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特許5739326Ｂ細胞上でのＢＣＭＡタンパク発現レベル及び診断法における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5739326
(24)【登録日】2015年5月1日
(45)【発行日】2015年6月24日
(54)【発明の名称】Ｂ細胞上でのＢＣＭＡタンパク発現レベル及び診断法における使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/564 20060101AFI20150604BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20150604BHJP
【ＦＩ】
G01N33/564 B
G01N33/68ZNA
【請求項の数】11
【全頁数】46
(21)【出願番号】特願2011-506406(P2011-506406)
(86)(22)【出願日】2009年4月22日
(65)【公表番号】特表2011-523455(P2011-523455A)
(43)【公表日】2011年8月11日
(86)【国際出願番号】US2009041332
(87)【国際公開番号】WO2009132058
(87)【国際公開日】20091029
【審査請求日】2012年3月16日
(31)【優先権主張番号】61/047,869
(32)【優先日】2008年4月25日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】505222646
【氏名又は名称】ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】502457803
【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ ワシントン
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100077517
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 敬
(74)【代理人】
【識別番号】100087871
【弁理士】
【氏名又は名称】福本 積
(74)【代理人】
【識別番号】100087413
【弁理士】
【氏名又は名称】古賀 哲次
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】グロス，ジェーン エー．
(72)【発明者】
【氏名】エルコン，キース ビー．
(72)【発明者】
【氏名】ディロン，ステイシー アール．
【審査官】
三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】
米国特許第０７３７１３８８（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】
米国特許第０６７７４１０６（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】
特表２００９−５１７０４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Robert H. Carter, Hong Zhao, Ximeng Liu, et al.，Expression and Occupancy of BAFF-R on B Cells in Systemic Lupus Erythemadosus，Arthritis and Rheumatism，米国，２００５年，Vol. 52, No. 12, pp 3943-3954
【文献】
Min Yang, Hdenori Hase, Diana Legarda-Addison, et al.，B Cell Maturation Antigen, the Receptor for a Proliferation-Inducing Ligand and B Cell-Activating Factor of the TNF Family, Induces Antigen Presentation in B Cells，The Journal of Immunology，米国，２００５年，Vol. 175: 2814-2824
【文献】
Lai Guan Ng, Andrew P. R. Sutherland, Rebecca Newton, et al.，B Cell-Activating Factor Belonging to the TNF Family (BAFF)-R is the Principal BAFF Receptor Facilitating BAFF Costimulation of Circulating T and B Cells，The Journal of Immunology，米国，２００４年，Vol. 173: 807-817
【文献】
松下貴史 佐藤伸一，The role of BAFF in autoimmune diseases，日本臨床免疫学会会誌，日本，２００５年，Vol. 28, No. 5 333-342
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｇ０１Ｎ ３３／５６４
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関連する症状を有する個体の末梢血メモリーＢ細胞表面上の増加したＢＣＭＡタンパク質発現を検出する方法であって：
前記ＳＬＥに関連する症状を有する個体由来の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現の第一レベルを測定し、
該第一レベルと健常個体の末梢血メモリーＢ細胞の表面上に存在するＢＣＭＡタンパク質発現の第二レベルとを比較し、そして
該第一レベルが該第二レベルに較べて増加されていることを測定すること含んでなり、ここで増加したＢＣＭＡタンパク質発現がＳＬＥに関係することを特徴とする方法。
前記ＳＬＥに関連する症状を有する個体由来の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現の第一レベルを測定し、
該第一レベルと健常個体の末梢血メモリーＢ細胞の表面上に存在するＢＣＭＡタンパク質発現の第二レベルとを比較し、そして
該第一レベルが該第二レベルに較べて増加されていることを測定すること含んでなり、ここで増加したＢＣＭＡタンパク質発現がＳＬＥに関係することを特徴とする方法。
【請求項2】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対する薬物治療に反応する患者の可能性を予測する方法であって、患者の末梢血メモリーＢ細胞上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定することを含み、ここで上昇したＢＣＭＡタンパク質発現レベルの存在が、ＳＬＥに対する薬物治療に反応する患者の可能性の予測となることを特徴とする方法。
【請求項3】
前記薬物治療がＢＬｙＳアンタゴニスト投与を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＢＬｙＳアンタゴニストが、ＡＰＲＩＬアンタゴニスでもある、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
試験管内において、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関連する症状を有する個体の末梢血メモリーＢ細胞表面上の増加したＢＣＭＡタンパク質発現を検出する方法であって：
個体由来のテスト用生体試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し、
そのレベルと健常対照群由来の試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡのタンパク質発現レベルとを比較し；そして
テスト用生体試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルが対照試料中のレベルと比較して、増加しているかどうかを測定することを含んで成り、ここで増加したＢＣＭＡタンパク質発現が、ＳＬＥに関係することを特徴とする方法。
個体由来のテスト用生体試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し、
そのレベルと健常対照群由来の試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡのタンパク質発現レベルとを比較し；そして
テスト用生体試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルが対照試料中のレベルと比較して、増加しているかどうかを測定することを含んで成り、ここで増加したＢＣＭＡタンパク質発現が、ＳＬＥに関係することを特徴とする方法。
【請求項6】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と臨床的に診断された個体を治療するのに最も有効な治療計画を選択する、試験管内における方法であって：
末梢血メモリーＢ細胞上の上昇したＢＣＭＡタンパク質発現レベルの有無に対し、ＳＬＥと臨床的に診断された個体由来の生体試料を生体外で解析することを含んで成り、ここで上昇したＢＣＭＡタンパク質発現レベルの存在がＳＬＥの臨床的診断に関係することを特徴とする方法。
末梢血メモリーＢ細胞上の上昇したＢＣＭＡタンパク質発現レベルの有無に対し、ＳＬＥと臨床的に診断された個体由来の生体試料を生体外で解析することを含んで成り、ここで上昇したＢＣＭＡタンパク質発現レベルの存在がＳＬＥの臨床的診断に関係することを特徴とする方法。
【請求項7】
前記治療計画がＢＬｙＳアンタゴニストの使用を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ＢＬｙＳアンタゴニストがＡＰＲＩＬアンタゴニストでもある、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
試験管内において全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に対する薬物治療に反応する患者の可能性を予測する方法であって、患者由来の試料中の末梢血メモリーＢ細胞表面上のＢＣＭＡ発現レベルを測定することを含んで成り、ここで上昇した末梢血メモリーＢ細胞のＢＣＭＡレベルの存在が、ＳＬＥに対する薬物治療に反応する患者の可能性の予測となることを特徴とする方法。
【請求項10】
前記薬物治療がＢＬｙＳアンタゴニストを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＢＬｙＳアンタゴニストがＡＰＲＩＬアンタゴニストでもある、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
免疫応答時に生じる細胞の相互作用は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーを含む、いくつかの細胞表面受容体ファミリーメンバーによって制御されている。ＴＮＦＲファミリーは多数の膜内在性糖タンパク質受容体からなり、これらの多くはそのリガンドと共に、異なる造血細胞系列間での相互作用を制御する（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＴＮＦ Ｒｅｃｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ，７６：９５９−６２，１９９４；Ｃｏｓｍａｎ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １２：４４０−５５，１９９４）。
【0002】
このような受容体の１つが、非グリコシル化膜内在性Ｉ型タンパク質であり、好ましくは成熟Ｂリンパ球で発現されるＢＣＭＡである（Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０９３−１０６、１９９５）。ＢＣＭＡは細胞表面及び核周囲のゴルジ様構造に存在する。２９３細胞でＢＣＭＡの過剰発現により、ＮＦ−ｋａｐｐａ Ｂ、Ｅｌｋ−１、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−末端キナーゼ、及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼが活性化され、これによって細胞の生存及び増殖のためのシグナルが生じる（Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：１３２２−３０，２０００）。このような受容体の別なものに、ＴＡＣＩ、即ちＣＡＭＬタンパク質（膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ−相互作用因子）（ｖｏｎ Ｂｕｌｌｏｗ ａｎｄ Ｂｒａｍ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３８−４１，１９９７及びＷＩＰＯの公報ＷＯ９８／３９３６１）がある。ＴＡＣＩは膜結合型受容体であり、２つのシステイン‐リッチ偽反復を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内小胞に存在する膜内在性タンパク質のＣＡＭＬ（カルシウムモジュレータ及びサイクロフィリンリガンド）と相互作用する細胞質ドメインを有し、ＣＡＭＬはＪｕｒｋａｔ細胞で過剰発現されるとＮＦ−ＡＴ活性のコインデューサー（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ）となる。Ｂ細胞に発現するＴＮＦＲファミリー由来の３番目の受容体はＢＡＦＦ‐Ｒである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２１０８−１１，２００１）。この受容体のシグナル伝達もＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ受容体３（ＢＲ３）として知られており、転写因子ＮＦ−ｋａｐｐａＢ２／ｐ１００からｐ５２へのプロセシングを促進する。このカスケードは生理的にＢ細胞の生存、そして、それ故Ｂ細胞の成熟の進行に重要である（Ｃｌａｕｄｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：８９８−９，２００２；Ｋａｙａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１７：５１５−２４，２００２）。
【0003】
多数のＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストが開発されてきている。これらは、そのリガンドのファミリーメンバー受容体への結合を阻害し、Ｂ細胞の同時刺激、形質芽球及び形質細胞の生存、Ｉｇクラススイッチ、Ｂ細胞抗原提示細胞の機能増強、悪性Ｂ細胞の生存、Ｂ−１細胞機能の発達、Ｔ−１ステージ以降のＢ細胞の発達、そして完全な胚中心の形成を含むが、これらに限定されない結合結果を阻害するためである。これらの分子の幾つかは、Ｂ細胞上のＡＰＲＩＬ及び免疫システムの他の成分に結合し、その効果も阻害することができる（Ｄｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓ．５，２３５−２４６）。ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬ結合を妨げることでＢ細胞に影響するように開発されてきた分子には、Ｌｙｍｐｈｏｓｔａｔ−Ｂ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）のようなＢＬｙＳ抗体を含む（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４８，３２５３−３２６５及びＷＯ０２／０２６４１）；ＴＡＣＩ−Ｉｇのような受容体‐細胞外ドメイン／Ｆｃドメインは、１つの具体的な実施態様であるアタシセプト（米国出願特許第２００６００３４８５２号）、ＢＡＦＦ‐Ｒ‐Ｆｃ（ＷＯ０５／００００３５１）、及びＢＣＭＡ−Ｉｇ又は受容体細胞外ドメインを利用するその他の融合タンパク質が含まれる。別のクラスのＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬのアンタゴニストには、ＡＭＧ６２３、受容体の抗体、及びＷＯ０３／０３５８４６及びＷＯ０２／１６３１２に開示されたその他の分子のように、その受容体への結合を阻害するのにＢＬｙＳ結合能力に依存する他の分子が含まれる。
【0004】
統計的に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患に関与する、これらＴＮＦＲファミリーメンバーの細胞表面発現パターンをより詳細に同定する技術が必要とされている。このような情報は上記自己免疫疾患を発症する傾向を有するか、活動性疾患の状態の個体を同定するために、そして、これらの疾患のＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニスト治療に好ましい反応を示すであろう個体を同定するために重要である。本発明はこの必要性に応え、自己免疫疾患に関与する細胞表面発現パターン及びこの発現パターンの存在、即ち、健常対照と比較して自己免疫疾患に罹患する個体においてＢ細胞上のＢＣＭＡ発現増加を測定する診断テストを提供する。
【発明の概要】
【0005】
本発明はＢ細胞表面上のＴＮＦＲファミリーメンバーレベルをスクリーニングする方法を提供する。ＢＣＭＡレベルの上昇はＳＬＥのような自己免疫疾患と深く関わっていることが示されてきたので、この測定は診断アッセイとして有用である。このような診断は、ＳＬＥのような自己免疫活性に関わる病気に罹る個体の可能性を予測するのに有用である。
【0006】
自己免疫活性、例えばＳＬＥと診断されるような自己免疫活性を示す患者のＢ細胞上の高レベルＢＣＭＡを検出することで、その病気に治療効果が最も高いとわれる治療計画を選択することが可能になる。これらの治療計画は一般的に、ＢＬｙＳアンタゴニストの単独、又は別の医薬品である免疫抑制剤（ＭＭＦ又はＣｅｌｌｃｅｐｔ（登録商標）等）或いはＣＤ２０アンタゴニスト（リツキサン（登録商標）等）との組み合わせのどちらかで使用される。
【0007】
このように本発明は更に、臨床的に自己免疫疾患と診断された個体を治療するための方法を提供し、該方法は一般的に、細胞上の高レベルのＢＣＭＡを検出し、健常対照群のＢ細胞上で見られるレベルと比較し、そして臨床的に自己免疫疾患と診断された個体に最も効果的な治療計画を選択することを含む。Ｂ細胞上の高レベルのＢＣＭＡを検出することにより、特定の薬物治療、特にＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストに反応する患者の可能性を予測することもできる。このように本発明は更に、ＳＬＥのような自己免疫疾患の治療中にＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニスト（単独又は他の薬物との組み合わせの何れか）に反応する患者の可能性を予測する方法を提供する。
【0008】
具体的には、本発明は個体のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現増加を検出する方法であって、生体試料中で第１のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し、そして、そのレベルと健常個体のＢ細胞表面上に存在する第２のＢＣＭＡタンパク質発現レベルとを比較し、そして第１レベルが第２のレベルと比較して増加していることを測定することを含み、前記ＢＣＭＡタンパク質発現の増加は自己免疫疾患に関与する方法を記載する。本発明の自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、 炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択することができる。
【0009】
