特許 5738294 抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体およびその抗体を含む薬学的組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5738294

(24)【登録日】2015年5月1日

(45)【発行日】2015年6月24日

(54)【発明の名称】抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体およびその抗体を含む薬学的組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/22 20060101AFI20150604BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20150604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150604BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20150604BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150604BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20150604BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20150604BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20150604BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20150604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150604BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/22ZNA

   C07K16/46

   C12N5/00 102

   A61K39/395 N

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61P25/00

   A61P3/04

   A61P3/10

   A61P27/02

   G01N33/53 D

   G01N33/53 V

   G01N33/574 A

   G01N33/577 B

   G01N37/00 102

   !C12P21/08

   !C12N15/00 A

【請求項の数】10

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2012-525877(P2012-525877)

(86)(22)【出願日】2010年8月27日

(65)【公表番号】特表2013-502445(P2013-502445A)

(43)【公表日】2013年1月24日

(86)【国際出願番号】CN2010076420

(87)【国際公開番号】WO2011023130

(87)【国際公開日】20110303

【審査請求日】2012年2月23日

(31)【優先権主張番号】200910171550.9

(32)【優先日】2009年8月28日

(33)【優先権主張国】CN

【微生物の受託番号】CGMCC  3233

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】512046279

【氏名又は名称】チャンスー シムサー ファーマシューティカル アールアンドディー カンパニー リミテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】512046280

【氏名又は名称】エピトミクス インク

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】リ、ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ケ、ヤオファン

(72)【発明者】

【氏名】ヂャン、ヨンキ

(72)【発明者】

【氏名】ヂュ、ウェイミン

(72)【発明者】

【氏名】ユ、グオリャン

(72)【発明者】

【氏名】マ、ファンシン

(72)【発明者】

【氏名】ファン、シン

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００１５２５９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５２０９９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１７４４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 2009. 4, Vol. 50, p. 296

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, No. 20, pp. 9348-9352

【文献】 J. Biol. Chem., 2006, Vol. 281, No. 2, pp. 951-961

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＶＥＧＦに特異的に結合する活性を有し、
重鎖可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号７によって示され、および、
軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号８によって示されることを特徴とする、モノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項2】

前記モノクローナル抗体は、単鎖抗体、二本鎖抗体、キメラ抗体、または、ヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項3】

重鎖アミノ酸配列が配列番号９によって示されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項4】

軽鎖のアミノ酸配列が配列番号１０によって示されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項5】

保存番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３３を有する細胞株によって産生されることを特徴とする、ＶＥＧＦに特異的に結合する活性を有し、重鎖の可変ドメインが配列番号１、配列番号２、および配列番号３のアミノ酸配列を含み、および、軽鎖の可変ドメインが配列番号４、配列番号５、および配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、モノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項6】

保存番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３３を有するＣＧＭＣＣに保存されていることを特徴とする細胞株。

【請求項7】

ＶＥＧＦ関連疾患を治療することに用いられる、請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項8】

前記ＶＥＧＦ関連疾患が腫瘍、ＡＭＤ、神経変性疾患、肥満、および糖尿病を含むことを特徴とする、請求項７に記載のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン。

【請求項9】

請求項１〜５のいずれかに記載の有効量のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含むことを特徴とする薬学的組成物。

【請求項10】

請求項１〜５のいずれかに記載の上記のモノクローナル抗体、またはその抗原結合ドメインを含む、試薬、キット、またはチップ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、その全体が参照により組み込まれる、「Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ｓａｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体およびその抗体を含む薬学的組成物）」という表題の２００９年８月２８日に出願された中国特許出願第２００９１０１７１５５０．９号の優先権を主張する。

【0002】

発明の分野
本発明は、遺伝子操作された抗体の技術分野に関し、特に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と特異的に結合する遺伝子操作された抗体、ならびにその抗体を含む薬学的組成物およびキットに関する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、インビボで血管形成を誘導することが可能である、血管内皮細胞に特異的なヘパリン結合増殖因子である。ヒトＶＥＧＦタンパク質は、１９８９年に米国人科学者によって成功裏に精製および同定され、彼はまた、その遺伝子をクローニングし、その遺伝子配列を決定した。

【0004】

ＶＥＧＦは血管形成を促進することが可能である。ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーが、結合する細胞の表面上の対応する受容体（ＶＥＧＦＲ）を通して細胞反応を活性化することが可能であり、これらはリン酸化によって二量体化され、活性化される。ＶＥＧＦＲは７個の免疫グロブリン様細胞外ドメイン、１個の膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを含む１個の細胞内ドメインを含む。ＶＥＧＦ ＡはＶＥＧＦ受容体１（受容体Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ／Ｆｌｔ−１）と結合することが可能である。ＶＥＧＦ受容体２は、ＶＥＧＦの知られているほぼすべての生物学的機能を媒介する。ＶＥＧＦならびにその生物活性および受容体は、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．およびＭａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．によって詳細に説明および研究されてきた（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１９９９補遺１：４４−５２；ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉ ＳＴＫＥ．２００１：ＲＥ２１を参照のこと）。

【0005】

ＶＥＧＦは、高度に保存されたホモ二量体糖タンパク質であり、ここでは、各々２４ｋＤａの分子量を有する２個の単鎖がジスルフィド結合を通して二量体を形成する。ｍＲＮＡによる様々なやり方のスプライシングのために、ＶＥＧＦ １２１、ＶＥＧＦ １４５、ＶＥＧＦ １６５、ＶＥＧＦ １８５、およびＶＥＧＦ２０６を含む少なくとも５通りのタンパク質パターンが生じ、ここで、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ １４５、およびＶＥＧＦ １６５は、血管内皮細胞に直接的に作用することが可能である分泌性可溶性タンパク質であり、血管内皮細胞の増殖および移動を促進し、そして血管透過性を増強する。

【0006】

ＶＥＧＦ関連疾患は、典型的には、以下の特徴を有する：血管内皮細胞の過剰増殖、血管透過性の増加、傷害、脳卒中または腫瘍によって引き起こされる脳浮腫などの組織浮腫および炎症；乾癬または関節リウマチを含む関節炎などの炎症性疾患によって引き起こされる浮腫；喘息；熱傷に付随する全身水腫；腫瘍、炎症または外傷によって引き起こされる腹水および胸水；慢性気管炎；毛細血管漏出症候群；腐敗血症；タンパク質漏出と関連する腎疾患；加齢に伴う黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼疾患；乳癌、肺癌、結腸直腸癌、脳の神経膠腫、腎臓癌を含む腫瘍など。

