特許 5738291 インスリンリンカー複合体を含むプロドラッグ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5738291

(24)【登録日】2015年5月1日

(45)【発行日】2015年6月24日

(54)【発明の名称】インスリンリンカー複合体を含むプロドラッグ

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/28 20060101AFI20150604BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20150604BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20150604BHJP

   A61K 47/48 20060101ALI20150604BHJP

   C07K 14/62 20060101ALN20150604BHJP

【ＦＩ】

   A61K37/26

   A61K9/10

   A61K9/08

   A61K47/48

   !C07K14/62

【請求項の数】58

【全頁数】78

(21)【出願番号】特願2012-522188(P2012-522188)

(86)(22)【出願日】2010年7月30日

(65)【公表番号】特表2013-500951(P2013-500951A)

(43)【公表日】2013年1月10日

(86)【国際出願番号】EP2010061159

(87)【国際公開番号】WO2011012718

(87)【国際公開日】20110203

【審査請求日】2013年7月16日

(31)【優先権主張番号】09167027.3

(32)【優先日】2009年7月31日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】09174525.7

(32)【優先日】2009年10月29日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】09179336.4

(32)【優先日】2009年12月15日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】09179818.1

(32)【優先日】2009年12月18日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】397056695

【氏名又は名称】サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ハーラルト・ラオ

(72)【発明者】

【氏名】フェリクス・クレーマン

(72)【発明者】

【氏名】ウルリッヒ・ヘルゼル

(72)【発明者】

【氏名】ジルフィア・カーデン−ファグト

(72)【発明者】

【氏名】トルベン・レースマン

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・ヴェッゲ

【審査官】 渡邊 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０１０４２８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０１５０９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／０９５４７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１４８８３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／０１２７１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Adv Drug Deliv Rev., (2002) Vol.54 No.4, p.505-30.

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ９／００

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ｃ０７Ｋ １４／６２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インスリンリンカー複合体Ｄ−Ｌ［式中、
Ｄは、インスリン部分を表し；そして
−Ｌは、式（Ｉ）

【化1】

（式中、点線は、アミド結合を形成することによるインスリンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ³Ｒ^3a）；又はＮ（Ｒ³）であり；
Ｒ^1aは、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より選ばれ；
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ^2aは、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；
Ｒ^2bは、Ｃ_1-4アルキルであり；
Ｒ³は、Ｈであり；
Ｒ^3aは、Ｎ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴であり；
Ｒ⁴は、Ｈである）
によって表される生物活性のないリンカー部分−Ｌ¹であり、
ここにおいて、Ｒ²及びＲ⁴のいずれか一方が、Ｌ²−Ｚで置換され、そしてここにおいて、
Ｌ²は、−Ｃ_1-20アルキレン−Ｙであり、ここで
Ｙは、以下の構造

【化2】

（式中、点線は、それぞれ、Ｌ²中のアルキレン部分及びＺへの結合を示し、上記において硫黄原子がＬ²中のアルキレン部分へ結合し、窒素原子がＺに結合する）であり；そして
Ｚは、ヒドロゲルである］
で表わされるプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩。

【請求項2】

式（Ｉ）において、Ｒ²がＬ²−Ｚによって置き換えられる、請求項１に記載のプロドラッグ。

【請求項3】

式（Ｉ）において、ＸがＮ（Ｒ³）である、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。

【請求項4】

式（Ｉ）において、ＸがＣ（Ｒ³Ｒ^3a）である、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。

【請求項5】

インスリン部分が窒素Ｎα^A1を通してＬ¹に結合された、請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項6】

インスリンが組換え型のヒトインスリンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項7】

組換え型のヒトインスリンがインスリン部分のリシン側鎖の窒素を通してＬ¹に結合された、請求項６に記載のプロドラッグ。

【請求項8】

ヒドロゲルＺが生分解性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項9】

ヒドロゲルが、加水分解により分解可能な結合によって相互連結された骨格鎖部分で構成される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項10】

骨格鎖部分が１ｋＤａから２０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する、請求項９に記載のプロドラッグ。

【請求項11】

骨格鎖部分がクロスリンカー部分を通して一緒に連結され、各クロスリンカー部分が加水分解により分解可能な結合の少なくとも２つによって終了する、請求項９又は１０に記載のプロドラッグ。

【請求項12】

クロスリンカー部分が０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量を有する、請求項１１に記載のプロドラッグ。

【請求項13】

Ｌ²が骨格鎖部分に連結される、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項14】

式（ＩＩａ）

【化3】

（式中、Ｎε−インスリンは、１つのリシン側鎖を介して連結されたインスリンのことである）の請求項１に記載のプロドラッグ。

【請求項15】

式（ＩＩｂ）

【化4】

の請求項１又は２に記載のプロドラッグ。

【請求項16】

ヒドロゲルが生分解性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである、請求項１４又は１５に記載のプロドラッグ。

【請求項17】

ヒドロゲルが加水分解により分解可能な結合によって相互連結された骨格鎖部分で構成される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項18】

骨格鎖部分は、以下の式：

【化5】

（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む、請求項９〜１３、１７のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項19】

骨格鎖部分が以下の式：

【化6】

（式中、ｎは５〜５０の整数であり、そして点線は残りの分子への結合を示す）
の構造を含む、請求項９〜１３、１７、１８のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項20】

骨格鎖部分が超分枝部分Ｈｙｐを含む、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のプロド
ラッグ。

【請求項21】

骨格鎖部分が、以下の式：

【化7】

（式中、点線は分子の残りへの結合を示し、そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む、請求項２０に記載のプロドラッグ。

【請求項22】

骨格鎖部分が、以下の式：

【化8】

（式中、点線の１つは、超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は、分子の残りへの結合を示し；そして
ｍは２〜４の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合されている、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項23】

骨格鎖部分が、以下の式：

【化9】

（式中、アスタリスクでマークされた点線は、ヒドロゲルと請求項１〜１３のいずれか１項に記載のチオスクシンイミド基のＮとの間の結合を示し、
他の点線はＨｙｐへの結合を示し、そして
ｐは、０〜１０の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している、請求項１７又は２２に記載のプロドラッグ。

【請求項24】

骨格鎖部分が、以下の構造

【化10】

（式中、ｑは３〜１００の整数である）
を有するクロスリンカー部分を通して一緒に連結されている、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項25】

マイクロ粒子の形態の請求項１〜２４のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項26】

マイクロ粒子が２０〜１００マイクロメートルの直径を有する、請求項２５に記載のプロドラッグ。

【請求項27】

マイクロ粒子が内径０．６ｍｍより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項２５に記載のプロドラッグ。

【請求項28】

マイクロ粒子が内径０．３ｍｍより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項２５に記載のプロドラッグ。

【請求項29】

マイクロ粒子が内径０．２ｍｍより小さな注射針による注射によって投与することができる請求項２５に記載のプロドラッグ。

【請求項30】

式（ＩＩＩａ）

【化11】

（式中、Ｎε−インスリンは、１つのリシン側鎖を介して連結されたインスリンのことである）
のインスリン−リンカー複合体。

【請求項31】

式（ＩＩＩｂ）

【化12】

のインスリン−リンカー複合体。

【請求項32】

請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を薬学的に許容しうる賦形剤と共に含む薬学的組成物。

【請求項33】

薬学的組成物が乾燥している、請求項３２に記載の薬学的組成物。

【請求項34】

薬学的組成物が凍結乾燥によって乾燥される、請求項３３に記載の薬学的組成物。

【請求項35】

インスリンヒドロゲルプロドラッグが、１回の適用で少なくとも３日間、治療有効量のインスリンを提供するように組成物で十分に投与される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項36】

単回投与組成物である、請求項３２〜３５のいずれ１項に記載の組成物。

【請求項37】

反復投与組成物である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項38】

１つ又はそれ以上のさらなる生物活性物質を、その遊離形態で；プロドラッグとして、特にヒドロゲルプロドラッグとしてのいずれかで含み；そして１つ又はそれ以上のさらなる生物活性物質が、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリブリド、グリピジド、グリメピリドなどのようなスルホニル尿素；レパグリニドなどのようなメグリチニド；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルコース−インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）、エキセンジン、及びジペプチルプロテアーゼ阻害剤（ＤＰＰＩＶ）；メトホルミンなどのようなビグアニド；ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン（ＭＣＣ−５５５として知られる）、２−［２−［（２Ｒ）−４−ヘキシル−３,４−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−２−イル］エトキシ］−ベンゼン酢酸などのようなチアゾリジンジオン；ＧＷ２５７０など；ターグレチン、９−ｃｉｓ−レチノイン酸などのようなレチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲ）モジュレーター；ＩＮＳ−１、ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼａ阻害剤、フルクトース−１,６−ビスホスファターゼ阻害剤などのような他のインスリン抵抗性改善剤；通常のインスリン、又は速効型、中間型及び持続型インスリン、及び吸入用インスリン；Ｌ−７８３２８１、ＴＥ−１７４１１など；Ｔ−１０９５、Ｔ−１０９５Ａ、フロリゼンなどのようなＮａ−グルコース共輸送体阻害剤；プラムリンチドなどを含むがそれらに限定されないアミリン作動剤；ＡＹ−２７９９５５などのようなグルカゴン拮抗剤；オルリスタットのような抗肥満剤；膵リパーゼ阻害剤；シブトラミン；ノルエピネフリン及びドーパミン；成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子；オキシントモジュリン及びグレリンモジュレーター；ベンズフェタミン、フェンメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、マジンドール、シブトラミン、フェニルプロパノールアミン又はエフェドリンのような食欲抑制剤；キパジン、フルオキセチン、セルトラリン、フェンフルラミン、又はデクスフェンフルラミンのような食欲抑制剤；アポモルヒネのような食欲抑制剤；Ｈ３受容体モジュレーターのような食欲抑制剤；ベータ−３アドレナリン作動剤及び脱共役タンパク質機能の刺激剤のようなエネルギー消費の促進剤；レプチン及びメトレレプチン；ニューロペプチドＹ拮抗剤；メラノコルチン−１、３及び４受容体モジュレーター；コレシストキニン作動剤；デヒドロエピアンドロステロンのようなアンドロゲン及びエチオコランジオンのような誘導体；テストステロン；オキサンドロロンのようなアナボリックステロイド、及びステロイドホルモン；ガラニン受容体拮抗剤；毛様体神経栄養因子のようなサイトカイン剤；アミラーゼ阻害剤；からなる群より選ばれる、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項39】

請求項３２〜３８に記載の薬学的組成物を含む容器。

【請求項40】

容器がデュアルチャンバー型注射器である、請求項３９に記載の容器。

【請求項41】

請求項３２及び３５〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を含む懸濁剤。

【請求項42】

請求項３３又は３４に記載の乾燥薬学的組成物を、再構成溶液を加えることによって再構成する工程を含む、請求項４１に記載の懸濁剤の製造方法。

【請求項43】

注射針、並びに注射針と共に使用するための再構成溶液及び請求項３３又は３４に記載の乾燥組成物を含む容器を含むパーツのキット。

【請求項44】

容器がデュアルチャンバー型注射器であり、そしてデュアルチャンバー型注射器の二チャンバーの一方が乾燥薬学的組成物を含み、そして該デュアルチャンバー型注射器の第２のチャンバーが再構成溶液を含む、請求項４３に記載のパーツのキット。

【請求項45】

薬剤として使用するための請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項46】

薬剤として使用するための請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

【請求項47】

インスリンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための請求項１〜２９のいずれか１項に記載のプロドラッグ。

【請求項48】

インスリンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための請求項３２〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

【請求項49】

インスリン−リンカー試薬Ｄ−Ｌ^*［式中、
Ｄは、インスリン部分を表し；そして
Ｌ^*は、式（ＩＶ）

【化13】

（式中、点線は、アミド結合の形成によるインスリンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ³Ｒ^3a）；又はＮ（Ｒ³）であり；
Ｒ^1aは、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ^2aは、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；
Ｒ^2bは、Ｃ_1-4アルキルであり；
Ｒ³は、Ｈであり；
Ｒ^3aは、Ｎ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴であり；
Ｒ⁴は、Ｈである）
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいて、Ｒ²及びＲ⁴のいずれか一方が、Ｌ^2*で置換され、
Ｌ^2*は、−Ｃ_1-20アルキレン−ＳＨである］。

【請求項50】

式（ＩＶ）において、Ｒ²がＬ^2*によって置き換えられる、請求項４９に記載のインスリン−リンカー試薬。

【請求項51】

式（ＩＶ）において、ＸがＮ（Ｒ³）である、請求項４９又は５０に記載のインスリン−リンカー試薬。

【請求項52】

式（ＩＶ）において、ＸがＣ（Ｒ³Ｒ^3a）である、請求項４９又は５０に記載のインスリン−リンカー試薬。

【請求項53】

（ａ）マレイミド官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で請求項４９〜５２のいずれか１項に記載のインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生じさせる工程；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で３４Ｄａ〜５００Ｄａのチオール含有化合物で処理する工程；
を含む、請求項１〜２９及び４５、４７のいずれか１項に記載のプロドラッグの製造方法。

【請求項54】

（ａ）請求項２５に記載のプロドラッグをマイクロ粒子の形態に調製する工程；
（ｂ）マイクロ粒子を篩別する工程；
（ｃ）プロドラッグビーズ径２５〜８０μｍの画分を選別する工程；
（ｄ）工程（ｃ）のビーズ画分を注射に適した緩衝水溶液中に懸濁する工程；
を含む、注射針で注射可能なプロドラッグの調製方法。

【請求項55】

請求項５４に記載の方法から入手可能な注射針で注射可能なプロドラッグ。

【請求項56】

内径３００μｍ未満の注射針を通して注射可能な請求項５５に記載のプロドラッグ。

【請求項57】

内径２２５μｍ未満の注射針を通して注射可能な請求項５５に記載のプロドラッグ。

【請求項58】

内径１７５μｍ未満の注射針を通して注射可能な請求項５５に記載のプロドラッグ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロドラッグ、前記プロドラッグを含む薬学的組成物及びインスリンによって治療することができる疾患又は障害を治療若しくは予防する薬剤としてのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

インスリン療法は、治療域が狭いので、非常に厳密なレベル内にインスリン薬物放出を保つ必要性が高いことを特徴としており、そして高インスリン血症の副作用は命にかかわる可能性がありうる。糖尿病の人々の具体的な要求を満たすため、さまざまな作用プロファイルを有する多くのインスリン製剤が商業化されている。速効型インスリン類似体は、食物摂取後の血漿グルコースのピークを制御するために食事の直前に投与されるのに対して、持効型インスリン類似体は、安定した基礎インスリンレベルを得るために典型的に１日１〜２回投与される。

【0003】

従って、投与間の期間全体を通してインスリンを連続的に放出する、インスリンの新規な持効型製剤が必要であることは明らかである。

【0004】

特許文献１は、標準的な毎日の基礎インスリン注射と比較して投薬頻度が減る可能性を有するインスリン放出可能なヒドロゲルを記載している。しかし、２日にわたる期間の間、厳密なインスリン分泌制御を確保するには速過ぎる速度でインスリンが放出される。実際、インスリンは約３０時間の半減期で放出され、それは、定常状態でピーク対トラフ比（peak to trough ratio）を２より下にするためには少なくとも３０時間毎にプロドラッグを投与しなければならないことを意味している。

【0005】

インスリンの可逆的ポリマープロドラッグ複合体（conjugate）を製造する概念は、Shechter等によって探究されており、そして科学論文及び特許出願に記載されている（例えば非特許文献１及び特許文献２）。インスリンは、フルオレニル−リンカーを通して４０ｋＤａのＰＥＧポリマーに結合される。前記リンカー分子の加水分解により約３０時間の半減期でインスリンが放出され、それは、定常状態でピーク対トラフ比が２より下であるためにはプロドラッグを少なくとも３０時間毎に投与しなければならないことを意味している。

【0006】

インスリン投薬頻度を減らす別の試みが行われている。非特許文献２は、最初にインスリン分子を永続的にＰＥＧ化し、次いで、その後にＰＬＧＡマイクロ粒子中のＰＥＧ化インスリンをマイクロカプセル化することによって週に１回インスリンを産生する方法を記載している。この場合、インスリンは、高分子量ポリマー単位による永続的修飾を通して実質的に構造変化を受ける。このような高分子量改変インスリンは、受容体結合の減少により有効性の低下を示すことがあり、そして皮下組織に高濃度の高分子量インスリンが長く存在するため、脂肪組織萎縮のような注射部位反応を示すことがある。さらに、このようなＰＥＧ化インスリンは、より低い分布体積を示し、それは糖尿病の治療に特有の欠点である。

【0007】

それにもかかわらず、インスリンのＰＥＧ化は、ＰＬＧＡポリマー処方物中でペプチドを劣化から保護するのに役立つことが明らかである。分解しているＰＬＧＡ処方物中でペプチドをアシル化から保護するＰＥＧ化の効果は、オクトレオチドについて非特許文献３によって示された。

【0008】

タンパク質のＰＬＧＡカプセル化により、ポリマーエステルとペプチド又はタンパク質アミノ基との副反応が生じることわかっている。中性ｐＨの緩衝液に処方物を曝露した後、乳酸アシル化生成物が観察された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。

【0009】

インスリンについては具体的に、非特許文献７（また、非特許文献８参照）によってポリマー処方物の有害効果が示されている。

【0010】

さらにまた、インスリンは、分子中の３つのジスルフィド架橋の存在に関して容易に副反応を受けることが知られている。例えば、インスリンは、ジスルフィド結合切断によってＡ及びＢ鎖に分解することがあり、又はジスルフィド相互変換反応のため二量体若しくはオリゴマーが形成されることがある。このようなジスルフィド再構成（reshuffling）は、インスリン分子がランダム的なやり方で密接に接触するよう強制された場合に特に起こりやすい。インスリン分子のこの固有の不安定性により、持効型デポ剤（long-acting depot）の開発における進展は有意に妨げられ、そして広範なジスルフィド交換に起因する種々の分解生成物を生じることがよく知られている非晶質沈殿と同様のやり方でインスリンをカプセル化する場合、他のポリマー処方物の使用は回避されてきた。

【0011】

従って、高分子量単位の永続的結合によって又はデポ剤中に存在している間に分子に構造的損傷を生じることによってインスリン薬力学を損なうことなく持効型インスリンを開発する挑戦が、残っている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＷＯ−Ａ ２００６／００３０１４

【特許文献2】ＷＯ−Ａ ２００４／０８９２８０

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008(70), 19-28

【非特許文献2】Hinds et al., Journal of Controlled Release, 2005 (104), 447-460

【非特許文献3】D. H. Na et al., AAPS PharmSciTech 2003, 4 (4) Article 72

【非特許文献4】G. Zhu et al., Nature Biotechnology 18 (2000) 52-57

【非特許文献5】A. J. Domb et al., Pharm. Res. 11 (1994) 865-868

【非特許文献6】A. Lucke et al., Pharm. Res. 19 (2002) 175-181

【非特許文献7】P. G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 4 (1999) 633-642

【非特許文献8】P. G. Shao et al., Pharm. Dev. Technol. 5 (2000) 1-9参照

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

従って、本発明の目的は、上記の必要を少なくとも部分的に満たすインスリン含有プロドラッグを提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0015】

目的は、インスリンリンカー複合体Ｄ−Ｌ［式中、
Ｄは、インスリン部分を表し；そして
−Ｌは、式（Ｉ）

【化1】

（式中、点線は、アミド結合を形成することによるインスリンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ³Ｒ^3a）；又はＮ（Ｒ³）であり；
Ｒ^1a、Ｒ^3aは、Ｈ、ＮＨ（Ｒ^2b）、Ｎ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ³、Ｒ⁴は、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のない（non-biologically active）リンカー部分−Ｌ¹であり、
ここにおいて、Ｌ¹は、１つのＬ²−Ｚで置換され、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられず、そしてここにおいて、
Ｌ²は、単化学結合又はスペーサーであり；そして
Ｚは、ヒドロゲルである］
を含むプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩によって達成される。

【0016】

ここで、驚くべきことに、本発明のプロドラッグは、投与間に少なくとも２日の期間にわたって構造的に無損傷の形態で皮下デポ剤からインスリンを放出しうることが発見された。さらなる利点として放出されたインスリンの構造完全性は、インスリン分子の分子間接触を最小限にする十分に水和されたポリマーマトリックスによって提供することができ、そしてインスリンとポリマーマトリックスの間の自己切断型プロドラッグリンカーによって持続的放出が可能となりうる。

【0017】

従って、現在の持効型インスリンより少ない頻度で本発明のプロドラッグ形態のインスリンを投与することが可能であるはずである。さらなる利点は、ピーク対トラフ比が小さくなるはずであり、これにより低血糖エピソードのリスクが非常に低下する。これは、インスリンの血漿レベル、そして結果的に血糖の最適制御を維持すること可能にしながら患者の注射頻度を減らすのに役立ちうる。

【0018】

本発明による「インスリン」は、組換え型ヒトインスリン、ランタス、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリシン、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、低分子量ＰＥＧに結合されたインスリンを意味する。低分子量ＰＥＧは、１０ｋＤａより小さな分子量を有する。生物活性のないリンカー（non-biologically active linker）に結合したインスリンは、「インスリン部分」と称する。

【0019】

本明細書に用いられる「インスリン類似体（insulin analogue）」とは、天然に存在するインスリン（naturally occurring insulin）の構造、例えばヒトインスリンのものから、天然に存在するインスリン中に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を除去及び／又は交換する及び／又は少なくとも１つのアミノ酸残基を付加することによって構造的に誘導することができる分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加及び／又は交換されたアミノ酸残基は、コード化可能なアミノ酸残基又は他の天然に存在する残基又は純粋に合成アミノ酸残基のいずれかであることができる。

【0020】

インスリン類似体は、Ｂ鎖の２８位が本来のＰｒｏ残基からＡｓｐ、Ｌｙｓ、又はｌｉｅの１つに改変されうるようなものであってもよい。別の態様において、Ｂ２９位のＬｙｓがＰｒｏに改変される。また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、そして好ましくはＧｌｙに改変されてもよい。さらにまた、Ｂ３位のＡｓｎは、Ｌｙｓ又はＡｓｐに改変されてもよい。さらに、インスリン類似体の例は、ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン；ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン類似体；ＰｈｅＢ１が除去されたインスリン類似体；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ末端延長を有するインスリン類似体及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ末端延長を有するインスリン類似体である。従って、１つ又は２つのＡｒｇがＢ１位に付加されてもよい。

【0021】

ｄｅｓＢ３０インスリンに関して、「ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」は、Ｂ３０アミノ酸残基が欠如した天然インスリン又はその類似体を意味する。同様に、「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０インスリン」又は「ｄｅｓＢ２９ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」は、Ｂ２９及びＢ３０アミノ酸残基が欠如した天然インスリン又はその類似体を意味する。「Ｂ１」「Ａ１」などに関して、それぞれ、インスリンのＢ鎖における１位のアミノ酸残基（Ｎ末端から数えて）及びインスリンのＡ鎖における１位のアミノ酸残基（Ｎ末端から数えて）を意味する。また、特定の位置のアミノ酸残基を、例えばＰｈｅＢ１と表してもよく、これはＢ１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味する。

【0022】

「生物活性のないリンカー」は、生物活性物質（biologically active agent）から誘導された薬物の薬理学的効果を示さないリンカーを意味する。

【0023】

「保護基」は、その後の化学反応において化学選択性を得るために合成中に分子の化学官能基を一時的に保護する部分のことである。アルコールの保護基は、例えば、ベンジル及びトリチルであり、アミンの保護基は、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル及びベンジルであり、そしてチオールについて、保護基の例は、２,４,６−トリメトキシベンジル、フェニルチオメチル、アセトアミドメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、トリフェニルメチル、３−ニトロ−２−ピリジルチオ、４−メチルトリチルである。

【0024】

「保護された官能基」は、保護基によって保護された化学官能基を意味する。

【0025】

「アシル化剤」は、場合により、酸塩化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール及びパラ−ニトロフェノールのような脱離基に結合された、アシル化反応においてアシル基を供給する構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の部分を意味する。

【0026】

「アルキル」は、直鎖又は分枝炭素鎖を意味する。アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。

【0027】

「アリール」は、複素環式環、例えばフェニル、チオフェン、インドリル、ナフチル、ピリジルを含む、単環式又は多環式又は縮合芳香環から誘導されたあらゆる置換基のことであり、それらは場合によりさらに置換されてもよい。

【0028】

「アシル」は、構造Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−の化学官能基を意味し、ここにおいて、Ｒはアルキル又はアリールである。

【0029】

「Ｃ_1-4アルキル」は、１〜４個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル ｔｅｒｔ−ブチル、又は例えば分子の２つの部分がアルキル基によって結合されている場合、−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ（Ｃ₂Ｈ₅）−、−Ｃ（ＣＨ₃）₂−を意味する。Ｃ_1-4アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。

