特許 5738561 新規環状バクテリオシン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5738561

(24)【登録日】2015年5月1日

(45)【発行日】2015年6月24日

(54)【発明の名称】新規環状バクテリオシン

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/195 20060101AFI20150604BHJP

   C12P 21/04 20060101ALI20150604BHJP

   A23L 3/3526 20060101ALI20150604BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20150604BHJP

   A23B 7/10 20060101ALN20150604BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20150604BHJP

   C12R 1/01 20060101ALN20150604BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/195ZNA

   C12P21/04

   A23L3/3526 501

   C12N1/20 A

   !A23B7/10 A

   !C12N15/00 A

   C12N1/20 A

   C12R1:01

【請求項の数】6

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2010-212838(P2010-212838)

(22)【出願日】2010年9月22日

(65)【公開番号】特開2012-67034(P2012-67034A)

(43)【公開日】2012年4月5日

【審査請求日】2013年9月12日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-924

(73)【特許権者】

【識別番号】399061916

【氏名又は名称】東海漬物株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】100075409

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久一

(74)【代理人】

【識別番号】100129757

【弁理士】

【氏名又は名称】植木 久彦

(74)【代理人】

【識別番号】100115082

【弁理士】

【氏名又は名称】菅河 忠志

(74)【代理人】

【識別番号】100125243

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 浩彰

(72)【発明者】

【氏名】小野 浩

(72)【発明者】

【氏名】園元 謙二

(72)【発明者】

【氏名】善藤 威史

(72)【発明者】

【氏名】益田 時光

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 晴夫

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−０２９１３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Applied and Environmental Microbiology，２００９年，Vol.75,No.6，p.1552-1558

【文献】 食品と開発，２０１４年，Vol.49,No.4，p.4-6

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（１）または（２）の何れかの構造を有することを特徴とする環状バクテリオシン：
（１） 配列番号２のアミノ酸配列を有し、且つＮ末端のロイシンとＣ末端のトリプトファンが結合している環状ペプチド；
（２） 上記環状ペプチド（１）において、１以上、３以下のアミノ酸が欠失、置換または付加されたものであり、且つ抗菌活性を有する環状ペプチド。

【請求項2】

上記（１）の構造を有する請求項１に記載の環状バクテリオシン。

【請求項3】

分子量が６１１６±５０である請求項２に記載の環状バクテリオシン。

【請求項4】

請求項２〜３の何れかに記載の環状バクテリオシンを製造するための方法であって、
ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）を培養する工程；および、
得られた培養液から環状バクテリオシンを単離する工程
を含むことを特徴とする方法。

【請求項5】

食品を製造するための方法であって、
ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）を培養する工程；および、
得られた培養液に含まれる請求項２〜３の何れかに記載の環状バクテリオシンを食品原料に添加する工程
を含むことを特徴とする方法。

【請求項6】

ロイコノストック メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ） ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗菌活性を有する新規な環状バクテリオシン、当該環状バクテリオシンを産生することができる新規乳酸菌、かかる乳酸菌を用いた環状バクテリオシンの製造方法と食品の製造方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

流通する食品製品には、通常、保存中または保管中における変質や腐敗を防ぐために、防腐剤などが添加されている。食品に用いられる防腐剤としては、例えば、安息香酸やパラオキシ安息香酸エステル類、ソルビン酸などが知られている。

【0003】

しかし近年、健康志向の高まりなどにより防腐剤への関心も高まっており、その害に関心が寄せられるようになっている。実際、防腐剤は微生物の増殖を妨げたり死滅させるものであるため、生体に対する害は完全に否定することができず、染色体異常を引き起こしたり発がん性が指摘されるなどにより使用が禁止されたものもある。

【0004】

よって、その使用目的に応じた選択性を有する化合物が求められている。即ち、食味を損なったり生体に害を及ぼす有害菌には強い抗菌活性を示す一方で、食味や栄養価を高める有益菌や過剰に増殖しなければ食品や生体に害を与えない菌には、過剰な増殖を抑制したり、その増殖速度を低減するといった程度の抗菌活性を示す化合物があれば、非常に有用である。

