特許 5743368 ペプチドのＯ結合型グリコシル化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5743368

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月1日

(54)【発明の名称】ペプチドのＯ結合型グリコシル化

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20150611BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20150611BHJP

   C07K 14/535 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20150611BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20150611BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20150611BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K37/02

   A61P11/02

   A61P11/06

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/08

   C07K14/535

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/00 102

   C12P21/02 C

【請求項の数】12

【全頁数】144

(21)【出願番号】特願2006-549517(P2006-549517)

(86)(22)【出願日】2005年1月10日

(65)【公表番号】特表2007-525212(P2007-525212A)

(43)【公表日】2007年9月6日

(86)【国際出願番号】US2005000799

(87)【国際公開番号】WO2005070138

(87)【国際公開日】20050804

【審査請求日】2007年12月13日

【審判番号】不服2013-6767(P2013-6767/J1)

【審判請求日】2013年4月12日

(31)【優先権主張番号】60/535,284

(32)【優先日】2004年1月8日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/544,411

(32)【優先日】2004年2月12日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/546,631

(32)【優先日】2004年2月20日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/555,813

(32)【優先日】2004年3月23日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/570,891

(32)【優先日】2004年5月12日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514177188

【氏名又は名称】ラショファーム ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】デフリース，ショーン

(72)【発明者】

【氏名】ゾフ，デイヴィッド，エー．

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ジー−クワン

(72)【発明者】

【氏名】クラウセン，ヘンリク

【合議体】

【審判長】 鈴木 恵理子

【審判官】 高堀 栄二

【審判官】 今村 玲英子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０３／０３１４６４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００７−５１３１８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-15/90

C07K14/00-14/535

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異ペプチド配列を含む単離されたＧ−ＣＳＦポリペプチドであって、前記変異ペプチド配列が、前記単離されたポリペプチドに対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位を含み、且つ、前記変異ペプチド配列が、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ２にＧａｌＮＡｃ受容体として認識される配列であり、前記変異ペプチド配列は、Ｍ^１ＡＰＴＰＬＧＰＡであり、
前記Ｏ結合型グリコシル化部位は、プロリン残基に隣接している、単離されたＧ−ＣＳＦポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。

【請求項3】

請求項２に記載の核酸を含む発現カセット。

【請求項4】

請求項２に記載の核酸を含む細胞。

【請求項5】

以下から選択される式を有する、請求項１に記載のポリペプチド

【化1】

（式中、ＡＡは、前記変異ペプチド配列の内部にある、ヒドロキシル部分を含むアミノ酸側鎖であり、Ｘは、修飾基またはサッカリル部分である）。

【請求項6】

Ｘが、シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａ部分から選択される基を含み、前記シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａのうちの少なくとも１つが修飾基を含む、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項7】

Ｘが以下の部分

【化2】

（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、
Ｇは、Ｒ１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから選択されるメンバーであり、
Ｒ１は、直鎖状または分枝状のポリ（エチレングリコール）残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、
Ｌは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、
ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであるとき、ＤはＲ１−Ｌ−ＮＨ−である）
を含む、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項8】

Ｘが以下の構造体

【化3】

（式中、Ｌは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、ｎは、０〜５００の整数から選択される）
を含む、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項9】

Ｘが以下の構造体

【化4】

（式中、ｓは、０〜２０の整数から選択される）
を含む、請求項５に記載のポリペプチド。

【請求項10】

請求項１に記載のポリペプチドの複合糖質を作製する方法であって、
（ａ）遺伝子組換えによって請求項１に記載のポリペプチドを生産するステップと、
（ｂ）前記Ｏ結合型グリコシル化部位において、修飾された糖で前記ポリペプチドを酵素的にグリコシル化するステップと、を含む方法。

【請求項11】

修飾された糖と複合糖質を形成している請求項１に記載のポリペプチドを有効量含む、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を含む医薬組成物。

【請求項12】

前記修飾された糖が、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーで修飾されている、請求項１１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２００４年１月８日に出願された米国仮出願第６０／５３５２８４号、２００４年２月１２日に出願された米国仮出願第６０／５４４４１１号、２００４年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／５４６６３１号、２００４年３月２３日に出願された米国仮出願第６０／５５５８１３号、２００４年５月１２日に出願された米国仮出願第６０／５７０８９１号に関連する。あらゆる目的のためにこれら各文献の全体を参照により本明細書に組み込む。

【0002】

本発明は、Ｏ結合型グリコシル化糖ペプチド、特に、野生型ペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位を含む治療用ペプチドおよびペプチド変異体に関する。

【背景技術】

【0003】

特定の生理反応を生じさせることを目的としたグリコシル化および非グリコシル化ペプチドの投与は、医薬分野では周知である。例えば、精製ｈＧＨおよび組換えｈＧＨの双方が、ｈＧＨ欠乏に起因する状態および疾患、例えば子供における小人症を治療するために使用されており、インターフェロンは、抗ウイルス活性を有することが知られており、また、顆粒球コロニー刺激因子は、白血球産生を促進する。

【0004】

治療用ペプチドの使用を制限してきた主要な要因は、野生型ペプチドのグリコシル化パターンを有するペプチドを発現する発現系を人工的に作る際につきまとう困難である。当技術分野で公知であるように、不適切または不完全にグリコシル化されたペプチドは、免疫原性になり、ペプチドを無効にし、かつ／またはアレルギー反応の発生をもたらすことがある。組換えによって作製された糖ペプチドのその他の欠陥には、最適とは言えない効力および急速なクリアランス速度が含まれる。

【0005】

グリコシル化ペプチド治療薬の作製につきものの諸問題を解決する１つの方法は、ペプチドが発現された後にそれらをｉｎ ｖｉｔｒｏで修飾することである。発現後のｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾は、グリカン構造の修飾および新規の部位へのグリカンの導入の双方に使用されている。真核生物の組換えグリコシルトランスフェラーゼの包括的なツールボックスが利用可能であり、これにより、特別に設計されたグリコシル化パターンおよびグリコシル構造を有する哺乳動物の複合糖質をｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素合成することが可能となっている。例えば、米国特許第５８７６９８０号、米国特許第６０３０８１５号、米国特許第５７２８５５４号、米国特許第５９２２５７７号、ＷＯ９８３１８２６号、ＵＳ２００３１８０８３５号、およびＷＯ０３／０３１４６４号を参照のこと。

【0006】

ポリペプチド上でグリコシル基の構造を操作する他に、糖ペプチドは、水溶性ポリマーなど糖類ではない１つまたは複数の修飾基を用いて調製することもできる。ペプチドに結合されている例示的なポリマーは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。ＰＥＧを使用してペプチド治療薬を誘導体化すると、ペプチドの免疫原性が低減されることが実証されている。例えば、米国特許第４１７９３３７号（Ｄａｖｉｓ他）では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールに結合させた酵素やペプチドホルモンなど非免疫原性ポリペプチドを開示している。免疫原性の低減に加えて、問題のポリペプチドのＰＥＧコンジュゲートのサイズが増大することにより、循環におけるクリアランス時間が延長される。

【0007】

ＰＥＧおよびその誘導体をペプチドに結合する主な態様は、ペプチドアミノ酸残基を介した非特異的な結合形成である（例えば、米国特許第４０８８５３８号、米国特許第４４９６６８９号、米国特許第４４１４１４７号、米国特許第４０５５６３５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ８７／０００５６号を参照のこと）。ＰＥＧをペプチドに結合する別の態様は、糖ペプチド上のグリコシル残基の非特異的酸化を介するものである（例えば、ＷＯ９４／０５３３２号を参照のこと）。

【0008】

これらの非特異的な方法では、ランダムにかつ非特異的に、ペプチド主鎖上の反応性残基にポリエチレングリコールが付加される。当然、ＰＥＧ分子のランダムな付加は、最終生成物の均質性の欠如、およびそのペプチドの生物活性または酵素活性の低減する可能性を含めて、欠点を有する。したがって、治療用ペプチドを作製するためには、特異的に標識され、容易に特徴づけることができ、ほぼ均質な生成物を形成させる誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚａｔｉｏｎ）戦略が優れている。

【0009】

特異的に標識された均質なペプチド治療薬は、酵素作用によってｉｎ ｖｉｔｒｏで作製することができる。合成ポリマーまたは他の標識をペプチドに結合させるための一般的な非特異的方法とは異なり、酵素に基づく合成は、位置選択性および立体選択性という長所を有する。標識ペプチドの合成に使用するための酵素の主要な２種のクラスは、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）、およびグリコシダーゼである。これらの酵素を用いて、治療効果を有する部分を含むようにその後で修飾することができる糖を特異的に付加することができる。あるいは、グリコシルトランスフェラーゼおよび改変されたグリコシダーゼを用いて、修飾された糖をペプチド主鎖に直接転移させることができる（例えば、米国特許第６３９９３３６号、米国特許出願公開第２００３００４００３７号、第２００４０１３２６４０号、第２００４０１３７５５７号、第２００４０１２６８３８号、および第２００４０１４２８５６号を参照のこと。これら各文献を参照により本明細書に組み込む）。化学合成要素と酵素合成要素の双方を併用する方法も公知である（例えば、参照により本明細書に組み込むＹａｍａｍｏｔｏ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：４１５〜４２２頁（１９９８年）および米国特許出願公開第２００４０１３７５５７号を参照のこと）。

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

糖質は、いくつかの方法で糖ペプチドに付加される。そのうち、アスパラギンへのＮ結合型ならびにセリンおよびトレオニンにＯ結合したムチン型が、組換え糖タンパク質治療薬として最も適している。残念ながら、すべてのポリペプチドが、その一次アミノ酸配列の一部としてＮまたはＯ結合型グリコシル化部位を含むわけではない。その他の場合では、既存のグリコシル化部位が、修飾基（例えば、水溶性ポリマーまたは水不溶性ポリマー、治療効果を有する部分、および／または生体分子）をポリペプチドに付加するのに不都合な場合があり、あるいは、その部位にこのような部分が付加することにより、ポリペプチドの生物活性の望ましくない低減が引き起こされることがある。したがって、グリコシル化部位の正確な作製とそれらの部位の修飾を正確に指示する能力の双方を実現する方法が当技術分野では必要である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

Ｏ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位に結合しているグリコシル残基を標的として酵素的な複合糖質形成反応を特異的に起こすことができるということが本発明の発見である。標的とするＯ結合型グリコシル化部位は、野生型ペプチドに本来備わっている部位でもよく、あるいは、突然変異によってペプチドに導入したものでもよい。したがって、本発明は、Ｏ結合型グリコシル化に適した変異部位を含むポリペプチドおよびその医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチドを作製し、そのようなポリペプチドおよび／またはその医薬組成物を治療上の処置のために使用する方法も提供する。

【0012】

したがって、第１の態様では、本発明は、対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位をコードしている変異ペプチド配列を含む、単離されたポリペプチドを提供する。

【0013】

一実施形態では、単離されたポリペプチドは、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドである。

【0014】

一実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｍ^１Ｘ_ｎＴＰＬＧＰまたはＭ^１Ｂ_ｏＰＺ_ｍＸ_ｎＴＰＬＧＰの式で表される変異ペプチド配列を含む。この実施形態では、上付き文字１は、野生型Ｇ−ＣＳＦ配列（配列番号１４３）のアミノ酸配列の第１位を示し、下付き文字ｎおよびｍは、０〜３から選択される整数であり、ＸおよびＢのうちの少なくとも１つはトレオニンまたはセリンであり、また、ＸおよびＢのうちの複数がトレオニンまたはセリンであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。またこの実施形態では、Ｚは、グルタミン酸、任意の非荷電アミノ酸、またはＭＱ、ＧＱ、およびＭＶを含むジペプチド化合物から選択される。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＭＶＴＰＬＧＰ（配列番号：１）、ＭＱＴＰＬＧＰ（配列番号：２）、ＭＩＡＴＰＬＧＰ（配列番号：３）、ＭＡＴＰＬＧＰ（配列番号：４）、ＭＰＴＱＧＡＭＰＬＧＰ（配列番号：５）、ＭＶＱＴＰＬＧＰ（配列番号：６）、ＭＱＳＴＰＬＧＰ（配列番号：７）、ＭＧＱＴＰＬＧＰ（配列番号：８）、ＭＡＰＴＳＳＳＰＬＧＰ（配列番号：９）、およびＭＡＰＴＰＬＧＰＡ（配列番号：１０）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0015】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｍ^１ＴＰＸＢＯ_ｒＰの式で表される変異ペプチド配列を含む。この実施形態では、上付き文字１は、野生型Ｇ−ＣＳＦ配列（配列番号１４３）のアミノ酸配列の第１位を示し、下付き文字ｒは、０〜３から選択される整数であり、Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの少なくとも１つはトレオニンまたはセリンであり、また、Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの複数がトレオニンまたはセリンであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＭＴＰＴＬＧＰ（配列番号：４）、ＭＴＰＴＱＬＧＰ（配列番号：１１）、ＭＴＰＴＳＬＧＰ（配列番号：１３）、ＭＴＰＴＱＧＰ（配列番号：１４）、ＭＴＰＴＳＳＰ（配列番号：１５）、Ｍ^１ＴＰＱＴＰ（配列番号：１６）、Ｍ^１ＴＰＴＧＰ（配列番号：１７）、Ｍ^１ＴＰＬＴＰ（配列番号：１８）、Ｍ^１ＴＰＮＴＧＰ（配列番号：１９）、ＭＴＰＬＧＰ（配列番号：１９０）、Ｍ^１ＴＰＶＴＰ（配列番号：２０）、Ｍ^１ＴＰＭＶＴＰ（配列番号：２１）、およびＭＴ^１Ｐ^２ＴＱＧＬ^３Ｇ^４Ｐ^５Ａ^６Ｓ^７（配列番号：２２）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0016】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＬＧＸ^５３Ｂ_ｏＬＧＩ（式中、上付き文字は、野生型Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列におけるアミノ酸位置を示し、Ｘは、ヒスチジン、セリン、アルギニン、グルタミン酸、またはチロシンであり、Ｂは、トレオニンまたはセリンであり、ｏは、０〜３の整数である）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＬＧＨＴＬＧＩ（配列番号：２３）、ＬＧＳＳＬＧＩ（配列番号：２４）、ＬＧＹＳＬＧＩ（配列番号：２５）、ＬＧＥＳＬＧＩ（配列番号：２６）、およびＬＧＳＴＬＧＩ（配列番号：２７）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0017】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｐ^１２９Ｚ_ｍＪ_ｑＯ_ｒＸ_ｎＰＴ（式中、上付き文字は、野生型Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列におけるアミノ酸位置を示し、Ｚ、Ｊ、Ｏ、およびＸは、トレオニンまたはセリンからそれぞれ独立に選択され、ｍ、ｑ、ｒ、およびｎは、０〜３からそれぞれ独立に選択される整数である）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｐ^１２９ＡＴＱＰＴ（配列番号：２８）、Ｐ^１２９ＴＬＧＰＴ（配列番号：２９）、Ｐ^１２９ＴＱＧＰＴ（配列番号：３０）、Ｐ^１２９ＴＳＳＰＴ（配列番号：３１）、Ｐ^１２９ＴＱＧＡＰＴ（配列番号：３２）、Ｐ^１２９ＮＴＧＰＴ（配列番号：３３）、ＰＡＬＱＰＴＱＴ（配列番号：３４）、Ｐ^１２９ＡＬＴＰＴ（配列番号：３５）、Ｐ^１２９ＭＶＴＰＴ（配列番号：３６）、Ｐ^１２９ＡＳＳＴＰＴ（配列番号：３７）、Ｐ^１２９ＴＴＱＰ（配列番号：３８）、Ｐ^１２９ＮＴＬＰ（配列番号：３９）、Ｐ^１２９ＴＬＱＰ（配列番号：４０）、ＭＡＰ^１２９ＡＴＱＰＴＱＧＡＭ（配列番号：４１）、およびＭＰ^１２９ＡＴＴＱＰＴＱＧＡＭ（配列番号：４２）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0018】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＰＺ_ｍＵ_ｓＪ_ｑＰ^６１Ｏ_ｒＸ_ｎＢ_ｏＣ（式中、上付き文字は、野生型Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列におけるアミノ酸位置を示し、Ｚ、Ｊ、Ｏ、およびＵのうちの少なくとも１つは、トレオニンまたはセリンから選択され、また、Ｚ、Ｊ、Ｏ、およびＵのうちの複数がトレオニンまたはセリンであるとき、各々はそれぞれ独立に選択され、ＸおよびＢは任意の非荷電アミノ酸またはグルタミン酸であり、ｍ、ｓ、ｑ、ｒ、ｎ、およびｏは、０〜３からそれぞれ独立に選択される整数である）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、Ｐ^６１ＴＳＳＣ（配列番号：４３）、Ｐ^６１ＴＳＳＡＣ（配列番号：４４）、ＬＧＩＰＴＡ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：４５）、ＬＧＩＰＴＱ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：４６）、ＬＧＩＰＴＱＧ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：４７）、ＬＧＩＰＱＴ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：４８）、ＬＧＩＰＴＳ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：４９）、ＬＧＩＰＴＱＰ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：５０）、ＬＧＴＰＷＡＰ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：５１）、ＬＧＴＰＦＡ Ｐ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：５２）、Ｐ^６１ＦＴＰ（配列番号：５３）、およびＳＬＧＡＰ^５８ＴＡＰ^６１ＬＳＳ（配列番号：５４）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0019】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、θ_ａＧ_ｐＪ_ｑＯ_ｒＰ^１７５Ｘ_ｎＢ_ｏＺ_ｍＵ_ｓΨ_ｔ（式中、上付き文字は、配列番号１４３におけるアミノ酸位置を示し、Ｚ、Ｕ、Ｏ、Ｊ、Ｇ、θ、Ｂ、およびＸのうちの少なくとも１つはトレオニンまたはセリンであり、また、Ｚ、Ｕ、Ｏ、Ｊ、Ｇ、θ、Ｂ、およびＸのうちの複数がトレオニンまたはセリンであるとき、それらはそれぞれ独立に選択される）の式で表される変異ペプチド配列を含む。θは場合によってはＲであり、Ｇは場合によってはＨである。記号Ψは、任意の非荷電アミノ酸残基またはグルタミン酸を表し、ａ、ｐ、ｑ、ｒ、ｎ、ｏ、ｍ、ｓ、およびｔは、０〜３からそれぞれ独立に選択される整数である。別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、ＲＨＬＡＱＴＰ^１７５（配列番号：５５）、ＲＨＬＡＧＱＴＰ^１７５（配列番号：５６）、ＱＰ^１７５ＴＱＧＡＭＰ（配列番号：５７）、ＲＨＬＡＱＴＰ^１７５ＡＭ（配列番号：５８）、ＱＰ^１７５ＴＳＳＡＰ（配列番号：５９）、ＱＰ^１７５ＴＳＳＡＰ（配列番号：６０）、ＱＰ^１７５ＴＱＧＡＭＰ（配列番号：６１）、ＱＰ^１７５ＴＱＧＡＭ（配列番号：６２）、ＱＰ^１７５ＴＱＧＡ（配列番号：６３）、ＱＰ^１７５ＴＶＭ（配列番号：６４）、ＱＰ^１７５ＮＴＧＰ（配列番号：６５）、およびＱＰ^１７５ＱＴＬＰ（配列番号：６６）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0020】