【0007】

抗体とその標的の場所との間の結合は特異的であり、これは免疫学的効果のメカニズムを媒介することができ、そして血清中で比較的長い半減期を有する。これらの特徴は抗体の強力な治療適用を生じる。

【0008】

現在、ＦＤＡおよびヨーロッパは、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、脳の神経膠腫、腎臓癌、および加齢に伴う黄斑変性（ＡＭＤ）の治療における、組換えヒト化マウス抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるアバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）の適用を認可しており、これは、２００８年において売り上げが４８億ＵＳドルに達している。しかし、アバスチン抗体はＶＥＧＦに対して高い親和性を有してはいない。さらに、独占的な製造のため、患者は高額を支払う必要がある。現在、患者は、１年あたり約５０，０００から１００，０００ＵＳドルをこの薬物のために支払う必要がある。従って、新たな抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を開発し、それによって患者への負担を軽減し、治療コストを低減するという危急の必要性が存在している。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

定義
本発明のさらなる説明の前に、本発明は、記載された特定の実施形態によって限定されないことを理解することが必要である。換言すれば、特定の形式に違いがあってもよい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に従うので、本明細書中の用語は、本発明を限定するのではなく、特定の実施形態を説明することのみを意図したものであることがさらに注意されるべきである。

【0010】

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で交換可能に使用されてもよい。これらの用語は当業者に周知であり、具体的には、抗原と特異的に結合可能である１種以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。１つの型の抗体が抗体の基本構造単位を構成し、これは四量体である。これは、各対が軽鎖および重鎖を有する２対の完全に同一の抗体鎖からなる。抗体鎖の各対において、軽鎖および重鎖の可変ドメインは一緒に結合されて、抗原との結合の原因となるのに対して、定常ドメインは抗体のエフェクター機能の原因である。

【0011】

現在知られている免疫グロブリンポリペプチドには、κおよびλ軽鎖、α、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ重鎖、または他のその等価物が含まれる。免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、その全長において、ＮＨ２末端に約１１０アミノ酸からなる可変ドメイン、およびＣＯＯＨ末端にκまたはλ定常ドメインを含む。同様に、免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）は、その全長において、可変ドメイン（約１１６アミノ酸）およびγなどの重鎖定常ドメイン（約３３０アミノ酸）のうち１つを含む。

【0012】

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソフォーム抗体または免疫グロブリン、または抗原となお特異的に結合される抗体セグメントを含み、これには、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦｄセグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を有する融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、例えば、放射性同位元素、アッセイ可能な物質を産生することが可能な酵素、蛍光タンパク質、およびビオチンによって、標識および検出されてもよい。さらに、抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズが挙げられるがこれらに限定されない固体支持体と結合できる。この用語はさらに、抗原と特異的に結合することが可能である、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２および／または他の抗体セグメントおよびモノクローナル抗体を含む。

【0013】

抗体はまた、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）_２、ならびに二機能ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７；１７，１０５）を含む種々の型で、ならびに単鎖（例えば、参照により本明細書に引用される、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＬ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８；８５，５８７９およびＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；２４２，４２３）の型で存在してもよい。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインは、３個の超可変ドメイン（「相補性決定領域」またはＣＤＲとも呼ばれる）からなる。これらの超可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられている。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に規定されている（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照のこと）。本明細書で説明されるすべての抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔシステムを参照することによって分類されている。同じ種の異なる軽鎖および重鎖ＦＲ配列が比較的保存されている。抗体ＦＲはＣＤＲを位置決めおよび較正するために使用される。ＣＤＲは抗原エピトープとの結合の主な原因である。

【0014】

キメラ抗体は、構築された重鎖および軽鎖遺伝子を有する抗体、特に、遺伝子操作されかつ異なる種に属する可変ドメインおよび定常ドメイン遺伝子を有する抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体遺伝子の可変ドメインセグメントは、γ１およびγ３などのヒト抗体の定常ドメインセグメントに結合される。例えば、医学的処置において使用されるキメラ抗体は、キメラタンパク質の一種であり、これは、ヒト抗体定常ドメインまたはエフェクトドメインと合わせたウサギ抗体可変ドメインセグメントまたは抗原結合ドメインセグメントである（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＣＲＬ ９６８８の保存番号を有する細胞を用いて調製された抗Ｔａｃキメラ抗体）。当然、キメラ抗体は、他の哺乳動物種からの遺伝子もまた使用できる。

【0015】

「ヒト化抗体」および「ヒト化免疫グロブリン」という用語は同じ意味を有する。非ヒト化型の抗体と比較して、そのヒト化抗体は、典型的には、ヒト宿主における免疫反応を減少させる。

【0016】

本発明に従って設計および産生されたヒト化抗体は、抗原結合または抗体の他の機能に実質的に影響を与えないいくつかの保存性アミノ酸を置き換えてもよいことが理解されるべきである。言い換えると、アミノ酸は、ｇｌｙおよびａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅおよびｌｅｕ；ａｓｐおよびｇｌｕ；ａｓｎおよびｇｌｎ；ｓｅｒおよびｔｈｒ；ｌｙｓおよびａｒｇ；ｐｈｅおよびｔｙｒの組み合わせの中で相互に置換できる。同じグループの中にないアミノ酸は「実質的に異なる」アミノ酸である。

【0017】

ある実施形態において、抗体とその標的の場所との間の親和性はＫ_ｄ（解離定数）によって表され、これは、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍより低いか、または約１０^−１２Ｍ以下である。

【0018】

抗体の重鎖または軽鎖の「可変ドメイン」は、その鎖のＮ末端における成熟領域である。すべてのドメイン、ＣＤＲ、および残基の数は、配列アラインメントを通して、そして既存の構造的知見に基づいて規定される。ＦＲおよびＣＤＲ残基の決定および番号付けは、Ｃｈｏｔｈｉａおよび他の研究者が記載したことに基づいている（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９８；２７８，４５７）。