本発明は、臨床的に自己免疫疾患と診断された個体を治療するための方法も記載している。該方法は、臨床的に自己免疫疾患と診断された個体の生体試料を、そのＢ細胞上のＢＣＭＡタンパク質発現レベル上昇の有無について解析し、前記ＢＣＭＡタンパク質発現レベルが上昇していれば、自己免疫疾患として臨床的に診断され；そして、ＢＣＭＡタンパク質発現レベルの増加が関与する病気に罹患しているとして臨床的に診断された個体に最も効果的な治療計画を選択することを含む。治療計画にはＢＬｙＳアンタゴニストの投与を含み得る。そして、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬアンタゴニストにもなり得る。この方法において、自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択され得る。特に、自己免疫疾患はＳＬＥである。
【0010】
更に、本発明は自己免疫疾患の治療薬に反応する患者の可能性を予測する方法を記載している。該方法は患者のＢ細胞上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し、ＢＣＭＡタンパク質発現レベルの増加があれば、その疾患の治療薬に反応する患者の可能性を予測できる。自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択され得る。特に、自己免疫疾患はＳＬＥである。更に薬物治療を含み得る本発明の方法は、ＢＬｙＳアンタゴニストの投与を含み、そして、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬアンタゴニストでもよい。
【0011】
本発明は試験管内（in vitro)で、個体のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現増加を検出する方法も包含する。該方法は、個体のテスト用生体試料中のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し；そのレベルと健常対照群の試料中のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルとを比較し；そしてテスト用生体試料中のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルと対照群の試料中のレベルとを比較して、増加しているか否かを測定し；ここで前記ＢＣＭＡタンパク質発現増加が自己免疫疾患に関与することを含む。本方法における自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択され得る。特に、自己免疫疾患はＳＬＥである。
【0012】
別の実施態様では、本発明は試験管内で自己免疫疾患として臨床的に診断された個体を治療するのに最も効果的な治療計画を選択する方法を含む。該方法は、臨床的に自己免疫疾患と診断された個体の生体試料を、そのＢ細胞上のＢＣＭＡタンパク質発現レベル上昇の有無について生体外で解析し、前記ＢＣＭＡタンパク質発現レベルの上昇は、臨床的に自己免疫疾患として診断されることを含む。本方法では、治療計画にはＢＬｙＳアンタゴニストの使用を含むことが可能である。そして、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬアンタゴニストにもなり得る。自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択され得る。特に、自己免疫疾患はＳＬＥである。
【0013】
更に別の実施態様では、試験管内で自己免疫疾患の治療薬に反応する患者の可能性を予測する方法を含む。該方法は患者のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルを測定し；前記Ｂ細胞レベルが上昇していれば、その疾患の治療薬に反応する可能性を有する患者であることを予測できる。自己免疫疾患は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択され得る。特に、自己免疫疾患はＳＬＥである。本発明の薬物治療はＢＬｙＳアンタゴニストを含み、前記ＢＬｙＳアンタゴニストは、ＡＰＲＩＬアンタゴニストでもよい。
【0014】
最終的に、本発明はＢ細胞上のＢＣＭＡ発現レベルが上昇している患者の自己免疫疾患治療に使用するためのＢＬｙＳアンタゴニストを企図する。該アンタゴニストはＬｙｍｐｈｏｓｔａｔ‐ＢのようなＢＬｙＳ抗体でもよい。該アンタゴニストはＴＡＣＩ‐Ｉｇ、ＢＣＭＡ‐Ｉｇ、及びＢＡＦＦ‐Ｒ‐Ｉｇからなる群から選択される受容体‐細胞外ドメイン／Ｆｃドメイン融合タンパク質でもよい。特に、受容体‐細胞外ドメイン／Ｆｃドメイン融合タンパク質はアタシセプトのようなＴＡＣＩ−Ｉｇでもよい。
【0015】
本発明のこれら及び他の局面は、下記に更に十分に説明されるように本発明の詳細を読めば、当業者にとって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】ナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞及び形質芽球表面上に存在するＢＡＦＦ‐Ｒ、ＴＡＣＩ、及びＢＣＭＡのレベルを示す。
【図1B】全Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、メモリー細胞及び形質芽球におけるＢＡＦＦ−Ｒの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、健常対照群（ＨＣ）とエリテマトーデス患者（ＳＬＥ）とで比較したものをグラフに示す。
【図1C】全Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、メモリー細胞及び形質芽球におけるＴＡＣＩの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、健常対照群（ＨＣ）とエリテマトーデス患者（ＳＬＥ）とで比較したものをグラフに示す。
【図1D】全Ｂ細胞、ナイーブＢ細胞、メモリー細胞及び形質芽球におけるＢＣＭＡの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、健常対照群（ＨＣ）とエリテマトーデス患者（ＳＬＥ）で比較したものをグラフに示す。
【図2】図２の上段は全Ｂ細胞上のＢＡＦＦ‐Ｒ発現と血清ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡ）との間の反比例関係をグラフに示すが、ＢＡＦＦ‐Ｒ発現と、血清ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡ並びにＳＬＥＤＡＩスコア（疾患活動性）との間に統計学的に有意な相関関係はない。図２の下段は血清ＩｇＧ抗ｄｓＤＮＡとの間の反比例関係、及び血清ＢＡＦＦ（ＢＣＭＡ）並びにＳＬＥＤＡＩスコア（疾患活動性）との間の相関関係の欠如をグラフに示す。
【図3A】健常対照群とエリテマトーデス患者におけるＢＣＭＡ＋及びＢＣＭＡ−Ｂ細胞のＭＦＩとして測定された前方散乱光（ＦＳＣ）をグラフに示す。ＦＳＣはＢ細胞活性化の指標である。
【図3B】健常対照群（ＨＣ）とエリテマトーデス患者の両方において、ＢＣＭＡのＭＦＩ検出のためにＣＤ１９ｈｉｇｈ及びＣＤ１９ｌｏｗＢ細胞の比較結果を示す。
【図4A】ＢＣＭＡ＋細胞はＩｇＤ＋且つＩｇＭ＋であり、従ってクラススイッチを受けていないことを意味する結果を示す。エリテマトーデス患者のＢＣＭＡ＋細胞で見られるより高レベルのＣＤ８６、及び健常対照群とエリテマトーデス患者の両方で見られる相対的に低レベルのＣＤ８０も図示する。
【図4B】健常対照群に較べて、エリテマトーデス患者に見られるより高パーセンテージのＩｇＤ＋Ｂ細胞をグラフに示す。
【図5A】健常対照群及びエリテマトーデス患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を５‐カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＳＦＥ）で標識し、リガンドの存在下又は非存在下でＣｐＧとインキュベートした結果を示す。上段は形質芽球誘導（ＣＤ２７ｈｉｇｈ）を示し、下段はＢＣＭＡ誘導を示す。
【図5B】５Ａで開示された実験をグラフに示すが、増殖結果に焦点を当てている。
【図5C】上段はＢＣＭＡ増加を伴うＣＤ２７ｈｉｇｈ細胞の増加を図示する５Ａの実験から得られた結果をグラフに示す。下段は本実験で種々の誘導を行ったエリテマトーデス患者と健常対照群のＢＣＭＡのＭＦＩを示す。
【図5D】５Ａで開示された実験で保存されたＢ細胞のＩｇＧ及びＩｇＭ産生を開示する。
【図6A】ナイーブＢ細胞（ＣＤ２７ｎｅｇ）、メモリー細胞（ＣＤ２７ｐｏｓ）、及び形質芽球（ＣＤ２７ｈｉｇｈ）において、健常対照群とエリテマトーデス患者を比較して、ＢＣＭＡ陽性細胞のパーセンテージをグラフに示す。
【図6B】健常対照群とエリテマトーデス患者の細胞表面上でのＣＤ２７ｈｉｇｈ（形質芽球）対ＢＣＭＡをグラフに示す。
【図7】健常対照群対患者の、ＣＤ２７ｐｏｓ及びＣＤ２７ｎｅｇ細胞のＦＳＣのＭＦＩを記載する。
【図8A】ナイーブＢ細胞（ＣＤ２７ｎｅｇ）、メモリー細胞（ＣＤ２７ｐｏｓ）及び形質芽球（ＣＤ２７ｈｉｇｈ）において、健常対照群（ＨＣ）とエリテマトーデス患者（ＳＬＥ）で見られたＣＤ１９ｈｉｇｈＢ細胞のパーセンテージを示す。
【図8B】健常対照群とエリテマトーデス患者についてのＣＤ１９ｈｉｇｈＢ細胞及びＣＤ１９ｌｏｗＢ細胞のＭＦＩのチャートである。
【図9】健常対照群及びエリテマトーデス患者のＣＤ１９ｈｉｇｈ及びＣＤ１９ｌｏｗＢ細胞表面の上の（ＭＦＩによる）ＢＡＦＦ‐Ｒレベルを示す。
【図10】健常対照群及びエリテマトーデス患者のＭＦＩＣＤ１９ｈｉｇｈ及びＣＤ１９ｌｏｗＢ細胞表面の上の（ＭＦＩによる）ＴＡＣＩレベルを示す。
【0017】
発明の詳細な説明本発明はＢ細胞表面上のＴＮＦＲファミリーメンバーをスクリーニングするための方法、及び自己免疫疾患の存在の予測、並びに患者がＢＬｙＳアンタゴニスト治療に反応する可能性を予測するための情報の使用を提供する。本発明はＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルが上昇し、ＢＬｙＳアンタゴニストが選択的に前記細胞によるＩｇＧ産生を中和するという発見に基づく。この結果により、Ｂ細胞表面上のＢＣＭＡの増加を検出する診断アッセイの開発が可能となり、ここでより高レベルのＢＣＭＡがＳＬＥのような自己免疫疾患を伴い、そしてＢ細胞、つまりＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストのように中和する治療方法に、個体が良く反応するという可能性も予測され得る。
【0018】
本発明を説明する前に、本発明は記載された特定の実施態様に限定されず、当然のことながら、そのようなものとしての変更も可能であるということを理解すべきである。本明細書中で使用された専門用語は特定の実施態様のみを説明することを目的としており、限定されるもではないことを理解するべきである。何故なら、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されるからである。
【0019】
特に断りのない限り、本明細書中で使用された技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することを理解すべきである。本明細書中に記載されたものと同様か又は等価の方法及び材料のどれも、本発明の実施又は試験で使用され得るが、好ましい方法及び材料は、これから記載される。本明細書中で言及された文献の全ては、該文献が引用される方法及び／又は材料に関して、開示或いは記載するために参照することで本明細書に組み込まれる。
【0020】
本明細書中又は添付の請求項で使用されたように、単数形である「１つ（“ａ”）」、「及び（“ａｎｄ”）」、そして「その（“ｔｈｅ”）」は、文脈中で明らかに別の指示がない限り、複数の指示対象を含む。このように、例えば、「１つの多型という表現は、このような複数の多型を含み、「１つの核酸分子」という表現は、このような複数の核酸分子を含み、そして「その方法」という表現は、１つ又は複数の方法、方法の工程、及びこれらに相当し、当該技術分野の当業者にとって既知のもの等を含む。
【0021】
本明細書中で論じられる文献は、それらが本願の出願日前に公開されたということだけで記載されている。本明細書中には、本発明は先行技術であるという理由で、これらの文献に先行する資格が与えられないみなされるものではない。更に、記載された文献の日付は実際の発行日とは異なる可能性があり、独立に確認する必要があるかもしれない。
【0022】
定義本明細書中で使用されたように、「ＢＣＭＡ」という用語は、特に断りのない限り、一般的に遺伝子配列の野生型及び変位型の両方を指すものである。当該技術分野で一般的に使用される時、「遺伝子」という用語は５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、エクソン、イントロン、及び３’ＵＴＲを包含するゲノム領域について指すものである。個々のセグメントは、具体的には、例えば、プロモーター、コード領域等を指す。完全なＢＣＭＡタンパク質を提供するようなセグメントの組み合わせは、一般的にタンパク質コード領域を指す。ＢＣＭＡの核酸配列は公的に入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＢＣ０５８２９１）。ヒトゲノムには４種の主要なハプロタイプのＢＣＭＡ遺伝子があり、本発明の開示では、「ＢＣＭＡ」という用語は４種全てを包含することを意味する（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ．２：２７６−９，２００１）。
【0023】
「多型」という用語は、本明細書中で使用されるように、所定の領域のヌクレオチド又はアミノ酸配列を、別の個体の相同領域のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較した時の相違を指し、特に、同種個体間同士における所定領域のアミノ酸配列のヌクレオチドの相違を指す。多型は一般的に参照配列との関係で定義される。多型は単一ヌクレオチドの相違、２つ以上のヌクレオチド配列の相違、そして単一または複数のヌクレオチドの挿入、逆位及び欠失；同様に、単一アミノ酸の相違、２つ以上のアミノ酸配列の相違、そして単一または複数のアミノ酸の挿入、逆位及び欠失を含む。
【0024】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書中では同じ意味に用いられ、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体を指す。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はそれらの類似体を含んでも良い。ヌクレオチドは、どのような三次元構造を有しても良く、既知又は未知のあらゆる機能を有しても良い。「ポリヌクレオチド」という用語は、１本、２本及び３本の螺旋状分子を含む。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡの約５から約１００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。しかし、本願開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに対する上限はない。オリゴヌクレオチドはオリゴマー又はオリゴとしても知られ、遺伝子から単離されても良い。又は、当該技術分野の既知の方法により、化学的に合成されても良い。
【0025】
下記は、ポリヌクレオチドの非限定的な実施態様である：遺伝子、又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボゾーム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。核酸分子は改変核酸分子、例えばメチル化核酸分子及び核酸分子類似体を含んでも良い。プリンおよびプリミジンの類似体は当該技術分野で知られている。核酸は天然に生じるもの、例えばＤＮＡ又はＲＮＡでも良く、又は当該技術分野では既知の合成類似体でも良い。このような類似体は、アッセイ条件下で優れた安定性のためにプローブとして使用することが好ましい。骨格、糖又はヘテロ環塩基の変更を含む天然構造の改変は、細胞内安定性及び結合親和性を増加することが示されてきた。骨格化学の有用な変更にはホスホロチオエートがある；両方の非架橋酸素が、硫黄に置換されたホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステル及びボラノリン酸塩。アキラルリン酸塩誘導体は３’‐Ｏ’‐５’‐Ｓ‐ホスホロチオエート、３’‐Ｓ‐５’‐Ｏ‐ホスホロチオエート、３’‐ＣＨ２‐５’‐Ｏ‐ホスホン酸塩及び３’‐ＮＨ‐５’‐Ｏ‐ホスホロアミダイトを含む。ぺプチド核酸は全体のリボースリン酸ジエステル骨格をペプチド結合と置換する。
【0026】
糖修飾も安定性と親和性の増強のためにも利用される。デオキシリボースのαアノマーを使用しても良く、そしてその塩基は天然のβアノマーに関しては反転される。リボース糖の２’‐ＯＨは２’‐Ｏ-メチル又は２’‐Ｏ-アリル糖を形成するために変更されてもよく、これらは親和性を含むことなく分解抵抗性をもたらす。
【0027】
へテロ環塩基の修飾は、適当な塩基対を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンのデオキシウリジンへの置換が含まれる；デオキシシチジンの５‐メチル‐２’‐デオキシシチジン及び５‐ブロモ‐２’‐デオキシシチジンへの置換が含まれる。５‐プロピニル‐２’‐デオキシウリジン及び５‐プロピニル‐２’‐デオキシシチジンはデオキシチミジン及びデオキシシチジンと、それぞれ置換されると、親和性及び生物活性を増加することが示されてきた。
【0028】
本明細書中で同様に使われている「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸の重合体を指し、これらの重合体はコード又は非コードのアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸及び修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る。この用語は異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末にメチオニン残基を有するか又は有さない異種及び同種リーダー配列を有する融合物を含むが、これに限定されない融合タンパク質；免疫学的タグを付けたタンパク質；及び同様なものを含む。
【0029】
広義には、本明細書中で使用されるように「自己免疫疾患」という用語は、患者の免疫システムが１つ又は複数の患者自身タンパク質に対して好ましからざる免疫反応を生じる疾患を指す。自己免疫疾患の代表的な例は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ループス腎炎（ＬＮ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、 特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、 糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎を含む。
【0030】
「実質的に単離された」又は「単離された」ポリヌクレオチドは、天然では関与する配列が実質的に存在しないものである。実質的にないという意味は、天然で関与する物質の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして更に好ましくは少なくとも９０％が存在しないことを意味する。本明細書中で使用されるように、「単離された」ポリヌクレオチドは組換えポリヌクレオチドも意味し、その由来又は操作により：（１）天然で関与するポリヌクレオチドの全て又は一部関与しない、（２）天然で連結されているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結されるか、又は（３）天然では生じないものである。
【0031】
