに適した単位用量の剤形に調製される。このような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。前記の抗体の含有量は一般に、単位用量の剤形当たり約５〜５００ｍｇであり、特に、注射剤の剤形では前記の抗体は約５〜１００ｍｇ含有され、他の剤形では約１０〜２５０ｍｇ含有されることが好ましい。

【0077】

上記の組成物はそれぞれ、配合により上記の抗体と任意の有害な相互作用を引き起こさない限り、他の活性成分をさらに含有することもできる。

【0078】

本発明はまた、ＲＧＤ配列結合機能分子（例えば、インテグリンなど）を有効成分として含む、細胞および／または組織リモデリングの阻害剤および／または促進剤；ならびにＲＧＤタンパク質を発現する細胞および／または組織（例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など）をＲＧＤタンパク質結合機能分子と接触させることを含む、細胞および／または組織リモデリングを阻害および／または促進するための方法に関する。このような治療薬における有効成分の用量、投与方法、医薬製剤などは、本発明のヒト化抗体を含む医薬に関する前述の記載を参照することによって適切に決定することができる。

【0079】

上記のとおり、本発明はさらに、ＲＧＤタンパク質に関連する、またはそれが関与する障害または疾患を予防または治療するための方法であって、有効量の本発明のヒト化抗体のうちの少なくとも１つを、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。

【0080】

５．５．診断的使用
本発明のヒト化抗体を含む医薬組成物は、癌（例えば、癌細胞の増殖または転移）および／または炎症性疾患（例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫など）の診断用薬として、または臓器移植後の慢性拒否反応、全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、増殖性糸球体腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の診断用薬として使用することができる。本発明のヒト化抗体は、ＲＧＤ配列を特異的に認識することができ、したがって試験体液中のＲＧＤタンパク質を定量するために、特に、サンドイッチイムノアッセイ、競合的アッセイ、イムノメトリー（immunometry）、比濁分析（nephrometry）など、免疫染色などによる定量に使用することができる。これらの免疫学的方法を本発明のアッセイ法に適用する際は、いかなる特定の条件、手順なども説明する必要はない。当技術分野における通常の技術的考慮事項を従来の条件および手順に付加することによりアッセイ系を構築することが十分である。これらの一般的な技術的手段の詳細については、総説、テキストなどを参照することができる．

【0081】

上記のとおり、本発明の抗体を使用することにより、ＲＧＤタンパク質を高感度で定量することもできる。本発明のヒト化抗体は、ＲＧＤタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで定量するための方法を適用することにより、ＲＧＤタンパク質に関連する種々の疾患を診断するのに特に有用である。例えば、ＲＧＤタンパク質の発現レベルの増大または低下が検出された場合、ＲＧＤタンパク質に関連する疾患、例えば、癌または炎症性疾患に罹患している可能性が高い、または将来これらの疾患に罹患する可能性が高いと診断することができる。したがって、本発明はまた、対象においてＲＧＤタンパク質に関連する、またはそれが関与する障害または疾患を診断するための方法であって、有効量の、本発明のヒト化抗体のうちの少なくとも１つまたは両方を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。このようなｉｎ ｖｉｖｏ診断に必要な投与量は、治療的使用に必要な投与量未満であってもよく、常用の手順に従って当業者によって決定することができる。

【0082】

本発明のヒト化抗体を使用して、体液、組織などの試験体液に存在するＲＧＤタンパク質を特異的に検出することもできる。ヒト化抗体は、ＲＧＤタンパク質を精製するための抗体カラムの調製、精製時のそれぞれの画分に含有されるＲＧＤタンパク質の検出、または試験対象の細胞中のＲＧＤタンパク質の挙動の分析に使用することもできる。

【実施例】

【0083】

６．実施例
以下の実施例では、ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するモノクローナル抗体の調製、モノクローナル抗体のＶ領域の配列決定、抗体のエピトープマッピングおよび他の特徴付け、ならびにこのような抗体のキメラ化およびヒト化、ならびに得られたキメラ抗体およびヒト化抗体の特徴付けを例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。

【0084】

６．１．ＲＧＤ配列に対するマウス抗体の調製
ＲＧＤ配列に対するマウスモノクローナル抗体をサブトラクティブ免疫化法（subtractive immunization method）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃ．Ｖ．ら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２：８４２〜８４７による）に従って調製した。ＲＧＤ配列を含むアミノ酸配列ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７１）およびＥＣＭタンパク質の細胞接着性配列であるアミノ酸配列ＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７２）の合成ペプチドとして抗原を調製した。抗原ペプチドをＥＭＣＳ（Ｄｏｊｉｎ）を介してサイログロブリンに結合させ、これを抗原としてアジュバントと共にマウスに免疫した。ハイブリドーマを当技術分野でよく知られている方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ掲載、５６３〜６８１ページ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１）を参照されたい）によって調製した。４回免疫した後、脾細胞を収集し、骨髄腫細胞Ｘ６３−Ａｇ８−６５３と融合した。次いで、ＨＡＴ培地を使用し、ＥＬＩＳＡ（抗原ペプチド固相）を用いて培養上清をスクリーニングすることにより、ＲＧＤ配列に免疫特異的に反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択した。ＲＧＤ配列を免疫特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離すると、８つのハイブリドーマクローン４Ｐ１１、１１Ｍ６、２５Ｈ１５、２９Ｒ５、３０Ｃ１７、３３Ｅ１０、３５Ｂ６および３８Ｉ８を樹立した。チオールセファロースビーズ（Ａｍａｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用することによって調製された抗原ペプチドカラムを使用することにより、抗体をハイブリドーマの上清から精製した。