別の実施形態では、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、配列Ｐ^１３３ＴＱＴＡＭＰ^１３９（配列番号：６７）、Ｐ^１３３ＴＱＧＴＭＰ（配列番号：６８）、Ｐ^１３３ＴＱＧＴＮＰ（配列番号：６９）、Ｐ^１３３ＴＱＧＴＬＰ（配列番号：７０）、およびＰＡＬＱＰ^１３３ＴＱＴＡＭＰＡ（配列番号：７１）から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0021】

別の実施形態では、単離されたポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチドである。

【0022】

一実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｐ^１３３ＪＸＢＯＺＵＫ^１４０ＱＴＹＳ（式中、上付き文字は、配列番号１０６におけるアミノ酸位置を示し、Ｊはトレオニンおよびアルギニンから選択され、Ｘは、アラニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンから選択され、Ｂは、グリシン、アラニン、ロイシン、バリン、アスパラギン、グルタミン、およびトレオニンから選択され、Ｏは、チロシン、セリン、アラニン、およびトレオニンから選択され、Ｚは、イソロイシンおよびメチオニンから選択され、Ｕは、フェニルアラニンおよびプロリンから選択される）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、ＰＴＴＧＱＩＦＫ（配列番号：７２）、ＰＴＴＡＱＩＦＫ（配列番号：７３）、ＰＴＴＬＱＩＦＫ（配列番号：７４）、ＰＴＴＬＹＶＦＫ（配列番号：７５）、ＰＴＴＶＱＩＦＫ（配列番号：７６）、ＰＴＴＶＳＩＦＫ（配列番号：７７）、ＰＴＴＮＱＩＦＫ（配列番号：７８）、ＰＴＴＱＱＩＦＫ（配列番号：７９）、ＰＴＡＴＱＩＦＫ（配列番号：８０）、ＰＴＱＧＱＩＦＫ（配列番号：８１）、ＰＴＱＧＡＩＦＫ（配列番号：８２）、ＰＴＱＧＡＭＦＫ（配列番号：８３）、ＰＴＩＧＱＩＦＫ（配列番号：８４）、ＰＴＩＮＱＩＦＫ（配列番号：８５）、ＰＴＩＮＴＩＦＫ（配列番号：８６）、ＰＴＩＬＱＩＦＫ（配列番号：８７）、ＰＴＩＶＱＩＦＫ（配列番号：８８）、ＰＴＩＱＱＩＦＫ（配列番号：８９）、ＰＴＩＡＱＩＦＫ（配列番号：９０）、Ｐ^１３３ＴＴＴＱＩＦＫ^１４０ＱＴＹＳ（配列番号：９１）、およびＰ^１３３ＴＱＧＡＭＰＫ^１４０ＱＴＹＳ（配列番号：９２）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0023】

別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｐ^１３３ＲＴＧＱＩＰＴＱＢＹＳ（式中、上付き文字は、配列番号１６０におけるアミノ酸位置を示し、Ｂはアラニンおよびトレオニンから選択される）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、ＰＲＴＧＱＩＰＴＱＴＹＳ（配列番号：９３）およびＰＲＴＧＱＩＰＴＱＡＹＳ（配列番号：９４）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0024】

別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｌ^１２８ＸＴＢＯＰ^１３３ＵＴＧ（式中、上付き文字は、配列番号２０におけるアミノ酸位置を示し、Ｘは、グルタミン酸、バリン、およびアラニンから選択され、Ｂは、グルタミン、グルタミン酸、およびグリシンから選択され、Ｏは、セリンおよびトレオニンから選択され、Ｕは、アルギニン、セリン、アラニン、およびロイシンから選択される）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、ＬＥＴＱＳＰ^１３３ＲＴＧ（配列番号：９５）、ＬＥＴＱＳＰ^１３３ＳＴＧ（配列番号：９６）、ＬＥＴＱＳＰ^１３３ＡＴＧ（配列番号：９７）、ＬＥＴＱＳＰ^１３３ＬＴＧ（配列番号：９８）、ＬＥＴＥＴＰ^１３３Ｒ（配列番号：９９）、ＬＥＴＥＴＰ^１３３Ａ（配列番号：１００）、ＬＶＴＱＳＰ^１３３ＲＴＧ（配列番号：１０１）、ＬＶＴＥＴＰ^１３３ＲＴＧ（配列番号：１０２）、ＬＶＴＥＴＰ^１３３ＡＴＧ（配列番号：１０３）、およびＬＡＴＧＳＰ^１３３ＲＴＧ（配列番号：１０４）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0025】

別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｍ^１ＢＰＴＸ_ｎＺ_ｍＯＰＬＳＲＬ（式中、上付き文字１は、配列番号１５９におけるアミノ酸位置を示し、Ｂは、フェニルアラニン、バリン、およびアラニンまたはその組合せ物から選択され、Ｘは、グルタミン酸、バリン、およびプロリンから選択され、Ｚはトレオニンであり、Ｏは、ロイシンおよびイソロイシンから選択され、また、Ｘがプロリンであるとき、Ｚはトレオニンであり、ｎおよびｍは、０および２から選択される整数である）の式で表される変異ペプチド配列を含む。別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｍ^１ＦＰＴＥＩＰＬＳＲＬ（配列番号：１０５）、Ｍ^１ＦＰＴＶＬＰＬＳＲＬ（配列番号：１０６）、およびＭ^１ＡＰＴＰＴＩＰＬＳＲＬ（配列番号：１０７）からなる配列から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0026】

さらに別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、以下の変異ペプチド配列、すなわちＭ^１ＶＴＰＴＩＰＬＳＲＬ（配列番号：１０８）を含む。

【0027】

さらに別の実施形態では、ｈＧＨポリペプチドは、Ｍ^１ＡＰＴＳＳＰＴＩＰＬ^７ＳＲ^９（配列番号：１０９）およびＤＧＳＰ^１３３ＮＴＧＱＩＦＫ^１４０（配列番号：１１０）から選択される変異ペプチド配列を含む。

【0028】

別の実施形態では、単離されたポリペプチドは、ＩＦＮαポリペプチドである。

【0029】

一実施形態では、ＩＮＦαポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含むペプチド配列を有し、そのペプチド配列は、配列番号１８０で示される配列を有するＩＮＦα２のある領域に対応しており、その変異アミノ酸配列は、ＩＮＦα２のＴ^１０６に対応する位置に変異を含んでいる。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、ＩＦＮα、ＩＦＮα４、ＩＦＮα５、ＩＦＮα６、ＩＦＮα７、ＩＦＮα８、ＩＦＮα１０、ＩＦＮα１４、ＩＦＮα１６、ＩＦＮα１７、およびＩＦＮα２１からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＭＱＥＥＲＶＴＥＴＰＬＭＮＡＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１１）、^９９ＣＶＭＱＥＥＧＶＴＥＴＰＬＭＮＡＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１２）、および^９９ＣＶＭＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＡＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１３）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮαポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１４）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１５）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα４ポリペプチドである。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＭＭＱＥＶＧＶＴＤＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１６）、^９９ＣＭＭＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１７）および^９９ＣＭＭＱＧＶＧＶＴＤＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１８）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα５ポリペプチドである。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＭＱＥＶＷＶＴＧＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１１９）、^９９ＣＶＭＱＥＶＧＶＴＧＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２０）、および^９９ＣＶＭＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２１）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα６ポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＦＩＬ^１１８（配列番号：１２２）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＦＩＬ^１１８（配列番号：１２３）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα７ポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＭＱＥＶＧＶＴＥＳＰＬＭＹＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２４）、および^９９ＣＶＭＱＧＶＧＶＴＥＳＰＬＭＹＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２５）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα８ポリペプチドである。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２６）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２７）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα１０ポリペプチドである。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２８）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１２９）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα１４ポリペプチドである。別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＴＱＥＶＧＶＴＥＩＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３０）、^９９ＣＶＴＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３１）、および^９９ＣＶＴＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３２）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα１６ポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＭＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３３）、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３４）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＭＴＥＴＰＬＭＮＥＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３５）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα１７ポリペプチドである。別の一実施形態では、ＩＦＮαポリペプチドは、^９９ＣＶＩＱＥＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３６）、および^９９ＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＮＶＤＳＩＬ^１１８（配列番号：１３７）からなる群から選択される変異アミノ酸配列を含むＩＦＮα２１ポリペプチドである。

【0030】

第２の態様では、本発明は、対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位をコードする変異ペプチド配列を含むポリペプチドをコードしている、単離された核酸を提供する。一実施形態では、変異ペプチド配列を含むポリペプチドをコードしている核酸は、発現カセット内に含まれる。別の関連した実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含む細胞を提供する。

【0031】

第３の態様では、対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位をコードする変異ペプチド配列を含む単離されたポリペプチドは、以下から選択される式を有する。

【0032】

【化1】

（式中、ＡＡは、変異ポリペプチド配列の内部にある、ヒドロキシル部分を含むアミノ酸側鎖であり、Ｘは、修飾基またはサッカリル部分である。）一実施形態では、Ｘは、シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａ部分から選択される基を含み、前記シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａのうちの少なくとも１つは、修飾基を含む。

【0033】

別の実施形態では、Ｘは、以下の部分を含む。

【0034】

【化2】

（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ^１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｌは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであるとき、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。）

【0035】

別の実施形態では、Ｘは、以下の構造体を含む。

【0036】

【化3】

（式中、Ｌは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、ｎは、０〜約５００の整数から選択される。）

【0037】

別の実施形態では、Ｘは、以下の構造体を含む。

【0038】

【化4】

（式中、ｓは、０〜２０の整数から選択される。）

【0039】

第４の態様では、本発明は、対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位をコードする変異ペプチド配列を含む単離されたポリペプチドの複合糖質を作製するための方法であって、
（ａ）組換えによって変異ポリペプチドを作製するステップと、
（ｂ）前記Ｏ結合型グリコシル化部位において、修飾された糖でその変異ポリペプチドを酵素的にグリコシル化するステップとを含む方法を提供する。

【0040】

第５の態様では、本発明は、対応する野生型ポリペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位をコードする変異ペプチド配列を含む単離されたポリペプチドの医薬組成物を提供する。

【0041】

一実施形態では、この医薬組成物は、修飾された糖と複合糖質を形成している本発明のＧ−ＣＳＦポリペプチドを有効量含む。関連した実施形態では、この修飾された糖は、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーで修飾されている。

【0042】

別の実施形態では、この医薬組成物は、修飾された糖と複合糖質を形成している本発明のｈＧＨポリペプチドを有効量含む。関連した実施形態では、この修飾された糖は、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーで修飾されている。

【0043】

別の実施形態では、この医薬組成物は、修飾された糖と複合糖質を形成している本発明の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチドを有効量含む。関連した実施形態では、この修飾された糖は、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーで修飾されている。

【0044】

別の実施形態では、この医薬組成物は、修飾された糖と複合糖質を形成している本発明のＩＦＮαポリペプチドを有効量含む。関連した実施形態では、この修飾された糖は、ポリエチレングリコールおよびメトキシポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ）から選択されるメンバーで修飾されている。

【0045】

第６の態様では、本発明は、治療を必要とする対象に治療を提供する方法であって、本発明の医薬組成物を有効量、前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、提供される治療は、Ｇ−ＣＳＦによる治療である。別の実施形態では、提供される治療は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子治療である。別の実施形態では、提供される治療は、インターフェロンα治療である。さらに別の実施形態では、提供される治療は、成長ホルモン治療である。

【0046】

本発明の追加の態様、利点、および目的は、以下の詳細な説明から明らかになろう。

【発明を実施するための最良の形態】

【0047】

略語
ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ｍ−ＰＥＧ、メトキシポリエチレングリコール；ＰＰＧ、ポリプロピレングリコール；ｍ−ＰＰＧ、メトキシポリプロピレングリコール；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、マンノサミニルアセタート；Ｓｉａ、シアル酸；ＮｅｕＡｃ、Ｎ−アセチルノイラミニル。

【0048】

定義
別段の定めが無い限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用する命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。核酸およびペプチドの合成には標準技術が使用される。これらの技術および手順は、本明細書の全体を通じて提供される、当技術分野の従来の方法および様々な一般的参考文献（一般には、参照により本明細書に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ他、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、（１９８９年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーを参照のこと）に従って一般に実施される。本明細書で使用する命名法、ならびに後述する分析化学および有機合成における実験手順は、当技術分野で周知であり一般に使用されるものである。標準技術またはその改変法が、化学合成および化学的分析に使用される。

【0049】

本明細書で記述するすべてのオリゴ糖は、非還元糖の名称または略語（すなわち、Ｇａｌ）、その後にグリコシド結合の立体配置（αまたはβ）、環結合（１または２）、結合に関与している還元糖の環の位置（２、３、４、６、または８）、次に、還元糖の名称または略語（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ）を書いて記述する。各糖はピラノースであることが好ましい。標準的な糖鎖生物学命名法の総説については、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖａｒｋｉ他編、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９９年）を参照のこと。

【0050】

オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であるかどうかに関わらず、還元末端および非還元末端を有しているとみなされている。一般に認められている命名法に従い、本明細書では、左側に非還元末端、右側に還元末端を書いてオリゴ糖を表現する。

【0051】

「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の型のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを意味する。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸に類似した結合特性を有し、天然のヌクレオチドに類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。別段の定めが無い限り、個々の核酸配列は、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換体）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列、ならびに、明示的に示される配列も暗黙的に包含する。詳細には、縮重コドン置換体は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって、実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされているｍＲＮＡと交換可能に使用される。

【0052】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の作製に関与しているＤＮＡ部分を意味する。これは、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレイラー）、ならびに個々のコード部分（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでもよい。

【0053】

「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に対して使用するとき、その核酸またはタンパク質が、天然の状態では結合している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。核酸またはタンパク質は、乾燥状態でも水溶液でもよいが、均質な状態であることが好ましい。純度および均質性は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術によって決定される。調製物中に存在する主な化学種であるタンパク質は、実質的に精製されている。具体的には、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接しタンパク質をコードしている、目的の遺伝子以外のオープンリーディングフレームから分離されている。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中に本質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、この用語は、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を有することを意味する。

【0054】

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同じ様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックを意味する。天然アミノ酸は、遺伝コードにコードされているもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを意味する。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸ミメティック」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同じ様に機能する化学化合物を意味する。

【0055】

当技術分野では、ポリペプチド鎖に部位特異的に非天然のアミノ酸誘導体または類似体を組み込むことを可能にする様々な公知の方法がある。例えば、ＷＯ０２／０８６０７５号を参照のこと。