ハイブリダイゼーション反応は異なる「ストリンジェンシー」条件下で行われることが可能である。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを強める条件は、当該技術分野では周知であり公表されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）を参照のこと。適切な条件の例（ストリンジェンシーを強めるため）では、インンキュベーション温度は２５°Ｃ、３７°Ｃ、５０°Ｃ及び６８°Ｃ；バッファー濃度は、１０ＸＳＳＣ、６ＸＳＳＣ、１ＸＳＳＣ、０．１ＸＳＳＣ（ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣ１及び１５ｍＭクエン酸バッファー）及びその他のバッファーシステムを用いる同等なもの；ホルムアミド濃度が０％，２５％、５０％、及び７５％；インキュベーション時間は５分から２４時間；１、２回又はそれ以上の洗浄工程；洗浄インキュベーション時間は１、２又は１５分間；そして６ＸＳＳＣ、１ＸＳＳＣ、０．１ＸＳＳＣ又は脱イオン水の洗浄液を含む。ストリンジェント条件の例では、ハイブリダイゼーション及び洗浄は、５０°Ｃ又はそれ以上で０．１ＸＳＳＣ（９ｍＭ ＮａＣｌ／０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）中で行う。
【0032】
「Ｔm」はワトソン‐クリックの塩基対により逆平行方向に水素結合された相補鎖で作られたポリヌクレオチド二本鎖の５０％が、実験条件下で一本鎖に解離する摂氏度における温度である。Ｔmは標準式に従って予想してもよい：例えば、［Ｘ+］はｍｏｌ／Ｌで表されるカチオン濃度（通常ナトリウムイオン、Ｎａ+）；（％Ｇ／Ｃ）は二本鎖中の総残基に対するパーセントとしてのＧ及びＣ残基；（％Ｆ）は溶液中に存在するホルムアミド（ｗｔ／ｖｏｌ）；及びＬは二本鎖の各鎖に存在するヌクレオチドの数。
【0033】
ＤＮＡ/ＤＮＡ及びＤＮＡ/ＲＮＡハイブリダイゼーションの両方のためのストリジェント条件はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載され、参照することで本明細書中に組み込まれる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の７５２頁を参照のこと。
【0034】
「宿主細胞」という用語は、個体の細胞又は本発明のあらゆる組換えベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントになり得るか又はレシピエントである細胞培養を含む。宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含み、その子孫は天然の、偶然の又は計画的な変異及び／又は変化による本来の親細胞に対して完全に同一（形態又は完全なＤＮＡ相補体において)である必要はない。宿主細胞は生体内又は試験管内で、本発明の組換えベクター又はポリヌクレオチドでトランスフェクト又は感染させた細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」である。
【0035】
「特異的に結合する」という用語は、抗体結合の文脈において、特異的ポリペプチド、即ち、多型性ＢＣＭＡポリペプチドのエピトープに対する抗体の高結合力及び／又は高親和性結合を指す。特異的な多型性ＢＣＭＡポリペプチド上のエピトープ（本明細書中で「多型性のＢＣＭＡエピトープ」とも言われる）への抗体結合は、同じ抗体のその他のどのエピトープ、特に、対象となる特異的ポリペプチドとして関連する分子中又は同一試料中に存在し得るエピトープへの結合よりも強いことが好ましく、例えば、特異的ＢＣＭＡ多型性エピトープを、別のＢＣＭＡエピトープよりも強く結合するので、結合条件を調節することにより、抗体は殆ど例外なく特異的ＢＣＭＡ多型性エピトープに結合するが、その他のＢＣＭＡエピトープ及び多型性のエピトープを含まないその他のどのようなＢＣＭＡポリペプチドにも結合しない。対象となるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いがそれでも検出可能なレべル（例えば、対象となるポリペプチドに対して示される結合の１０％又はそれ以下）で、他のポリペプチドに結合することが可能である。このような弱い結合、又はバックグラウンド結合は、例えば適切な対照を用いることで、対象となる化合物又はポリペプチドに対する特異的抗体結合と容易に区別できる。一般に、１０7モル／ｌ又はそれ以上、好ましくは１０8モル／ｌ又はそれ以上の結合親和性を有する特異的ＢＣＭＡポリペプチドに結合する本発明の抗体が、特異的ＢＣＭＡポリペプチドに特異的に結合すると言われている。一般に、１０6モル／ｌ又はそれ以下の結合親和性を有する抗体は、現在使用されている従来方法を用いる検出可能なレベルでは抗原を結合しないという点で有用ではない。
【0036】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用されるように実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量存在するかもしれない天然に生じる可能性のある変異を除いて同一である。
【0037】
モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して抗体が作られる。更に、一般的に異なる決定基（エピトープ）に対して作られた異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して抗体が作られる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの培養によって合成され、他の免疫グロブリンの混入がない点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な集団から得られた抗体としての特徴を示し、特別な方法による抗体の産生を必要とするものとしてみなされない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法で作成されても良いし、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）で作成されても良い。「モノクローナ抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いるファージ抗体ライブラリから単離しても良い。
【0038】
本明細書中のモノクローナル抗体は、具体的には「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、その中で重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体中の、対応する配列と同一か又は相同であるか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する。一方、望ましい生物活性を示す限り、鎖の残りの部分は別の種に由来する抗体の対応する配列と同一か又は相同であるか、或いは別の抗体クラス又はサブクラス、及びこのような抗体のフラグメントに属する（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。キメラ抗体の作成方法は当該技術分野では既知である。
【0039】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形はキメラ免疫グロブリン、それらの免疫グロブリン鎖又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗体の抗原結合配列）であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む。
【0040】
ヒト化抗体は殆どの部分においてヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、その中のレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）残基は所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット又はウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）由来のＣＤＲ残基と置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体や移入されたＣＤＲには見られない残基を含むか、或いはフレームワーク配列を含んでも良い。これらの変更は抗体の能力を更に改善し、そして最大化するために行われる。一般にヒト化抗体は実質的に、少なくとも１つ、そして一般的には２つの可変領域の全てを含み、この中の全て又は実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに相当し、そして全て又は実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域に相当するが、このＦＲ領域は結合親和性を改善する１つ又は複数のアミノ酸置換を含んでも良い。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は一般に、Ｈ鎖では６個以上にはならず、L鎖では３個以上にならない。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの定常領域も含む。更に詳細は、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。ヒト化抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ抗体を含み、ここで抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを対象となる抗原で免疫することで産生された抗体に由来する。ヒト化抗体作成方法は、当該技術分野では既知である。
【0041】
ヒト抗体は、ファージ‐ディスプレイライブラリを含む当該技術分野の既知の種々の技術を用いて産生することができる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９1）；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．の技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用可できる。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）。
【0042】
本発明の結合抗体の「機能的フラグメント」はＢＬｙＳ、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ‐Ｒ、又はＢＣＭＡへの結合を保持するフラグメントであり、実質的に、それらが由来する無傷の完全鎖分子と同じ親和性を有し、そして本明細書中で記載されるような試験管内又は生体内でのアッセイで測定されるようにＢ細胞を枯渇させても良い。
【0043】
抗体の「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因するこれらの生物活性を指し、抗体のアイソタイプによって異なる。抗体のエフェクター機能の例には：Ｃｌｑ結合と補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；そしてＢ細胞活性が含まれる。
【0044】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は細胞傷害性の形態を指し、ここである種の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ)上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合した分泌性Ｉｇは、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が特異的に抗原保持標的細胞結合し、そしてその結果標的細胞を細胞毒で殺すことを可能にする。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、そしてこのような細胞殺傷には必ず必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃｙＲＩＩＩのみを発現する。一方、単球はＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ及びＦｃｙＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はＲａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ,Ａｎｎ.Ｒｅｖ.Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、試験管内でのＡＤＣＣアッセイを、例えば米国特許第５，５００,３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載されているように行ってもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末消血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代わりに或いは追加で、対象となる分子のＡＤＣＣ活性を、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２‐６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルのように生体内で評価してもよい良い。
【0045】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化による溶解は、補体系（Ｃｌｑ）の第一成分がそれらの同種抗原に結合される抗体（適当なサブクラス）へ結合されることによって開始される。補対活性を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【0046】
「単離された」抗体は、自然環境の成分から同定され、分離され及び／又は回収されたものである。自然環境の混入成分は、抗体の診断又は治療用途を妨げる物質である。そして、酵素、ホルモン及びその他のタンパク性又は非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施態様において、抗体は（１）Ｌｏｗｒｙの方法で測定されるように、抗体の９５重量％以上、そして最も好ましく９９重量％以上、（２）スピニングカップシークエネータの使用によりＮ末又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、又は(3)クマーシーブルー又は好ましくは銀染色を用いて還元又は非還元条件下でＳＤＳ‐ＰＡＧにより等質になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも一成分が存在しないので、ｉｎｓｉｔｕで組換え細胞内に抗体を含む。しかし、単離された抗体は、通常、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【0047】
「検出可能な標識化抗体」という用語は、結合された検出可能な標識を有する抗体（又はＢＣＭＡポリペプチド又はエピトープに対する結合特異性を保持する抗体フラグメント）を指す。検出可能な標識は、通常、化学結合で結合されるが、標識がポリペプチドである場合、別な方法として遺伝子工学技術により結合することが可能である。検出可能な標識化タンパク質の製造方法は、当該技術分野では既知である。検出可能な標識は、このように当該技術分野では既知の様々な標識から選択され、放射性同位体、蛍光色素分子、常磁性体標識、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、又は検出可能な信号（例えば放射線、蛍光色）又は標識の基質に暴露後検出可能な信号を発するその他の成分又は化合物を含むが、これに限定されない。各種の検出可能な標識／基質の組み合わせ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）抗体標識化方法、及び標識化抗体を用いる方法は、当該技術分野では周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， ｅｄｓ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照のこと）。
【0048】
「生体試料」は個体から得た各種の試料を包含し、そして診断又は監視アッセイで使用され得る。その定義として、血液及びその他の生体由来の液体試料、固体試料、例えば生検標本又はそれに由来する組織培養或いは細胞、そしてそれらの子孫を包含する。又、入手後、試薬による処理、可溶化、又はポリヌクレオチドのようなある成分の濃縮等のように、あらゆる方法で処理された試料も含む。「生体試料」という用語は臨床試料を包含し、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、及び組織試料も含む。
【0049】
本明細書中で使用されるように,「治療(treatment)」、「処置（treating）」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。その効果は疾病又は症状を完全に若しくは部分的に防ぐという点では予防的であり、及び／又は疾病及び／又は疾病に起因する副作用を部分的若しくは完全に治すという点では治療的である。本明細書中で使用されるように「治療」は哺乳類、特にヒトのあらゆる疾病に対する治療に及び、そして：（ａ）疾病に罹患しやすいが、罹患したという診断がまだされていない被検体において、その疾病が発症するのを防ぐこと；（ｂ）疾病を抑制、即ち、その進行を止めること；そして（ｃ）疾病を軽減、即ち、退行させることを含む。
【0050】
「免疫抑制薬」は免疫システムを妨げるあらゆる分子であり、そして外来又は自己抗原に対する反応を鈍らせる。シクロホスファミド（ＣＹＣ）及びミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）の２つが、そのような分子である。この用語は、免疫システムを下方制御する治療薬として有用なあらゆる薬物又は分子を包含することを意味する。
【0051】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は共有結合で結合された２つの部分を有するポリペプチドを指し、その部分は異なる特性を有するポリペプチドである。その特性は、試験管内又は生体内での活性のような生物学的な特性でもよく、又、標的分子への結合、反応の触媒など単純な化学又は物理的特性でも良い。この２つの部分は１つのペプチド結合によって、又は１つ若しくは複数のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して直接連結されてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは、お互いにリーディングフレーム内にある。
【0052】
「複合体」は、融合タンパク質を含むあらゆるハイブリッド分子、及びアミノ酸又はタンパク質部分並びに非タンパク質部分の両方を含む分子を指す。複合体は、例えば、組換えＤＮＡ技術、固相合成、液相合成、有機化学合成技術、又はこれらの技術の組み合わせを含む当分野において、様々な既知の技術により合成される。合成の選択は、生成される特定分子による。例えば、実際は全てが「タンパク質」ではないハイブリッド分子は、組換え技術と液相技術の組み合わせにより合成されてもよい。
【0053】