【0085】

６．２．抗ＲＧＤ配列モノクローナル抗体のエピトープ分析
アミノ酸配列ＣＬＰＶＫＴＤＳＧＳＳＥＥＫＬＹ（ｍＯＰＮ１）（配列番号７３）、ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（ｍＯＰＮ５）（配列番号７１）、ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳ（配列番号７４）、ＣＰＮＧＲＧＤ（配列番号７５）、ＣＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７６）、ＣＧＤＳＬＡＹＧ（配列番号７７）、ＣＧＤＳＬＡＵＧＬＲ（配列番号７８）およびＣＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７２）からなる、マウスＯＰＮに由来する部分ペプチドを含むペプチド、アミノ酸配列ＣＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ（配列番号７９）およびＣＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８０）からなる、ヒトＯＰＮに由来する部分ペプチドを含むペプチド、ならびにアミノ酸配列ＣＧＲＧＤＳ（配列番号８１）の、ヒトＯＰＮおよびマウスＯＰＮの共通のペプチド配列を含むペプチドを、ＥＭＣＳ（同仁化学研究所）を介してＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に結合させ、ＥＬＩＳＡに使用した。

【0086】

９６ウェルプレートにペプチド（１０μｇ／ｍｌ）またはタンパク質（５μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間培養することによって固定化し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ_３溶液でブロッキングし、次いで様々な濃度の抗体と３７℃で１時間反応させた。次に、プレートを二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と３７℃で３０分間反応させ、ＯＰＤを色素原として添加し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止させ、次いで４９０ｎｍでの吸光度を検出した。

【0087】

図１、図２、図３、図４および図５に示すとおり、モノクローナル抗体４Ｐ１１、１１Ｍ６、２５Ｈ５、３５Ｂ６および３３Ｅ１０は、ｍＯＰＮ５およびｈＯＰＮ５に結合し、ＲＧＤタンパク質のマウスおよびヒト部分ペプチドを認識する。モノクローナル抗体３３Ｅ１０は、ＧＲＧＤＳ（配列番号８１）、ＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳ（配列番号７４）およびＰＮＧＲＧＤ（配列番号７５）を認識したが、ＯＰＮのＲＧＤに続く配列を含むＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７２）またはＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８０）を認識しなかった。モノクローナル抗体３３Ｅ１０は、ＧＲＧＤＳ（配列番号８１）、ＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳ（配列番号７４）およびＰＮＧＲＧＤ（配列番号７５）に共通に含まれるＲＧＤ配列を認識し、ヒトペプチドとマウスペプチドの両方に結合することができる。モノクローナル抗体３５Ｂ６は、ＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７６）、ＧＤＳＬＡＹＧ（配列番号７７）およびＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７８）を認識したが、ＧＲＧＤＳ（配列番号８１）、ＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳ（配列番号７４）またはＰＮＧＲＧＤ（配列番号７５）を認識しなかった。モノクローナル抗体３５Ｂ６は、ＧＤを含む、ＲＧＤに続く配列を認識する。モノクローナル抗体２９Ｒ５、３０Ｃ１７および３８Ｉ８は、ＧＲＧＤＳ（配列番号８１）、ＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７２）およびＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号８０）にはわずかな反応性しか示さなかったが、ｍＯＰＮ５にだけ反応し、それにより、これらのモノクローナル抗体はマウスＯＰＮのＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号７１）を認識することが示される。

【0088】

６．３．抗ＲＧＤ抗体のＣＤＲ分析
モノクローナル抗体３３Ｅ１０および３５Ｂ６のＣＤＲのアミノ酸配列を以下の手順によって決定した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して対応するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してｃＤＮＡを調製した。抗体のＨ鎖ｃＤＮＡを、Ｈｅａｖｙ ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍａｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用したＰＣＲによって増幅し、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、次いでｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を決定した。ＡＢＧ：Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ｏｆ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ｈｔｍｌ）によってＣＤＲを決定した。Ｖ鎖およびＬ鎖のＣＤＲは以下のとおりである（図６および図７にも示す）。
（Ｈ鎖）
［ＣＤＲＨ１］
３３Ｅ１０：ＧＦＴＦＴＤＹＹＭＩ（配列番号１）
３５Ｂ６：ＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号７）
［ＣＤＲＨ２］
３３Ｅ１０：ＷＬＧＦＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号２）
３５Ｂ６：ＷＩＧＮＩＮＰＲＮＧＤＳＮＹＮＥＫＦＲＳ（配列番号８）
［ＣＤＲＨ３］
３３Ｅ１０：ＧＡＹ（配列番号３）
３５Ｂ６：ＧＹＦＤＶ（配列番号９）
（Ｌ鎖）
［ＣＤＲＬ１］
３３Ｅ１０：ＲＳＳＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号４）
３５Ｂ６：ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＳ（配列番号１０）
［ＣＤＲＬ２］
３３Ｅ１０：ＲＶＳＮＲＦＳ（配列番号５）
３５Ｂ６：ＲＡＮＲＬＶＤ（配列番号１１）
［ＣＤＲＬ３］
３３Ｅ１０：ＧＳＦＶＰＷ（配列番号６）
３５Ｂ６：ＹＤＥＦＰＦ（配列番号１２）