【0030】

「Ｃ_1-6アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：Ｃ_1-4アルキル、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル；ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、又は例えば分子の２つの部分がアルキル基によって結合されている場合、−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ（ＣＨ₃）−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ（Ｃ₂Ｈ₅）−、−Ｃ（ＣＨ₃）₂−を意味する。Ｃ_1-6アルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。

【0031】

従って、「Ｃ_1-18アルキル」は、１〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味し、そして「Ｃ_8-18アルキル」は、８〜１８個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。従って、「Ｃ_1-50アルキル」は、１〜５０個の炭素原子を有するアルキル鎖を意味する。

【0032】

「Ｃ_2-50アルケニル」は、２〜５０個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルケニル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：−ＣＨ＝ＣＨ₂、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＣＨ＝ＣＨ₂、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₃、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ₂、又は例えば分子の２つの部分がアルケニル基によって結合されている場合、−ＣＨ＝ＣＨ−を意味する。Ｃ_2-50アルケニル炭素の各水素は、さらに明記された置換基によって置き換えられてもよい。従って、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を有する炭素鎖のことである。場合により、１つ又はそれ以上の三重の結合が存在してもよい。

【0033】

「Ｃ_2-50アルキニル」は、２〜５０個の炭素原子を有する分枝又は非分枝アルキニル鎖、例えば分子の末端に存在する場合：−Ｃ≡ＣＨ、−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｃ≡ＣＨ、ＣＨ₂−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₃、又は例えば分子の２つの部分がアルキニル基によって結合されている場合、−Ｃ≡Ｃ−を意味する。Ｃ_2-50アルキニル炭素の各水素は、さらに明記された置換基によって置き換えられてもよい。従って、「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素炭素三重結合を有する炭素鎖のことである。場合により、１つ又はそれ以上の二重結合が存在してもよい。

【0034】

「Ｃ_3-7シクロアルキル」又は「Ｃ_3-7シクロアルキル環」は、少なくとも部分的に飽和された炭素−炭素二重結合を有しうる３〜７個の炭素原子を有する環式アルキル鎖、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチルを意味する。シクロアルキル炭素の各水素は、置換基によって置き換えられてもよい。また、「Ｃ_3-7シクロアルキル」又は「Ｃ_3-7シクロアルキル環」という用語は、ノルボナン又はノルボネンの様な架橋されたビシクルを含む。従って、「Ｃ_3-5シクロアルキル」は、３〜５個の炭素原子を有するシクロアルキルを意味する。

【0035】

従って、「Ｃ_3-10シクロアルキル」は、３〜１０個の炭素原子を有する環式アルキル、例えばＣ_3-7シクロアルキル；シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシルを意味する。また、「Ｃ_3-10シクロアルキル」という用語は、少なくとも部分的に飽和したカルボモノ−及び−ビシクルを含む。

【0036】

「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。一般に、ハロゲンは、フルオロ又はクロロであることが好ましい。

【0037】

「４〜７員ヘテロシクリル」又は「４〜７員複素環」は、４個までの環原子のうちの少なくとも１個の環原子が硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選ばれるヘテロ原子によって置き換えられており、そして環は炭素又は窒素原子を介して残りの分子に結合されている、最大数までの二重結合を含みうる４、５、６又は７個の環原子を有する環（完全飽和、部分飽和又は不飽和の芳香環又は非芳香環）を意味する。４〜７員複素環の例は、アゼチジン、オキセタン、チエタン、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、イミダゾール、イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、イソオキサゾリン、チアゾール、チアゾリン、イソチアゾール、イソチアゾリン、チアジアゾール、チアジアゾリン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソオキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、チアジアゾリジン、スルホラン、ピラン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、イミダゾリジン、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、テトラゾール、トリアゾール、トリアゾリジン、テトラゾールイジン、ジアゼパン、アゼピン又はホモピペラジンである。

【0038】

「９〜１１員ヘテロビシクリル」又は「９〜１１員ヘテロビシクル」は、６個までの環原子のうちの少なくとも１個の環原子が硫黄（−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂−を含む）、酸素及び窒素（＝Ｎ（Ｏ）−を含む）からなる群より選ばれるヘテロ原子によって置き換えられており、そして環は炭素又は窒素原子を介して残りの分子に結合されている、少なくとも１つの環原子が両方の環によって共有されており、そして最大数までの二重結合を含んでもよい９〜１１個の環原子を有する２環の複素環式系（完全飽和、部分飽和又は不飽和の芳香環又は非芳香環）を意味する。９〜１１員ヘテロビシクルの例は、インドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾイミダゾリン、キノリン、キナゾリン、ジヒドロキナゾリン、キノリン、ジヒドロキノリン、テトラヒドロキノリン、デカヒドロキノリン、イソキノリン、デカヒドロイソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ジヒドロイソキノリン、ベンゾアゼピン、プリン又はプテリジンである。また、９〜１１員ヘテロビシクルという用語には、１,４−ジオキサ−８−アザスピロ［４.５］デカンのような２環のスピロ構造又は８−アザ−ビシクロ［３.２.１］オクタンのような架橋された複素環も含まれる。

【0039】

また、式（Ｉ）による化合物を含むインスリンプロドラッグが１つ又はそれ以上の酸性又は塩基性基を含む場合、本発明は、それらの対応する薬学的に又は毒物学的に許容しうる塩、特にそれらの薬学的に使用できる塩を含む。従って、酸性基を含む式（Ｉ）の化合物を含むインスリンプロドラッグは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩として又はアンモニウム塩として本発明により用いることができる。このような塩のより詳しい例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はアンモニアとの塩又は例えばエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸のような有機アミンが含まれる。１つ又はそれ以上の塩基性基、すなわち、プロトン化することができる基を含む式（Ｉ）の化合物を含むインスリンプロドラッグは、無機又は有機酸とのそれらの付加塩の形態において本発明により存在することができ、そして用いることができる。適切な酸の例には、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に知られている他の酸が含まれる。また、式（Ｉ）の化合物を含むインスリンプロドラッグが分子中に酸性及び塩基性基を同時に含む場合、本発明は、記載された塩形態に加えて、分子内塩又はベタイン（両性イオン）も含む。式（Ｉ）を含むインスリンプロドラッグによるそれぞれの塩は、当業者に知られている慣用の方法によって、例えば、溶媒若しくは分散媒中でこれらを有機若しくは無機の酸若しくは塩基と接触させることによって、又は他の塩とのアニオン交換若しくは陽イオン交換によって得ることができる。また、本発明は、低い生理学的適合性のため、薬剤に使用するには直接適していないが、例えば、化学反応の中間体として又は薬学的に許容しうる塩を製造するために用いることができる、式（Ｉ）の化合物を含むインスリンプロドラッグのすべての塩を含む。

【0040】

生体内でインスリンのような薬物の物理化学的又は薬物動態学的性質を強化するため、このような薬物を担体と結合させることができる。薬物が担体及び／又はリンカーに一時的に結合される場合、このような系は、一般に担体結合プロドラッグ（carrier-linked prodrugs）と称する。ＩＵＰＡＣによって提供された定義（２００９年７月２２日にアクセスされたhttp://www.chem.qmul.ac.uk/iupac.medchem下に記載された）によれば、担体結合プロドラッグは、所定の活性物質と、改善された物理化学的又は薬物動態学的性質をもたらし、そして、通常、加水分解によって生体内で容易に除去することができる一過性担体基（transient carrier group）との一時的な結合を含むプロドラッグである。

【0041】

このような担体結合プロドラッグに用いられるリンカーは、一過性（transient）であり、それは、例えば１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファ）下で非酵素的加水分解により分解可能（切断可能）であることを意味している。

【0042】

適切な担体はポリマーであり、リンカーに直接結合するか又は切断されないスペーサーを介して結合することができる。「インスリンヒドロゲルプロドラッグ」という用語は、インスリンの担体結合プロドラッグのことであり、ここにおいて、担体はヒドロゲルである。「ヒドロゲルプロドラッグ」及び「ヒドロゲル結合プロドラッグ（hydrogel-linked prodrug）」という用語は、ヒドロゲルに一時的に結合された生物活性物質（biologically active agents）のプロドラッグのことであり、そして同義的に用いられる。「ヒドロゲル」は、大量の水を取り込むことができる三次元的な親水性又は両親媒性ポリマーネットワークと定義してもよい。ネットワークは、ホモポリマー又はコポリマーで構成されており、共有結合性の化学的又は物理的（イオン性、疎水性相互作用、エンタングルメント（entanglements））架橋の存在のため不溶性である。架橋は、ネットワーク構造及び物理的完全性をもたらす。ヒドロゲルは、水性媒体中でそれを膨潤させる水との熱力学的適合性を示す。ネットワークの鎖は、孔が存在し、これらの孔の実質部分が１ｎｍ〜１０００ｎｍの寸法であるような形態で結合されている。

【0043】

薬物の「遊離形態」とは、ポリマー複合体から放出された後のような、その改変されてない薬理活性形態の薬物のことである。

【0044】

「薬物」、「生物活性分子（biologically active molecule）」、「生物活性部分（biologically active moiety）」、「生物活性物質（biologically active agent）」、「活性物質（active agent）」などの用語は、ウイルス、細菌、真菌、植物、動物及びヒトを含むが、それらに限定されない生物学的有機体あらゆる物理的又は生化学的性質に影響を及ぼすことができるあらゆる物質を意味する。特に、本明細書に用いられるように、生物活性分子には、ヒト若しくは他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、治療若しくは予防を目的とする、又は別途、ヒト若しくは動物の身体的若しくは精神的な健全性を強化するためのあらゆる物質が含まれる。具体的には、「薬物」、「生物活性分子」、「生物活性部分」、「生物活性物質」、「活性物質」などの用語は、インスリンのことである。

【0045】

本明細書に用いられるインスリンの「治療有効量」は、所定の疾患及びその合併症の臨床症状を治癒、緩和又は部分的に抑制するのに十分な量を意味する。これを達成するために適切な量は、「治療有効量」として定義される。それぞれの目的についての有効量は、疾患又は損傷の重症度並びに被験者の体重及び全身状態に左右される。適切な用量の決定は、数値の行列（matrix）を構成し、そして行列中のさまざまなポイントを試験することによって常用実験を用いて達成してもよく、それはすべて熟練医師の通常のスキル内にあることが理解される。

【0046】

「安定な」及び「安定性」は、指示された保存時間内において、ヒドロゲル複合体が結合したままであり、実質的な程度まで加水分解しておらず、そしてインスリンに関して許容しうる不純物プロファイルを示すことを意味する。安定とみなすには、組成物は、その遊離形態の薬物を５％より少なく含む。

【0047】

「薬学的に許容しうる」という用語は、動物、好ましくはヒトに使用するため、例えばＥＭＥＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）のような監督機関及び／又は任意の他国の監督機関によって承認されたことを意味する。

【0048】

「薬学的組成物」又は「組成物」は、１つ又はそれ以上の活性成分、及び１つ又はそれ以上の不活性成分、並びにいずれか２つ若しくはそれ以上の成分の組み合わせ、複合体形成、若しくは凝集から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の解離から、又は１つ若しくはそれ以上の成分の他のタイプの反応若しくは相互作用から直接的又は間接的に生じるあらゆる生成物を意味する。従って、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物及び薬学的に許容しうる賦形剤（薬学的に許容しうる担体）を混合することによって製造されるあらゆる組成物を包含する。

【0049】

「乾燥組成物」は、インスリンヒドロゲルプロドラッグ組成物が容器中に乾燥形態で提供されることを意味する。適切な乾燥方法は、噴霧乾燥及び凍結乾燥（フリーズドライ）である。インスリンヒドロゲルプロドラッグのこのような乾燥組成物は、最大１０％、好ましくは５％未満、そしてより好ましくは２％未満の残留水分含量を有する（カールフィッシャー（Karl Fischer）に従って決定）。好ましい乾燥方法は、凍結乾燥である。「凍結乾燥された組成物」は、インスリンヒドロゲルポリマープロドラッグ組成物が最初に凍結され、そして、その後、減圧による水還元にかけられることを意味する。この用語は、組成物を最終容器に充填する前に製造過程で生じるさらなる乾燥工程を排除するわけではない。

【0050】

「凍結乾燥」（フリーズドライ）は、組成物を凍結し、次いで周囲圧力を下げ、そして場合により加熱して組成物中の凍結した水を固相から気体に直接昇華させることを特徴とする脱水過程である。典型的に、昇華された水は、凝結によって集められる。

【0051】

「再構成」は、組成物の最初の形態に戻すための液体の添加を意味する。

【0052】

「再構成溶液」は、それを必要とする患者に投与する前にインスリンヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を再構成するために用いられる液体のことである。

【0053】

「容器」は、インスリンヒドロゲルプロドラッグ組成物を含み、そして再構成まで保存することができるあらゆる容器を意味する。

【0054】

「バッファ」又は「緩衝剤」は、所望の範囲にｐＨを維持する化学化合物のことである。生理学的に許容しうるバッファは、例えば、ナトリウムのリン酸塩、コハク酸塩、ヒスチジン、炭酸水素塩、クエン酸塩及び酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、ピルビン酸塩である。Ｍｇ（ＯＨ）₂又はＺｎＣＯ₃のような酸中和剤を用いてもよい。緩衝能力は、ｐＨ安定性に最も感受性な条件に適合するよう調整してもよい。

【0055】

「賦形剤」は、治療剤と共に投与される化合物、例えば、緩衝剤、等張性調整剤（isotonicity modifiers）、防腐剤、安定剤、抗吸着剤、酸化防止剤、又は他の補助剤のことである。しかしながら、いくつかの場合、１つの賦形剤は、２つ又は３つの機能を有することがある。

【0056】

「リオプロテクタント（lyoprotectant）」は、興味のタンパク質と合わせたときに、一般に乾燥したときの、そして特に凍結乾燥及びその後の保存中のタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を有意に防止する又は低下させる分子である。例となるリオプロテクタントとしては、糖、例えばスクロース又はトレハロース；アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン、グルタメート又はヒスチジン；メチルアミン、例えばベタイン；離液性塩（lyotropic salts）、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば３価の又はより高級な糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；エチレングリコール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；プルロニック；ヒドロキシアルキルデンプン、例えばヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、並びにそれらの組み合わせが含まれる。

【0057】

「界面活性剤」は、液体の表面張力を低下させる湿潤剤のことである。

【0058】

「等張性調整剤」は、注射デポ剤の浸透圧の違いのため細胞損傷から生じることがありうる疼痛を最小限にする化合物のことである。

【0059】

「安定剤」という用語は、ポリマープロドラッグの安定化に用いられる化合物のことである。安定化は、タンパク質安定化力の強化、変性状態の不安定化、又はタンパク質に賦形剤を直接結合することによって達成される。

【0060】

「抗吸着剤」は、組成物の容器の内面にコートする又は競合的に吸着するのに用いられる主にイオン性若しくは非イオン性界面活性剤又は他のタンパク質又は可溶性ポリマーのことである。選択される賦形剤の濃度及びタイプは、回避すべき効果に左右されるが、典型的には、ＣＭＣ値よりすぐ上の界面で界面活性剤の単層が形成される。

【0061】

「酸化防止剤」は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、エクトイン、グルタチオン、メチオニン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、キレート剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、六リン酸、チオグリコール酸のことである。

【0062】

「抗菌剤」は、細菌、真菌、酵母、原生動物のような微生物の殺す又は成長を阻害する及び／又はウイルスを撲滅する化学物質のことである。

【0063】

「容器を密閉する」とは、容器が気密性であり、外部と内部の間でガス交換することなく、そして内容物を無菌に保つように容器が閉じられていることを意味する。

【0064】

「試薬」又は「前駆体」という用語は、本発明のプロドラッグに至る製造過程に用いられる中間体又は出発物質のことである。

【0065】

「化学官能基」という用語は、カルボン酸及び活性化誘導体、アミノ、マレイミド、チオール及び誘導体、スルホン酸及び誘導体、カルボネート及び誘導体、カルバメート及び誘導体、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、リン酸及び誘導体、ホスホン酸及び誘導体、ハロアセチル、アルキルハライド、アクリロイル及び他のアルファ−ベータ不飽和マイケル受容体、フッ化アリールのようなアリール化剤、ヒドロキシルアミン、ピリジルジスルフィドのようなジスルフィド、ビニルスルホン、ビニルケトン、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、オキシラン、並びにアジリジンのことである。

【0066】

化学官能基が別の化学官能基に結合される場合、生成した化学構造を、「結合（linkage）」と称する。例えば、アミン基とカルボキシル基の反応は、アミド結合において起こる。

【0067】

「反応性官能基」は、超分枝部分（hyperbranched moiety）に結合された骨格鎖部分（backbone moiety）の化学官能基である。

【0068】

「官能基」は、「反応性官能基」、「分解性相互結合官能基（degradable interconnected functional group）」、又は「複合体官能基（conjugate functional group）」に用いられる集合名である。

【0069】

「分解性相互結合官能基」は、一方の側で骨格鎖部分に結合したスペーサー部分に結合しており、そしてもう一方の側で架橋部分に結合した生分解性結合（biodegradable bond）を含む結合である。「分解性相互結合官能基」、「生分解性相互結合官能基（biodegradable interconnected functional group）」、「相互結合生分解性官能基（interconnected biodegradable functional group）」及び「相互結合官能基（interconnected functional group）」という用語は、同義的に用いられる。

【0070】

「ブロック基（blocking group）」又は「キャッピング基（capping group）」という用語は、同義的に用いられ、そして反応性官能基に不可逆的に結合してそれを、例えば化学官能基と反応できなくする部分のことである。

【0071】

「保護基（protecting group）」又は「保護基（protective group）」という用語は、反応性官能基に可逆的に結合してそれを、例えば他の化学官能基と反応できないようにする部分のことである。

【0072】

「相互結合性官能基（interconnectable functional group）」という用語は、ラジカル重合反応に参入し、そしてクロスリンカー試薬又は骨格鎖試薬の部分である化学官能基のことである。

【0073】

「重合性官能基（polymerizable functional group）」という用語は、ライゲーション型重合反応（ligation-type polymerization reaction）に参入し、そしてクロスリンカー試薬及び骨格鎖試薬の部分である化学官能基のことである。

【0074】

骨格鎖部分は、一端で骨格鎖部分に、そしてもう一方の側で架橋部分に結合されたスペーサー部分を含んでもよい。

【0075】

「誘導体」という用語は、保護基及び／又は活性化基で適切に置換された化学官能基又は当業者に知られている対応する化学官能基の活性化形態のことである。例えば、カルボキシル基の活性化形態には、スクシンイミジルエステル、ベンゾトリアジルエステル、ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、アザベンゾトリアジルエステル、アシルハロゲン化物、混合又は対称性無水物、アシルイミダゾールのような活性エステルが含まれるが、それらに限定されるわけではない。

【0076】

「非酵素的に切断可能なリンカー」という用語は、酵素活性のない生理学的条件下で加水分解により分解可能であるリンカーのことである。

【0077】

「生物活性のないリンカー（non-biologically active linker）」は、生物活性部分から誘導された薬物（Ｄ−Ｈ）の薬理学的効果を示さないリンカーを意味する。

【0078】

「スペーサー」、「スペーサー基」、「スペーサー分子」及び「スペーサー部分」という用語は、同じ意味で用いられ、そして本発明のヒドロゲル担体中に存在する部分を記載するために用いられる場合、その断片が、−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ１−４アルキル）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ_1-4アルキル）−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）₂−、４〜７員ヘテロシクリル、フェニル又はナフチルから選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されたＣ_1-50アルキル、Ｃ_2-50アルケニル又はＣ_2-50アルキニルのような２つの部分を結合するのに適したあらゆる部分のことである。

【0079】

「末端の」、「末端」又は「遠位端（distal end）」という用語は、分子又は部分内の官能基又は結合の位置のことであり、それによってこのような官能基は、化学官能基であってもよく、そして結合は分解可能な又は永続的結合であってもよく、２つの部分間の結合に隣接して若しくはその中に又はオリゴマー若しくはポリマー鎖の終端に位置することを特徴とする。

【0080】

「結合形態における」又は「部分」という表現は、より大きな分子の部分である下部構造のことである。「結合形態における」という表現は、試薬、出発物質又は当分野でよく知られている仮定的な出発物質の命名又は列記によって部分への表示を簡略化するために用いられ、そして、それによって「結合形態における」は、例えば１つ若しくはそれ以上の水素基（−Ｈ）、又は試薬若しくは出発物質中に存在する１つ若しくはそれ以上の活性化若しくは保護基が部分中に存在しないことを意味する。

【0081】

ポリマー部分を含むすべての試薬及び部分は、分子量、鎖長若しくは重合度、又は官能基の数に関して多様性を示すことが知られている高分子単位のことであると理解される。従って、骨格鎖試薬、骨格鎖部分、クロスリンカー試薬及びクロスリンカー部分について示した構造は、ほんの代表例である。

【0082】

試薬又は部分は、線状又は分枝であってもよい。試薬又は部分が２つの末端基を有する場合、それは、線状試薬又は部分と称する。試薬又は部分が２つを超える末端基を有する場合、分枝又は多官能性の試薬又は部分とみなす。

【0083】

「ポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖」又は「ＰＥＧベースの鎖」という用語は、オリゴ−又はポリマー分子鎖のことである。

【0084】

好ましくは、このようなポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖は、分枝コア（branching core）に結合されており、それは、そのうちの一方の末端は分枝コアに、そしてもう一方は超分枝樹枝状部分に結合された線状ポリ（エチレングリコール）鎖である。ＰＥＧベースの鎖は、ヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されたアルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよい事が理解される。

【0085】

「ポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖」という用語がクロスリンカー試薬に関して用いられる場合、それは、少なくとも２０質量％エチレングリコール部分を含むクロスリンカー部分又は鎖のことである。

【0086】

好ましくは、式（Ｉ）中、Ｒ²はＬ²−Ｚによって置き換えられる。

【0087】

好ましくは、式（Ｉ）中、Ｒ¹はＬ²−Ｚによって置き換えられる。

【0088】

好ましくは、式（Ｉ）中、ＸはＮ（Ｒ³）である。

【0089】

好ましくは、式（Ｉ）中、ＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、そしてＲ^3aはＮ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴である。

【0090】

好ましくは、式（Ｉ）中、ＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、そしてＲ^3aはＬ²−Ｚによって置き換えられる。

【0091】

好ましくは、ＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、Ｒ^3aはＮ（Ｒ^2b）−Ｌ²−Ｚである。

【0092】

本発明の好ましいプロドラッグは、インスリンリンカー複合体Ｄ−Ｌを含み、ここにおいて、式（Ｉ）のＬ¹は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）又は（Ｉｄ）：

【化2】

（式中、
Ｒ¹、Ｒ^1a、Ｒ²、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｌ²、Ｚは、本明細書に記載された意味を有し、そしてＬ¹は場合によりさらに置換されるが、但し、式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）中のアスタリスクでマークされた水素は、置換基によって置き換えられない）によって表される。

【0093】

好ましくは、Ｌ¹はさらに置換されない（必須置換基Ｌ²−Ｚは別として）。

【0094】

好ましくは、インスリン部分は、窒素Ｎ^αA1を通して又はインスリン部分のリシン側鎖の窒素を通してＬ¹に結合されている。

【0095】

好ましくは、インスリン部分は、組換え型のヒトインスリンである。

【0096】

例えば、式（Ｉａ）〜（Ｉｄ）中に示されるように、１つの水素は、基Ｌ²−Ｚによって置き換えられる。

【0097】

式（Ｉ）中のアスタリスクでマークされた水素の置き換えは別として、Ｌ²はあらゆる位置でＬ¹に結合することができる。好ましくは、Ｒ¹、Ｒ^1a、Ｒ²、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ³、Ｒ^3a、Ｒ⁴によって表わされる水素の１つは、直接又はＣ_1-4アルキル若しくはさらなる基の水素としてＬ²−Ｚによって置き換えられる。

【0098】

さらにまた、Ｌ¹は場合によりさらに置換されてもよい。一般に、切断原則が影響を受けない限り、あらゆる置換基を用いてもよい。しかしながら、Ｌ¹はさらに置換されないことが好ましい。

【0099】

好ましくは、１つ又はそれ以上のさらなる場合による置換基は、ハロゲン；ＣＮ；ＣＯＯＲ⁹；ＯＲ⁹；Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｒ⁹；Ｓ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^9aＲ^9b）；ＳＲ⁹；Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；ＮＯ₂；ＯＣ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^9aＲ^9b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｔ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；又はＣ_2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており、そしてＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹¹−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹Ｒ^11a）−からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；

【0100】

Ｒ⁹、Ｒ^9a、Ｒ^9bは、Ｈ；Ｔ；及びＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；又はＣ_2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており、そしてＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹¹−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹Ｒ^11a）−からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；