本明細書中で使用されるように、「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、異種タンパク質の結合特性と免疫グロブリン定常領域のエフェクター機能とを組み合わせた抗体様分子を指す。構造的に、Ｆｃ融合タンパク質は、抗体の抗原認識及び結合部位（即ち、「異種」）以外であり、そして免疫グロブリン定常領域である所望の結合特性を有するアミノ酸配列を含む。Ｆｃ融合タンパク質分子は通常、少なくとも受容体又はリガンドの結合部位を含む連続したアミノ酸配列を含む。Ｆｃ融タンパク質中の免疫グロブリン定常領域の配列はあらゆる免疫グロブリン、例えばＩｇＧ‐１、ＩｇＧ‐２、ＩｇＧ‐３、又はＩｇＧ‐４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ‐１及びＩｇＡ‐２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られる。例えば、本発明による有用なＦｃ融合タンパク質はポリペプチドであり、該ペプチドはＢＬｙＳ受容体の膜貫通部又は細胞質配列を有さない、ＢＬｙＳ受容体のＢＬｙＳ結合部分を含む。一実施態様において、ＢＡＦＦ‐Ｒ、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの細胞外ドメインは、免疫グロブリン配列の定常領域に融合される。
【0054】
本明細書中で殆ど同じ意味で使用される「個体」、「被検体」、及び「患者」という用語は哺乳類を指し、マウス、サル、ヒト、哺乳類の飼育動物（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）、哺乳類のスポーツ動物、及び哺乳類のペットが含まれるが、これに限定されない。
【0055】
「哺乳類」は、哺乳類として分類されるあらゆる動物を指し、ヒト、家畜及び飼育動物、ならびに動物園動物、スポーツ動物又ペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む。好ましくは、本明細書中の哺乳類はヒトである。
【0056】
ＢＣＭＡポリペプチドの検出本発明は、ＢＣＭＡポリペプチドの検出を可能にする。「ＢＣＭＡポリペプチド」という用語は、既知のＢＣＭＡポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされたアミノ酸配列を包含し、全長の天然ポリペプチド及びそれらのフラグメント、特に生物学的に活性なフラグメント及び／又は、例えば生物学的活性等を有する領域又はドメインのような機能的ドメインに相当するフラグメント；それらの抗原性フラグメント、及び本ポリペプチドと別のタンパク質又はそれらの一部との融合物を含む。ＢＣＭＡポリペプチドのアミノ酸配列が開示されている。（例えばＬａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：１１４７−１１５４，１９９４；Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１１：３８９７−３9０４（１９９２）；Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：１０９３−１１０６（１９９５）；及びＭａｄｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０：１６９３−１７０２（１９９８）を参照のこと。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは様々な材料、例えばヒト組織から、又は別の材料から、又は組換え及び／又は合成法により調製される材料から単離可能である。ＢＣＭＡポリペプチドの多型性は、一般的に参照配列と比較して定義づけられる。
【0057】
本明細書中で使用されるように「多型性のＢＣＭＡポリペプチド」は、ｉ）天然の多型性ＢＣＭＡポリペプチド、ｉｉ）多型性ＢＣＭＡポリペプチドフラグメント、ｉｉｉ）多型性ＢＣＭＡポリペプチドのポリペプチド類似体、ｉｖ）多型性ＢＣＭＡ ポリペプチドの変異体、ｖ）多型性ＢＣＭＡポリペプチドの免疫学的に活性なフラグメント；及びｖｉ）多型性ＢＣＭＡポリペプチドを含む融合タンパク質のアミノ酸配列を有する、組換え又は非組換えポリペプチドのアミノ酸配列を指す。本発明の多型性ＢＣＭＡポリペプチドは、生体試料から又は天然、合成、半合成又は組換えのあらゆる材料から得ることができる。
【0058】
「多型性ＢＣＭＡポリペプチド」又は「ＢＣＭＡポリペプチド」という用語は、少なくとも約５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも約１５アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、少なくとも約７５アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、又は最大で多型性ＢＣＭＡポリペプチドのポリペプチド全てを含むポリペプチドを包含する。いくつかの実施態様において、多型性ＢＣＭＡポリペプチドは、例えばＢ細胞の増殖及び試験管内アッセイでの免疫グロブリン産生を引き起こすポリペプチドのような生物活性を示す。ＢＣＭＡ生物活性のためのその他のアッセイは当該技術分野では既知であり、多型性ＢＣＭＡポリペプチドが生物活性を示すかどうかを測定するために使用可能であり、そしてもし必要であれば、ＢＣＭＡ生物活性を定量するために使用できる。ＢＣＭＡの生物学的アッセイは種々の文献、例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ．に記載されている。
【0059】
ＢＣＭＡポリペプチドは、あらゆる既知の方法又はそのような方法の組み合わせにより得ることが可能であり、これらには天然の材料からの単離；化学合成による産生；及び標準組換え技術による産生が含まれる。ＢＣＭＡポリペプチドは、例えば、固体支持体上で固定化されたＢＣＭＡポリペプチド特異的抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーを用い、生物材料から単離することができる。ポリペプチドは従来通り、発現目的によって原核生物又は真核生物中で発現されうる。タンパク質の大規模生産では、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような単細胞生物、バキュロウイルスベクターと併用する昆虫細胞、又は脊椎動物、特に哺乳類、例えばＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等のより高等な生物の細胞が発現宿主細胞として使用されうる。場合によっては、タンパク質が天然の折りたたみと翻訳後修飾の恩恵を受ける真核細胞で遺伝子を発現することが望ましい。ポリペプチドは、細胞培養上清又は細胞溶解物から、上記のアフィニティークロマトグラフィー方法又はアニオン交換／サイズ排除クロマトグラフィー方法を用いて、単離することができる。
【0060】
発現宿主の使用によって多量のタンパク質又はそれらのフラグメントが使用できるようになると共に、タンパク質が単離され、そして従来の方法に従って精製されうる。溶解物が発現宿主から調製され、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、又はその他の精製技術により精製される。単離されたタンパク質は抗体を産生するのに使用してもよく、その抗体は同様に、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ解析等の標準アッセイシステムを用いて、そのタンパク質の存在を検出するのに使用することもできる。
【0061】
ＢＣＭＡポリペプチドの調製以下のセクションでより詳細に説明される複数の使用法に加えて、ＢＣＭＡ核酸組成物はＢＣＭＡポリペプチドの全て又は一部を調製するのに使用される。ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又は全長の遺伝子を含む）は部分的又は完全な遺伝子産物を発現するために使用される。本ポリヌクレオチドを含むコンストラクトは合成により作成することができる。別な方法として、多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからなる遺伝子と完全なプラスミドの一段階アッセンブリ（ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｅｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ）が、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｔ．，Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９９５）１６４（１）：４９−５３により記載されている。この方法では、アセンブリＰＣＲ（多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）からの長いＤＮＡ配列の合成）が記載されている。この方法はＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７０：３８９−３９１）に由来し、そしてＤＮＡリガーセに依存しないが、代わりにＤＮＡポリメラーゼに依存して、アセンブリ工程の間に次第により長いＤＮＡフラグメントを形成する。適切なポリヌクレオチドのコンストラクトは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，に記載されている標準組換えＤＮＡ技術を用いて、および組換えＤＮＡ研究に関する米国ＨＨＳ、国立衛生研究所（ＮＩＨ）指針に記載されている現行規則の下で精製される。
【0062】
本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクター中にその分子を置くことで増殖させる。プラスミドを含む、ウイルス及び非ウイルスベクターが使用される。プラスミドの選択は、増殖が望まれる細胞の種類と増殖の目的による。ある種のベクターは所望のＤＮＡ配列を大量に増幅し作成するのに有用である。他のベクターは培養細胞での発現に適する。更に、他のベクターは、無傷の動物又は人の細胞内への導入や発現に適する。適切なベクターの選択は十分当該技術分野の技術にはいる。このような-ベクターの多くは市販されている。部分的又は全長のポリヌクレオチドは、一般的にベクター中の切断された制限酵素部位へＤＮＡのリガーゼ結合によってベクターに挿入される。別の方法として所望のヌクレオチド配列は、生体内での相同組み換えによって挿入される。一般的に、これはベクターと相同な領域を所望のヌクレオチド配列に隣接して結合することで達成される。相同領域は、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、又は例えば、相同領域と所望のヌクレオチド配列の両方を含むプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、付加される。
【0063】
発現のために、発現カセット又は発現システムを用いてもよい。本発明のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物は、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類及び哺乳類類を含むあらゆる簡便な発現システムで発現される。適切なベクター及び宿主細胞は米国特許第５，６５４，１７３に記載されている。発現ベクターでは、ＢＣＭＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、所望の発現タンパク質を得るのに適当な制御配列に連結される。これらはプロモーター（センス鎖の５’末端又はアンチセンス鎖の３’末端のどちらかに連結される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、及びインデューサーを含み得る。プロモーターは制御的又は構成的でもよい。場合によっては、組織特異的又は発生段階特異的プロモーターのように、条件的活性化プロモーターを使用することが望ましい。これらはベクターへ連結するために、上記技術を用いて所望のヌクレオチド配列に連結される。当該技術分野で既知のあらゆる技術が使用され得る。つまり、発現ベクターは誘導性又は構成的でもよい転写及び翻訳開始領域を提供し、そのコード領域が転写開始領域の転写制御下、及び転写及び翻訳停止領域下に操作可能に連結されている。これらの制御領域はＢＣＭＡ遺伝子にとって天然のもの又は外来性のものでもよい。
【0064】
発現ベクターは通常、プロモーター配列付近に位置する好都合な制限部位を有し、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を可能にする。発現宿主で作動する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは融合タンパク質産生に使用されてもよく、ここで外来性融合ペプチドは付加的な機能性、即ち、タンパク質合成の増加、安定性、規定の抗血清との反応性、例えばβ-ガラクトシダーゼの酵素マーカー等をもたらす。
【0065】
発現カセットは転写開始領域、遺伝子又はそれらのフラグメント及び、転写停止領域を含めて調製してもよい。特に対象となるのは機能的エピトープ又はドメインの発現を可能にする配列の使用であり、一般的に少なくとも約８アミノ酸の長さ、より一般的には少なくとも長さ約１５アミノ酸から約２５アミノ酸まで、そして最長で遺伝子の完全なオープンリーディングフレームまでである。ＤＮＡの導入後、コンストラクトを含む細胞は選択マーカーで選択され、増殖され、それから発現に使用される。
【0066】
ＢＣＭＡポリペプチドは、発現の目的によって従来方法に従い、原核生物又は真核生物で発現させてもよい。タンパク質の大規模産生では、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような単細胞生物、バキュロウイルスベクターと併用する昆虫細胞、又は脊椎動物、特に哺乳類、例えばＣＯＳ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ、アフリカツメガエル卵母細胞等のより高等な生物の細胞が発現宿主細胞として使用されてもよい。場合によっては、多型性ＢＣＭＡタンパク質が天然の折りたたみと翻訳後修飾の恩恵を受ける、真核細胞の多型性ＢＣＭＡの核酸分子を発現することが望ましい。小さなペプチドは研究室で合成可能である。完全なＢＣＭＡ配列のサブセットであるポリペプチドは、機能に重要なタンパク質部分を同定し、研究するために使用してもよい。
【0067】
対象となる特異的発現システムは、発現システム由来の細菌、酵母、昆虫細胞及び哺乳類細胞を含む。これらの各カテゴリーの代表的システムを以下に示す：
【0068】
細菌．細菌の発現システムは、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７５：６１５； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９） ２８１：５４４； Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７； ＥＰ０ ０３６，７７６；米国特許第４，５５１，４３３号； ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳＣＩ．（ＵＳＡ）（１９８３） ８０：２１−２５；及びＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：２６９に記載されたものを含む。
【0069】
酵母．酵母の発現システムは、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９７８）７５：１９２９；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３； Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２；Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２； Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５；Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８５）５：３３７６；米国特許第４，８３７，１４８号及び同第４，９２９，５５５号；Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６；Ｄａｖｉｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ：（１９８５）１０：４９；Ｂａｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．,Ｂｉｏｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８３） ２６：２０５−２２１；Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８４）８１：１４７０−１４７４；Ｋｅｌｌｙ ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９；ＥＰ ０ ２４４，２３４；及びＷＯ９１／００３５７に記載されたものを含む。
【0070】
昆虫細胞．昆虫の異種遺伝子の発現は、米国特許第４，７４５，０５１号；Ｆｒｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ.，「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，ｉｎ：Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６）（Ｗ． Ｄｏｅｒｆｉｅｒ，ｅｄ.）；ＥＰ ０ １２７，８３９；ＥＰ ０ １５５，４７６；及びＶｌａｋ ｅｔ ａｌ.，Ｊ． Ｇｅｎ. Ｖｉｒｏｌ.（１９８８）６９：７６５−７７６；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ.，Ａｎｎ．Ｒｅｖ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.（１９８８）４２：１７７；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：４０９；Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４；Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ.，Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：３１２９；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.（ＵＳＡ）（１９８５）８２：８８４４；Ｍｉｙａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ.，Ｇｅｎｅ（１９８７）５８：２７３；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ.，ＤＮＡ（１９８８）７：９９に記載されたように達成される。多数のバキュロウイルス株及び変異体、並びに対応する宿主由来の許容昆虫宿主細胞が、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７−５５，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６）８：２７７−２７９及びＭａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２−５９４に記載されている。
【0071】
哺乳類細胞．哺乳類の発現は、Ｄｉｊｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８５）４：７６１，Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８２）７９：６７７７，Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１及び米国特許第４，３９９，２１６号に記載されたように達成される。哺乳類発現の別の特徴は、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４，Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ.（１９８０）１０２：２５５,米国特許第４，７６７，７０４号，同第４，６５７，８６６号，同第４，９２７，７６２号，同第４，５６０，６５５号，ＷＯ９０／１０３４３０，ＷＯ８７／００１９５及び米国再発行特許第３０，９８５号に記載されたように助長される。