【0019】

ＶＨは抗体の重鎖の可変ドメインである。ＶＬは抗体の軽鎖の可変ドメインであり、これは、κおよびλアイソタイプを含んでもよい。Ｋ−１抗体はκ−１アイソタイプを有するのに対して、Ｋ−２抗体はκ−２アイソタイプを有し、そしてＶλは可変λ軽鎖である。

【0020】

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で交換可能に使用されてもよい。これらの両方は、任意の長さの重合したアミノ酸をいい、これは、コードアミノ酸および非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含んでもよい。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質；Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有さない、異種および同種リーダー配列を有する融合タンパク質；免疫学的タグを有するタンパク質；検出可能な融合パートナーを有する融合タンパク質、例えば、蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、フルオレセインなどを含む融合パートナーとして機能できる融合タンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない、融合タンパク質を含んでもよい。ポリペプチドは任意の長さであり得、「ペプチド」という用語は８〜５０残基（例えば、８〜２０残基）の長さのポリペプチドをいう。

【0021】

「被験体」、「宿主」、「患者」、および「個体」という用語は本明細書では交換可能に使用されてもよく、具体的には、診断または治療される任意の哺乳動物、特にヒトをいう。他の被験体には、サル、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが含まれてもよい。

【0022】

「一致するアミノ酸」とは、２個以上のアミノ酸配列が比較されるときに、同じ位置におけるアミノ酸残基をいう（すなわち、これらは互いに一致している）。抗体配列の比較および番号付けの方法は、Ｃｈｏｔｈｉａ（上記を参照のこと）、Ｋａｂａｔ（上記を参照のこと）、およびその他によって詳細に記載されてきた。時折、１個、２個、または３個のギャップが作製されてもよく、および／または１個、２個、３個、もしくは４個の残基もしくは最大で約１５個の残基（特に、Ｌ３およびＨ３ ＣＤＲ中）が抗体の１個または２個のアミノ酸の中に挿入され、それによって、比較を完了してもよいことが当業者に知られている（例えば、Ｋａｂａｔ １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＤＨＨＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣを参照のこと）。

【0023】

「置換可能な位置」とは、抗体の結合活性を有意に減少させることなく、異なるアミノ酸によって置換できる、抗体の特別な位置をいう。置換可能な位置を決定するための方法、およびこれらがどのように置換できるかは、以下により詳細に記載される。置換可能な位置は、「変動耐容性位置」と呼ばれることもある。

【0024】

「親の」抗体とは、アミノ酸置換の標的抗体をいう。ある実施形態において、「ドナー」抗体は親の抗体にアミノ酸を「供与」して、変化した抗体を産生する。「関連抗体」とは、類似の配列を有し、共通のＢ細胞祖先を有する細胞によって産生される抗体をいう。このＢ細胞祖先は、再編成された軽鎖ＶＪＣドメインおよび再編成された重鎖ＶＤＪＣドメインを有するゲノムを含み、そしてさらに、親和性成熟を受けていない抗体を産生する。脾臓組織に存在するこの「未感作」または「一次」Ｂ細胞がＢ細胞の共通の祖先である。同一のエピトープとの関連抗体の結合は、典型的には、配列、特に、それらのＬ３およびＨ３ ＣＤＲが非常に類似している。関連抗体のすべてのＨ３およびＬ３ ＣＤＲが同じ長さおよびほぼ同一の配列を有する（０〜４個の異なるアミノ酸残基を伴う）。関連抗体は、共通の抗体祖先、すなわち、もともとのＢ細胞祖先によって産生された抗体を通して相関している。

【0025】

発明の要旨
本発明の目的は、ＶＥＧＦとのより高い親和性を有するモノクローナル抗体を提供することである。本発明に従うＶＥＧＦモノクローナル抗体は、配列番号１、配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖の可変ドメイン、ならびに／または配列番号４、配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖の可変ドメインを有する。

【0026】

本明細書における「抗体」は、必要とされる特異性を伴う結合ドメインを有する任意の特異的結合因子を包含するように解釈されるべきである。従って、この用語は、その同種抗体セグメント、誘導体、およびヒト化抗体、ならびに抗体の機能的等価物および相同物を包含し、天然または合成のいずれかである、抗原結合ドメインを有する任意のポリペプチドもまた含む。抗体の例は、免疫グロブリンサブタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）ならびにそのサブタイプおよびサブクラスであり；これは、さらにＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびＦｄなどの抗原結合ドメイン；およびダイアボディを含有するセグメントであってもよい。別のポリペプチドに融合し、抗原結合ドメインまたはその等価物を含有するキメラ分子もまた含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現はＥＰ．Ａ−０１２０６９４およびＥＰ．Ａ．０１２５０２３に記載されている。

【0027】

本発明に従うモノクローナル抗体は、例えば、一価または単鎖抗体、二本鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびに上記の抗体の誘導体、機能的等価物、および相同物であってもよく、そして抗体セグメント、および抗原結合ドメインを含有する任意のポリペプチドをさらに含有してもよい。

【0028】

抗体は、様々な方法を通して修飾されてもよく、ＤＮＡ組換え技術を使用してもともとの抗体特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生してもよい。この技術は、抗体の免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常ドメインまたは定常ドメインプラスフレームワーク領域に導入し得る。ＥＰ．Ａ．１８４１８７、ＧＢ ２１８８６３８ＡまたはＥＰ．Ａ．２３９４００を参照のこと。遺伝子変異または他の変化は、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞に対して実施されてもよく、これは、産生される抗体の結合特異性を変化させてもよいし、変化させなくてもよい。

【0029】

重鎖および軽鎖における高度な可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにリンカー配列以外では、本発明に従うモノクローナル抗体の残りの部分はフレームワーク領域である。このフレームワーク領域は、結合により必要とされる三次元構造が影響を受けないという条件で、他の配列によって置き換えられてもよい。抗体の特異性の分子的基礎は、主として、その高度な可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に由来し、これらは抗原と結合するための鍵となる位置である。好ましい結合特異性を維持するために、ＣＤＲ配列は可能な限り保持されるべきである。しかし、結合特異性を最適化するためにいくつかのアミノ酸を変化させることが必要であるかもしれない。当業者は標準的な実務を通してこの目的を達成し得る。

