特許 5738348 神経細胞性脳腫瘍に対する新規免疫療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5738348

(24)【登録日】2015年5月1日

(45)【発行日】2015年6月24日

(54)【発明の名称】神経細胞性脳腫瘍に対する新規免疫療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150604BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20150604BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150604BHJP

   C07K 7/02 20060101ALI20150604BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20150604BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20150604BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150604BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20150604BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K37/02

   A61K48/00

   A61K39/00 H

   A61P35/00

   C07K7/02

   C07K7/06

   C12P21/02 C

   C12N5/00 102

   C12N5/00 202L

【請求項の数】13

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2013-112532(P2013-112532)

(22)【出願日】2013年5月29日

(62)【分割の表示】特願2010-517326(P2010-517326)の分割

【原出願日】2008年7月25日

(65)【公開番号】特開2013-226145(P2013-226145A)

(43)【公開日】2013年11月7日

【審査請求日】2013年5月29日

(31)【優先権主張番号】07014797.0

(32)【優先日】2007年7月27日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】60/953,161

(32)【優先日】2007年7月31日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】08005889.4

(32)【優先日】2008年3月27日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100088904

【弁理士】

【氏名又は名称】庄司 隆

(72)【発明者】

【氏名】スホール，オリバー

(72)【発明者】

【氏名】ヒルフ，ノルベルト

(72)【発明者】

【氏名】ヴァインシェンク，トーニ

(72)【発明者】

【氏名】トラウトヴァイン，クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】ウォルター，シュテッフェン

(72)【発明者】

【氏名】シン，ハープリート

【審査官】 西村 亜希子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２６０１３２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００５／１１６０５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１４６３７０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Cancer Res.，１９９７年，Vol.57，pp.4570-4577

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ ７／０２

Ｃ０７Ｋ ７／０６

Ｃ１２Ｎ ５／０７８３

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５に示されるアミノ酸配列（KVFAGIPTV）からなるペプチド。

【請求項2】

ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合する能力を維持しており、さらにＣＤ８Ｔ細胞を刺激する能力を有する、請求項１記載のペプチド。

【請求項3】

請求項２に記載のペプチドのペプチド結合が、非ペプチド結合に置換されている、ペプチド模倣物。

【請求項4】

ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連変異体鎖（Ii）のＮ-末端アミノ酸および請求項１または２に記載のペプチドからなる融合ペプチド。

【請求項5】

請求項１、２または４のいずれか１に記載のペプチドをコードする核酸。

【請求項6】

請求項５に記載の核酸を発現する能力のある発現ベクター。

【請求項7】

宿主細胞が樹状細胞または抗原提示細胞である、請求項５に記載の核酸または請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項8】

請求項１、２または４のいずれか１に記載のペプチドを作製する方法であって、請求項５に記載の核酸または請求項６記載の発現ベクターを発現する請求項７記載の宿主細胞を培養すること、及び該宿主細胞またはその培地から該ペプチドを単離することからなる方法。

【請求項9】

in vitroで活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を作製する方法であって、in vitroでＣＴＬを、抗原特異的方法で前記ＣＴＬを活性化するのに十分な期間、適当な抗原提示細胞表面上で発現された抗原負荷ヒトクラスＩのＭＨＣ分子と接触させるか、または抗原提示細胞を模倣する人工抗原提示細胞と接触させることを含む、前記抗原が請求項１〜４のいずれか１に記載のペプチドまたはペプチド模倣物である方法。

【請求項10】

請求項９記載の方法により作製されるものであって、請求項１または２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する、活性化細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）。

【請求項11】

請求項１〜４のいずれか１に記載のペプチドもしくはペプチド模倣物、請求項５に記載の核酸、請求項６に記載の発現ベクター、請求項７に記載の細胞、または請求項１０記載の活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、抗ガン剤の製造における使用。

【請求項12】

抗ガン剤がワクチンである、請求項１１記載の使用。

【請求項13】

がんは、星細胞腫、 毛様細胞性星細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、多形神経膠芽腫、混合膠腫、神経膠腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、胚細胞種、奇形腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、中枢神経節細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍（PNETすなわち、髄芽腫、 髄上皮腫、神経芽種、 網膜芽細胞腫、 上衣芽腫を含む）、松果体組織にでききた腫瘍（松果体細胞腫や松果体芽腫を含む）、上衣細胞腫、脈絡叢腫瘍、原発不明の神経皮腫瘍（大脳神経膠腫症、星状芽細胞腫を含む）または神経膠芽腫、肺癌または腺扁平上皮癌から選択されるものである、請求項１１または１２記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法で用いられるペプチド、核酸及び細胞に関する。 特に、本発明は、癌の免疫療法に関する。 本発明はさらに、腫瘍関連障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のペプチドエピトープ単独について、あるいは抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く他の腫瘍関連ペプチドとこれらエピトープとの組み合わせに関する。 本発明は、抗腫瘍免疫応答を誘発するワクチン組成物で使用され得る、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子から誘導される１１個の新規ペプチド配列と変異体に関する。

【背景技術】

【0002】

神経膠腫は神経系の膠細胞由来の脳腫瘍である。 膠細胞は、一般に神経膠細胞、または単に膠細胞と呼ばれる非神経細胞であり、神経系において、神経細胞の維持と栄養補給、ホメオスタシスの維持、髄鞘（ミエリン）の構成、神経伝達に関与している。 神経膠腫の最も重要な２つのサブグループは、星状膠細胞腫と稀突起膠細胞腫であり、それらが由来する正常な膠細胞種である星状細胞、または稀突起膠細胞よりそれぞれ名前がつけられた。 星状膠細胞腫のサブグループに属する多形性神経膠芽細胞腫（以下、神経膠芽細胞腫という）は、成人に最も多い悪性脳腫瘍であり、全悪性脳腫瘍の約４０％、また、神経膠腫の約５０％を占めている（ＣＢＴＲＵＳ、２００６）。 神経膠芽細胞腫は中枢神経系への浸潤が非常に強く、全神経膠腫中で最も高い悪性度（ＧｒａｄｅＩＶ）に入っている。 神経膠腫の治療方法は、神経画像処理や顕微手術の改良、また、テモゾロミドや放射線など多岐にわたる治療が選択できるようになったことで着実に進歩してきているが、神経膠芽細胞腫は未だに不治の病である (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000)。 神経膠芽細胞腫の致死率は非常に高く、平均生存期間は、初回の診断から９ヶ月から１２ヶ月である。 １９８６年から１９９０年の５年生存率は８．０％であった。 今日まで、腫瘍全摘出などの積極的治療法施行後の５年生存率は未だに１０％未満である (Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000)。 そのため、これに代わりうる効果的な治療方法に対し医療ニーズが高まっている。

【0003】

神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞は、脳腫瘍の中で最も未分化であり、そのため遊走能及び増殖能が高く、また、浸潤性が高く、予後が極めて悪くなる。 神経膠芽細胞腫は、脳内で急速に、侵攻的に、さらに浸潤的に発育するため、死につながっている。 神経膠芽細胞腫は浸潤性発育型のため、本来摘出不能である。 また、神経膠芽細胞腫は、比較的、放射線や化学療法に耐性を持つため術後の再発率が高い。 更に、摘出し放射線照射後、全腫瘍細胞を完全に根絶できるほど、これらの腫瘍細胞に対する免疫応答性にはあまり効果がない（Ｒｏｔｈ 及び Ｗｅｌｌｅｒ，１９９９，ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓａｂｌｏｔｚｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）

【0004】

神経膠芽細胞腫は、分化星状膠細胞またはグリア前駆細胞の悪性転換過程での遺伝子メカニズムの違いによって、未原発性神経膠芽細胞腫（新生）と二次性神経膠芽細胞腫に分けられる。 二次性神経膠芽細胞腫は、４５歳までの若年層に発症する。 二次性神経膠芽細胞腫は、平均して４年から５年の間に軽度の星状細胞腫から未分化星状細胞腫に進展する。 それに対し、原発性神経膠芽細胞腫は老年層に圧倒的に多く発症し、平均年齢は５５歳である。 一般的に、原発性神経膠芽細胞腫は劇症として発症し、臨床的、または病理的に異常のない状態から３ヶ月以内に腫瘍が進行するのが特徴である（Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000))。.

神経膠芽細胞腫はミリエン化された神経に沿って移動し、中枢神経系内に広範囲に広がる。 殆どの場合、外科的治療を行っても維持療法的な限られた効果を示すだけである(Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997) (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000)。

【0005】

悪性神経膠腫細胞は、Ｔ細胞の増殖と免疫を刺激するサイトカインＩＬ−２の分泌の両方を減弱させる免疫抑制物質を生成することにより、宿主の免疫システムからの探知を逃れる (Dix et al., 1999)。

【0006】

頭蓋内の腫瘍は、脳、髄膜、脳下垂体、頭蓋骨、さらに胚組織の残りなど、中枢神経系に提示されるあらゆる構造や細胞型からも発生しうる。 アメリカ合衆国における年間の原発性脳腫瘍の総罹患件数は人口１０万人に対して１４人である。 最も好発する原発性脳腫瘍は髄膜腫及び神経膠芽細胞腫であり、髄膜腫は全原発性脳腫瘍の２７％、神経膠芽細胞腫は２３％を占める（ただし、成人の悪性脳腫瘍では、神経膠芽細胞腫が４０％を占める）。 これらの腫瘍の多くは進行性で、Grade が高い。 原発性脳腫瘍は小児に最も好発する固形腫瘍で、小児癌では白血病に次いで２番目に多い死因となっている。

【0007】

神経膠芽細胞腫の患者に対する効果的な治療方法の探究は今日もなお続けられている。 これらの腫瘍細胞と戦うため、免疫療法すなわち免疫系の補充による治療法が研究されてきている。 最初の有望な研究成果は、ヒトの免疫学的療法の研究において得られた。その研究では、抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発することができ、毒性が最小限な標準療法を適用した場合と比べ、生存期間中央値が延長された (Heimberger et al., 2006)。

【0008】

それゆえ、近い将来、免疫療法の適用により解決される課題として、効果的で安全な脳腫瘍の新治療方法の選択肢を確立すること、また、重篤な副作用を引き起こす可能性のある化学療法剤や他の薬剤を使わずに患者の健康状態を促進することなどが挙げられた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Allison AC 1998; The mode of action of immunological adjuvants; Dev Biol Stand.; 92:3-11

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【非特許文献15】Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Muller M, Kramer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanovic S (2006). Unexpected Abundance of HLA Class II Presented Peptides in Primary Renal Cell Carcinomas. Clin Cancer Res. 12, 4163-4170.

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【非特許文献17】Dudley ME, Wunderlich JR, Robbins PF, Yang JC, Hwu P, Schwartzentruber DJ, Topalian SL, Sherry R, Restifo NP, Hubicki AM, Robinson MR, Raffeld M, Duray P, Seipp CA, Rogers-Freezer L, Morton KE, Mavroukakis SA, White DE, Rosenberg SA (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854.

【非特許文献18】Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC, Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, Royal RE, Kammula U, White DE, Mavroukakis SA, Rogers LJ, Gracia GJ, Jones SA, Mangiameli DP, Pelletier MM, Gea-Banacloche J, Robinson MR, Berman DM, Filie AC, Abati A, Rosenberg SA (2005). Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 23, 2346-2357.

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【発明の概要】

【0010】

本発明の原理の簡単な説明
本発明で使用される全ての用語は、特に記載されない限り、以下に定義されたとおりである。

【0011】

「ペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表すために使用される。 ペプチドは、通常９個のアミノ酸残基であるが、最短で８個、最長で１４個のアミノ酸残基である。

【0012】

「オリゴペプチド」という用語は、本明細書では、隣接したアミノ酸のαアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表すために使用される。 正しいエピトープの１つあるいは複数がそこに維持される限り、オリゴペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。 オリゴペプチドの長さは通常、アミノ酸残基約３０個未満で、アミノ酸は約１４個を超える

【0013】

「ポリペプチド」という用語は、隣接したアミノ酸のα位のアミノ基及びカルボニル基間のペプチド結合によって、通常お互いの間を接続する一連のアミノ酸残基を表す。 正しいエピトープの１つあるいは複数がそこに維持される限り、ポリペプチドの長さは本発明に決定的なものではない。 ペプチドやオリゴペプチドという用語に比べ、ポリペプチドという用語は、アミノ酸残基が約30個を超えるタンパク質分子を示す。

【0014】

そのような分子をコードするペプチド、オリゴペプチド、タンパク質は、免疫応答を誘発できる場合、「免疫原性」(したがって本発明内の「免疫原」)である。 本発明の場合には、免疫原性はＣＴＬが介在する応答を誘発する能力としてより明確に定義される。 したがって、「免疫原」は、免疫応答の誘発が可能な分子で、本発明の場合は、ＣＴＬ応答を誘発できる分子と考えられる。

【0015】

Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩまたはクラスIIのＭＨＣ分子と結合し、続いてＴ細胞によって認識される短いペプチド分子である。 クラスＩ ＭＨＣ分子と結合するＴ細胞エピトープの長さは通常、８個から１４個のアミノ酸で、最も典型的な長さは９個のアミノ酸である。 クラスＩＩＭＨＣ分子と結合するＴ細胞エピトープの長さは通常、１２個から３０個のアミノ酸である。 クラスＩＩＭＨＣ分子と結合するエピトープの場合、同じＴ細胞エピトープは共通のコア断片を共有するが、カルボキシル末端及びアミノ末端の隣接配列の長さが異なることがある。これはペプチド分子の両末端は、クラスＩＭＨＣ分子のペプチド結合溝に埋もれており、クラスＩＩＭＨＣ分子のペプチド結合溝には埋もれないためである。

【0016】

ＭＨＣクラスＩ分子をコードする３つの異なる遺伝子座として、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃがある。 ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２及びＨＬＡ−Ａ１１は、これらの遺伝子座から発現されうる別なクラスＩＭＨＣ分子の例である。

【0017】

本発明で、ＤＮＡ配列には 一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの両方が含まれる。 そのため、特に記載のない限り、特異的配列とは、かかる配列の一本鎖ＤＮＡ、かかる配列の相補鎖との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、及びかかる配列の相補鎖を示す。 「コード領域」という用語は、天然ゲノム環境すなわち、体内における遺伝子の天然発現産物のコード領域において、天然にまたは通常に該遺伝子の発現産物をコードする、遺伝子のその部分を示す。

【0018】

コード領域は、正常で、変異した、または改変された遺伝子であり、また、ＤＮＡ合成の当業者に周知の方法で研究室において完全に合成されたＤＮＡ配列や遺伝子である。

【0019】

「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボ核酸のヘテロ多量体を示す。
特定のペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は天然に発生することも、合成されることもある。 一般的に、本発明のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡフラグメント及び短いオリゴヌクレオチドリンカー、または一連のオリゴヌクレオチドから作成され、微生物またはウイルスオペロン由来の調節エレメントからなる遺伝子組換え転写単位内で発現されうる合成遺伝子を与える。