【0089】

本実施例では、ＣＤＲをＡＢＧによって決定した。しかし、他のプログラムを使用してＣＤＲを決定することもでき、それによりある程度異なる配列が得られることもあることは当技術分野でよく知られている。

【0090】

６．４．ＲＧＤ配列を有するＥＣＭタンパク質に対する結合能
ヒトＯＰＮ（ｈＯＰＮ）遺伝子またはマウスＯＰＮ（ｍＯＰＮ）遺伝子をそれぞれ導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清から、抗ＯＰＮ抗体カラムを使用することにより、ｈＯＰＮまたはｍＯＰＮをそれぞれ精製した。ヒトビトロネクチン（以下「ＶＮ」と略記する）はＡＧＣ ＴＥＣＨＮＯ ＧＬＡＳＳ Ｃｏ．，Ｌｔｄから得た。ヒトフィブロネクチン（以下「ＦＮ」と略記する）、ヒトトロンボスポンジンおよびマウスラミニンはＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。

【0091】

上記で得たｈＯＰＮ、ｍＯＰＮ、ＦＮ、ＶＮまたはラミニンを固定化した９６ウェルプレートを使用したＥＬＩＳＡにより、ＥＣＭタンパク質に対するモノクローナル抗体３３Ｅ１０および３５Ｂ６の結合能を検出した。９６ウェルプレートにペプチド（１０μｇ／ｍｌ）またはタンパク質（５μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間培養することによって固定化し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ_３溶液でブロッキングし、次いで様々な濃度の抗体と３７℃で１時間反応させた。次に、プレートを二次抗体のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と３７℃で３０分間反応させ、ＯＰＤを色素原として添加し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加して反応を停止させ、次いで４９０ｎｍでの吸光度を検出した。

【0092】

図８にその結果を示した。モノクローナル抗体３３Ｅ１０は、試験したすべてのＥＣＭタンパク質と交差反応性を示したが、ラミニンとは低い反応性を示した。モノクローナル抗体３５Ｂ６は、ｈＯＰＮおよびｍＯＰＮと反応性を示したが、ラミニンとは反応性を示さなかった。

【0093】

６．５．細胞接着阻害活性
細胞接着にはＲＧＤペプチドとそのリガンド、すなわちインテグリンなどとの結合が関与することが知られているので、単離された抗ＲＧＤ抗体をその細胞接着阻害活性について検討した。ヒトＯＰＮ（ｈＯＰＮ）遺伝子またはマウスＯＰＮ（ｍＯＰＮ）遺伝子をそれぞれ導入したＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養上清から、抗ＯＰＮ抗体カラムを使用することにより、ｈＯＰＮまたはｍＯＰＮをそれぞれ精製した。大腸菌から単離することによる、トロンビン切断型ｍＯＰＮのＮ末端部分とのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として、ｍＯＰＮのＮ半分を精製した。ヒトＦＮおよびヒトＶＮはＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た。

【0094】

５０μｌのタンパク質を９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、プレート上に固定化した。プレートをブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）でブロッキングし、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を０．２５％ＢＳＡ−最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁させ、単離されたモノクローナル抗体を１．０×１０^５細胞／ｍｌの最終濃度で混合し、プレートに２００μｌ／ウェルで添加し、５％ＣＯ_２下、３７℃で１時間インキュベートした。非接着細胞をＰＢＳですすぎ、接着細胞を固定し、０．５％Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔ（和光純薬工業、大阪、日本による）／２０％メタノールで染色した。染色細胞を室温で３０分間静置させた。プレートを蒸留水で洗浄し、それに２０％酢酸溶液を添加して溶解させた。５９０ｎｍでのＯＤを測定することによって接着活性を定量した。

【0095】

ｍＯＰＮのＮ半分を固定化した９６ウェルプレートに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とモノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６の混合物を添加し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とｍＯＰＮのＮ半分との結合に及ぼす抗体の効果を検討した。ｍＯＰＮのＮ半分、ＦＮまたはＶＮをそれぞれ固定化した９６ウェルプレートに、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とモノクローナル抗体３３Ｅ１０の混合物を添加し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞と各タンパク質との結合に及ぼす抗体の効果を検討した。