【0030】

ある好ましい実施形態において、モノクローナル抗体は、以下のような可変ドメインを含む：例えば、ＣＤＲ１（ＳＮＮＤＶＭＣＷ；配列番号１）、ＣＤＲ２（ＧＣＩＭＴＴＤＶＶＴＥＹＡＮＷＡＫＳ；配列番号２）およびＣＤＲ３（ＲＤＳＶＧＳＰＬＭＳＦＤＬＷ；配列番号３）を含む配列番号７を含む重鎖可変ドメイン；ならびに、例えば、ＣＤＲ１（ＱＡＳＱＳＩＹＮＮＮＥＬＳ；配列番号４）、ＣＤＲ２（ＲＡＳＴＬＡＳ；配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＧＹＫＳＹＳＮＤＧＮＧ；配列番号６）を含む配列番号８を含む軽鎖可変ドメイン。

【0031】

最大で６個のアミノ酸の置換に違いがあることを除けば、可変ドメインＣＤＲの改変体は上記のＣＤＲと実質的に同じであり（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸の置換）、このモノクローナル抗体のＣＤＲはＶＥＧＦ結合活性を有する。

【0032】

他の実施形態において、抗体は、ａ）アミノ酸配列が最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号７とは異なる、重鎖可変ドメイン；およびｂ）アミノ酸配列が最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号８とは異なる、軽鎖可変ドメインを含んでもよい。標的抗体は、これらの置換のいずれか１つまたはその組み合わせを含んでもよい。

【0033】

同様に、これらの置換位置のいずれか１つを有する抗体、およびすべての置換位置を有する抗体はＶＥＧＦ結合活性を有する。アミノ酸置換はフレームワーク領域に存在してもよく、ＣＤＲはフレームワーク領域またはＣＤＲに同時にまたは単独で出現する。従って、ある好ましい実施形態において、重鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列は、最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号７とは異なってもよく、そして軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸配列は、最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号８とは異なってもよい。

【0034】

ある抗体において、アミノ酸置換は、複数のＣＤＲに広がってもよい。従って、重鎖可変ドメインの複数のＣＤＲのアミノ酸配列が、最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号７とは異なってもよく、軽鎖可変ドメインの複数のＣＤＲのアミノ酸配列が、最大で６個のアミノ酸置換、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸置換を有するという点で配列番号８とは異なってもよい。

【0035】

特別に好ましい実施形態において、この抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号７と同じである重鎖可変ドメイン、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号８と同じである軽鎖可変ドメインを含んでもよい。

【0036】

特別に好ましい実施形態において、この抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号７と少なくとも９５％同一性を有する重鎖可変ドメイン、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号８と少なくとも９５％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでもよい。従って、標的抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号７と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖可変ドメイン、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号８と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでもよい。

【0037】

特別に好ましい実施形態において、この抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号９と同じである重鎖、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号１０と同じである軽鎖を含んでもよい。

【0038】

特別に好ましい実施形態において、この抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号９と少なくとも９５％同一性を有する重鎖、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも９５％同一性を有する軽鎖を含んでもよい。従って、標的抗体は、ａ）アミノ酸配列が配列番号９と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する重鎖、およびｂ）アミノ酸配列が配列番号１０と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する軽鎖を含んでもよい。上記に記載されたアミノ酸置換に加えて、標的抗体は、重鎖または軽鎖の両端においてさらなるアミノ酸を有してもよい。例えば、標的抗体は、重鎖および／または軽鎖のＣ末端またはＮ末端において、それぞれ、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または６個以上のさらなるアミノ酸を含んでもよい。ある実施形態において、標的抗体は、本明細書に記載される例示的なアミノ酸よりも短くてもよく、その主な違いは、重鎖および軽鎖の２つの末端が、それぞれ、例示的なアミノ酸よりも１個、２個、３個、４個、５個、または６個少ないアミノ酸を有することである。

【0039】

標的抗体はヒト化されてもよい。一般的に言えば、ヒト化抗体は、親の抗体のフレームワーク領域においてアミノ酸置換を実施することを通して修飾された抗体であり、そして親の抗体と比較して、ヒト化抗体は、より低い免疫原性を有する。抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＲＡ−２３９、４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）などを含む当該分野において周知である多くの技術を用いてヒト化されてもよい。ある好ましい実施形態において、フレームワーク置き換えは、ＣＤＲとフレームワーク残基の間との相互作用を模倣することを通して抗原結合におけるフレームワーク残基の重要性を明らかにし、そして配列アラインメントを通して通常ではないフレームワーク残基を同定する（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８；３３２，３２３を参照のこと）。抗体ヒト化方法の具体的な詳細のための２００４年１１月８日に出願されかつ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」という表題の米国特許出願第１０／９８４，４７３号を参照のこと。この出願は、その全体が参考として組み込まれる。一般的に言えば、このようなヒト化方法は、同一の抗原を結合することが可能である抗体配列を比較することを通しての適切な部位の同定、およびその部位上のアミノ酸を類似のアミノ酸の同じ部位における異なるアミノ酸で置換することを含む。これらの方法に従って、親の抗体のアミノ酸配列は、他の関連する抗体と比較され（例えば、配列アラインメント）、それによって、変動耐容性位置を同定する。典型的には、親の抗体の可変ドメインのアミノ酸配列は、ヒト抗体データベース中のアミノ酸配列と比較され、親の抗体と類似のアミノ酸配列を有するヒト化抗体が選択される。親の抗体の配列とヒト化抗体の配列が比較され（例えば、配列アラインメント）、親の抗体の１個以上の変動耐容性位置のアミノ酸が、ヒト化抗体中の対応する位置におけるアミノ酸によって置換される。

【0040】

変動耐容性位置の上記の置換方法は、任意の公知のヒト化方法と容易に合わせられることができ、ＣＤＲを含むヒト化抗体の産生において容易に応用されることができ、これらの抗体のＣＤＲは修飾されるが、親の抗体のＣＤＲに対して忠実である。従って、本発明は、親の抗体の修飾バージョンからの複数のＣＤＲを含むヒト化ＶＥＧＦ中和抗体をさらに提供する。