【0056】

本明細書では、一般に知られている３文字の記号によって、または、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字の記号によって、アミノ酸を呼んでよい。同様に、ヌクレオチドも、一般に認められている１文字の記号によって呼んでよい。

【0057】

「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の双方に適用される。個々の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、あるいは、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を意味する。遺伝コードの縮重により、多数の機能的に同一な核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなく、記述した対応するコドンのいずれかにコドンを変更することができる。このような核酸変異は、保存的に改変される変異の１種である「サイレント変異」である。あるポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列は、その核酸の起こりうるすべてのサイレント変異も説明する。ある核酸の（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧ以外の）各コドンを改変して機能的に同一な分子を得られることが、当業者には認識されよう。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記述した各配列に潜在的に含まれる。

【0058】

アミノ酸配列に関しては、コードされている配列中の単一のアミノ酸または低い比率のアミノ酸を改変、追加、または除去する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加が、「保存的に改変された変異体」であり、その際、その改変によって、あるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸で置換されることが、当業者には認識されよう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。これら保存的に改変された変異体は、本発明の多形性変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加するものであり、それらを除外するものではない。

【0059】

以下の８種のグループはそれぞれ、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照のこと）。

【0060】

本明細書では、一般に知られている３文字の記号によって、または、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字の記号によって、アミノ酸を呼んでよい。同様に、ヌクレオチドも、一般に認められている１文字の記号によって呼んでよい。

【0061】

本出願では、１番の番号をつけられる、未修飾の野生型ポリペプチド配列中の最もＮ末端にある残基からの相対的な位置に従って、アミノ酸残基に番号をつける。

【0062】

「ペプチド」とは、モノマーがアミノ酸であり、アミド結合を介してそれらが相互に結合しているポリマーを意味する。本発明のペプチドは、例えば、２つのアミノ酸から数百または数千のアミノ酸まで、様々な大きさのものでよく、代わりにポリペプチドとも呼ばれる。さらに、非天然アミノ酸、例えば、β−アラニン、フェニルグリシン、およびホモアルギニンも含まれる。遺伝子によってコードされていないアミノ酸も本発明で使用してよい。さらに、反応性基、グリコシル化部位、ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子などを含むように修飾されたアミノ酸も、本発明で使用してよい。本発明で使用するアミノ酸はすべて、Ｄ型異性体でもＬ型異性体でもよい。一般にＬ型異性体が好ましい。さらに、他のペプチドミメティックも、本発明で有用である。本明細書では、「ペプチド」とは、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドの双方を意味する。ペプチドを発現する系によって不完全にグリコシル化されたペプチドも含まれる。一般的な総説については、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳ、ＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク、２６７頁（１９８３年）を参照のこと。

【0063】

本出願では、１番の番号をつけられる、ペプチド配列中のＮ末端、例えば、最も左の残基からの相対的な位置に従って、アミノ酸残基に番号をつける。

【0064】

「変異ポリペプチド」または「変異タンパク質」という用語は、その対応する野生型または天然に存在する型と異なるペプチドの型を意味する。変異ペプチドは、変異ペプチドをもたらす１つまたは複数の変異、例えば、置換、挿入、欠失などを含んでよい。

【0065】

「ペプチドコンジュゲート」という用語は、ペプチドが、本発明で説明するような修飾された糖と複合糖質を形成している、本発明の化学種を意味する。代表的な例では、このペプチドは、野生型ペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位を有する変異ペプチドである。

【0066】

本明細書では、「プロリン残基の近位」とは、プロリン残基からの距離がアミノ酸約１０個未満、好ましくは、プロリン残基からの距離がアミノ酸約９、８、７、６または５個、より好ましくは、プロリン残基からの距離が残基約４、３、２または１個未満であるアミノ酸を意味する。「プロリン残基の近位の」アミノ酸は、プロリン残基のＣ末端側にあってもＮ末端側にあってもよい。

【0067】

「シアル酸」という用語は、炭素９個のカルボキシル化糖ファミリーの任意のメンバーを意味する。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノス−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、またはＮＡＮＡと略される）である。ファミリーの第２のメンバーは、ＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基がヒドロキシル化されているＮ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）である。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏ他、（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０〜１１５５７頁；Ｋａｎａｍｏｒｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１〜２１８１９頁（１９９０年））。９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃや９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−Ｏ−Ｃ_１〜Ｃ_６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、および９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃなどの９位置換シアル酸も含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Ｖａｒｋｉ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：２５〜４０頁（１９９２年）；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９２年））を参照のこと。シアル酸付加手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０号で開示されている。

【0068】

本明細書では、「修飾された糖」という用語は、本発明の方法においてペプチドのアミノ酸またはグリコシル残基上に酵素的に付加される、天然または非天然の糖を意味する。修飾された糖は、それだけには限らないが、糖ヌクレオチド（１リン酸型、２リン酸型、および３リン酸型）、活性化糖（例えば、グリコシルハライド、グリコシルメシラート）、および活性化されてもおらず、ヌクレオチドでもない糖を含めて、いくつかの酵素基質から選択される。「修飾された糖」は、「修飾基」によって共有結合によって官能化されている。有用な修飾基には、それだけには限らないが、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、診断用の部分、生体分子などが含まれる。修飾基は、天然、すなわち未修飾の糖ではないことが好ましい。修飾基による官能化の位置は、「修飾された糖」が酵素的にペプチドに付加されるのを妨げないように、選択する。

【0069】

「水溶性」という用語は、水中でいくらかの検出可能な程度の溶解性を示す部分を意味する。水溶性を検出および／または定量する方法は、当技術分野で周知である。例示的な水溶性ポリマーには、ペプチド、糖、ポリエーテル、ポリアミン、ポリカルボン酸などが含まれる。ペプチドは、混合配列を有するものでも、単一のアミノ酸から構成されるもの、例えば、ポリリシンでもよい。例示的な多糖はポリシアル酸である。例示的なポリエーテルは、ポリエチレングリコール、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリエチレンイミンは、例示的なポリアミンであり、ポリアクリル酸は、代表的なポリカルボン酸である。

【0070】

水溶性ポリマーのポリマー主鎖は、ポリエチレングリコール（すなわちＰＥＧ）でよい。しかし、他の関連ポリマーも、本発明の実施において使用するのに適していること、ならびに、ＰＥＧまたはポリエチレングリコールという用語の使用は、この点に関して包括的であり排他的ではないことを理解すべきである。ＰＥＧという用語は、アルコキシＰＥＧ、２官能性ＰＥＧ、マルチアームＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、ペンダント型ＰＥＧ（すなわち、ポリマー主鎖につり下がった１つまたは複数の官能基を有するＰＥＧまたは関連ポリマー）、あるいは、内部に分解性の結合を有するＰＥＧを含めて、任意の形態のポリエチレングリコールを含む。

【0071】

ポリマー主鎖は、直鎖状でも分枝状でもよい。分枝状のポリマー主鎖は、一般に、当技術分野で公知である。一般に、分枝ポリマーは、中央の分枝コア部分と、中央の分枝コア部分に連結されている複数の直鎖状ポリマー鎖とを有する。ＰＥＧは、グリセロール、ペンタエリトリトール、およびソルビトールなどの様々な多価アルコールにエチレンオキシドを付加することにより調製できる分枝型で一般に使用される。中央の分枝部分は、リシンなどいくつかのアミノ酸から誘導することもできる。分枝ポリエチレングリコールは、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）_ｍ（式中、Ｒは、グリセロールやペンタエリトリトールなどのコア部分を表し、ｍは、アームの数を表す）として一般的な形式で表すことができる。参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第５９３２４６２号で記載されているものなどのマルチアームＰＥＧ分子も、ポリマー主鎖として使用することができる。

【0072】

多くの他のポリマーも、本発明に適している。２〜約３００の末端を有する水溶性非ペプチド性ポリマー主鎖が、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、それだけには限らないが、ポリプロピレングリコール（「ＰＰＧ」）など他のポリアルキレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールなどとの共重合体、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリオレフィンアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリビニルアルコール、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、参照によりその全体を本明細書に組み入れる米国特許第５６２９３８４号で記載されているようなポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ならびに、それらの共重合体、三元重合体、および混合物が挙げられる。ポリマー主鎖の各鎖の分子量は変わり得るが、通常、約１００Ｄａ〜１００，０００Ｄａ、しばしば、約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａの範囲である。

【0073】

本明細書では、「複合糖質形成」という用語は、ポリペプチド、例えば、本発明の変異ヒト成長ホルモンのアミノ酸またはグリコシル残基への修飾された糖種の酵素を介した結合を意味する。「複合糖質形成」の小区分は、修飾された糖の修飾基がポリエチレングリコール、およびそのアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）または反応性誘導体（例えば、Ｈ_２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「グリコール−ＰＥＧ化」である。

【0074】

「大規模」および「工業規模」という用語は、同義的に使用され、１回の反応サイクルの完了時に少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約１ｇの複合糖質を生成する反応サイクルを意味する。

【0075】

「グリコシル結合基」という用語は、本明細書では、修飾基（例えば、ＰＥＧ部分、治療効果を有する部分、生体分子）が共有結合しているグリコシル残基を意味する。グリコシル結合基は、コンジュゲートの残りの部分に修飾基を連結する。本発明の方法では、「グリコシル結合基」は、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに共有結合し、それによって、ペプチド上のアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に作用物質を結合させる。「グリコシル結合基」は、通常、ペプチドのアミノ酸残基および／またはグリコシル残基に「修飾された糖」を酵素的に付加させることによって、「修飾された糖」から誘導される。グリコシル結合基は、修飾基によって修飾された糖のカセットを形成する間に分解される（酸化→シッフ塩基形成→還元）、糖から誘導された構造体でよく、あるいは、グリコシル結合基は完全なものでもよい。「完全なグリコシル結合基」とは、修飾基をコンジュゲートの残りの部分に連結している糖モノマーが分解されていない、例えば、例えばメタ過ヨウ素酸ナトリウムによって酸化されていないグリコシル部分から誘導される結合基を意味する。本発明の「完全なグリコシル結合基」は、１つもしくは複数のグリコシル単位を付加することにより、または親となる糖構造体から１つもしくは複数のグリコシル単位を除去することにより、天然のオリゴ糖から誘導することができる。

【0076】

「標的性部分」という用語は、本明細書では、身体の特定の組織または領域に選択的に局在すると考えられる化学種を意味する。この局在は、分子決定基の特異的認識、標的性作用物質または標的性コンジュゲートの分子サイズ、イオン性相互作用、疎水性相互作用などによって起こる。作用物質を特定の組織または領域に標的化する他の機序は、当業者に公知である。例示的な標的性部分としては、抗体、抗体断片、トランスフェリン、ＨＳ−糖タンパク質、凝固因子、血清タンパク質、β−糖タンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯなどが挙げられる。

【0077】

本明細書では、「治療効果を有する部分」とは、それだけには限らないが、抗生物質、抗炎症物質、抗腫瘍薬、サイトトキシン、および放射性物質を含めて、治療に有用な任意の作用物質を意味する。「治療効果を有する部分」には、生理活性物質のプロドラッグ、複数の治療効果を有する部分が担体に結合している構築体、例えば、多効果性の（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）作用物質が含まれる。治療効果を有する部分には、タンパク質およびタンパク質を含む構築体も含まれる。例示的なタンパク質としては、それだけには限らないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、β、γ）、インターロイキン（例えば、インターロイキンＩＩ）、血清タンパク質（例えば、第ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および黄体形成（Ｌｕｔｅｎｉｚｉｎｇ）ホルモン（ＬＨ）および抗体融合タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子レセプター（（ＴＮＦＲ）／Ｆｃドメイン融合タンパク質））が挙げられる。

【0078】

本明細書では、「抗腫瘍薬」とは、それだけには限らないが、サイトトキシン、ならびに代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロン、放射性物質などの作用物質を含めて、癌と闘うのに有用な任意の作用物質を意味する。抗腫瘍活性を有するペプチド、例えばＴＮＦ−αのコンジュゲートも、「抗腫瘍薬」という用語の範囲に包含される。コンジュゲートには、それだけには限らないが、治療効果を有するタンパク質と本発明の糖タンパク質との間で形成されるものも含まれる。代表的なコンジュゲートは、ＰＳＧＬ−１とＴＮＦ−αの間で形成されるものである。

【0079】

本明細書では、「サイトトキシンまたは細胞障害性物質」とは、細胞に対して有害である任意の作用物質を意味する。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシネジオン（ａｎｔｈｒａｃｉｎｅｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体が挙げられる。他の毒素としては、例えば、ヒマ毒、ＣＣ−１０６５および類似体、デュオカルマイシン類が挙げられる。さらに他の毒素としては、ジフテリア毒素およびヘビ毒液（例えば、コブラ毒液）が挙げられる。

【0080】

本明細書では、「放射性物質」には、腫瘍を診断および撲滅するのに有効な任意の放射性同位体が含まれる。例としては、それだけには限らないが、インジウム−１１１、コバルト−６０が挙げられる。さらに、一般に放射性同位体の混合物である、ウラン、ラジウム、およびトリウムなど天然の放射性成分が、放射性物質の適切な例である。金属イオンは、一般に有機キレート化成分とキレートを形成している。

【0081】

クラウンエーテル、クリプタンドなど多くの有用なキレート基が当技術分野では公知であり、本発明の化合物に組み入れることができる（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡなど、およびＤＴＰＰ、ＥＤＴＰ、ＨＤＴＰ、ＮＴＰなどそれらのホスホン酸類似体）。例えば、Ｐｉｔｔ他「Ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｒｏｎ Ｏｖｅｒｌｏａｄ」、ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＩＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＥＤＩＣＩＮＥ、Ｍａｒｔｅｌｌ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８０年、２７９〜３１２頁、Ｌｉｎｄｏｙ、ＴＨＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣ ＬＩＧＡＮＤ ＣＯＭＰＬＥＸＥＳ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ケンブリッジ、１９８９年、Ｄｕｇａｓ、ＢＩＯＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８９年、ならびにそれらに含まれる参考文献を参照のこと。

【0082】

さらに、キレート剤、すなわちクラウンエーテルおよびシクロデキストリンの他の分子への結合を可能にする多種多様の経路が、当業者には利用可能である。例えば、Ｍｅａｒｅｓ他、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｈｅｌａｔｅ−Ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ：ＦＯＯＤ，ＮＵＴＲＩＴＩＯＮＡＬ，ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＳＰＥＣＴＳ、Ｆｅｅｎｅｙ他編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２年、３７０〜３８７頁、Ｋａｓｉｎａ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、９：１０８〜１１７頁（１９９８年）、Ｓｏｎｇ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、８：２４９〜２５５頁（１９９７年）を参照のこと。

【0083】

本明細書では、「製薬上許容される担体」には、コンジュゲートと混合したときにコンジュゲートの活性を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の物質が含まれる。例として、それだけには限らないが、リン酸緩衝化生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など標準的な薬剤用担体のうちの任意のものが挙げられる。他の担体として、滅菌液剤、被覆錠剤を含む錠剤、およびカプセル剤を挙げることができる。通常、このような担体は、デンプン、乳、糖、いくつかのタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、タルク、植物性の脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含有する。このような担体は、香料添加剤および着色添加剤または他の成分も含んでよい。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製される。

【0084】

本明細書では、「投与すること」とは、経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病巣内投与、もしくは皮下投与、吸入による投与、または徐放装置、例えばミニ浸透圧ポンプの対象への埋め込みを意味する。非経口投与および経粘膜投与（例えば、口、鼻、膣、直腸、または経皮）を含めて、任意の経路により、特に吸入によって投与を行う。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、および頭蓋内が挙げられる。さらに、注射で腫瘍を治療しようとする場合、例えば、アポトーシスを誘発しようとする場合は、投与は、腫瘍への直接投与および／または腫瘍周辺の組織中への投与でよい。他の送達形態には、それだけには限らないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれる。

【0085】

「改善すること」または「改善する」という用語は、症状の緩和、寛解、もしくは低減、または患者の肉体的健康もしくは精神的健康の改善など任意の客観的または主観的パラメータを含めて、病状または病態の治療の成功を示す任意の徴候を意味する。症状の改善は、理学的検査および／または精神鑑定の結果を含めて、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。

【0086】

「療法」という用語は、ある疾患に罹患しやすい可能性があるが、その疾患の症状をまだ経験および提示していない動物において、その疾患または病態が生じるのを防ぐこと（予防治療）、その疾患を抑制すること（発達を遅らせることもしくは阻止すること）、その疾患の症状または副作用からの軽減を提供すること（対症治療を含む）、ならびにその疾患を軽減すること（疾患の消退を引き起こすこと）を含めて、ある疾患または病態を「治療すること」またはそれらの「治療」を意味する。

【0087】

「有効量」、「有効な量」、「治療有効量」という用語、または文法的に等価な任意の用語は、ある疾患を治療するために動物に投与したときに、その疾患に対する治療を実施するのに十分である量を意味する。