【0096】

図９および図１０Ａ〜１０Ｃに示すとおり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞はｍＯＰＮのＮ半分に接着し、この接着を抗ＲＧＤ抗体によって阻害した。モノクローナル抗体３３Ｅ１０は、モノクローナル抗体３５Ｂ６と比較して強い阻害活性を示した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、検討したすべてのＥＣＭタンパク質に接着した。モノクローナル抗体３３Ｅ１０は、ｍＯＰＮのＮ半分との細胞接着を阻害したが、ＦＮまたはＶＮとの細胞接着を阻害しなかった。したがって、モノクローナル抗体３３Ｅ１０はＯＰＮと細胞の間の接着を特異的に阻害することが示される。

【0097】

６．６．抗ＲＧＤ抗体の治療効果
抗ＲＧＤ抗体の治療効果をマウス系において検討した。抗ＲＧＤモノクローナル抗体（４Ｐ１１、１１Ｍ６、２９Ｒ５、３０Ｃ７、３８Ｉ８、３３Ｅ１０および３５Ｂ６）を抗ＲＧＤ抗体についての記載（セクション６．１、前掲を参照されたい）と実質的に同様に調製した。

【0098】

６．６．１．肝炎に対する治療効果
ＷＯ０２／０８１５２２は、ＯＰＮ機能を阻害することによって肝炎を治療できることを開示している。したがって、マウス肝炎モデルにおいてマウス抗ＲＧＤ抗体（４Ｐ１１、１１Ｍ６、２９Ｒ５、３０Ｃ７、３８Ｉ８、３３Ｅ１０および３５Ｂ６）を使用して抗ＲＧＤ抗体の治療効果を試験した。マウス（マウス５匹／群）の血中ＡＳＴおよびＡＬＴレベルを、２００μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ）の静脈内投与から１２時間後、ＧＰＴ／ＡＬＴ−ＰＩＩＩおよびＧＯＴ／ＡＳＴ−ＰＩＩＩ（富士フイルム）を使用して測定した。ＣｏｎＡ注射の３時間前に抗体を２００μｇ投与した。対照抗体としてマウスＩｇＧを使用した。

【0099】

図１１に示すとおり、モノクローナル抗体２５Ｈ１５はいかなる治療効果も示さなかったが、モノクローナル抗体４Ｐ１１、１１Ｍ６、２９Ｒ５、３０Ｃ１７および３８Ｉ８は治療効果を示した。モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６を投与したマウスは、ＡＳＴおよびＡＬＴレベルの増大を示さなかった。したがって、この結果から、モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６によって肝炎を治療する可能性があることが明らかになった。

【0100】

６．６．２．マウス癌細胞株の転移に及ぼす抗ＲＧＤ抗体の効果
肺転移のマウス実験モデルおよび自然発症モデルにおいて転移に及ぼす抗ＲＧＤ抗体の効果を試験した。

【0101】

実験モデルでは、４００μｇ／マウスのモノクローナル抗体と混合したマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射し、注射から１４日後、肺転移数をカウントした。対照として同じ種類の抗体（ｍＩｇＧ１）を使用した。

【0102】

自然発症モデルでは、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−ＢＬ６細胞（４×１０^５細胞／マウス）をＣ５７ＢＬ／６マウスの左足蹠に皮下注射した。注射から１９日後、原発性腫瘍を外科的に切除し、切除から１４日後（Ｂ１６−ＢＬ６細胞の注射から３３日後）、屠殺したマウス由来の肺における腫瘍コロニーの数をカウントした。２００μｇ／マウスのモノクローナル抗体を腫瘍細胞の注射から３、５、７、９、１１、１３、１５および１７日後の８回、腹腔内投与した。原発性腫瘍のサイズは切除までに測定した。外科切除から１４日後、肺における腫瘍コロニーの数をカウントした。対照として同じ種類の抗体（ｍＩｇＧ１）を使用した。

【0103】

図１２Ａ〜１２Ｂにマウス実験モデルの結果を示す。モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６を投与したマウスにおける肺転移の平均数は対照と比較して少なかった。モノクローナル抗体３５Ｂ６は肺転移を有意に阻害した。

【0104】

図１３Ａ〜１３Ｃは、マウス自然発症モデルにおける以下のフォーマット：原発性腫瘍サイズの経日変化、肺転移コロニーの数、および体重変化の結果を示す。モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６のいずれかを投与したマウスにおける原発性腫瘍のサイズは、対照マウスと比較して小さかった。したがって、その結果から、モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６によって腫瘍増殖を阻害する可能性があることが示される。対照群における５匹のマウスのうち２匹が非常に多数の肺転移コロニーを示したので、３５Ｂ６に関しては統計学的有意差が示されなかった。しかし、モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６を投与したマウスにおける肺転移の平均数は対照抗体と比較して少なかった。したがって、モノクローナル抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６は癌転移を阻害することが示される。