【0005】

そのような化合物として、バクテリオシンに注目が集まっている。バクテリオシンは、主にその生産菌の類縁菌に対して抗菌活性を示すペプチドであり、抗生物質などに比して耐性菌を誘導し難く、生体内で分解され易いため安全性に優れるものである。バクテリオシンの中でも乳酸菌であるＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓが産生するナイシンは、５０ヶ国以上で食品添加物として認められており、我が国でも平成２１年３月に食品添加物として認可されている。しかし、添加すべき食品に応じた抗菌活性を有することが望ましいので、新規なバクテリオシンは常に求められている。

【0006】

上述したナイシンの他、乳酸菌が産生するバクテリオシンとしては、例えば、特許文献１〜１０に開示されているものがある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００４／０２９０８２号パンフレット

【特許文献2】国際公開第２００６／０３３３５２号パンフレット

【特許文献3】特表平８−５０３１４０号公報

【特許文献4】特表平１１−５１１６４８号公報

【特許文献5】特表２００１−５０３９７０号公報

【特許文献6】特開平６−９６９０号公報

【特許文献7】特開平９−１２１８７４号公報

【特許文献8】特開２００１−３３５５９７号公報

【特許文献9】特開２００３−３３９３７７号公報

【特許文献10】特開２０１０−２９１３０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述したように、安全性に優れる食品添加物としての利用が期待されるバクテリオシンは、既に様々なものが知られている。しかし、汎用食品添加物であるパラオキシ安息香酸エステル類などに比べて抗菌スペクトルが比較的狭い分、様々な食品に適用するため、新たなバクテリオシンは常に求められている。

【0009】

そこで本発明は、食品、特に浅漬などの漬物の賞味期間を延長できる新規な環状バクテリオシン、当該環状バクテリオシンを産生することができる新規乳酸菌、かかる乳酸菌を用いた環状バクテリオシンの製造方法と食品の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、浅漬の試作品の中に他の菌の増殖を阻害する乳酸菌が存在し、かかる乳酸菌が産生する抗菌物質が新規な環状バクテリオシンであることを見出して、本発明を完成した。

【0011】

本発明に係る環状バクテリオシンは、下記（１）または（２）の何れかの構造を有することを特徴とする：
（１） 配列番号２のアミノ酸配列を有し、且つＮ末端のロイシンとＣ末端のトリプトファンが結合している環状ペプチド；
（２） 上記環状ペプチド（１）において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたものであり、且つ抗菌活性を有する環状ペプチド。

【0012】

本発明に係る環状バクテリオシンとしては、上記（１）の構造を有するものがより好ましい。また、当該環状バクテリオシン（１）の分子量は、６１１６±５０である。

【0013】

本発明に係るバクテリオシンの製造方法は、上記環状バクテリオシンを製造するためのものであり、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）を培養する工程；および、培養液から環状バクテリオシンを単離する工程を含むことを特徴とする。

【0014】

本発明に係る食品の製造方法は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）を培養する工程；および、培養液に含まれる上記環状バクテリオシンを食品原料に添加する工程を含むことを特徴とする。

【0015】

本発明に係る新規乳酸菌は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−９２４）である。

【発明の効果】

【0016】

本発明に係る環状バクテリオシンは、食品、特に浅漬などの漬物の変敗菌の増殖を抑制することにより食品の食味、物性、外観などの品質を維持でき、賞味期間を延長することができ、無味無臭であり食品の味や香りに影響を与えず、さらに、消化酵素により容易に分解されるため安全性が高いといった利点を有する。また、本発明に係る新規乳酸菌を用いれば、このように高い効果を示す環状バクテリオシンを製造することができ、また、賞味期限が延長された食品を製造することができる。従って本発明は、近年における健康志向の高まりに応じた安全性を有しながらも、賞味期間が比較的長い食品の製造において、非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、本発明に係る乳酸菌の培養液に含まれる環状バクテリオシンのプロテアーゼ感受性を試験した結果を示す写真である。

【図2】図２は、本発明に係る乳酸菌の培養液に含まれる環状バクテリオシンのｐＨ安定性を試験した結果を示すグラフである。

【図3】図３は、本発明に係る乳酸菌の培養液に含まれる環状バクテリオシンの熱安定性を試験した結果を示すグラフである。

【図4】図４は、本発明に係る環状バクテリオシンの一次構造を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明に係る乳酸菌であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１は、下記のとおり寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 寄託機関の名称および宛名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
宛名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 寄託日： ２０１０年４月９日
（ｉｉｉ） 受託番号： ＮＩＴＥ Ｐ−９２４