【0101】

Ｔは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ_3-10シクロアルキル；４〜７員ヘテロシクリル；又は９〜１１員ヘテロビシクリルからなる群より選ばれ、ここにおいて、Ｔは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており；
Ｒ¹⁰は、ハロゲン；ＣＮ；オキソ（＝Ｏ）；ＣＯＯＲ¹²；ＯＲ¹²；Ｃ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｒ¹²；Ｓ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^12aＲ^12b）；ＳＲ¹²；Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；ＮＯ₂；ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^12aＲ^12b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；又はＣ_1-6アルキルであり、ここにおいて、Ｃ_1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
Ｒ¹¹、Ｒ^11a、Ｒ¹²、Ｒ^12a、Ｒ^12bは、Ｈ；又はＣ_1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいて、Ｃ_1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されている。

【0102】

「中断された」という用語は、２個の炭素間に又は炭素と水素の間の炭素鎖の末端に基が挿入されることを意味する。

【0103】

Ｌ²は、単化学結合又はスペーサーである。Ｌ²がスペーサーである場合、上記定義された１つ又はそれ以上の場合による置換基として定義されることが好ましいが、但し、Ｌ²はＺで置換される。

【0104】

従って、Ｌ²が単化学結合とは異なるとき、Ｌ²−Ｚは、ＣＯＯＲ⁹；ＯＲ⁹；Ｃ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｒ⁹；Ｓ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^9aＲ^9b）；ＳＲ⁹；Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；ＯＣ（Ｏ）Ｒ⁹；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｓ（Ｏ）Ｒ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^9a；Ｎ（Ｒ⁹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^9aＲ^9b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ⁹Ｒ^9a）；Ｔ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；又はＣ_2-50アルキニルであり、ここにおいてＴ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており、そしてＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、−Ｔ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹¹−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹Ｒ^11a）からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；

【0105】

Ｒ⁹、Ｒ^9a、Ｒ^9bは、Ｈ；Ｚ；Ｔ；及びＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；又はＣ_2-50アルキニルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＴ；Ｃ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており、そしてＣ_1-50アルキル；Ｃ_2-50アルケニル；及びＣ_2-50アルキニルは、Ｔ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｏ−；−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹）−；−Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^11a）−；−Ｓ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）−；−ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹¹−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）₂−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｓ（Ｏ）−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｏ−；−Ｎ（Ｒ¹¹）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^11a）−；及び−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹¹Ｒ^11a）からなる群より選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；
Ｔは、フェニル；ナフチル；インデニル；インダニル；テトラリニル；Ｃ_3-10シクロアルキル；４〜７員ヘテロシクリル；又は９〜１１員ヘテロビシクリルからなる群より選ばれ、ここにおいてｔは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のＲ¹⁰で場合により置換されており；
Ｒ¹⁰は、Ｚ；ハロゲン；ＣＮ；オキソ（＝Ｏ）；ＣＯＯＲ¹²；ＯＲ¹²；Ｃ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ₁₂Ｒ_12a）；Ｓ（Ｏ）₂Ｒ¹²；Ｓ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）₂Ｎ（Ｒ^12aＲ^12b）；ＳＲ¹²；Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；ＮＯ²；ＯＣ（Ｏ）Ｒ¹²；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｓ（Ｏ）Ｒ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）ＯＲ^12a；Ｎ（Ｒ¹²）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^12
aＲ^12b）；ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ¹²Ｒ^12a）；又はＣ_1-6アルキルであり、ここにおいてＣ_1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
Ｒ¹¹、Ｒ^11a、Ｒ¹²、Ｒ^12a、Ｒ^12bは、Ｈ；Ｚ；又はＣ_1-6アルキルからなる群より独立して選ばれ、ここにおいてＣ_1-6アルキルは、同一又は異なる１つ又はそれ以上のハロゲンで場合により置換されており；
但し、Ｒ⁹、Ｒ^9a、Ｒ^9b、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ^11a、Ｒ¹²、Ｒ^12a、Ｒ^12bの１つだけがＺである。

【0106】

より好ましくは、Ｌ²は、Ｃ_1-20アルキル鎖であり、これは、−Ｏ−；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^3aa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基によって場合により中断されており；ＯＨ；及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^3aaＲ^3aaa）から独立して選ばれる１つ又はそれ以上の基で場合により置換されており；そしてＲ^3aa、Ｒ^3aaaは、Ｈ；及びＣ１−４アルキルからなる群より独立して選ばれる。

【0107】

好ましくは、Ｌ²は１４ｇ／ｍｏｌから７５０ｇ／ｍｏｌまでの範囲の分子量を有する。

【0108】

好ましくは、Ｌ²は、

【化3】

から選ばれる末端基を介してＺに結合される。

【0109】

さらにまた、Ｌ²がこのような末端基を有する場合、Ｌ²がこのような末端基なしで算出された１４ｇ／ｍｏｌから５００ｇ／ｍｏｌまでの範囲の分子量を有することが好ましい。

【0110】

好ましくは、リンカーとヒドロゲルＺの間に形成された共有結合は、永続的結合である。

【0111】

好ましくは、ヒドロゲルＺは、生分解性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである。本明細書において理解される「ＰＥＧベースの」という用語は、ヒドロゲル中のＰＥＧ鎖の質量比がヒドロゲルの全質量に基づいて少なくとも１０質量％、好ましくは少なくとも２５％であることを意味する。残りは、他のスペーサー及び／又はオリゴマー又はポリマー、例えばオリゴ−又はポリリシンで構成することができる。

【0112】

さらに、「水不溶性」という用語は、ヒドロゲルを形成する膨潤可能な三次元的に架橋された分子ネットワークのことである。ヒドロゲルは、大過剰の水又は生理学的浸透圧の水性バッファ中に懸濁される場合、例えば質量基準当たり質量において１０倍までの実質的な量の水を取り込んでもよく、従って膨潤可能であるが、過剰の水を除去した後でも、ゲルの物理的安定性及び形状を保持している。このような形状は、あらゆる幾何学的形状であってもよく、そしてこのような独特のヒドロゲル物体は、各成分が化学結合を通してそれぞれ他の成分に結合された成分からなる単一分子とみなすべきであることが理解される。

【0113】

本発明によれば、ヒドロゲルは、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成されてもよい。

【0114】

好ましくは、Ｌ²は骨格鎖部分に結合される。

【0115】

好ましくは、骨格鎖部分は、１ｋＤａから２０ｋＤａまで、より好ましくは１ｋＤａから１５ｋＤａまで、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａから１０ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。また、骨格鎖部分は、１つ又はそれ以上のＰＥＧ鎖を含むＰＥＧベースであることが好ましい。

【0116】

本発明による薬物−リンカー複合体を担持しているヒドロゲルにおいて、骨格鎖部分は、相互結合した生分解性官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体、並びに場合によりキャッピング基を含む多くの官能基を特徴とする。これは、骨格鎖部分が、多くのヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体；生分解性相互結合官能基を含む官能基；及び場合によりキャッピング基を特徴とすることを意味する。好ましくは、相互結合生分解性官能基及び薬物−リンカー複合体及びキャッピング基の合計は、１６〜１２８個、好ましく２０〜１００個、より好ましくは２４〜８０個、そして最も好ましくは３０〜６０個である。

【0117】

好ましくは、相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及び骨格鎖部分のキャッピング基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割される。例えば、３２個の相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及びキャッピング基がある場合、８個の基は、コアから延びた４本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベースのポリマー鎖の末端に結合された樹枝状部分によって提供されてもよい。代わりに、４個の基が、コアから延びた８本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、又は２個の基が１６本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって提供されてもよい。分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数が等しく分配することができない場合、ＰＥＧベースのポリマー鎖当たりの相互結合官能基及びヒドロゲル結合薬物−リンカー複合体及びキャッピング基の合計の平均数からの偏差を最小に保つことが好ましい。

【0118】

本発明によるこのような担体結合プロドラッグでは、有意量の骨格鎖部分の放出（＜１０％）が行われる前に、ほとんどすべての薬物放出（＞９０％）が起こっていることが望ましい。これは、本発明によるヒドロゲルの分解速度に対する担体結合プロドラッグの半減期を調整することによって達成することができる。

【0119】

優先的に、骨格鎖部分は、少なくとも３本のＰＥＧベースのポリマー鎖が延びた分枝コアを有することを特徴とする。従って、本発明の好ましい態様において、骨格鎖試薬は、少なくとも３本のＰＥＧベースのポリマー鎖が延びた分枝コアを含む。このような分枝コアは、結合形態においてポリ−若しくはオリゴアルコール、好ましくはペンタエリスリトール、トリペンタエリスリトール、ヘキサグリセリン、スクロース、ソルビトール、フルクトース、マンニトール、グルコース、セルロース、アミロース、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン、ポリビニルアルコール、デキストラン、ヒアルロナンを含んでもよく、又は分枝コアは、結合形態においてポリ−若しくはオリゴアミン、例えばオルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン又はオリゴリシン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミンを含んでもよい。

【0120】

好ましくは、分枝コアは、３〜１６本、より好ましくは４〜８本のＰＥＧベースのポリマー鎖を延ばしている。好ましい分枝コアは、結合形態においてペンタエリスリトール、オルニチン、ジアミノ酪酸、トリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン又はオリゴリシン、低分子量ＰＥＩ、ヘキサグリセリン、トリペンタエリスリトールを含んでもよい。好ましくは、分枝コアは、３〜１６本、より好ましくは４〜８本のＰＥＧベースのポリマー鎖を延ばしている。好ましくは、ＰＥＧベースのポリマー鎖は、そのうちの一方の末端が分枝コア、そしてもう一方が超分枝樹枝状部分に結合している、線状ポリ（エチレングリコール）鎖である。ポリマーＰＥＧベースの鎖は、ヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されたアルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよいことが理解される。

【0121】

好ましくは、ＰＥＧベースのポリマー鎖は、適切に置換されたポリエチレングリコール誘導体（ＰＥＧベースの）である。

【0122】

骨格鎖部分に含まれる分枝コアから延びた対応するＰＥＧベースのポリマー鎖の好ましい構造は、例えば、JenKem Technology、米国（２００９年７月２８日にwww.jenkemusa.comからダウンロードによってアクセスされた）の製品リストに詳述されたようなマルチアーム（multi-arm）ＰＥＧ誘導体、４ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（ペンタエリスリトールコア）、８ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（ヘキサグリセリンコア）及び８ＡＲＭ−ＰＥＧ誘導体（トリペンタエリスリトールコア）である。最も好ましいのは、４アームＰＥＧアミン（ペンタエリスリトールコア）及び４アームＰＥＧカルボキシル（ペンタエリスリトールコア）、８アームＰＥＧアミン（ヘキサグリセリンコア）、８アームＰＥＧカルボキシル（ヘキサグリセリンコア）、８アームＰＥＧアミン（トリペンタエリスリトールコア）及び８アームＰＥＧカルボキシル（トリペンタエリスリトールコア）である。骨格鎖部分中のこのようなマルチアームＰＥＧ誘導体の好ましい分子量は、１ｋＤａ〜２０ｋＤａ、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａである。

【0123】

上記のマルチアーム分子の末端アミン基は、骨格鎖部分に結合形態で存在し、骨格鎖部分のさらに相互結合された官能基及び反応性官能基を提供することが理解される。

【0124】

相互結合官能基及び骨格鎖部分の反応性官能基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割されることが好ましい。分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数が等しく分配することができない場合、ＰＥＧベースのポリマー鎖当たりの相互結合官能基及び反応性官能基の合計の平均数からの偏差が最小に保たれることが好ましい。

【0125】

より好ましくは、骨格鎖部分の相互結合官能基及び反応性官能基の合計は、分枝コアから延びたＰＥＧベースのポリマー鎖の数によって等しく分割される。例えば、３２個の相互結合官能基及び反応性官能基がある場合、８個の基は、コアから延びた４本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、好ましくは各ＰＥＧベースのポリマー鎖の末端に結合された樹枝状部分によって提供されてもよい。代わりに、４個の基が、コアから延びた８本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって、又は２個の基が１６本のＰＥＧベースのポリマー鎖のそれぞれによって提供されてもよい。

【0126】

このようなさらなる官能基は、樹枝状部分によって提供されてもよい。好ましくは、各樹枝状部分は、０．４ｋＤａから４ｋＤａまで、より好ましくは０．４ｋＤａ〜２ｋＤａの範囲の分子量を有する。好ましくは、各樹枝状部分は、少なくとも３個の分枝及び少なくとも４個の反応性官能基、そして多くとも６３個の分枝及び６４個の反応性官能基、好ましくは、少なくとも７個の分枝及び少なくとも８個の反応性官能基、そして多くとも３１個の分枝及び３２個の反応性官能基を有する。

【0127】

このような樹枝状部分の例には、結合形態においてトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、オクタリシン、ノナリシン、デカリシン、ウンデカリシン、ドデカリシン、トリデカリシン、テトラデカリシン、ペンタデカリシン、ヘキサデカリシン、ヘプタデカリシン、オクタデカリシン、ノナデカリシンが含まれる。このような好ましい樹枝状部分の例には、結合形態においてトリリシン、テトラリシン、ペンタリシン、ヘキサリシン、ヘプタリシン、最も好ましくは、結合形態においてトリリシン、ペンタリシン又はヘプタリシン、オルニチン、ジアミノ酪酸が含まれる。

【0128】

最も好ましくは、本発明のヒドロゲル担体は、骨格鎖部分が式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）₄の第四級炭素を有し、ここにおいて各Ａは、独立して永続的共有結合によって第四級炭素に末端結合されたポリ（エチレングリコール）ベースのポリマー鎖であり、そしてＰＥＧベースのポリマー鎖の遠位末端は、樹枝状部分Ｈｙｐに共有結合されており、各樹枝状部分Ｈｙｐは、相互結合官能基及び反応性官能基を表す少なくとも４個の官能基を有することを特徴とする。

【0129】

好ましくは、各Ａは、式−（ＣＨ₂）_n1（ＯＣＨ₂ＣＨ₂）_nＸ−から独立して選ばれ、ここにおいて、ｎ１は１又は２であり；ｎは５から５０までの範囲の整数であり；そしてＸはＡ及びＨｙｐを共有結合している化学官能基である。

【0130】

好ましくは、Ａ及びＨｙｐは、アミド結合によって共有結合される。

【0131】

好ましくは、樹枝状部分Ｈｙｐは、超分枝ポリペプチドである。好ましくは、超分枝ポリペプチドは、結合形態においてリシンを含む。好ましくは、各樹枝状部分Ｈｙｐは、０．４ｋＤａから４ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。骨格鎖部分Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）₄は、同一又は異なる樹枝状部分Ｈｙｐからなることができ、そして各Ｈｙｐは、独立して選ぶことができることが理解される。各部分Ｈｙｐは、５〜３２個のリシン、好ましくは少なくとも７個のリシンからなり、すなわち、各部分Ｈｙｐは、結合形態において５〜３２個のリシン、好ましくは結合形態において少なくとも７個のリシンを含む。最も好ましくは、Ｈｙｐはヘプタリシニルを含む。

【0132】

重合性官能基と骨格鎖試薬との反応、より具体的にはＨｙｐとポリエチレングリオールベースのクロスリンカー試薬の重合性官能基との反応は、永続的アミド結合を生じる。

【0133】

好ましくは、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）₄は、１ｋＤａから２０ｋＤａまで、より好ましくは１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、そしてさらにより好ましくは１ｋＤａ〜１０ｋＤａの反応の分子量を有する。

【0134】

１つの好ましい骨格鎖部分を以下：

【化4】

に示し、点線は、クロスリンカー部分への生分解性結合を相互結合していることを示し、そしてｎは５〜５０の整数である。

【0135】

本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解により分解可能な結合の導入によって達成される。

【0136】

「加水分解により分解可能な」、「生分解性の（biodegradable）」又は「加水分解により切断可能な」、「自動切断可能な（auto-cleavable）」、若しくは「自己切断（self-cleavage）」、「自己切断可能な」、「一過性」又は「一時的な」という用語は、本発明に関して、１時間から３ヵ月までの半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファ）下で非酵素的加水分解により分解可能又は切断可能である結合（bonds）及び結合（linkages）のことであり、アコニチル、アセタール、アミド、カルボン無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、リン酸エステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホンエステル、芳香族カルバメート、それらの組み合わせ、及び同様ものが含まれるが、それらに限定されるものではない。

【0137】

本発明によるヒドロゲル中に分解可能な相互結合官能基として存在する場合、好ましい生分解性結合は、カルボン酸エステル、炭酸エステル、リン酸エステル及びスルホン酸エステルであり、そして最も好ましいのは、カルボン酸エステル又は炭酸エステルである。

【0138】

永続的結合は、例えば、アミドのように６カ月又はそれより長い半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファ）下で非酵素的加水分解により分解可能である。

【0139】

本発明のヒドロゲル担体に加水分解により切断可能な結合を導入するために、骨格鎖部分は生分解性結合によって相互に直接結合することができる。

【0140】

一実施態様において、生分解性ヒドロゲル担体の骨格鎖部分は、直接、すなわちクロスリンカー部分なしで一緒に結合されてもよい。このような生分解性ヒドロゲルの２つの骨格鎖部分の超分枝樹枝状部分は、いずれも、２つの超分枝樹枝状部分を結合する相互結合官能基を通して直接結合されてもよい。代わりに、２つの異なる骨格鎖部分の２つの超分枝樹枝状部分は、骨格鎖部分に結合された２つのスペーサー部分を通して相互結合してもよく、そしてもう一方の側では、相互結合官能基によって分離された架橋部分に結合している。

【0141】

代わりに、骨格鎖部分がクロスリンカー部分を通して一緒に結合してもよく、各クロスリンカー部分は、少なくとも２つの加水分解により分解可能な結合によって終結される。終端の分解可能な結合に加えて、クロスリンカー部分は、さらに生分解性結合を含んでもよい。従って、骨格鎖部分に結合されたクロスリンカー部分の各末端は、加水分解により分解可能な結合を含み、そしてさらなる生分解性結合が場合によりクロスリンカー部分に存在してもよい。

【0142】

好ましくは、生分解性ヒドロゲル担体は、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成され、そして骨格鎖部分は、クロスリンカー部分を通して一緒に結合されている。

【0143】

生分解性ヒドロゲル担体は、１つ又はそれ以上の異なるタイプの、好ましくは１つのクロスリンカー部分を含んでもよい。クロスリンカー部分は、線状又は分枝分子であってもよく、そして好ましくは線状分子である。本発明の好ましい実施態様において、クロスリンカー部分は、少なくとも２つの生分解性結合によって骨格鎖部分に結合される。

【0144】

好ましくは、クロスリンカー部分は、６０ｄａから５ｋＤａまで、より好ましくは０．５ｋＤａから４ｋＤａまで、さらにより好ましくは１ｋＤａから４ｋＤａまで、さらにより好ましくは１ｋＤａから３ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。一実施態様において、クロスリンカー部分は、ポリマーからなる。

【0145】

オリゴマー又はポリマー架橋部分に加えて、特に本発明による生分解性ヒドロゲルの形成のため親水性高分子量骨格鎖部分を用いるときは、低分子量架橋部分を用いてもよい。

【0146】

好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、エチレングリコール単位を含み、場合によりさらなる化学官能基を含む炭化水素鎖であり、ここにおいて、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、少なくともそれぞれｍ個のエチレングリコール単位を含み、ここにおいて、ｍは３から１００まで、好ましくは１０から７０までの範囲の整数である。好ましくは、ポリベースの（エチレングリコール）クロスリンカー部分は、０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。

【0147】

クロスリンカー部分又は分枝コアに結合されたＰＥＧベースのポリマー鎖の表示に用いる場合、「ＰＥＧベースの」という用語は、クロスリンカー部分又はＰＥＧベースのポリマー鎖は、少なくとも２０質量％のエチレングリコール部分を含む。

【0148】

一実施態様において、ポリマークロスリンカー部分を構成するモノマーは、生分解性結合によって結合されている。このようなポリマークロスリンカー部分は、クロスリンカー部分の分子量及びモノマー単位の分子量に応じて１００個までの又はそれ以上の生分解性結合を含んでもよい。このようなクロスリンカー部分の例は、ポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）ベースのポリマーである。このようなポリ（乳酸）又はポリ（グリコール酸）鎖は、アルキル又はアリール基によって終結又は中断されてもよく、そしてそれらはヘテロ原子及び化学官能基で場合により置換されてもよいことが理解される。

【0149】

好ましくは、クロスリンカー部分はＰＥＧベースであり、好ましくは、１つのＰＥＧベースの分子鎖によってのみ表される。好ましくは、ポリベースの（エチレングリコール）クロスリンカー部分は、エチレングリコール単位を含み、場合によりさらなる化学官能基を含む炭化水素鎖であり、ここにおいて、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、少なくともそれぞれｍ個のエチレングリコール単位を含み、ここにおいて、ｍは、３から１００まで、好ましくは１０から７０までの範囲の整数である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）ベースのクロスリンカー部分は、０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量を有する。

【0150】

本発明の好ましい実施態様において、クロスリンカー部分はＰＥＧからなり、これは、永続的なアミド結合を通して超分枝樹枝状部分に結合された骨格鎖部分によって提供される２つのアルファ、オメガ−脂肪族ジカルボン酸スペーサーにエステル結合を介して対称的に結合されている。

【0151】

骨格鎖部分に及びもう一方の側に結合されたスペーサー部分のジカルボン酸は、３〜１２個の炭素原子、最も好ましくは５〜８個の炭素原子からなり、そして１つ又はそれ以上の炭素原子において置換されてもよい架橋部分に結合されている。好ましい置換基は、アルキル基、ヒドロキシル基又はアミド基又は置換されたアミノ基である。脂肪族ジカルボン酸のメチレン基の１つ又はそれ以上は、Ｏ又はＮＨ又はアルキル置換されたＮによって場合により置換されてもよい。好ましいアルキルは、１〜６個の炭素原子を有する線状又は分枝アルキルである。

【0152】

好ましくは、超分枝樹枝状部分と骨格鎖部分に結合されたスペーサー部分との間には永続的なアミド結合があり、そしてもう一方の側では架橋部分に結合されている。

【0153】

１つの好ましいクロスリンカー部分を以下：

【化5】

（式中、ｎは５〜５０の整数である）
に示し；点線は、骨格鎖部分に相互結合された生分解性結合を示す。

【0154】

好ましくは、ヒドロゲル担体は、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成される。

【0155】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化6】

（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む。

【0156】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化7】

（式中、ｎは５〜５０の整数であり、そして点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の構造を含む。

【0157】

好ましくは、骨格鎖部分は、超分枝部分Ｈｙｐを含む。

【0158】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化8】

（式中、点線は分子の残りへの結合を示し、そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ−配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む。

【0159】

好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化9】

（式中、点線の１つは超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は分子の残りへの結合を示し；そして
ｍは２〜４の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。

【0160】

好ましくは、骨格鎖部分は、以下の構造

【化10】

（式中、ｑは３〜１００、好ましくは５〜５０の整数である）
を有するクロスリンカー部分を通して一緒に結合されている。

【0161】

本発明のヒドロゲルプロドラッグでは、骨格鎖部分とクロスリンカー部分の間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して結合された原子の数及びタイプによって影響を受けるか又は決定される。例えば、ＰＥＧエステル形成に関してコハク酸、脂肪酸又はグルタル酸を選択することによって本発明による生分解性ヒドロゲル担体の分解半減期を変えることは可能である。

【0162】

好ましくは、Ｌ²は、オリゴエチレングリコール鎖のようなスペーサーを通してヒドロゲルの骨格鎖部分にさらに結合されたチオスクシンイミド基を通してＺに結合されている。好ましくは、骨格鎖部分へのこのスペーサー鎖の結合は、永続的な結合、好ましくはアミド結合である。

【0163】

本発明によるヒドロゲルの生分解性は、加水分解により分解可能な結合の導入によって達成される。

【0164】

相互結合官能基について、「加水分解により分解可能である」という用語は、本発明に関して、１時間から３ヵ月までの範囲の半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファ）下で非酵素的加水分解により分解可能である結合のことであり、アコニチル、アセタール、カルボン無水物、エステル、イミン、ヒドラゾン、マレアミド酸アミド、オルトエステル、ホスファミド、リン酸エステル、ホスホシリルエステル、シリルエステル、スルホンエステル、芳香族カルバメート、それらの組み合わせ及び同様のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい生分解性結合は、カルボンエステル、炭酸エステル、リン酸エステル及びスルホン酸エステルであり、そして最も好ましいのは、カルボンエステル又は炭酸エステルである。インビトロ研究では、例えば、ｐＨ９、３７℃、水性バッファのような加速条件を実際的に用いてもよいことが理解される。

【0165】

永続的な結合は、例えば、アミドのように、６カ月又はそれより長い半減期を有し、生理学的条件（ｐＨ７．４、３７℃の水性バッファ）下で非酵素的加水分解により分解可能である。