【0105】

６．６．３．マウス関節リウマチモデルにおける抗ＲＧＤ抗体の治療効果
ＩＩ型コラーゲン特異的モノクローナル抗体（ＩＢＬ、日本）のカクテルを供給元のプロトコールに従って使用して、マウスに関節リウマチを誘発した。すなわち、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）にＩＩ型コラーゲン特異的モノクローナル抗体のカクテルを注射し、注射の３日後、ＬＰＳを注射して関節リウマチを発症させた。抗ＲＧＤモノクローナル抗体または正常ハムスターＩｇＧ（ＮＨＧ）をコラーゲン抗体注射の前日からコラーゲン抗体注射の６日後まで全８回２００μｇ／マウス／日で腹腔内に投与した。マウスをコラーゲン抗体注射の日から毎日観察し、各足を関節の紅斑および腫脹に基づいて０から４までに類別することによって関節炎のレベルをスコア付けした（０＝紅斑または腫脹なし；１＝つま先などの１つの小さい関節に紅斑または腫脹あり；２＝小さい関節の２つ以上に紅斑または腫脹あり、または手首または足首などのより大きい関節に紅斑または腫脹あり；３＝足全体に紅斑または腫脹あり；４＝足全体に完全な紅斑または腫脹あり；マウス（４足）１匹の最大スコア１６）。

【0106】

その結果を図１４に示す。対照ＮＨＧを注射したマウスは高スコアを示し、関節リウマチを発症したが、抗ＲＧＤ抗体３３Ｅ１０または３５Ｂ６をそれぞれ注射したマウスは低スコアを示し、関節リウマチの発症は完全に遮断された。したがって、この結果に照らして、抗ＲＧＤ抗体は関節リウマチに対して予防的および治療的効果を有することが示された。

【0107】

６．６．４．マウス子宮内膜症モデルにおける抗ＲＧＤ抗体の治療効果
子宮内膜症の症状は、嚢胞形成、周囲の間質における炎症、子宮内膜腺上皮の異所的な増殖による平滑筋化生、神経新生および血管形成を示す。免疫組織化学的方法により、オステオポンチン（ＯＰＮ）がヒト子宮内膜症およびラット子宮内膜症モデルにおいて高度に発現されることが報告された。したがって、抗ＲＧＤ抗体（３３Ｅ１０）による動物モデル対する治療効果を子宮内膜症に対する新たな療法として調べた。

【0108】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性マウス（９週齢）を使用した。子宮内膜症モデルとして１８匹のマウスを準備した。右の子宮を切除し、子宮の２ｍｍ×２ｍｍ角の２つ小片を腹部に自己移植した。左の子宮は参照用に処置しなかった。マウス抗ＲＧＤ抗体（５００μｇ／頭部、ｉｐ）を９匹のマウス（処置群）に週２回４週間（８回投与の全投与量：４０００μｇ／頭部）施した。対照群（マウス９匹）には抗体を投与しなかった。投与後、形成された嚢胞の数を確認し、組織学的検査によって病的変化を観察した。

【0109】

その結果を表１に示した。２つの群に体重の差はなかった。処置群の出現した子宮内膜症の数は対照群よりも著しく少なかった。形成された嚢胞の重量は明らかに減少し、処置群は対照群の平均して約１／３であった。免疫組織化学的検査により、子宮内膜腺上皮におけるＯＰＮ発現が抗体処置によって抑制されることを確認することができた。処置群の間質における平滑筋の厚さは、対照群の１／２に減少した。

【0110】

マウス子宮内膜症モデルは抗ＲＧＤ抗体の投与による治療効果を示した。

【0111】

【表1】

【0112】

６．７．非ヒト抗体のヒト化
６．７．１．マウス３３Ｅ１０可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
７．５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＴＩＬ培地Ｉ（免疫生物研究所、群馬、日本）中、３７℃でマウス３３Ｅ１０ハイブリドーマ細胞を増殖させた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を供給元のプロトコールに従って使用して、約３×１０^６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給元のプロトコールに従って使用して、オリゴｄＴプライマーによるｃＤＮＡを合成した。３５Ｂ６重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、マウスγ−１およびκ鎖定常領域にそれぞれアニーリングする３’プライマー、ならびにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔにおいて提供されるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号８４）を使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて増幅した。ＶＨのＰＣＲ増幅については、３’プライマーは配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号８５）を有する。ＶＬのＰＣＲ増幅については、３’プライマーは配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号８６）を有する。増幅されたＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして配列を決定した。可変領域のＤＮＡ配列決定をＴｏｃｏｒｅ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）で実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンの配列を決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域に相同である固有の配列を同定した。３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図１５および１６に示す。

【0113】

６．７．２．キメラ３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κ抗体の構築
３３Ｅ１０ ＶＨをコードする遺伝子は、ＰＣＲにより、鋳型として３３Ｅ１０ ＶＨ ｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＴ−３’（ＳｐｅＩ部位は下線付き）（配列番号８７）および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位は下線付き）（配列番号８８）を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した（図１７）。同様に、３３Ｅ１０ ＶＬをコードする遺伝子は、ＰＣＲにより、鋳型として３３Ｅ１０ ＶＬ ｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧ−３’（ＮｈｅＩ部位は下線付き）（配列番号８９）および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＧＧＡＴＴＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’（ＥｃｏＲＩ部位は下線付き）（配列番号９０）を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した（図１８）。３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖系列ＪＨ３およびＪκ１配列に由来するものであった。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨについて）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬについて）で消化し、ヒトγ−１およびκ定常領域を担う哺乳動物発現ベクター中にクローニングしてキメラ３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κ抗体を産生した。得られた発現ベクターｐＣｈ３３Ｅ１０の概略構造を図１９に示す。