【0019】

光学顕微鏡（オリンパス社製，製品名「ＣＫＸ４１」）を用いて観察した、ＴＫ４１４０１株の細胞形態、グラム染色性、胞子の有無、運動性の有無と、カタラーゼ反応性、グルコースの酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）、至適温度、至適ｐＨ、耐塩性の試験結果は、表１に示す通りである。

【0020】

【表1】

【0021】

また、ＴＫ４１４０１株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示す。

【0022】

以上の形態や性状、糖類資化性試験、１６ＳｒＤＮＡの結果より、ＴＫ４１４０１株は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ属に分類される乳酸菌であると結論付けられた。

【0023】

ＴＫ４１４０１株は、食品の変敗菌であるグラム陽性菌に対して優れた抗菌活性を示し、特に浅漬の変敗菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌を含むグラム陽性菌に対して広い抗菌活性を示す。また、ＴＫ４１４０１株が産生する抗菌成分は、ペプチドであるバクテリオシンである。よって、ＴＫ４１４０１株は人体にとり安全であり、流通食品の保存安定性を高め、賞味期限を延長するために用いることができる。

【0024】

本発明に係る乳酸菌は、環状バクテリオシンを分泌生産する。よって、本発明に係る環状バクテリオシンは、上記乳酸菌の培養液上清から単離することができる。

【0025】

本発明乳酸菌の培養条件は、適宜調整すればよい。例えば、培地としては、表２に示す組成を有する市販のＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）の他、バクテリオシンを添加しようとしている食品の水抽出物に、炭素栄養源や窒素栄養源などを添加したものを用いることができる。

【0026】

【表2】

【0027】

但し、菌体外へ分泌されたバクテリオシンを回収するという観点からは、液体培地を用いることが好ましい。また、培養温度は２０℃以上、４０℃以下程度の範囲で調整すればよく、培養時間は菌が十分に増殖できるまでとすればよいが、通常は１０時間以上、４８時間以下程度とすることができる。

【0028】

本発明乳酸菌を十分に培養した後は、遠心分離や濾過などにより菌体などの固形成分を培養液から除去する。

【0029】

さらに、クロマトグラフィーなどにより、バクテリオシンを単離すればよい。その条件などは、適宜調整すればよい。例えば、本発明に係るバクテリオシンはペプチドであることから、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを適宜組合わせることができる。また、最初に、透析などにより培地中の低分子を除去してもよい。最終的に、逆相クロマトグラフィーなどにより精製すればよく、また、本発明に係るバクテリオシンの分子量は明らかとなっていることから、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製してもよい。

【0030】

上記方法で得られる本発明に係る環状バクテリオシンは、大腸菌などのグラム陰性菌に対しては抗菌活性を示さないものの、グラム陽性菌に対しては幅広い抗菌活性を示し、特に浅漬の変敗菌に対して優れた抗菌活性を示す。なお、本発明に係るＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１は、自らが産生するバクテリオシンに対して耐性を示す。

【0031】

本発明に係る環状バクテリオシンは、（１）配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）のアミノ酸配列を有し、且つＮ末端のロイシンとＣ末端のトリプトファンが結合している環状ペプチド；または、（２）上記環状ペプチド（１）において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたものであり、且つ抗菌活性を有する環状ペプチドである。

【0032】

上記環状ペプチド（２）において、欠失、置換または付加されるアミノ酸の数としては、１以上、１０以下が好ましく、１以上、５以下がより好ましく、１以上、３以下がさらに好ましく、１以上、２以下が特に好ましい。

【0033】

上記環状ペプチド（２）において、アミノ酸が置換される場合には、同じカテゴリーに分類され、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換であれば、より多く置換が許容される。かかるカテゴリーとしては、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、分枝アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、含硫アミノ酸、イミノ酸、芳香族アミノ酸などを挙げることができる。

【0034】

上記環状ペプチド（２）において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加される場合には、環状ペプチド（１）との同一性が５０％以上であることが好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。なお、アミノ酸配列の同一性に関する検索や解析は、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＣｌｕｓｔａｌＷなど、当業者に公知のアルゴリズムやプログラムを用いて行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適宜設定することができ、また、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの検索方法や解析方法の具体的な手法もまた、当業者にとり公知である。