【0020】

「発現産物」という用語は、遺伝子コード縮重の結果、同等物をコードし、次いで同一アミノ酸をコードする、遺伝子及びあらゆるヌクレオチド配列から天然に翻訳された産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【0021】

「フラグメント」という用語は、コード配列に関する場合は、完全なコード領域より短い核酸の一部を意味し、その発現産物は、完全なコード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保持する。

【0022】

「ＤＮＡセグメント」という用語は、分離フラグメントあるいはより大きいＤＮＡ構築物の一組成の形であるＤＮＡポリマーを示し、このポリマーは十分に純粋な、すなわち、内因性物質の混在がない形で、しかも、標準的な生物学的方法たとえばクローニングベクターによりセグメントやその構成ヌクレオチド配列の同定、操作、回収ができる量と濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡから誘導されている。 そのようなセグメントは、真核生物の遺伝子中で通常提示される内在性非翻訳配列、すなわちイントロンによって中断されないオープンリーンディングフレームの形で供給される。 非翻訳ＤＮＡ配列は、オープンリーンディングフレームの下流に存在することがあるが、コード領域の調節や発現を邪魔することはない。

【0023】

「プライマー」という用語は一本鎖ＤＮＡと対になることができ、ＤＮＡポリメラーゼがデオキシリボ核酸鎖の合成を開始する、遊離３'ＯＨ末端を供給する短い核酸配列を意味する。
「プロモーター」という用語は、転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるＤＮＡの一領域を意味する。
「単離される」という用語は、物質がその本来の環境（例えば、それが自然に起こるのであれば、自然環境）から取り除かれることを意味する。 例えば、生存する動物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されているとは言えないが、自然界の一部または全ての共存物質から分けられた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていると言える。 そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部である可能性があり、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部となる可能性があり、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないため、単離されていると言える。

【0024】

本発明によって開示されているポリヌクレオチド及び、遺伝子組換え体または免疫原性ポリペプチドも、「精製されている」状態である。 「精製される」という用語は、完全に精製されることは必要なく、むしろ、相対的な定義を意味し、高純度に精製された調製物または、部分的にのみ精製された調製物も含むが、これらの用語は関連する当業者には理解されている。 例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一になるように従来法で精製される。 出発物質または天然物質の精製では、最低でも有効数字１桁、好ましくは２桁または３桁、より好ましくは４桁または５桁が明確に意図される。 さらに、請求項におけるポリペプチドの精製では、重量で、好ましくは９９．９９９％、少なくとも９９．９９％または９９．９％、さらに望ましくとも９９％以上が明確に意図される。

【0025】

本発明によって開示される核酸及びポリペプチド発現産物、及びそのような核酸及び／またはポリペプチドを含む発現ベクターは「濃縮型」である。 本明細書で使われている「濃縮型」と言う用語は、物質の濃度が例えば、それ自身の自然に存在する濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であり、また、重量で０．０１％であれば有利であり、好ましくは少なくとも約０．１％であることを意味する。 また、濃縮調製物で期待されるのは、重量で約０．５％、１％、５％、１０％、及び２０％である。 本発明における配列、構造物、ベクター、クローン及び他の物質は、濃縮型または単離型であることが有利である。

【0026】

「活性フラグメント」という用語は、適切なアジュバントと供に、または単独で、動物例えばウサギまたはマウス、及びヒトも含む哺乳動物に投与した際、免疫応答を起こす（すなわち免疫原性活性を有する）フラグメントを意味し、このような免疫応答は、ヒトなどの受容動物内でＣＴＬ応答を刺激する。 また、この"活性フラグメント"は in vitroでＣＴＬ応答の誘導に使用されることもある。

【0027】

本明細書では、「一部分」、「セグメント」、「フラグメント」という用語は、ポリペプチドに関して使用される時、アミノ酸残基のような残基の連続的な配列を指し、その配列はより大きな配列のサブセットを形成する。 例えば、ポリペプチドがトリプシンまたはキモトリプシンのような一般的なエンドペプチダーゼの処理を受けた場合、そのような処理により得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの一部分、セグメントあるいはフラグメントに相当すると思われる。 このことは、そのようなフラグメントのいずれも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の配列に全く同一でなくとも、実質的に同一なセグメント、フラグメントまたは一部分を、そのアミノ酸配列の一部として、必要に含んでいることを意味している。 この配列は、自然発生または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の"親"タンパク質に相当する。 ポリヌクレオチドに関連して使用する時、そのような用語は任意の共通のエンドヌクレアーゼをもつ前記ポリヌクレオチドの処理によって生成された生成物を指す。

【0028】

本発明に従って、配列に言及する場合、「同一性パーセント」もしくは「同一パーセント」という用語は、比較されることになる配列（「比較配列」）を記載されたもしくは請求項の配列（「参照配列」）とアラインメントした後に、ある配列が、記載されたもしくは請求項の配列と比較されることを意味する。続いて、同一性パーセントは次式により決定される:

本発明に従って、配列に言及する場合、「同一性パーセント」または「同一パーセント」という用語は、比較する配列（「比較配列」）を記載済みまたは請求項の配列（「参照配列」）とアラインメントした後に、ある配列を、記載済みまたは請求項の配列と比較することを意味する。 続いて、同一性パーセントは次式により決定される:
同一性パーセント= 100 [I -(C/R)]
Cは、参照配列と比較配列間のアラインメントの長さ上の参照配列と比較配列間とで異なる残基数を示す。ここで、
(i) 比較配列上で相当する整列した塩基やアミノ酸を持たない参照配列の各塩基またはアミノ酸、及び
(ii) 参照配列の各ギャップ、及び
(iii)比較配列の整列した塩基あるいはアミノ酸と異なる参照配列の整列した各塩基あるいはアミノ酸が差の構成要素なっている。つまり、
Rは、参照配列の塩基またはアミノ酸の数を、塩基またはアミノ酸としても数えられる参照配列で生成する任意のギャップを伴う比較配列とのアラインメントの長さ上の比較配列の塩基またはアミノ酸の数である。

【0029】

もし、アラインメントが比較配列と参照配列の間に存在し、上記のように計算した同一性パーセントが、指定の最小同一性パーセント以上である場合、たとえ、本明細書で上述した計算した同一性パーセントが指定の同一パーセントより小さいアラインメントが存在する可能性があったとしても、比較配列は参照配列に対し指定の最小同一性パーセントを有する。

【0030】

そのような置換は保存的であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸に置き換わるように、1個のアミノ酸が類似構造及び特性を持つアミノ酸に置換される。 さらにもっと保存的なのは、ロイシンがイソロイシンに置換されるように、サイズ及び化学的性質が同一あるいは類似のアミノ酸の交換になることも考えられる。 自然発生的な同属タンパク質ファミリーにおける配列多様性の研究において、ある種のアミノ酸置換はより頻繁に他より認容性が高く、これらは元のアミノ酸とその置換物の間で、大きさ、電荷、極性、疎水性について頻繁に類似性の相関関係を示す。これが、「保存的置換」の定義の基礎である。

【0031】

保存的置換は、本明細書では次の５つのグループのうちの１つ以内で交換されると定義される: グループ１−分子量が小さい脂肪族の、非極性またはやや極性残基（Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ）；グループ２−極性、負電荷残基及びそれらのアミド類（Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ）；グループ３−極性、正電荷残基（Ｈｉｓ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ）；グループ４−分子量が大きい脂肪族の、非極性残基（Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｃｙｓ）；そしてグループ５−分子量が大きい、芳香残基（Phe、Tyr、Trp）。

【0032】

より保存性の少ない置換は、イソロイシン残基によるアラニンの置換のように、類似の特性を有するがサイズが多少異なる別の分子によるアミノ酸1個の置換を含む可能性も少しある。 非常に非保存的な置換では、酸性アミノ酸の極性、あるいは塩基性アミノ酸との置換を含む可能性も少しある。 しかしながら、化学的効果が完全には予想できないこと、また、過激な置換は単純な化学的原理から他に予想できない限り、思いがけない効果を生じる可能性が少しあるので、そのような「過激な」置換は、その可能性がないとは片付けることはできない。

【0033】

もちろん、そのような置換は、共通のL-アミノ酸以外の構造を含むことがある。 そのため、D-アミノ酸は、本発明の抗原ペプチドで一般に見つかるL-アミノ酸の代わりに用いられ、依然として開示により本明細書に包含されている。 さらに、非標準R基(すなわち、自然タンパク質の一般的な20個のアミノ酸以外のR基)を所有するアミノ酸も、本発明によって免疫原及び免疫原生ポリペプチドを生産する置換目的に使用され得る。
２つ以上の場所での置換が、以下に定義ように実質的に同等か、より大きな抗原活性を有するペプチドに帰着することがわかる場合、これらの置換の組み合わせが試験され、組み合わせた置換がペプチド抗原性への相加効果あるいは相乗効果に帰着するかどうか判断する。 ペプチド内で、最大４箇所まで同時に置き換えられるであろう。

【0034】

「Ｔ細胞応答」という用語は、体外 または体内において、ペプチドによって引き起こされるエフェクター機能の特異的増殖及び活性化を意味する。 ＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬにおいて、エフェクター機能とはパルスペプチド、パルスペプチド前駆体、または生体内の標的細胞を提示するペプチドの溶解、サイトカイン、好ましくはインターフェロンガンマ、ＴＮＦα、またはペプチドによって誘発されるＩＬ−２の分泌、エフェクター分子、好ましくはグランザイム、またはペプチドによって誘発されるパーフォリンの分泌、または脱顆粒のこともある。 Ｔヘルパー細胞を制御するＭＨＣクラスＩＩ制限Ｔヘルパー細胞において、エフェクター機能とはサイトカイン、好ましくはインターフェロンガンマ、ＴＮＦα、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１０またはＩＬ−２分泌誘発ペプチド、またはペプチド誘発脱顆粒でありうる。 ＣＴＬとＴヘルパー細胞に対するエフェクター機能の可能性はこのリストだけに限定されない。

【0035】

細胞毒性アッセイに基づくと、参照ペプチドと比較したＣＴＬ認識によるエピトープ再構成から、置換ペプチド能力を定義した場合、エピトープが参照ペプチドの抗原活性を少なくとも１０％有していれば、エピトープは参照ペプチドと実質的に同一であると考えられる。 それ故、エフェクター・ターゲット曲線上の直線部分の溶解活性を、参照ペプチドと置換ペプチドの等モル濃度と比較する場合、比較される参照ペプチドのエフェクター・ターゲット比の１０倍を超えないエフェクター・ターゲット比において、置換ペプチドによりインキュベートされた標的細胞の実際の特異的死滅パーセントは、参照ペプチドの値と等しくなるはずである。

【0036】

好ましくは、置換ペプチドについて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ペプチドに特異的なＣＴＬを分析する際、バックグラウンドと比較して、溶解増加の最大値の半分に達する置換ペプチドのペプチド濃度は、１ｍＭ程度、好ましくは１μＭ程度、より好ましくは約１ｎＭ程度、更により好ましくは約１００ｐＭ程度、最も好ましくは１０ｐＭ程度である。 また、置換ペプチドが1つを超えた、少なくとも2つの個体からCTLによって認識されることは好ましく、3つの個体ならさらに好ましい。

【0037】

よって本発明におけるエピトープは、実質的に同一抗原活性を持つ限り、自然発生の腫瘍関連エピトープまたは腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、または、参照ペプチドと異なる残基が多くとも４個に留まるエピトープを含んでいてもよい。
免疫応答の刺激は、ホストの免疫システムにより異物であると認識された抗原が存在するかに依存する。 腫瘍に関係した抗原の存在が発見されたことにより、現在では、ホストの免疫システムを利用して、腫瘍細胞表面に発現した標的抗原に特異的な免疫応答で、それにより作用メカニズムが、腫瘍の退化、静止、増殖速度の低下を引き起こすことが出来る、免疫応答を促進できる可能性がでてきた。 体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を結びつける様々なメカニズムが、現在、ガンの免疫療法において研究されつつある。
細胞性免疫応答の特定の要素は腫瘍細胞を特異的に認識し破壊することができる。 細胞傷害性Ｔ細胞(ＣＴＬ)が腫瘍浸潤組織群や抹消血から単離されることから、このような細胞がガンに対する自然免疫反応において重要な働きをしていることが示唆されている (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999)。 Galonらは、415人の大腸ガン患者の標本を用いた解析の結果、腫瘍組織内の免疫細胞の種類、密度及び位置が、広く使用されている腫瘍のＴＮＭ分類よりも患者の生存率を推定するのに実際に良い指標であることを示した (Galon et al., 2006)。 タンパク質に由来する通常8個から10個のアミノ酸残基のペプチドを持つ、主要組織適合遺伝子複合体クラスI分子(MHCクラスI分子)、つまりデフェクティブリボゾームプロダクト(defective ribosomal products 、DRIPs) (Schubert et al., 2000)を認識するCD8陽性T細胞（ＴＣＤ８＋）は特に、この応答に重要な働きをしている。 また、スプライシングされたタンパク質からのペプチドのステミングについても、その文献に記述されている。 ヒトのＭＨＣ分子はヒト白血球型抗原(ＨＬＡ)とも呼ばれる。

【0038】

MHC分子には２つのクラスがある。 ＭＨＣクラスＩ分子は核を持つほとんどの細胞に存在していることが分かっている。 ＭＨＣ分子は、それぞれ、重鎖（α鎖）とβ2-ミクログロブリンから（ＭＨＣクラスＩレセプター）、または、α鎖とβ鎖から（ＭＨＣクラスＩＩレセプター）なる。 これらの分子は３次元をとることで、ペプチドとの非共有結合に使われる結合溝を作り出している。 ＭＨＣクラスＩは、主に内在性のタンパク質の分解により生成するペプチドである、ＤＲＰＩ及びより大きなペプチドを示す。 ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主にプロフェッショナル抗原提示細胞(ＡＰＣｓ)に認められ、エンドサイトーシスの過程でAPCにより取り込まれた後処理される、外因性タンパクまたは膜貫通型タンパクのペプチドを主に与える(Cresswell, 1994)。 ペプチドとＭＨＣクラスＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）を持つＣＤ８陽性細胞傷害性T細胞により認識され、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを持つＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞により認識される。 ＴＣＲとペプチドとＭＨＣ分子は１:１:１の量比で与えられることが良く知られている。

【0039】

ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞はＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による有効な応答を誘導し維持するのに重要な働きをしている (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003)。 このことから、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)由来のＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープを同定することは、抗腫瘍性の免疫応答を始動させる薬剤を開発するのに大変重要である(Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003)。
ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は炎症がない場合、主に免疫応答の細胞、特にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、単核球、単核球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞に限られる。 がん患者では、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するために腫瘍細胞が驚くほど認められている (Dengjel et al., 2006)。