【0166】

本発明による生分解性ヒドロゲル担体の分解は、多数の分解可能な結合が切断されて水溶性又は水不溶性でありうる分解生成物を生じる多段階反応である。しかし、水不溶性分解生成物は、水溶性分解生成物は得られるという点で切断できるように分解可能な結合をさらに含んでもよい。これらの水溶性分解生成物は、１つ又はそれ以上の骨格鎖部分を含んでもよい。放出された骨格鎖部分は、例えば、スペーサー又はブロック若しくはリンカー基又は親和性基（affinity groups）及び／又はプロドラッグリンカー分解生成物に永続的に結合されてもよく、そしてまた、水溶性分解生成物は、分解可能な結合を含んでもよいことが理解される。

【0167】

分枝コア、ＰＥＧベースのポリマー鎖、超分枝樹枝状部分及び超分枝樹枝状部分に結合された部分の構造は、本発明のヒドロゲル担体を扱う段落に記載された対応する説明から推測することができる。分解物の構造は、分解を受ける本発明によるヒドロゲルのタイプに左右されることが理解される。

【0168】

骨格鎖部分の総量は、本発明によるヒドロゲルが完全に分解した後、そして分解中に溶液中で測定することができ、可溶性の骨格鎖分解生成物の画分は、本発明による不溶性ヒドロゲルから分離することができ、そして本発明によるヒドロゲルから放出された他の可溶性分解生成物からの干渉なしに定量化することができる。本発明によるヒドロゲル物体は、沈降又は遠心分離によって生理学的浸透圧のバッファの過剰の水から分離してもよい。遠心分離は、上澄みが本発明による膨潤したヒドロゲルの体積の少なくとも１０％になるようなやり方で実施してもよい。可溶性のヒドロゲル分解生成物は、このような沈降又は遠心分離工程後に水性上澄み中に残り、そして１つ又はそれ以上の骨格鎖部分を含む水溶性分解生成物は、このような上澄みのアリコートを適切な分離及び／又は分析方法にかけることによって検出可能である。

【0169】

好ましくは、水溶性分解生成物は、０．４５μｍフィルターを通した濾過によって水不溶性分解生成物から分離してもよく、その後、水溶性分解生成物は、フロースルー（flow-through）中に見出すことができる。また、水溶性分解生成物は、遠心分離及び濾過工程の組み合わせによって水不溶性分解生成物から分離してもよい。

【0170】

例えば骨格鎖部分は、他の分解生成物がＵＶ吸収を示さない波長でＵＶ吸収を示す基を担持してもよい。このような選択的ＵＶ吸収基は、アミド結合のような骨格鎖部分の構成成分であってもよく又はインドイル基のような芳香環系によってその反応性官能基に結合することによって骨格鎖に導入してもよい。

【0171】

本発明によるこのようなヒドロゲル結合したインスリンプロドラッグにおいて、骨格鎖分解生成物（＜１０％）の有意量の放出が起こる前に、ほとんどすべてのインスリン放出（＞９０％）が起こることが望ましい。これは、ヒドロゲル分解速度に対してヒドロゲル結合インスリンプロドラッグの半減期を調整することによって達成することができる。

【0172】

好ましくは、式（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）

【化11】

（式中、Ｎ^ε−インスリンは、１つのリシン側鎖を介して結合されたインスリンのことである）又は

【化12】

の構造を有するインスリンプロドラッグである。

【0173】

好ましくは、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のヒドロゲルは、生分解性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの水不溶性ヒドロゲルである。

【0174】

好ましくは、（ＩＩａ）又は（ＩＩｂ）のヒドロゲルは、加水分解により分解可能な結合によって相互結合された骨格鎖部分で構成される。

【0175】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化13】

（式中、点線は骨格鎖部分の残りへの結合を示す）
の分枝コアを含む。

【0176】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化14】

（式中、ｎは５〜５０の整数であり、そして点線は分子の残りへの結合を示す）
の構造を含む。

【0177】

好ましくは、骨格鎖部分は、超分枝部分Ｈｙｐを含む。

【0178】

より好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化15】

（式中、点線は分子の残りへの結合を示し、そしてアスタリスクでマークされた炭素原子はＳ配置を示す）
の超分枝部分Ｈｙｐを含む。

【0179】

好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化16】

（式中、点線の１つは、超分枝部分Ｈｙｐへの結合を示し、そして第２の点線は、分子の残りへの結合を示し；そして
ｍは２〜４の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。

【0180】

好ましくは、骨格鎖部分は、以下の式：

【化17】

（式中、アスタリスクでマークされた点線は、ヒドロゲルとチオスクシンイミド基のＮとの間の結合を示し、
他の点線はＨｙｐへの結合を示し、そして
ｐは、０〜１０の整数である）
の少なくとも１つのスペーサーに結合している。

【0181】

好ましくは、骨格鎖部分は、以下の構造

【化18】

（式中、ｑは３〜１００の整数である）
を有するクロスリンカー部分を通して一緒に結合されている。

【0182】

骨格鎖とクロスリンカー部分の間の生分解性結合の加水分解速度は、ＰＥＧ−エステルカルボキシ基に隣接して結合された原子の数及びタイプによって決定される。例えばＰＥＧエステル形成のためコハク酸、脂肪酸又はグルタル酸から選択することによってクロスリンカーの分解半減期を変えることが可能である。

【0183】

本発明のヒドロゲル結合したインスリンプロドラッグは、当分野で知られている都合のよい方法によって本発明のヒドロゲルから出発して製造することができる。いくつかの経路が存在することは、当業者には明らかである。例えば生物活性部分が共有結合された上記プロドラッグリンカーを、部分的に又は全体として活性部分を有する又はすでに担持している本発明のヒドロゲルの反応性官能基と反応させることができる。

【0184】

好ましい製造方法において、ヒドロゲルは、化学ライゲーション反応を通して生成される。ヒドロゲルは、縮合又は付加のような反応を受ける相補的な官能基を有する２つの巨大分子遊離体から形成してもよい。これらの出発物質の一方は、少なくとも２つの同一官能基を有するクロスリンカー試薬（crosslinker reagent）であり、そしてもう一方の出発物質は、ホモ多官能性骨格鎖試薬（homomultifunctional backbone reagent）である。クロスリンカー試薬に存在する適切な官能基としては、末端アミノ、カルボン酸及び誘導体、マレイミド並びにビニルスルホンのような他のアルファ、ベータ不飽和マイケル受容体、チオール、ヒドロキシル基が含まれる。骨格鎖試薬中に存在する適切な官能基としては、アミノ、カルボン酸及び誘導体、マレイミド並びにビニルスルホンのような他のアルファ、ベータ不飽和マイケル受容体、チオール、ヒドロキシル基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

【0185】

クロスリンカー試薬反応性官能基が骨格鎖反応性官能基に関して化学量論量未満で（substoichiometrically）用いられる場合、生成したヒドロゲルは、骨格鎖構造に結合された遊離反応性官能基と反応性のヒドロゲルである。

【0186】

場合により、プロドラッグリンカーをインスリンに最初に結合してもよく、次いで生成したインスリン−プロドラッグリンカー複合体をヒドロゲルの反応性官能基と反応させてもよい。別法として、プロドラッグリンカーの官能基の１つを活性化した後、リンカー−ヒドロゲル複合体を第２の反応工程でインスリンと接触させてもよく、そしてヒドロゲル結合プロドラッグリンカーにインスリンを結合した後、過剰のインスリンを濾過によって除去してもよい。

【0187】

本発明によるプロドラッグの好ましい製造方法は、以下の通りである：
骨格鎖試薬合成の好ましい出発物質は、４−アームＰＥＧテトラアミン又は８−アームＰＥＧオクタアミンであり、ＰＥＧ試薬は、２０００〜１００００ダルトン、最も好ましくは２０００〜５０００Ｄａの範囲の分子量を有する。このようなマルチアームＰＥＧ−誘導体に、リシン残基を逐次的にカップリングして超分枝骨格鎖試薬を形成する。リシンは、カップリング工程中に保護基によって部分的に又は完全に保護することができ、そしてまた、最終的な骨格鎖試薬は、保護基を含んでもよいことが理解される。好ましい構成ブロックは、ビス−ｂｏｃリシンである。別法として、リシン残基の逐次付加の代わりに、樹枝状ポリリシン部分を最初に構成し、その後、４−アームＰＥＧテトラアミン又は８−アームＰＥＧオクタアミンにカップリングさせてもよい。３２個のアミノ基を担持する骨格鎖試薬を得ることが望ましく、結果的に、７個のリシンを４−アームＰＥＧの各アームに結合させるか、又は５個のリシンを８−アームＰＥＧの各アームに結合させる。別の実施態様において、マルチアームＰＥＧ誘導体は、テトラ−又はオクタカルボキシＰＥＧである。この場合、樹枝状部分は、グルタル又はアスパラギン酸から生成してもよく、そして生成した骨格鎖試薬は、３２個のカルボキシ基を担持する。骨格鎖試薬の官能基のすべて又は一部は、塩として、遊離形態で存在するか、又は保護基に結合されてもよいことが理解される。実際的な理由のため、ＰＥＧ−アーム当たりリシンの骨格鎖試薬の数は、６〜７個、より好ましくは約７個であることが理解される。

【0188】

好ましい骨格鎖試薬を以下に示す：

【化19】

【0189】

クロスリンカー試薬の合成は、０．２〜５ｋＤａ、より好ましくは０．６〜２ｋＤａの範囲の分子量を有する線状ＰＥＧ鎖から開始され、これはジカルボン酸、ほとんどアジピン酸又はグルタル酸の半エステルでエステル化されている。半エステル形成の好ましい保護基は、ベンジル基である。生成したビスジカルボン酸ＰＥＧ半エステルをアシルクロリド又は活性エステルのようなより反応性のカルボキシ化合物、例えばペンタフルオロフェニル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、最も好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転換し、そのうちの好ましい選ばれた構造を以下に示す。

【0190】

【化20】

【0191】

別法として、ビスジカルボン酸ＰＥＧ半エステルをＤＣＣ又はＨＯＢｔ又はＰｙＢＯＰのようなカップリング剤の存在下で活性化してもよい。

【0192】

別の実施態様において、骨格鎖試薬は、カルボキシ基を担持し、そして対応するクロスリンカー試薬は、エステル含有アミノ末端ＰＥＧ鎖から選ばれる。

【0193】

逆相乳化重合を用いて骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬を重合して本発明によるヒドロゲルを形成してもよい。骨格鎖とクロスリンカー官能基の間で所望の化学量論を選択した後、骨格鎖及びクロスリンカーをＤＭＳＯ中に溶解し、そして適当に選ばれたＨＬＢ値を有する適切なエマルゲーター（emulgator）、好ましくはArlacel P135を用い、機械的撹拌機を用いて撹拌速度を制御して逆エマルションを形成する。重合は、適切な塩基、好ましくはＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミンの添加によって開始する。適当な時間撹拌した後、酢酸のような酸及び水の添加によって反応をクエンチする。ビーズを集め、洗浄し、そして機械的篩分けによって粒径に従って分別する。場合により、この段階で保護基を除去してもよい。

【0194】

さらに、ヒドロゲルによって得られるのとは異なる反応性官能基を担持するスペーサーを用いて本発明によるこのようなヒドロゲルを官能化してもよい。例えば、Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳのような適切なヘテロ二官能性スペーサーをヒドロゲルにカップリングすることによってマレイミド反応性官能性基をヒドロゲルに導入してもよい。このような官能化ヒドロゲルは、リンカー部分に反応性チオール基を担持するインスリン−リンカー試薬にさらに結合して、本発明によるヒドロゲル結合インスリンプロドラッグを形成することができる。

【0195】

インスリン−リンカー複合体を官能化マレイミド基含有ヒドロゲルに装填した後、すべての残っている官能基をメルカプトエタノールのような適切なブロッキング試薬でキャップ形成して望ましくない副反応を予防する。

【0196】

本発明の好ましい実施態様では、リンカー部分に結合された遊離チオール基を担持するインスリン−リンカー複合体を、ｐＨ２〜５、好ましくはｐＨ２．５〜４．５、より好ましくはｐＨ３．０〜４．０の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温でマレイミド官能化ヒドロゲルと反応させる。その後、対応する生成したインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ２〜５、好ましくはｐＨ２．５〜４．０、より好ましくはｐＨ２．５〜３．５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温でメルカプトエタノールにより処理する。

【0197】

本発明の別の好ましい実施態様では、リンカー部分に結合されたマレイミド基を担持するインスリン−リンカー複合体を、ｐＨ２〜５、好ましくはｐＨ２．５〜４．５、より好ましくはｐＨ３．０〜４．０の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温で、チオール官能化ヒドロゲルと反応させる。その後、対応する生成したインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ２〜５、好ましくはｐＨ２．５〜４．０、より好ましくはｐＨ２．５〜３．５の緩衝水性溶液中、室温から４℃の間の温度で、より好ましくは室温で、マレイミド基含有低分子量化合物、好ましくは１００〜３００Ｄａのマレイミド含有化合物、例えばＮ−エチルマレイミドにより処理する。

【0198】

本発明の別の態様は、
（ａ）マレイミド官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度でチオール基を担持するインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成し；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で３４Ｄａ〜５００Ｄａのチオール含有化合物により処理する
工程を含む方法である。

【0199】

本発明の別の態様は、
（ａ）チオール官能化ヒドロゲルマイクロ粒子を含む水性懸濁液をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度でマレイミド基を担持するインスリン−リンカー試薬を含む溶液と接触させてインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体を生成し；
（ｂ）場合により、工程（ａ）からのインスリン−リンカー−ヒドロゲル複合体をｐＨ２〜５の緩衝水溶液中、室温から４℃の間の温度で１００〜３００Ｄａのマレイミド含有化合物により処理する
工程を含む方法である。

【0200】

本発明のプロドラッグの特に好ましい製造方法は、
（ａ）式Ｃ（Ａ'−Ｘ¹）₄（式中、Ａ'−Ｘ¹はＨｙｐ又はＨｙｐの前駆体に結合する前のＡを表し、そしてＸ１は適切な官能基である）の化合物を、
式Ｈｙｐ'−Ｘ²（式中、Ｈｙｐ'−Ｘ²はＡに結合する前のＨｙｐ又はＨｙｐの前駆体を表し、そしてＸ²はＸ¹と反応する適切な官能基である）の化合物と反応させ；
（ｂ）場合により工程（ａ）から生成した化合物を１つ又はそれ以上のさらなる工程で反応させて少なくとも４つの官能基を有する式Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）₄の化合物を得；
（ｃ）工程（ｂ）から生成した化合物の少なくとも４つの官能基をポリエチレングリオールベースのクロスリンカー前駆体と反応させ、その際、Ｃ（Ａ−Ｈｙｐ）₄の反応性官能基の総数と比較してクロスリンカー前駆体の活性なエステル基を化学量論量未満の量で用いてヒドロゲルを得；
（ｄ）工程（ｃ）のヒドロゲル骨格鎖中に残っている未反応の官能基（ヒドロゲル中に含まれる骨格鎖の反応性官能基を表す）を生物活性部分及び一過性プロドラッグリンカーの共有結合性複合体と反応させるか又は最初に未反応の官能基を一過性プロドラッグリンカー、続いて生物活性部分と反応させ；
（ｅ）場合により残っている未反応の官能基にキャップ形成して本発明のプロドラッグを得る
工程を含む。

【0201】

具体的には、本発明のインスリンプロドラッグのヒドロゲルは、以下にように合成される：
バルク重合では、骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬をアミン／活性エステル２：１〜１．０５：１の比率で混合する。

【0202】

骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬の両方をＤＭＳＯ中に溶解して１００ｍＬ当たり５〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｌ当たり７．５〜２０ｇ、そして最も好ましくは１００ｍｌ当たり１０〜２０ｇの濃度の溶液を得る。

【0203】

重合を実施するには、２〜１０％（体積）のＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）を、クロスリンカー試薬及び骨格鎖試薬を含むＤＭＳＯ溶液に加え、そして混合物を１〜２０秒間振盪し、そして放置したままにする。混合物は１分未満のうちに凝固する。

【0204】

本発明によるこのようなヒドロゲルは、機械的方法、例えば撹拌、破砕、切断 加圧成形又はミル処理、及び場合により篩分けによって粉砕されるのが好ましい。

【0205】

乳化重合では、反応混合物は、分散相及び連続相を含む。

【0206】

分散相のため、骨格鎖試薬及びクロスリンカー試薬をアミン／活性エステル比２：１〜１．０５：１で混合し、そしてＤＭＳＯ中に溶解して１００ｍＬ当たり５〜５０ｇ、好ましくは１００ｍｌ当たり７．５〜２０ｇ、そして最も好ましくは１００ｍｌ当たり１０〜２０ｇの濃度の溶液を得る。

【0207】

連続相は、ＤＭＳＯで混和性でなく、塩基性でなく、非プロトン性であり、そして１０Ｐａ＊ｓより低い粘度を示すあらゆる溶媒である。好ましくは、溶媒は、ＤＭＳＯと混和性でなく、塩基性でなく、非プロトン性であり、２Ｐａ＊ｓより低い粘度を示し、そして非毒性である。より好ましくは、溶媒は５〜１０個の炭素原子を有する飽和線状又は分枝炭化水素である。最も好ましくは、溶媒はｎ−ヘプタンである。

【0208】

連続相中の分散相のエマルションを形成するには、分散相を加える前に乳化剤を連続相に加える。乳化剤の量は、分散相１ｍＬ当たり２〜５０ｍｇ、より好ましくは、分散相１ｍＬ当たり５〜２０ｍｇ、最も好ましくは、分散相１ｍＬ当たり１０ｍｇである。

【0209】

乳化剤は、ＨＬＢ値３〜８を有する。好ましくは、乳化剤は、ソルビトール及び脂肪酸のトリエステル又はポリ（ヒドロキシル脂肪酸）−ポリ（エチレングリコール）複合体である。より好ましくは、乳化剤は、０．５ｋＤａから５ｋＤａまでの範囲の分子量の線状ポリ（エチレングリコール）及び鎖の各末端において０．５ｋＤａから３ｋＤａの範囲の分子量のポリ（オキシ脂肪酸）単位を有するポリ（オキシ脂肪酸）−ポリエチレングリコール複合体である。最も好ましくは、乳化剤は、ポリ（エチレングリコール）ジポリヒドロキシステアレート、シトロールＤＰＨＳ（Cithrol DPHS）（Cithrol DPHS, 以前のアラセルＰ１３５（Arlacel P135）, Croda International Plc）である。

【0210】

分散相の液滴は、Isojet、Intermig、Propeller（EKATO Ruhr- und Mischtechnik GmbH, Germany)）のような撹拌機に類似した、最も好ましくは反応器直径の５０〜９０％の直径を有するIsojetに類似した形状を有する軸流羽根車（axial flow impeller）を用いた撹拌によって生成される。好ましくは、分散相を添加する前に撹拌を開始する。撹拌機の速度は、０．６〜１．７ｍ／秒に設定する。分散相を室温で加え、そして分散相の濃度は、全体反応体積の２％〜７０％、好ましくは５〜５０％、より好ましくは１０〜４０％、そして最も好ましくは２０〜３５％である。塩基を効果重合（effect polymerization）に加える前に、分散相、乳化剤及び連続相の混合物を５〜６０分間撹拌する。

【0211】

塩基５〜１０当量（形成される各アミド結合に関して）を分散及び連続相の混合物に加える。塩基は、分散相中で非プロトン性、非求核性及び可溶性である。好ましくは、塩基は、分散相及びＤＭＳＯの両方において非プロトン性、非求核性、十分に可溶性である。より好ましくは、塩基は、分散相及びＤＭＳＯの両方において非プロトン性、非求核性、十分に可溶性、アミン塩基、そして非毒性である。最も好ましくは、塩基は、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）である。塩基存在下での撹拌は、１〜１６時間継続する。

【0212】

撹拌中に、分散相の液滴が硬化して本発明による架橋されたヒドロゲルビーズになり、これは集めることができ、そして７５μｍ及び３２μｍデッキを有する振動連続篩分け装置においてサイズによる分別を実施して本発明によるヒドロゲルマイクロ粒子を得る。

【0213】

本発明の別の態様は、式（ＩＩＩａ）及び（ＩＩＩｂ）

【化21】

（式中、Ｎ^ε−インスリンは、１つのリシン側鎖を介して連結されたインスリンのことである）及び

【化22】

のインスリン−リンカー複合体である。

【0214】

本発明の別の態様は、インスリン−リンカー試薬Ｄ−Ｌ^*、
［式中、
Ｄは、インスリン部分を表し；そして
Ｌ^*は、式（ＩＶ）、

【化23】

（式中、点線は、アミド結合の形成によるインスリンのアミノ基の１つへの結合を示し；
Ｘは、Ｃ（Ｒ³Ｒ^3a）；又はＮ（Ｒ³）であり；
Ｒ^1a、Ｒ^3aは、Ｈ、ＮＨ（Ｒ^2b）、Ｎ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれ；
Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ^2a、Ｒ^2b、Ｒ³、Ｒ⁴は、Ｈ及びＣ_1-4アルキルからなる群より独立して選ばれる）
によって表される生物活性のないリンカー試薬であり、
ここにおいて、Ｌ^*は１つのＬ^2*で置換されており、そして場合によりさらに置換されるが、但し、式（ＩＶ）中のアスタリスクでマークされる水素は、置換基によって置き換えられることはなく、そしてここにおいて、
Ｌ^2*は、Ｌ^*に連結したスペーサーであり、そして反応性の生分解性ヒドロゲルに結合するための化学官能基を含む］
である。

【0215】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＲ²は、Ｌ^2*によって置き換えられる。

【0216】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＲ¹は、Ｌ^2*によって置き換えられる。

【0217】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＸは、Ｎ（Ｒ³）である。

【0218】

より好ましくは、式（ＩＶ）中のＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、そしてＲ^3aはＮ（Ｒ^2b）Ｃ（Ｏ）Ｒ⁴である。

【0219】

より好ましくは、式（ＩＶ）中のＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、そしてＲ^3aはＬ^2*によって置き換えられる。

【0220】

さらにより好ましくは、式（ＩＶ）中のＸはＣ（Ｒ³Ｒ^3a）であり、Ｒ^3aはＮ（Ｒ^2b）−Ｌ^2*である。

【0221】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＬ^*は、さらに置換されない。

【0222】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＬ^2*は、チオール基を含む。

【0223】

好ましくは、式（ＩＶ）中のＬ^2*は、マレイミド基を含む。

【0224】

本発明のプロドラッグのためのヒドロゲルは、マイクロ粒子の形態で製造方法から得ることができる。本発明の好ましい実施態様において、反応性ヒドロゲルは、メッシュ又はステントのような形状の物品である。最も好ましくは、ヒドロゲルは、標準注射器によって皮下又は筋肉内注射として投与することができるマイクロ粒子ビーズに形成される。このような軟質ビーズは、１〜５００マイクロメートルの直径を有してもよい。

【0225】

好ましくは、マイクロ粒子は、等張性の水性処方物バッファ中に懸濁される場合、１０〜１００マイクロメートルの直径、最も好ましくは２０〜１００マイクロメートルの直径、最も好ましくは２５〜８０マイクロメートルの直径を有する。

【0226】

好ましくは、マイクロ粒子は、内径０．６ｍｍより小さな針、好ましくは、内径０．３ｍｍより小さな針、より好ましくは、内径０．２２５ｍｍより小さな針、さらにより好ましくは、内径０．１７５ｍｍより小さな針、そして最も好ましくは内径０．１６ｍｍより小さな針を通した注射によって投与することができる。

【0227】

「注射によって投与することができる」、「注射可能な」又は「注射可能性（injectability）」という用語は、一定濃度（ｗ／ｖ）及び一定温度の液体中で膨潤した本発明による生分解性ヒドロゲルを含む注射器のプランジャーにかかる一定の力、このような注射器の排出口につながれた所定の内径の針、並びに本発明による生分解性ヒドロゲルの一定体積を注射器から針まで押し出すのに必要な時間といったような要因の組み合わせのことであると理解される。

【0228】

注射可能性を得るためには、水中で少なくとも５％（ｗ／ｖ）濃度に膨潤し、そして直径４．７ｍｍのプランジャーを保持する注射器中に含まれた本発明によるインスリンプロドラッグ１ｍＬの体積を、５０ニュートン未満の力を適用することによって室温で１０秒以内に押し出さなければならない。

【0229】

注射可能性は、水中で約１０％（ｗ／ｖ）の濃度に膨潤した本発明によるインスリンプロドラッグについて達成されることが好ましい。

【0230】

さらに、インスリンのＢ鎖に見出される単一の遊離ε−アミノ基及びそのアナロガ（analoga）を保護されたチオール又は他の官能基を含むアシル化剤で選択的にアシル化する一工程方法が提供される。組換え型のヒトインスリン、インスリングラルギン及びインスリンアスパルトについて、アシル化の部位はＬｙｓＢ２９のε−アミノ基であり、インスリンリスプロの場合、アシル化の部位はＬｙｓＢ２８のε−アミノ基であり、そしてインスリングルリシンの場合、アシル化の部位はＬｙｓＢ３のε−アミノ基である。この方法は、前記のインスリン及びインスリンアナロガに限定されるわけではないが、ε−アミノ基を含む限り、他のインスリンアナロガに適用することができ、そして当業者はアシル化に適した対応するリシン残基を特定することができることが理解される。