【0035】

なお、当業者であれば、公知の手段や条件を適宜調整することにより、上記環状ペプチド（２）など特定のアミノ酸配列や三次元構造のペプチドを調製することは可能である。

【0036】

上記環状ペプチド（２）において、「抗菌活性を有する」とは、例えば、後述する実施例２で用いた検定菌のうち、少なくとも１の細菌に対して、Ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法において抗菌活性を示すことをいう。抗菌活性のより具体的な評価方法は、後述する実施例２を参照すればよい。

【0037】

マススペクトルにより測定された本発明に係る環状バクテリオシン（１）の分子量は６１１６．６０であった。しかし、本発明に係る環状バクテリオシンはペプチドであるので、測定誤差などを考慮して、本発明に係る環状バクテリオシン（１）の分子量は６１１０±５０とする。

【0038】

上記で説明したＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１の培養液、また、当該培養液から単離された環状バクテリオシンは、食品原料に添加することにより、食品の賞味期間を延長することができる。即ち、上記培養液に含まれる環状バクテリオシンは、培養液から単離した上で食品原料に添加してもよいし、培養液に含まれた状態で添加してもよい。

【0039】

例えば、食品の製造の際、その調味液に上記培養液や環状バクテリオシンを添加すればよい。当該調味液は、食品原料に浸透させた後にそのまま製品にしてもよいし、過剰分を除去した上で製品にしてもよい。なお、上記培養液や環状バクテリオシンの添加量は、食品の賞味期間を十分に延長できる範囲で予備実験などにより決定すればよい。

【実施例】

【0040】

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

【0041】

実施例１ 本発明に係るバクテリオシン産生菌の同定
（１） 本発明に係るバクテリオシン産生菌の単離
赤カブの浅漬試作品の保存中における細菌の有無を確認するために、調味液試料を適宜希釈し、ＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ＋１．２ｗ／ｖ％ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ社製）を用い、３０℃で４８時間培養した。その結果、培地にはクリアゾーンが確認された。このクリアゾーンの中心には菌が生育していたことから、その菌がバクテリオシンを産生しているのではと考え、先ずは当該菌の単離を試みた。具体的には、上記ＭＲＳ寒天培地から、クリアゾーンに生育している４菌株をＭＲＳ液体培地へ植菌し、３０℃で４８時間培養した。次いで、各菌株を顕微鏡観察し、培地のｐＨを測定し、また、ガス発生の有無とカタラーゼ反応の有無を調べた。顕微鏡観察の結果、４菌株は全て球菌であった。その他の結果を表３に示す。

【0042】

【表3】

【0043】

上記結果のとおり、４菌株は全て球菌であり、また、培地ｐＨを低下させ、カタラーゼ反応を示さず、且つガスを発生していることから、４菌株ともヘテロ乳酸菌である可能性が高いと判断された。

【0044】

（２） 本発明に係るバクテリオシン産生菌の同定１
ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用い、上記菌株１のゲノムＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡを増幅した。増幅された１６ＳｒＤＮＡを精製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりその塩基配列を解析した。塩基配列を、配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示す。

【0045】

ＤＮＡ塩基配列データベースアポロンＤＢ−ＢＡ４．０（テクノスルガ・ラボ）と国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）により、得られた１６ＳｒＤＮＡの塩基配列と既知菌株の１６ＳｒＤＮＡ塩基配列との相同性を解析したところ、乳酸菌であるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ ＮＲＩＣ １５３９株と１００％、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＮＣＤＯ ５２３株と１００％、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＮＣＤＯ ５４３株と９９．９％の相同性が見られたことから、上記菌株１はＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属すると決定した。

【0046】

（３） 本発明に係るバクテリオシン産生菌の同定２
ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ ｋｉｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製，フランス）を用いて、上記菌株１〜４の糖類資化性試験を行った。本キット付属のマニュアルに従い、２４時間および４８時間経過後に、糖類資化性試験の結果を記録した。その結果、上記菌株１〜４の糖類資化性は全て同一であった。具体的な結果を表４に示す。

【0047】

【表4】

【0048】

上記の糖類資化性試験の結果をＡＰＩＬＡＢ Ｐｌｕｓソフトウェアで解析したところ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ／ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ２と９９．９％の相同性が見られた。以上の結果より、上記菌株１〜４は全て同じ菌であり、また、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓに属すると決定した。なお、上記菌株１は、（独）製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、菌株名：Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１で寄託した。

【0049】

実施例２ 本発明に係るバクテリオシン産生菌の抗菌活性の確認
上記菌株１を、市販のＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）にて、３０℃で２４時間培養した。培養後、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、培養液の上清を得た。得られた上清を、孔径０．４５μｍのメンブランフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製，ＤＩＳＭＩＣ−２５ｃｓ）を用いてフィルター滅菌した。