【0040】

マウスなどのモデル哺乳動物において、ＣＴＬエフェクター細胞（すなわちＣＤ８陽性Ｔリンパ球）がなくとも、ＣＤ４陽性Ｔ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて、腫瘍の発現を阻害するのに十分であることが確認された (Qin and Blankenstein, 2000)。 更に、ＨＬＡクラスＩＩ分子が与える腫瘍関連抗原とペプチドとを認識するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、抗体（Ａｂ）応答の誘導を通じて腫瘍の進行に対抗することが確認された(Kennedy et al., 2003)。 ＨＬＡクラスＩ分子に結合する腫瘍関連ペプチドと比較して、少数のＴＡＡクラスＩＩリガンドしかこれまでに説明されていない(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de)。

【0041】

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常免疫系の細胞に限られているため (Mach et al., 1996)、原発性腫瘍から直接クラスＩＩペプチドを単離することはできないと考えられていた。 しかしながらDengjelらは最近、腫瘍から多数のＭＨＣクラスＩＩエピトープを直接単離することに成功した(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006)。

【0042】

ペプチドが細胞性免疫応答を始動する（引き起こす）には、ＭＨＣ分子へ結合が必要である。 この過程はＭＨＣ分子の対立遺伝子とペプチドのアミノ酸配列固有の多型性によって決定される。 ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドの長さは通常８個から１０個のアミノ酸残基であり、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するペプチドの配列内に通常２つの保存残基（「アンカー」）を持つ。 このようにして、個々のＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝に特異的に結合できるかを決定する「結合モチーフ」を有する (Rammensee et al., 1997)。

【0043】

ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応において、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現中のある種のＭＨＣクラスＩ分子と結合可能であることが必要であり、特定のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を持つＴ細胞によって認識されることも必要である。

【0044】

腫瘍に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞に認識される抗原、つまり細胞傷害性Ｔ細胞のエピトープは、酵素、レセプター、転写因子などすべての種類のタンパク質から由来した分子であり、それらの分子は発現され、さらに起源が同一で変化していない細胞と比較して、各々の腫瘍細胞内でアップレギュレートされている。

【0045】

腫瘍に関連する抗原についての分類は、現時点では以下にあげる主要グループからなる (Novellino et al., 2005)。
1. がん-精巣抗原: 最初に同定された、Ｔ細胞が認識できるＴＡＡ (van der Bruggen et al., 1991)は、このクラス属し、このクラスは、メンバーの発現が、組織学的に異なるヒト腫瘍及び正常組織では、精巣の精母細胞／精原細胞及び時折胎盤でのみ起きていることから、初めはがん-精巣(ＣＴ)抗原と呼ばれていた。 精巣の細胞はＣｌａｓｓＩ及びＣｌａｓｓＩＩのＨＬＡ分子を発現しないため、これらの抗原は通常の組織ではＴ細胞に認識されず、よって免疫学的には腫瘍特異的であると考えられる。 ＣＴ抗原として良く知られている例は、ＭＡＧＥファミリーのメンバーまたはＮＹ−ＥＳＯ-1である。
2. 分化抗原： これらのＴＡＡは腫瘍及び腫瘍の発生源となった正常組織間で共有され、多くがメラノーマまたは正常のメラニン細胞内で見出されている。 これらのメラニン細胞系列関連のタンパク質の多くはメラニンの生合成に関与しており、それゆえに腫瘍特異的でないにもかかわらずガンの免疫療法に広く使用されている。 例として、チロシナーゼやMelan-A/MART-1がメラノーマに、ＰＳＡが前立腺がんに使用されているが、これだけには限定されない。
3. 過剰発現ＴＡＡ: 広く発現しているＴＡＡをコードしている遺伝子は組織学的に異なる型の腫瘍で検出され、また正常組織でも一般的に低い発現レベルで検出される。 正常細胞により処理され潜在的に提示されるエピトープの多くがＴ細胞に認識される閾値を下回っているが、一方、これらの腫瘍細胞の過剰発現が以前に獲得された耐性を破って抗がん作用を始動させる可能性はありうる。 このクラスのＴＡＡの代表例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ，サバイビン、テロメラーゼ及びＷＴ１である。
4. 腫瘍特異的抗原: これらの特有のＴＡＡは正常の遺伝子（例えばβカテニン, ＣＤＫ４など） の突然変異により生じる。 これらの分子変化の一部は腫瘍性形質転換と進行の両方又は一方に関与している。 腫瘍特異抗原は正常組織に対する自己免疫反応のリスクを持たずに、通常強い免疫応答を始動させることができる。 一方、これらのＴＡＡは多くの場合、これらが同定されたまさにその腫瘍のみに関連しており、通常、個々の多数の腫瘍間では共有されない。
5. 翻訳後の異常修飾により生じるＴＡＡ; このようなＴＡＡは、腫瘍細胞に対し特異的でもなく過剰発現していないにも関わらず、主に腫瘍内で活性な翻訳後の工程に関連した腫瘍になるタンパク質から生じうる。 このクラスの例として、ＭＵＣ１に関しては腫瘍細胞で新規エピトープに導く、変化したグリコシル化パターンや、腫瘍細胞に特異的または非特異的な、分解過程中のタンパク質スプライシングが挙げられる (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004) 。
6. がんウイルスタンパク質： これらのＴＡＡはガン化の過程に重要な働きする可能性のあるウイルスタンパク質で、外来性（ヒト由来ではない）であるため、Ｔ細胞応答を喚起することができる。 このようなタンパク質の例として、子宮頸癌で発現されるヒトのパピローマタイプ16ウイルスタンパク質，Ｅ６とＥ７がある。

【0046】

タンパク質が腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原として細胞傷害性Ｔリンパ球に認識され、また、治療で使用するには、特定の条件が満たされていなければならない。 抗原は主に腫瘍細胞から発現されるものであり、正常で健康な組織によって比較的少量で発現されるべきではない。 個々の抗原はあるタイプの腫瘍細胞に存在するだけでなく、濃度（１細胞につき各々のペプチドのコピー数）が高いことがさらに好ましい。 腫瘍特異抗原及び腫瘍関連抗原は、例えば細胞周期調節やアポトーシス抑制のような機能を原因とする、正常細胞から腫瘍細胞への転換に直接関わるタンパク質から生ずる。 更に、転換の直接原因となるタンパク質の下流ターゲットはアップレギュレートされるため、腫瘍には間接的に関連している可能性がある。 このような間接的腫瘍関連抗原は、ワクチン療法のターゲットにもなることがある (Singh-Jasuja et al., 2004)。 両方の場合とも、エピトープが抗原のアミノ酸配列に存在することが不可欠である。というのは、このような腫瘍関連抗原由来のペプチド（"免疫学的ペプチド"）が、体外または体内でＴ細胞応答を引き起こすはずだからである。

【0047】

基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるいずれのペプチドも、Ｔ細胞エピトープとして機能しうる。 体外または体内においてＴ細胞応答を誘発するには、対応するＴＣＲを有するＴ細胞の存在と、さらにこの固有エピトープに対する免疫学的耐性の欠損が必須条件である。

【0048】

そのため、ＴＡＡは腫瘍ワクチンの開発における出発点である。 ＴＡＡを同定、及び特性を示す方法は、患者または健康な被験者から単離できるＣＴＬを使用することに基づくか、または腫瘍と正常組織の間の異なる転写プロファイルまたは異なるペプチド発現パターンの生成に基づいている (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al., 2002)。

【0049】

しかしながら、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株に過剰発現しているか、選択的にそのような組織や細胞株に発現している遺伝子の同定では、免疫療法でこれらの遺伝子から転写中の抗原を利用することに関して正確な情報は得られない。 これは、対応するＴＣＲを持つＴ細胞の存在が必要であり、また、この特定エピトープに対する免疫耐性の欠損、または最小化が必要であることから、これらの抗原エピトープの個々の亜集団のみがそのような用途に適しているからである。 それゆえ、機能的Ｔ細胞が認められるＭＨＣ分子と結合した状態で存在する、過剰発現または選択的に発現しているタンパクから生ペプチドのみを選択することが重要となる。 そのような機能的Ｔ細胞は、特異抗原の刺激によって、クローンを増やし、エフェクター機能を行使できるＴ細胞として定義される（「エフェクターＴ細胞」）。 Ｔ細胞の特異的エフェクター機能は、インターフェロンガンマとパーフォリンとグランザイムの分泌である。

【0050】

ヘルパーＴ細胞は、抗腫瘍免疫性において、ＣＴＬのエフェクター機能を統合する際に重要な役割を果たす。 ＴＨ１タイプのヘルパーＴ細胞応答を始動させるヘルパーＴ細胞エピトープは、腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を細胞表面に有している腫瘍細胞に対する傷害機能など、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能をサポートしている。 このようにして、腫瘍関連ヘルパーＴ細胞ペプチドのエピトープは、単独または他の主要関連ペプチドと共に、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の薬剤有効成分として働く。

【0051】

ＣＤ８及びＣＤ４依存型の2つの免疫応答タイプは共に、連携し相乗して抗腫瘍効果に寄与しているため、ＣＤ８陽性ＣＴＬ（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）またはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のいずれかを利用した腫瘍関連抗原の同定、及び特徴づけは腫瘍ワクチンの開発に重要である。

【0052】

それ故、本発明の目的は、どちらのクラスのＭＨＣ複合体にも結合可能なペプチドの新規アミノ酸配列を提供することである。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1a】図１ａ及びｂは、ＭＨＣクラスＩ制御下において与えられた腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）である、神経膠芽細胞腫サンプルＧＢ１００６由来のＰＴＰ−００１及び神経膠芽細胞腫サンプルＧＢ６００３由来のＰＴＰ−００２を同定したＥＳＩ液体クロマトグラフィーマススペクトルを示すものである。

【図1b】図１ａ及びｂは、ＭＨＣクラスＩ制御下において与えられた腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）である、神経膠芽細胞腫サンプルＧＢ１００６由来のＰＴＰ−００１及び神経膠芽細胞腫サンプルＧＢ６００３由来のＰＴＰ−００２を同定したＥＳＩ液体クロマトグラフィーマススペクトルを示すものである。

【図2】図２は表１に示されている神経膠芽細胞腫に関連したペプチドをコードする遺伝子ＰＴＰＲＺ１のｍＲＮＡ発現プロフィールを示すものである。この遺伝子の発現は、正常組織では起こらないか、起きても非常に低く、一方、神経膠芽細胞腫サンプル（ＧＢ１００６ＴからＧＢ１０１１Ｔ；ＮＣＨ３５９Ｔ及びＮＣＨ３６１Ｔ）において強く発現する。

【図3】図３はフローサイトメトリー分析で測定した、ＰＴＰ−００２による体外刺激後のＨＬＡ−Ａ＊０２０１健常人ドナーにおけるＰＴＰ−００２特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の代表例を示すものである。 ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、健康体ドナーのヒトＰＢＭＣから単離され、また、同時刺激分子及びＡ＊０２０１／ＰＴＰ−００２（左図）または関連性のないＡ＊０２０１ペプチド（右図）と共に装填された、分子的にに確認された"人工抗原提示細胞"（aＡＰＣｓ）を使って体外でプライムされた(Walter et al., 2003)。 刺激サイクルを３回実施後、ＰＴＰ−００２と関連性のないペプチド四量体を合わせた染色により、ペプチド反応細胞の検出が行われた。 細胞はＣＤ８陽性リンパ球集団上でゲートが開閉され、パーセントは本集団内での四量体陽性細胞の頻度を示す。

【図4】図４は本発明のペプチドＨＬＡ−Ａ＊０２０１への親和性を示す。 ＨＬＡクラスＩペプチド及びウイルスマーカーペプチドＨＢＶ−００１の解離定数（Ｋｄ）は、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイで測定された（例４参照）。

【発明を実施するための形態】

【0054】

本発明は 神経膠芽細胞腫の治療に有効なペプチドを提供する。 これらのペプチドはヒト初代神経膠芽細胞腫サンプル上でHLA分子によって天然に提示されることが質量分析法により直接示された（例１及び図１）。 これらのペプチドのうち10個が由来する原遺伝子であるＰＴＰＲＺ１は、神経膠芽細胞腫において正常細胞より過剰発現しており（例２及び図２）、これらのペプチドは腫瘍と強く関係する、すなわち、これらのペプチドは腫瘍細胞において強く発現するが、 正常細胞では発現していないことが示された。 ＣＨＩ３Ｌ２は、１１番目のペプチドが由来する原遺伝子であるが、最初に軟骨細胞から同定された。 免疫系、とくにＴリンパ球／Ｔ細胞は、ＨＬＡと結合したペプチドを認識できる。 Ｔ細胞は、例えば ＰＴＰＲＺ１やＣＨＩ３Ｌ２の由来ペプチドを提示している神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞など、認識されうるＨＬＡ/ペプチド複合体を提示する細胞を破壊できる.。 本発明のうち、いつくかのペプチドはＴ細胞応答の促進能力が示されている（例３及び図３）。 したがってこれらのペプチドは、患者の腫瘍細胞を破壊できる免疫応答を起こすことができるため有用である。 上記のペプチド、または適当な前駆体（例えば伸張ペプチド、タンパク質またはこれらのペプチドをコードする核酸）を、理想的には免疫原性を促進する薬剤（例えばアジュバントなど）とともに直接患者に投与して、患者の免疫応答は誘発できる。 本発明の標的ペプチドは、正常組織では提示されず、患者の正常細胞に対する不要な自己免疫反応を抑制できるため、このような治療的ワクチンの接種で誘導された免疫反応は、腫瘍細胞に極めて特異的であることが期待できる。

【0055】

本発明のペプチドはガンの治療に有効であるのに加えて、診断にも有効である。 本発明のペプチドは神経膠芽細胞腫から発生し、しかも正常組織には存在しないことから、腫瘍の有無を診断するのに使用できる。

【0056】

請求項のＴＵＭＡＰが組織生検に存在することを、病理学者の腫瘍診断に役立てることができる。 病理学者は、抗体、マススペクトロメトリー、または当該分野で既知の他の方法を用いてＴＵＭＡＰを検出し、その組織が悪性または炎症性、あるいは一般的な病変組織であるかを判断できる。 ＴＵＭＡＰのグループが存在すれば、病変組織の分類または下位分類ができる。

【0057】

特に、Ｔリンパ球が既知で、またはＴリンパ球が作用機序に関わっていると予想される場合は、病変組織標本でＴＵＭＡＰを検出することにより、免疫学的療法の有効性を決定できる。 ＭＨＣの発現欠失が、感染した悪性腫瘍細胞が免疫学的監視から逃れる機序を良く示している。 したがって、ＴＵＭＡＰの存在が、この機序は分析した細胞により使用されていないことを示している。