【0072】
上記宿主細胞、又は他の適当な宿主細胞或いは生物の何れも、本発明のポリヌクレオチド又は核酸を複製及び／又は発現するために使用されると、その結果の複製された核酸、ＲＮＡ、発現されたタンパク質又はポリペプチドは宿主細胞又は生物の生産物として本発明の範囲内に含まれる。産生物は当該技術分野で既知の適当な手段で回収される。
【0073】
選択されたポリヌクレオチドに一致する遺伝子が同定されると、その発現はその遺伝子が本来存在する細胞内で制御され得る。例えば、細胞の内因性遺伝子は、細胞内での遺伝子発現を少なくとも強化するのに十分な位置で細胞ゲノムに挿入された外来性制御配列で制御され得る。制御配列は、米国特許第５，６４１，６７０号及び同第５，７３３，７６１号に記載されるように相同組み換えによりゲノム内に組み込まれるように設計されてもよく、そしてこれらの開示は参照することにより本明細書中に組み込まれるか、又はＷＯ９９／１５６５０に記載されるように非相同組み換によりゲノム内で組みこまれるように設計されてもよく、そしてこれらの開示は参照することにより本明細書中に組み込まれる。本発明にはこのようなものとして、コードしている核酸それ自体の操作を伴わないＢＣＭＡタンパク質の産生も包含されるが、しかしその代わりに、上記の組み込まれた特許文献に記載されるように、所望のタンパク質をコードする遺伝子がすでに含まれる細胞ゲノム内への制御配列の組み込みを介する。
【0074】
ＢＣＭＡポリペプチに特異的な抗体の調製本発明は更に抗体、特にＢＣＭＡポリペプチドに特異的な単離された抗体の使用を包含し得る。本発明の抗体は、以下により詳細に記載されるように、各種の診断アッセイ又は治療において有用である。例えば、抗体は生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドレベルを検出及び／又は測定するために使用できる。
【0075】
本発明の単離されたＢＣＭＡポリペプチドは抗体産生に有用であり、ここで短いフラグメントは特定のポリペプチドに特異的な抗体を提供し、そして大きなフラグメント又はタンパク質全体はポリペプチド表面全体への抗体産生を可能にする。従って、本発明の方法はＢＣＭＡポリペプチド、又はその抗原性フラグメントを特異的に結合する単離された抗体を利用することができる。抗体は野生型又は変異体種に対して産生され得る。抗体は、これらのドメインに相当する単離されたペプチド又は天然タンパク質に対して産生され得る。抗体はあらゆる哺乳類のＢＣＭＡポリペプチド及び／又はペプチドフラグメントに対して産生され得る。１つの限定されない例として、酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ＢＣＭＡポリペプチドに対する所与のモノクローナル抗体の特異性を測定するのに使用できる。
【0076】
ＢＣＭＡポリペプチドは抗体産生に有用であり、ここでショートフラグメントは特定のポリペプチドに特異的な抗体を提供し、そして大フラグメント又はタンパク質全体はポリペプチド表面全体への抗体産生を可能にする。 本明細書中で使用されるように、「抗体」という用語はあらゆるアイソタイプの抗体、抗原への特異的結合を保持する抗体フラグメントを含み、これらはＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びＦｄフラグメント、このような抗体フラグメントを含む融合タンパク質、検出可能な標識化抗体、及びキメラ抗体を含むが、これに限定されない。抗体‐抗原相互作用の文脈において、「抗体特異性」は当該技術分野では十分に理解された用語であり、そして所与の抗体が所与の抗原に結合すること意味し、その結合は抗体により認識される抗原又はそのエピトープにより阻害され得るが、実質的に関連のない抗原には結合しない。特異的抗体結合を測定する方法は、当該技術分野の当業者には周知であり、そしてＢＣＭＡポリペプチドの抗体特異性を測定するのに使用ｄきる。具体的な実施態様では、ＢＣＭＡ抗体はＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する。 例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｍｏｌ Ｃａｎ Ｔｈｅｒ ６：３００９−１８を参照のこと。更に別の実施態様では、ＢＣＭＡ抗体はＢＣＭＡ細胞外ドメインに結合し、更にＢＣＭＡ活性を阻害する。ＢＣＭＡ抗体がＢＣＭＡ活性を阻害するかどうかを決定する方法が知られている。
【0077】
抗体は従来方法に従って調製され、ここで発現されたものはポリペプチド又はタンパク質であり、それ自体又はＫＬＨ、ｐｒｅ‐ＳＨＢｓＡｇ、その他のウイルス性又は真核性タンパク質等の既知の免疫源キャリアーとの複合体により免疫源として使用される。各種のアジュバントも一連の注射とともに、適切なものとして用いられる。モノクローナル抗体のために、１回又は複数回のブースター注射の後、脾臓が単離され、リンパ球は細胞融合によって不死化され、そして高親和性抗体結合に対するスクリーニングが行われる。不死化細胞、すなわち、所望の抗体を産生するハイブリドーマが増殖される。更に詳細はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８を参照のこと。必要に応じて、重鎖及び軽鎖をコードするｍＲＮＡが単離され、そしてＥ．ｃｏｌｉ中でクローニングすることで突然変異を起こさせてもよく、そして重鎖及び軽鎖を混合して、更に抗体親和性を増強する。抗体を産生させる方法として生体内での免疫化に代わるものには、通常、試験管内での親和性成熟を伴うファージディスプレイライブラリに対する結合が含まれる。
【0078】
抗体は直接又は間接的（例えばリンカー分子を介して）に、生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドの存在を決定及び／又は測定する診断アッセイに使用するための固体支持体に結合される。結合は通常共有結合であるが、それである必要はない。固体支持体はビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ等）；プラスチック表面(例えば、ポリスチレン又はＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で一般的に使用されるポリカーボネートマルチウェルプレート等)；ナイロン、ニトロセルロース等のシート；及びチップ、例えば、マイクロアレイで使用されるようなＳｉ０2チップを含むが、これに限定されない。従って、本発明は更に、固体支持体に結合された抗体を含むアッセイ装置を提供する。
【0079】
単一抗体又は一連の異なる抗体は、アッセイデバイスを作成するために使用され得る。そのようなアッセイ装置は、当該技術分野の当業者に既知の従来技術を用いて調製することができる。抗体は既知の技術を用いて精製、単離され、既知の手順を用いて支持体表面に結合され得る。その結果、その上に結合された抗体を有する表面は、例えば生体試料などのテスト試料を、１種又は複数種のＢＣＭＡポリペプチドを含むかどうかを決定するために生体外で使用され得る。例えば、特異的ＢＣＭＡエピトープにのみ結合する抗体は、物質の表面に結合され得る。或いは、複数の特異的抗体は、２つ又はそれ以上の異なるＢＣＭＡエピトープに特異的な抗体が固体支持体に結合されるアレイに配列されても良く、この特異的抗体を使用することができる。テスト用試料は物質表面に結合された抗体と接触させる。特異的結合はあらゆる既知の方法で検出可能である。もし特異的結合が検出されなければ、試料は特異的ＢＣＭＡエピトープを含んでいないと推定できる。特異的結合がどのように検出され得るのかという１つの限定されない例として、テスト用試料を固体支持体に結合された抗体と接触させたら、２番目の検出可能な標識化抗が添加され、固体支持体結合抗体により認識されるエピトープとは異なるＢＣＭＡエピトープを認識する。
【0080】
各種の試薬は、本明細書中に記載されたＢＣＭＡポリペプチド検出のために、アッセイに含まれてもよい。これらには、塩類、例えばアルブミンのような中性タンパク質、界面活性剤等のような試薬が含まれ、最適なタンパク質‐タンパク質結合を促進、及び／又は非特異的又はバックグラウンドの相互作用を減らすために使用される。アッセイの効率を改善する試薬、例えば、プロテアーセ阻害剤、抗菌剤等を使用してもよい。成分は、必要な結合を与えるためのあらゆる順番で添加される。インキュベーションは一般的に４°Ｃから４０°Ｃの間の、適切なあらゆる温度で行われる。インキュベーション時間は最適活性のために選択されるが、高速ハイスループットスクリーニングを促進するために最適化してもよい。一般的に、０．１から１時間の間で十分であろう。
【0081】
二重特異性抗体は、抗体少なくとも２つの異なるエピトープに対する特異的結合を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２つの異なるエピトープに結合する。別のこのような抗体は、第１のＢ細胞マーカーに結合し、更に第２のＢ細胞表面マーカーに結合し得る。或いは、抗Ｂ細胞マーカー結合腕は、細胞の防御機能をＢ細胞に集中させるために、Ｔ‐細胞受容体分子（例えばＣＤ２又はＣＤ３）、又はＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、FｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧ（ＦｃｙＲ）のためのＦｃ受容体のような白血球上のトリガー分子と結合する腕と組み合わされても良い。二重特異性抗体はＢ細胞に対する細胞傷害性薬剤を局在化するために使用しても良い。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合腕及び細胞傷害性薬剤（例えばサポニン、抗インターフェロン、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位元素ハプテン）を結合する腕を有する。
【0082】
二重特異性抗体は、全長の抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野では知られている。全長の二重特異性抗体の、従来の製造は２つの免疫グロブリン重鎖‐軽鎖対の同時発現に基づいており、この２本の鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。
【0083】
免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムな取り合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、これらのうちただ１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーの工程で処理されるが、むしろ扱いにくく、産生量は少ない。同様な手順がＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【0084】
別のアプローチによると、所望の結合特異性（抗体‐抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域内にあり、少なくともヒンジ部、ＣＨ２、及びＣＨ３領域を含む。少なくとも１つの融合物内に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、及び、必要であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時導入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）される。コンストラクト中で使用される３つのポリペプチド鎖が同等でない割合で最大の収量を与える時、これにより実施態様で３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調節するための大きな柔軟性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が同等の割合で高収量になる時又はその割合が特に重要ではない時、２又は３つ全てのポリペプチド鎖をコードする配列を１つの発現ベクターに挿入することは可能である。
【0085】
このアプローチの好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、１つの腕に第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方の腕にハイブリッド免疫グロブリンの重鎖‐軽鎖対（第二の結合特異性を与える)からなる。二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在することで、容易な分離方法を提供できることから、この非対称構造は望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物の分離を促進することが分かった。このアプローチはＷＯ９４/０４６９０に開示されている。二重特異性の抗体の作成について更に詳細には、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。米国特許第５，７３１，１６８号に記載された、別のアプローチによると、抗体分子対の間のインターフェースは、組み換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するように変更され得る。好ましいインターフェースは、少なくとも抗体定常領域のＣＨ３ドメインの一部を含む。この方法において、第一抗体分子のインターフェース由来の１つ又は複数の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置換される。大きな側鎖に対して同一又は同様なサイズの補正的「穴」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな物（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することにより、第二抗体分子のインターフェース上に作成される。これによって、ホモダイマーのような望ましくない最終生成物に対して、ヘテロダイマーの収量を増加させる機作を提供する。
【0086】
二重特異性抗体は架橋した又は「異種複合体」抗体を含む。例えば、異種複合体の抗体の１つはアビジンに、もう一方はビオチンに連結可能である。このような抗体は、例えば、免疫システム細胞が望ましくない細胞を標的とするため（米国特許第４，６７６，９８０号）、そしてＨＩＶ感染治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ ０３０８９）提唱されてきた。異種複合体抗体は、どのような利便な架橋結合方法を用いて作成されてもよい。適切な架橋剤は当該技術分野では周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に多くの架橋結合技術と共に開示されている。
【0087】
抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成する技術は、論文にも記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）は無傷の抗体をタンパク質分解により開裂し、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順を記載している。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウム存在下で還元され、近接するジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を抑制する。生成されたＦａｂ’フラグメントは、それからチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’‐ＴＮＢ誘導体はそれからメルカプトエタノールアミンで還元され、Ｆａｂ’‐チオールに再変換される。そして等モル量の別のＦａｂ’‐ＴＮＢ誘導体と混合され、二重特異性抗体を形成する。産生された二重特異性抗は、酵素の選択的固定のための薬剤として使用され得る。
【0088】
近年の進展により、化学的に結合され、二重特異性抗体を形成できるＥ.ｃｏｌｉからＦａｂ’‐ＳＨフラグメントを直接回収することが容易になった。Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ.，Ｊ.Ｅｘｐ. Ｍｅｄ.，１７５：２１７‐２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントはＥ.ｃｏｌｉから別々に分泌され、そして生体外で直接化学結合され、二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２受容体過剰発現細胞及び正常ヒトＴ細胞に結合し、そしてヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の細胞溶解活性を引き起こすことができた。
【0089】
二重特異性抗体フラグメントを組換え細胞培養から直接作成し単離する各種の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて産生することが可能である。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。
【0090】
抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、そしてそれから再酸化されて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は抗体ホモダイマー生産にも利用可能である。
【0091】
Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載された「二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作成する別の機作を提供している。フラグメントは、あまりにも短いので同一鎖上で２つの領域間での対を形成できないリンカーにより、軽鎖可変領域（ＶＬ）に連結された重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインと、別なフラグメントの相補的ＶＨ及びＶＬドメインとの間に強制的に対が形成され、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単一鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により、二重特異性抗体フラグメントを作成する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５２：５３６８（１９９４）を参照。２価を上回る抗体も考えられている。例えば、三重特異性抗体も調製化の可能である。Ｔｕｔｔｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【0092】
診断アッセイ本発明は更に、生体試料中のＢＣＭＡｍＲＮＡの存在及び／又はレベルを検出する方法；そして、生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドの存在及び／又はレベルを検出する方法を提供する。
【0093】
他の実施態様において、個体由来の生体試料中のＢＣＭＡｍＲＮＡのレベルを検出するための方法が提供され、ＢＣＭＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡレベルのために、個体由来のポリヌクレオチド試料を解析することを含む。ＢＣＭＡｍＲＮＡレベルは自己免疫疾患に関与する可能性がある。更に別の実施態様において、生体試料中のＢＣＭＡポリペプチドの存在及び／又はレベルを検出する方法を提供する。
【0094】