【0114】

６．７．３．ヒト化３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の作製
３３Ｅ１０可変領域のヒト化をＱｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９〜１００３３、１９８９）に概説されているとおりに実施した。まず、コンピュータプログラムを利用して３３Ｅ１０可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、３３Ｅ１０ ＶＨと高い相同性を有するＵ０３４００（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のヒトアミノ酸配列を、ヒト化３３Ｅ１０ ＶＨのフレームワークを提供するアクセプターとして選択した。同様に、Ｘ７２４５２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のヒトアミノ酸配列を３３Ｅ１０ ＶＬのヒト化用のアクセプターとして選択した。

【0115】

コンピュータモデルがＣＤＲとの有効な接触を提案したフレームワーク位置で、ヒトフレームワークアミノ酸をマウス３３Ｅ１０可変領域のアミノ酸で置換した。３０位および４８位でこれを実施して、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＨを作製した（図２０）。軽鎖については、置き換えることを必要とせずに、ヒト化３３Ｅ１０（Ｈｕ３３Ｅ１０）ＶＬを作製した（図２１）。３３Ｅ１０、設計したＨｕ３３Ｅ１０およびヒトアクセプターアミノ酸配列のアライメントをＶＨについては図２０、ＶＬについては図２１に示す。

【0116】

Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬのぞれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナルおよび適切な制限酵素部位を含むエキソンとして設計して、続いて哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれヒト生殖系列ＪＨ４およびＪκ１配列に由来するものであった。マウス３３Ｅ１０ ＶＬ遺伝子のシグナルペプチド配列は、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄシグナルペプチド予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｂｐｃｕ３６．ｌｅｅｄｓ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｔ＿ａｎａｌｙｓｉｓ／Ｓｉｇｎａｌ．ｈｔｍｌ）により、正確な切断に部分最適であることが示された。したがって、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアによって効率的かつ正確に切断すると予測された、マウスモノクローナル抗体３５Ｂ６のＶＬ遺伝子のシグナルペプチド（ジーンテクノサイエンス）をＨｕ３３Ｅ１０ ＶＬエキソンにおいて使用した。Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨエキソンにおけるシグナルペプチド配列は、対応するマウス３３Ｅ１０ ＶＨ配列に由来するものであった。ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアにより、Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨ遺伝子のシグナルペプチドが効率的かつ正確に切断されることが示された。

【0117】

Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、Ｈｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９〜１０３５、１９９８）に概説されているとおり、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、いくつかの重複している合成オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２および１２３）の伸長およびＰＣＲ増幅によって構築した。Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築に使用されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ図２２および図２３に記載する。Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子におけるオリゴヌクレオチドの位置をそれぞれ図２４および２５を示す。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター中にクローニングして配列を決定した。ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨについて）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬについて）で消化した後、Ｈｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子を哺乳動物発現ベクター中の対応する部位にサブクローニングしてヒトＩｇＧ１／κの形で産生した。得られた発現ベクターｐＨｕ３３Ｅ１０の概略構造を図１９に示す。得られたＨｕ３３Ｅ１０ ＶＨおよびＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図２６（配列番号５２）および図２７（配列番号５４）に示す。

【0118】

６．７．４．キメラおよびヒト化３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κの一過性発現
キメラおよびヒト化３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κ抗体は、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ９、２００２）に従ってポリエチレンイミンを使用してｐＣｈ３５Ｂ６およびｐＨｕ３５Ｂ６プラスミドＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることによって一過性に発現させる。一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、７．５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、３７℃で２日間維持する。培養上清におけるＣｈ３３Ｅ１０およびＨｕ３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κ抗体のそれぞれの発現レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中２，０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を１００μｌ／ウェルで加えて４℃で一晩コーティングし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）を３００μｌ／ウェルで加えて室温で１時間ブロッキングする。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中で適切に希釈した試料を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートにアプライする。ヒト骨髄腫血清（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）から精製したヒトＩｇＧ１／κ抗体を標準物質として使用する。ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、２，０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を１００μｌ／ウェルで使用して、結合した抗体を検出する。室温で１時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質（ｂｉｏＷＯＲＬＤ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＯＨ）を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を実施する。２％シュウ酸を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を停止させる。４０５ｎｍでの吸光度を読み取る。