【0088】

「単離された」という用語は、その物質を作製するのに使用される成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。本発明のペプチドコンジュゲートの場合、「単離された」という用語は、そのペプチドコンジュゲートを調製するのに使用される混合物中で通常はその物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。「単離された」と「純粋な」は、同義的に使用される。通常、本発明の単離されたペプチドコンジュゲートは、好ましくはある範囲として示されるレベルの純度を有する。ペプチドコンジュゲートの純度範囲の下限は約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上限は約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％より高い。

【0089】

ペプチドコンジュゲートの純度が約９０％より高いとき、それらの純度も、好ましくはある範囲として示される。この純度範囲の下限値は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。この純度範囲の上限値は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の純度である。

【0090】

純度は、当業者に認知されている任意の分析方法（例えば、銀染色ゲル上でのバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、または類似の手段）によって、測定される。

【0091】

本明細書では、「集団のほぼすべてのメンバー」とは、選択された比率の、あるペプチドに付加される修飾された糖が、そのペプチド上の複数かつ同一の受容体部位に付加されているという、本発明のペプチドコンジュゲート集団の特徴を説明している。「集団のほぼすべてのメンバー」とは、修飾された糖に結合されるペプチド上の部位の「均質性」を説明しており、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％均質である本発明のコンジュケートに関する。

【0092】

「均質性」とは、修飾された糖が結合される受容体部分の集合全体にわたる構造の一貫性を意味する。したがって、修飾された各糖部分が、他のすべての修飾された糖が結合されている受容体部位と同じ構造を有する受容体部位に結合されている本発明のペプチドコンジュゲートでは、そのペプチドコンジュゲートは、約１００％均質であると称される。均質性は、通常、ある範囲として示される。ペプチドコンジュゲートの均質性の範囲の下限値は、約６０％、約７０％、または約８０％であり、純度範囲の上限値は、約７０％、約８０％、約９０％、または約９０％より高い。

【0093】

ペプチドコンジュゲートが約９０％以上均質であるとき、それらの均質性も、好ましくはある範囲として示される。この均質性の範囲の下限値は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、または約９８％である。この純度の範囲の上限値は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％、または約１００％の均質性である。ペプチドコンジュゲートの純度は、通常、当業者には公知の１種または複数の方法、例えば、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動法などによって測定される。

【0094】

糖ペプチド種に言及するときの「実質上同一のグリコフォーム」または「実質上同一のグリコシル化パターン」とは、当該のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）によってグリコシル化されている受容体部分の比率に関係する。例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼの場合、Ｇａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒおよびシアル酸付加されたその類似体の（以下に定義するように）ほぼすべてが本発明のペプチドコンジュゲートにおいてフコシル化されている場合、実質上同一のフコシル化パターンが存在する。出発原料が、グリコシル化された受容体部分（例えば、フコシル化されたＧａｌβ１，４−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ部分）を含む場合があることが、当業者には理解されよう。したがって、算出されるグリコシル化比率は、本発明の方法によってグリコシル化される受容体部分、ならびに出発原料中で既にグリコシル化されている受容体部分を含むと考えられる。

【0095】

上記の「実質上同一の」の定義における「実質上」という用語は、一般に、ある特定のグリコシルトランスフェラーゼに対する受容体部分の少なくとも約４０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％がグリコシル化されていることを意味する。

【0096】

置換基が従来の化学式によって指定され、左から右に書かれている場合、それらは、その構造を右から左に書くことにより得られるであろう化学的に同一な置換基も等しく包含する。例えば、−ＣＨ_２Ｏ−は、−ＯＣＨ_２−も示すものとする。

【0097】

「アルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せ物を意味し、これらは、完全に飽和されているものでも、１価不飽和もしくは多価不飽和のものでもよく、２価の基および多価の基が含まれてよく、指定の炭素原子数を有する（すなわち、Ｃ_１〜Ｃ_１０は、１〜１０個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例としては、それだけには限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つまたは複数の二重結合または三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、それだけには限らないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高次の同族体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語は、別段の注記の無い限り、「ヘテロアルキル」など以下により詳細に定義するアルキルの誘導体も含むことを意図されている。炭化水素基に限定されているアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。

【0098】

「アルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、それだけには限らないが、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−で例示されるような、アルカンから誘導される２価の基を意味し、さらに、「ヘテロアルキレン」として以下に説明するような基も含む。一般的に、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有すると考えられ、１０個以下の炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、より短い鎖のアルキル基またはアルキレン基であり、通常、８個以下の炭素原子を有する。

【0099】

「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、従来の意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りの部分に結合されているアルキル基を意味する。

【0100】

「ヘテロアルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、指定された数の炭素原子とＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子とからなり、その窒素原子および硫黄原子が場合によっては酸化されてよく、その窒素ヘテロ原子が場合によっては四級化されてよい、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状の炭化水素基、あるいはそれらの組合せ物を意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に存在しても、アルキル基が分子の残りの部分に結合されている位置に存在してもよい。例としては、それだけには限らないが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（Ｏ）_２−ＣＨ_３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ_３、−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、−ＣＨ_２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ_３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_３が挙げられる。例えば、−ＣＨ_２−ＮＨ−ＯＣＨ_３や−ＣＨ_２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ_３）_３など、最大２個のヘテロ原子が連続していてよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、それだけには限らないが、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−および−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−で例示されるような、ヘテロアルキルから誘導される２価の基を意味する。ヘテロアルキレン基の場合、ヘテロ原子は、鎖の末端の一方または双方を占めてもよい（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキル結合基の場合、結合基の式が書かれる方向によっては、結合基の向きは示されない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２−の双方を表す。

【0101】

「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の用語と組み合わせて、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状型を表す。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合されている位置を占めてもよい。シクロアルキルの例としては、それだけには限らないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、それだけには限らないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。

【0102】

「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、別段の定めが無い限り、それ自体でまたは別の置換基の一部分として、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルも含むことを意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキル」という用語は、それだけには限らないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むことを意図されている。

【0103】

「アリール」という用語は、別段の定めが無い限り、多価不飽和な芳香族置換基を意味し、この置換基は、単環でも、相互に融合されまたは共有結合された多環（好ましくは１〜３個の環）でもよい。「ヘテロアリール」という用語は、その窒素原子および硫黄原子が場合によっては酸化されており、その１つまたは複数の窒素原子が場合によっては四級化されている、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を意味する。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合されることができる。アリール基およびヘテロアリール基の非限定的な例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｂ］フラニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル、ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イルおよび６−キノリルが挙げられる。上記に示したアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、後述の許容される置換基の群から選択される。

【0104】

簡潔のために、他の用語と組み合わせて使うときの「アリール」という用語は（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、上記に定義したアリール環およびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、アルキル基の炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば酸素原子によって置換されているもの（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）を含めて、アルキル基にアリール基が結合されているような基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意図されている。

【0105】

上記の用語（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）のそれぞれは、示された基の置換型と非置換型の双方を含むことを意図されている。各タイプの基に対して好ましい置換基を、以下に提供する。

【0106】

（しばしば、アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含めた）アルキルおよびヘテロアルキル基に対する置換基は、総称的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、これらは、それだけには限らないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２から、０から（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は、このような基の中の炭素原子の総数である）までの範囲の数で選択される様々な基のうちの１種または複数でよい。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換のアルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基をそれぞれ独立に意味する。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むときは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基のうちの複数が存在するときにされるのと同じように、Ｒ基のそれぞれは、独立に選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合されているとき、それらは、窒素原子と結合して５、６、または７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、それだけには限らないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むことを意図されている。置換基に関する上記の考察から、当業者には、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ_３および−ＣＨ_２ＣＦ_３）やアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）など、水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基を含むように意図されていることが理解されよう。

【0107】

アルキル基について説明した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基に対する置換基は、総称的に「アリール基置換基」と呼ばれる。これらの置換基は、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ_２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ_２Ｒ’、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−Ｒ’、−Ｎ_３、−ＣＨ（Ｐｈ）_２、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_４）アルキルから、０から芳香族環系上の空の原子価の総数までの範囲の数で選択され、式中、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、好ましくは、水素、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のヘテロアリールからそれぞれ独立に選択される。例えば、本発明の化合物が複数のＲ基を含むときは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基のそれぞれが、これらの基のうちの複数が存在するときにされるのと同じように、Ｒ基のそれぞれは、独立に選択される。以下のスキームにおいて、記号Ｘは、前述の「Ｒ」を表す。

【0108】

アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つは、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）_ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは、それぞれ独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−、または一重結合であり、ｑは０〜３の整数である）で表される置換基で場合によっては置換されてよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つが、式−Ａ−（ＣＨ_２）_ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは、それぞれ独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−、または一重結合であり、ｒは１〜４の整数である）で表される置換基で場合によっては置換されてもよい。このようにして形成された新しい環の一重結合のうちの１つは、場合によっては、二重結合に置き換えられてよい。あるいは、アリール環またはヘテロアリール環の隣接した原子上の置換基のうちの２つが、式−（ＣＲＲ’）_ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）_ｄ−（式中、ｓおよびｄは、それぞれ独立に０〜３の整数であり、Ｘは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）_２−、または−Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’−である）で表される置換基で場合によっては置換されてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、好ましくは、水素または置換もしくは非置換の（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルからそれぞれ独立に選択される。

【0109】

本明細書では、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意図されている。

【0110】

序論
本発明は、修飾された糖部分が、ペプチド上のＯ結合型グリコシル化部位に直接的または間接的に（例えば、介在するグリコシル残基によって）結合している、糖ペプチドのコンジュゲートを提供する。また、本発明のコンジュゲートを作製するための方法も提供される。

【0111】

Ｏ結合型グリコシル化部位は、通常、天然アミノ酸（例えば、セリン、トレオニン）または非天然アミノ酸（例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシン）のヒドロキシ側鎖である。例示的なＯ結合型サッカリル残基としては、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロースが挙げられる。

【0112】

本発明の方法は、Ｏ結合型グリコシル化部位を有する任意のペプチド上で実施することができる。例えば、これらの方法は、野生型ペプチド中に存在するＯ結合型グリコシル化部位にグリコシル部分が結合しているＯ結合型複合糖質を作製するのに有用である。したがって、本発明は、Ｏ結合型グリコシル化部位を含む、野生型ペプチドの複合糖質を提供する。本明細書による例示的なペプチドには、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびインターフェロンが含まれる。

【0113】

例示的な実施形態では、本発明は、対応する野生型ペプチドには存在しない１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位を含む新規な変異ペプチドも提供する。一実施形態では、変異ポリペプチドは、Ｇ−ＣＳＦポリペプチドである。他の例示的な実施形態では、変異ポリペプチドは、ｈＧＨポリペプチド、ＩＦＮαポリペプチド、またはＧＭ−ＣＳＦポリペプチドである。変異ペプチドのＯ結合型グリコシル化された種、およびＯ結合型グリコシル化変異ペプチドを調製する方法も提供される。追加の方法は、Ｏ結合型グリコシル残基、およびＯ結合型ではなくＮ結合型のグリコシル残基の合成、トリミング、および／または修飾を含む。

【0114】

例示的な態様では、本発明は、以下の式を有する変異ペプチドを提供する。

【0115】

【化5】

（式中、ＡＡは、ヒドロキシル部分を含む側鎖を有するアミノ酸である。）例示的なヒドロキシアミノ酸は、トレオニンおよびセリンである。ＧａｌＮＡｃ部分は、ヒドロキシル部分の酸素原子を介してＡＡに結合している。ＡＡは、野生型ペプチド中に存在するものでもよく、あるいは、野生型ペプチドの配列を変異させることによって追加または移動させたものでもよい。Ｘは、修飾基、サッカリル部分、例えば、シアリル、ガラクトシル、Ｇａｌ−Ｓｉａ基、あるいは、サッカリル部分および修飾基である。Ｘがサッカリル部分である例示的な実施形態では、本明細書で説明するように、Ｘは修飾基を含む。グリコシル化されるアミノ酸は、ペプチド配列のＮもしくはＣペプチド末端にあっても、ペプチド配列の内部にあってもよい。

【0116】

例示的な実施形態では、Ｘは、シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａ部分から選択される基を含み、前記シアリル、ガラクトシル、およびＧａｌ−Ｓｉａのうちの少なくとも１つは、修飾基を含む。さらに例示的な実施形態では、Ｘは、以下の部分を含む。

【0117】

【化6】

（式中、Ｄは、−ＯＨおよびＲ^１−Ｌ−ＨＮ−から選択されるメンバーであり、Ｇは、Ｒ^１−Ｌ−および−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルから選択されるメンバーであり、Ｒ^１は、直鎖状または分枝状のポリエチレングリコール残基を含む部分から選択されるメンバーを含む部分であり、Ｌは、結合、置換または非置換のアルキル、および置換または非置換のヘテロアルキルから選択されるメンバーであるリンカーであり、ＤがＯＨであるとき、ＧはＲ^１−Ｌ−であり、Ｇが−Ｃ（Ｏ）（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであるとき、ＤはＲ^１−Ｌ−ＮＨ−である。）

【0118】

別の例示的な実施形態では、Ｘは、以下の構造体を含む。

【0119】

【化7】

（式中、Ｌは、置換もしくは非置換のアルキル、または置換もしくは非置換のヘテロアルキル基であり、ｎは、０〜約２５００の整数から選択される。）さらに別の例示的な実施形態では、Ｘは、以下の構造体を含む。

【0120】

【化8】

（式中、ｓは、０〜２０の整数から選択される。）

【0121】

別の例示的な実施形態では、ＡＡは、変異ペプチドのプロリンに富む部分内に位置しており、かつ／または、ＡＡは、プロリン残基の近位にある。Ｏ結合型グリコシル化部位を形成する適切な配列は、１つまたは複数の推定上のＯ結合型グリコシル化部位を含んでいる短いペプチドの酵素的なＯ結合型グリコシル化を調べることによって、容易に決定される。

【0122】

本発明のコンジュゲートは、ペプチドと、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、診断用の部分、標的性部分など多様な化学種との間で形成される。リンカーアームを介して相互に結合した２つ以上のペプチドを含むコンジュゲート、すなわち、多機能性コンジュゲートも提供される。その際、少なくとも１つのペプチドがＯ−グリコシル化されており、あるいは、Ｏ−グリコシル化変異部位を含んでいる。本発明の多機能性コンジュゲートは、同じペプチドの２つ以上のコピー、あるいは、様々な構造および／または諸特性を有する多様なペプチドの集団を含むことができる。この実施形態による例示的なコンジュゲートでは、２つのペプチド間のリンカーは、Ｏ結合型グリコシルの完全なグリコシル結合基などＯ結合型グリコシル残基を介して、ペプチドのうちの少なくとも１つに結合している。

【0123】

本発明のコンジュゲートは、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドへの修飾された糖の酵素的付加によって形成される。この修飾された糖は、Ｏ結合型グリコシル化部位に、あるいは、直接的または間接的に（例えば、１つまたは複数のグリコシル残基を介して）Ｏ結合型グリコシル化部位に結合しているグリコシル残基に直接付加される。本発明は、修飾された糖が、Ｎ結合型部位、あるいはＮ結合型グリコシル化部位に直接的または間接的に結合しているグリコシル残基に直接結合されている、Ｏ結合型グリコシル化ペプチドのコンジュゲートも提供する。

【0124】

この修飾された糖は、ペプチド（またはグリコシル残基）と糖上の修飾基の間に介在しているとき、本明細書で「完全なグリコシル結合基」と呼ぶものとなる。グリコシルトランスフェラーゼなどの酵素の精巧な選択性を用いて、本発明の方法は、１つまたは複数の特定の位置に所望の基を有するペプチドを提供する。したがって、本発明によれば、修飾された糖は、ペプチド鎖上の選択された位置に直接結合されており、あるいは、修飾された糖は、糖ペプチドの糖部分に付加されている。修飾された糖が、糖ペプチドの糖にも、直接ペプチド主鎖のアミノ酸残基にも結合されているペプチドも、本発明の範囲内である。

【0125】

公知の化学的および酵素的ペプチド合成戦略とは対照的に、本発明の方法は、実質上均質な誘導体化パターンを有するペプチドおよび糖ペプチドを構築することを可能にする。本発明で使用する酵素は、一般に、ペプチドの特定のあるアミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の組合せ物に対して選択的である。これらの方法は、修飾されたペプチドおよび糖ペプチドの大量生産にも実用的である。したがって、本発明の方法は、予め選択した均一な誘導体化パターンを有する糖ペプチドを大量調製するための実用的手段を提供する。これらの方法は、それだけには限らないが、細胞培養用の細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、もしくは原核細胞）またはトランスジェニック植物もしくは動物中で作製される間に不完全にグリコシル化される糖ペプチドを含めて、治療用ペプチドを修飾するのに特によく適している。

【0126】

本発明は、例えば、クリアランス速度の低減によって、または免疫もしくは細網内皮系（ＲＥＳ）による取込み速度の低減によって、治療効果の半減期を延長したグリコシル化ペプチドおよび非グリコシル化ペプチドのコンジュゲートも提供する。さらに、本発明の方法は、ペプチド上の抗原決定基をマスキングし、それによって、そのペプチドに対する宿主の免疫応答を低減または消失させるための方法も提供する。適切な修飾された糖による、ペプチドへの標的性作用物質の選択的結合を用いて、特定の標的性作用物質に特異的な特定の組織または細胞表面受容体にペプチドを導くこともできる。さらに、グリコシル結合基を介して結合された治療効果を有する部分によって特異的に修飾されるペプチドのクラスも提供される。