例えば、特定試料中のＢＣＭＡｍＲＮＡ、又はＢＣＭＡポリペプチド等、ＢＣＭＡ核酸分子の発現レベルを測定するために、多くの方法が利用できる。患者試料中の正常又は異常なＢＣＭＡｍＲＮＡの非存在又は存在又は変化量を測定するために、多くの方法で診断は行うことができる。例えば、検出は従来の方法に従って行われる、標識化抗体による細胞又は組織切片の染色を利用してもよい。細胞は細胞質分子を染色するために透過処理される。対象の抗体は細胞試料に添加され、エピトープへ結合するのに十分な時間、通常少なくとも約１０分間インキュベーションされる。抗体は放射性同位体、酵素、蛍光体、化学発光体、又は直接検出するための、その他の標識体で標識してもよい。又は、第二ステージの抗体又は試薬がシグナルを増幅するために使用される。このような試薬は当該技術分野では周知である。例えば、一次抗体はビオチンと結合させてもよく、そして第二ステージの試薬として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンが添加される。或いは、二次抗体は蛍光化合物、例えば フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、等に結合させた。最終検出はペルオキシダーゼ存在下で色が変化する基質を使用する。抗体結合の有無は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、Ｘ線写真、シンチレーション計測等を含む様々な方法で検出してもよい。ＢＣＭＡポリペプチドレベルの存在及び／又はレベルは当業者の知るどのような方法で検出及び／又は定量されてもよい。
【0095】
加えて、テストにはＢＣＭＡmＲＮＡの発現測定も含まれる。ＢＣＭＡコード領域又は制御領域の配列多型性が疾病に関与するかどうかを決定するために、生化学的調査を行ってもよい。
【0096】
多型性を伴う疾病には、遺伝子の欠失又は短縮化、発現レベルを変える変異、タンパク質活性に影響する変異等が含まれうる。
【0097】
ＢＣＭＡ発現レベルに影響し得るプロモーター又はエンハンサー配列の変化は、当該技術分野で既知の様々な方法により正常アレルの発現レベルと比較できる。プロモーター又はエンハンサー強度を測定する方法には、発現された天然タンパク質の定量；例えば、β‐ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等、簡便な定量法を提供するレポーター遺伝子を有するベクターへの変異体調節エレメントの挿入等；及びその他等が含まれる。
【0098】
ＢＣＭＡ遺伝子発現レベルが対象となる本発明の診断方法は、通常、対象のＢＣＭＡ核酸又はタンパク質量と対照の値とを比較して、あらゆる相対的差異を測定することを含み、ここで、試料中の差異は定性的及び／又は定量的であり、その差異は異常なＢＣＭＡ遺伝子発現パターンの存在の有無に関わる。試料中の核酸の存在を測定するための各種の異なる方法は当該技術分野の当業者には既知であり、対象となる特定の方法は：Ｐｉｅｔｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（Ｊｕｎｅ １９９６）６：４９２−５０３；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ（Ａｐｒ. ２４，１９９５）１５６：２０７−２１３；Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９７）８：５４２‐５４６；Ｒａｖａｌ， Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９４）３２：１２５−１２７；Ｃｈａｌｉｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｆｅｂ．１，１９９４）２１６：２９９−３０４；Ｓｔｏｌｚ ＆ Ｔｕａｎ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９６０ ６：２２５‐２３０；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９８２）２：９０７；そして、ＭｃＧｒａｗ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）１４３：２９８に記載されたものを含む。又、対象となるのはＷＯ９７／２７３１７に記載された方法であり、その開示は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【0099】
特定の生理的状態と「関連する」か又は「関わる」遺伝子の発現レベルにより、遺伝子の発現が統計的に生理的状態と有意な相関を有することが示される。異なった形で発現される遺伝子の発現レベルと特定の生理的状態の有無との間の相関は、統計的優位性検定によって決定され得る。異なった形で発現される遺伝子レベルと、統計学的スコアを前記相関に割り当てた特定の生理的状態との相関の強さを決定する方法は、Ｈｏｌｌｏｗａｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．３２：４８１−８９，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．３２：４９０−９５，Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．３２：４９６−５０１；Ｓｌｏｎｉｍ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．３２：５０２−０８；及びＣｈｕａｑｕｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．３２：５０９−５１４；で概説され、これらはその全体を参照することにより、本明細書中に組み込まれる。
【0100】
自己免疫疾患の重症度又は進行に関わる別のテストと、上記のＢＣＭＡテストを組み合わせて完全な診断又は予後の見込みを提供することが可能である。
【0101】
例えば米国リューマチ学会はＳＬＥを診断するために１１の基準を作り、これは皮膚、全身性、及び臨床試験においてＳＬＥの臨床スペクトラムを測定する。これらの基準には頬部発疹、円盤状発疹、日光過敏症、,口腔内潰瘍、関節炎、漿膜炎、腎臓及び中枢神経系炎症、血液変化、及び抗核抗体の存在が含まれる。患者は、ＳＬＥ患者として分類されるためには、これらの基準の４つを満たさなければならない（Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ.２５：１２７１−１２７７）。ＳＬＥは一般に抗核抗体を検出する血液検査；腎機能を評価する血液及び尿検査；ＳＬＥにしばしば関与する低レベルの補対を検出するための補体検査；炎症レベルを測定するための沈降速度（ＥＳＲ）又はＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；肺損傷を評価するためのＸ線及び心臓損傷を評価するためのＥＫＧを含むが、これに限定されない検査により確認される。
【0102】
薬物治療のモニタリング効果発現又はＢＣＭＡタンパク質（例えば、転写活性の調節）への薬物（例えば、薬物、化合物）の効果のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験にも適用できる。例えば、ＢＣＭＡ遺伝子発現、又はタンパク質レベルを減少する本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイで測定される薬物の効果は、ＢＣＭＡ遺伝子発現又はタンパク質レベルの減少を示す被検体の臨床試験でモニターすることができる。このような臨床試験において、ＢＣＭＡ遺伝子の発現又は活性、そして好ましくは、例えば、ＢＣＭＡタンパク質レベルが関わる疾患に関係するとみなされるその他の遺伝子は、特定の細胞、この場合はＢ細胞の表現型の「読み取り」又はマーカーとして使用され得る。
【0103】
ある実施態様では、本発明は薬物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬物）による被検体の治療効果をモニタリングする方法を提供し、該方法は（ｉ）薬物投与前の被検体から、投与前試料を得る；（ｉｉ）投与前試料中のＢＣＭＡタンパク質又はｍＲＮＡの発現レベルを検出する；（ｉｉｉ）被検体から１つ又は複数の投与後試料を得る；（ｉｖ）投与後試料中のＢＣＭＡタンパク質又はｍＲＮＡの発現又は活性レベルを検出する；（ｖ）投与前試料中のＢＣＭＡタンパク質又はｍＲＮＡの発現又は活性レベルと、投与後試料中のＢＣＭＡタンパク質又はｍＲＮＡを比較する；そして（ｖｉ）薬物の投与をその被検体に応じて、変更することを含む。このような実施態様によると、観察可能な表現型反応がなくても、ＢＣＭＡの発現又は活性は薬物効果の指標として使用され得る。
【0104】
異なる組織でのＢＣＭＡの基礎発現レベルは、特異的多型性の存在の有無により分類された個体からの組織試料を解析して測定されてもよい。どのような簡便な方法、例えば、タンパク質定量のためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ等、ｍＲＮＡ定量のためのノーザンブロット又は他のハイブリダイゼーション解析、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ等を使用してもよい。組織特異的発現は、遺伝子型と相関する。
【0105】
修飾因子に対する反応におけるＢＣＭＡ発現の変化は、候補修飾因子を投与するか又は、例えば、動物、細胞、生体外での転写アッセイ等の発現システムとを組み合わせることにより、決定され得る。ＢＣＭＡ転写及び／又は定常状態のｍＲＮＡレベルに対する修飾因子の効果が測定される。基礎発現レベルの様に、組織特異的相互作用が対象となる。ＢＣＭＡレベルに作用する発現修飾因子の能力と与えられた多型性の存在との間に相関が形成される。異なる修飾因子、細胞種類等のパネルは、多数の異なる条件下での影響を決定するためにスクリーニングされ得る。
【0106】
治療方法本発明はＢ細胞表面上のＢＣＭＡレベル増加を伴う疾患として、臨床的に診断された個体を治療する方法を提供する。該方法は一般に、生体試料を解析してＢＣＭＡレベルを測定し、そして健常対照群におけるこのようなレベルと比較することを含む。自己免疫疾患のようなＢＣＭＡレベル増加を伴う疾患を有するとして臨床的に診断された個体に最も有効な治療計画が、それから選択される。このように、本発明は更に、ＢＣＭＡレベル増加を伴う疾患の薬物治療に反応する患者の可能性を予測する方法を提供する。該方法は患者のＢＣＭＡ遺伝子発現を測定することを含み、ここでＢＣＭＡレベル増加の存在はＳＬＥのような自己免疫疾患を伴い、そしてその疾患のための薬物治療に反応する患者の可能性を予測する。
【0107】
このように、本発明の別の局面は、個体の薬物反応性に応じた個体のＢＣＭＡ発現のオーダーメイド治療処置を行う方法を提供する。薬理ゲノミクスにより、臨床家又は内科医はこの治療により最も恩恵を受ける患者への予防的又は治療的処置を目標とし、そして毒性の高い薬物関連の副作用に悩む患者の治療を避けることが可能である。
【0108】
自己免疫疾患以下に、現在開示されているＢＣＭＡ測定アッセイを使用することで、その治療に役立つ可能性のある自己免疫疾患を列記するが、これに限定されない。Ｂ細胞調節性自己免疫疾患には、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節炎、乾癬性関節炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；慢性自己免疫性蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、全身性強皮症及び硬化、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、潰瘍性大腸炎）関連反応、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性疾患、湿疹、喘息、Ｔ細胞浸潤性疾患及び慢性炎症性反応、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、紅斑性狼瘡（腎炎、非腎性、円盤状、脱毛症を含む）、若年型糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、急性及び遅延性のサイトカイン及びＴリンパ球介在過敏症に関連する免疫反応、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（ＡＮＣＡを含む）、無形成性貧血、クームス陽性貧血、ダイモンド・ブラックファン貧血、自己免疫溶性血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫溶性血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少、白血球漏出を含む疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多発性臓器損傷シンドローム、重症筋無力症、抗原‐抗体複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、Ｌａｍｂｅｒｔ‐Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶（パネル反応性抗体価高値に対する前治療、組織内のＩｇＡ沈着などを含む）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡（尋常性、落葉状を含む全て）、自己免疫性多内分泌腺症、ライター病、全身強直症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパシーまたはＩｇＭ介在性ニューロパシー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性の精巣炎と卵巣炎など精巣および卵巣の自己免疫性疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本病）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（または多腺性内分泌障害症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ぶＩ型糖尿病、ならびにシーハン症候群などの自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ球様間質性肺炎（ＨＩＶ）、ＮＳＩＰに対する閉塞性細気管支炎（非移植）、ギラン・バレー症候群、大血管の血管炎（リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中血管の血管炎（川崎病、結節性多発動脈炎を含む）、強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、クリオグロブリン血症、ＡＬＳ、そして冠動脈疾患が含まれる。
【0109】
ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニスト自己免疫疾患に罹る患者のＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質発現レベルが高ければ、患者のＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩの阻害反応が有望である可能性を示唆するものである。このように、本発明は自己免疫疾患の治療に使用されるＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストを含み、該患者はＢ細胞表面上のＢＣＭＡタンパク質の発現レベルが増加している。以下に、このような患者の治療するために利用され得るＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストの代表的な例を示す。ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストとして、機能するために、ＴＮＦＲファミリー受容体のどの細胞外ドメインも、ＢＬｙＳを結合する能力を一般的に保持する膜貫通又は細胞質ドメインのポリペプチドは本質的に存在しない。具体的には、ＴＡＣＩの細胞外ドメインは、ＴＡＣＩポリペプチド配列(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２)のアミノ酸１から１５４を含む。加えて、ＥＣＤはｖｏｎ Ｂｕｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，ＷＯ９８／３９３６１，ＷＯ００／４０７１６，ＷＯ０１／８５７８２，ＷＯ０１／８７９７９、及びＷＯ０１／８１４１７に記載されるように、ＴＡＣＩのＥＣＤ形のようなフラグメント又はこの配列の変異体でもよい。特に、これらＥＣＤ形はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸３０‐１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸３０‐１０６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸３０‐１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸３０‐１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１２０、そしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸１‐１２６を含むことができる。更に、ＴＡＣＩＥＣＤは、システインリッチドメインを１つだけ有するこれらの分子を含むことができる。
【0110】
ＢＡＦＦ‐ＲのＥＣＤ形はＢＡＦＦ‐Ｒポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のアミノ酸１‐７１を含有するものを含む。更にＥＣＤはＷＯ０２／２４９０９、ＷＯ０３／１４２９４及びＷＯ０２／３８７６６に記載されるように、ＢＡＦＦ‐ＲのＥＣＤ形のようなフラグメント又はこの配列の変異体でもよい。特に、これらＥＣＤ形はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸７−７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸７‐６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸２‐６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸２‐７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐６１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸２‐６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸７‐３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１‐１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸３９‐６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１９‐３５、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸１７‐４２を含むことができる。更にＢＡＦＦ‐ＲのＥＣＤはシステインリッチドメインを１つ有するこれらの分子を含むことができる。
【0111】