【0041】

先行技術に従う製品であるアバスチンと比較すると、本発明に従うヒト化ウサギ抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の方が、より低い解離定数Ｋｄを有し（本発明に従うモノクローナル抗体は０．４８５ｎＭのＫｄを有するのに対して、アバスチンのＫｄは４７．９ｎＭである）、本発明に従うモノクローナル抗体はＶＥＧＦとのより高い親和性を有し、本発明がＶＥＧＦに対してより強い阻害を有することを示す。マウスモデルを用いる実験は、本発明に従う抗体がアバスチンよりも著しく高い腫瘍阻害速度を有することを示した（実施例５を参照のこと）。従って、本発明はアバスチンよりも理論的に高い潜在的な臨床治癒効果を有する。

【0042】

１つの実施形態において、本発明に従うモノクローナル抗体は、配列番号９によって示されるその重鎖アミノ酸配列および配列番号１０によって示されるその軽鎖アミノ酸配列を有する、保存番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３３の細胞株によって産生される。そのＶＥＧＦとの解離定数は０．４８５ｎＭであり、これはアバスチンの解離定数の１／１００であり、このことは、アバスチンよりもＥＰＩ００３がＶＥＧＦとのより強い結合能力を有することを示す。

【0043】

本発明はさらに、ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒに保存されており、保存番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３３を有する細胞株を提供する。これはモノクローナル抗体を産生し、この抗体は、配列番号９として示される重鎖アミノ酸配列および配列番号１０として示される軽鎖アミノ酸配列を有する。本発明に従う実施形態において、これはＥＰＩ００３０抗体と名付けられる。細胞実験およびインビボ動物実験は、この抗体がＶＥＧＦによって誘導される内皮細胞の増殖および移動のインビトロ阻害が可能であり、そして動物の体内で腫瘍増殖を阻害できることを示してきた。この抗体はＶＥＧＦ関連疾患を治療するために使用できる。

【0044】

本発明はさらに、ＶＥＧＦ関連疾患を治療するために薬物を調製する際のこのモノクローナル抗体の適用を提供する。このＶＥＧＦ関連疾患には、腫瘍、ＡＭＤ、神経変性疾患、肥満、および糖尿病が含まれる。この標的抗体は、発生生物学、細胞生物学、代謝、構造生物学、および機能ゲノミクスを含む様々な分野における研究などのＶＥＧＦ関係研究、または腫瘍、ＡＭＤ、神経変性疾患、肥満、および糖尿病などに対する薬学的研究において使用されてもよい。

【0045】

本発明はさらに、有効量の上記のモノクローナル抗体および薬学的に許容されるキャリアを含むことを特徴とする薬学的組成物を提供する。

【0046】

本発明はさらに、上記のモノクローナル抗体を含む試薬、キット、またはチップを提供する。

【0047】

本発明はさらに、ＶＥＧＦ活性を阻害するためにこの標的抗体を使用し、ＶＥＧＦ関連疾患を治療するためにこの標的抗体を使用し、またはＶＥＧＦ関連診断およびアッセイを実施するためにこの抗体を含むキットを使用する方法を提供する。

【0048】

本発明に従う抗体分子が調製されるとき、これは、免疫グロブリン分子を精製するための当該分野において公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡを通しての特定の抗原のためのアフィニティークロマトグラフィー、および他のカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度の違い、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準的な技術を用いて精製できる。多くの実施形態において、抗体は細胞から培養培地に分泌され、そして抗体は培養培地を収集することおよび精製を通して得られる。

【0049】

抗体は様々な手法を通して修飾されてもよく、ＤＮＡ組換え技術を使用して、もともとの抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生してもよい。この技術は、抗体の免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常ドメインまたは定常ドメインプラスフレームワーク領域に導入してもよい。ＥＰ．Ａ．１８４１８７、ＧＢ ２１８８６３８Ａ、またはＥＰ．Ａ．２３９４００を参照のこと。遺伝子変異または他の変化もまた、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞に対して実施されてもよく、これは、産生された抗体の結合特異性に変化を与えてもよいし、変化を与えなくてもよい。

【0050】

本発明において使用されるモノクローナル抗体はまた、ハイブリドーマ法を用いて調製されてもよい。本発明に従うヒト化抗体をコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知の従来的な手段、例えば、本発明において公開されるアミノ酸配列の人工合成またはＰＣＲ増幅などを通して入手できるので、従って、この配列はまた、組換えＤＮＡ法を用いて、および当該分野で公知である種々の方法を用いて、適切な発現キャリアに連結できる。最終的に、本発明に従う抗体の発現のために適切な条件下で、当業者は、得られた宿主細胞を培養および形質転換し、次いで、周知の従来的な分離および精製手段を利用して、本発明に従うモノクローナル抗体を精製する。

【0051】

上記のように、本発明は、本発明に従う抗体を実行するための試薬、キット、またはチップをさらに提供する。これらの試薬、キット、またはチップは、以下の１つ以上を少なくとも含む：上記の方法に従って調製される抗体、この抗体をコードするリボヌクレオチド、またはこの抗体を含有する真核生物細胞、原核生物細胞、およびウイルス。この抗体はヒト化されてもよい。

【0052】

これらの試薬、キット、またはチップの他の任意の成分には、抗体活性アッセイの実験を実施するための制限エンドヌクレアーゼ、プライマーおよびプラスミド、緩衝溶液などが含まれる。これらの試薬、キット、またはチップの核酸は、非ウサギ抗体核酸とのこれらの接続のための制限エンドヌクレアーゼ部位、マルチプルクローンサイト、プライマーサイトなどをさらに含んでもよい。これらの試薬、キット、またはチップのすべての成分は、別々の容器に個別に保存されてもよく、またはいくつかの適合可能な成分が必要に応じて単一の容器にあらかじめ集められてもよい。

【0053】

薬学的に許容されるキャリアは、標的抗体を調製するときに加えられてもよい。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、天然または合成であってもよく、抗体と合わせた後で抗体の適用を促進できる、１種以上の有機または無機成分をいう。薬学的に許容されるキャリアは、滅菌生理食塩水溶液、または薬学的に利用可能でありかつ当該分野において公知である他の水系もしくは非水系等浸透圧性溶液および滅菌懸濁液を含む。「有効用量」とは、病理学的状態、変性状態、または損傷状態の進行を改善させることができるかまたは遅らせることができる用量をいう。