【0127】

Ｏ−グリコシル化
本発明は、Ｏ結合型グリコシル化ペプチド、これらの化学種のコンジュゲート、および選択されたアミノ酸配列（「Ｏ結合型グリコシル化部位」）を含むＯ結合型グリコシル化ペプチドを形成させるための方法を提供する。対応する野生型ペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位を含む変異ペプチドが特に興味深い。Ｏ結合型グリコシル化部位は、修飾基を有するグリコシル残基が付加するための部位である。

【0128】

ムチン型のＯ結合型グリコシル化は、タンパク質グリコシル化の最も豊富な型の１つであり、すべての真核細胞の分泌糖タンパク質および細胞表面結合糖タンパク質上でみとめられる。Ｏ結合型グリコシル化によって作り出される構造体は非常に多様であり（何百種類もの潜在的な構造体）、これらは、ゴルジ複合体に内在する何百ものグリコシルトランスフェラーゼ酵素の触媒活性によって産生される。グリカン構造のレベル、およびタンパク質主鎖へのＯ−グリカンの付加位置において多様性が存在する。潜在的な多様性の程度は高いものの、Ｏ結合型グリコシル化は、多細胞生物間で高度の保存を示す高度に調節されたプロセスであることが明らかとなっている。

【0129】

ムチン型のＯ結合型グリコシル化の第１段階は、ＧａｌＮＡｃをセリンおよびトレオニン受容体部位に転移させるＵＤＰ−ＧａｌＮａｃ、すなわち、ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ）（ＥＣ２．４．１．４１）の大ファミリーの１種または複数のメンバーによって触媒される（Ｈａｓｓａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５頁（２０００年））。これまでに、哺乳動物のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼファミリーの１２種のメンバーが同定され、特徴を決定されており（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２２６２３〜２２６３８頁（２００２年））、また、ゲノムデータベースの解析により、この遺伝子ファミリーの数種の推定上の追加メンバーが予測されている。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアイソフォームは様々な動力学的諸特性を有し、時間的かつ空間的に示差的な発現パターンを示す。これは、それらの生物学的機能が異なることを示唆している（Ｈａｓｓａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５頁（２０００年））。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの配列解析により、これらの酵素が２種の異なるサブユニットを有するという仮説が導かれた。これらのサブユニットは、中央の触媒ユニット、ならびに、「レクチンドメイン」と呼ばれる、植物のレクチンリシンに配列が類似したＣ末端ユニットである（Ｈａｇｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６７９７〜６８０３頁（１９９９年）、Ｈａｚｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：１３５３〜１３５６頁（１９９７年）、Ｂｒｅｔｏｎ他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：５６３〜５７１頁（１９９９年））。選択された保存残基の部位特異的変異誘発を伴う以前の実験により、触媒ドメインの変異は触媒活性を消失させることが確認された。一方、「レクチンドメイン」における変異は、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアイソフォームであるＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の触媒活性に対して有意な影響を及ぼさなかった（Ｔｅｎｎｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４９）：４７０８８〜９６頁（２００２年））。したがって、Ｃ末端の「レクチンドメイン」は、機能的ではなく、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの酵素機能に対して役割を果たしていないと考えられていた（Ｈａｇｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：６７９７〜６８０３頁（１９９９年））。

【0130】

しかし、最近の証拠により、一部のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが、部分的にＧａｌＮＡｃ−グリコシル化された糖ペプチドによる特有の活性を示すことが実証されている。少なくとも３種のＧａｌＮａｃトランスフェラーゼアイソフォーム、すなわち、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４、−Ｔ７、および−Ｔ１０の触媒作用は、クラスター形成された潜在的なグリコシル化部位の一部だけが他のＧａｌＮａｃトランスフェラーゼによってＧａｌＮａｃグリコシル化されているムチンのタンデムリピート領域に対応する糖ペプチドに選択的に作用する（Ｂｅｎｎｅｔｔ他、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４６０：２２６〜２３０頁（１９９９年）、Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７３９５〜１７４０４頁（２００１年）、Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０４７２〜３０４８１頁（１９９８年）、Ｔｅｎ Ｈａｇｅｎ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７８６７〜２７８７４頁（１９９９年）、）ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４および−Ｔ７は、様々なＧａｌＮＡｃ−グリコシル化ペプチドを認識し、以前に利用されていた部位の他の受容体基質部位へのＧａｌＮＡｃの転移を触媒する。このようなＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性の機能のうちの１つは、高密度のＯ結合型グリコシル化を有するムチンおよびムチン様糖タンパク質におけるＯグリカン占有の密度を制御するステップに相当すると予測されている。

【0131】

この一例は、癌関連ムチンＭＵＣ１のグリコシル化である。ＭＵＣ１は、５箇所の潜在的なＯ結合型グリコシル化部位を有する２０残基（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ）（配列番号：１３８）からなるタンデムリピートＯ結合型グリコシル化領域を含んでいる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ３は、ＭＵＣ１タンデムリピートのグリコシル化を開始し、３つの部位だけに（ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ、ＧａｌＮＡｃ結合部位に下線）（配列番号：１３９）組み込むことができる。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、乳癌関連ムチンＭＵＣ１の２０アミノ酸からなるタンデムリピート配列中の５つの受容体部位すべてへのＯ結合型グリカン付加を完了することができる、これまでに確認されている唯一のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼアイソフォームであるという点で、特有である。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４は、ＧａｌＮＡｃ_４ＴＡＰ２４糖ペプチド（ＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号：１４０）、特有のＧａｌＮＡｃ−Ｔ４付加部位は太字体である）上の、他のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼアイソフォームによって使用されていない少なくとも２つの部位にＧａｌＮＡｃを転移させる（Ｂｅｎｎｅｔｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０４７２〜３０４８１頁（１９９８年））。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４によって示されるもののような活性は、潜在的な部位がすべてグリコシル化されている、癌細胞によって発現されるＭＵＣ１のグリコフォームの作製に必要と思われる（Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８１６５〜１８１７２頁（１９９９年）。泌乳中の乳腺に由来する正常なＭＵＣ１は、１リピート当たり約２．６個のＯ結合型グリカンを有しており（Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４７８０〜２４７９３頁（１９９７年））、癌細胞系統Ｔ４７Ｄに由来するＭＵＣ１は、１リピート当たり４．８個のＯ結合型グリカンを有している（Ｍｕｌｌｅｒ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８１６５〜１８１７２頁（１９９９年））。したがって、ＭＵＣ１の癌関連型は、より高密度のＯ結合型グリカンによる占有に関連しており、これは、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４の活性と同一または類似したＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性によって実現されている。

【0132】

ポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼも、明らかなＧａｌＮＡｃ糖ペプチド特異性は示していないが、その推定上のレクチンドメインによって調節されているようである（ＰＣＴ出願ＷＯ０１／８５２１５ Ａ２号）。最近、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の推定上のレクチンドメインにおける変異が、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４において以前に分析された変異と同様に（Ｈａｓｓａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８１９７〜３８２０５頁（２０００年））、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ４と同様の様式で酵素の活性を変更することが発見された。すなわち、野生型のＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、複数の受容体部分を有するペプチド基質に複数のＧａｌＮＡｃ残基を連続的に付加したが、変異ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、同じ基質に複数のＧａｌＮＡｃ残基を付加することができなかった（Ｔｅｎｎｏ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４９）：４７０８８〜９６頁（２００２年））。

【0133】

野生型酵素によって産生されるものとは異なるグリコシル化パターンを得るためにＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの変異を利用できることが実証されているため、本発明のＯ結合型グリコシル化ペプチドを調製する際に１種または複数の変異ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを利用することは、本発明の範囲内である。

【0134】

Ｏ結合型グリコシル化部位を有する変異ペプチド
本発明によって提供されるペプチドは、１種または複数の野生型または変異ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼによってＧａｌＮＡｃ受容体として認識されているアミノ酸配列を含む。このペプチドのアミノ酸配列は、Ｏ結合型グリコシル化部位を含むペプチドの場合の野生型、非天然のＯ結合型グリコシル化部位を導入される変異配列、または、天然および非天然のＯ結合型グリコシル化部位の双方を含むポリペプチドである。本発明を実施するのに用いる例示的なペプチドとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えば、１７５アミノ酸および１７８アミノ酸の野生型（Ｎ末端メチオニン残基があるものとないもの）、インターフェロン（例えば、インターフェロンα、例えばインターフェロンα２ｂもしくはインターフェロンα２ａ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモン、およびインターロイキン（例えば、インターロイキン２）が挙げられる。Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＦＮ−α２βに関する以下の考察を強調するのは、例示を明確にするためである。アミノ酸の上付き文字の任意の数字は、そのポリペプチドのＮ末端メチオニンに対するそのアミノ酸の位置を示す。ポリペプチドのＮ末端がメチオニン無しで始まる場合は、Ｎ末端メチオニンが無いことを示すようにこれらの数字を容易に調整することができる。例示的なペプチドのＮ末端は、メチオニンで始まることもメチオニン無しで始まることもできることが理解されよう。さらに、野生型ペプチドおよび変異ペプチドのＯ結合型の複合糖質を形成された類似体を調製するための本発明で説明する戦略は、任意のペプチドに適用可能であることも当業者には理解されよう。

【0135】

例示的な実施形態では、このペプチドは、Ｎ末端、Ｈ^５３、Ｐ^６１、Ｐ^１２９、Ｐ^１３３、およびＰ^１７５に隣接またはそれらを含む部位から選択される部位に１つまたは複数の変異を含む、生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体である。本発明の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体は、当業者に公知である任意の適切な機能アッセイによって測定したときにその生物活性の実質的または完全な消失をもたらさない１つまたは複数の変異を有する任意のＧ−ＣＳＦポリペプチドの一部または全体を含む。一実施形態では、本発明の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体内の変異は、野生型Ｇ−ＣＳＦに天然には存在していない１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位内に位置している。別の実施形態では、本発明の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦ変異体内の変異は、Ｇ−ＣＳＦ変異体の１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位の内部にも外部にも存在している。

【0136】

代表的な野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドおよび変異Ｇ−ＣＳＦポリペプチドは、以下から選択される配列を有する。
配列番号：１４１（１７８アミノ酸からなる野生型）

【数1】

配列番号：１４２（Ｎ末端にメチオニンを有さない、１７８アミノ酸からなる野生型）

【数2】

【数3】

配列番号：１４３（１７５アミノ酸からなる野生型）

【数4】

配列番号：１４４（Ｎ末端にメチオニンを有さない、１７５アミノ酸からなる野生型）

【数5】

配列番号：１４５

【数6】

配列番号：１４６

【数7】

配列番号：１４７

【数8】

配列番号：１４８

【数9】

【数10】

配列番号：１４９

【数11】

配列番号：１５０

【数12】

配列番号：１５１

【数13】

配列番号：１５２

【数14】

配列番号：１５３

【数15】

配列番号：１５４

【数16】

【数17】

配列番号：１５５

【数18】

配列番号：１５６

【数19】

配列番号：１５７

【数20】

配列番号：１５８

【数21】

【0137】

別の例示的な実施形態では、このペプチドは、Ｎ末端、または、Ｐ^１３３に隣接もしくはＰ^１３３を含む部位から選択される部位に１つまたは複数の変異を含む、生物学的に活性なｈＧＨ変異体である。本発明の生物学的に活性なｈＧＨ変異体は、当業者に公知である任意の適切な機能アッセイによって測定したときにその生物活性の実質的または完全な消失をもたらさない１つまたは複数の変異を有する任意のｈＧＨポリペプチドの一部または全体を含む。一実施形態では、本発明の生物学的に活性なｈＧＨ変異体内の変異は、野生型ｈＧＨに天然には存在していない１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位内に位置している。別の実施形態では、本発明の生物学的に活性なｈＧＨ変異体内の変異は、ｈＧＨ変異体の１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位の内部にも外部にも存在している。

【0138】

代表的な野生型ｈＧＨポリペプチドおよび変異ｈＧＨポリペプチドは、以下から選択される配列を有する。
配列番号：１５９（Ｎ末端メチオニンを含む、１９２アミノ酸からなる野生型の脳下垂体由来ｈＧＨ）

【数22】

配列番号：１６０（Ｎ末端メチオニンを欠いている、１９１アミノ酸からなる野生型の脳下垂体由来ｈＧＨ）

【数23】

配列番号：１５９（野生型）

【数24】

【0139】

以下は、配列番号：１５９の野生型で下線を引いた領域に対応する代表的な変異ペプチド配列である。
ＬＥＤＧＳＰＴＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６１）、ＬＥＤＧＳＰＴＴＡＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６２）、ＬＥＤＧＳＰＴＡＴＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６３）、ＬＥＤＧＳＰＴＱＧＡＭＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６４）、ＬＥＤＧＳＰＴＱＧＡＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６５）、ＬＥＤＧＳＰＴＱＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６６）、ＬＥＤＧＳＰＴＴＬＹＶＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６７）、ＬＥＤＧＳＰＴＩＮＴＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６８）、ＬＥＤＧＳＰＴＴＶＳＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１６９）、ＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＰＴＱＴＹＳ（配列番号：１７０）、ＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＰＴＱＡＹＳ（配列番号：１７１）、ＬＥＤＧＳＰＴＴＬＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７２）、ＬＥＴＥＴＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７３）、ＬＶＴＥＴＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７４）、ＬＥＴＱＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７５）、ＬＶＴＱＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７６）、ＬＶＴＥＴＰＡＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７７）、ＬＥＤＧＳＰＴＱＧＡＭＰＫＱＴＹＳ（配列番号：１７８）、およびＬＥＤＧＳＰＴＴＴＱＩＦＫＱＴＹＳ（配列番号：１７９）

【0140】

別の例示的な実施形態では、このペプチドは、ＩＮＦα２のＴ^１０６に対応する部位、例えば、ＩＮＦα２のＴ^１０６に対応またはＴ^１０６とともに並んでいるＩＦＮα野生型におけるアミノ酸位置に隣接またはその位置を含む部位に１つまたは複数の変異を含む、生物学的に活性なＩＦＮα変異体である。本発明の生物学的に活性なＩＦＮα変異体は、当業者に公知である任意の適切な機能アッセイによって測定したときにその生物活性の実質的または完全な消失をもたらさない１つまたは複数の変異を有する任意のＩＦＮαポリペプチドの一部または全体を含む。一実施形態では、本発明の生物学的に活性なＩＦＮα変異体内の変異は、野生型ＩＦＮαに天然には存在していない１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位内に位置している。別の実施形態では、本発明の生物学的に活性なＩＦＮα変異体内の変異は、ＩＦＮα変異体の１つまたは複数のＯ結合型グリコシル化部位の内部にも外部にも存在している。

【0141】

野生型ＩＦＮαポリペプチドおよび変異ＩＦＮαポリペプチドを以下に示す。
配列番号１８０（野生型ＩＦＮ２ｂに由来）

【数26】

【0142】

Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ以外のペプチドに対する他の適切なＯ結合型グリコシル化配列は、推定上のＯ結合型グリコシル化部位を組み込んだポリペプチドを調製し、そのポリペプチドを適切なＯ結合型グリコシル化条件下におき、その結果、そのポリペプチドがＧａｌＮａｃトランスフェラーゼに対する受容体となる能力を確認することによって、決定することができる。さらに、１つまたは複数の変異を含むペプチドが本発明の範囲内であることも、当業者には明らかであろう。これらの変異は、ペプチドの望ましい特性、例えば、活性、ならびにペプチド上のＯ結合型および／またはＮ結合型グリコシル化部位の数および位置の調整を可能にするように設計される。

【0143】

ペプチドコード配列の取得
一般的な組換え技術
本発明は、組換え遺伝学の分野の慣用技術を利用する。本発明で有用な一般的方法を開示している基本的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）、およびＡｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４年）が挙げられる。

【0144】

核酸のサイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で与えられる。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、公開されているＤＮＡ配列から導かれた概算値である。タンパク質のサイズは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、演繹されたアミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から概算される。

【0145】

例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８６２頁（１９８１年）によって最初に説明された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従い、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８頁（１９８４年）で記載されているように自動合成機を用いて、市販されていないオリゴヌクレオチドを化学的に合成することができる。遺伝子全体も、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において認識されている任意の戦略、例えば、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９頁（１９８３年）で説明されている陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて、実施される。

【0146】

クローン化した野生型ペプチド遺伝子、変異ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅ他、Ｇｅｎｅ１６：２１〜２６頁（１９８１年）で説明されている２本鎖鋳型の配列決定を行うためのチェーンターミネーション法によって、クローニング後に確認することができる。

【0147】

野生型ペプチドコード配列のクローニングおよびサブクローニング
野生型ペプチドをコードしている多数のポリヌクレオチド配列が決定されており、商業的な供給業者から入手可能である。例えば、ヒト成長ホルモン、例えば、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ０００５１５、ＮＭ００２０５９、ＮＭ０２２５５６、ＮＭ０２２５５７、ＮＭ０２２５５８、ＮＭ０２２５５９、ＮＭ０２２５６０、ＮＭ０２２５６１、およびＮＭ０２２５６２である。