ＢＣＭＡのＥＣＤ形はＢＣＭＡポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）のアミノ酸１‐４８を含有するものを含む。ポリペプチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）のアミノ酸１‐７１を含有するものを含む。更にＥＣＤはＷＯ００／４０７１６及びＷＯ０５／０７５５１１に記載されるように、ＢＣＭＡのＥＣＤ形のようなフラグメント又はこの配列の変異体でもよい。特に、これらＥＣＤ形は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸１‐１５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸１‐４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸１‐４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸８‐４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸８‐３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸８‐８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸４１‐８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸１‐５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸４‐５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸４‐５１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸２１‐５３を含むことができる。更にＢＣＭＡのＥＣＤは部分的なシステインリッチドメインだけを有するこれらの分子を含むことができる。
【0112】
更に実施態様において、ＢＬｙＳ受容体（例えば、ＢＡＦＦ‐Ｒ、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの細胞外ドメイン又はそれらのフラグメント)のＢＬｙＳ結合領域は免疫グロブリン分子のＦｃ部へ融合され、生体内でその溶解性を促進する。ある実施態様によると、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、１００ｎＭ又はそれより小さい結合親和性を有するＢＬｙＳポリペプチドに結合する。別の実施態様によると、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは１０ｎＭ又はそれより小さい結合親和性を有するＢＬｙＳポリペプチドに結合する。更に別の実施態様によると、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは１ｎＭ又はそれより小さい結合親和性を有するＢＬｙＳポリペプチドに結合する。
【0113】
別の例では、ＢＬｙＳ及び／又は ＡＰＲＩＬアンタゴニストは、本来の配列はないＢＬｙＳ結合ポリペプチド又その変異体を含む。このようなポリペプチドのいくつかの例は、ＷＯ０５／０００３５１に記載されるように、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩの配列を有するものである。特に、いくつかの結合ポリペプチドは、ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＲＷＶＰＣＥＭＬＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＳＷＶＰＣＨＭＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１６）、ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ:１７）、又はＷＯ０５／０００３５１の図．３２に列挙された配列を含む。
【0114】
或いは、ＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは本来の配列ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ‐Ｒ、又はＢＣＭＡの細胞外ドメインをそのＢＬｙＳ結合領域で結合し、試験管内で、ｉｎ ｓｉｔｕ又は生体内で部分的又は完全にＢＬｙＳ結合を阻害、抑制又は中和することができる。例えば、このような間接的アンタゴニストは、ＢＬｙＳ結合が立体的に障害されるようなＴＡＣＩの領域で結合するＴＡＣＩ抗体である。例えば、アミノ酸７２‐１０９又はその近辺の領域での結合は、ＢＬｙＳ結合を阻害すると考えられている。この分子へのＡＰＲＩＬ結合はアミノ酸８２‐２２２の領域で生じると考えられており、これを阻害することも有利であろう。別のＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストはヒトＢＡＦＦ−ＲのＢＬｙＳへの結合が立体的に障害されるようなＢＡＦＦ−Ｒの領域で結合するＢＡＦＦ‐Ｒ抗体である。例えば、アミノ酸２３‐３８又はアミノ酸１７‐４２又は近隣領域での結合は、ＢＬｙＳ結合を阻害すると考えられている。最終的に、更に間接的なアンタゴニストはＢＬｙＳの結合が立体的に障害されるようなＢＣＭＡの領域で結合するＢＣＭＡ抗体だろう。例えばアミノ酸５‐４３又は近隣領域での結合は、ＢＬｙＳ（又はＡＰＲＩＬ）結合を阻害すると考えられている。
【0115】
いくつかの実施態様において、本発明に係るＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストは、ＢＬｙＳ抗体を含む。「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、そして具体的には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多抗原決定基特異性を有する抗体、一本鎖抗体及び抗体フラグメントを含む。いくつかの実施体様によると、本発明のポリペプチドプチドは、抗体が結合し、そしてＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ‐Ｒ又はＢＣＭＡへのＢＬｙＳ結合を阻害できるか又はＢＬｙＳシグナルを阻害するような、例えば可変領域又はＣＤＲ中の抗体フレームワーク、に融合される。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体でもよい。本発明のポリペプチドを含む抗体は抗体フラグメントでもよい。又は本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを有する動物を免疫することで産生されうる。このように、本発明のポリペプチドに対する抗体が検討される。
【0116】
特に、ヒトＢＬｙＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）の領域内で結合するＢＬｙＳ特異的抗体は、ヒトＢＬｙＳの１６２−２７５残基及び／又は１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４及び２６５からなる群から選択されるアミノ酸の近隣のアミノ酸を含み、これらが検討される。この抗体結合とは、抗体が、１つ又は複数のその受容体へのＢＬｙＳ結合を立体的に障害するようなものである。このような抗体はＷＯ０２／０２６４１及びＷＯ０３／０５５９７９に記載されている。特に好ましい抗体はＬｙｍｐｈｏｓｔａｔ−Ｂ（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ.（２００３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ，４８，３２５３−３２６５）として記載されたようなものである。
【0117】
その他の免疫抑制剤本発明の方法は、免疫抑制剤を単一又はＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ又はＢＣＭＡ阻害剤との組み合わせのどちらかでの使用が考慮されている。これらのその他の薬剤は、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ又はＦＫ５０６）、ステロイド（例えば、メチルプレドニゾン又はプレドニゾン）のような免疫抑制剤又は免疫細胞の成長を阻む免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン）、及び抗ＣＤ４０経路阻害剤（例えば、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０リガンド抗体及び抗ＣＤ４０経路の小分子阻害剤）、移植サルベージ経路阻害剤（例えば、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ））、ＩＬ−２受容体アンタゴニスト（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．のＺｅｏｎｐａｘ（著作権）及びＮｏｖａｒｔｉｓ，Ｉｎｃ．のＳｉｍｕｌｅｔ）又はその類似体、シクロフォスファミド、サリドマイド、アザチオプリン、モノクローナル抗体（例えば、ダクリズマブ（抗インターロイキン（ＩＬ）−２）、インフリキシマブ（抗腫瘍壊死因子）、ＭＥＤＩ−２０５（抗ＣＤ２）、ａｂｘ−ｃｂｌ（抗ＣＤ ４７））、及びポリクローナル抗体（例えば、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン））を含むが、これに限定されない。
【0118】
一実施態様において、ＢＣＭＡアンタゴニスト（ＢＣＭＡ細胞外ドメインに結合する抗体など）の治療有効量は、治療有効量のリツキシマブと組み合わせて、被検体に投与してもよい。このような方法により、前記被検体のＢ細胞からの枯渇及び／又は中和の改善が可能になる。このような化合物の同時投与は同時又は連続的に、そしてあらゆる効果的な投与経路を介して行われる。
【0119】
本明細書中で使用されるように、対象となる薬剤の「治療有効量」は、被検体に投与された時、 その組成物で処理される被検体のＢ細胞の枯渇及び／又は中和のような所望の効果を十分に達成する量である。
【0120】
ある実施態様において、ＢＣＭＡアンタゴニスト又はリツキシマブのような抗ＣＤ２０薬剤を含む医薬組成物の「治療有効量」又は「効果量」は、単回投与又は分割投与で約０．１から約２００ｍｇ／ｋｇ体重である；例えば約１から約１００ｍｇ／ｋｇ、約２から約５０ｍｇ／ｋｇ、約３から約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約５から約１０ｍｇ／ｋｇである。動物アッセイが用いられる時、投薬量は動物アッセイで効果的であると示されたのと同じ標的組織濃度となるように投与される。治療方法はＢＣＭＡアンタゴニスト（ＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する抗体など）及びリツキシマブのような抗ＣＤ２０薬剤の治療有効量の単回投与又は治療有効量の反復投与を含むことが認められている。
【0121】
「抗ＣＤ２０薬剤」という用語はＣＤ２０を結合するいかなる分子も包含し、そして最も好ましい態様では殺傷のためにＣＤ２０タンパク質に関与する細胞を標的とする。このような分子には、リツキサン（登録商標）のような抗ＣＤ２０抗体及びその後続の薬剤、そのヒト化抗体のｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ、ｏｆａｔｕｍｕｍｂａｂ（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０（登録商標）、完全ヒト抗ＣＤ２０抗原）、ＤＸＬ６２５（第二世代の抗ＣＤ２０モノクローナル)、ＧＡ１０１（変更されたＦｃ領域を有する第二世代の抗ＣＤ２０薬剤）、米国出願第２００６０１２１０３２号に記載された抗ＣＤ２０分子、米国出願第２００７００２０２０５９号に記載された抗ＣＤ２０分子、米国出願第２００７００１４７２０号に記載された抗ＣＤ２０分子、米国出願第２００６０２５１６５２号に記載された抗ＣＤ２０分子、米国出願第２００５００６９５４５号に記載された抗ＣＤ２０分子、米国出願第２００４０１６７３１９号に記載された抗ＣＤ２０分子、ＴＲＵ−０１５（ＣＤ２０を標的とする小免疫医薬分子）、及びｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ（ゼヴァリン（登録商標））のような複合分子が含まれる。
【0122】
製剤処方本発明に従って使用されるＢＬｙＳ結合抗体のようなＢＬｙＳ及び／又はＡＰＲＩＬアンタゴニストの治療製剤は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｔｇｔｏｒｚ’ｓＰｈａｍａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ， Ａ. Ｅｄ.（１９８０））を任意に伴い、所望の程度までに精製された抗体を混合し、凍結乾燥製剤又は水溶液の形で保存される。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに毒性がなく、そしてリン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンのような抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３‐ペンタノール；及びｍ‐クレゾール）；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清、アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンのようなアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；サッカロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属複合体（例えば Ｚｎ‐タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤ＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。
【0123】
本明細書中の製剤は治療されるべき特定の症状に必要とされる複数の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも、含んでも良い。例えば、更に細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリンのようにＴ細胞に作用するもの、又は例えば、ＬＦＡ−１を結合するようなＴ細胞に結合する抗体）を提供することが望ましい。 このような、その他の薬剤の有効量は、処方中に存在する抗体の量、疾病又は疾患又は治療の種類、及び上記で検討されたその他の因子による。これらは一般に同じ用量且つ本明細書中で記載された投与経路、又はこれまでに用いられた用量の約１から９９％で使用される。
【0124】
活性成分は作成されたマイクロカプセル中に、例えば液滴形成技術により、又は、例えばヒドロキメチルセルロース又はセラチン‐マイクロカプセル及びポリ‐（メチルメタクリレート）マイクロカプセルがそれぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン、ミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンの中で界面重合することにより、封入される。このような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ， Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載される。
【0125】
持続性放出製剤も調製され得る。持続性放出製剤の適切な例には、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの半透過性基材が含まれ、基材は例えば、フィルム又はマイクロカプセルのような形成品の形である。持続性放出製剤の例には、ポリエステル、ヒドロゲル、（例えば、ポリ（２‐ヒドロキシエチル‐メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ‐グルタミン酸及びエチル‐Ｌ‐グルタミン酸塩のコポリマー、非崩壊性エチレン‐ビニルアセテート、崩壊性乳酸‐グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（乳酸‐グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）、及びポリ‐Ｄ‐（−）‐３‐ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【0126】
生体内投与のために使用される製剤は滅菌されなければならない。これは滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に達成される。
【実施例】
【0127】
以下の実施例は当該技術分野の当業者に対し、本発明をどのように完成し、そして使用するかを完全に開示し記載するために提示されものであって、これらは発明者が発明者自身の発明として考える本発明の範囲を制限するものでなく、又は下記実験が全てではないし、又は行われた実験のみを示すものではない。使用された数値（例えば量及び温度等)に関して正確さを期する努力を行ったが、幾つかの実験誤差及び偏差があることは考慮すべきである。他に指定がない限り、部（ｐａｒｔｓ）は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、そして圧力は大気圧又は大気圧近辺を意味する。
【0128】
実施例１自己免疫患者のＢ細胞上のＢＣＭＡレベル測定
末梢血Ｂ細胞が１６人の健常対照群（ＨＣ）及び患者の疾患活動性がＳＬＥＤＡＩ解析により評価された１５人のＳＬＥ患者からのネガティブ選択により得られた。Ｂ細胞はＣＤ１９＋ＣＤ２７−（ナイーブ）、ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋（メモリー）及びＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉｇｈ（形質芽球）としてサブグループ分けされた。ＢＡＦＦ‐Ｒ、ＴＡＣＩ、及びＢＣＭＡ発現はＳＬＥ由来のＢ細胞の各サブセット上のフローサイトメトリーにより比較され、そして健常対照群（ＨＣ）はフローサイトメトリーにより比較された。血清ＢＡＦＦＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ及び自己抗体レベルがＥＬＩＳＡによって定量された。幾つかの実験では、ＢＣＭＡ‐陽性及び‐陰性Ｂ細胞はフローサイトメトリーソーティングにより選別された。
【0129】
ヒト末梢血Ｂ細胞中のヒトＢＡＦＦ‐Ｒ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡの発現パターン末梢血Ｂ細胞は抗ＢＡＦＦ‐Ｒ、抗ＴＡＣＩ及び抗ＢＣＭＡ抗体で染色された。ＢＡＦＦ−受容体発現はＢ細胞成熟に伴って変化することが示された；それ故、ナイーブ（ＣＤ２７−）、メモリーＢ細胞（ＣＤ２７＋）及び形質芽球（ＣＤ２７ｈｉｇｈ）が全て別々に解析された。ＢＡＦＦ‐Ｒ及びＴＡＣＩは全てのサブセットで検出されるが、ＢＡＦＦ‐Ｒ発現は形質芽球で低く、ＴＡＣＩ発現はナイーブＢ細胞（図１Ａ）ではより低い。ＢＣＭＡ発現が形質細胞及び胚中心Ｂ細胞においてのみ限定されていることが報告されているとしても、末消血由来のナイーブ及びメモリーＢ細胞におけるＢＣＭＡ＋集団も観察することができる（図１Ａ）。この差は、ＢＣＭＡは選択的スプライシングの結果である５つの転写変異体を有するとして報告されたので、様々な転写変異体に対する抗体の異なる特異性によるものかもしれない。ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞の平均はナイーブＢ細胞で２４％、そしてメモリーＢ細胞で２０．８％であり、これは形質芽球より低い（３７．９％）（図６Ａ）。
【0130】
対照及及びＳＬＥ患者のＢ細胞上のＢＡＦＦ‐Ｒ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ発現１５人のＳＬＥ患者及び１６人の非自己免疫個体からのＢ細胞は、ＢＡＦＦ受容体発現のために検査された。該ＳＬＥ患者及び対照群のＢＡＦＦ‐Ｒ発現解析では、ＳＬＥ患者は、Ｂ細胞の３つのサブセット全てにおいてＢＡＦＦ‐Ｒ発現の有意な減少を示した（対照対ＳＬＥのＭＦＩ、ナイーブ＝１３８７対９２９、ｐ＝０．００２；メモリー＝１２９０対８４０、ｐ＝０．００３；形質芽球＝１３０対８５、ｐ＝０．０７７、図１Ｂ）。両グループのＴＡＣＩ発現は３つのサブセットにおいて有意に異ならない（対照対ＳＬＥのＭＦＩ、ナイーブ＝１８．８対２４．４、ｐ＝０．１４４；メモリー＝７３．２対６０．４、ｐ＝０．１２１；形質芽球＝３９．０対３２．１、ｐ＝０．１１０、図１Ｃ)。