【0231】

本発明による別の態様は、極性溶媒中、ｐＨ８．０から９．０より下でインスリン又はインスリン類似体を１つ又はそれ以上の保護官能基を含む可溶性アシル化剤と反応させることを含む、１つ又はそれ以上の遊離α−アミノ基及び遊離ε−アミノ基を有するインスリン又はインスリン類似体のε−アミノ基を、１つ又はそれ以上の保護官能基を含むアシル化剤でアシル化する方法である。前記条件で安定であるような保護基のみを用いるべきであることは理解される。

【0232】

反応は、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ジメチルアセトアミド、アセトニトリルの水性混合溶媒のような極性溶媒中、ｐＨ約８．００から９．０より下、好ましくは、８．０から８．９まで、より好ましくは、８．３から８．７までの範囲の塩基性条件下で、１つ又はそれ以上の保護された官能基を含むリンカー試薬のようなアシル化剤をインスリン又はインスリン類似体のε−アミノ基と反応させることによって実施される。

【0233】

本発明の別の態様は、インスリン又はインスリン類似体のε−窒素に結合したアシル基を有し、その際、このようなアシル基は１つ又はそれ以上の保護官能基を有することを特徴とするインスリン化合物である。

【0234】

本発明の別の態様は、本発明のプロドラッグ又はその薬学的に許容しうる塩を薬学的に許容しうる賦形剤と共に含む薬学的組成物である。薬学的組成物を以下の段落でさらに説明する。

【0235】

インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、懸濁液組成物として又は乾燥組成物として提供されうる。 好ましくは、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、乾燥組成物である。適切な乾燥方法は、例えば、噴霧乾燥及び凍結乾燥（フリーズドライ）である。

【0236】

好ましくは、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、凍結乾燥によって乾燥される。好ましくは、インスリンヒドロゲルプロドラッグは、１回の適用で少なくとも３日間、治療有効量のインスリンを供給する組成物において十分に投薬される。

【0237】

より好ましくは、１週間に１回のインスリンヒドロゲルプロドラッグの適用で十分である。

【0238】

本発明によるインスリン−ヒドロゲルプロドラッグの薬学的組成物は、１つ又はそれ以上の賦形剤を含む。

【0239】

非経口組成物に用いられる賦形剤は、緩衝剤、等張性調整剤、防腐剤、安定剤、抗吸着剤、酸化防止剤、増粘剤（viscosifiers）／粘度増強剤（viscosity enhancing agents）、又は他の補助剤として分類してもよい。いくつかの場合、これらの成分は、二つ又は三つの機能を有してもよい。本発明によるインスリン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、以下の群から選ばれる１つ又はそれ以上の賦形剤を含む：
（ｉ）緩衝剤：所望の範囲にｐＨを維持する生理学的に許容しうるバッファ、例えばナトリウムのリン酸塩、炭酸水素塩、コハク酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物、ピルビン酸。また、酸中和剤、例えばＭｇ（ＯＨ）₂又はＺｎＣＯ₃を用いてもよい。緩衝能力は、ｐＨ安定性に最も感受性の状態に合わせて調整してもよい。
（ｉｉ）等張性調整剤：注射デポ剤での浸透圧の違いによる細胞損傷から生じることがある疼痛を最小限にするため。例として、グリセリン及びナトリウムクロリドがある。有効濃度は、血清について２８５〜３１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの推定浸透圧を用いて浸透圧測定によって決定することができる。
（ｉｉｉ）防腐剤及び／又は抗菌剤：反復投与の非経口製剤では、患者が注射時に感染するリスクを最小限にするために十分な濃度で防腐剤を添加する必要があり、そして対応する規制上の要件は確立されている。典型的な防腐剤としては、ｍ−メタクレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロソール（thimerosol）、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾール、及び塩化ベンザルコニウムが含まれる。
（ｉｖ）安定剤：安定化は、タンパク質安定化力を強化することによって、変性したステーター（stater）の不安定化によって、又は賦形剤をタンパク質に直接結合することによって達成される。安定剤は、アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリン、糖、例えばグルコース、スクロース、トレハロース、ポリオール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、塩、例えばリン酸カリウム、硫酸ナトリウム、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、六リン酸エステル、リガンド、例えば二価金属イオン（亜鉛、カルシウム、など）、他の塩又は有機分子、例えばフェノール系誘導体であってもよい。さらに、オリゴマー又はポリマー、例えばシクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、ＰＥＧ又はＰＶＰ又はプロタミン又はＨＳＡを用いてもよい。
（ｖ）抗吸着剤：主にイオン性若しくは非イオン性界面活性剤又は他のタンパク質又は可溶性のポリマーを用いて組成物又は組成物の容器の内面にコーティングする又は競合的に吸着させる。例えば、ポロキサマー（プルロニック（Pluronic）Ｆ−６８）、ＰＥＧドデシルエーテル（ブリッジ（Brij）３５）、ポリソルベート２０及び８０、デキストラン、ポリエチレングリコール、ＰＥＧ−ポリヒスチジン、ＢＳＡ及びＨＳＡ並びにゼラチン。賦形剤の濃度及びタイプの選択は、回避すべき効果により左右されるが、典型的にＣＭＣ値のすぐ上では界面に界面活性剤の単層が形成される。

【0240】

（ｖｉ）リオプロテクタント（lyoprotectants）及び／又は凍結防止剤：凍結乾燥又は噴霧乾燥中に、賦形剤は、水素結合切断及び水除去によって生じる不安定化効果を打ち消しうる。この目的のため、糖及びポリオールを用いてもよいが、対応する陽性効果は、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒及び他のペプチドについても観察されている。トレハロースは、水分に誘発された凝集を低下させるのに特に有効であり、そしてまた、タンパク質の疎水基が水に曝露されることによって生じる可能性がある熱安定性を改善する。また、マンニトール及びスクロースは、単独のリオプロテクタント／凍結防止剤として又は相互の組み合わせのいずれかで用いてもよく、その際、より高い比率のマンニトール：スクロースは、凍結乾燥されたケークの物理的安定性を強化することが知られている。また、マンニトールをトレハロースと合わせてもよい。また、トレハロースをソルビトールと合わせてもよく、又はソルビトールは単独の保護剤として用いられる。また、デンプン又はデンプン誘導体を用いてもよい。
（ｖｉｉ）酸化防止剤：抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、没食子酸プロピル、ビタミンＥ、キレート剤、例えばクエン酸、ＥＤＴＡ、六リン酸エステル、チオグリコール酸
（ｖｉｉｉ）増粘剤（viscosifiers）又は粘度増強剤（viscosity enhancers）：バイアル及び注射器中で粒子の沈降を遅らせ、そして粒子の混合及び再懸濁を促進するため、そして注射がより容易な（すなわち、注射器のプランジャーにおける力が弱い）懸濁液を作るために用いられる。適切な増粘剤又は粘度増強剤は、例えば、カルボポール（Carbopol）９４０、カルボポールウルトレッツ（Ultrez）１０のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ヒプロメロース、ＨＰＭＣ）又はジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ又はＤＥＡＥ−Ｃ）のようなセルロース誘導体、コロイド状ケイ酸マグネシウム（Veegum）又はケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、サチアガム（Satia gum）ＵＴＣ３０のようなカラゲナン、脂肪族ポリ（ヒドロキシ酸）、例えばポリ（Ｄ，Ｌ −又はＬ−乳酸）（ＰＬＡ）及びポリグリコール酸（ＰＧＡ）並びにそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）、Ｄ，Ｌ−ラクチド、グリコリド及びカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オキシプロピレン）−ポリ（オキシエチレン）（例えばプルロニック（登録商標））のトリブロックを構成するための親水性ポリ（オキシエチレン）ブロック及び疎水性ポリ（オキシプロピレン）ブロック、ポリエチルエステルコポリマー、例えばポリエチレングリコールテレフタレート／ポリブチレンテレフタレートコポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル（ＳＡＩＢ）、デキストラン又はその誘導体、デキストラン及びＰＥＧの組み合わせ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ（アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム（ＤＡＤＭＡ））、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、例えばデルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン、疎水性Ａブロック、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）又はポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）及び親水性Ｂブロック、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリビニルピロリドンで構成されたＡＢＡトリブロック又はＡＢブロックコポリマーである。前記のポロキサマーと同様にこのようなブロックコポリマーは、逆熱ゲル化（reverse thermal gelation）挙動（投与を容易にするため室温で流体状態、そして注射後に体温でゾル−ゲル転移温度より上のゲル状態）を示すことがある。
（ｉｘ）拡散（spreading）又は拡散剤（diffusing agent）：限定されるわけではないが、結合組織の細胞間隙に見出されるヒアルロン酸、多糖類のような組織間隙（intrastitial space）中の細胞外マトリックス成分の加水分解を通して結合組織の透過性を改良する。ヒアルロニダーゼのような拡散剤は、一時的に、細胞外マトリックスの粘度を低下させ、そして注射された薬物の拡散を促進する。
（ｘ）他の補助剤：例えば湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼ。酸及び塩基、例えば塩酸及び水酸化ナトリウムは、製造中のｐＨ調整に必要な補助剤である。

【0241】

好ましくは、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物は、１つ又はそれ以上の増粘剤及び／又は粘度調整剤を含む。

【0242】

「賦形剤」という用語は、好ましくは、治療剤と共に投与される希釈剤、佐剤（adjuvant）又は媒体（vehicle）のことである。このような薬学的賦形剤は、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油及び同様のものを含むが、それらに限定されるわけではない、石油、動物、植物又は合成由来のものを含む水及び油のような滅菌液であることができる。薬学的組成物を経口投与するとき、水は好ましい賦形剤である。生理食塩水及び水性デキストロースは、薬学的組成物を静脈内に投与するとき、好ましい賦形剤である。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、注射剤用の液体賦形剤として用いることが好ましい。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール及び同様のものが含まれる。組成物は、所望により、少量の湿潤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含むこともできる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドのような、従来の結合剤及び賦形剤を用いて坐剤として処方することができる。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準賦形剤を含むことができる。適切な薬学的賦形剤の例は、E.W. Martinによって“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。このような組成物は、患者に適当な投与形態を提供するために治療有効量の治療剤を、好ましくは精製された形態で適切な量の賦形剤と共に含む。製剤は投与方法に適していなければならない。

【0243】

一般的な実施態様において、本発明の薬学的組成物は、乾燥形態で又は懸濁液として又は別の形態であるかどうかにかかわらず、単回又は反復投与組成物として提供されうる。

【0244】

本発明の一実施態様において、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物は、一回量として提供され、それは、供給される容器が１回の薬学的用量を含むことを意味する。

【0245】

従って、本発明の別の態様において、組成物は単回投与組成物として提供される。

【0246】

好ましくは、懸濁液組成物は反復投与組成物であり、それは１回を超える治療用量を含むことを意味する。

【0247】

好ましくは、反復投与組成物は、少なくとも２用量を含む。インスリン−ヒドロゲルのこのような反復投与組成物は、それを必要とする異なる患者に用いるか又は１人の患者に用いることを意図するかいずれかであることができ、その際、初回投与を適用した後、残りの用量は、必要になるまで保存される。

【0248】

本発明の別の態様において、組成物は容器中に含まれる。好ましくは、容器はデュアルチャンバー型注射器（dual-chamber）である。特に、本発明による乾燥組成物はデュアルチャンバー型注射器の第１のチャンバーに提供され、そして再構成溶液はデュアルチャンバー型注射器の第２のチャンバーに提供される。

【0249】

インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物を、それを必要とする患者に適用する前に、乾燥組成物を再構成する。再構成は、バイアル、注射器、デュアルチャンバー型注射器、アンプル及びカートリッジ中のようなインスリン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物が提供される容器中で行うことができる。再構成は、所定量の再構成溶液を乾燥組成物に加えることによって行われる。再構成溶液は、水又はバッファのような滅菌液であり、それは防腐剤及び／又は抗菌剤のようなさらなる添加剤を含んでもよい。インスリン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物が一回量として提供される場合、再構成溶液は、１つ又はそれ以上の防腐剤及び／又は抗菌剤を含んでもよい。好ましくは、再構成溶液は滅菌水である。インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物が反復投与組成物である場合、再構成溶液は、例えばベンジルアルコール及びクレゾールのような１つ又はそれ以上の防腐剤及び／又は抗菌剤を含むことが好ましい。

【0250】

本発明のさらなる態様は、再構成されたインスリンヒドロゲルプロドラッグ組成物の投与方法に関する。インスリンヒドロゲルプロドラッグ組成物は、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、骨内、及び腹腔内を含む注射又は注入方法によって投与することができる。

【0251】

さらなる態様は、治療有効量のインスリンヒドロゲルプロドラッグ、及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含み、ここにおいて、インスリンはヒドロゲルに一時的に結合された、再構成された組成物の製造方法であって、
・本発明の組成物を再構成溶液と接触させる
工程を含む前記方法である。

【0252】

別の態様は、治療有効量のインスリンヒドロゲルプロドラッグ、及び場合により１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤を含む再構成された組成物であって、ここにおいて、インスリンは上記の方法によって入手可能なヒドロゲルに一時的に結合された前記組成物である。

【0253】

本発明の別の態様は、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの乾燥組成物の製造方法である。

【0254】

一実施態様において、このような懸濁液組成物は、
（ｉ）インスリン−ヒドロゲルプロドラッグを１つ又はそれ以上の賦形剤と混合し、
（ｉｉ）単回又は反復投与に相当する量を適切な容器に移し、
（ｉｉｉ）前記容器中の組成物を乾燥し、そして
（ｉｖ）容器を密閉すること
によって製造される。

【0255】

適切な容器は、バイアル、注射器、デュアルチャンバー型注射器、アンプル、及びカートリッジである。

【0256】

別の態様は、パーツのキットである。投与器具が単に皮下注射器であるとき、キットは、注射器、針並びに注射器に使用するための乾燥インスリン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物を含む容器及び再構成溶液を含む第２の容器を含んでもよい。より好ましい実施態様において、注射器具は、単純な皮下注射器とは異なり、従って、再構成されたインスリン−ヒドロゲルプロドラッグを有する別々の容器は、使用する際に容器中の液体組成物が、注射器具の排出口とつながった液体中にあるように注射器具と係合するよう構成されている。投与器具の例としては、皮下注射器及びペン型注入器具が含まれるが、それらに限定されるわけではない。特に好ましい注射器具は、ペン型注入器具であり、その場合、容器はカートリッジ、好ましくは使い捨てのカートリッジである。

【0257】

好ましいパーツのキットは、注射針及び本発明による組成物を含み、そして場合によりさらに再構成溶液を含む容器を含み、容器は注射針用に合わせてある。好ましくは、容器はデュアルチャンバー型注射器である。

【0258】

別の態様において、本発明は、ペン型注入器具の使用について先に記載されたようにインスリン−ヒドロゲルプロドラッグの組成物を含むカートリッジを提供する。カートリッジは、一回量又は多回用量のインスリンを含んでもよい。

【0259】

本発明の一実施態様において、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグの懸濁液組成物は、インスリン−ヒドロゲルプロドラッグ及び１つ又は複数の賦形剤を含むだけでなく、また他の生物活性物質（biologically active agents）も、その遊離形態で又はプロドラッグとしてのいずれかで含む。好ましくは、このようなさらなる１つ又はそれ以上の生物活性物質は、プロドラッグ、より好ましくはヒドロゲルプロドラッグである。このような生物活性物質には、以下の種類の化合物が含まれるが、それらに限定されるわけではない：（ｉ）スルホニル尿素、例えば、クロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリブリド、グリピジド、グリメピリド、及び同様のものなど、
（ｉｉ）メグリチニド、例えば、レパグリニドなど、
（ｉｉｉ）グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びその模倣剤、グルコース−インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）及びその模倣剤、エキセンジン及びその模倣剤、及びジペプチルプロテアーゼ阻害剤（Dipeptyl Protease Inhibitors）（ＤＰＰＩＶ）、
（ｉｖ）ビグアニド、例えば、メトホルミンなど、
（ｖ）チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、イサグリタゾン（isaglitazone）（ＭＣＣ−５５５として知られる）、２−［２−［（２Ｒ）−４−ヘキシル−３,４−ジヒドロ−３−オキソ−２Ｈ−１,４−ベンゾオキサジン−２−イル］エトキシ］−ベンゼン酢酸、及び同様のものなど
（ｖｉ）ＧＷ２５７０、及び同様のもの、
（ｖｉｉ）レチノイド−Ｘ受容体（ＲＸＲ）モジュレーター、例えば、ターグレチン、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、及び同様のものなど、
（ｖｉｉｉ）他のインスリン抵抗性改善剤（insulin sensitizing agents）、例えば、ＩＮＳ−１、ＰＴＰ−１Ｂ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼａ阻害剤、フルクトース−１,６−ビスホスファターゼ阻害剤、及び同様のものなど；
（ｉｘ）通常のインスリン、又は速効型、中間型及び持続型インスリン、を含むインスリン、吸入用インスリン並びにインスリン類似体、例えば天然アミノ酸配列においてマイナーな違いを有するインスリン分子
（ｘ）Ｌ−７８３２８１、ＴＥ−１７４１１、及び同様のものを含むが、それらに限定されるわけではないインスリンの小分子模倣剤、
（ｘｉ）Ｎａ−グルコース共輸送体阻害剤、例えばＴ−１０９５、Ｔ−１０９５Ａ、フロリゼン（phlorizen）、及び同様のもの；
（ｘｉｉ）プラムリンチド、及び同様のものを含むがそれらに限定されるわけではないアミリン作動剤、
（ｘｉｉｉ）グルカゴン拮抗剤、例えばＡＹ−２７９９５５、及び同様のもの。

【0260】

抗糖尿病剤に加えて、生物活性化合物には、抗肥満剤、例えばオルリスタット、脂肪の分解及び吸収を予防する膵リパーゼ阻害剤；又はシブトラミン、食欲抑制剤並びに脳内のセロトニン、ノルエピネフリン及びドーパミンの再取り込み阻害剤、脂肪動員を増強する成長因子（例えば、成長ホルモン、ＩＧＦ−１、成長ホルモン放出因子）、オキシントモジュリン及びグレリンモジュレーターであってもよい。他の潜在的生物活性抗肥満剤としては、アドレナリン作用機構を通して作用する食欲抑制剤、例えば、ベンズフェタミン、フェンメトラジン、フェンテルミン、ジエチルプロピオン、マジンドール、シブトラミン、フェニルプロパノールアミン又はエフェドリン；セロトニン作動性機構を通して作用する食欲抑制剤、例えばキパジン、フルオキセチン、セルトラリン、フェンフルラミン、又はデクスフェンフルラミン；ドーパミン機構を通して作用する食欲抑制剤、例えば、アポモルヒネ；ヒスタミン作動性機構を通して作用する食欲抑制剤（例えば、ヒスタミン模倣剤、Ｈ３受容体モジュレーター）；エネルギー消費の促進剤、例えばベータ−３アドレナリン作動剤及び脱共役タンパク質機能の刺激剤；レプチン及びレプチン模倣剤（例えば、メトレレプチン）；ニューロペプチドＹ拮抗剤；メラノコルチン−１、３及び４受容体モジュレーター；コレシストキニン作動剤；グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）模倣剤及び類似体（例えば、エキセンジン）；アンドロゲン（例えば、デヒドロエピアンドロステロン及び誘導体、例えばエチオコランジオン（etiocholandione））、テストステロン、アナボリックステロイド（例えば、オキサンドロロン）、及びステロイドホルモン；ガラニン受容体拮抗剤；サイトカイン剤（cytokine agent）、例えば毛様体神経栄養因子；アミラーゼ阻害剤；エンテロスタチン作動剤／模倣剤；オレキシン／ヒポクレチン拮抗剤；ウロコルチン拮抗剤；ボンベシン作動剤；プロテインキナーゼＡのモジュレーター；副腎皮質刺激ホルモン放出因子模倣剤；コカイン及びアンフェタミンで調節された転写物模倣剤（cocaine- and amphetamine-regulated transcript mimetics）；カルシトニン遺伝子関連ペプチド模倣剤；並びに脂肪酸合成酵素阻害剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。

【0261】

別の実施態様において、最初にインスリン−ヒドロゲルプロドラッグを、それを必要とする患者に投与し、その後、第２の化合物を投与するようなやり方で本発明によるインスリン−ヒドロゲルプロドラッグ組成物を、第２の生物活性化合物と組み合わせる。別法として、別の化合物を同じ患者に投与した後、インスリン−ヒドロゲル組成物を、それを必要とする患者に投与する。

【0262】

本発明のさらに別の態様は、本発明のプロドラッグ又は薬剤として使用するための本発明の薬学的組成物である。

【0263】

本発明のさらに別の態様は、インスリンによって治療することができる疾患又は障害の治療又は予防方法に使用するための本発明のプロドラッグ又は本発明の薬学的組成物である。

【0264】

このような疾患又は障害は、例えば高血糖、糖尿病前症、耐糖能異常、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、Ｘ症候群、肥満、高血圧症である。

【0265】

本発明に記載された持効型インスリン組成物による治療を必要とする患者は、共存症を発症する危険性が高い。従って、本持効型インスリンと適切な生物活性化合物との組み合わせを、例えば、高血圧症（収縮期高血圧症及び家族性脂質異常性高血圧症を含むが、これらに限定されるものではない）、うっ血性心不全、左心室肥大、末梢動脈疾患、糖尿病性網膜症、黄斑変性、白内障、糖尿病性腎症、糸球体硬化症、慢性腎不全、糖尿病性神経障害、Ｘ症候群、月経前症候群、冠動脈性心疾患、狭心症、血栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性虚血発作、脳卒中、血管再狭窄、高血糖症、高インスリン血症、高脂質血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、グルコース代謝障害（impaired
glucose metabolism）、耐糖能異常（impaired glucose tolerance）の状態、空腹時血漿グルコース異常（impaired fasting plasma glucose）の状態、肥満、勃起障害、皮膚及び結合組織障害、足潰瘍及び潰瘍性大腸炎、内皮機能不全及び血管コンプライアンス障害（impaired vascular compliance）からなる群より選ばれる疾患及び障害の予防、進行の遅延又は治療に用いてもよい。

【0266】

上記の群から選ばれる疾患及び障害の予防、進行の遅延又は治療は、本発明の持効型インスリン組成物とＡＴ１−受容体拮抗剤；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；レニン阻害剤；ベータアドレナリン受容体遮断剤；アルファアドレナリン受容体遮断剤；カルシウムチャネル遮断剤；アルドステロン合成酵素阻害剤；アルドステロン受容体拮抗剤；中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤；二重アンギオテンシン変換酵素／中性エンドペプチダーゼ（ＡＣＥ／ＮＥＰ）阻害剤；エンドセリン受容体拮抗剤；利尿剤；スタチン；ニトラート；抗凝固剤；ナトリウム利尿ペプチド；ジギタリス化合物；ＰＰＡＲモジュレーターを含む、前記状態の治療に用いられる薬物種から選ばれる少なくとも１つの生物活性化合物との組み合わせによって達成することができる。

【0267】

また、生物活性物質；プロドラッグ、特にヒドロゲルプロドラッグが１つ又はそれ以上の酸性又は塩基性基を含む場合、本発明は、それらの対応する薬学的に又は毒物学的に許容しうる塩、特にそれらの薬学的に利用できる塩も含む。従って、酸性基を含むプロドラッグは、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩として又はアンモニウム塩として本発明に従って用いることができる。このような塩のより具体的な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩又はアンモニア若しくは有機アミン、例えば、エチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミンなど若しくはアミノ酸との塩が含まれる。１つ又はそれ以上の塩基性基、すなわち、プロトン化されうる基を含むプロドラッグは、存在することができ、そして無機又は有機酸とのそれらの付加塩の形態で本発明により用いられることができる。適切な酸の例としては、塩化水素、臭化水素、リン酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、サリチル酸、安息香酸、ギ酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、スルファミン酸、フェニルプロピオン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、イソニコチン酸、クエン酸、アジピン酸、及び当業者に知られている他の酸が含まれる。また、プロドラッグが分子中に酸性及び塩基性基を同時に含む場合、本発明は、記載された塩形態に加えて分子内塩又はベタイン（両性イオン）を含む。それぞれの塩は、当業者に知られている慣用の方法によって、例えば、これらを溶媒若しくは分散媒中で有機若しくは無機の酸若しくは塩基と接触させることによって、又は他の塩を用いて陰イオン交換若しくは陽イオン交換によって得ることができる。また、本発明は、低い生理学的適合性のため、薬剤に使用するには直接適してないが、例えば、化学反応の中間体として又は薬学的に許容しうる塩を製造するために用いることができるプロドラッグのすべての塩を含む。