【0058】

ＴＵＭＡＰを使用して、ＴＵＭＡＰ または ＭＨＣ分子に結合したＴＵＭＡＰに対するＴ細胞応答や抗体応答のような、リンパ球応答を分析することもある。 これらのリンパ球応答は、それ以上の治療段階を決定する際、予後マーカーとして使用できる。 これらの応答は、タンパク質ワクチン、核酸、自己物質、リンパ球養子免疫療法など異なる方法を使った、リンパ球応答の誘発を目的とした免疫療法的アプローチにおいて、代理マーカーとしても使用できる。 遺伝療法において、副作用を評価する際、ＴＵＭＡＰに対するリンパ球応答を考慮できる。 また、リンパ球応答を監視することで、移植片対宿主病を検出するなど、移植治療のフォローアップに有効なこともたまにある。

【0059】

ＴＵＭＡＰは、ＭＨＣ／ＴＵＭＡＰ複合体に対する特異抗体を生成/開発するのに利用できる。 これらは毒物や放射性物質を、病変組織に対する標的として治療に利用できる。 ＴＵＭＡＰは、また、ＰＥＴなどの画像を得るために、放射線核種を病変組織対して標的とすることができる。 これによって、小さな転移の検出、サイズの測定、病変組織の正確な場所の決定などができる。

【0060】

更に、生検サンプルに基づく病理学者による腫瘍診断を検証するのにＴＵＭＡＰを利用できる。

【0061】

表１は、本発明に従うペプチド、各々のＳＥＱ識別番号、ペプチド結合に対するＨＬＡ対立遺伝子、ペプチド由来タンパク質を示すものである。
表1： 本発明のペプチド

【表1】

#恐らくＡ*２０５のサブタイプ

【0062】

驚くべき事に、SEQ ID２は、主に扁平上皮癌（肺癌のタイプ）に提示されることが分かり、そのため本明細書上記に記載に従う前記癌タイプ治療にも利用できる。

【0063】

受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ１（ＰＴＰＲＺ１、ＰＴＰ−ξ）
ＰＴＰＲＺ１は受容体型タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの１つで、乳癌 (Perez-Pinera et al., 2007)、多数の硬化病変の再ミエリン化稀突起膠細胞 (Harroch et al., 2002)、及び、低酸素状態におけるヒト胚の腎臓細胞 (Wang et al., 2005)などにおいて、細胞質の２つのチロシンホスファターゼドメイン、１つのα炭水脱水酵素ドメイン、及びフィブロネクチンタイプＩＩＩを持つ、１回膜貫通型タンパク質タイプＩをコードする (Wu et al., 2006)。

【0064】

タンパク質と転写物質は共に神経膠芽細胞腫の細胞で過剰発現され、走触遊走を促進する(Lu et al., 2005)。 更に、ＰＴＲＰＺ１は、神経膠芽細胞において、ゲノムＤＮＡレベルでしばしば増幅される (Mulholland et al., 2006).

【0065】

Kaplanらは、ＰＴＰ−γを含む３つのヒトＰＴＰ受容体遺伝子をクローン化した(Kaplan et al., 1990)。 Kaplanらは、腎臓細胞腫の５個の細胞株のうち３個で、また、検査した１０個の肺細胞腫の腫瘍サンプルのうち５個で、１個のＰＴＰＧ対立遺伝子が失われたことを示した ＰＴＰ−γ ｍＲＮＡは腎臓細胞株と肺細胞株で発現したが、検査したいくつかの造血細胞株では発現しなかった。 このことから、ＰＴＰ−γ遺伝子は、腎臓細胞腫及び肺細胞腫において癌抑制遺伝子である可能性を示唆する性質を持つようにみえる。 Gebbinkらは、レセプター様タンパク質チロシンホスファターゼファミリーの'新規'のメンバーであるＲＰＴＰμをコードする５．７ｋｂのマウスｃＤＮＡを単離した(Gebbink et al., 1991)。 このｃＤＮＡは、 １，４３２個のアミノ酸（シグナルペプチドを含まない）からなるタンパク質であり、計算上１６１，６３６ドルトン分子量であることが予想される。 更にGebbinkらは、マウスのタンパク質と９８．７％相同なアミノ酸を示したヒトホモログをクローニングした。 予想されるマウスのタンパク質は、１３個のＮ−グリコシル化部位を持つ７２２残基のアミノ酸の細胞外領域と、１回膜貫通型ドメインと、他のチロシンホスファターゼの触媒ドメインと相同性を持つ２つの縦列型反復配列ホモログを含む６８８個のアミノ酸の細胞内部分から構成される。 ＲＮＡブロット解析は、転写物は肺で最もよく発現されるが、脳や心臓でも少量存在することを示した。 ヒト及びげっ歯動物の体細胞の雑種クローンを用いたサザンブロット解析によって、ヒトＰＴＰμ遺伝子は１８pter-qllに割り当てられた。

【0066】

ＰＴＰ−εのｃＤＮＡはKruegerらによって単離された (Krueger et al., 1990)。 この７００残基のアミノ酸からなるタンパク質は、短い細胞外ドメインと、２つの縦列反復細胞内PTPase（タンパク質チロシンホスファターゼ）のドメインを含む。 ＰＴＰ−eが高レベルの転写がマウスの脳及び精巣で見られた。 ＰＴＰ−eアイソフォームである膜貫通型受容体アイソフォームとより短い細胞質アイソフォームは共に、選択的プロモーター及び５プライムエクソンを使うことで単独遺伝子から生じるようにみえる。

【0067】

Barneaらは、ヒト及びマウスのＰＴＰ−γ遺伝子のｃＤＮＡを、脳のｃＤＮＡライブラリーからクローニングし（ＰＴＰ−γはこのグループによって名づけられた）、自分たちが予想したポリペプチド配列を解析した。 ヒトの配列（１，４４５アミノ酸）及びマウスの配列（１，４４２アミノ酸）は、アミノ酸レベルで９５％同一であり、それらの配列は推定細胞外ドメイン、１回膜貫通型ドメイン、及び２つのタンデム型触媒チロシンホスファターゼドメインを持つ細胞質領域を予測させる。 細胞外ドメインは、２６６個のアミノ酸が伸展した領域を含み、亜鉛含有の炭酸脱水酵素（ＭＩＭ１１４８００）に極めて類似しており、ＰＴＰ−γとＰＴＰ-ξ （ＰＴＰＲＺ１）は、２５分子からなる受容体型チロシンホスファターゼのサブファミリーであることが考えられる。 ＰＴＰ−γの遺伝子は３０個のエクソンを持ち、長さが約７８０ｋｂであり、 約１００ｋｂのＣＤ４５遺伝子（ＭＩＭ１５１４６０）を持つその他の受容体型PTP遺伝子や、さらに小さい他の受容体型ＰＴＰ遺伝子と比較してかなり長い。

【0068】

別の受容体型チロシンホスファターゼであるタンパク質チロシンホスファターゼξ（ＰＴＰＲＺ１）（ＰＴＰ−ζ、ＨＰＴＰΞ、ＨＰＴＰＺ，ＲＰＴＰ−ベータ（β）、またはＰＲＴＰＢとも呼ばれる）は、２つのグループによって１９９０年代初めにｃＤＮＡ配列として単離された。Levyらはヒト新生児の脳幹ｍＲＮＡ発現ライブラリーからｃＤＮＡクローンを単離し、２３０７残基のアミノ酸を含む大きな受容体型タンパク質チロシンホスファターゼの完全なアミノ酸配列を推定した (Levy et al., 1993)。

【0069】

Levyは彼らが名づけたＰＴＰベータ（ＰＴＰＲＺ１）タンパク質が、２つの細胞質ＰＴＰアーゼドメインおよび１６１６残基のアミノ酸からなる細胞外ドメインを持つ膜貫通型タンパク質であることを発見した。 ＰＴＰ−γ（ＭＩＭ１７６８８６）と同様に、細胞外ドメインのＮ末端２６６残基は、炭酸脱水酵素に極めて類似している（ＭＩＭ１１４８８０参照）。 ＰＴＰＲＺ１をコードしているヒト遺伝子は、染色体in situハイブリダイゼーションによって、染色体の７ｑ３１．３−ｑ３２に位置づけられることが分かった (Ariyama et al., 1995)。 ノーザンブロット解析は、ＰＴＰζはヒトの中枢神経系のみで発現されることを示した。 また、Levyらは、In situハイブリダイゼーションにより、小脳細胞層、歯状回、及び側脳質の前角上衣下層など、ヒト成人脳の異なる領域への発現に限定した (Levy et al., 1993)。 Levyは、その発現が神経系にのみ限定される哺乳類最初のチロシンホスファターゼであると発表した。 更に、マウスの胚脳での高度な発現により、ＰＴＰΞがＣＮＳの発達に重要な役割をしていることが示唆された。

【0070】

このように、ＰＴＰ受容体ファミリータンパク質は、ＰＴＰアーゼ細胞基質ドメイン構造を共有する膜結合型受容体及び非膜結合アイソフォームの極めて多様なファミリーとして特徴づけられた。 胎児及び胚組織におけるＰＴＰ受容体の発現から、ＰＴＰ受容体は発生生物学的な役割を担っていることが示唆されたが、生物学的に正常状態及び病変状態における完全な機能は未だに十分には分かっていない。

【0071】

米国特許 6,455,026ではＰＴＰζ（ＰＴＰＲＺ１）を脳腫瘍の治療及び視覚化におけるターゲットとして確認している。 この適用により、治療及びイメージングの両方の目的で、脳腫瘍細胞を特異的に標的にする方法及び試薬が提供された。 また、患者の脳腫瘍の治療に有用な、ＰＴＰζとの親和性に基づく化合物及び組成が提供され、組成及び化合物は全般的に次の２つのグループに分けられた。 １つはＰＴＰξ結合共役化合物であり、腫瘍細胞の増殖を阻害する細胞毒性部位を持つ。もう１つは、ＰＴＰξ結合化合物組成であり、その中でＰＴＰζ結合部位が腫瘍細胞中のＰＴＰξの正常機能を変更し従って、細胞増殖を抑制する。

【0072】

最初のグループにおいて、治療目的のＰＴＰξ結合共役化合物が与えられた。 これらの化合物は一般的な組成式α（Ｐｚ）Ｃを持ち、ここでα（Ｐｚ）とはヒトタンパク質チロシンホスファターゼ−ξに特異的に結合する1つまたは複数の構成成分のことであり、Ｃとは1つまたは複数の細胞毒性構成成分のことであった。 好ましい実施例（全てのグループに開示されている）にて、α（Ｐｚ）は、抗体または抗体フラグメントであることが開示された。 ２つ目のグループにおいて、治療に使用できるＰＴＰζ結合化合物が提供され、この化合物は脳腫瘍細胞中のＰＴＰζの正常機能を変更し、脳腫瘍細胞の増殖を抑制した。 これらの治療に使用できるＰＴＰＲＺ１結合化合物の一般組成式はα（Ｐｚ）であり、ここでα（Ｐｚ）はヒトタンパク質チロシンホスファターゼ−ξに特異的に結合する1つまたは複数の構成成分のことであり、また、α（Ｐｚ）の結合はタンパク質チロシンホスファターゼ−ξの機能を変えた。

【0073】

米国特許 7,060,275 B2では、ＰＴＰＲＺ１のスプライシング変異体、これらの変異体を含むベクター、及び様々な変異体に対する抗原が開示されている。

【0074】

キチナーゼ３様２（ＣＨＩ３Ｌ２）
ＣＨＩ３Ｌ２は軟骨細胞から最初に単離された。 ＣＨＩ３Ｌ２は関節リュウマチの標的抗原として頻繁に説明されてきた。 ＣＨＩ３Ｌ２の腫瘍との関連性は確認されていない。 キチナーゼ３様タンパク質は、細胞外シグナル調節キナーゼ及びＰＫＢ介在シグナル経路を活性化させることで、繊維芽細胞などのヒト結合組織の増殖を促進することが示唆されてきた（Recklies AD, White C, Ling H、The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase- and protein kinase B-mediated signalling pathways; Biochem J. 2002; 365:119-126）。 マウスのキチナーゼ３様タンパク質はヘリコバクター誘発胃癌モデルにおいて、強くアップレギュレートされていることが分かった(Takaishi S, Wang TC; Gene expression profiling in a mouse model of Helicobacter-induced gastric cancer; Cancer Sci. 2007 (3): 284-293)。

【0075】

従来技術において、ＰＴＰＲＺ１またはＣＨＩ３Ｌ２由来のＭＨＣ結合ペプチドを、脳腫瘍治療の薬剤の有効成分として利用することは全く考えられていなかった。

【0076】

そこで本発明では、最初の一側面として、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＮｏ．１１グループまたはＳＥＱＩＤＮｏ．１からＮｏ．１１に８０％相同である変異体、または上記のペプチドとＴ細胞の交差反応を引き起こす変異体から選択された配列からなるペプチドを提供する。

【0077】

本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子への結合能力を有する。

【0078】

本発明において、「 相同性」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列などの配列間の同一性の程度を示す。 前述の「 相同性」とは、至適条件で整列させた２つの配列を、比較される配列と比べることで決定される。 ここでいう比較される配列は、２つの配列の最適アラインメントにおいて、追加、または欠失（例、ギャップなど）含んでいてもよい。 そのようは配列の相同性は、ClustalWアルゴリズムなどのアラインメントを作ることで計算できる(Nucleic Acid Res., 1994, 22(22): 4673 4680)。 4673 4680). 一般に利用可能な配列解析ソフトウエアであるベクターＮＴＩ，ＧＥＮＥＴＹＸ， ＢＬＡＳＴまたはhttp://dragon.bio.purdue.edu/bioinfolinks/ などにあるような後悔データにて提供される解析ツールも利用することができる。

【0079】

当業者は、特定のペプチド変異体で誘導されたＴ細胞とペプチド自体との交差反応が可能かについて評価できることになる。

【0080】

発明者によれば、 特定のアミノ酸配列の「変異体」とは、側鎖、例えば１個または２個のアミノ酸残基が修正され、（例えば、このアミノ酸残基の側鎖を他の天然発生的なアミノ酸残基の側鎖または他の側鎖で置き換えることにより）その結果、このペプチドが置換後も、ＳＥＱＩＤＮＯ．１からＮｏ．１１における特定アミノ酸配列から成るペプチドと実質上同じようにＨＬＡ分子に結合できることを、意味するものである。 例えば、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２やＨＬＡ−ＤＲなどの適当なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用したり、結合したりする能力を、改善しないまでも少なくとも維持するように改変されてもよく、そのようにして、ペプチドは活性化ＣＴＬのＴＣＲとの結合能力を改善しないまでも少なくとも維持する。 これらのＣＴＬは、実質上細胞と交差反応ができ、本発明の側面で定義されているように同族ペプチドの、天然のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している細胞を殺傷できる。 科学文献 (Rammensee et al., 1997)や、データベース (Rammensee et al., 1999)から得られるように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定な位置は、ＨＬＡ受容体の結合モチーフに結合できるコア配列を持つアンカー残基であり、一般的に結合溝を構成するポリペプチド鎖のイオン性、電気物理性、疎水性、空間性といった性質により特徴づけられる。 こうして、当業者は、既存のアンカー残基を保持しながらＳＥＱＩＤＮＯ．１から１１のアミノ酸配列を修飾できるようになり、また、そのような変異体のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子への結合能力を保持するかについて決定できることになる。本発明の変異体は、活性化ＣＴＬへのＴＣＲとの結合能力を維持しており、実質的に交差反応が可能であり、また、本発明の側面で定義しているように、同族ペプチドの体内アミノ酸配列を含んだポリペプチドを発現する細胞を殺傷できる。