【0119】

６．７．５．ヒト化３５Ｂ６の特徴付け
ＥＬＩＳＡにより、ヒト化３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κの親和性をキメラ３３Ｅ１０ ＩｇＧ１／κと比較する。抗原として、ウシ血清アルブミンとコンジュゲートした合成オリゴペプチド（Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）（ｈＯＰＮ５−ＢＳＡ）を使用する。典型的な実験において、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ ｈＯＰＮ−ＢＳＡを１００μｌ／ウェルで加えて４℃で一晩コーティングし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ／ウェルで加えて室温で１時間ブロッキングする。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ中で適切に希釈した試料を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートにアプライする。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、２，０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を１００μｌ／ウェルで使用して、結合した抗体を検出する。室温で１時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を実施し、２％シュウ酸を１００μｌ／ウェルで添加することによって停止させる。４０５ｎｍでの吸光度を読み取る。

【0120】

６．７．６．マウス３５Ｂ６可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
７．５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）を含有するＴＩＬ培地Ｉ（免疫生物研究所、群馬、日本）中、３７℃でマウス３５Ｂ６ハイブリドーマ細胞を増殖させた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を供給元のプロトコールに従って使用して、約３×１０^６ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給元のプロトコールに従って使用して、オリゴｄＴプライマーによるｃＤＮＡを合成した。３５Ｂ６重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、マウスγ−１およびκ鎖定常領域にそれぞれアニーリングする３’プライマー、ならびにＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔにおいて提供されるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号８４）を使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて増幅した。ＶＨのＰＣＲ増幅については、３’プライマーは配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１２４）を有する。ＶＬのＰＣＲ増幅については、３’プライマーは配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’（配列番号１２５）を有する。増幅されたＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングして配列を決定した。可変領域のＤＮＡ配列決定をＴｏｃｏｒｅ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）で実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンの配列を決定し、典型的なマウス重鎖および軽鎖可変領域に相同である固有の配列を同定した。３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図２８および２９に示す。

【0121】

６．７．７．キメラ３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κ抗体の構築
３５Ｂ６ ＶＨをコードする遺伝子は、ＰＣＲにより、鋳型として３５Ｂ６ ＶＨ ｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴＣ−３’（ＳｐｅＩ部位は下線付き）（配列番号１２６）および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣ−３’（ＨｉｎｄＩＩＩ部位は下線付き）（配列番号１２７）を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した（図３０）。同様に、３５Ｂ６ ＶＬをコードする遺伝子は、ＰＣＲにより、鋳型として３５Ｂ６ ＶＬ ｃＤＮＡ、５’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴ−３’（ＮｈｅＩ部位は下線付き）（配列番号１２８）および３’プライマーとして５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＧＴＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡ−３’（ＥｃｏＲＩ部位は下線付き）（配列番号１２９）を使用して、スプライスドナーシグナルおよび適切なフランキング制限酵素部位を含むエキソンとして作製した（図３１）。３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれマウス生殖系列ＪＨ１およびＪκ４配列に由来するものであった。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨについて）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬについて）で消化し、ヒトγ−１およびκ定常領域を担う哺乳動物発現ベクター中にクローニングしてキメラ３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κ抗体を産生した。得られた発現ベクターｐＣｈ３５Ｂ６の概略構造を図３２に示す。

【0122】

６．７．８．ヒト化３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の作製
３５Ｂ６可変領域のヒト化をＱｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：１００２９〜１００３３、１９８９）に概説されているとおりに実施した。まず、コンピュータプログラムを利用して３５Ｂ６可変領域の分子モデルを構築した。次に、ヒト可変領域配列に対する相同性検索に基づいて、３５Ｂ６ ＶＨと高い相同性を有するＺ４７２３０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のヒトアミノ酸配列を、ヒト化３５Ｂ６ ＶＨのフレームワークを提供するアクセプターとして選択した。同様に、Ｘ７２４７９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号）のヒトアミノ酸配列を３５Ｂ６ ＶＬのヒト化用のアクセプターとして選択した。

【0123】

コンピュータモデルがＣＤＲとの有効な接触を提案したフレームワーク位置で、ヒトフレームワークアミノ酸をマウス３５Ｂ６可変領域のアミノ酸で置換した。４８位、６６位、６７位、６８位、６９位および７１位でこれを実施して、ヒト化３５Ｂ６（Ｈｕ３５Ｂ６）ＶＨを作製した（図３３）。軽鎖については、４６位および６９位で置き換えて、ヒト化３５Ｂ６（Ｈｕ３５Ｂ６）ＶＬを作製した（図３４）。３５Ｂ６、設計したＨｕ３５Ｂ６およびヒトアクセプターアミノ酸配列のアライメントをＶＨについては図３３、ＶＬについては図３４に示す。