【0268】

「薬学的に許容しうる」という用語は、動物、好ましくはヒトに使用するために監督機関、例えばＥＭＥＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）及び／又は任意の他国の監督機関によって認可されたことを意味する。

【0269】

本発明のさらに別の態様は、治療有効量の本発明のプロドラッグ又は本発明の薬学的組成物又はその薬学的に許容しうる塩を患者に投与することを含む、１つ又はそれ以上の状態の治療を必要とする哺乳動物患者、好ましくはヒトにおいて治療、抑制、遅延又は予防する方法である。

【図面の簡単な説明】

【0270】

【図1a】インスリン−リンカー複合体１２ａのＵＰＬＣクロマトグラム

【図1b】インスリン−リンカー複合体の１２ｂのＵＰＬＣクロマトグラム

【図2】インスリン６ｍｇを含む試験品目１１ａを健常なラットに単回皮下投与した後、２週間にわたる動物１〜１０の平均血漿インスリン濃度を示す。（エラーバーは、全１０匹の動物から導出された±標準偏差として示し、ｔ₀値は投薬３日前に得た。）

【図3】インスリン３ｍｇを含む試験品目１１ｄａを健常なラットに単回皮下投与した後、１３日間にわたる動物１〜８の平均血漿インスリン濃度。（エラーバーは、誤差横棒は、全８匹の動物から導出された±標準偏差として示し、ｔ₀値は投薬１日前に得た。）

【図4】インスリン６．４ｍｇを含む試験品目１１ｄａを糖尿病ラット（ｎ＝７）に単回皮下投与した後の血漿インスリン濃度（灰色の四角）及び血糖値（黒丸）。（エラーバーは、全７匹の動物から導出された±標準偏差であり、ｔ₀値は投薬４日前に得た。）

【図5】８ｍｇ／ｋｇの試験品目１１ｄｂを健常なラットに単回皮下投与した後、投薬後の最初の２４時間における平均血漿インスリン値（バースト分析）。８匹のラットを２群に分け、そして薬物動態用の血液サンプルを両群の間で交互に採取した。いずれの群でも、バースト効果は感知できなかった。（エラーバーは、群当たりすべての動物から導出された±標準偏差であり、ｔ₀値は投薬１日前に得た。）

【図6】８ｍｇ／ｋｇの試験品目１１ｄａを糖尿病ラット（ｎ＝８）に週１回で３回皮下投与した後、４週間の間の血漿インスリン濃度（灰色の四角）及び血糖レベル（黒丸）。（エラーバーは、全８匹の動物から導出された±標準偏差であり、ｔ₀値は投薬の３日前に得た。）

【図7】試験品目１１ｄｃ中に処方された１２ｍｇ／ｋｇのインスリンを健常なラットに単回皮下投与した後、１３日間にわたる動物１〜８（０．３、１時間、２及び４時間値について、それぞれ動物１〜４及び動物５〜８）の平均血漿インスリン濃度。（エラーバーは、全８匹の動物から導出された＋／−標準偏差として示し、ｔ₀値は投薬４日前に得た）

【図8】インスリン放出及びインスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ａのヒドロゲル分解のオーバレイ。ｐＨ７．４及び３７℃でインスリン−リンカー−ヒドロゲルをインキュベーションした際のインスリン−リンカー−ヒドロゲル中のインスリン含量（三角）及び骨格鎖部分の放出（丸）の量をインキュベーション時間に対してプロットした。

【図9】３０Ｇの注射針を用いた力対流量をプロットしたグラフを示す。データポイント：黒四角＝エチレングリコール；黒三角＝水；黒点＝ヒドロゲルインスリンプロドラッグ。

【0271】

実施例
物質及び方法
組換え型のヒトインスリンは、Biocon Ltd., Bangalore, Indiaから入手した。アミノ４−アームＰＥＧ ５ｋＤａは、JenKem Technology, Beijing, P. R. Chinaから入手した。Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４,７,１０,１３,１６,１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル（Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ）は、Celares GmbH, Berlin, Germanyから入手した。

【0272】

２−クロロトリチルクロリド樹脂、ＨＡＴＵ、Ｎ−シクロヘキシル−カルボジイミド−Ｎ'−メチルポリスチレン及びアミノ酸は、特に明記しない限り、Merck Biosciences GmbH, Schwalbach/Ts, Germanyから入手した。Ｆｍｏｃ（ＮＭｅ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨは、Bachem AG, Bubendorf, Switzerlandから入手した。Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキサン酸は、Polypeptide, Strasbourg, Franceから購入した。使用したアミノ酸は、特に明記しない限りＬ配置であった。

【0273】

他のすべての化学物質は、Sigma-ALDRICH Chemie GmbH, Taufkirchen, Germanyからであった。

【0274】

固相合成は、１．３ｍｍｏｌ／ｇの装填量（loading）を有する２−クロロトリチルクロリド（ＴＣＰ）樹脂上で実施した。ポリプロピレンフリットを備えた注射器を反応容器として用いた。

【0275】

樹脂への最初のアミノ酸の装填は、製造者の説明に従って実施した。
Ｆｍｏｃ脱保護：Ｆｍｏｃ保護基除去については、樹脂は、ピペリジン／ＤＢＵ／ＤＭＦ２／２／９６（ｖ／ｖ／ｖ）（２回、それぞれ１０分）で撹拌し、そしてＤＭＦ（１０回）で洗浄した。

【0276】

Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ装填樹脂のＦｍｏｃ脱保護
固定化Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨのＦｍｏｃ脱保護は、樹脂をＤＭＦ／ピペリジン４／１（ｖ／ｖ）中、５０℃で２０分間（２回）撹拌することによって達成した。

【0277】

２−クロロトリチルクロリド樹脂の切断プロトコール：
合成が完了したら、樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空で乾燥し、そしてＤＣＭ／ＨＦＩＰ６／４（ｖ／ｖ）を用いて３０分間で２回処理した。溶出液を合わせ、揮発性物質を窒素流れ下で除去し、そして生成した粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含むＨＰＬＣ画分を合わせ、そして凍結乾燥した。ＴＦＡ塩として得たアミン含有生成物を、イオン交換樹脂（Discovery DSC-SAX, Supelco, USA）を用いて対応するＨＣｌ塩に転換した。この工程は、残留ＴＦＡが、例えばその後のカップリング反応を妨げることが

【0278】

予想される場合に実施した。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製：
ＲＰ−ＨＰＬＣは、Waters 600 HPLCシステム及びWaters 2487吸光度検出器に接続された１００×２０ｍｍ又は１００×４０ｍｍC18 ReproSil-Pur 300 ODS-3 ５μカラム（Dr.
Maisch, Ammerbuch, Germany）において実施した。
溶液Ａ（Ｈ₂Ｏ中の０．１％ＴＦＡ）及び溶液Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いた。生成物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥した。

【0279】

フラッシュクロマトグラフィ
フラッシュクロマトグラフィ精製は、Biotage KP-Silシリカカートリッジ並びに溶離液としてｎ−ヘプタン及び酢酸エチルを用いてBiotage AB, SwedenからのIsolera Oneシステムにおいて実施した。生成物は２５４ｎｍで検出した。

【0280】

ヒドロゲルビーズのため、ポリプロピレンフリットを備えた注射器を反応容器として又は洗浄工程に用いた。

【0281】

分析方法
分析用超高性能（analytical ultra-performance）ＬＣ（ＵＰＬＣ）は、Thermo ScientificからのLTQ Orbitrap Discovery質量分析器につながれた、Waters BEH300 C18カラム（２．１×５０ｍｍ，粒径１．７μｍ）を備えたWaters Acquityシステムにおいて実施した。

【0282】

ＰＥＧ生成物のＭＳは、ＰＥＧ出発物質の多分散性のため一連の（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_n部分を示した。解釈をより簡単にするため、単一の代表的ｍ／ｚシグナルを１つだけ実施例中に示した。インスリン複合体のＭＳは、代表的な同位体について報告し、そして４−プロトン付加物［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺に相当する。

【0283】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、特に明記しない限り、０．４５μｍ入口フィルター付きのSuperdex200 5/150 GLカラム（Amersham Bioscience/GE Healthcare）を備えたAmersham Bioscience AEKTAbasicシステムを用いて実施した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を移動相として用いた。

【0284】

実施例１
骨格鎖試薬１ｇの合成

【化24】

【0285】

以下のスキームに従ってアミノ４−アームＰＥＧ５０００ １ａから骨格鎖試薬１ｇを合成した：

【化25】

【0286】

化合物１ｂを合成するため、アミノ４−アームＰＥＧ５０００ １ａ（ＭＷ約５２００ｇ／ｍｏｌ，５．２０ｇ，１．００ｍｍｏｌ，ＨＣｌ塩）をＤＭＳＯ（無水）２０ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）５ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２．１７ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ（１．１５ｇ，６．００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（０．９６ｇ，６．２５ｍｍｏｌ）、及びコリジン（５．２０ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。

【0287】

反応混合物をジクロロメタン１２００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄（２×）６００ｍＬ、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ５００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして蒸発させて粗生成物１ｂ ６．３ｇを無色の油として得た。
化合物１ｂをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量３．８５ｇ（５９％）無色のガラス状生成物１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ １２９４．４＝［Ｍ＋５Ｈ］⁵⁺（計算値＝１２９４．６）

【0288】

化合物１ｂ ３．４０ｇ（０．５２１ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬ及びジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ９ｍＬ中、室温で１５分間撹拌することによって化合物１ｃを得た。揮発性物質を真空で除去した。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １１５１．９＝［Ｍ＋５Ｈ］⁵⁺（計算値＝１１５２．０）

【0289】

化合物１ｄを合成するため、化合物１ｃ ３．２６ｇ（０．５４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（無水）１５ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）１５ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ２．９９ｇ（８．６４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ １．５５ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ １．２４ｇ（８．１ｍｍｏｌ）、及びコリジン５．６２ｍＬ（４３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。

【0290】

反応混合物をＤＣＭ８００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄ ４００ｍＬ（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ ８００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして蒸発させてガラス状の粗生成物を得た。

【0291】

生成物をＤＣＭ中に溶解し、そして冷却した（−１８℃）ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。この手順を２回繰り返し、そして沈殿を真空で乾燥した。
収量：４．０１ｇ（８９％）無色のガラス状生成物１ｄ、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］⁶⁺（計算値＝１４０５．４）

【0292】

メタノール７ｍＬ及びジオキサン中４Ｎ ＨＣｌ ２０ｍＬ中の化合物１ｄ（３．９６ｇ，０．４７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１５分間撹拌することによって化合物１ｅを得た。揮発性物質を真空で除去した。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ９６９．６＝［Ｍ＋７Ｈ］⁷⁺（計算値＝９６９．７）

【0293】

化合物１ｆを合成するため、化合物１ｅ（３．５５ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（無水）２０ｍＬ中に溶解した。ＤＭＳＯ（無水）１８．８ｍＬ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５．３２ｇ，１５．４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ ＨＣｌ（２．７６ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ₂Ｏ（２．２０ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）、及びコリジン１０．０ｍＬ（７６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。

【0294】

反応混合物をＤＣＭ ８００ｍＬで希釈し、そして０．１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄ ４００ｍＬ（２×）、ブライン（１×）、０．１Ｍ ＮａＯＨ（２×）、及びブライン／水１／１（ｖ／ｖ）（４×）で洗浄した。水層をＤＣＭ ８００ｍＬで再抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして蒸発させて無色の油として粗生成物１ｆを得た。
生成物をＤＣＭ中に溶解し、そして冷却した（−１８℃）ジエチルエーテルを用いて沈殿させた。この工程を２回繰り返し、そして沈殿を真空で乾燥した。
収量４．７２ｇ（８２％）無色のガラス状生成物１ｆ、これをさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ １５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］⁸⁺（計算値＝１５０５．４）

【0295】

メタノール２０ｍＬ及びジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ ４０ｍＬ中の化合物１ｆ（ＭＷ約１２０３５ｇ／ｍｏｌ，４．７２ｇ，０．３９ｍｍｏｌ）の溶液を室温で３０分間撹拌することによって骨格鎖試薬１ｇを得た。揮発性物質を真空で除去した。
収量３．９１ｇ（１００％）、ガラス状生成物骨格鎖試薬１ｇ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９７７．２＝［Ｍ＋９Ｈ］⁹⁺（計算値＝９７７．４）

【0296】

１ｇの別の合成経路
化合物１ｂを合成するため、ｉＰｒＯＨ（無水）２５０ｍＬ中の４−アーム−ＰＥＧ５０００テトラアミン（１ａ）（５０．０ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（２６．６ｇ，６０．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２０．９ｍＬ，１２０ｍｍｏｌ）を４５℃で加え、そして混合物を３０分間撹拌した。

【0297】

続いて、ｎ−プロピルアミン（２．４８ｍＬ，３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、溶液をＭＴＢＥ１０００ｍＬで希釈し、そして撹拌することなく−２０℃で一夜保存した。上澄み約５００ｍＬをデカントして捨てた。冷ＭＴＢＥ３００ｍＬを加え、そして１分振盪した後、ガラスフィルターを通して濾過することによって生成物を集め、そして冷ＭＴＢＥ５００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：６５．６ｇ（７４％）塊の多い白色固形物として１ｂ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９３７．４＝［Ｍ＋７Ｈ］⁷⁺（計算値＝９３７．６）

【0298】

前工程からの化合物１ｂ（４８．８ｇ，７．４４ｍｍｏｌ）を２−プロパノール１５６ｍＬ中、４０℃で撹拌することによって化合物１ｃを得た。２−プロパノール１９６ｍＬ及びアセチルクロリド７８．３ｍＬの混合物を、撹拌下で１〜２分以内に加えた。溶液を４０℃で３０分間撹拌し、そして撹拌することなく−３０℃で一夜冷却した。冷ＭＴＢＥ１００ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そして−３０℃で１時間冷却した。ガラスフィルターを通して濾過することによって生成物を集め、そして冷ＭＴＢＥ２００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：３８．９ｇ（８６％）白色粉末として１ｃ
ＭＳ：ｍ／ｚ ９６０．１＝［Ｍ＋６Ｈ］⁶⁺（計算値＝９６０．２）

【0299】

化合物１ｄを合成するため、２−プロパノール８０ｍｌ中の前工程からの１ｃ（１９．０ｇ，３．１４ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１６．７ｇ，３７．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１３．１ｍＬ，７５．４ｍｍｏｌ）を４５℃で加えた。その後、ｎ−プロピルアミン（１．５６ｍＬ，１８．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、冷ＭＴＢＥ ６００ｍＬを用いて溶液を沈殿させ、そして遠心分離した（３０００分−１，１分）。沈殿を真空で１時間乾燥し、そしてＴＨＦ ４００ｍＬ中に溶解した。ジエチルエーテル２００ｍＬを加え、そして撹拌することなく生成物を−３０℃に１６時間冷却した。ガラスフィルターを通して懸濁液を濾過し、そして冷ＭＴＢＥ ３００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：２１．０ｇ（８０％）白色固形物として１ｄ
ＭＳ：ｍ／ｚ １４０５．４＝［Ｍ＋６Ｈ］⁶⁺（計算値＝１４０５．４）

【0300】

前工程からの化合物１ｄ（１５．６ｇ，１．８６ｍｍｏｌ）を溶解し、メタノール中の３Ｎ ＨＣｌ（８１ｍＬ，２４３ｍｍｏｌ）中に溶解し、そして４０℃で９０分間撹拌することによって化合物１ｅを得た。ＭｅＯＨ２００ｍＬ及びｉＰｒＯＨ７００ｍＬを加え、そして混合物を−３０℃で２時間保存した。完全に結晶化させるため、ＭＴＢＥ１００ｍＬを加え、そして懸濁液を−３０℃で一夜保存した。冷ＭＴＢＥ２５０ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そしてガラスフィルターを通して濾過し、そして冷ＭＴＢＥ１００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で乾燥した。
収量：１３．２ｇ（９６％）白色粉末として１ｅ
ＭＳ：ｍ／ｚ ６７９．１＝［Ｍ＋１０Ｈ］¹⁰⁺（計算値＝６７９．１）

【0301】

化合物１ｆを合成するため、２−プロパノール１６５ｍｌ中の前工程からの１ｅ（８．２２ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）の懸濁液にｂｏｃ−Ｌｙｓ（ｂｏｃ）−ＯＳｕ（１１．９ｇ，２６．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（９．３４ｍＬ，５３．６ｍｍｏｌ）を４５℃で加え、そして混合物を３０分間撹拌した。続いて、ｎ−プロピルアミン（１．４７ｍＬ，１７．９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、溶液を−１８℃に２時間冷却し、次いで冷ＭＴＢＥ１６５ｍＬを加え、懸濁液を１分間振盪し、そしてガラスフィルターを通して濾過した。続いて、濾過ケークを冷ＭＴＢＥ／ｉＰｒＯＨ４：１の４×２００ｍＬ及び冷ＭＴＢＥ１×２００ｍＬで洗浄した。生成物を真空で１６時間乾燥した。
収量：１２．８ｇ、ＭＷ（９０％）淡黄色の塊の多い固形物として１ｆ
ＭＳ：ｍ／ｚ １５０５．３＝［Ｍ＋８Ｈ］⁸⁺（計算値＝１５０５．４）

【0302】

４ＡｒｍＰＥＧ５ｋＤａ（−ＬｙｓＬｙｓ２Ｌｙｓ４（ｂｏｃ）８）４（１ｆ）（１５．５ｇ，１．２９ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ３０ｍＬ中に溶解し、そして０℃に冷却することによって骨格鎖試薬１ｇを得た。ジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ（１２０ｍＬ，４８０ｍｍｏｌ，０℃に冷却）を３分以内に加え、そして氷浴をはずした。２０分後、メタノール中の３Ｎ ＨＣｌ（２００ｍＬ，６００ｍｍｏｌ，０℃に冷却）を１５分以内に加え、そして溶液を室温で１０分間撹拌した。冷ＭＴＢＥ４８０ｍＬを用いて生成物溶液を沈殿させ、そして３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。沈殿を真空で１時間乾燥し、そしてＭｅＯＨ９０ｍＬ中に再溶解し、冷ＭＴＢＥ２４０ｍＬを用いて沈殿させ、そして懸濁液を３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。生成物１ｇを真空で乾燥した。
収量：１１．５ｇ（８９％）淡黄色フレークとして
ＭＳ：ｍ／ｚ １１０４．９＝［Ｍ＋８Ｈ］⁸⁺（計算値＝１１０４．９）

【0303】

実施例２
クロスリンカー試薬２ｄの合成
クロスリンカー試薬２ｄは、アジピン酸モノベンジルエステル（English, Arthur R. et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1990, 33(1), 344-347）及びＰＥＧ２０００から以下のスキームに従って製造した：

【0304】

【化26】

【0305】

ジクロロメタン（９０．０ｍＬ）中のＰＥＧ２０００（２ａ）（１１．０ｇ，５．５ｍｍｏｌ）及びアジピン酸ベンジル半エステル（４．８ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．４７ｇ，２１．７ｍｍｏｌ）、続いて触媒量のＤＭＡＰ（５ｍｇ）を加え、そして溶液を撹拌し、そして一夜かけて室温に到達するにまかせた（１２時間）。フラスコを＋４℃で５時間保存した。固形物を濾過し、そして真空で蒸留することによって溶媒を完全に除去した。残留物をジエチルエーテル／酢酸エチル１／１（ｖ／ｖ）１０００ｍＬ中に溶解し、そして室温で２時間保存し、その間に少量の薄片状固形物が形成された。セライト（登録商標）のパッドを通して濾過することによって固形物を除去し、結晶化が完了するまで、冷凍庫中、−３０℃で１２時間きつく密閉したフラスコ中に溶液を保存した。ガラスフリットを通して結晶質生成物を濾過し、そして冷却されたジエチルエーテル（−３０℃）で洗浄した。濾過ケークを真空で乾燥した。収量：１１．６ｇ（８６％）無色の固形物として２ｂ。生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ８１３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］³⁺（計算値＝８１３．３）

【0306】

５００ｍＬのガラスオートクレーブ中、ＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸−ビス−ベンジルエステル２ｂ（１３．３ｇ，５．５ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１８０ｍＬ）中に溶解し、そして木炭上の１０％パラジウム（０．４ｇ）を加えた。水素消費が終わるまで（５〜１２時間）、溶液を６ｂａｒ（４０℃）で水素化した。セライト（登録商標）のパッドを通して濾過することによって触媒を除去し、そして溶媒を真空で蒸発させた。
収量：１２．３ｇ（定量的）黄色がかった油として２ｃ
生成物をさらに精製することなく次の工程に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ７５３．１＝［Ｍ＋３Ｈ］³⁺（計算値＝７５３．２）

【0307】

ＤＣＭ（無水）７５ｍＬ中のＰＥＧ２０００−ビス−アジピン酸半エステル２ｃ（９．４３ｇ，４．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．９２ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（３．４４ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一夜撹拌した。反応混合物を０℃に冷却し、そして沈殿を濾過した。ＤＣＭを蒸発させ、そして残留物をＴＨＦから再結晶させた。
収量： ８．７３ｇ（８５％）無色の固形物としてクロスリンカー試薬２ｄ
ＭＳ：ｍ／ｚ ８１７．８＝［Ｍ＋３Ｈ］³⁺（計算値＝８１７．９ｇ／ｍｏｌ）

【0308】

実施例３
遊離アミノ基を含むヒドロゲルビーズ（３）及び（３ａ）の製造
ＤＭＳＯ１４ｍＬ中の１ｇ ２７５ｍｇ及び２ｄ ８６６ｍｇの溶液をヘプタン６０ｍＬ中の Arlacel P135（Croda International Plc）１００ｍｇの溶液に加えた。慣用の金属撹拌機を用いて７００ｒｐｍで混合物を２５℃で１０分間撹拌して懸濁液を形成した。Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン１．０ｍＬを加えて重合を実施した。２時間後、撹拌機の速度を４００ｒｐｍに下げ、そして混合物をさらに１６時間撹拌した。酢酸１．５ｍＬを加え、それから１０分後、水５０ｍＬを加えた。５分後、撹拌機を停止し、そして水相を排出した。
ビーズサイズ分別のため、水−ヒドロゲル懸濁液を７５、５０、４０、３２及び２０μｍメッシュのスチール篩上で湿式篩にかけた（wet-sieved）。３２、４０及び５０μｍの篩上に残ったビーズ画分を貯め、そして水で３回、エタノールで１０回洗浄し、そして０．１ｍｂａｒで１６時間乾燥して白色粉末として３を得た。
３ａは、１ｇ １２００ｍｇ、２ｄ ３８４０ｍｇ、ＤＭＳＯ２８．６ｍｌ、Arlacel P135 ４２５ｍｇ、ヘプタン１００ｍＬ及びＴＭＥＤＡ４．３ｍｌを使用することを除いて、３について記載されたように製造した。処理のため、酢酸６．６ｍｌを加え、それから１０分後、水５０ｍＬ及び飽和塩化ナトリウム水溶液５０ｍＬを加えた。
ヒドロゲルのアミノ基含量は、Gude, M., J. Ryf, et al. (2002) Letters in Peptide
Science 9(4): 203-206によって記載されたように、ヒドロゲル上の遊離アミノ基へのｆｍｏｃアミノ酸の結合、そしてその後のｆｍｏｃ測定によって決定した。
３及び３ａのアミノ基含量は０．１１〜０．１６ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。

【0309】

実施例４
マレイミド官能化ヒドロゲルビーズ（４）及び（４ａ）及び（４ａａ）の製造及びマレイミド置換の決定

【化27】

【0310】

アセトニトリル／水２／１（ｖ／ｖ）中のＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ６００ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の溶液４.５ｍＬを乾燥ヒドロゲルビーズ３の２００ｍｇに加えた。リン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４，０．５Ｍ）５００μＬを加え、そして懸濁液を室温で３０分間撹拌した。アセトニトリル／水２／１（ｖ／ｖ）、メタノール及びアセトニトリル／水／ＴＦＡ１／１／０．００１（ｖ／ｖ／ｖ／）を用いてそれぞれ５回、ビーズ４を洗浄した。４ａは、３の代わりに３ａを使用することを除いて前記のように合成した。

【0311】

別法として、ヒドロゲルビーズ３ａをＤＭＳＯ／ＤＩＥＡ９９／１（ｖ／ｖ）で予め洗浄し、ＤＭＳＯで洗浄し、そしてＤＭＳＯ中のＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ（ヒドロゲル上のアミノ基の理論量に対して２．０当量）の溶液を用いて４５分間定温放置した。ビーズ４ａａをＤＭＳＯで２回、そしてコハク酸塩ｐＨ３．０（２０ｍＭ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。サンプルを、リン酸ナトリウムｐＨ６．０（５０ｍＭ，５０ｍＭエタノールアミン，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、室温で１時間定温放置し、そしてコハク酸ナトリウムｐＨ３．０（２０ｍＭ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で５時間洗浄した。