【0054】

有効用量の定義は個体ベースであり、具体的には、これは、徴候の治療、および個体に基づく結果を模索することを考慮する。有効用量は当該分野における一般的な技術を通して決定され、これを使用するためのこれらの因子は従来的な実験を超えるものではない。

【0055】

生物学的材料の保存の説明
保存番号ＣＧＭＣＣ ＮＯ．３２３３を有する細胞株は、２００９年８月２０日にＤａｔｕｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇの所在地で保存されており、その分類名はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】図１は、ＨＺＤ−Ｖ１、ＨＺＤ−Ｖ２、ＨＺＤ−Ｖ５、およびＨＺＤ−Ｖ６クローンを通して発現された組換え抗体によるＶＥＧＦおよびＫＤＲの結合の競合阻害を示す。

【図2】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通してのＨＺＤ−Ｖ６クローンによって発現されたＥＰＩ００３０抗体の純度を示す。レーン１は還元電気泳動である。レーン２は分子量標準を示す−上から下に連続して、１７０ｋＤ、１３０ｋＤ、１００ｋＤ、７０ｋＤ、５５ｋＤ、４０ｋＤ、３５ｋＤ、２５ｋＤ、１５ｋＤ、およびｌ０ｋＤである。レーン３は非還元電気泳動である。

【図3】図３は、ＨＺＤ−Ｖ６クローンによって発現されたＥＰＩ００３０抗体の純度のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析グラフを示す。

【図4】図４は、ＶＥＧＦ直接結合法を使用して決定されたヒトＶＥＧＦとの抗体の結合活性を示す。

【図5】図５は、ＥＰＩ００３０およびアバスチンによるＶＥＧＦおよびＫＤＲの結合の阻害のＩＣ_５０アッセイを示す；ＥＰＩ００３０のＩＣ_５０＝１６６．３ｎｇ／ｍｌ、アバスチンのＩＣ_５０＝２５３．７ｎｇ／ｍｌである。

【図6】図６は、ＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖に対する５ｍｇ／ｋｇ ＥＰＩ００３０およびアバスチンの影響を示す。

【図7】図７は、ＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の増殖に対する５ｍｇ／ｋｇ ＥＰＩ００３０およびアバスチンの影響を示す。

【図8】図８は、ＮＣＩ−Ｈ４６０腫瘍の増殖に対する１．５ｍｇ／ｋｇ ＥＰＩ００３０の影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0057】

特定の実施形態の説明
実施例１：ヒトＶＥＧＦ１６５ウサギモノクローナル抗体およびその遺伝子クローンを発現するハイブリッド腫瘍細胞の調製
ウサギモノクローナルクローン抗体はハイブリドーマ技術を用いて調製される。関連する実験計画についは、米国特許第７，４２９，４８７号、特に、実施例１〜４を参照のこと。

【0058】

最初に、組換え技術を通して、ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａ（ヒトＶＥＧＦ １６５）融合タンパク質を調製し、ここで、ＩｇＧ Ｆｃ配列はウサギ由来である。ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−ＡのＤＮＡ配列をｐＴＴ５プラスミドにクローニングし、このプラスミドをΗΕΚ ２９３−６Ε細胞株に一過性にトランスフェクトし、無血清培地中で細胞を培養し、上清を収集し、そして一過性に発現されたＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａ融合タンパク質を精製し、これはプロテインＡカラムで精製される。

【0059】

精製されたＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａを（抗原成分として）使用して、ニュージーランドウサギに対する初回免疫のための多点皮下注射において、完全フロイントアジュバントと混合し、次いで、３週間あたり１回のウサギへの免疫の増強のための皮下注射において、精製タンパク質を不完全フロイントアジュバントと混合し、そして脾臓収集の４日前に最終免疫のためにウサギへの静脈内注射において抗原プラスＰＢＳを使用する。

【0060】

米国特許第７４２９４８７号によって開示される方法に従って、ウサギ脾臓細胞を、免疫脾臓細胞と同種である不死化ＨＲＧＴＰ−Ｂリンパ球、２４０Ｅ−Ｗ２細胞と２：１の比率で融合させ、９６ウェルプレート中のＨＡＴ培地中で培養し、次いで、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、そして得られた細胞クローンを入れ、スクリーニングのために新たなＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａと結合させる。

【0061】

同定およびスクリーニングプロセスは２段階のポジティブクローンスクリーニングプロセスを含む：（１）９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上でＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａ抗原を固定化し、クローニングおよび発現上清を加えそして１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、酵素標識抗体を使用して、ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａ結合活性を有する細胞クローン上清を同定し、そしてそれによって、ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａと直接的に結合可能であるポジティブクローンを得る。（２）続いて、工程（１）におけるポジティブクローンを培養のための２４ウェルプレートに移し、より多くの発現産物を得る。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にＩｇＧ Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）細胞外領域を固定化し、ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａならびにクローニングおよび発現産物を加え、１時間一緒にインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、酵素標識抗体を使用してＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ−Ａ含量を決定し、その結果、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２結合活性に対するクローンの阻害を同定し、それによって、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ２結合を遮断することが可能であるポジティブクローンを同定する。

【0062】

スクリーニングされたポジティブクローンのハイブリドーマ細胞は溶解を受け、ｍＲＮＡを抽出し、そして逆転写を通してｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲ法を使用して、ウサギＩｇＧ抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列をそれぞれ増幅し、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをアッセイし、コードされた重鎖可変ドメインは、配列番号１の親の配列（Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｒｐ）、配列番号２の親の配列（Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｓｅｒ）、および配列番号３の親の配列（Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｒｐ）を含み、そして軽鎖可変ドメインは、配列番号４の親の配列（Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ）、配列番号５の親の配列（Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ）、および配列番号６の親の配列（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ）を含む。軽鎖ヌクレオチド配列はｐＴＴ５プラスミドにクローニングされている。重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、重鎖定常ドメインを有するｐＴＴ５プラスミドにクローニングされる。ΗΕΚ ２９３−６Ε細胞株に軽鎖、重鎖のプラスミドを同時トランスフェクトし、５日間培養し、プロテインＡで上清を精製し、そして組換えウサギ抗ヒトＶＥＧＦ １６５モノクローナル抗体を最終的に得る。上記のポジティブクローンスクリーニング法を使用して、発現された組換え抗体の親和性を確認する。