【0050】

上記上清を用い、Ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法で抗菌活性試験を行った。はじめに、上記ＭＲＳ液体培地に１．２ｗ／ｖ％の割合で寒天を加えたＭＲＳ寒天培地のプレートを調製した。次に、表５に示す組成を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ Ａｇａｒ ＡＯＡＣ（Ｄｉｆｃｏ社製）の４８．０ｇ／Ｌ水溶液を試験管に５ｍＬずつ分注し、加熱溶解後、その温度を５５℃に調節した。表６に示す検定菌をＭＲＳ液体培地または表７に示す組成を有するＴＳＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した後、上記水溶液に１ｖ／ｖ％接種し、上記ＭＲＳ寒天液体培地に重層した。

【0051】

【表5】

【0052】

【表6】

【0053】

【表7】

【0054】

重層した寒天培地が固化した後、５５℃に設定した恒温槽で１５分間乾燥させた。上記の菌株１の液体培養液上清を、０．１ｗ／ｗ％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（ナカライテスク社製，Ｔｗｅｅｎ８０）を含む滅菌蒸留水で２倍段階希釈し、その１０μＬを寒天培地上に滴下した。滴下した試料液が乾燥した後、表６に示す検定菌の最適培養温度で１８時間培養し、検定菌の生育阻止円が形成される最大希釈液を求めた。抗菌活性（ＡＵ／ｍＬ）は下記に示す式によって算出した。
抗菌活性（ＡＵ／ｍＬ）＝２ｎ（ＡＵ）／０．０１（ｍＬ）
［式中、ＡＵ：ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ，ｎ：希釈倍数］

【0055】

この方法では、抗菌活性が強いほど阻止円を形成する最大希釈倍数が大きくなるため、抗菌活性値が大きくなる。結果を表８に示す。

【0056】

【表8】

【0057】

上記結果のとおり、本発明に係るバクテリオシン産生菌は、グラム陰性菌であるＥ．ｃｏｌｉなどには効果を示さないが、浅漬の変敗菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属乳酸菌を含むグラム陽性菌に対して広い抗菌活性を示すことが分かった。

【0058】

実施例３ 本発明に係るバクテリオシンの性質の検討
（１） プロテアーゼ感受性
上記実施例２で得た培養液上清試料を用いて、本発明に係るバクテリオシンのプロテアーゼ感受性を試験した。プロテアーゼとしては、プロテアーゼＫ（Ｓｉｇｍａ社製，０．６ｕｎｉｔ／ｍｇ）を用いた。まず、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を調製し、ここへ３ｍｇ／ｍｌの濃度で上記酵素を溶解することにより酵素溶液を得た。当該酵素溶液に培養液上清を酵素溶液：培養液上清＝３：７（ｖ：ｖ）の割合で混合し、３７℃で１５時間処理した。次いで、１００℃で５分間の熱処理を行い、酵素を失活させた。これを用いて残存活性の測定を行った。測定は、検定菌としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｓａｋｅｉ ＪＣＭ １１５７とＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ＪＣＭ ２００５０を用い、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法によって測定した。また、コントロールとして５０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液：培養液上清を３：７（ｖ：ｖ）で混合し、且つ酵素処理しなかったものにつき、同様の測定を行った。結果を図１に示す。

【0059】

図１のとおり、本発明に係る菌株１の上清は、プロテアーゼで処理することで抗菌活性を失った。よって、本発明に係る抗菌成分は、ペプチドであるバクテリオシンであることが明らかとなった。

【0060】

（２） ｐＨ安定性
本発明に係るバクテリオシンのｐＨ安定性について検討した。上記実施例２で得た培養液上清試料のｐＨを、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液または１Ｍ塩酸により２．０から１２．０まで調整した。ｐＨ調整後、３７℃で１時間処理し、処理後に全てのサンプルのｐＨを６．０に調整した。得られた上清試料の抗菌活性を、検定菌としてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＪＣＭ ５８０５株を使用し、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法によって測定した。ｐＨ４．５での抗菌活性を基準とし、各ｐＨでの抗菌活性を相対値として算出した。また、バクテリオシンであるナイシンを産生するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ ＮＢＲＣ １２００７株を用い、同様の実験を行った。結果を図２に示す。