【0148】

ヒトゲノム研究の急速な発展により、以前に同定されているペプチドのコード配列など、ある公知のヌクレオチド配列に対してある程度の比率の配列相同性を有する任意の遺伝子セグメントを調べるためにヒトＤＮＡ配列データベースを検索することができるクローニング手法が可能になった。このようにして確認した任意のＤＮＡ配列は、続いて、化学合成および／またはオーバーラップ伸長法などのポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって得ることができる。短い配列の場合は、完全に新規の合成で十分となり得るが、より大きな遺伝子を得るには、合成プローブを用いてヒトｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーから完全長コード配列をさらに単離することが必要となることがある。

【0149】

あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などの標準のクローニング技術を用いて、あるペプチドをコードしている核酸配列をヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのライブラリーから単離することもできる。その際、相同性に基づくプライマーは、多くの場合、ペプチドをコードしている公知の核酸配列から誘導することができる。この目的のために最もよく使用される技術は、標準の教科書、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著書で説明されている。

【0150】

野生型ペプチドのコード配列を得るのに適したｃＤＮＡライブラリーは、市販されているものでもよく、あるいは、構築することもできる。ｍＲＮＡを単離し、逆転写によってｃＤＮＡを作製し、ｃＤＮＡを組換えベクター中に連結し、組換え宿主にトランスフェクトして増やし、スクリーニングし、クローニングする一般的方法は、周知である（例えば、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ、２５：２６３〜２６９頁（１９８３年）、上述のＡｕｓｕｂｅｌ他を参照のこと）。ＰＣＲによってヌクレオチド配列の増幅されたセグメントを得た直後に、そのセグメントをプローブとしてさらに使用して、野生型ペプチドをコードしている完全長ポリヌクレオチド配列をｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。適切な手順の概要は、上述のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの著書で確認することができる。

【0151】

同様の手順に従って、野生型ペプチド、例えば、前述のジェンバンクアクセッション番号のうちの任意のものをコードしている完全長配列をヒトゲノムライブラリーから得ることができる。ヒトゲノムライブラリーは市販されており、または、当技術分野において認識されている様々な方法に従って構築することができる。通常、ゲノムライブラリーを構築するためには、最初に、ペプチドがおそらく存在している組織からＤＮＡを抽出する。次に、そのＤＮＡを機械で切断し、または、酵素で消化して、長さ約１２〜２０ｋｂの断片を得る。続いて、それらの断片を勾配遠心分離によって、望ましくないサイズのポリヌクレオチド断片から分離し、バクテリオファージλベクター中に挿入する。これらのベクターおよびファージを、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングする。ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０〜１８２頁（１９７７年）で説明されているように、プラークハイブリダイゼーションによって組換えファージを解析する。Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：３９６１〜３９６５頁（１９７５年）で説明されているようにして、コロニーハイブリダイゼーションを実施する。

【0152】

配列相同性に基づき、プライマーセットとして縮重オリゴヌクレオチドを設計することができ、また、適切な条件下でＰＣＲを実施して（例えば、Ｗｈｉｔｅ他、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９３年、ＧｒｉｆｆｉｎおよびＧｒｉｆｆｉｎ、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９９４年を参照のこと）、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからヌクレオチド配列のセグメントを増幅させることができる。増幅されたセグメントをプローブとして用いて、野生型ペプチドをコードしている完全長核酸を得る。

【0153】

野生型ペプチドをコードしている核酸配列を得たすぐ後に、そのコード配列をベクター、例えば発現ベクター中にサブクローニングして、得られた構築体から組換え野生型ペプチドを作製できるようにすることができる。分子の特質を改変するために、野生型ペプチドのコード配列にさらなる改変、例えば、ヌクレオチド置換を続けて行ってもよい。

【0154】

ペプチド配列中への変異の導入
コード性のポリヌクレオチド配列から、野生型ペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。続いて、このアミノ酸配列を改変して、アミノ酸配列中の様々な位置に追加のグリコシル化部位を導入することにより、タンパク質のグリコシル化パターンを変えることができる。

【0155】

タンパク質グリコシル化部位のいくつかのタイプは、当技術分野で周知である。例えば、真核生物では、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘ_ａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘ_ａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギン上でＮ結合型グリコシル化が起こる（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ他、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６３１〜６６４頁（１９８５年）、Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：２１４５〜２１４９頁（１９８７年）、Ｈｅｒｓｃｏｖｉｃｓ他、ＦＡＳＥＢ Ｊ７：５４０〜５５０頁（１９９３年）、およびＯｒｌｅａｎ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｖｏｌ．３（１９９６年））。Ｏ結合型グリコシル化は、セリンまたはトレオニン残基上で起こる（Ｔａｎｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．９０６：８１〜９１頁（１９８７年）およびＨｏｕｎｓｅｌｌ他、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ１３：１９〜２６頁（１９９６年））。他のグリコシル化パターンは、タンパク質のカルボキシル末端のカルボキシル基にグリコシルホスファチジルイノシトールを連結することによって形成される（Ｔａｋｅｄａ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０：３６７〜３７１頁（１９９５年）およびＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：５９３〜５９１頁（１９９５年））。この知識に基づき、適切な変異を野生型ペプチド配列にこのように導入して、新しいグリコシル化部位を形成させることができる。

【0156】

ペプチドポリペプチド配列内のアミノ酸残基の直接的な改変が、新しいＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化部位の導入に適していることもあるが、より頻繁には、ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を変異させることによって、新しいグリコシル化部位の導入が行われる。これは、公知の変異誘発方法のうちのいずれかによって実現することができ、そのうちのいくつかを以下に考察する。Ｇ−ＣＳＦペプチドに対する例示的な改変には、配列番号５〜１８で例示されているものが含まれる。

【0157】

変異を起こすための様々なプロトコールが確立されており、当技術分野で説明されている。例えば、Ｚｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４５０４〜４５０９頁（１９９７年）、およびＳｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）を参照のこと。これらの手順を別々にまたは組み合わせて使用して、１組の核酸の変異体、その結果、コードされているポリペプチドの変異体を得ることができる。変異誘発、ライブラリー構築、および他の多様性を生成する方法のためのキットが市販されている。

【0158】

多様性を生成する変異的方法としては、例えば、部位特異的変異誘発（ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３〜１２０１頁（１９８５年））、ウラシル含有鋳型を用いた変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８〜４９２頁（１９８５年））、オリゴヌクレオチドを用いた変異誘発（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７〜６５００頁（１９８２年））、ホスホロチオエート修飾によるＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：８７４９〜８７６４頁および８７６５〜８７８７頁（１９８５年）、およびギャップを形成した二重鎖ＤＮＡによる変異誘発（Ｋｒａｍｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：９４４１〜９４５６頁（１９８４年））が挙げられる。

【0159】

変異を生じさせるための他の方法としては、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒ他、Ｃｅｌｌ、３８：８７９〜８８７頁（１９８４年））、修復能欠損宿主系統を用いた変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４４３１〜４４４３頁（１９８５年））、欠失による変異誘発（ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：５１１５頁（１９８６年））、制限選択および制限精製（Ｗｅｌｌｓ他、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ，３１７：４１５〜４２３頁（１９８６年））、遺伝子全体の合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９〜１３０１頁（１９８４年））、二重鎖切断修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７〜７１８１頁（１９８６年））、ポリヌクレオチドチェーンターミネーション法（米国特許第５９６５４０８号）による変異誘発、およびエラープロンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１：１１〜１５頁（１９８９年））が挙げられる。

【0160】

宿主生物における好ましいコドン使用のための核酸改変
特定の宿主の好ましいコドン使用に合致するように、変異ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列をさらに改変することができる。例えば、細菌細胞のある系統の好ましいコドン使用を利用して、本発明の変異ペプチドをコードし、この系統にとって好ましいコドンを含むポリヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞によって示される好ましいコドン使用頻度は、その宿主細胞によって発現されている多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均することによって算出することができる（例えば、算出サービスは、かずさＤＮＡ研究所（Ｋａｚｕｓａ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ）（日本）のウェブサイトから利用可能である）。この解析は、好ましくは、宿主細胞によって高発現されている遺伝子に限定される。例えば、米国特許第５８２４８６４号は、双子葉植物および単子葉植物によって示されている高発現遺伝子によるコドン使用頻度を提供している。

【0161】

改変の完了時に、配列決定によって変異ペプチドコード配列を確認し、次いで、野生型ペプチドと同様の方式で、組換え作製用の適切な発現ベクター中にサブクローニングする。

【0162】

変異ペプチドの発現および精製
配列を確認した後、組換え遺伝学の分野の慣用技術により、本明細書で開示するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を使用して、本発明の変異ペプチドを作製することができる。

【0163】

発現系
本発明の変異ペプチドをコードしている核酸の高レベルな発現を得るためには、一般に、転写を指示する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および翻訳を開始するためのリボソーム結合部位を含む発現ベクター中に、変異ペプチドをコードしているポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの前掲書、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ他の前掲書に記載されている。野生型ペプチドまたは変異ペプチドを発現するための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびコーロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）において利用可能である。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系が当技術分野で周知であり、同様に、市販されている。一実施形態では、真核細胞用発現ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。

【0164】

異種核酸を直接発現させるのに使用されるプロモーターは、個々の用途に応じて変わる。このプロモーターは、場合によっては、天然の設定においてプロモーターが転写開始部位から離れている距離とおよそ同じ距離だけ、異種の転写開始部位から離れた位置にある。しかし、当技術分野で公知であるように、この距離のいくらかの変化は、プロモーター機能を失わずに受け入れられることができる。

【0165】

プロモーターに加えて、発現ベクターは一般に、転写単位、または宿主細胞で変異ペプチドを発現するのに必要とされる追加の要素すべてを含む発現カセットを含む。すなわち、一般的な発現カセットは、変異ペプチドをコードしている核酸配列に作動可能に連結したプロモーターおよび転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、ならびに翻訳終結部位を含む。ペプチドをコードしている核酸配列は、一般に、形質転換細胞によるペプチド分泌を促進するための切断可能なシグナルペプチド配列に連結されている。このようなシグナルペプチドとしては、特に、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、および神経成長因子、ならびにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼虫ホルモンであるエステラーゼに由来するシグナルペプチドが挙げられる。このカセットの追加要素として、エンハンサー、また、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合は、機能性のスプライス供与部位および受容部位を有するイントロンも挙げることができる。

【0166】

プロモーター配列に加えて、発現カセットは、効率的な終結をもたらすために構造遺伝子の下流に転写終結領域も含むべきである。この終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、あるいは、異なる遺伝子から得てもよい。

【0167】

遺伝情報を細胞中に送り込むのに使用する個々の発現ベクターは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞での発現用に使用される従来のベクターのうちの任意のものを使用してよい。標準の細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、およびＧＳＴやＬａｃＺなどの融合発現系が挙げられる。便利な単離方法を提供するために、エピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃを組換えタンパク質に付加してもよい。

【0168】

真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが、通常、真核細胞用発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス由来のベクターで使用されている。他の例示的な真核細胞用ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびに、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示のもとでタンパク質を発現させることができる他の任意のベクターが挙げられる。

【0169】

いくつかの例示的な実施形態では、発現ベクターは、参照により本明細書に組み込む２００４年４月９日出願の共有の米国特許出願明細書で開示されているように、ｐＣＷｉｎ１、ｐＣＷｉｎ２、ｐＣＷｉｎ２／ＭＢＰ、ｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＳＢＤ（ｐＭＳ_３９）、およびｐＣＷｉｎ２−ＭＢＰ−ＭＣＳ−ＳＢＤ（ｐＭＸＳ_３９）から選択される。

【0170】

一部の発現系は、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼなど、遺伝子増幅をもたらすマーカーを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーターまたはその他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で変異ペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を有する、昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターなど、遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も適している。

【0171】

発現ベクター中に一般に含まれる構成要素としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを含む細菌の選定を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物の配列の挿入を可能にする、プラスミドの非必須領域中の特有の制限酵素認識部位も挙げられる。選択される個々の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野で公知の多くの耐性遺伝子のうちの任意のものが適している。必要な場合には、原核生物の配列を場合によっては選択し、その際は、原核生物の配列が真核細胞中のＤＮＡの複製を妨害しないようにする。

【0172】

組換えタンパク質（例えば、本発明のｈｇｈ変異体）のペリプラズム発現が望まれるとき、発現ベクターは、発現しようとするタンパク質のコード配列の５’に直接結合している、大腸菌ＯｐｐＡ（ペリプラズム中のオリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナルやその修飾型などの分泌シグナルをコードしている配列もさらに含む。このシグナル配列は、細胞質で産生された組換えタンパク質を、細胞膜を通してペリプラズム空間中へと導く。この発現ベクターはさらに、組換えタンパク質がペリプラズム空間に入るときにシグナル配列を酵素的に切断することができるシグナルペプチダーゼ１のコード配列も含んでよい。組換えタンパク質のペリプラズムでの作製に関するより詳細な説明は、例えば、Ｇｒａｙ他、Ｇｅｎｅ３９：２４７〜２５４頁（１９８５年）、米国特許第６１６００８９号、および米国特許第６４３６６７４号で確認することができる。

【0173】

上述したように、ぺプチドの生物活性をなお保持しつつ、任意の野生型ペプチドもしくは変異ペプチドまたはそのコード配列に様々な保存的置換を施すことができることが、当業者には認識されよう。さらに、得られるアミノ酸配列を変えずに個々の発現宿主での好ましいコドン使用を提供するために、ポリヌクレオチドコード配列の改変を行ってもよい。

【0174】

トランスフェクション法
標準のトランスフェクション法を用いて、大量の変異ペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫の細胞系を作製し、次いで、それら変異ペプチドを標準技術によって精製する（例えば、Ｃｏｌｌｅｙ他、Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９〜１７６２２頁（１９８９年）、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０年）を参照のこと）。標準技術に従って、真核細胞および原核細胞の形質転換を実施する（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ Ｂａｃｔ．１３２：３４９〜３５１頁（１９７７年）、ならびにＣｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７〜３６２頁（Ｗｕ他編、１９８３年）を参照のこと）。

【0175】

宿主細胞中に外来のヌクレオチド配列を導入するための周知の手順のうちの任意のものを使用してよい。これらの手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、細胞質内発現用ベクター（ｐｌａｓｍａ ｖｅｃｔｏｒ）、ウイルスベクター、ならびにクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のうちのいずれかの使用が挙げられる（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの前掲書を参照のこと）。使用される個々の遺伝子工学手順が、変異ペプチドを発現することができる宿主細胞中に少なくとも１つの遺伝子を成功裡に導入できることのみ必要である。

【0176】

宿主細胞における変異ペプチド発現の検出
適切な宿主細胞中に発現ベクターを導入した後、変異ペプチドの発現を促進する条件下で、トランスフェクトされた細胞を培養する。次に、標準技術によって続いて培養物から回収される組換えポリペプチドの発現について細胞をスクリーニングする（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２年）、米国特許第４６７３６４１号、Ａｕｓｕｂｅｌ他の前掲書、およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの前掲書を参照のこと）。

【0177】

遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間では周知である。第１に、核酸レベルで遺伝子発現を検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技術による特異的なＤＮＡおよびＲＮＡ測定を行う様々な方法が、通常使用される（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの前掲書）。一部の方法は、電気泳動による分離（例えば、ＤＮＡ検出用のサザンブロットおよびＲＮＡ検出用のノーザンブロット）を要するが、電気泳動無しでも（ドットプロット法によってなど）ＤＮＡまたはＲＮＡの検出を同様に実施することができる。トランスフェクトされた細胞における変異ペプチドをコードしている核酸の存在も、配列特異的プライマーを用いたＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって検出することができる。

【0178】

第２に、ポリペプチドレベルで遺伝子発現を検出することができる。遺伝子産物のレベルを測定するために、様々な免疫学的アッセイ、特に、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するポリペプチドなど本発明の変異ペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いたアッセイが、当業者によって通常使用される（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１４章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年、ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７頁（１９７５年））。これらの技術は、変異ペプチドまたはその抗原性部分に対する高い特異性を有する抗体を選別することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生させる方法は確立されており、それらの説明は、文献、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅの前掲書、ならびに、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：５１１〜５１９頁（１９７６年）で確認することができる。本発明の変異ペプチドに対する抗体の調製および変異ペプチドを検出する免疫学的アッセイの実施に関するより詳細な説明は、後述のセクションで提供される。

【0179】

組換えによって作製した変異ペプチドの精製
トランスフェクトされた宿主細胞における組換え変異ペプチドの発現を確認した後、次いで、組換えポリペプチドを精製するために、適切なスケールで宿主細胞を培養する。