【0063】

実施例２：本発明に従うヒト化ウサギ抗ＶＥＧＦ１６５ モノクローナル抗体の調製
ヒト化技術については、米国特許第７，４６２，６９７号、特に、その好ましい実施形態の詳細な説明を参照のこと。

【0064】

米国特許第７，４６２，６９７号によって開示される技術に従って、参照配列として、ヒト配列ＶＫＩ−２−ｌ−（Ｕ）−Ａ２０＿ＪＫ４およびＶＨ３−１−３−３−２１＿ＪＨ４を使用する。４バージョンのＶＫおよびＶＨが、各々発現されたウサギ抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体配列について、それがヒト化された後で得られる。軽鎖可変ドメインは、ＶＫ−ＨＺＤ１（例えば、配列番号１２）、ＶＫ−ＨＺＤ２（例えば、配列番号１４）、ＶＫ−ＨＺＤ５（例えば、配列番号１６）、およびＶＫ−ＨＺＤ６（例えば、配列番号８）を含み；重鎖可変ドメインは、ＶＨ−ＨＺＤ１（例えば、配列番号１１）、ＶＨ−ＨＺＤ２（例えば、配列番号１３）、ＶＨ−ＨＺＤ５（例えば、配列番号１５）、およびＶＨ−ＨＺＤ６（例えば、配列番号７）を含む。ＶＫ−ＨＺＤ１と比較して、ＶＫ−ＨＺＤ２はＣＤＲ１に２個の異なる残基を有する。ＶＫ−ＨＺＤ１およびＶＫ−ＨＺＤ２は、それらのＮ末端に２個の余分のアミノ酸残基を加えることによって、それぞれ、ＶＫ−ＨＺＤ５およびＶＫ−ＨＺＤ６になる。ＶＨ−ＨＺＤ１およびＶＨ−ＨＺＤ２は７１位に異なる残基を有し、ＶＨ−ＨＺＤ１の７１位はＫであるのに対して、ＶＨ−ＨＺＤ２の７１位はＲである。ＶＫ（Ｈ）−ＨＺＤ１およびＶＫ（Ｈ）−ＨＺＤ２の配列はウサギシグナルペプチドを含むの対して、ＶＫ（Ｈ）−ＨＺＤ５およびＶＫ（Ｈ）−ＨＺＤ６の配列はヒトシグナルペプチドを含む。

【0065】

人工合成後、ヒトＣＫ配列およびヒトＣＨ配列を有するｐＴＴ５プラスミドに４バージョンのＶＫおよびＶＨのＤＮＡ配列をそれぞれクローニングし、ヒトシグナルペプチドを通して抗体を発現する。上記の２種のプラスミドをΗΕΚ ２９３−６Ε細胞に同時トランスフェクトし、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体を一過性に発現する。実施例１におけるスクリーニング方法に従って、最終的に使用されるクローンとして適切な親和性を有するＨＺＤ−Ｖ６クローンを選択し、それによって、発現されたヒト化抗ＶＥＧＦ抗体はＥＰＩ００３０と称され、そしてそのアミノ酸配列は、配列番号９によって示される重鎖および配列番号１０によって示される軽鎖である。

【0066】

収率を増加させ、工業的製造のための細胞株を得るために、配列番号９によって示される重鎖と配列番号１０によって示される軽鎖のアミノ酸配列を有する発現プラスミドを、２００９年８月２０日に、Ｄａｔｕｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎの所在地で、ＣＧＭＣＣにおいて、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．３２３３の保存番号で保存された、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に同時トランスフェクトする。

【0067】

実施例３：本発明に従うモノクローナル抗体ΕΡΙ００３０のＶＥＧＦとの結合の検討
ＶＥＧＦ抗体はＶＥＧＦと結合して、受容体ＫＤＲとのその結合を遮断し、ＶＥＧＦシグナルチャネルを阻害する。様々な組換え抗体（ＨＺＤ−Ｖ１、ＨＺＤ−Ｖ２、ＨＺＤ−Ｖ５、ＨＺＤ−Ｖ６）およびアバスチン（９０μｇ／ｍｌ−４５ｎｇ／ｍｌ）の１：３での段階希釈後、ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）と混合し、混合した抗体−ＶＥＧＦ複合体をＩｇＧ Ｆｃ−ＶＥＧＦＲ２を広げたプレートのウェルに加え、そしてマウス抗ヒトＶＥＧＦ抗体を加えた後、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体−ＡＰを用いる発色を通して検出する。結果は、発現された組換え抗体が、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合の競合阻害においてアバスチンと同様の活性を有することを示す。測定結果は、ＨＺＤ−Ｖ１、ＨＺＤ−Ｖ２、ＨＺＤ−Ｖ５、およびＨＺＤ−Ｖ６クローンによって発現されるすべての抗体がＶＥＧＦのＫＤＲとの結合を遮断できることを示す（図１を参照のこと）。

【0068】

上記の実験アプローチを参照して、ＥＰＩ００３０およびアバスチンのＩＣ_５０値、すなわち、メジアン阻害濃度を決定する。結果は図５に示され、これは、ＥＰＩ００３０およびアバスチンが同様の競合阻害活性を有することを示す。

【0069】

ＢＩＡｃｏｒｅ−３０００を使用して、ＥＰＩ００３０のＶＥＧＦとのＫｄを決定する。ＣＭ５チップ上にヒトＶＥＧＦを固定化し、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝溶液への２回の段階希釈後のＥＰＩ００３０およびアバスチンを、３０μｌ／分の流速で注入する。Ｋｄはｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎである。ＥＰＩ００３０およびアバスチンのヒトＶＥＧＦとの解離定数は表１に示され、ＥＰＩ００３０のＶＥＧＦとの解離定数は０．４８５ｎＭであり、これはアバスチンの１／１００であり、このことは、ＥＰＩ００３０のＶＥＧＦとの結合能力がアバスチンのそれよりも強力であることを示す。