【0081】

実質上Ｔ細胞受容体と相互作用できないこれらのアミノ酸残基は、Ｔ細胞受容体との結合が実質上Ｔ細胞活性に影響せず、また関連するＭＨＣとの結合を壊さない、他のアミノ酸との置換によって修飾できる。 こうして本発明のペプチドは、所定の条件とは別に、あるアミノ酸配列または、その一部分または変異体を含んだいずれかのペプチド（オリゴペプチドまたはポリペプチドを含む）である。

【0082】

表２ ＳＥＱ．ＩＤ１から１０に対する変異体及びペプチドモチーフ

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0083】

ＭＨＣクラスＩＩ提示ペプチドは、特定のＨＬＡ対立遺伝子の特異的モチーフに適合したアミノ酸配列を持つ「コア配列」と、任意選択として、Ｎ末端及び／またはコア配列の機能を阻害しないＣ末端伸長アミノ酸配列（すなわちこのペプチド、及び天然カンターパートを認識するＴ細胞クローンの全てあるいはサブセットとの相互作用とは無関係とみなされる）から構成されることはよく知られている。 Ｎ末端及び／またはＣ末端伸長は、それぞれ例えばアミノ酸１から１０残基の長さである。 これらのペプチドは直接使用され、ＭＨＣクラスＩＩ分子に負荷でき、また以下に示す方法で、この配列がベクターにクローン化できる。 これらのペプチドは、細胞内で、より大きなペプチドが加工された最終産物であるため、より長いペプチドも、同様に利用できる。 本発明のペプチドは、いずれのサイズでもよいが、一般的には分子量は１００，０００未満、好ましくは５０，０００未満、より好ましくは１０，０００未満であり、また通常は約５，０００である。 本発明のペプチドのアミノ酸残基数は１，０００残基未満であり、好ましくは５００残基未満であり、より好ましく１００残基未満であり、最も好ましくは８から３０残基である。 更に、本発明でペプチド及び変異体を提供するが、前記ペプチドまたは変異体は、全長のアミノ酸残基が８から１００残基、好ましくは８から３０残基であり、最も好ましくは８から１６残基、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６残基である。

【0084】

したがって、本発明のペプチドとのＴ細胞交差反応を誘発する天然発生変異体あるいは人工的変異体は、しばしは長さが異なる変異体である。

【0085】

約１２アミノ酸残基より長いペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子の結合に直接使用われる場合、コアＨＬＡ結合部位に隣接するアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝への特異的結合あるいは、Ｔ（ヘルパー）細胞にペプチドを提示するペプチド能力に実質上影響しない残基であることが好ましい。 しかし、上記に記載されたとおり、より大きなペプチドは適当な抗体提示細胞によって断片化されるため、ポリペプチドによってコードされる場合など、このようなより大きなペプチドが利用可能であることが理解される。

【0086】

また、通常８から１０アミノ酸長のＭＨＣクラスＩエピトープは、実際のエピトープを含んだより長いペプチド、またはタンパク質から処理されたペプチドから生成される。 実際のエピトープの側面に位置する残基は、実際のエピトープを処理中に曝露するのに必要なタンパク質開裂に、実質的に影響しないものであることが好ましい。

【0087】

更に本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチド及び変異体も提供し、このペプチドまたは変異体の全長は、８から１００アミノ酸残基であり、好ましくは８から３０残基であり、最も好ましくは８から１６残基、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６残基である。

【0088】

当然のことながら、本発明のペプチドまたは変異体は、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩあるいはＩＩ分子に結合する能力を持つ。 ペプチドまたは変異体のＭＨＣ分子への結合は、異なるＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に関する文献(例 (Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998))に記載されているように、当該分野で知られる方法でテストされる。

【0089】

本発明の特に好ましい実施形態において、ペプチドは、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．１１に示されたアミノ酸配列から構成されるか、または基本的に構成される。

【0090】

「基本的に構成される」とは、本発明に従うペプチドが、ＳＥＱＩＤＮｏ．１からＳＥＱＩＤＮｏ．１１のいずれの配列あるいはその変異体に加え、さらにＭＨＣ分子エピトープに対するエピトープとして機能するペプチドの形成に不要なアミノ酸伸長に位置する、別のＮ末端及び／またはＣ末端を含むことを意味する。

【0091】

いずれにせよこれらの伸長は、本発明に従うペプチドを細胞内に効率的に導入するのに重要である。 本発明の一実施形態において、ペプチドは、ＮＣＢＩ、すなわちGenBank Accession-number X00497由来ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連変異体鎖（ｐ３３、Ｉｉに続く）の８０Ｎ末端アミノ酸からなる融合タンパク質である(Strubin, M. et al 1984)。

【0092】

より好ましいペプチド例は、特異的ＨＬＡサブタイプを持つペプチドから選んだＣＤ８細胞の刺激が可能なペプチドであり、ここで前記ペプチドは、次表２ａに示された特異なアンカーアミノ酸モチーフを有する。

【0093】

表２ａ 好ましいペプチドのＨＬＡサブタイプ及びアンカーモチーフ

【表2a】

【0094】

更に、ペプチドまたは変異体は、より強い免疫応答を引き起こすため、ＭＨＣ分子に対する安定性及び／または結合性をより向上できるように修飾してもよい。 そのようなペプチド配列の最適化の方法は、当該分野では良く知られており、逆方向ペプチド結合または非ペプチド結合の導入などがある。

【0095】

逆方向ペプチド結合において、アミノ酸残基はペプチド連鎖（−ＣＯ−ＮＨ−）ではなく、逆向きに結合している。 このようなレトロインバーソ（retro-inverso）型ペプチド模倣物は、参照文献として引用されるMeziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237に記載のように、当該分野で知られている方法で作成してもよい。 この方法では、骨格の変化はあるが側鎖方向は変化させずに擬ペプチドを作成する。 Meziere ら(1997)は、これらの擬ペプチドが、ＭＨＣ結合とヘルパーＴ細胞応答に有効であることを示した。 ＣＯ−ＮＨ結合の代わりにＮＨ−ＣＯ結合を含むレトロインバーソペプチドは、タンパク質分解にかなり耐性がある。

【0096】

非ペプチド結合とは、-CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, また、 -CH₂SO-.のことである。 米国特許４，８９７，４４５では、標準方法で合成したポリペプチドを含むポリペプチド鎖内の非ペプチド結合と、ＮａＣＮＢＨ_３存在下アミノアルデヒドとアミノ酸を反応させ合成した非ペプチド結合（-CH₂-NH）の固相合成法が提供されている。

【0097】

上述の配列を持つペプチドは、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端にある別の化学基とともに合成され、その結果、例えば、安定性、バイオアベイラビリティ、及び／またはペプチドへの親和性が促進される。 例えば、カルボベンゾキシル基、デンシル基、またはｔ−ブチルオキシカルボニル基などの疎水基は、ペプチドのアミノ末端に付加される。 同様に、アセチル基または９−フルオレニルメトキシカルボニル基をペプチドのアミノ末端に付加される。 更に、疎水基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、またはアミノ基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加される。

【0098】

更に、本発明のペプチドは、その立体配置が変化するように合成される。 例えば、通常のＬイソマーの代わりに、１個またはそれ以上のアミノ酸残基のＤイソマーを使用してもよい。 更に、本発明のペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基を、既知の合成アミノ酸残基に置換してもよい。 このような置換は、本発明のペプチドの安定性、バイオアベイラビリティ、及び／または結合反応を促進することもある。

【0099】

同様に、本発明のペプチドまたは変異体は、ペプチド合成の前後において、特定のアミノ酸と反応して化学的に修飾される。 このような改変は、当該分野では良く知られており、本明細書で参考文献として引用した、R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005など要約されている。 アミノ酸の化学的改変としては、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元的アルキル化、２，３，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、カルボキシル基のアミド改変、及びシステインからシステイン酸への過ギ酸酸化によるスルフィドリル改変、水銀誘導体形成、他のチオール化合物とジスルフィドとの混合体形成、マレイミド反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドとのカルボキシメチル化、及びアルカリ性ｐＨ下でのシアン酸塩とのカルバモイル化が挙げられるが、これだけに限定されない。 これに関して
、当業者は、より広義なタンパク質の化学改変方法論について、"Current Protocols In Protein Science", Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000)の１５章を参照されたい。

【0100】

タンパク質のアルギニル残基などの改変は、簡単に言えば、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、及び１，２−シクロヘキサンジオンなど隣接のジカルボニル化合物との反応に基づくことが頻繁であり、付加化合物を形成する。 別の例は、メチルグリオキサルのアルギニン残基との反応である。 システインは、リジン及びヒスチジンなど他の求核部位で付随する修飾がなくとも改変できる。 その結果、多数の試薬がシステインの修飾に使用できる。 Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com)などのウエブサイトで特定な試薬の情報が得られる。

【0101】

タンパク質におけるジスルフィド結合の選択的還元も一般的である。 ジスルフィド結合は生物製剤の熱処理中に形成され、酸化される。

【0102】

ウッドワード試薬Ｋを特定のグルタミン酸残基を修飾するのに使ってもよい。 Ｎ−（（３−ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ'−エチルカルボジイミドはリジン残基及びグルタミン酸残基との分子内架橋を形成するのに使われる。

【0103】

例えばジエチルピロカルボネートは、タンパク質のヒスチジル残基を修飾する試薬である。 ヒスチジンも４−ヒドロキシ−２−ノネナールで修飾できる。

【0104】

リジン残基と他のα−アミノ基の反応は、ペプチドの表面への結合またはタンパク質/ペプチドの架橋などに有用である。 リジンは、ポリ（エチレン）グリコールの接続部位であり、また、タンパク質糖化における主な修飾部位である。

【0105】

タンパク質のメチオニン残基は、ヨードアセトミド、臭化エチルアミン、及びクロラミンＴなどで修飾できる。

【0106】

テトラニトロメタンとＮ−アセチルイミダゾールは、チロシン残基の修飾に使われる。 ジチロシンの形成を介して起こる架橋には、過酸化水素あるいは銅イオンが使われる。

【0107】

トリプトファン修飾に関する最近の研究においては、Ｎ−ブロモサクシンイミド、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル臭化物もしくは３−ブロモ−３−メチル２−（２−ニトロフェニルメルカプト）−３Ｈインドール（BPNS-スカトール）が使われている。

【0108】

治療用のタンパク質及びペプチドをＰＥＧによりうまく修飾できると、しばしば循環半減期の延長につながり、一方、グルタルアルデヒト、ポリエチレングリコールジアクリレートによるタンパク質の架橋は、ハイドロゲルの調整用として使われる。 免疫療法に対するアレルゲンの化学的修飾は、しばしば シアン酸カリウムとの カルバミル化によって達成される。

【0109】

ペプチドまたは変異体、ここでペプチドは修飾されるか非ペプチド結合を含むが、本発明の好ましい実施形態である。 一般的に、ペプチド及び変異体（少なくともアミノ酸残基間にペプチド連鎖を持つ）は、Lu ら(1981)及び参考文献で公表されているように、固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミドモードによって合成される。 一時的なＮ−末基の保護には９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基が使われる。 塩基に非常に不安定なこの保護基が反復性開裂は、２０％ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液で実施される。 側鎖の官能性は、ブチルエーテル（セリンスレオニンとチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸とアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンとヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、そして４−メトキシー２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護してもよい。 グルタミンまたはアスパラギンがC末端残基の場合、官能性側鎖アミドの官能性の保護に４、４'−ジメトキシベンズヒドリル基を用いたものもある。 固相の支持体は、ジメチルアクリルアミド(骨格モノマー)、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）及びアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基化剤）の３つのモノマーから成るポリジメチルアクリルアミドポリマーに基づいている。 ペプチド−樹脂の開裂可能な連結剤には、酸に不安定な４−ヒドロキシメチル−フェノキシ酢酸誘導体を使う。 全てのアミノ酸誘導体は予め作られた対称の無水物誘導体として付加されるが、アスパラギン及びグルタミンは例外であり、これらはN、N-ジシクロヘキシル−カルボジイミド/１−ヒドロキシベンゾトリアゾールで仲介される非対称性カップリング反応により付加される。 全てのカップリングと脱保護反応はニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸もしくはイソチン（isotin）テストで測定される。 合成が終了すると、ペプチドは、５０％捕捉剤を含む９５％トリフルオロ酢酸の処理による側鎖保護基の除去と同時に樹脂支持体から開裂する 捕捉剤には一般的にエタンジチオール、フェノール、アニソール及び水が使われるが、適格な選択は合成されるペプチドの構成アミノ酸に依存する。 また、ペプチド合成では固相法及び溶液相法の組み合わせも可能である（Bruckdorfer et al. 2004及び本明細書の参考文献などを参照）。

【0110】

真空で蒸発しトリフルオロ酢酸を除去し、続いてジエチルエーテルで粉末とし、粗ペプチドを得る。 捕捉剤はすべて単純な抽出作業で除去され、液相の凍結乾燥で捕捉剤不含の粗ペプチドが得られる。 ペプチド合成の試薬は一般的にＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＮＧ７，ＵＫ）などで入手できる。

【0111】

精製は、再結晶、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び（通常）アセトニトリル/水の勾配分離などによる逆相高速液体クロマトグラフィーの１つあるいは組み合わせて実施する。

【0112】

ペプチド解析は、薄相クロマトグラフィー、電気泳動、特にキャピラリー電気泳動、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析及び、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法そしてＭＡＬＤＩ及びＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析法にて行われる。

【0113】

本発明の別な一側面では、ペプチドもしくは変異体をコードする核酸（例、ポリヌクレオチド）を提供する。 捕捉剤不含のポリヌクレオチドはＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＣＡＮ、ＲＮＡもしくはその組み合わせなどであり、一本鎖及び／または二本鎖、天然型または安定型であり、例えばホスホロチオエート結合骨格を有するポリヌクレオチドなどであってもよく、また、ポリペプチドをコードしている限り、イントロン含有または不含どちらの場合であってもよい。 当然のことながら、そのポリペプチドはポリヌクレオチドでコードされている天然発生のペプチド結合によって連結される天然発生のアミノ酸残基を含むペプチドのみである。 更に、本発明の別な一側面では、本発明に従うポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。

【0114】

ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに例えば、相補的に結合力のある末端を介して連結させる様々な方法が開発されている。 例えば、相補的ホモポリマーの束がDNAセグメントに付加され、ベクターDNAに挿入される。 そして、ベクターとＤＮＡセグメントは、相補的ホモポリマーの尾部間で水素結合し、組み替えDNA分子を形成する