【0061】

図２のとおり、本発明に係るバクテリオシンは、既知のバクテリオシンであるナイシンに比して、塩基性ｐＨ環境下でも抗菌活性を維持できることが分かった。

【0062】

（３） 熱安定性
本発明に係るバクテリオシンの熱安定性について検討した。上記実施例２で得た培養液上清試料を、８０℃で１０分間、８０℃で３０分間、１００℃で１０分間、１００℃で３０分間、または１２１℃で１５分間、熱処理した。次いで、検定菌としてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ ＪＣＭ ５８０５株を使用し、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法によって、各熱処理後上清の抗菌活性を測定した。熱処理を実施しない対照区の抗菌活性を基準とし、各熱処理条件での抗菌活性を相対値として算出した。結果を図３に示す。

【0063】

図３のとおり、本発明に係るバクテリオシンは、既知のバクテリオシンであるナイシンに比して、熱安定性により優れることが明らかとなった。

【0064】

実施例４ 本発明に係るバクテリオシンの同定
（１） バクテリオシンの精製
上記菌株１（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１）をＭＲＳ液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製，１０００ｍＬ）にて３０℃で２４時間培養した。培養後、培地のｐＨを１Ｍ塩酸で３．０に調整し、次いで、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより培養液上清を得た。

【0065】

得られた培養液上清を、陽イオン交換クロマトグラフィーに供した。具体的には、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を、エコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製，Φ１．０×１０ｃｍ）に充填し、送液はＭｉｃｒｏ ｔｕｂｅ ｐｕｍｐ ＭＰ３（東京理化社製）を用いて行った。充填したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０，以下、「緩衝液Ａ」という）１００ｍＬで平衡化した後、上記上清を負荷した。次いで、緩衝液Ａ（１００ｍＬ）で洗浄した。その後、１Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液Ａ（５０ｍＬ）で活性画分を溶出し、分取した。次に、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うため、終濃度が１Ｍになるよう硫酸アンモニウムを活性画分に添加した。

【0066】

疎水性相互作用クロマトグラフィーの担体としては、エコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製，Φ１．０×５．０ｃｍ）に充填したＯｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６，以下、「緩衝液Ｂ」という）で洗浄した。１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂ（１００ｍＬ）でゲルを平衡化し、１Ｍ硫酸アンモニウムを溶解した上記活性画分を負荷した。次に、緩衝液Ｂ（５０ｍＬ）で洗浄し、７０ｖ／ｖ％エタノールを含む緩衝液Ｂで活性画分を溶出した。

【0067】

次に、得られた活性画分を逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供した。カラムとしてはＲｅｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣ（ＧＥヘルスケア社製，３ｍＬ）を使用し、溶離液としては、０．１ｖ／ｗ％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉＱ水（以下、「Ｃ液」という）と０．１ｖ／ｗ％ＴＦＡを含むアセトニトリル（関東化学社製，ＨＰＬＣ用）溶液（以下、「Ｄ液」という）の混合液を用いた。表９に示すＣ液とＤ液の濃度勾配により溶出し、フラクションコレクター（東京理化社製，ＳＦ２１００）にて活性画分を分取した。

【0068】

【表9】

【0069】

（２） バクテリオシンの分子量の測定
活性画分に含まれるバクテリオシンの分子量を、ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ法により測定した。具体的には、ＥＳＩ−ＴＯＦ／ＭＳ測定装置（日本分光社製，ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ ＡｃｃｕＴＯＦ）を用い、０．１ｖ／ｗ％ＴＦＡを含むアセトニトリル溶液を０．２ｍｌ／ｍｉｎで送液しながら、活性画分試料を３μＬ注入し、分子量を測定した。その結果、活性画分に含まれるバクテリオシンの分子量は、６１１６．６０であることが明らかとなった。既知のバクテリオシンで分子量が６１１６．６０のものは報告されていないことから、本発明に係るバクテリオシンは新規なものであることが示唆された。

【0070】

実施例５ 本発明に係るバクテリオシンの構造解析
（１） アミノ酸配列の一部の決定
上記実施例４（１）で精製されたバクテリオシンのアミノ酸配列を、プロテインシーケンサーにより決定しようとしたが、シーケンス反応は全く進行しなかった。