【0312】

マレイミド含量を決定するため、ヒドロゲルビーズ４、４ａ又は４ａａのアリコートを、それぞれ凍結乾燥し、そして計量した。ヒドロゲルビーズ４、４ａ又は４ａａの別のアリコートを、それぞれ、過剰メルカプトエタノールと反応させ（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中、室温で３０分）、そしてメルカプトエタノール消費は、エルマン（Ellman）試験（Ellman, G. L. et al., Biochem. Pharmacol., 1961, 7, 88-95）によって検出した。マレイミド含量は、０．１１〜０．１３ｍｍｏｌ／ｇの乾燥ヒドロゲルであると決定された。

【0313】

実施例５
リンカー試薬５ｄの合成
リンカー試薬５ｄは、以下のスキームに従って合成した：

【化28】

【0314】

リンカー試薬中間体５ａの合成：
４−メトキシトリチルクロリド（３ｇ，９．７１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）中に溶解し、そしてＤＣＭ（２０ｍＬ）中のエチレンジアミン（６．５ｍＬ，９７．１ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。２時間後、溶液をジエチルエーテル（３００ｍＬ）中に注ぎ、そしてブライン／０．１ Ｍ ＮａＯＨ溶液３０／１（ｖ／ｖ）で３回（それぞれ５０ｍｌ）、そしてブライン（５０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去してＭｍｔ−保護された中間体（３．１８ｇ，９．５６ｍｍｏｌ）を得た。
Ｍｍｔ−保護された中間体（３．１８ｇ，９．５６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解した。６−（トリチルメルカプト）−ヘキサン酸（４．４８ｇ，１１．４７ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（５．６７ｇ，１１．４７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（５．０ｍＬ，２８．６８ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で３０分間撹拌した。溶液をジエチルエーテル（２５０ｍＬ）で希釈し、そしてブライン／０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液３０／１（ｖ／ｖ）で３回（それぞれ５０ｍＬ）、そしてブライン（５０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去した。５ａをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量：５．６９ｇ（８．０９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ７０５．４＝［Ｍ＋Ｈ］⁺（計算値＝７０５．０）

【0315】

リンカー試薬中間体５ｂの合成：
無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の５ａ（３．１９ｇ，４．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＢＨ３・ＴＨＦ（１ｍ溶液，８．５ｍＬ，８．５ｍｍｏｌ）を加え、そして溶液を室温で１６時間撹拌した。さらにＢＨ３・ＴＨＦ（１Ｍ溶液，１４ｍＬ，１４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。メタノール（８．５ｍＬ）を添加して反応をクエンチし、Ｎ,Ｎ−ジメチル−エチレンジアミン（３ｍＬ，２７．２ｍｍｏｌ）を加え、そして溶液を還流に加熱し、そして３時間撹拌した。混合物を室温で酢酸エチル（３００ｍＬ）により希釈し、飽和Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液（２×１００ｍＬ）、そして飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして揮発性物質を減圧で蒸発させて粗アミン中間体（３．２２ｇ）を得た。

【0316】

アミン中間体をＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解し、ＤＣＭ（５ｍＬ）及びＤＩＥＡ（３．９５ｍＬ，２２．６５ｍｍｏｌ）中に溶解したＢｏｃ２Ｏ（２．９７ｇ，１３．６９ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をフラッシュクロマトグラフィによって精製してＢｏｃ−及びＭｍｔ−保護された粗中間体（３ｇ）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ ７９１．４＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，５１９．３＝［Ｍ−Ｍｍｔ＋Ｈ］⁺（計算値＝７９１．１）

【0317】

０．４Ｍ水性ＨＣｌ（４８ｍＬ）をアセトニトリル（４５ｍＬ）中のＢｏｃ−及びＭｍｔ−保護された中間体の溶液に加えた。混合物をアセトニトリル（１０ｍＬ）で希釈し、そして室温で１時間撹拌した。続いて、５Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加することによって反応混合物のｐＨ値を５．５に調整し、アセトニトリルを減圧下で除去し、そして水溶液をＤＣＭ（４×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして揮発性物質を減圧下で除去した。粗５ｂをさらに精製することなく用いた。
収量：２．５２ｇ（３．１９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５１９．３＝［Ｍ＋Ｈ］⁺（ＭＷ計算値＝５１８．８ｇ／ｍｏｌ）

【0318】

リンカー試薬中間体５ｃの合成：
５ｂ（７８０ｍｇ，０．９８ｍｍｏｌ，純度約６５％）及びＮａＣＮＢＨ₃（１２８ｍｇ，１．９７ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１３ｍＬ）中に溶解した。ＤＣＭ（２ｍＬ）中の２,４−ジメトキシベンズアルデヒド（１９５ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ）の溶液を加え、そして混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、そして粗生成物をＤＣＭ中に溶解し、そして飽和ＮａＣＯ₃溶液で洗浄した。水相をＤＣＭで３回抽出し、そして合わせた有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして減圧下で濃縮した。溶離液としてＤＣＭ及びＭｅＯＨを用いて５ｃをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量：３４３ｍｇ（０．５１２ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ６６９．３７＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝６６９．９５）

【0319】

リンカー試薬５ｄの合成：
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−装填されたＴＣＰ樹脂（９８０ｍｇ，約０.９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／ピペリジンで脱保護し、ＤＭＦ（５回）及びＤＣＭ（６回）で洗浄し、そして真空で乾燥した。樹脂を、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中のｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（３６４ｍｇ，１．８１ｍｍｏｌ）及びコリジン（３９８μＬ，３．０ｍｍｏｌ）の溶液で処理し、そして３０分間振盪した。試薬溶液を濾過によって除去し、そして樹脂をＴＨＦ（５回）で洗浄した後、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）中のアミン５ｃ（４９０ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．２３ｍＬ，７．１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。室温で１８時間振盪した後、試薬溶液を濾過によって除去し、そして樹脂をＤＣＭ（５回）で洗浄した。リンカー試薬を樹脂から切断し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。飽和水性ＮａＨＣＯ₃の添加によって生成物画分をｐＨ６にし、そして減圧下で濃縮した。生成したスラリーは、飽和水性ＮａＣｌとＤＣＭの間で分配し、そして水層をＤＣＭで抽出した。合わせた有機画分を濃縮して乾燥状態にしてリンカー試薬５ｄを得た。
収量：２３０ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）
ＭＳｍ／ｚ ７９８．４１＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝７９８．１）

【0320】

実施例６
リンカー試薬６ｃの合成
リンカー試薬６ｃは、以下のスキームに従って合成した：

【化29】

【0321】

アミン６ａの合成：
トリフェニルメタンチオール（１１．９０ｇ，４３．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（４０ｍＬ）中に懸濁した。ＤＢＵ（７．４１ｍＬ，４９．５５ｍｍｏｌ）及び６−ブロモヘキシルフタルイミド（１３．３２ｇ，４２．９４ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を約１５分間反応するにまかせた。反応混合物を酢酸エチル（７００ｍＬ）と０．１Ｍ ＨＣｌ（２００ｍＬ）との間で分配した。水相を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出し、そして合わせた有機画分を飽和ＮａＨＣＯ₃（８０ｍＬ）及びブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして濃縮した。粗黄色油をｎ−ヘプタン／酢酸エチルから再結晶させた。中間体６−（Ｓ−トリチル−）メルカプトヘキシルフタルイミドを白色固形物（１３．３ｇ，２６．４ｍｍｏｌ，６２％）として得た。

【0322】

６−（Ｓ−トリチル−）メルカプトヘキシルフタルイミド（１４．２７ｇ，２８．２ｍｍｏｌ）をエタノール（２５０ｍＬ）中に懸濁した。ヒドラジン水和物（３．４５ｍＬ，７０．５ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を還流に２時間加熱した。混合物を濾過し、そして濾液を真空で濃縮した。クロロホルム（１８０ｍＬ）を残留油に加え、そして生成した懸濁液を室温で１．５時間撹拌した。混合物を濾過し、そして濾液を水（６０ｍＬ）及びブライン（６０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、そして濃縮して粗６−（トリチルメルカプト）−ヘキシルアミン（１０．１０ｇ，２６．８７ｍｍｏｌ，９５％）を得た。
ＭＳ：ｍ／ｚ ３７６．２２＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝３７６．２０）

【0323】

ＤＩＥＡ（１．４１ｍＬ，８．１１ｍｍｏｌ）及びｎ−クロロギ酸ブチル（９０８μＬ，７．１４ｍｍｏｌ，ＴＨＦ１ｍＬ中）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中の６−（トリチルメルカプト）−ヘキシルアミン（２．４４ｇ，６．４９ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に加えた。３０分後にＬｉＡｌＨ₄（ＴＨＦ中１Ｍ，９．７４ｍＬ，９．４７ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を還流に９０分間加熱した。水、３．７５Ｍ水性ＮａＯＨ及び水の添加により沈殿が形成され、それを濾過によって混合物から除去した。濾液を真空で濃縮して６ａを得た。
収量：２．４１ｇ（６．２０ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ３９０．２２＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝３９０．２２）

【0324】

リンカー試薬中間体６ｂの合成：
６ａ（２．１ｇ，５．３１ｍｍｏｌ）の溶液に２−ブロモエチルフタルイミド（１．９６ｇ，７．７ｍｍｏｌ）及びＫ₂ＣＯ₃（１．０９ｇ，７．９ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を還流に６時間加熱した。濾過して濃縮した後、粗混合物を酢酸エチルと飽和水性ＮａＨＣＯ₃との間で分配した。粗中間体（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（６−トリチルメルカプトヘキシル−）アミノ）エチル）フタルイミドをフラッシュクロマトグラフィによって精製した。
収量：１．２３ｇ（２．１８ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ：５６３．２７＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝５６３．２７）

【0325】

エタノール（１２ｍＬ）中の（２−（Ｎ−メチル−Ｎ−（６−トリチルメルカプトヘキシル−）アミノ−）エチル）フタルイミド（６７２ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ）の溶液にヒドラジン一水和物（２０８μＬ，４．１７ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を還流に１時間加熱した。反応混合物を濾過し、濃縮し、そしてＮ−（２−アミノエチル−）−Ｎ−メチル−Ｎ−（６−トリチルメルカプトヘキシル−）アミンをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量：６２４ｍｇ（０．９４４ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ４３３．２７＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝４３３．２６）

【0326】

無水ＭｅＯＨ（６ｍＬ）中のＮ−（２−アミノエチル−）−Ｎ−メチル−Ｎ−（６−トリチルメルカプトヘキシル−）アミン（１５１ｍｇ，０．２２９ｍｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ３（３０ｍｇ，０．４６３ｍｍｏｌ）の溶液に無水ＣＨ₂Ｃｌ₂（０．６μＬ）中の２,４−ジメトキシベンズアルデヒドの溶液を加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を濃縮し、水／アセトニトリル１／９（ｖ／ｖ）２ｍＬ中に再溶解し、そして６ｂをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量：１７７ｍｇ（０．２１９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５８３．３３＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝５８３．３３）

【0327】

リンカー試薬６ｃの合成
５ｃの代わりにアミン６ｂ（ＴＦＡ塩として，４３０ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）を使用すること除いて、５ｄについて記載されたように、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−装填された樹脂（７０４ｍｇ，約０．６ｍｍｏｌ）からリンカー試薬６ｃを製造した。
収量：２８５ｍｇ（０．３３０ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ７１２．３７＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝７１２．３７）

【0328】

実施例７
リンカー試薬７ｆの合成
リンカー試薬７ｆは、以下のスキームに従って合成した：

【0329】

【化30】

【0330】

ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）及び酢酸（０．５ｍＬ）中のＮ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（０．５ｍＬ，２．７９ｍｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ₃（１４０ｍｇ，２．２３ｍｍｏｌ）冷却（０℃）溶液にＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中の２,４,６−トリメトキシベンズアルデヒド（０．５４７ｍｇ，２．７９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、２Ｍ ＨＣｌ（１ｍＬ）で酸性化し、そして飽和水性Ｎａ₂ＣＯ₃（５０ｍＬ）で中和した。すべての揮発性物質を蒸発させて、生成した水性スラリーをＤＣＭ抽出し、そして有機画分を濃縮してＮ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−Ｎ'−ｔｍｏｂ−エチレンジアミン（７ａ）を粗油として得、それはＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量：５９３ｍｇ（１．５２ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ３７７．３５＝［Ｍ＋Ｎａ］⁺，（計算値＝３７７．１４）

【0331】

Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（２２５ｍｇ，０．５２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解し、そして７ａ（３００ｍｇ，０．８４７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２０１ｍｇ，０．５２９ｍｍｏｌ）及びコリジン（０．４８ｍＬ，３．７０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌して７ｂを得た。ｆｍｏｃ脱保護のため、ピペリジン（０．２２ｍＬ，２．１６ｍｍｏｌ）を加え、そして撹拌を１時間続けた。酢酸（１ｍＬ）を加え、そして７ｃをＲＰ−ＨＬＰＣによって精製した。
収量：２８５ｍｇ（ＴＦＡ塩として０．４３６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ５６２．５４＝［Ｍ＋Ｎａ］⁺，（計算値＝５６２．６７）

【0332】

６−トリチルメルカプトヘキサン酸（０．８４７ｇ，２．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（７ｍＬ）中に溶解した。ＨＡＴＵ（０．８２５ｇ，２．１７ｍｍｏｌ）、並びにコリジン（０．８ｍＬ，６．１ｍｍｏｌ）及び７ｃ（０．７８ｇ，１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分間撹拌し、ＡｃＯＨ（１ｍＬ）で酸性化し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ₃で中和し、そして濃縮した。残っている水相をＤＣＭで抽出し、そして溶媒を蒸発させて７ｄを単離した。
収量：１．４ｇ（９４％）
ＭＳ：ｍ／ｚ ９３４．７＝［Ｍ＋Ｎａ］⁺，（計算値＝９３４．５）

【0333】

ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）及びＨ₂Ｏ（２ｍＬ）中の７ｄ（１．４０ｍｇ，１．５３ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ（２５０ｍｇ，１０．４ｍｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を７０℃で１４時間撹拌した。混合物をＡｃＯＨ（０．８ｍＬ）で酸性化し、そして７ｅをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ₃で中和し、そして濃縮した。水相をＤＣＭで抽出し、そして溶媒を蒸発させて７ｅを単離した。
収量：７８０ｍｇ（６０％）
ＭＳ：ｍ／ｚ ８７８．８＝［Ｍ＋Ｎａ］⁺，（計算値＝８７８．４０）

【0334】

無水ＤＣＭ（４ｍＬ）中の７ｅ（１７０ｍｇ，０．１９８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（１２３ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１４ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を濾過し、そして濾液をＡｃＯＨ０．５ｍＬで酸性化し、そして７ｆをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。生成物画分を飽和水性ＮａＨＣＯ₃で中和し、そして濃縮した。残っている水相をＤＣＭで抽出し、そして溶媒を蒸発させて７ｆを単離した。
収量：１５４ｍｇ（０．１６１ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ９５３．４＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝９５３．４３）

【0335】

別法として、リンカー試薬７ｆを、以下の手順に従って合成した：

【0336】

別の反応スキーム：

【化31】

【0337】

ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中のＮ−メチル−Ｎ−ｂｏｃ−エチレンジアミン（２ｇ，１１．４８ｍｍｏｌ）及びＮａＣＮＢＨ３（８１９ｍｇ，１２．６３ｍｍｏｌ）の溶液に２,４,６−トリメトキシベンズアルデヒド（２．０８ｍｇ，１０．６１ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。混合物を室温で９０分間撹拌し、３Ｍ ＨＣｌ（４ｍＬ）で酸性化し、そしてさらに１５分撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ₃溶液（２００ｍＬ）に加え、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて５回抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして溶媒を真空で蒸発させた。生成したＮメチル−Ｎ−ｂｏｃ−Ｎ'−ｔｍｏｂ−エチレンジアミン（７ａ）を高真空で完全に乾燥し、そしてさらに精製することなく次の反応工程に用いた。収量：３．７６ｇ（１１．４８ｍｍｏｌ，純度８９％，７ａ：二重Ｔｍｏｂ保護された生成物＝８：１）
ＭＳ：ｍ／ｚ ３５５．２２＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝３５４．２１）

【0338】

ＣＨ₂Ｃｌ₂（２４ｍｌ）中の７ａ（２ｇ，５．６５ｍｍｏｌ）の溶液にＣＯＭＵ（４．８４ｇ，１１．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨ（２．０８ｇ，４．５２ｍｍｏｌ）及びコリジン（２．６５ｍＬ，２０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２５０ｍＬ）で希釈し、そして０．１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄（１００ｍｌ）で３回、そしてブライン（１００ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして残留物を２４ｍＬの体積まで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィを用いて７ｇを精製した。
収量：５．３１ｇ（１４８％，６．６６ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ ７９６．３８＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝７９５．３７）

【0339】

ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の７ｇ［５．３１ｇ，Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ａｓｐ（ＯＢｎ）−ＯＨを基準にして最大４．５１ｍｍｏｌ］の溶液にＤＢＵ（１．８ｍＬ，３％ｖ／ｖ）を加えた。溶液を室温で１２分間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍｌ）で希釈し、そして０．１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄（１５０ｍｌ）で３回、そしてブライン（１５０ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、そして濾過した。溶媒を蒸発させて７ｈを単離し、そしてさらに精製することなく次の反応に用いた。
ＭＳ：ｍ／ｚ ５７４．３１＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝５７３．３０）

【0340】

７ｈ（５．３１ｇ，４．５１ｍｍｏｌ，粗物質）をアセトニトリル（２６ｍＬ）中に溶解し、そしてＣＯＭＵ（３．８７ｇ，９．０４ｍｍｏｌ）、６−トリチルメルカプトヘキサン酸（２．１２ｇ，５．４２ｍｍｏｌ）及びコリジン（２．３５ｍＬ，１８．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（４００ｍｌ）で希釈し、そして０．１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄（１００ｍｌ）で３回、そしてブライン（１００ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させて７ｉを単離した。フラッシュクロマトグラフィを用いて生成物７ｉを精製した。
収量：２．６３ｇ（６２％，純度９４％）
ＭＳ：ｍ／ｚ ８５６．４１＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝８５５．４１）

【0341】

ｉ−ＰｒＯＨ（３３ｍＬ）及びＨ₂Ｏ（１１ｍＬ）中の７ｉ（２．６３ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ（２６７ｍｇ，１１．１２ｍｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を室温で７０分間撹拌した。混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）で希釈し、そして０．１Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄（５０ｍｌ）で３回、そしてブライン（５０ｍｌ）で３回洗浄した。水相をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）で再抽出した。合わせた有機相をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させて７ｅを単離した。フラッシュクロマトグラフィを用いて７ｊを精製した。
収量：２．１ｇ（８８％）
ＭＳ：ｍ／ｚ ８７８．４＝［Ｍ＋Ｎａ］⁺，（計算値＝８７８．４０）

【0342】

無水ＤＣＭ（４ｍＬ）中の７ｅ（１７０ｍｇ，０．１９８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＣ（１２３ｍｇ，０．５９ｍｍｏｌ）及び触媒量のＤＭＡＰを加えた。５分後、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（１１４ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）を加え、そして反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、溶媒を真空で除去し、そして残留物を９０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ（３．４ｍｌ）中に溶解した。粗混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。生成物画分をｐＨ７．４の０．５Ｍリン酸バッファで中和し、そして濃縮した。残っている水相をＤＣＭで抽出し、そして溶媒を蒸発させて７ｆを単離した。収量：１５４ｍｇ（８１％）
ＭＳ：ｍ／ｚ ９５３．４＝［Ｍ＋Ｈ］⁺，（計算値＝９５３．４３）

【0343】

実施例８
Ｎ^αA1−インスリン−リンカー複合体８ｂ及び８ｃの合成

【化32】

【0344】

保護されたインスリンリンカー複合体８ａの合成

【化33】

リンカー試薬５ｄをＤＣＭ（２０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、そしてＮ−シクロヘキシル−カルボジイミド−Ｎ'−メチルポリスチレン−樹脂（１．９ｍｍｏｌ／ｇ，１０当量）で１時間活性化した。活性化リンカー試薬の溶液を、ＤＭＳＯ中のインスリン（１．２当量）及びＤＩＥＡ（３．５当量）の溶液（１００ｍｇインスリン／ｍＬ）に加え、そして混合物を室温で４５分間振盪した。溶液を酢酸で酸性化し、ＤＣＭを減圧下で蒸発させ、そして、Ｎ^αA1結合して保護されたインスリン−リンカー複合体８ａをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
凍結乾燥した８ａを、ＨＦＩＰ／ＴＦＡ／水／トリエチルシラン９０／１０／２／２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）（２ｍＬ／１００ｍｇの８ａ）の混合物を用いて室温で４５分間処理した。反応混合物を水で希釈し、そしてすべての揮発性物質を窒素流れ下で除去した。Ｎ^αA1結合インスリン−リンカー複合体８ｂをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
８ｂ：
収量：リンカー５ｄ ６２ｍｇ（０．０７８ｍｍｏｌ）から１３９ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １５２４．４５＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１５２４．７５）
Ｎ^αA1結合インスリン−リンカー複合体８ｃは、５ｄの代わりに６ｃ（７２ｍｇ，０．１０１ｍｍｏｌ）を使用したことを除いて８ｂについて記載されたように合成した。
８ｃ：
収量：２３７ｍｇ（０．０３９ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １５２８．２３＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１５２８．２８）

【0345】

実施例９
Ｎ^αB1−インスリン−リンカー複合体９の合成

【化34】

二重保護されたＮ^α−ｂｏｃ−Ｇｌｙ^A1−Ｎ^ε−ｂｏｃ−Ｌｙｓ^B29−インスリンを以前に記載されたように製造した（J. Markussen, J. Halstrom, F. C. Wiberg, L. Schaffer, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18814-18818）。リンカー試薬５ｄ（０．０４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．５ｍＬ）中に溶解し、そしてＮ−シクロヘキシル−カルボジイミド−Ｎ'−メチルポリスチレン樹脂（０．２０５ｍｍｏｌ）を用いて室温で２時間活性化した。生成した活性化リンカー試薬の溶液をビス−ｂｏｃ−保護されたインスリン（２４ｍｇ，０．００４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（５μＬ，０．０２２９ｍｍｏｌ）の溶液に加え、そして室温で１時間振盪した。反応混合物を酢酸１００μＬで酸性化し、そして保護されたインスリン−リンカー複合体をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量：５ｍｇ（０．０００７５ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １６６０．２７＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１６６０．４３）
凍結乾燥された保護されたインスリン−リンカー複合体を、ＨＦＩＰ／ＴＦＡ／水／ＴＥＳ ９０／１０／２／２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）１ｍＬを用いて室温で４５分間処理した。反応混合物を水０．５ｍＬで希釈し、そしてすべての揮発性物質を窒素流れ下で除去した。Ｎ^aB1−結合インスリン−リンカー複合体９をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
収量：４ｍｇ（０．０００７ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １５２４．４６＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１５２４．７５）

【0346】

実施例１０
Ｎ^εB29−インスリンリンカー複合体１０の合成

【化35】

インスリン（６４４ｍｇ，０．１１１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ６．５ｍＬ中に溶解した。冷却された（４℃）０．５Ｍホウ酸ナトリウムバッファ（ｐＨ８．５）３ｍＬ及びＤＭＳＯ２．５ｍＬ中の７ｆ（７０ｍｇ，０．０７３ｍｍｏｌ）を加え、そして混合物を室温で５分間撹拌した。ＡｃＯＨ４００μＬを加え、そして保護されたインスリン複合体をＲＰ ＨＰＬＣによって精製した。
収量：１７２ｍｇ（０．０２５ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １６６２．２７＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１６６２．４８）
保護基の除去は、ＨＦＩＰ／ＴＦＡ／ＴＥＳ／水９０／１０／２／２（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）６ｍＬを用いて、凍結乾燥された生成物画分を室温で１時間処理することによって実施した。Ｎ^εB29−結合インスリン−リンカー複合体１０をＲＰ ＨＰＬＣによって精製した。
収量：１４３ｍｇ（０．０２３ｍｍｏｌ）
ＭＳ：ｍ／ｚ １５３１．４６＝［Ｍ＋４Ｈ］⁴⁺（計算値＝１５３１．７１）

【0347】

実施例１１
インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ、１１ｄａ、１１ｄｂ、及び１１ｄｃの製造

【化36】

【0348】

乾燥マレイミド官能化ヒドロゲル４（８２ｍｇ，１０．３μｍｏｌマレイミド基）を、フィルターフリットを備えた注射器に充填した。アセトニトリル／水／ＴＦＡ １／１／０．００１（ｖ／ｖ／ｖ）１．０ｍＬ中のインスリン−リンカー−チオール８ｂ（２７．８ｍｇ，４．６μｍｏｌ）の溶液を加え、そして懸濁液を室温で５分間定温放置した。酢酸バッファ（０．４ｍＬ，ｐＨ４．８，１．０Ｍ）を加え、そしてサンプルを室温で１時間定温放置した。チオールの消費をエルマン（Ellman）試験によってモニターした。ヒドロゲルを、アセトニトリル／水／ＴＦＡ １／０．４３／０．００１（ｖ／ｖ／ｖ）で１０回、そして１．０ＭサルコシンｐＨ７．４／アセトニトリル／０．５Ｍリン酸バッファｐＨ７．４／水 １／１／０．２／０．２５（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で２回洗浄した。最後に、ヒドロゲルをサルコシン溶液中に懸濁し、そして室温で２時間定温放置した。
インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ａをアセトニトリル／水／ＴＦＡ １／１／０．００１（ｖ／ｖ／ｖ）で１０回洗浄し、そして４℃で保存した。
インスリン含量は、ｐＨ１２の還元条件下におけるインスリン−リンカー−ヒドロゲルのアリコートの全加水分解並びにその後のＲＰ−ＨＰＬＣによるインスリンＡ鎖及びインスリンＢ鎖の定量によって決定した。