【0115】

合成リンカーは１個以上の制限部位を含み、DNAセグメントとベクターが連結する代替方法を提供する。 様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を持つ合成リンカーはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．(ＮＥＷ Ｈａｖｅｎ ＣＮ，ＵＳＡ)などの多くの企業から市販されている。

【0116】

本発明のポリペプチドをコードするDNA修飾には、ＳＡｉｋｉ ら(１９８８)によって開示されているポリメラーゼ鎖反応を用いることが望ましい。 例えば適切な制限部位中で設計することにより、ＤＮＡを適切なベクターに導入する際、または、当該分野で既知の他の有用な方法でＤＮＡを修飾する際、この方法を使用してもよい。 ウイルス性ベクターを使用する場合は、ポックスベクターあるいはアデノウイルスベクターが好ましい。

【0117】

続いてＤＮＡ（レトロウイルスベクターの場合、ＲＮＡ）を適切な宿主にて発現し、本発明のペプチドもしくは変異体からなるポリペプチドを生成してもよい。 こうして、本発明のペプチドまたは変異体をコードするDNAを、 本明細書に記載の指導的見解で改変した既存技術を使用し、発現ベクターを構築し、続いてその発現ベクターを使い、本発明のポリペプチドの発現と生産するのに適切な宿主細胞に導入する。 このような技術は本明細書の参照文献に組み込まれ、米国特許 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075, and 4,810,648 に開示されているものである。

【0118】

本発明の化合物を構成するポリペプチドをコード化するＤＮＡ（レトロウイルスベクターの場合、ＲＮＡ）は、適切な宿主の導入のために、他の各種配列と連結されてもよい。 随伴ＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法、及びエピソームの維持または組み込みの要求によって決まる。

【0119】

一般的に、ＤＮＡは、発現の適切な配向と正確なリーディングフレームで、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。 必要に応じて、ＤＮＡは、目的とする宿主に認識される適切な転写及び翻訳の調節制御核酸の配列に連結されてもよいが、一般的にはそのような制御は発現ベクターで行われる。 続いてベクターは、標準的な技術で宿主に導入される。 一般的には、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。 それ故、形質転換する宿主細胞を選択する必要となる。 選択技術の１つに、全ての必要な制御エレメントとともに、抗体耐性のような形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、発現ベクターのＤＮＡ配列に組み込む方法がある

【0120】

代わりに、このような選択的形質に対する遺伝子は、別のベクター上に存在できるため、そのベクターを使って目的の宿主細胞を同時に形質転換することもできる。

【0121】

本発明の組み換えDNAによって形質転換された宿主細胞は、続いて本明細書に開示されている指導的見解で当業者に既知の適切な条件下で、十分時間培養され、ポリペプチドの発現を可能にし、次いで回収される。

【0122】

バクテリア（大腸菌、枯草菌など）、酵母（出芽酵母など）、糸状菌類（アスペルギルス属など）、植物細胞、動物細胞、及び昆虫細胞など、多数の発現系が知られている。 発現系は、ATCC Cell Biology Collection で入手可能なCHO細胞など哺乳動物細胞であることが好ましい。

【0123】

構成的発現用の哺乳動物細胞の典型的なベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部とネオマイシンなどの耐性マーカーを伴ったＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーターを含む。 １例は、Pharmacia (Piscataway, NJ, USA) で入手可能なｐＳＶＬである。 哺乳動物の誘導発現ベクターの１例は、ｐＭＳＧであり、ファルマシアから入手できる。 有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６とｐRS４１３−４１６であり、一般にStratagene Cloning Systems, (La Jolla, CA 92037, USA)で入手可能である。 プラスミドｐRS４０３、ｐRS４０４、ｐRS４０５、ｐRS４０６は酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３が組み込まれている。 プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。 ＣＭＶプロモーターベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどで入手可）は、一時的な発現もしくは安定した発現、細胞質発現もしくは分泌、また、FLAG、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃあるいはＭＡＴの様々な組み合わせにおけるＮ末端またはＣ末端の標識化を提供する。 これらの融合タンパクによって組み換えタンパクの検出、精製及び分析が可能である。 二重標識融合により強力なヒトサイトメガロウイルスのプロモーター制御部位は、１ｍｇ／Lの高いタンパク質の発現レベルをＣＯＳ細胞で恒常的に保つ。検出に柔軟性を与えている。

【0124】

強力なヒトサイトメガロウイルスのプロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞中のタンパク質発現レベルを１ｍｇ／Lと高く推進する。 作用が弱い細胞株では、典型的なタンパク質レベルは約０．１ｍｇ／Lである。

【0125】

ＳＶ４０の複製開始点が存在すると、ＳＶ４０の複製が許容されるＣＯＳ細胞においてＤＮＡ複製レベルが高くなる。 例えばＣＭＶベクターは、バクテリア細胞の複製開始点であるｐＭＢ１（ｐＢＲBR３２２誘導体）、バクテリアのアンピリシン耐性を選択するｂ-ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、及びｆ１開始点を含むことができる。 プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）の配列を含むベクターは、ＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ抗体、樹脂及びプレートを使って、ＦＬＡＧ融合タンパクの培地への分泌を命ずることができる。 他のベクターや発現系が、様々な宿主細胞を使う当該分野においてよく知られている。

【0126】

本発明は、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物により形質転換した宿主細胞を提供する。 宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であってもよい。 一部の状況では細菌細胞が好ましい原核生物の宿主細胞であり、典型的なものは、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ） から譲渡可能なDH5株、または米国培養細胞系統保存機関 （ＡＴＣＣ）から譲渡可能な ＲＲ１などの大腸菌の菌株である。 真核生物の好ましい宿主細胞は、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞であり、好ましくはマウスやラット、サル、ヒトの繊維芽細胞や大腸細胞株など脊椎動物由来の細胞である。 酵母の宿主には、Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA 92037, USA) から入手可能なYPH499、YPH500、YPH501がある。 哺乳動物細胞の宿主として好ましいものは、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能な、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ） 、ＡＴＣＣからＣＲＬ １６５８として入手可能なＮＩＨ スイスマウス胎児由来細胞ＮＩＨ/３Ｔ３、 ＡＴＣＣからＣＲＬ １６５０として入手可能なサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、及びヒト胎児由来腎臓細胞である２９３ 細胞である。 好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターを導入可能なＳｆ９細胞である。 発現に適した宿主細胞の選択方法についての概要は、Ｐａｕｌｉｎａ ＢａｌｂａｓとＡｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅ著 "Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，" Ｐａｒｔ Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８−１５８８２９−２６２−９などの教科書や、当業者に知られている他の文献に記述されている。

【0127】

本発明におけるDNA構築物の適切な宿主細胞への形質転換は周知の方法で実施され、それは使用されるベクターの種類により異なる。 原核生物細胞の形質転換については、例えば Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110やSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYなどの文献を参照する。 酵母の形質転換については、Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NYに説明されている。 また、 Beggs (1978) Nature 275,104-109 に記述された方法も有用である。 脊椎動物細胞では、形質移入（形質移入）については、例えばリン酸カルシウムやDEAEデキストラン、またはリポソーム製剤などの細胞を形質移入するのに有用な試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ
やＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８７７，ＵＳＡ）から入手可能である。 電気穿孔法も細胞の形質転換及び/または形質移入に有用であり、酵母や細菌、昆虫細胞、脊椎動物細胞の転換は当該分野では良く知られている。

【0128】

形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術で同定できる。 代わりに抗体を使って、上清中にタンパク質の存在を検出できる。

【0129】

本発明における特定な宿主細胞、例えば細菌、酵母、昆虫細胞などが、本発明のペプチドの調製に有用であることは理解される。 しかしながら、特定な治療方法においては他の宿主細胞も有用なこともある。 例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、ペプチドが適切なMHC分子に負荷されるように、本発明のペプチドを発現させるのに有用に使用されることもある。 したがって現行の本発明は、本発明に従う核酸または発現ベクターを有する宿主細胞も提供する。

【0130】

好ましい実施形態において、宿主細胞は抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。 前立腺性酸性ホスファターゼ （ＰＡＰ）含有組換え融合タンパク質で負荷されたAPCは、現在前立腺癌(Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅ−Ｔ)治療に向けて研究中である。

【0131】

本発明の別な一側面では、ペプチドまたはその変異体の生成方法、宿主細胞を培養し、ペプチドを宿主細胞あるいはその培養液から単離する方法を提供する。

【0132】

別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクター薬剤として使用される。 例えば、ペプチドまたはその変異体を、静脈内注射(ｉ．ｖ．)、皮下注射（ｓ．ｃ．), 皮内注射(ｉ．ｄ．)、腹腔内注射(ｉ．ｐ．)または筋肉内注射として調製してもよい。 ペプチドの好ましい注射法は、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、 ｉ．ｍ．、及びｉ．ｖ．である。
例えば、ペプチドの投与量は、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５ μｇ〜５００μｇであり、またはＤＮＡを投与してもよく、投与量は各ペプチドやＤＮＡにより異なる。 この範囲の投与量は以前行われた臨床試験で使用され成功したものである(Brunsvig et al 2006; Staehler et al 2007)。

【0133】

本発明の別な一側面は、活性化T細胞の体外での生成方法、つまり抗原特異的方法でT細胞を活性化させるのに充分な時間をかけて、適切な抗原提示細胞の表面に発現した、抗原負荷ヒトＭＨＣＩ及びＩＩ分子を、生体外でＴ細胞と接触させる方法である。 充分な量の抗原を抗原提示細胞とともに使用するのが好ましい。

【0134】

MHCクラスIIエピトープが抗原として使われている場合、T細胞はCD4陽性ヘルパー細胞であり、好ましくはT_H1タイプである。 MHCクラスII分子があらゆる適切な細胞表面に発現してもよい。 （MHCクラスII分子を発現させるために細胞を形質移入する場合）当該細胞は天然でMHCクラスII分子を発現していないのが好ましい。 代わりに、細胞が天然でMHCクラスII分子を発現している場合は、抗原の処理または抗原提示の経路が欠けていることが好ましい。 この場合、MHCクラスII分子の発現細胞が、T細胞を活性化する前に、選択されたペプチド抗原で完全に負荷されることが可能となる。

【0135】

抗原提示細胞（または活性化細胞）は、典型的にはその表面にMHCクラスII分子を有し、前記MHCクラスII分子を選択した抗原で負荷される能力を、それ自体実質的に持たないことが好ましい。 MHCクラスII分子は、選択した抗原と体外で直ちに負荷される。

【0136】

好ましくは、哺乳動物細胞が、TAPペプチドトランスポーターを欠いているか、その発現または機能が低下していることである。 TAPペプチドトランスポーターを欠いた適切な細胞は、T2, RMA-Sやショウジョウバエの細胞である。 TAPはTransporter associated with Antigen Processing（抗原プロセシング関連輸送体）のことである。

【0137】

ヒトペプチド負荷欠損細胞株Ｔ２は、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA)からカタログ番号CRL1992として、また、ショウジョウバエのSchneider line 2は、同じく米国培養細胞系統保存機関からカタログ番号CRL19863として入手可能であり、またマウスのRMA-S株についてはKarreら(1985)の文献に記述されている。

【0138】

便宜上、形質移入する前記宿主細胞は、実質的にMHCクラスI分子を発現していないとする。 また、刺激細胞が、B7.1, B7.2, ICAM-1やLFA 3のいずれかのように、T細胞同時刺激シグナルを与えるのに重要な分子を発現しているのが好ましい。 多数のMHCクラスII分子や同時刺激分子の核酸配列は、GenBankとEMBLのデーターベースから入手可能である

【0139】

同様に、MHCクラスIエピトープが抗原として使われる場合、T細胞はCD8陽性CTLである。

【0140】

抗原提示細胞がこのようなエピトープを発現させるために形質移入された場合、好ましくは前記細胞が、SEQ ID No 1から SEQ ID No 11のペプチドまたはその変異体アミノ酸配列を発現可能な発現ベクターを有することである。

【0141】

他の方法を体外でのCTLの生成に多数使用してもよい。 例えば、Peoples ら(1995)及びKawakami ら(1992)の論文に記載の方法では、CTLの作成に自己腫瘍浸潤リンパ球を用いている。 Plebanski ら(1995)は自己末梢血リンパ球(PLB)をCTLの調製に使用している。 Jochmus ら(1997)は、ペプチドまたはポリペプチドで鼓動させるか、または組換えウイルスの感染を通じて、自己CTLを生成する方法について記述している。 Hill ら(1995)とJerome ら(1993)は、B細胞を自己CTLの生成に使用している。 更に、ペプチドまたはポリペプチドで鼓動させたか、または組換えウイルスで感染させたマクロファージを用いて、自己CTLを調製してもよい。 S. Walter ら(2003)は、人工抗原提示細胞(aAPC)を用いた、T細胞の体外でのプライミング（初回抗原刺激）について説明しており、これは、選択したペプチドに対するT細胞の作成方法としても適している。 この研究では、aAPCを、ビオチン-ストレプトアビジン生化学手法により、ポリスチレン粒子（微小粒子）の表面に機能したMHC:ペプチド複合体をカップリングさせて作成した。 本システムは、aAPC上のMHC密度を正確に制御できるため、血液試料から高い効率で、抗原特異性が高いあるいは低いT細胞応答を選択的に引き出すことができる。 aAPCは、MHC:ペプチド複合体とは離れて、その表面にカップリングした同時刺激活性様抗CD28抗体と共に他のタンパク質をその表面に運ぶ必要がある。 更に、このようなaAPCに基づくシステムは、しばしばインターロイキン12様サイトカインなどの適切な可溶性因子の添加が必要である。

【0142】

同種細胞をT細胞の調製に使ってもよく、詳しい方法は本明細書の参考文献として引用しているWO 97/26328に記載されている。 例えば、ショウジョウバエ細胞とT2細胞に加え、他の細胞を使用して、CHO細胞やバキュロウイルスに感染した昆虫細胞、細菌、酵母、ワクチンに感染した標的細胞などの抗原を提示してもよい。 さらに、植物ウイルスを使用してもよく(例; Porta et al (1994)参照)、そこでは外来ペプチドの提示のための高収率システムとして、ササゲモザイクウイルスの開発について説明している。

【0143】

本発明のペプチドに注目した活性化T細胞は治療に有用である したがって、本発明の別な一側面では、本発明の前述の方法で得られる活性化T細胞を提供する。

【0144】

上記の方法で生産された活性化T細胞は、SEQ ID NO 1からSEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する

【0145】

好ましくは、T細胞がそのTCRとHLA/ペプチド複合体の相互作用（例とえば結合）により細胞を認識することである。 このようなT細胞は、本発明のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する標的細胞を持つ患者で、標的細胞を殺す方法には有用であり、ここで、患者には効果的な数の活性化T細胞が投与される。 患者に投与するT細胞は、その患者に由来し上記の方法で活性化されたものであってもよい（すなわち、これらは自己T細胞である）。 代わりに、T細胞は患者に由来せず、他の個人に由来してもよい。 もちろん、個人は健康であることが好ましい ここでいう「健康な個人」とは、一般に健康状態にあり、好ましくは十分な免疫系を持ち、さらに好ましくは、容易に検査/検出できるいかなる疾患にも患っていない個人を意味する。