【0071】

シーケンス反応が進行しなかった原因として、両末端アミノ酸同士が結合した環状構造を有する可能性を考え、バクテリオシンをＢＮＰＳ−スカトール処理してから構造解析を行った。即ち、ＢＮＰＳ−スカトール処理によりトリプトファン残基のＣ末端を特異的に切断した後、得られたペプチド断片を上記実施例４（１）と同様の条件の逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。得られたペプチド断片の分子量を上記実施例４（２）と同様の条件で分子量を測定したところ、２４３７．２４であった。当該ペプチド断片のアミノ酸配列をプロテインシーケンサーにより決定したところ、配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の３８から６１番目に相当する部分であった。

【0072】

（２） バクテリオシンのアミノ酸配列の決定
上記実施例５（１）で決定されたアミノ酸配列の情報を基にして、本発明に係るバクテリオシンのアミノ酸配列を、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｅｓｔｅｄ ａｎｃｈｏｒ ＰＣＲとＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲにより決定した。

【0073】

具体的には、上記実施例１で単離したＴＫ４１４０１株の全ゲノムＤＮＡを、表１０に示す条件に従って、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＭｂｏＩ、ＳａｃＩまたはＸｂａＩにより断片化した。反応温度は３７℃、反応時間は一晩とし、また、制限酵素とバッファーは、ニッポンジーン社製のものを使用した。得られたＤＮＡ断片の中から上記実施例５（１）のアミノ酸配列をコードする遺伝子（以下、「構造遺伝子」という）を含む断片を選択し、ライゲーション試薬（東洋紡績社製，ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ）を用いてｐＵＣ１８ベクターにライゲーションした。なお、当該ライゲーション試薬の使用方法は説明書に従った。

【0074】

【表10】

【0075】

上記ライゲーションベクターを鋳型にし、上記構造遺伝子の末端配列を基に構築したプライマー（塩基配列を表１１に示す）と、ベクター由来のＭｕｐ−１３プライマー（塩基配列を表１２に示す）を用いてＰＣＲを行い、上記構造遺伝子を含み、さらに下流の上記断片を含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲの反応条件を表１３に、反応液の組成を表１４に示す。

【0076】

【表11】

【0077】

【表12】

【0078】

【表13】

【0079】

【表14】

【0080】

また、上記と同様の反応条件および反応液組成で、得られたＰＣＲ産物を鋳型として、同じく上記構造遺伝子の末端配列を基に構築したプライマー（塩基配列を表１５に示す）と、ベクター由来のＳ−Ｍ−１３プライマー（塩基配列を表１６に示す）を用い、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析することにより、上記構造遺伝子と、その先の下流領域の配列を決定した。

【0081】

【表15】

【0082】

【表16】

【0083】

さらに、得られた塩基配列を基にしてＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、上記構造遺伝子の完全な遺伝子配列を決定した。より詳しくは、上記表１０に示した条件に従って、ＴＫ４１４０１株の全ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＤｄｅＩ、ＤｒａＩ、ＤｐｎＩ、ＫｐｎＩまたはＳａｃＩにより断片化し、上記構造遺伝子を含む断片をセルフライゲーションさせた。上記ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｎｅｓｔｅｄ ａｎｃｈｏｒ ＰＣＲにより得られた上記構造遺伝子の塩基配列情報から、当該塩基配列に対応するフォワードプライマーとリバースプライマーを構築し、セルフライゲーションさせた環状ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。使用したプライマーの塩基配列を表１７に、ＰＣＲの反応条件を表１８に、反応液の組成を表１９に示す。

【0084】

【表17】

【0085】

【表18】

【0086】

【表19】

【0087】

得られたＰＣＲ産物の塩基配列を解析することにより、上記構造遺伝子の完全な遺伝子配列を決定した。さらに、得られた遺伝子配列情報から、本発明に係るバクテリオシンのアミノ酸配列を決定した。当該アミノ酸配列を、配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）として示す。また、上記実施例５（１）のとおり、本発明に係るバクテリオシンは断片化しなければ全くシーケンス反応が進行しなかったことと、配列番号２のペプチドの分子量から環状化するための脱水反応分の１８を引いた値が６１１５．１３であり、この理論値と実施例４（２）の実測値である６１１６．６０がほぼ一致したことから、本発明に係るバクテリオシンは末端のロイシンとトリプトファンが結合した環状ペプチドであることが強く示唆された。