【0180】

１．組換えによって作製した変異ペプチドの細菌からの精製
一般にはプロモーター導入後、形質転換された細菌により、本発明の変異ペプチドが組換えによって大量に作製されるとき、発現は構成的となり得るが、それらのタンパク質は不溶性の凝集体を形成することがある。タンパク質封入体を精製するのに適したいくつかのプロトコールがある。例えば、タンパク質凝集体（以下、封入体と呼ぶ）の精製は、一般に、細菌細胞を破壊することにより、例えば、約１００〜１５０μｇ／ｍｌのリゾチームと非イオン系界面活性剤の０．１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含む緩衝液中でのインキュベーションにより、封入体を抽出、分離、および／または精製することを伴う。細胞懸濁液は、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）粉砕機（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ニューヨーク州）を用いて粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することもできる。細菌を溶解する代替方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ他の前掲書、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌの前掲書に記載されており、当業者には明らかであろう。

【0181】

一般に、細胞懸濁液を遠心分離し、封入体を含有している沈殿物を、封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液、例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および非イオン系界面活性剤の２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００に再懸濁する。できるだけ多くの細胞片を除去するために洗浄工程を繰り返すことが必要な場合がある。適切な緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中に封入体の残存沈殿物を再懸濁してよい。他の適切な緩衝液は、当業者には明らかであろう。

【0182】

洗浄工程の後に、強力な水素受容体でもあり強力な水素供与体でもある溶剤（または、これらの特性のうちの１つをそれぞれ有する溶剤の組合せ物）を添加することによって、封入体を可溶化する。次に、封入体を形成していたタンパク質を、化学反応を起こさない緩衝液で希釈または透析することによって再生することができる。適切な溶媒としては、それだけには限らないが、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％（基準は体積／体積）、およびグアニジン塩酸塩（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられる。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）や７０％ギ酸など、凝集体形成タンパク質を可溶化することができるいくつかの溶媒は、タンパク質を不可逆的に変性させ、免疫原性および／または活性の欠如を伴う可能性があるため、この手順で使用するのに適さない場合がある。グアニジン塩酸塩および類似の作用物質は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤を除去（例えば、透析による）または希釈すると再生が起こり、免疫学的および／または生物学的に活性な目的タンパク質の再形成を可能にし得る。可溶化の後、標準の分離技術によって、他の細菌タンパク質からそのタンパク質を分離することができる。細菌の封入体からの組換えペプチド精製に関するさらなる説明については、例えば、Ｐａｔｒａ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ １８：１８２〜１９０頁（２０００年）を参照のこと。

【0183】

あるいは、組換えポリペプチド、例えば変異ペプチドを細菌のペリプラズムから精製することも可能である。組換えタンパク質が細菌のペリプラズム中に移行している場合、細菌のペリプラズム部分は、当業者に公知の他の方法に加えて低温浸透圧ショックを施すことによって単離することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ他の前掲書を参照のこと）。組換えタンパク質をペリプラズムから単離するために、細菌細胞を遠心分離して沈殿物を形成させる。沈殿物を２０％スクロース含有緩衝液中に再懸濁させる。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、氷冷した５ｍＭ ＭｇＳＯ_４に沈殿物を再懸濁し、氷浴中で約１０分間保存する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清を静かに他の容器に移し、取っておく。当業者には周知の標準的な分離技術によって、上清中に存在する組換えタンパク質を宿主のタンパク質から分離することができる。

【0184】

２．精製のための標準的なタンパク質分離技術
組換えポリペプチド、例えば本発明の変異ペプチドが可溶型で宿主細胞において発現されるとき、その精製は、後述する標準のタンパク質精製手順に従うことができる。

【0185】

ｉ．溶解性による分画
しばしば最初の工程として、また、タンパク質混合物が複雑な場合に、最初に塩分画を行って、不必要な宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを、目的の組換えタンパク質、例えば、本発明の変異ペプチドから分離することができる。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に低減させることによって、タンパク質を沈殿させる。そのとき、タンパク質は、溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性が高いほど、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿が起こる可能性が高い。一般的なプロトコールは、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％になるように、タンパク質溶液に飽和硫酸アンモニウムを加えるものである。これにより、大半の疎水性タンパク質は沈殿すると考えられる。（目的タンパク質が疎水性ではない場合は）この沈殿物を廃棄し、目的タンパク質を沈殿させることが分かっている濃度になるまで、上清に硫酸アンモニウムを加える。次に、緩衝液中で沈殿物を可溶化し、必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションによって過剰な塩を除去する。低温エタノールによる沈殿などタンパク質の溶解性に依拠する他の方法は、当業者には周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するのに使用することができる。

【0186】

ｉｉ．サイズの差を利用したろ過
計算された分子量に基づき、限外ろ過により様々なポアサイズの膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎ社製またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の膜）を通して、サイズのより大きなタンパク質およびサイズのより小さなタンパク質を単離することができる。第１の工程として、目的タンパク質、例えば、変異ペプチドの分子量より低分子量のカットオフ値を有するポアサイズの膜を用いてタンパク質混合物を限外ろ過する。次に、目的タンパク質の分子量より大きな分子カットオフ値を有する膜を用いて限外ろ過の濃縮液を限外ろ過する。組換えタンパク質は、膜を通過してろ液に溶出すると考えられる。次に、このろ液を後述するようにクロマトグラフィーにかけることができる。

【0187】

ｉｉｉ．カラムクロマトグラフィー
（本発明の変異ペプチドなどの）目的タンパク質は、サイズ、正味の表面電荷、疎水性、またはリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、ペプチドに対して産生させた抗体を、カラムのマトリックスに結合させ、ペプチドを免疫精製することもできる。これらの方法はすべて、当技術分野で周知である。

【0188】

任意のスケールで、また、多くの様々な製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）の機器を用いて、クロマトグラフィー法を実施できることは、当業者には明らかであろう。

【0189】

変異ペプチド発現を検出するためのイムノアッセイ
組換え変異ペプチドの産生を確認するために、イムノアッセイが、サンプル中でポリペプチドの発現を検出するのに有用となり得る。イムノアッセイは、組換えホルモンの発現レベルを定量するのにも有用となり得る。変異ペプチドに対する抗体が、これらのイムノアッセイを実施するのに必要である。

【0190】

変異ペプチドに対する抗体の作製
目的の免疫原と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者には公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ニューヨーク、１９９１年、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年、Ｓｔｉｔｅｓ他（編）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ロスアルトス（Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ）、カリフォルニア州、ならびにその中で引用されている参考文献、Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク市、ニューヨーク州、１９８６年、ならびにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７頁、１９７５年を参照のこと）。このような技術は、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体ライブラリーから抗体を選択することによる抗体調製を含む（Ｈｕｓｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１頁、１９８９年、およびＷａｒｄ他、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６頁、１９８９年を参照のこと）。

【0191】

所望の特異性を有する抗体を含有する抗血清を調製するために、目的ポリペプチド（例えば、本発明の変異ペプチド）またはその抗原性断片を用いて、適切な動物、例えば、マウス、ウサギ、または霊長類を免疫化することができる。標準の免疫感作プロトコールに従って、フロイントのアジュバントなど標準のアジュバントを使用することができる。あるいは、その特定のポリペプチドから誘導した合成の抗原ペプチドを担体タンパク質に結合し、続いて免疫原として使用することもできる。

【0192】

試験血液を採取し、目的の抗原に対する反応性の力価を測定することにより、免疫原調製物に対する動物の免疫応答をモニターする。抗原に対する抗体の力価が適切に高くなったとき、動物から血液を採取し、抗血清を調製する。抗原に特異的に反応する抗体を濃縮するための抗血清のさらなる分画および抗体の精製を続いて行うことができる。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅの前掲書、ならびに前述したタンパク質精製に関する一般的な説明を参照のこと。

【0193】

モノクローナル抗体は、当業者にはよく知られている様々な技術を用いて得られる。典型的には、一般に骨髄腫細胞と融合させることによって、所望の抗原で免疫化した動物に由来する脾臓細胞を不死化する（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９頁、１９７６年を参照のこと）。不死化の代替方法としては、例えば、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当技術分野で周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーを、所望の特異性および抗原に対する親和性を有する抗体の産生に関してスクリーニングし、また、脊椎動物宿主の腹腔への注射を含めて、様々な技術により、これらの細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率を高めることができる。

【0194】

さらに、Ｈｕｓｅ他の前掲書に概説がある一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによる、所望の特異性を有する抗体またはそのような抗体の結合フラグメントをコードしている核酸配列の同定に基づいて、モノクローナル抗体を組換えによって作製することもできる。前述の組換えポリペプチド作製の一般的な原理および方法は、組換法による抗体作製にも応用できる。

【0195】

望むなら、本発明の変異ペプチドを特異的に認識することができる抗体を、野生型ペプチドに対する交叉反応性について試験し、それによって、野生型タンパク質に対する抗体と区別することができる。例えば、変異ペプチドで免疫化した動物から得た抗血清を、野生型ペプチドを表面に固定化したカラムに通すことができる。カラムを通過する抗血清部分は、変異ペプチドのみを認識し、野生型ペプチドは認識しない。同様に、変異ペプチドに対するモノクローナル抗体も、変異体のみを認識するが野生型ペプチドは認識しない際の排他性をもとにスクリーニングすることができる。

【0196】

本発明の変異ペプチドのみを特異的に認識するが野生型ペプチドは認識しないポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、固体支持体上に固定化された、変異ペプチドに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とともにサンプルをインキュベートすることにより、野生型タンパク質から変異タンパク質を単離するのに有用である。

【0197】

変異ペプチド発現を検出するためのイムノアッセイ
本発明の変異ペプチドに対して特異的な抗体が利用可能になった後、サンプル中のポリペプチド、例えば、細胞溶解産物の量は、当業者に質的および定量的結果を与える様々なイムノアッセイ法により測定することができる。一般的な免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の総説については、例えば、Ｓｔｉｔｅｓの前掲書、米国特許第４３６６２４１号、米国特許第４３７６１１０号、米国特許第４５１７２８８号、米国特許第４８３７１６８号を参照のこと。

【0198】

イムノアッセイにおける標識化
イムノアッセイは、抗体および標的タンパク質によって形成された結合複合体に特異的に結合し、それを標識する標識物質をしばしば利用する。標識物質は、それ自体が、抗体／標的タンパク質複合体を含む部分のうちの１つでもよく、あるいは、別の抗体など、抗体／標的タンパク質複合体に特異的に結合する第３の部分でもよい。標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能なものでよい。例としては、それだけには限らないが、磁性ビーズ（例えば、「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）」）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）、ローダミンなど）、放射性同位体（例えば、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで一般に使用される他の酵素）、およびコロイド金や有色のガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの比色標識物質が挙げられる。

【0199】

いくつかの場合では、標識物質は、検出可能な標識を有する二次抗体である。あるいは、二次抗体は標識を欠いていてもよいが、代わりに、二次抗体が由来する種の抗体に特異的な、標識された三次抗体が結合していてもよい。酵素標識ストレプトアビジンなど第３の標識化分子が特異的に結合することができるビオチンなどの検出可能部分で二次抗体を修飾することができる。

【0200】

タンパク質Ａやタンパク質Ｇなど、免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質も、標識物質として使用することができる。これらのタンパク質は、連鎖球菌の細胞壁の通常の構成成分である。それらは、様々な種に由来する免疫グロブリンの定常領域との非免疫原性の強い反応性を示す。（一般には、Ｋｒｏｎｖａｌ他Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１：１４０１〜１４０６頁（１９７３年）、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、他、Ｊ：Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５：２５８９〜２５４２頁（１９８５年）を参照のこと）。

【0201】

イムノアッセイの形式
サンプルから標的目的タンパク質（例えば、ヒト成長ホルモン変異体）を検出するためのイムノアッセイは、競合的でも非競合的でもよい。非競合イムノアッセイは、捕捉された標的タンパク質の量が直接測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、例えば、標的タンパク質に特異的な抗体を固体基板に直接結合させ、その基板上でその抗体を固定化してよい。次に、その抗体は、試験サンプル中の標的タンパク質を捕捉する。次に、このようにして固定化された抗体／標的タンパク質複合体に、標識を有する前述したような二次抗体や三次抗体などの標識物質を結合させる。

【0202】

競合アッセイでは、サンプル中に存在する標的タンパク質によって標的タンパク質に特異的な抗体から移動させられた（または競争して追いやられた）、追加された（外因性の）標的タンパク質の量を測定することにより、サンプル中の標的タンパク質の量を間接的に測定する。このようなアッセイの典型的な例では、抗体を固定化し、外因性の標的タンパク質を標識化する。抗体に結合する外因性標的タンパク質の量は、サンプル中に存在する標的タンパク質の濃度に反比例するため、結果として、抗体に結合し、そうして固定化された外因性標的タンパク質の量に基づいてサンプル中の標的タンパク質レベルを決定することができる。

【0203】

いくつかの場合では、サンプル中の変異ペプチドの存在を検出および定量するために、ウエスタンブロット（イムノブロット）解析を使用する。この技術は、一般に、分子量を基準にしてゲル電気泳動によってサンプルのタンパク質を分離するステップと、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、またはナイロン誘導体のフィルターなど）に移すステップと、標的タンパク質に特異的に結合する抗体とともにサンプルをインキュベートするステップとを含む。これらの抗体を直接標識してもよく、あるいは、変異ペプチドに対する抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識化したヒツジの抗マウス抗体）によって、続いて検出してもよい。

【0204】

他のアッセイ形式としては、特定の分子（例えば、抗体）に結合するように設計されたリポソームを使用し、封入された試薬またはマーカーを放出する、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられる。次いで、標準技術に従って、放出された化学物質を検出する（Ｍｏｎｒｏｅ他、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．、５：３４〜４１頁（１９８６年））。

【0205】

コンジュゲート
代表的な態様では、本発明は、ペプチドと選択された修飾基の間の複合糖質であって、その修飾基が、グリコシル結合基、例えば、完全なグリコシル結合基を介してペプチドに結合されている複合糖質を提供する。グリコシル結合基は、ペプチド上のＯ結合型グリコシル化部位に直接結合しており、あるいは、１つまたは複数の追加のグリコシル残基を介して、Ｏ結合型グリコシル化部位に結合している。コンジュゲートの調製方法は、本明細書、ならびに米国特許第５８７６９８０号、米国特許第６０３０８１５号、米国特許第５７２８５５４号、米国特許第５９２２５７７号、ＷＯ９８／３１８２６号、ＵＳ２００３１８０８３５号、およびＷＯ０３／０３１４６４号において説明されている。

【0206】

例示的なペプチドとしては、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によってＯ結合型グリコシル化部位に結合しているＯ結合型ＧａｌＮＡｃ残基が挙げられる。ＧａｌＮＡｃそれ自体が完全なグリコシル結合基でもよい。例えば、Ｇａｌ残基またはＳｉａ残基によって、ＧａｌＮＡｃをさらに精巧に作ることもできる。その際、Ｇａｌ残基またはＳｉａ残基のいずれかが、完全なグリコシル結合基の役割を果たすことができる。代表的な実施形態では、Ｏ結合型サッカリル残基は、ＧａｌＮＡｃ−Ｘ、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ、またはＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｓｉａ−Ｘ（Ｘは修飾基である）である。

【0207】

例示的な実施形態では、ペプチドは、野生型ペプチドには存在しないＯ結合型グリコシル化部位を含む変異ペプチドである。ペプチドは、好ましくは、変異部位で、ＧａｌＮＡｃ残基によってＯグリコシル化される。サッカリル部分の構造に関する直前の考察が、ここでも同様に該当する。

【0208】

ペプチドと選択された部分の間の結合は、ペプチドと修飾部分の間に介在している完全なグリコシル結合基を含む。本明細書で論じるように、選択された部分は、糖単位に結合され、その結果、修飾された糖をペプチドに付加させる適切なトランスフェラーゼ酵素によって認識される「修飾された糖」を生じることができる、本質的に任意の化学種である。修飾された糖の糖部分は、ペプチドと選択された部分の間に介在しているとき、「完全なグリコシル結合基」となる。グリコシル結合基は、選択された部分で修飾された後に適切なトランスフェラーゼの基質となる、任意の単糖またはオリゴ糖から形成される。

【0209】

本発明のコンジュゲートは、通常、以下の一般的な構造に対応すると考えられる。

【0210】

【化9】

式中、記号ａ、ｂ、ｃ、ｄ、およびｓは、ゼロではない正の整数を表し、ｔは０または正の整数である。「作用物質」は、治療薬、生理活性物質、検出可能な標識、水溶性部分などである。「作用物質」は、ペプチド、例えば、酵素、抗体、抗原などでもよい。リンカーは、下記の多彩な結合基のうちの任意のものでよい。あるいは、リンカーは、一重結合または「ゼロ次のリンカー」でもよい。ペプチドのアイデンティティには制限はない。

【0211】

例示的な実施形態では、選択された部分は水溶性のポリマー、例えば、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ、ＰＰＧ、ｍ−ＰＰＧなどである。この水溶性のポリマーは、グリコシル結合基を介してペプチドに共有結合している。このグリコシル結合基は、ペプチドのアミノ酸残基またはグリコシル残基に共有結合している。あるいは、グリコシル結合基は、糖ペプチドの１つまたは複数のグリコシル単位に結合している。本発明は、グリコシル結合基（例えば、ＧａｌＮＡｃ）がアミノ酸残基（例えばＴｈｒまたはＳｅｒ）に結合しているコンジュゲートも提供する。