【0146】

体内で、本発明に従うCD4陽性T細胞の標的細胞は、腫瘍細胞（MHCクラスII分子を時に発現する）及び／または腫瘍（腫瘍細胞）をとりまく間質細胞（MHCクラスII分子を時に発現 (Dengjel et al., 2006) ）であってもよい。

【0147】

本発明のT細胞を治療組成物の有効成分として使用してもよい。 従って本発明は、本発明のアミノ酸配列を含んだポリペプチドを異常に発現する標的細胞を持つ患者で、標的細胞を殺す方法、つまり上記に記載したとおり、患者に効果的な数の活性化T細胞を投与する方法も提供する。

【0148】

ここでいう「異常に発現する」とは、ポリペプチドが正常レベルに比べ過剰発現していること、または、腫瘍が由来する組織においては発現していないが腫瘍では発現していることを意味する。 また、ここでいう「過剰発現」とは、ポリペプチドが、正常な組織と比較して少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは少なくとも５倍または１０倍発現していることを意味している。

【0149】

T細胞は、上述のような当該分野で既知の方法で得てもよい。

【0150】

この、いわゆるT細胞の養子細胞移植のプロトコールは、当該分野では周知であり、文献（Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005)や総説 (Gattinoni et al., 2006) and (Morgan et al., 2006)に記載されている。

【0151】

ペプチドや核酸、発現ベクター、細胞、活性化ＣＴＬ、Ｔ細胞レセプターやこれをコードする核酸など、本研究のいずれの分子も、細胞が免疫応答から逃れる特徴を持つ疾患の治療に有用である。 それ故、本発明のすべての分子を、薬剤として、または薬剤の製造において使用してもよい。 これらの分子を単独で、または本発明における他の分子や既知の分子と組合せて使用してもよい

【0152】

本発明の薬剤はワクチンが好ましい。 本ワクチンは患者に直接、または影響を受けた器官に、またはｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．またはｉ．ｖ．により全身に投与してもよく、また、続いて患者に投与される、患者またはヒト細胞株に由来の細胞をｅｘ ｖｉｖｏ で適用しても、あるいは ｉｎ ｖｉｖｏ で使用して、患者由来の免疫細胞のサブ集団を選択し、その後患者に戻す。 細胞にIn vitroで核酸を投与する場合は、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現できるように核酸を形質移入することが、細胞にとって有用なこともある。 ペプチドは実質的に純粋に（単独で）、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と併用してもよく、また免疫刺激サイトカインとともに使用したり、リポソームなどの適切な送達系に投与してもよい。 ペプチドはまた標識化されても、あるいは融合タンパク質であるか、ハイブリッド分子であってもよい。 その配列が本発明で与えられるペプチドは、CD8陽性CTLを刺激することが期待される。 しかしながら、ＣＤ４Ｔ−ヘルパー細胞により提供される助けの存在で、ＣＤ８ＣＴＬの刺激はより効率的になる。 したがって、CD8CTLを刺激するMHCクラスIエピトープに対し、融合パートナーまたはハイブリッド分子のセクションは、CD4陽性T細胞を刺激するエピトープを適切に提供する。 CD4及びCD8刺激性エピトープは、当該分野で良く知られており、本発明により同定されたエピトープを含む。

【0153】

本発明の一形態において、ワクチンは少なくとも一種のペプチド、好ましくは２から５０種、より好ましくは２から２５種、さらに好ましくは２から１５種、最も好ましくは、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、または１３種のペプチドを含む。 前記ペプチドは１つまたは複数の特定なＴＡＡに由来し、ＭＨＣクラスＩ分子とクラスＩＩ分子の一方またはその両方に結合してもよい。

【0154】

ポリヌクレオチドは実質的に純粋であり、適切なベクターまたは送達系に含まれる。 核酸はDNA, cDNA, PNA, CAN, RNAまたはこれらの組合せである。 このような核酸の設計や導入方法は、当該分野では良く知られている。 概要は 、 Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, or A Mahdavi 2006などに記述されている。

【0155】

ポリヌクレオチドワクチンは簡単に調製できるが、これらのベクターが免疫応答を誘発する作用様式については完全には解明されていない。 適切なベクターと送達系は、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルスや、複数のウイルスのエレメントを含む複合体などを基にした、ウイルスＤＮＡやウイルスＲＮＡの一方またはその両方である。 ウイルスなしの送達系は、陽イオン性脂質や陽イオン性ポリマーなどで、ＤＮＡ送達に関する技術分野で良く知られている。 遺伝子銃などの、物理的な送達法を使用してもよい。 核酸でコードされたペプチドまたは複数のペプチドは、例えば、上述した各々の反対側のＣＤＲに対しＴ細胞を刺激するエピトープとの融合タンパク質であってもよい。

【0156】

本発明の薬剤は、１個または複数のアジュバントを含んでもよい。 アジュバントは、免疫応答(例えば抗原に対するＣＴＬ及びヘルパーＴ(Ｔ_H)細胞介在による免疫応答)を非特異的に増強または促進するので、そのために本発明の薬剤に役立つと考えられる物質である。 適切なアジュバントには、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＯＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９，ＣｙａＡ，ｄＳＬＩＭ、フラジェリンもしくはフラジェリン由来のＴＬＰ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、 イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ）、ＩｍｕＦａｃｔ、 ＩＭＰ３２１、インターフェロンα、インターフェロンβー、またはＰＥＧ誘導体、ＩＳ Ｐａｔｃｈ 、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＯＣＯＭｓ、ＪｕｖＬｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、 モノホスホリル脂質Ａ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水乳剤、水中油乳剤、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ^{（登録商標）} ベクターシステム、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７、ＶＥＧＦ トラップ、Ｒ８４８、βーグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ａｑｕｉｌａ'ｓＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ (サポニン、マイコバクテリア抽出物及び合成バクテリア細胞壁模倣体から誘導される)、及びＲｉｂｉ'ｓ Ｄｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ、あるいはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の所有権のあるアジュバントがあるが、それらに限定されるものではない。 フロイントもしくは GM-CSFなどのアジュバントなども好ましい。 樹状細胞に特異ないくつかの免疫アジュバント(ＭＦ５９など)及びその調製は前述されている(Dupuis M et al 1998; Allison 1998)。 またサイトカインを使用してもよい。 いくつかのサイトカインは、リンパ系組織(例えばＴＮＦ−α)への樹状細胞の移動に対する影響、Ｔリンパ球(例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４)のために効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟の加速に(米国特許５、８４９、５８９、その全体を参照として本明細書に明確に組み入れる)、さらに免疫アジュバント(例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β)としての作用などに、直接関連がある (Gabrilovich et al 1996)。

【0157】

免疫活性化ＣｐＧ オリゴヌクレオチドも、ワクチンの設定におけるアジュバントの影響を増強することが報告されている。 理論に拘束されずに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、トール様受容体（ＴＬＲ）、主としてＴＬＲ９によって生来の(適応できない)免疫系を活性化することで作用する。 ＴＬＲ９活性化に誘発されたＣｐＧは、ペプチドもしくはタンパク抗原、生ウイルスもしくは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己由来の細胞ワクチン、及び予防/治療ワクチン両方の多糖類接合体を含む、種々様々の抗原に対する抗原特異性の体液細胞反応を増強する。 更に重要なことには、そのＣｐＧは、ＣＤ４ T細胞の助けがない状態でさえ、樹状細胞の成熟及び分化を増強し、T_H1細胞の活性化の増強、及び強力な細胞傷害性リンパ球(ＣＴＬ)生成をもたらす。 ＴＬＲ９刺激により誘発されたＴ_H1バイアスは、通常、Ｔ_H2バイアスを促進するミョウバンもしくは不完全なフロイントのアジュバント(ＩＦＡ)のようなワクチンアジュバントが存在する状態でさえ維持される。 ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと処方された場合もしくは併用して投与された場合、または微粒子、ナノ粒子、脂肪乳剤などの調製物もしくは同様の調製物の場合、さらに大きなアジュバントの活性を呈するが、それは抗原が比較的弱い場合に、強い応答を誘発するために特に必要である。 いくつかの実験において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドはさらに、免疫応答を加速し、ＣｐＧなしの十分量のワクチンに対し同程度の抗体反応を伴いながら、抗原用量を約２桁低減し得る (Krieg et al 2006)。 米国特許６，４０４，７０５Ｂ１は、抗原特異性免疫応答を誘発するためにＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント及び抗原を組み合わせた使用について記述している。 CpG TLR9拮抗薬は、本発明の薬剤組成物の好ましい成分であるMologen(ベルリン、ドイツ)によるdSLIM(ダブルステムループ免疫賦活剤)である。 RNA結合TLR 7、TLR 8及び/またはTLR 9などの分子と結合する他のTLRを使用してもよい。

【0158】

他の有用なアジュバントの例には、 化学的に改変されたCpGs (例えば、CpR、Idera)、dsRNA類似化合物（ Poly(I:C)やAmpliGen）、非CpGバクテリアDNA もしくはRNAの他にも、免疫活性小分子及び抗体（シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、NCX-4016、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、XL-999、CP-547632、パゾパニブ、VEGFトラップ、ZD2171、AZD2171、抗CTLA4及びSC58175）が上げられ、これらは治療として及び/またはアジュバントとして作用することもあるが、これらだけに限定されるものではない。 本発明の状況において有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度は、必要以上に実験を重ねなくても熟練した当業者により容易に決定され得る。 好ましいアジュバントは、ｄＳＬＩＭ、インターフェロンα及びβ、ＣｐＧ７９０９、ＩＣ３１、ＡＬＤＡＲＡ（イミキモド）、ＰｅｖｉＴｅｒ、ＲＮＡ、タダラフィル、テモゾロミド、及びＪｕｖＩｍｍｕｎｅである。

【0159】

本発明はがん、具体的には神経細胞腫瘍、特に脳腫瘍の治療に有用な薬剤を提供する がんは、転移性または非転移性であり、具体的には星細胞腫、 毛様細胞性星細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、乏突起膠腫、上衣腫、多形神経膠芽腫、混合膠腫、神経膠腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、胚細胞種、奇形腫、神経節膠腫、神経節細胞腫、中枢神経節細胞腫、原始神経外胚葉性腫瘍 （PNETすなわち、髄芽腫, 髄上皮腫, 神経芽種, 網膜芽細胞腫, 上衣芽腫など）、松果体組織にでききた腫瘍（松果体細胞腫や松果体芽腫など）、上衣細胞腫、脈絡叢腫瘍、原発不明の神経皮腫瘍（大脳神経膠腫症、星状芽細胞腫など）、神経膠芽腫、肺癌または腺扁平上皮癌などのこともある。

【0160】

本発明のペプチドは、神経膠芽腫から、またSEQ ID No. 2では 腺扁平上皮癌から単離されたので、本発明による薬剤は神経膠芽腫あるいは腺扁平上皮癌に使用されるのが好ましい。

【0161】

本発明は、次の事項から成るキットを含む: つまり、(a) 上述の薬剤組成物（溶液または凍結乾燥物）を含む容器; (b)任意に、希釈剤もしくは、該凍結乾燥製剤用の再構成溶液を含む第二の容器、及び(c)任意に、(i)溶液の使用方法あるいは(ii)再構成方法、及び/または、該凍結乾燥製剤の使用である。 キットはさらに、(i)緩衝液、(ii)希釈剤、(iii)フィルタ、(iv)針もしくは(v)注射器を1つまたは複を含むことがある。 容器は、好ましくはバイアル、ガラス瓶、注射器もしくは試験管で、容器は多重使用容器であってよい。 薬剤組成物は、好ましくは凍結乾燥される。

【0162】

本発明のキットには、好ましくは適切な容器中に本発明の凍結乾燥調製物及び再構成及び/または使用の説明書が含まれる。 適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル(例えば、二腔バイアル)、注射器(二腔注射器など)及び試験管を含む。 容器はガラスもしくはプラスチックのような様々な材料から形成される。 好ましくは、キット及び/または容器は、再構成及び/または使用の方法を示す、容器あるいはその容器に関連する使用説明書を含む。 例えば、ラベルは、凍結乾燥調製物が上述のペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。 ラベルはさらに、調製物が有用であるか、あるいは皮下投与を意図するものであることを表示する。

【0163】

調製物が入った容器は多重使用バイアルであり、再構成調製物の反復投与(例えば2から6回投与から）が許される。 キットはさらに、適切な希釈剤(例えば重炭酸ナトリウム溶液)を含む、第2容器を含んでもよい。

【0164】

希釈剤及び凍結乾燥調製物の混合に際して、再構成調整物の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも0.15mg/mL/ペプチド(=75μg)で、好ましくは最高3mg/mL/ペプチド(=1500μg)までである。 キットはさらに、他のバッファ、賦形剤、フィルタ、針、注射器及び使用方法の添付文書を含む、商業上及び使用者の観点から見て望ましい他の材料を含む。

【0165】

本発明のキットは、他のコンポーネント(例えば、他の化合物あるいはこれらの他の化合物の薬剤組成物の有無に関わらず、本発明による薬剤組成物の調製物を含む単一容器、あるいは各コンポーネントの別個の容器を含む。

【0166】

好ましくは、本発明のキットは、第2化合物の併用を組み合わせた使用に包装された本発明の製剤(例えば、GM-CSF、化学療法剤、天然産物、ホルモンもしくは拮抗薬、抗血管形成作用薬もしくは阻害剤、アポトーシス誘導作用薬もしくはキレート化剤)、または薬剤組成物それ自体を含む。 キットのコンポーネントは、あらかじめ複合体を形成するか、または各コンポーネントが患者に投与する前に個別の容器内にある。 キットのコンポーネントは、1つまたはそれ以上の溶液中に、好ましくは水溶液、さらに好ましくは無菌液剤中に提供される。 キットのコンポーネントはまた、固体として提供され得、好ましくは他の別個の容器で提供され、適切な溶剤を添加することで液体に変換されてもよい。

【0167】

治療キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器もしくは固体か液体を入れるその他の手段にもなる。 通常、２つ以上のコンポーネントがある時、キットは第2のバイアルあるいは他の容器を含み、それにより別々の投与が可能となる。 キットはまた、薬学的に受理可能な液体用の別の容器を含んでもよい。 好ましくは、治療キットは装置(例えば、1本またはそれ以上の針、注射器、点眼びん、ピペットなど)を含み、それは、現在のキットのコンポーネントである、本発明の薬剤の投与を可能にする。

【0168】

現調製物は、経口(腸内)、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、もしくは経皮的な任意の受理可能なルートによるペプチドの投与に適するものである。 好ましくは、投与は皮下注射で、最も好ましくは輸液ポンプによる皮内注射である。