【0088】

実施例６ 本発明に係るバクテリオシンの構造解析
本発明に係るバクテリオシンの酵素に対する安定性を試験することにより、その構造を検討した。具体的には、本発明に係るバクテリオシンを、ペプシン、α−キモトリプシン、トリプシン、カルボキシエンドペプチダーゼ、ライシルエンドペプチダーゼ、アスパラギンＮペプチダーゼ、プロテアーゼＫまたはＶ８−プロテアーゼで処理した上で、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ． ｓａｋｅｉ ＪＣＭ １１５７を検定菌とし、３７℃で４時間インキュベートした。

【0089】

その結果、ヒトの消化酵素であるペプシンとα−キモトリプシン、および切断箇所の特異性が低く且つペプチド切断能力の高いプロテアーゼＫで処理した場合には、抗菌活性が見られず、本発明に係るバクテリオシンが分解されていた。その他の酵素で処理した場合には抗菌活性は維持されており、バクテリオシンは分解されていないことが分かった。特に、ペプチドのＣ末端から切断するカルボキシエンドペプチダーゼでも分解されていないことから、本発明に係るバクテリオシンはＣ末端を有しない、即ち末端が結合されている環状構造であることが明らかとなった。図４に、本発明に係るバクテリオシンの一次構造を示す。

【0090】

実施例７ 本発明に係る環状バクテリオシンを用いた浅漬の製造
（１） バクテリオシン溶液の調製
培養液として、酵母エキス（ＢＤ社製）２．０ｗ／ｖ％、ブドウ糖１．０ｗ／ｖ％、酢酸ナトリウム０．２ｗ／ｖ％、クエン酸三ナトリウム０．５ｗ／ｖ％、リン酸水素二カリウム０．２ｗ／ｖ％を含む溶液を調製した。当該培養液（１０ｍＬ）に、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＴＫ４１４０１を植菌し、３０℃で２４時間培養した。培養後、４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより培養液上清を得た。得られた培養液上清を、孔径０．４５μｍのメンブランフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製，ＤＩＳＭＩＣ−２５ ｃｓ）でフィルター滅菌した。

【0091】

（２） 浅漬の製造
適度に切断した白菜１００質量部に対して４５質量部の１０ｗ／ｗ％食塩水を加え、これらと同質量の荷重を負荷することにより、２４時間下漬した。次いで、下漬された白菜を水切りした。別途、２．２ｗ／ｗ％食塩、１．０ｗ／ｗ％グルタミン酸ナトリウム、０．４ｗ／ｗ％グリシン、および１．０ｗ／ｗ％エタノールを含む浅漬調味液を調製した。得られた下漬白菜（４０ｇ）に浅漬調味液（４０ｇ）を加えて浅漬を製造した。その際、浅漬に対する濃度が１ｗ／ｗ％または２ｗ／ｗ％になるように上記培養液上清試料を添加した区（以下、それぞれ「１％添加区」と「２％添加区」という）、ナイシン（Ｓｉｇｍａ社製）を２００ＩＵ（５ｐｐｍ）添加した区（以下、「ナイシン添加区」という）および何も添加していない浅漬（以下、「コントロール区」という）の４区分のサンプルを作製した。

【0092】

これらを１０℃で保存し、実験開始時、および実験開始から２日後、５日後、７日後および９日後に、ｐＨの測定、酸度の測定、一般生菌数の測定、官能評価を実施した。官能評価は、試料を成人男性２名、成人女性１名に食べてもらい、試験開始直後の試料と食味が変わらない場合またはかえって食味が改善されている場合を５点、試験開始直後の試料より劣化してはいるが商品価値があるものを３点、到底食べられる状態ではないものを１点とし、５段階で評価を行った。結果を表２０に示す。

【0093】

【表20】

【0094】

上記結果のとおり、コントロール区ではｐＨの低下と酸度の上昇が見られたが、本発明に係るＴＫ４１４０１株の培養上清を添加した場合、それらが抑制されていることが示された。官能評価においても、コントロール区では９日間の保存により商品価値が無いほどの食味の低下が見られ、ＴＫ４１４０１株の培養上清を１ｖ／ｗ％添加した場合でも食味の低下が見られたが、２ｖ／ｗ％添加した場合には、ナイシンと同程度に、賞味期間を延長できることが示された。よって、本発明に係る環状バクテリオシンは、実際に食品のペプチド系保存料として用いられているナイシンと比較しても遜色ない抗菌活性を有することが証明された。

【図2】

【図3】

【図4】

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]