【0349】

１１ａのインスリン装填：
インスリン１７５ｍｇ／インスリン−リンカー−ヒドロゲルのｇ
１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファｐＨ５，１３５ｍＭ塩化ナトリウム中の１１ａ懸濁液中のインスリン量：１１ａ懸濁液１ｍｌ当たりインスリン１２ｍｇ
１１ｂ、１１ｃ、及び１１ｄは、８ｂの代わりに、それぞれ８ｃ、９及び１０を使用したことを除いて上記のように製造した。

【0350】

１１ｄａは、８ｂ及び４の代わりに１０及び４ａを使用したことを除いて上記のように製造した。

【0351】

１１ｄｂは、以下のように製造した：
ｐＨ２．５ ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０中のマレイミド官能化ヒドロゲル４ａの懸濁液（５．０ｍＬ，１１９μｍｏｌマレイミド基）を、フィルターを備えた注射器に充填した。ｐＨ２．５のＨＣｌ ８．０ｍＬ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０中のインスリン−リンカー−チオール１０（１６６ｍｇ，２４．４μｍｏｌ）の溶液を加え、そして懸濁を室温で５分間定温放置した。コハク酸ナトリウムバッファ（３．９ｍＬ，ｐＨ４．０，１５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えてｐＨ３．６を得、そしてサンプルを室温で９０分間定温放置した。チオールの消費をエルマン試験によってモニターした。ヒドロゲルをコハク酸ナトリウムバッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０回、そして２００ｍＭアセチルシステインを含むコハク酸ナトリウムバッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。最後に、ヒドロゲルを、アセチルシステイン含有バッファ中に懸濁し、そして室温で１時間定温放置した。
インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ｄｂをコハク酸バッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０回、そして酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０，１０ｍＭ；１３０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で８回洗浄した。
１１ｄｂのインスリン装填量：インスリン−リンカー−ヒドロゲル懸濁液のｍＬ当たりインスリン６．１２ｍｇ

【0352】

１１ｄｃは、以下のように製造した。
ｐＨ２．５ ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０（５８．３ｍＬ，９５８μｍｏｌマレイミド基）中のマレイミド官能化ヒドロゲル４ａの懸濁液を固相合成反応器に加えた。２．５ＨＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０中のインスリン−リンカー−チオール１０（１１７ｍＬ，４６０μｍｏｌ）の溶液を４ａに加えた。懸濁液を室温で５分間定温放置した。コハク酸バッファ（４．８ｍＬ，ｐＨ４．０，１５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えてｐＨ３．６を得、そして懸濁液を室温で９０分間定温放置した。
チオールの消費をエルマン試験によってモニターした。ヒドロゲルを、コハク酸バッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０回、そして１０ｍＭメルカプトエタノールを含むコハク酸バッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄した。最後に、ヒドロゲルをメルカプトエタノール含有バッファ中に懸濁し、そして室温で３時間定温放置した。インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ｄｃをコハク酸塩バッファ（ｐＨ３．０，５０ｍＭ；１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０回、そしてコハク酸／トリスバッファ（ｐＨ５．０，１０ｍＭ；８５ｇ／Ｌトレハロース，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で６回洗浄した。
１１ｄｃのインスリン装填量：インスリン−リンカー−ヒドロゲル懸濁液のｍＬ当たりインスリン１８．７ｍｇ
別法として、４ａの代わりにマレイミド誘導化ヒドロゲルマイクロ粒子４ａａを用いることができる。

【0353】

実施例１２
インビトロ放出速度論
インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ａ、１１ｂ、１１ｃ及び１１ｄ（インスリン約１ｍｇを含むインスリン−リンカー−ヒドロゲル）を、それぞれ、２ｍｌの６０ｍＭリン酸ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中に懸濁し、そして３７℃で定温放置した。時間間隔をとって懸濁液を遠心分離し、そして上澄みを２１５ｎｍのＲＰ−ＨＰＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳによって分析した。遊離インスリンに関連するＵＶ−シグナルを積分し、そして定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用して対応する放出の半減期を評価した。１６ｄ、１０ｄ、３０ｄ及び１４ｄのインビトロ半減期を、それぞれ、１１ａ、１１ｂ、１１ｃ及び１１ｄについて決定した。
別法として、インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ｄｂを、フィルターを備えた注射器に移し、６ｍｌの６０ｍＭリン酸ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中で懸濁し、そして３７℃で定温放置した。所定の時点で、上澄みを交換し、そして遊離されたインスリンを２１５ｎｍのＲＰ−ＨＰＬＣによって定量化した。放出されたインスリンの量を、定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用し、そして１１ｄｂについては、インビトロ半減期が１５日と決定された。
別法として、インスリン−リンカー−ヒドロゲル１１ｄｂをクロマトグラフィカラムに充填し、そして温度制御された恒温器（３７℃）中に置いた。リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４，６０ｍＭ；３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を、０．２５ｍＬ／時（公称）の一定流量でカラムを通してポンピングし、そして恒温器の外側で集めた。所定の時点で、溶液を２１５ｎｍでＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。放出されたインスリンの量を定温放置時間に対してプロットした。曲線適合ソフトウェアを適用し、そして１１ｄｂについては、インビトロ半減期が１３日と決定された。

【0354】

実施例１３
インスリンのＬｙｓＢ２９−リンカー複合体（１２ａ）及びインスリンリスプロのＬｙｓＢ２８−リンカー複合体（１２ｂ）の合成：
インスリンのＬｙｓＢ２９−リンカー複合体（１２ａ）の合成

【化37】

インスリン１．２ｇ（０．２０６ｍｍｏｌ，０．８５当量）を室温でＤＭＳＯ中に溶解した。３０分後、溶液を０℃に冷却しながら、ホウ酸バッファ（０．５Ｍ，ｐＨ８．５，２１．６ｍｌ）を４．４０分間にわたって加えた。溶液の温度を２５〜２８℃の間に保持した。７ｆ２２８ｍｇ（０．２３９ｍｍｏｌ，１当量）の溶液をＤＭＳＯ４０ｍｌ中に溶解し、３分間かけて時間で変化させずに（time-invariant）加えた。氷浴をはずし、そして反応混合物を室温で５分間撹拌した。ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ（１：１，０．１％ＴＦＡ）７０ｍｌ及びＡｃＯＨ４００ｌを添加することによって反応をクエンチした。１２ａを、ＲＰ ＨＰＬＣ（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ入りＨ₂Ｏ，溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ入りＭｅＣＮ，勾配：１４分かけて３０−８０％Ｂ，流量：４０ｍｌ／分）によって精製した。
ＵＰＬＣ分析（ＲＰ ＨＰＬＣ精製前）による位置選択性：０．７０％の７ｆがインスリンのＧｌｙＡ１に結合し、そして７６．２％の７ｆがインスリンのＬｙｓＢ２９に結合した（図１ａ参照）。
収量：８６２ｍｇ（ＴＦＡ塩，６０％）
ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_1/4⁺＝１６６２．２５ｇ／ｍｏｌ（（ＭＷ＋Ｈ）_1/4計算値＝１６６２．３５ｇ／ｍｏｌ）

【0355】

インスリンリスプロのＬｙｓＢ２８−リンカー複合体（１２ｂ）の合成

【化38】

インスリンリスプロ０．３４７ｇ（０．０５９ｍｍｏｌ，０．８５当量）を室温でＤＭＳＯ６ｍｌ中に溶解した。３０分後、溶液を０℃に冷却しながら、ホウ酸バッファ（０．５Ｍ，ｐＨ８．５，５．６４ｍｌ）を１．４０分間かけて加えた。溶液の温度を２５〜３０℃の間に保持した。ＤＭＳＯ８ｍｌ中に溶解した７ｆ６７ｍｇ（０．０７０ｍｍｏｌ，１当量）の溶液を２分間にわたって時間で変化させずに加えた。氷浴をはずし、そして反応混合物を室温で５分間撹拌した。ＭｅＣＮ／Ｈ₂Ｏ（１：１，０．１％ＴＦＡ）２０ｍｌ及びＡｃＯＨ１ｍｌを添加することによって反応をクエンチした。１２ｂを、ＲＰ ＨＰＬＣ（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ入りＨ₂Ｏ、溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡ入りＭｅＣＮ、勾配：１４分かけて３０−８０％Ｂ、流量：４０ｍｌ／分）によって精製した。
ＵＰＬＣ分析（ＲＰ ＨＰＬＣ精製前）による位置選択性：生成物の１．３％は、インスリンリスプロのＧｌｙＡ１に結合した７ｆであり、生成物の７６．７％は、インスリンリスプロのＬｙｓＢ２８に結合した７ｆであった（図１ｂ参照）。
収量：３０５ｍｇ（ＴＦＡ塩，７２％）
ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］_1/4⁺＝１６６２．２５ｇ／ｍｏｌ（（ＭＷ＋Ｈ）_1/4計算値＝１６６２．３５ｇ／ｍｏｌ）

【0356】

実施例１４
ラットにおける薬物動態研究
ラットに一回量を皮下適用した後、血漿インスリン濃度を測定することによって１１ａの薬物動態を決定した。
１０匹の雄ウィスターラット（２００〜２５０ｇ）からなる一群を用いて１４日間にわたる血漿インスリン値を研究した。各動物にインスリン６ｍｇ（インスリン１２ｍｇ／ｍｌ）を含む酢酸バッファｐＨ５中の１１ａ懸濁液５００μＬを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液２００μＬを舌下から採血してＬｉ−ヘパリン血漿１００μＬを得た。適用前、並びに注射後の４時間、１、２、３、４、７、９、１１及び１４日後にサンプルを採取した。採血後、１５分以内に血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。超高感度インスリンＥＬＩＳＡキット（Mercodia）を用いて製造者のプロトコールに従って血漿インスリン濃度を測定した。
測定前に血漿サンプルをＥＬＩＳＡバッファ（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）中に希釈した。インスリン標準を二通りに測定し、そして線形回帰を用いて値を適合させることによって得た検量線からインスリン濃度を算出した。インスリン濃度は、それぞれの希釈係数によって修正され、時間に対してプロットされた２つの独立した希釈系列からの平均として定義された。各時点の平均血漿インスリン濃度は、図２に示すように用いたすべての動物の平均を算出することによって得た。
１４日にわたってインスリンのバーストのない持続的放出が観察された。

【0357】

実施例１５：ラットにおける薬物動態研究
健常なラットにおいて１３日間にわたって血漿インスリン濃度を測定することによって１１ｄａの薬物動態を決定した。８匹のウィスターラット（体重約２５０ｇ）にインスリン３ｍｇ（約１２ｍｇ／ｋｇ）を含む酢酸バッファｐＨ５中の試験品目１１ｄａ５００μＬを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液２００μＬを尾静脈から採血してＬｉ−ヘパリン血漿約１００μＬを得た。試験品目投与の１日前並びに４時間、１日、２日、３日、６日、７日、８日、１０日及び１３日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ＥＬＩＳＡキット（DRG Instruments GmbH, Germany）を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。ブランク（キャリブレータ０）は、検量線に含まれており、そしてサンプル値から差し引かれており、そして３次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管中で希釈した（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Ultra）を用いて参照波長補正なしで４５０ｎｍのＯＤを測定した。研究したすべての動物について１３日目までの血漿インスリン含量の結果を図３に示す。
インスリン３ｍｇを含む１１ｄ５００μＬの単回皮下注射後、平均血漿インスリン値は、１日目に最大約５００ｐｍまで上昇した。予想通り、血漿インスリン濃度は、その後２週間のうちに連続的に低下した。本研究の第１週内の血漿インスリン値のピーク対トラフ比は、約１．７であった。

【0358】

実施例１６
ラットにおける薬物動態及び薬力学研究
糖尿病スプレーグドーリー（Sprague-Dawley）（ＳＤ）ラットを用いた探索的薬物動態学的／薬力学的研究において血漿インスリン濃度及び血糖低下効果を分析することによって放出されたインスリンの量及び生物活性（bioactivity）を研究した。この目的のため、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を用いて８匹のラットに糖尿病を誘発させ、そして血糖値が０日目において３５０ｍｇ／ｄＬより上のすべての動物を本研究に含めた。８匹のＳＤラットのうちの７匹は、糖尿病になり、そしてインスリン６．４ｍｇを含む酢酸バッファｐＨ５中の試験品目１１ｄａ５００μＬを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液２００μＬを尾静脈から採血してＬｉ−ヘパリン血漿約１００μＬを得た。試験品目投与の４日前、並びに２時間、１日、２日、３日、６日、７日、８日、１０日及び１３日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。注射前に３回並びに試験品目投与の２時間、１日、２日、３日、６日、７日、８日、１０日、１３日、１５日、１７日、２０日、２２日及び２４日後に、AccuChek Comfort器具を用いて尾静脈から血糖を測定した。ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（DRG Instruments GmbH, Germany）を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク（キャリブレータ０）が含まれており、サンプル値から差し引き、そして３次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Ultra）を用いて参照波長の補正なしに４５０ｎｍのＯＤを測定した。図４に示すように血漿インスリン値を２週間にわたって、そして血糖値を３週間にわたってモニターした。
インスリンヒドロゲル１１ｄａの単回皮下注射後、血糖値は１０日間にわたって効果的に低下し、低血糖に関するなんらかの症状もなく１００ｍｇ／ｄＬ以下の値であった。動物当たりインスリン６．４ｍｇのより高い用量のため、最大血漿インスリン濃度は、１日目に約８００ｐＭであり、そして２週間のうちに約３００ｐＭまで連続的に低下した。同時に血糖値は、１０日後に上昇を始め、そして３週間後に投薬前の値に到達した。

【0359】

実施例１７：
ラットにおける２４時間にわたる薬物動態研究（バースト研究）
インスリンがインスリン−リンカー−ヒドロゲルからバーストなしに放出されることを立証するため、健常なラットにおいて２４時間にわたって血漿インスリン濃度をモニターした。８匹のスプレーグドーリーラット（体重２００〜２５０ｇ）を２つの群に分け、そして体重１ｋｇ当たり酢酸バッファｐＨ５中の試験品目１１ｄｂ２ｍＬを単回皮下注射した。試験品目は、各動物が体重１ｋｇ当たりインスリン８ｍｇを受けるように４ｍｇ／ｍｌのインスリンの濃度を有した。動物及び時点毎に血液２００μＬを尾静脈から採血してＬｉ−ヘパリン血漿約１００μＬを得た。群Ａサンプルは、投薬前並びに試験品目適用の５分、３０分、２時間、４時間及び８時間後、そして群Ｂについては、投薬前並びに試験品目投与の１５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間後に採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ＥＬＩＳＡキット（DRG Instruments GmbH, Germany）を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク（キャリブレータ０）が含まれており、サンプル値から差し引き、そして３次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Ultra）を用いて参照波長の補正なしに４５０ｎｍのＯＤを測定した。結果を図５に示し、そしてインスリンがなんらバーストなしに放出されることを明白に示している。

【0360】

実施例１８：
ラットにおける薬物動態及び薬力学反復投与研究
糖尿病ラットにおいて４週間にわたって血漿インスリン濃度及び血糖値を測定することによって１１ｄａを毎週３回投与した後の薬物動態及び薬力学を決定した。
平均体重２３９ｇの８匹のスプレーグドーリーラットを用いた。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で糖尿病を誘発させ、そして０日目（試験品目注射日）に血糖値が３５０ｍｇ／ｄＬより上のすべての動物を本研究に含めた。ＳＴＺ処置を受けた８匹の動物のうち８匹が糖尿病になり、そして体重１ｋｇ当たり酢酸バッファｐＨ５中の試験品目１１ｄａ２ｍＬを０、７及び１４日目に毎週３回皮下注射した。４ｍｇ／ｍｌの試験品目インスリン濃度では、適用された用量は、体重１ｋｇ当たりインスリン８ｍｇであった。動物及び時点毎に２００μＬの血液を尾静脈から採血してＬｉ−ヘパリン血漿約１００μＬを得た。試験品目投与の３日前、そして２８日後までサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。注射前に３回、そして注射後３０日までAccuChek Comfort器具を用いて尾静脈から血糖を測定した。ヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（DRG Instruments GmbH, Germany）を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク（キャリブレータ０）が含まれており、サンプル値から差し引き、そして３次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Ultra）を用いて参照波長の補正なしに４５０ｎｍのＯＤを測定した。血漿インスリン値及び血糖値を４週間にわたってモニターし、そして両方を図６に示す。
曲線の形状は、３回目の注射後に血糖値を約１００ｍｇ／ｄＬの値まで着実に低下させ、それは約１週間低いままであったことにより放出されたインスリンが生物活性であることを示している。同時に、最大インスリン濃度は、１回目の後に２００ｐＭから始まり、そして２回目の投薬後に３００ｐＭ、３回目の投薬後に４００ｐＭまで着実に上昇し、そして、その後、２週間のうちに１００ｐＭ以下の値に再び低下した。

【0361】

実施例１９：
ラットにおける薬物動態研究
健常なラットにおいて１３日間にわたって血漿インスリン濃度を測定することによって１１ｄｃの薬物動態を決定した。
８匹のウィスターラット（体重約２３０ｇ）にインスリン３ｍｇ（１２ｍｇ／ｋｇの用量）を含む、コハク酸バッファｐＨ５（１０ｍＭコハク酸／トリス，８５ｇ／ｌトレハロース，０．０１％Ｔｗｅｅｎ］２０，ｐＨ５．０）中の２ｍｌ／ｋｇの試験品目１１ｄｃを単回皮下注射した。動物及び時点毎に血液２００μＬを尾静脈から採血してＬｉ−ヘパリン血漿約１００μＬを得た。試験品目投与の４日前、そして０．３時間（４匹の動物）、１時間（４匹の動物）、２時間（４匹の動物）、４時間（４匹の動物）、１日、２日、３日、６日、８日、１０日及び１３日後にサンプルを採取した。血漿サンプルを凍結し、そして検定するまで−８０℃で保存した。ヒトインスリン超高感度ＥＬＩＳＡキット（DRG Instruments GmbH, Germany）を用いて製造者の説明に従って血漿サンプルのインスリン含量を測定した。検量線にはブランク（キャリブレータ０）が含まれており、サンプル値から差し引き、そして３次元の多項式を用いて検量線を適合させた。分析前に血漿サンプルをかき混ぜ、そして反応管（キャリブレータ０で１：５及び１：１０）中で希釈した。分析のため、マイクロタイタープレートリーダー（Tecan Ultra）を用いて参照波長の補正なしに４５０ｎｍのＯＤを測定した。研究したすべての動物についての１３日目までの血漿インスリン含量の結果を図７に示す。
１２ｍｇ／ｋｇの１１ｄｃを単回皮下注射した後、平均血漿インスリン値は、１日目に最大約５００ｐＭまで上昇した。予想通り、血漿インスリン濃度は、その後、２週間のうちに連続的に低下した。最初の週のうち、血漿インスリンのピーク対トラフ比は、約１．４であった。

【0362】

実施例２０
ｐＨ７．４でのリアルタイムインスリン放出及びヒドロゲル分解
ｐＨ５．０の酢酸バッファ（１０ｍＭ，１３０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）トゥイーン−２０）中のインスリン−リンカーヒドロゲル１１ａ（７３０μＬ，インスリン３．１９ｍｇを含む）を、ｐＨ７．４の放出バッファ（６０ｍＭリン酸ナトリウム，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄したサンプル調合管中に充填し、そして１．００ｍＬまで満たした。懸濁液のアリコート（０．５ｍＬ，インスリン１．５９ｍｇ）をクロマトグラフィカラム中に充填し、そして温度制御された恒温器（３７℃）中に置いた。放出バッファ（ｐＨ７．４）を０．２５ｍＬ／時（公称）の一定流量でカラムを通してポンピングし、そして恒温器の外側で集めた。所定の時点で溶液をＲＰ−ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ）によって分析した。放出されたインスリンの量を定温放置時間に対してプロットし、そして曲線適合ソフトウェアを適用して対応する放出半減期を推定した。インスリン放出については、半減期が９．４日と決定された。
３７℃で３９日の定温放置後、ヒドロゲル懸濁液をサンプル調合管に移し、ｐＨ７．４の放出バッファを用いて残留ヒドロゲルをカラムから洗浄し、そしてサンプルを１．００ｍＬまで満たした。２つのアリコート（それぞれ３００μＬ）を滅菌サンプル調合管に移し、１．５ｍＬまで満たし、そして３７℃で定温放置した。時間間隔をおいてサンプルを採取し、そしてサイズ排除クロマトグラフィによって分析した。１つ又はそれ以上の骨格鎖部分（反応性官能基に対応する）を含むヒドロゲル放出された水溶性分解生成物に相当するＵＶ−シグナルを積分し、そして定温放置時間に対してプロットした、図８参照。

【0363】

実施例２１
インスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグの注射可能性
ｐＨ５．０のコハク酸／トリス（１０ｍＭ，４０ｇ／Ｌマンニトール；１０ｇ／Ｌトレハロース二水和物；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中のインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグ１１ｄｃ（３２−７５ｍからのビーズサイズ分布、インスリン１８ｍｇ／ｍｌ）５ｍＬを用いた。２０Ｇの注射針を介してインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグ懸濁液を１ｍＬの注射器（長さ５７ｍｍ）に充填した。２０Ｇの注射針を３０Ｇの注射針と交換し、そして注射器台（Aqua Computer GmbH&Co. KG）に設置し、そして１７２ｍｍ／分（５０μＬ／秒に等しい）のピストン速度で測定を開始した（押込試験台（Force test stand）：Multitest 1-d，データ記録ソフトウェア：EvaluatEmperor Lite, Version 1.16-015、Forge Gauge：BFG 200 N（すべてMecmesin Ltd., UK）。下の表に示したピストン速度を高める実験は、新しいインスリン−リンカー−ヒドロゲルプロドラッグサンプルを用いて実施した。水及びエチレングリコールを用いた実験を、それに応じて実施した。すべての実験で、同じ３０Ｇの注射針を用いた。３０Ｇの注射針を用いた力対流量を図９に示す。

【0364】

【表1】

【0365】

略語：
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡｃＯＥｔ 酢酸エチル
Ａｉｂ ２−アミノイソ酪酸
Ｂｎ ベンジル
Ｂｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＣＯＭＵ （１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ−モルホリノ−カルベニウムヘキサフルオロホスフェート

ＤＢＵ １,３−ジアザビシクロ［５.４.０］ウンデセン
ＤＣＣ Ｎ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｄｍｏｂ ２,４−ジメトキシベンジル
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＥＤＣ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ｅｑ 化学量論的当量
ＥＳＩ−ＭＳ エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＥｔＯＨ エタノール
Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＦＩＰ ヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＰＬＣ 高性能液体クロマトグラフィ
ＨＯＢｔ Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｉＰｒＯＨ ２−プロパノール
ＬＣＭＳ 質量分析連動液体クロマトグラフィ
Ｍａｌ ３−マレイミドプロピル
Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ Ｎ−（３−マレイミドプロピル）−２１−アミノ−４,７,１０,１３,１６,１９−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸ＮＨＳエステル
Ｍｅ メチル
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール

Ｍｍｔ ４−メトキシトリチル
ＭＳ 質量スペクトル／質量分析
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ．−ブチルエーテル
ＭＷ 分子量
ｎ．ｄ． 未検出
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＯＤ 光学濃度
ＯＢｕ ブチルオキシ
ＯｔＢｕ ｔｅｒｔ．−ブチルオキシ
ＰＥＧ ポリ（エチレングリコール）
Ｐｈｔｈ フタル−
ＰｙＢＯＰ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＲＰ−ＨＰＬＣ 逆相高性能液体クロマトグラフィ
ｒｐｍ １分当たりの回数
ＲＴ 室温
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィ
Ｓｕ スクシンイミジル
ＴＣＰ ２−クロロトリチルクロリド樹脂
ＴＥＳ トリエチルシラン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＭＥＤＡ Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン
Ｔｍｏｂ ２,４,６−トリメトキシベンジル
Ｔｒｔ トリフェニルメチル、トリチル
ＵＰＬＣ 超高性能液体クロマトグラフィ
ＵＶ 紫外線
ＶＩＳ ビジュアル（visual）

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】