【0169】

本発明は、ここで、以下の実施例の記述により、その好ましい実施形態を説明するが、この実施例だけに限られるものではない。 本発明の目的のため、本明細書で引用されている全ての参考文献が、その全体の参照として組み込まれている。

【実施例】

【0170】

実施例１：
細胞表面に提示された腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）の同定
組織サンプル
患者の腫瘍及び健常組織は、Hopital Cantonal Universitaire de Geneve （腫瘍免疫学癌治療研究室）とNeurochirurgische Universitats-Klinik Heidelberg（Molekularbiologisches Labor）から提供された。 手術まえにすべての患者から書面でインフォームドコンセントを得た。 組織は、術後直ちに液体窒素で衝撃冷凍し、TUMAPを単離するまで−８０℃で保存した。

【0171】

組織サンプルからのHLAの単離
衝撃冷凍した組織サンプルのＨＬＡペプチドプールは、わずかに改変したプロトコール（Falk, K. et al 1991;Seeger, F.H. et al.T 1999）に従い、 HLA-A^*02特異抗体ＢＢ７．２またはＨＬＡ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ特異抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、及び限外ろ過により、固体組織から免疫沈降によって得た。

【0172】

ＥＳＩ液体クロマトグラフィー質量分析法（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）によるＴＵＭＡＰの検出
方法１：
得られたＨＬＡペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（CapLC, Waters) ）により分離し、溶出するペプチドは、ＥＳＩ源付き四重極直交加速飛行時間タンデム質量分析計を用いて分析した。 ペプチドプールは、濃縮と脱塩のためＣ１８カラムに装填された。 装填後、5 μm C18 逆相充填剤（Dionex）が詰まった溶融シリカミクロキャピラリーカラム（75 μm i.d. x 250 mm）により分離するため、予備カラムを ラインにセットした。 溶媒Ａは、４ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液である。 溶媒Bは、２ｍＭ酢酸アンモニウムの８０％アセトニトリル/水溶液である。 両溶媒とも蟻酸でｐＨ３．０に調整した。 スプリットシステムで流速を５μｌ/分から約２００ nl/分まで減少させながら、９０分以内に１５％から６０％のバイナリ勾配をかけた。 金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip, New Objective）を微少ESI源の導入に使った。 ＴＯＦ分析計の積分時間は内部スキャン遅延時間0.1 秒で1.9秒であった。
その後、ペプチド配列を衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析計（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ／ＭＳ）で明らかにした。 同定したＴＵＭＡＰ配列は、発生した天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。

【0173】

方法２：
得られたＨＬＡペプチドプールをその疎水性に従い逆相クロマトグラフィー（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）により分離し、溶出するペプチドは、ＥＳＩ源付きLTQオービトラハイブリッド質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）で分析した。 ペプチドプールを１．７μｍＣ１８ 逆相充填剤（Ｗａｔｅｒｓ）が詰まった分析用溶融シリカミクロキャピラリーカラム（７５μｍｘ２５０ｍｍ）に、流速４００μＬ／ｎＬで直接装填した。 その後、その後ペプチドを，流速３００μＬ／分で１０％から３３％まで，２段階の１８０分バイナリ勾配をかけて分離した.． 勾配は，溶媒Ａ（０．１％蟻酸水溶液）と溶媒Ｂ（０．１％蟻酸アセトニトリル溶液）から成る． 金被覆ガラスキャピラリー（PicoTip, New Objective）を微少ESI源の導入に使った。 ＬＴＱ−オービトラ質量分析計をＴＯＰ５戦略でデータ依存モードで運転した． 手短に，オービトラップで（Ｒ＝３００００），高い質量精度の全スキャンを用いてスキャンサイクルを開始し，続いて，以前に選択したイオンを動的排除した5つの最も豊富な前駆体イオン上で，オービトラップ内で（Ｒ＝７５００）ＭＳ／ＭＳスキャンを実施した． タンデム質量形は，SEQUESTと別な手動コントロールで解釈された． 同定したＴＵＭＡＰ配列は、発生した天然ＴＵＭＡＰの断片化パターンを、合成配列の同一参照ペプチドの断片化パターンと比較して確認した。
図１ａ及びｂは，ＭＨＣクラスい関連ＴＵＭＡＰの腫瘍組織から得た代表するスペクトルを示す．

【0174】

実施例２：
本発明のペプチドをコード化する遺伝子発現プロフィール
ＭＨＣ分子による腫瘍細胞表面に提示されて同定されたペプチドすべてが、免疫療法に適しているとはいえない。その理由は、多くのペプチドが多数の細胞タイプにより発現された正常の細胞タンパク質に由来しているからである。 これらのペプチドのほんの僅かだけが、腫瘍に関連しており、由来する腫瘍を認識するのに高い特異性を有するＴ細胞を誘発できる傾向を有している。 このようなペプチドを同定し、予防接種により誘発される自己免疫のリスクを最小限にするため、本発明者は多数の正常組織と比較して、腫瘍細胞で過剰発現されるタンパク質に由来するこれらのペプチドに焦点を当てた。

【0175】

理想的なペプチドは、腫瘍に特異的で他の組織には提示されないタンパク質に由来することである。 理想的なペプチドに近い発現プロフィールを有する遺伝子に由来するペプチドを同定するために、同定したペプチドを、それらが由来するタンパク質と遺伝子にそれぞれ割り当て、これらの発現プロフィールを生成した。

【0176】

ＲＮＡ源と予備調製
手術で取り除いた組織標本は、各患者から書面でインフォームドコンセントを得た後、２ヶ所の別な臨床施設（実施例１を参照）から提供された。 腫瘍組織標本は、術後直ちに液体窒素でスナップ冷凍し、その後液体窒素下で乳鉢と乳棒を使い均質化した。 ＲＮＡは，ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてこれらのサンプルから調製し，続いてＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でクリーンアップした．両方法とも製造業者プロトコールに従って実施した．

【0177】

ヒト健常組織の総ＲＮＡは、市販で得た（Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Germany; Stratagene, Amsterdam, Netherlands; BioChain, Hayward, CA, USA）。 数名の個人（２名から１２３名の間）から得たＲＮＡを混合して、個々のＲＮＡを等しく加重した。 白血球は４名の健常ボランティアの血液サンプルから単離した。

【0178】

すべてのＲＮＡサンプルの質と量は、RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).を用いてAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Germany) で測定した。

【0179】

マイクロアレイ実験
腫瘍及び正常組織のＲＮＡサンプルすべての遺伝子発現解析は、Affymetrix Human Genome (HG) U133A または HG-U133 Plus 2.0 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（Affymetrix, Santa Clara, CA, USA）で実施した。 すべてのステップはAffymetrixの説明書に従って実施された(http://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx)。 簡単にいうと、二本鎖cDNAは、取扱説明書の記載通り、SuperScript RTII (Invitrogen) と oligo-dT-T7 primer (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) を用いて、合計5-8 μg のRNAから合成した。 in vitro転写は、U133A アレイにはBioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, USA)で、U133 Plus 2.0 アレイにはGeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix)で実施し、続いて cRNA のハイブリダイゼーション、及び染色は、ストレプタビジン−フィコエリスリンとビオチン化抗ストレプタビジン抗体を用いて実施した。 画像はAgilent 2500A 遺伝子アレイスキャナー (U133A)またはAffymetrix 遺伝子チップスキャナー 3000 (U133 Plus 2.0) でスキャンし、データは全パラメータの初期設定値を用いて GCOSソフトウェア（Affymetrix）で解析した。 正規化は、Affymetrixにより提供された１００個のハウスキーピング遺伝子を使った(http://www.affymetrix.com/support/technical/mask_files.affx)。 相対的発現値は、ソフトウェアで得たシングルログ比から計算した、正常サンプルは適宜１．０に設定した。

【0180】

本発明のペプチドすべてに対する遺伝子源の発現プロフィールは（ＰＴＰＲＺ１）、遺伝子が正常組織中で非常に低いレベルで発現されるか否かには関係なく、神経膠芽細胞腫の腫瘍細胞中で高く発現することを示している。

【0181】

実施例３：
ＭＨＣクラスＩ 提示ペプチドのin vitro免疫原性
CD8+ T 細胞のin vitroプライミング
ペプチドーＭＨＣ複合体（pMHC）と抗ＣＤ２８抗体を装填した人工抗原提示細胞（aAPC）による in vitro 刺激を実行するために、本発明者はまず、標準密度勾配による分離溶媒（PAA, Colbe, Germany）を使って、新鮮なHLA-A^*02+ 軟膜からＰＢＭＣを単離した。 軟膜はKatharinenhospital Stuttgartから得た。 １０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（TCM）で補給されたＲＰＭＩ−グルタマックス（Invitrogen, Karlsruhe, Germany）、100 U/ml ペニシリン / 100 μg/ml ストレプトマイシン (Cambrex, Verviers, Belgium)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（CC Pro, Neustadt, Germany）、おょび２０μｇｍｌ／ゲンタマイシン（Cambrex）で構成される、ヒトin vitroプライミングを行うため、単離ＰＢＭＣを、Ｔ細胞培地（TCM）で一晩インキュベートした。 ＣＤ８陽性リンパ球を、製造業者の指示に従ってＣＤ８陽性ＭＡＣＳ陽性分離キット（Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany）を用いて単離した。 得られたCD8陽性細胞は、2.5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germany) 及び 10 U/ml IL-2 (Chiron, Munich, Gemany)で補給されたＴＣＭ中で使用するまで、インキュベートした。 pMHC/抗-CD28 被覆ビーズ、Ｔ細胞刺激及び読み出しなどの生成は、僅かな改変をして前述した通り（Walter et al., 2003）に実施した。 簡単にいうと、膜貫通型ドメインを欠きカルボキシル末端重鎖でビオチン化された、ビオチン化組み換え HLA-A^*0201 分子が、記述した方法（Altman et al., 1996）に従い生成された。 精製した共刺激マウス IgG2a 抗ヒト CD28 Ab 9.3（Jung et al., 1987）は、製造業者が推奨するように、スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドビオチンで化学的にビオチン化された。 使用したビーズは、サイズ 5.60 μm のストレプタビジン被覆ポリスチレン粒子（Bangs Laboratories, Illinois/USA）である。
陽性と陰性コントロールとして使用したｐＭＨＣは、それぞれ、A^*0201/MLA-001（改変Melan-A/MART-1から得たペプチドELAGIGILTV）とA^*0201/DDX5-001 (DDX5から得たYLLPAIVHI) である。

【0182】

ビーズ 800.000 個/ 200 μl を、600 ng ビオチン抗CD28＋200 ng 関連ビオチンーpMHC（高密度ビーズ）あるいは、2 ng 関連ビオチン＋200 ng非関連 MHC （低密度ビーズ）の存在下96ウェルプレート中で被覆した。 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) で補給された 200 μl TCM 中で 2x10⁵ 洗浄済み被覆ビーズと共に 1x10⁶ CD8+ T 細胞を、37°Cで3〜4日間共インキュベートして、刺激を開始した。

【0183】

続いて、培地の半分を 80 U/ml IL-2 で補給された新鮮な TCM で交換し、インキュベーションは 37°Cで3〜4日間続けた。 この刺激サイクルを合計３回実施した。 最後に、四量体分析を、 FACSCaliburまたはLSR IIフロサイトメーター（BD）で、蛍光ＭＨＣ四量体（Altman et al., 1996の記載方法により生成）＋抗体 CD8-FITC クローン SK1 （D, Heidelberg, Germany）を用いて実施した。 ペプチド特異的細胞を CD8+ T 細胞の合計パーセントとして計算した。 四量体分析の評価を、ソフトウェア FCS Express (De Novo Software)を用いて行った。 特定な四量体＋CD8＋リンパ球のin vitro プライミングを、適切なゲート開閉と陰性コントロール刺激との比較によって、検出した。 一名の健常ドナーでin vitro で刺激された評価可能な少なくとも1つのウェルに、in vitro 刺激後 特異的なCD8+ T細胞株を含んでいることが発見される場合は（すなわち、このウェルがCD8+ T細胞中に少なくとも１％の特異的四量体＋を含んでおり、特異的四量体＋細胞のパーセントが陰性コントロール中央値の少なくとも１０倍であった場合）、特定抗原の免疫原性が検出された。

【0184】

PTP-002 やPTP-001 に特異的なＴ細胞株 の発生を示す代表を図３に示す。 結果は、 CHI-001に関する類似結果と共に以下の表3に要約されている。

【0185】

【表3】

【0186】

発明者と出願人Immaticsによって実施されたin vitro免疫原性実験の結果である、陽性試験ドナー数とウェル数の割合を、この表に要約する。 この結果は高密度ビーズで CD8+ を刺激することにより得られたものである。 異なるヒト血清ロットが免疫原性の結果に大きな影響を与える可能性があるので、1つあるいは同一血清ロットが使用されるアッセイのみ一緒に評価した。

【0187】

実施例４：
HLA クラスI 限定ペプチドの HLA-A^*0201への結合
この分析の目的は、HLA class I ペプチドPTP-001, PTP-002, PTP-003, PTP-004 及び PTP-005 のHLA-A*0201MHC分子によってコードされMHC分子への親和性を評価することであった。 すべてのペプチドの HLA-A^*0201 に対する親和性は、周知のコントロールペプチド HBV-001に匹敵し、溶解定数（KD）は 0.02 から 1.6 nMの範囲であった。

【0188】

試験の原理
安定なＨＬＡ／ペプチド複合体は、ＨＬＡ重鎖、ベータ２ミクログロブリン（b2m）、及びペプチド性リガンドの３つの分子から構成される。 変性組み換えHLA-A^*0201 重鎖分子単独の活性は、その重鎖分子に「空の HLA-A^*0201分子」と同等な機能を与えながら維持することができる。 これらの分子は、ｂ２ｍと適切なペプチドを含んだ水溶液バッファで希釈すると、完全にペプチド依存様式で迅速に効率よく折り重なる。 これらの分子の利用性はＥＬＩＳＡに基づくアッセイで使用され、ペプチドとＨＬＡクラスＩ分子間の相互作用の親和性を測定する（Sylvester-Hvid et al., 2002）。

【0189】

精製された組み換えHLA-A^*0201分子は、ｂ２ｍと共にインキュベートされ、関心のあるペプチドの用量に段階分けされた。 新規折りたたみＨＬＡ／ペプチド複合体量は、定量的ＥＬＩＳＡ法で測定された。 解離定数（KD 値）は、較正物質であるＨＬＡ／ペプチド複合物の解離数から得た標準曲線を用いて計算された。

【0190】

結果は、図４に示した。 KD が低いとHLA-A^*0201への親和性は高くなる。 すべてのペプチドの HLA-A^*0201に対する親和性は、周知のコントロールペプチド HBV-001に匹敵し、溶解定数（KD）は 0.02 から 1.6 nMの範囲であった。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]