【0131】
ＳＬＥ由来のＢ細胞は正常対照より高い表面ＢＣＭＡ発現を示した（対照対ＳＬＥのＭＦＩ−１７．８対２７．９、ｐ＝０．０３８；図１Ｄ）。メモリーＢ細胞におけるＳＬＥのＢＣＭＡ発現は正常の対照より高い（ナイーブＢ細胞のＢＣＭＡＭＦＩ＝１９．５対２９．５、ｐ＝０．００８、図１Ｄ）。しかし、ナイーブ及び形質芽球のＢＣＭＡ発現は、有意に異ならない。
【0132】
ＢＡＦＦ受容体及び血清ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬレベル、自己抗体、疾患活動性との関係全Ｂ細胞のＢＡＦＦ‐Ｒ発現と血清ＢＡＦＦとの間に逆相関があった（ｐ＝０．０４９１）が、しかしＡＦＦ−Ｒ発現及び血清ＡＰＲＩＬとの間に有意な相関はなかった（図２）。ＢＡＦＦ‐Ｒ発現は、抗dsＤＮＡと弱い逆相関（ｐ＝０．０６４）を示したが、統計学的には有意ではなかった。ＢＡＦＦ‐ＲとＳＬＥＤＡＩスコアにより評価された疾患活動性との間に何ら相関はなかった（ｐ＝０．３４２、図２）。
たとえＢＣＭＡ及び疾患活動性（ＳＬＥＤＡＩ）又は血清ＢＡＦＦレベルとの間に有意な相関はなくても、ＢＣＭＡ陽性メモリー細胞のＭＦＩは、血清ＩｇＧ抗dsＤＮＡ抗体レベルと逆相関を示す（ｐ＝０．０１１９、図２）。
【0133】
ＢＣＭＡ陽性Ｂ細胞の特徴エリテマトーデス患者は、ナイーブ及びメモリーＢ細胞のＢＣＭＡ発現が増する。私たちはＢＣＭＡ＋Ｂ細胞の特徴を検査して、自己免疫との関連を調べた。各Ｂ細胞サブセットのＢＣＭＡ＋及びＢＣＭＡ−細胞の中間ＦＳＣが最初に解析された。特に、エリテマトーデス患者は正常対照より高い中間ＦＳＣを有し、予想通りエリテマトーデスでは、活性化Ｂ細胞の割合の増加をしていることを示す。ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞は、エリテマトーデス及び健常対照群両方に由来するナイーブＢ細胞におけるＢＣＭＡ−Ｂ細胞より高い中間ＦＳＣを示した（図３Ａ）。メモリーＢ細胞において、健常対照群及びエリテマトーデス患者由来のＢＣＭＡ＋Ｂ細胞はＢＣＭＡ−Ｂ細胞より有意に高い中間ＦＳＣを示した（図３Ａ）。これらのデータはナイーブ及びメモリーＢ細胞のＢＣＭＡ陽性Ｂ細胞は、ＢＣＭＡ陰性Ｂ細胞より活性化されたＢ細胞であることを示す。これは、正常及びＳＬＥ患者の両方において本当であり、そして両者の間に違いはなかった。
【0134】
エリテマトーデス患者の間で増加しているとして報告されたＣＤ１９ｈｉｇｈ集団でのＢＣＭＡ発現も解析した。我々の研究ではＣＤ１９ｈｉｇｈ集団において、健常対照群及びエリテマトーデス患者との間で有意な差は見つからなかった（Ｓｕｐ．図２）が、健常対照群及びエリテマトーデス患者の両方において、ＣＤ１９ｈｉｇｈＢ細胞はＣＤｌ９ｌｏｗB細胞よりはるかに高いＢＣＭＡ発現を示す（図３Ｂ）。ＣＤ１９はＢＣＲシグナル伝達及びＣＤ２１、ＣＤ４０、ＣＤ３８、ＣＤ７２、ＶＬＡ‐４及びＦｃｙＲＩＩＢのような多受容体のパートナーを増強するＢＣＲコレセプター受容体なので、ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞でのより高いＣＤ１９発現は、ＢＣＲシグナル伝達を含む多くの免疫反応に対するより高い感受性と関連するのかもしれない。
【0135】
ＢＣＭ＋Ｂ細胞の多くは、エリテマトーデス及び健常人の両方においてＩｇＤ＋及びＩｇＭ＋であり、ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞は、クラススイッチされていないことを意味する（図４Ａ）。それゆえ、ＣＤ２７−ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞はナイーブＢ細胞集団に含まれるかもしれない。ＣＤ２７＋ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞はＩｇＤ＋も示し、そしてこれらの細胞は非クラススイッチメモリーＢ細胞でもよい。更にエリテマトーデス患者は健常対照群より高いＩｇＤ＋Ｂ細胞のパーセンテージを示す（図４Ｂ）。
【0136】
エリテマトーデス患者のＢ細胞は通常、健常人より活性化されている。そしてＣＤ８６の発現は、エリテマトーデスＢ細胞ではるかに高いことが報告された。ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞のＣＤ８０及びＣＤ８６発現が、エリテマトーデス及び健常人で検査された。エリテマトーデス患者は、はるかに高いＣＤ８６発現を示し、そしてＢＣＭＡ＋細胞に対するＣＤ８６＋細胞のパーセンテージは、ＢＣＭＡ−細胞より高い。健常対照群のＣＤ８６発現は低いが、ＢＣＭＡ＋細胞上のＣＤ８６＋細胞のパーセンテージは、ＢＣＭＡ−細胞より高い。ＣＤ８０の発現は、エリテマトーデス及び健常対照群の両方で高くなかった（図４Ａ）。ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬプラスＣＰＧは、Ｂ細胞の全てのサブセット上でＢＣＭＡの発現を増加し、形質芽球及びナイーブＢ細胞の増殖を誘導した。
【0137】
エリテマトーデス患者及び健常対照群のＰＢＭＣから単離されたＢ細胞は、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテート）で標識化され、そしてＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ又はＨＴの存在下又は非存在下で、ＣＰＧ（ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド）とインキュベーションした。４日間のインキュベーション後、Ｂ細胞の各サブセット上のＢＣＭＡ発現及びそれらの増殖が、解析された（図５Ａ及び図５Ｃ）。ＣＰＧ単独ではＢＣＭＡの発現を増加しなかった。Ｂ細胞上の全てのサブセット上のＢＣＭＡ発現は、ＣＰＧ＋ＢＡＦＦ及びＣＰＧ＋ＨＴによって増加され、特にＣＤ２７ｈｉｇｈ形質芽球上で有意に増加された。ＣＰＧ＋ＡＰＲＩＬは、ＢＣＭＡ発現も僅かに増加させた。ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、及びＨＴは、ＣＤ２７ｈｉｇｈＢ細胞の強い増殖を誘導し、そしてＣＤ２７‐Ｂ細胞（図５Ｂ）の適度な増殖を誘導した。しかし、ＣＤ２７＋集団は増殖されなかった。ＣＤ２７＋メモリーＢ集団の減少は、ＣＤ２７＋細胞がＣＤ２７ｈｉｇｈ形質細胞へ分化されたた適めか又はＣＤ２７＋Ｂ細胞の増殖が起きなかったためかもしれない。
【0138】
ＢＣＭ＋及びＢＣＭＡ−Ｂ細胞によるＩｇ分泌及び自己抗体産生Ｂ細胞が磁気分離（Ｂ細胞濃縮キット、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｃａｎａｄａ）により、エリテマトーデス及び健常人のＰＢＭＣから単離される。ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞はＦＡＣＳソーティングにより単離されたＢ細胞から選別される。選別されたＢＣＭＡ＋Ｂ細胞は９６穴培養プレートで５日間、抗ＣＤ４０／ＩＬ４、抗ＣＤ４０／ＩＬ４／ＣＰＧ、抗ＣＤ４０／ＩＬ４／ＢＣＲの存在下又は非存在下でインキュベートされた。ＩｇＭ及びＩｇＧ濃度並びに上清の抗ｄｓＤＮＡ活性がＥＬＩＳＡで測定された。
【0139】
結果の要約ＳＬＥのＢ細胞上のＢＡＦＦ‐Ｒ発現は、ＨＣのＢ細胞上のレベルと比較して有意に低かった（対照対ＳＬＥのＭＦＩ、ナイーブ＝１３８７対９２９、ｐ＝０．００２；メモリー＝１２９０対８４０、ｐ＝０．００３）。その一方で、ＢＣＭＡ発現は実質的にＳＬＥのＢ細胞上で、より高かった（対照対ＳＬＥのＭＦＩ：１８対２８、ｐ＝０．０３８）。これはメモリーＢ細胞サブセットにおいて最も明白であった（対照対ＳＬＥのＭＦＩ＝１９対２９、ｐ＝０．００８）。ＢＣＭＡレベルは、疾病重症度（ＳＬＥＤＡＩ）又は血清ＢＬｙＳ又はＡＰＲＩＬレベルのどちらとも相関しなかった。ＢＣＭＡ＋細胞は、ＢＣＭＡ陰性細胞よりも大型化する傾向があり、そして活性程度がより高いでことを意味する高ＣＤ１９及び高ＣＤ８６発現を示した。ＢＣＭＡの差異発現の機能的関連性を調べるために、精製したＢＣＭＡ陽性又はＢＣＭＡ陰性Ｂ細胞をＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ又はＢＬｙＳ/ＡＰＲＩＬヘテロトリマー（ＨＴ）と共に、ＴＬＲ９刺激薬であるＣｐＧの存在下又は非存在下でインキュベートした。どのリガンドもＢＣＭＡ＋Ｂ細胞上での増殖を誘導しなかったが、ＣｐＧと各リガンドとの組み合わせは、実質ＢＣＭＡ＋Ｂ細胞の増殖を誘導した。
【0140】
結論：ＳＬＥ患者由来のＢ細胞上のＢＣＭＡ発現は、特にメモリーＢ細胞上で有意に増加される。ＢＣＭＡ陽性細胞は、より活性化された表現型を有し、そしてより多量の免疫グロブリン及び自己抗体を産生する。３つの全てのリガンド、ＢＬｙＳ、ＡＰＲＩＬ又はＨＴは、ＣｐＧ存在下で強くＢＣＭＡ陽性細胞を活性化する。これらの知見はＢＬｙＳ及びＡＰＲＩＬ存在下で観察されたＤＮＡ反応性のＳＬＥ Ｂ細胞の増殖を説明するのに役立つかもしれない。
【0141】
実施例２ヒトＣＤ２０遺伝子組み換えマウスにおけるＢ細胞の枯渇及び／又は中和のためのＢＣＭＡ抗体及びリツキシマブでの組み合わせ治療
ＢＣＭＡ発現は形質細胞の生存にとって重要である。遺伝子ターゲティングにより、形質細胞由来の長期生存骨髄はＢＣＭＡ欠失マウスで減少されることが確認されている。ＣＤ２０は骨髄中の長期生存形質細胞上で発現されないので、ＢＣＭＡに対する阻害又は細胞傷害性抗体によるこれらの細胞のターゲティングが、ＳＬＥ患者の抗ＣＤ２０抵抗性自己免疫抗体産生細胞の重要な成分を与え得るこれらの細胞を枯渇させる。このような処置とリツキシマブとの組み合わせは、更に有効な結果をもたらすだろう。
【0142】
リツキシマブはマウスＣＤ２０に結合せず、それ故、正常マウスのＢ細胞を枯渇させるのに使用することができない。又、生体内でＢ細胞枯渇に有効な市販の抗マウスＣＤ２０ｍＡｂもない。Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７４：８１７−８２６；２００５）はヒトＣＤ２０遺伝子組み換えマウス系統（細菌人工染色体／ＢＡＣ技術を用いて作成）を用いて、抗ヒトＣＤ２０ｍＡｂ（リツキシマブ及びｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）で治療し、これらのｍＡｂで治療されたヒトで観察されたのと同様なＢ細胞枯渇又は中和を誘導することができた。本例では、Ａｈｕｊａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ１７９：３３５１−３３６１；２００７で開示されたｈＣＤ２０Ｔｇマウス系統を用いる。
【0143】
一般方法：逐次又は組み合わせの何れかでの各治療薬（ＢＣＭＡ細胞外ドメイン及びリツキシマブに結合するＢＣＭＡ抗体アンタゴニスト）の最適用量での使用、及びＢ細胞枯渇及び中和の評価最適時点（３週）でのＢ細胞枯渇を評価するが、治療停止後継続するＢ細胞回復（〜２０週）を評価する追加の群も含む。
【0144】
【表1】
【0145】
動物管理、順化、及び収容施設室温は７０〜７４°Ｆ、そして湿度は３０％〜７０％に保たれる。暗サイクル中に研究関連活動を行うために室内照明灯をつける時以外は、１２時間の明暗サイクルを用いる。各動物には齧歯類用餌（照射済５０５６、Ｐｉｃｏ Ｌａｂ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＮ）及び水が適宜供給される。本研究の手順は動物に対して不快、ストレス、又は疼痛を与えないようにするが又は最小限にするように計画されている。実験動物の処置は、実験動物の管理と使用に関する指針（ＩＬＡＲ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， １９９６，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ）で特定された条件に従っている。動物は各種の処置グループにランダムに割り振られる。
【0146】
処置グループ：投薬期間は、投薬フェーズとして指定される。投薬初日を、「第１日」とする。第１日の前日を「−１日」とする。投薬フェーズ最後の屠殺処理の翌日が回復フェーズの初日である。【表2】
【0147】
リツキシマブは腹腔内に投与される（ＩＰ）。ＢＣＭＡ抗体及び溶媒（ＰＢＳ）は、週３回（全９回投与）肩甲骨下領域内に皮下注（ＳＣ）で投与される。第１回投与は第１日（Ｄ１）に投与される。組み合わせ治療のグループにおいて、関連する動物は全て、最初にＩＰ注射を受け、それから６０分以内にＳＣ注射での投与が続く。グループ４：第一処理のリツキシマブ後、ＢＣＭＡ抗体；グループ５：第一処理のＢＣＭＡ抗体後、リツキシマブ。投与量は個々の動物の体重によって毎週調節される。
【0148】
研究評価項目の概要：・全血（１５０μＬ；ＥＤＴＡ）が収集され、そしてＴ及びＢ細胞サブセットに対してフローサイトメトリー解析が行われる。
・血清（血清分離チューブに入れられた〜１００μＬの全血）が後に行うＬｕｍｉｎｅｘ ａｓｓａｙによる総ＩｇＧ1、ＩｇＧ2a、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＡ解析のために、各時点で収集される。
・屠殺時に脾臓が収集され、フロー解析及び後のＩＨＣ／組織学ために処理される。脾臓摘出はイソフルレン麻酔下で全血収集前に行われる。脾臓全体が秤量され、そして切片作成前に記録される。
・屠殺時に、主要な末梢リンパ節（鼠径、腋窩、上腕、頸部、及び腸間膜）が今後可能なＩＨＣ及び組織学のために収集される。リンパ節がホルマリン又は亜鉛トリスバッファーで固定され、そして７０％アルコール中で今後の使用のために保存される。
・組織学用：脾臓１／３及び１ＬＬＮ（左ＬＮ）がＺｎＴｒｉｓ中に置かれ、そして同じ組織（右ＬＮ）が１０％ＮＢＦ中で収集される。
グループ１〜５の全動物は血清（血清分離チューブ中の１００μＬの血液）及び全血（ＥＤＴＡチューブ内の１５０μＬ)を−５日に後眼窩静脈からに収集する。
［血清収集：]最低１００μＬの全血を血清分離チューブ中に入れるか、又は最低１５分間凝固させる。血液はそれから４０００ｒｐｍで１０分間遠心される。最低５０μＬの血清が第二容器に等分に分注され、＜６０°Ｃで保存される。
【0149】
ＥＤＴＡ中での全血収集：最低１５０μＬの血液をＥＤＴＡ含有ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに入れる。チューブは最低２０回穏やかに反転させる。ＥＤＴＡサンプル中の全血はフローサイトメトリーのために処理されるまで室温で保存される。
【0150】
屠殺される動物は全てイソフルオレンで麻酔される。屠殺される動物全ての血液、血清、脾臓、及び主要末梢リンパ節が収集される。脾臓は、脾臓細胞サブセットの変化を避けるために、血液試料前にイソフルオレン麻酔下で収集される。脾臓全体が秤量される。脾臓は３分割（頭部、中間部及び尾部）され、表３のように処理される。【表3】
【0151】
［リンパ節収集：］主要末梢リンパ節（鼠径、腋窩、上腕、頸部、及び腸間膜）がカセット中で組織学／ＩＨＣために収集される。
【0152】
ａ．ＩＨＣのための左リンパ節（腸間膜ＬＮを除く）を含むカセットが亜鉛トリスバッファー中に置かれる。ｂ．組織学のための右リンパ節（腸間膜ＬＮを除く）を含むカセットが１０％ＮＢＦ中に置かれる。
ｃ．腸間膜リンパ節を含むカセットが、全腸管（胃から直腸のすぐ上まで）を丸ごと取り、洗浄せずに１０％ＮＢＦ中で収集される。
【0153】
全試料は室温で保存される。【表4】
【0154】
全血免疫表現型のタイピング：簡単には、全血がＫ2ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（商標）チューブに収集される。分注された全血５０μＬが適切に機能する抗体カクテル（表５参照）とインキュベートされ、そして赤血球が溶解される。フローサイトメトリーで試料を収集する前に、フローカウンター（商標）蛍光ミクロスフェアが細胞の絶対濃度計算のために各試料チューブに添加される。データ取得は４８８ｎｍでのエミッションを有する１５ｍＷ空冷アルゴンイオンレーザー及び６３５ｎｍでのエッミッションを有する赤色ダイオードレーザーを備えたＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで行われる。【表5】
２．表現型［Ｂ２２０＋／ＣＤ１９＋／ｈｕＣＤ２０＋］は、Ｂ２２０及びヒトＣＤ２０導入遺伝子を含むマウスＣＤ１９表面抗原の両方を発現するＢ細胞集団である。
【0155】
脾臓の免疫表現型のタイピング：簡単には単一細胞が単離され、適切に機能する抗体カクテル（表６参照）とインキュベートされる。機器の較正とデータ取得は全血免疫表現型のタイピングと同様に行われる。【表6】
【0156】
ＩＨＣ解析 組織：テスト用組織は脾臓及びリンパ節の両方からの試料を含む。脾臓試料として、各動物からの脾臓の横断切片（頭部及び尾部片）が含まれる。脾臓の頭部切片（亜鉛トリス‐固定）はＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ１３８、又はＣＤ５単独に対するラットモノクローナル抗体で染色される。組織切片のサブセットは、陰性対照としてラットアイソタイプＩｇＧでも染色される。脾臓の頭部切片（ホルマリン‐固定）はビオチン化ＰＮＡ（視覚化が必要であれば、ＧＣ； Ｈ＆Ｅで十分である）及びＨ＆Ｅで染色される。組織切片のサブセットは、陰性対照としてビオチン化副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）でも染色される。
【0157】
各動物で調べられたリンパ節は、鼠径、腋窩、上腕、頸部、及び腸間膜を含む。リンパ節はホルマリン又は亜鉛トリスで固定され、将来の使用される可能性のために７０％アルコール中で保存される 。
【0158】
抗体： 使用される抗体には、マウスＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（クローンＲＡ３‐６Ｂ２，アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ，ｋ；０．５ｍｇ／ｍＬ，＃５５７３９０，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＣＤ５（Ｌｙ−１，ｃｌｏｎｅ ５３‐７．３，０．５ ｍｇ／ｍＬ，＃５５３０１７，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ１３８（クローンＳｙｎｄｅｃａｎ−１， ０．５ｍｇ／ｍＬ，＃５５３７１２，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する３つのラットモノクローナル抗体が含まれていた。
【0159】
統計学的解析：臓器重量、Ｂ細胞数、及び免疫グロブリンレベルでの群間有意差のための統計解析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行われた。
【0160】
上記で概説したデータ収集では、測定されるべき所定の治療グループに対し、様々な時点でのマウス末梢血試料中のＢ細胞の絶対濃度のパーセント変化が与えられる。或いは、該データは陽性リンパ球又はＢ２２０＋細胞のパーセント変化として表現され得る。このようなデータは、抗ＣＤ２０薬剤と例えばリツキサン（登録商標）及びＢＣＭＡ抗体等のＢＣＭＡアンタゴニストとの組み合わせは、多くの時点でリツキサン（登録商標）及びＢＣＭＡアンタゴニスト単独で用いた時の減少レベルと比べて、Ｂ細胞レベルの枯渇（いくつかの実施態様では相乗的枯渇）及び／又は中和をもたらすことを示す。
【0161】
本発明はその具体的実施態様に関して記載されているが、様々な変更がなされ、そして本発明の真の精神と範囲から逸脱しない範囲で同等なものは置換されてもよいことは、当該技術分野の当業者により理解されるべきである。更に、本発明の目的、精神及び範囲に適応させるために具体的な状況、材料、組成物、方法、方法の工程に対して変更がなされてもよい。このような変更の全ては、本明細書に添付された請求の範囲内であることが予定される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]