【0124】

Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬのぞれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナルおよび適切な制限酵素部位を含むエキソンとして設計して、続いて哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬエキソンのスプライスドナーシグナルは、それぞれヒト生殖系列ＪＨ６およびＪκ１配列に由来するものであった。マウス３５Ｂ６ ＶＨ遺伝子のシグナルペプチド配列は、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄシグナルペプチド予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｍｂｐｃｕ３６．ｌｅｅｄｓ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｔ＿ａｎａｌｙｓｉｓ／Ｓｉｇｎａｌ．ｈｔｍｌ）により、正確な切断に部分最適であることが示された。したがって、ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアによって効率的かつ正確に切断すると予測された、マウスモノクローナル抗体３５Ｅ１０のＶＨ遺伝子のシグナルペプチド（ジーンテクノサイエンス）をＨｕ３５Ｂ６ ＶＬエキソンにおいて使用した。ヒト化Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＬエキソンにおけるシグナルペプチド配列は、対応するマウス３５Ｂ６ ＶＬ配列に由来するものであった。ＳＩＧ−Ｐｒｅｄソフトウェアにより、Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＬ遺伝子のシグナルペプチドが効率的かつ正確に切断されることが示された。

【0125】

Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、Ｈｅら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９〜１０３５、１９９８）に概説されているとおり、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、いくつかの重複している合成オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号９１、９２、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１０７、１０８、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４および１５５）の伸長およびＰＣＲ増幅によって構築した。Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築に使用されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ図３５および図３６に記載する。Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子におけるオリゴヌクレオチドの位置をそれぞれ図３７および３８を示す。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してＰＣＲ増幅断片をゲル精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター中にクローニングして配列を決定した。ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨについて）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬについて）で消化した後、Ｈｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子を哺乳動物発現ベクター中の対応する部位にサブクローニングしてヒトＩｇＧ１／κの形で産生した。得られた発現ベクターｐＨｕ３５Ｂ６の概略構造を図３２に示す。得られたＨｕ３５Ｂ６ ＶＨおよびＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を推定アミノ酸配列と一緒にそれぞれ図３９（配列番号６８）および図４０（配列番号７０）に示す。

【0126】

６．７．９．キメラおよびヒト化３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κの一過性発現
キメラおよびヒト化３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κ抗体は、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ９、２００２）に従ってポリエチレンイミンを使用してｐＣｈ３５Ｂ６およびｐＨｕ３５Ｂ６プラスミドＤＮＡをそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることによって一過性に発現させた。一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、７．５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、３７℃で２日間維持した。培養上清におけるＣｈ３５Ｂ６およびＨｕ３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κ抗体のそれぞれの発現レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中２，０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を１００μｌ／ウェルで加えて４℃で一晩コーティングし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）を３００μｌ／ウェルで加えて室温で１時間ブロッキングした。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ（１％Ｓｋｉｍ Ｍｉｌｋおよび０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）中で適切に希釈した試料を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートにアプライした。ヒト骨髄腫血清（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）から精製したヒトＩｇＧ１／κ抗体を標準物質として使用した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、２，０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を１００μｌ／ウェルで使用して、結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質（ｂｉｏＷＯＲＬＤ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＯＨ）を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を実施した。２％シュウ酸を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を停止させた。４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。

【0127】

６．７．１０．ヒト化３５Ｂ６の特徴付け
ＥＬＩＳＡにより、ヒト化３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κの親和性をキメラ３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κと比較した。抗原として、ウシ血清アルブミンとコンジュゲートした合成オリゴペプチ（Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ）（配列番号７９）（ｈＯＰＮ５−ＢＳＡ）を使用した。典型的な実験において、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ ｈＯＰＮ−ＢＳＡを１００μｌ／ウェルで加えて４℃で一晩コーティングし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ／ウェルで加えて室温で１時間ブロッキングした。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＥＬＩＳＡ Ｂｕｆｆｅｒ中で適切に希釈した試料を１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートにアプライした。ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、２，０００倍希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトγ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を１００μｌ／ウェルで使用して、結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベートし、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、ＡＢＴＳ基質を１００μｌ／ウェルで添加することによって発色を実施し、２％シュウ酸を１００μｌ／ウェルで添加することによって停止させた。４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。図４１Ａ、４１Ｂに示すとおり、ヒト化３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κとｈＯＰＮ５−ＢＳＡの結合は、キメラ３５Ｂ６ ＩｇＧ１／κに類似し（図４１Ａ）、または識別不可能であった（図４１Ｂ）。この結果から、マウス３５Ｂ６抗体のヒト化に成功したことが示される。

【0128】

７．寄託
本明細書で３３Ｅ１０および３５Ｂ６と称した、マウス抗ＲＧＤモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、微生物の寄託に関するブダペスト条約に従って、２００５年１０月２７日、茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６（郵便番号：３０５−８５６６）にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託し、それぞれアクセッション番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４０およびＦＥＲＭ ＢＰ−１０４４１を受けた。すべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【産業上の利用可能性】

【0129】

８．産業上の利用可能性
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ＲＧＤタンパク質の機能を阻害して、癌、例えば、癌細胞の増殖または転移、および炎症性疾患、例えば、関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、真性糖尿病、動脈硬化症、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫疾患などに対して治療効果を発揮する。本発明の抗ＲＧＤ抗体および抗インテグリン抗体の両方を含む医薬組成物は、癌および炎症性疾患に対してより改善された治療効果を及ぼす。

【0130】

９．配列の表
本明細書を通じて参照される配列を以下に要約する。

【0131】

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】