【0070】

【表1】

【0071】

実施例４：本発明に従うモノクローナル抗体ΕΡΙ００３０の特徴付けおよびそのインビトロ活性の決定
ＨＥＫ ２９３−６Ｅ細胞のＨＺＤ−Ｖ６クローンによって一過性に発現されたＥＰＩ００３０抗体を精製した後に、特定の分析項目を用いて関連する定性分析を以下のように実施する：
Ａ：純度
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元および非還元）およびＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、図２および図３に示される結果を用いて純度を分析し、ＥＰＩ００３０抗体の純度は９８％より高く、重合体含量は５％より低く、主ピーク（保持時間１０．５７２分）面積は全体の面積の９５％より大きく（左から右にピーク１、２、および３を示す）、そしてピーク１および２は重合体であることを示す。

【0072】

Ｂ：インビトロ結合活性
ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦを使用してプレートに広げ、１％ ＢＳＡを使用してシールし、８段階の１：３段階希釈を通してＥＰＩ００３０抗体およびアバスチンを希釈し（１μｇ／ｍｌ〜０．４６ｎｇ／ｍｌ）、これをＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦを広げたウェルに加え、−ＡＰ検出のためにロバ抗ヒトＩｇＧ抗体を加える。結果はＥＰＩ００３０抗体およびアバスチンが同様の結合活性を有することを示す。

【0073】

ＩｇＧ Ｆｃ−ｈＶＥＧＦ直接結合法（実施例１を参照のこと）およびＫＤＲ競合結合法（実施例３）を含むＥＬＩＳＡ法を使用する。結果は、ＥＰＩ００３０抗体のＶＥＧＦとの結合が、用量によって、ＶＥＧＦのＫＤＲとの結合の阻害と相関することを示し、これらは図４および５に示される。

【0074】

実施例５：本発明に従うモノクローナル抗体ΕΡΙ００３０のインビボ活性の検出
実験の２週間前に、液体窒素タンクから、凍結したヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６細胞およびヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の１つの系統（約１×１０^７細胞）を取り、これらを素早く３７℃ウォーターバスに配置して融解させる。次いで、あらかじめ３７℃に加熱したＭｃＣｏｙの５Ａ培地およびＤＭＥＭ培地を有する７５ＣＭ^２細胞培地に細胞を接種し、それぞれ、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯより購入）を加え、細胞が８０％融合比率まで増殖したときに１：５で継代培養し、そして連続して３回継代培養する。全細胞量が接種によって必要とされる数に達したとき、膵臓酵素で細胞を消化しおよび遠心分離し、ＰＢＳを使用して細胞を洗浄して血清を除去し、そして最後に、無血清で抗生物質を含まないＭｃＣｏｙの５Ａ培地およびＤＭＥＭ培地を使用して、処理されたヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６細胞およびヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の細胞密度を５×１０^７／ｍｌにそれぞれ調整し、細胞懸濁液を氷上に配置し、６−９週齢のヌードマウスの腹部に接種し、各マウスに０．１ｍｌ、すなわち、５×１０^６細胞／マウスで接種する。副尺付きカリパスを使用して、２日ごとにヌードマウスの腫瘍直径を測定し、すべてのマウスの腫瘍が１００ｍｍ^３−３００ｍｍ^３に成長したときに、腫瘍体積ＳＤ＜１／３のものを選択し、それらを、群あたり６匹の５つの群にランダムに分ける。ヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６モデル群は、モデル対照群、（１群）、５ｍｇ／ｋｇ アバスチン（１群）、および５ｍｇ／ｋｇ ＥＰＩ−００３０（１群）であり、そして生理食塩水を使用してアバスチンおよびＥＰＩ−００３０を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈する。ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０モデル群は、モデル対照群（１群）、５ｍｇ／ｋｇ アバスチン（１群）、および１．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ ＥＰＩ−００３０（２群）であり、そして生理食塩水を使用してアバスチンおよびＥＰＩ−００３０を０．５ｍｇ／ｍｌおよび０．１５ｍｇ／ｍｌに希釈する。薬物投与群については、０．２ｍｌ アバスチンおよびＥＰＩ−００３０は、それぞれ、各週の１日、３日、および５日に１回、腹腔内注射を通して投与され、０．２ｍｌ生理食塩水は同時にかつ同じやり方を介してモデル対照群に投与され、投与は３週間継続された（２１日間、全体で９回）。

【0075】

ヌードマウスの腫瘍小結節の最大直径ａおよび最小直径ｂを測定し、式Ｖ＝０．５×ａ×ｂ^２に従って腫瘍体積を計算し、そして相対的な腫瘍増殖速度、Ｔ／Ｃ％を治癒効率を評価するための指標として使用する。

【0076】

結果は、ヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６モデルにおいて、５ｍｇ／ｋｇ群におけるＥＰＩ−００３０およびアバスチンの腫瘍阻害速度がそれぞれ６５．７％および１５．７％であることを示す（図６を参照のこと）。ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０モデルにおいて、ＥＰＩ−００３０およびアバスチンの腫瘍阻害速度は、それぞれ、９５．５％および６６．７％であり（図７を参照のこと）；１．５ｍｇ／ｋｇ群においては、ＥＰＩ−００３０の腫瘍阻害速度は５７．６％である（図８を参照のこと）。結果はＥＰＩ−００３０が腫瘍増殖を阻害する顕著な能力を有することを示す。

【0077】

アバスチンの臨床適応を参照することによって、ＥＰＩ−００３０によるヒト結腸癌およびヒト非小細胞肺癌の阻害を確証するために、ＥＰＩ−００３０がヒト結腸癌およびヒト非小細胞肺癌の異種移植片腫瘍の顕著な阻害を有するという条件で、ヌードマウスにおけるヒト結腸癌ＨＣＴ−１１６およびヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０の異種移植片腫瘍モデルを選択する。これらのモデルにおいて、ＥＰＩ−００３０はアバスチンよりも強力な腫瘍阻害活性を有する。

【0078】

上記の説明は本発明の好ましい実施形態を開示したに過ぎない。多くの改良および修飾が本発明の原理から逸脱することなくなされ得ることが当業者に注目されるべきである。これらのすべての改良および修飾は、本発明の保護範囲によって包含されるべきである。

【図1】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]