【0212】

例示的な実施形態では、タンパク質は、インターフェロンである。インターフェロンは、ヒトにおいて、ウイルスまたは２本鎖ＲＮＡによる誘導後に、ヒト初代線維芽細胞によって分泌される、抗ウイルス性糖タンパク質である。インターフェロンは、治療薬、例えば、抗ウイルス剤（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）、抗腫瘍剤（例えば、肝細胞癌）として、また、多発性硬化症の治療において注目に値する。インターフェロンαに関連する参考文献については、Ａｓａｎｏ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２７（補遺４）：２１〜２５頁（１９９１年）、Ｎａｇｙ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８（３）：４６７〜４７０頁（１９８８年）、Ｄｒｏｎ他、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ，３（１）：１３〜１９頁（１９８９年）、Ｈａｂｉｂ他、Ａｍ．Ｓｕｒｇ．、６７（３）：２５７〜２６０頁（２００１年３月））、およびＳｕｇｉｙａｍａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１７：９２１〜９２７頁（１９９３年）を参照のこと。インターフェロンβに関連する参考文献については、例えば、Ｙｕ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、６４（１）：９１〜１００頁（１９９６年）、Ｓｈｕｍｉｄｔ，Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、６５（１）：５９〜６７頁（２００１年）、Ｗｅｎｄｅｒ他、Ｆｏｌｉａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、３９（２）：９１〜９３頁（２００１年）、Ｍａｒｔｉｎ他、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、１８（１）：１〜２４頁（１９９６年）、Ｔａｋａｎｅ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２９４（２）：７４６〜７５２頁（２０００年）、Ｓｂｕｒｌａｔｉ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、１４：１８９〜１９２頁（１９９８年）、Ｄｏｄｄ他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、７８７：１８３〜１８７頁（１９８４年）、Ｅｄｅｌｂａｕｍ他、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、１２：４４９〜４５３頁（１９９２年）、Ｃｏｎｒａｄｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２（３０）：１４６００〜１４６０５頁（１９８７年）、Ｃｉｖａｓ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７３：３１１〜３１６頁（１９８８年）、Ｄｅｍｏｌｄｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３２：１７９〜１８９頁（１９９４年）、Ｓｅｄｍａｋ他、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、９（補遺１）：６１〜６５頁（１９８９年）、Ｋａｇａｗａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３（３３）：１７５０８〜１７５１５頁（１９８８年）、Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ他、米国特許第４８９４３３０号、Ｊａｙａｒａｍ他、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３（２）：１７７〜１８０頁（１９８３年）、Ｍｅｎｇｅ他、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．、６６：３９１〜４０１頁（１９８７年）、Ｖｏｎｋ他、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、３（２）：１６９〜１７５頁（１９８３年）、およびＡｄｏｌｆ他、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．、１０：２５５〜２６７頁（１９９０年）を参照のこと。

【0213】

例示的なインターフェロンコンジュゲートでは、インターフェロンα、例えば、インターフェロンα２ｂおよび２ａが、完全なグリコシルリンカーを介して水溶性ポリマーに結合している。

【0214】

さらに例示的な実施形態では、本発明は、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のコンジュゲートを提供する。Ｇ−ＣＳＦは、機能的に成熟した好中球への好中球を新生する前駆細胞の増殖、分化、および活性化を刺激する糖タンパク質である。注射されたＧ−ＣＳＦは、身体から迅速に除去される。例えば、Ｎｏｈｙｎｅｋ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９：２５９〜２６６頁（１９９７年）、Ｌｏｒｄ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７（７）：２０８５〜２０９０頁（２００１年７月）、Ｒｏｔｏｎｄａｒｏ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１（２）：１１７〜１２８頁（１９９９年）、およびＢｏｎｉｇ他、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２８：２５９〜２６４頁（２００１年）を参照のこと。

【0215】

本発明は、ＧＭ−ＣＳＦを修飾するための方法を包含する。ＧＭ−ＣＳＦは、活性化Ｔ−細胞、マクロファージ、内皮細胞、および間質線維芽細胞によって産生されるサイトカインとして当技術分野で周知である。ＧＭ−ＣＳＦは、主として骨髄に作用して炎症性白血球の産生を増大させ、さらに、炎症作用の間に消費される好中球の補充を開始させる内分泌ホルモンとしても作用する。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ活性化因子であり、ランゲルハンス細胞の樹状細胞への分化を促進する。Ｇ−ＣＳＦと同様に、ＧＭ−ＣＳＦも、化学療法の後の骨髄置換において臨床応用されている。

【0216】

酵素的に付加される完全なグリコシル結合基を通じて形成されるコンジュゲートを提供することに加えて、本発明は、置換パターンが極めて均質なコンジュゲートを提供する。本発明の方法によって、本発明のコンジュゲートの集合全体における修飾された糖部分のほぼすべてが、構造的に同一のアミノ酸残基またはグリコシル残基に結合されている、ペプチドコンジュゲートを形成させることが可能である。したがって、第２の態様では、本発明は、完全なグリコシル結合基を介してペプチドに共有結合している水溶性のポリマー部分の集合を有する、ペプチドコンジュゲートを提供する。本発明の別のコンジュゲートでは、その集団のほぼすべてのメンバーは、グリコシル結合基を介してペプチドのグリコシル残基に結合しており、グリコシル結合基が結合しているペプチドの各グリコシル残基は同じ構造を有している。

【0217】

水溶性ポリマー部分の集団がグリコシル結合基を介して共有結合しているペプチドコンジュゲートも提供される。別の実施形態では、水溶性ポリマー部分の集団のほぼすべてのメンバーは、完全なグリコシル結合基を介してペプチドのアミノ酸残基に結合しており、完全なグリコシル結合基が結合している各アミノ残基は同じ構造を有している。

【0218】

本発明は、ペプチドが、治療効果を有する部分、診断用の部分、標的性部分、毒性部分などにグリコシル結合基を介して結合されている、前述したものに類似したコンジュゲートも提供する。前述した部分はそれぞれ、小分子、天然ポリマー（例えばポリペプチド）、または合成ポリマーでよい。

【0219】

さらに別の実施形態では、本発明は、コンジュゲートの構成要素として標的性作用物質が存在するために、特定の組織中に選択的に局在化するコンジュゲートを提供する。例示的な実施形態では、この標的性作用物質はタンパク質である。例示的なタンパク質としては、トランスフェリン（脳、血液プール）、ＨＳ−糖タンパク質（骨、脳、血液プール）、抗体（脳、抗体に特異的な抗原を有する組織、血液プール）、凝固因子Ｖ〜ＸＩＩ（損傷組織、血餅、癌、血液プール）、血清タンパク質、例えば、α−酸糖タンパク質、フェチュイン、α−胎児タンパク質（脳、血液プール）、β２−糖タンパク質（肝臓、アテローム性動脈硬化症のプラーク、脳、血液プール）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ（免疫刺激、癌、血液プール、赤血球過剰産生、神経保護）、アルブミン（半減期の延長）、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−αが挙げられる。

【0220】

例示的な標的化コンジュゲートでは、インターフェロンα２β（ＩＦＮ−α２β）は、ＰＥＧ部分の各末端に完全なグリコシル結合基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合している（スキーム１）。例えば、ＰＥＧリンカーの一方の末端は、トランスフェリンに結合した完全なシアル酸リンカーで官能化され、他方は、ＩＦＮ−α２βに結合した完全なＯ結合型ＧａｌＮＡｃリンカーで官能化されている。

【0221】

本発明のコンジュゲートは、一価または多価（例えば、アンテナ構造）であるグリコシル結合基を含み得る。したがって、本発明のコンジュゲートは、選択された部分が一価のグリコシル結合基を介してペプチドに結合している、双方の化学種を含む。複数の選択された部分が多価の結合基を介してペプチドに結合しているコンジュゲートも、本発明の範囲に含まれる。

【0222】

方法
上述のコンジュゲートに加えて、本発明は、これらおよび他のコンジュゲートを調製するための方法も提供する。さらに、本発明は、ある疾患を発症する危険にさらされている対象またはその疾患を罹患している対象に本発明のコンジュゲートを投与することによって、疾患状態を予防、治癒、または改善する方法も提供する。さらに、本発明は、身体の特定の組織または領域に本発明のコンジュゲートを標的化させるための方法も提供する。

【0223】

したがって、本発明は、選択された部分とペプチドの間の共有結合性コンジュゲートを形成させる方法を提供する。例示的な実施形態では、コンジュゲートは、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、標的性部分、または生体分子とグリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドとの間で形成される。ポリマー、すなわち治療効果を有する部分または生体分子は、ペプチドと修飾基（例えば、水溶性ポリマー）の間に介在しそれらの双方に共有結合しているグリコシル結合基を介してペプチドに結合している。この方法は、修飾された糖と、その修飾された糖を基質とするグリコシルトランスフェラーゼとを含有する混合物にペプチドを接触させることを含む。反応は、修飾された糖とペプチドの間に共有結合を形成させるのに適した条件のもとで実施する。修飾された糖の糖部分は、好ましくは、ヌクレオチド糖、活性化糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もされていない糖から選択される。

【0224】

受容体ペプチド（Ｏ−グリコシル化もしくは非グリコシル化）は、通常、新規に合成され、あるいは、原核細胞（例えば、大腸菌などの細菌細胞）中、または哺乳動物、酵母、昆虫、真菌、もしくは植物の細胞など真核細胞中で組換えによって発現される。ペプチドは、完全長タンパク質でも断片でもよい。さらに、ペプチドは、野生型ペプチドでも変異ペプチドでもよい。例示的な実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数のＮ結合型またはＯ結合型グリコシル化部位をペプチド配列に加える突然変異を含んでいる。

【0225】

例示的な実施形態では、ペプチドは、以下の方法でＯ−グリコシル化され、水溶性ポリマーで官能化される。ペプチドは、利用可能なアミノ酸グリコシル化部位を用いて作製され、または、グリコシル化される場合は、アミノ酸が露出されるようにそのグリコシル部分がトリミングされる。例えば、ＧａｌＮＡｃをセリンまたはトレオニンに付加し、そのガラクトシル化ペプチドを、ＳＴ６Ｇａｌ−１を用いて、シアル酸−修飾基カセットによってシアル酸付加する。あるいは、ガラクトシル化ペプチドをＣｏｒｅ−１−ＧａｌＴ−１によってガラクトシル化し、ＳＴ３ＧａｌＴ１を用いてシアル酸−修飾基カセットによってその生成物にシアル酸付加する。この方法による例示的なコンジュゲートは、以下の結合、すなわち、Ｔｈｒ−α−１−ＧａｌＮＡｃ−β−１，３−Ｇａｌ−α２，３−Ｓｉａ＊（Ｓｉａ＊はシアル酸−修飾基カセットである）を有する。

【0226】

複数の酵素およびサッカリル供与体を用いる、前述したもののような本発明の方法では、個々のグリコシル化ステップは、別々に実施しても、「ワンポット」反応系で組み合わせてもよい。例えば、上述した３種の酵素を用いる反応では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、ＧａｌＴ、ＳｉａＴ、およびそれらの供与体を、１つの容器中で混合してよい。あるいは、ＧａｌＮＡｃ反応を単独で実施し、ＧａｌＴとＳｉａＴの双方と適切なサッカリル供与体を１つのステップとして加えてもよい。反応を行う他の態様は、各酵素および適切な供与体を順次添加し、「ワンポット」の形式で反応を実施するものである。前述した各方法を組み合わせると、本発明の化合物を調製するのに有用である。

【0227】

本発明のコンジュゲートでは、Ｓｉａ−修飾基カセットは、α−２，６結合またはα−２，３結合でＧａｌに結合することができる。

【0228】

例えば、一実施形態では、Ｇ−ＣＳＦを哺乳動物の系で発現させ、シアリダーゼ処理によって末端のシアル酸残基をトリミングし、続いて、ＳＴ３Ｇａｌ３およびＰＥＧ−シアル酸供与体を用いてＰＥＧ化することにより、Ｇ−ＣＳＦを修飾する。

【0229】

本発明の方法は、組換えによって作製される不完全なグリコシル化ペプチドの修飾法も提供する。多くの組換えによって作製される糖タンパク質は、不完全にグリコシル化されており、望ましくない特性、例えば、免疫原性、ＲＥＳによる認識などを有する可能性がある糖残基を露出している。本発明の方法で修飾された糖を使用すると、ペプチドをさらにグリコシル化し、同時に、例えば、水溶性ポリマーや治療薬などで誘導体化することができる。修飾された糖の糖部分は、完全なグリコシル化ペプチドの受容体に適切に結合すると考えられる残基でも、所望の特性を有する別の糖部分でもよい。

【0230】

本発明の方法によって修飾されるペプチドは、合成ペプチドでも野生型ペプチドでもよく、あるいは、それらは、部位特異的変異誘発など当技術分野で公知の方法によって作製される変異ペプチドでもよい。ペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型である。例示的なＮ−結合は、アスパラギン残基の側鎖への修飾された糖の付加である。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、糖部分がアスパラギン側鎖に酵素的に付加するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ−結合型グリコシル化とは、１つの糖（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース、フコース、またはキシロース）がヒドロキシアミノ酸のヒドロキシ側鎖に付加することを意味する。ヒドロキシアミノ酸は、珍しいアミノ酸または非天然アミノ酸、例えば、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用してよいが、好ましくは、セリンまたはトレオニンである。

【0231】

さらに、ペプチドに加えて、本発明の方法は、他の生物学的構造体（例えば、Ｏ結合型グリコシル化部位を有する糖脂質、脂質、スフィンゴイド、セラミド、細胞全体など）を用いて実施することもできる。

【0232】

ペプチドまたは他の構造体へのグリコシル化部位の追加は、アミノ酸配列が１つまたは複数のグリコシル化部位を有するようにアミノ酸配列を改変することによって、好都合に実現される。−ＯＨ基を提示している１種または複数の化学種、好ましくはセリンまたはトレオニン残基をペプチドの配列内部に組み込むことによっても追加を行うことができる（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。突然変異によって、またはペプチドを完全に化学合成することによって追加を行うことができる。ペプチドアミノ酸配列は、好ましくは、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、具体的には、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、予め選択した塩基の位置で、そのペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって改変される。ＤＮＡ突然変異は、好ましくは、当技術分野で公知の方法を用いて行われる。

【0233】

例示的な実施形態では、グリコシル化部位は、ポリヌクレオチドをシャッフリングすることによって追加される。ＤＮＡシャッフリングプロトコールを用いて、候補のペプチドをコードしているポリヌクレオチドを改変することができる。ＤＮＡシャッフリングは、関連遺伝子のプールのランダム断片化と、それに続くポリメラーゼ連鎖反応法と同様のプロセスによる断片の再構築によって実施される、組換えおよび突然変異を繰り返すプロセスである。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３７０：３８９〜３９１頁（１９９４年）、および、米国特許第５６０５７９３号、米国特許第５８３７４５８号、米国特許第５８３０７２１号、米国特許第５８１１２３８号を参照のこと。

【0234】

本発明は、１つまたは複数の選択されたグリコシル残基をペプチドに付加し（またはそれから除去し）、その後に、そのペプチドの選択されたグリコシル残基うちの少なくとも１つに修飾された糖を結合させる手段も提供する。この実施形態は、例えば、ペプチド上に存在していない、または所望の量が存在していない選択されたグリコシル残基に修飾された糖を結合することが望ましいときに、有用である。すなわち、修飾された糖をペプチドに結合させる前に、酵素的または化学的結合によって、選択されたグリコシル残基をペプチドに結合させる。別の実施形態では、糖ペプチドから糖残基を除去することによって、修飾された糖を結合させる前に糖ペプチドのグリコシル化パターンを改変する。例えば、ＷＯ９８／３１８２６を参照のこと。

【0235】

糖ペプチド上に存在する任意の糖部分の付加または除去は、化学的または酵素的に遂行する。化学的脱グリコシル化は、好ましくは、ポリペプチド変異体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価な化合物に曝露させることによってもたらされる。この処理により、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大半またはすべての糖が切断されるが、ペプチドは損なわれずに残る。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２頁（１９８７年）およびＥｄｇｅ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１頁（１９８１年）で記載されている。ポリペプチド変異体上の糖部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０頁（１９８７年）で記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって達成することができる。

【0236】

グリコシル部分の化学的付加は、当業者に認知されている任意の方法によって実施される。糖部分の酵素的付加は、好ましくは、本明細書で説明する方法の変法により、本発明で使用する修飾された糖の代わりに天然のグリコシル単位を用いて実施される。糖部分を付加する他の方法は、米国特許第５８７６９８０号、米国特許第６０３０８１５号、米国特許第５７２８５５４号、および米国特許第５９２２５７７号で開示されている。

【0237】

選択されたグリコシル残基の例示的な付加位置としては、それだけには限らないが、（ａ）Ｎ結合型グリコシル化のためのコンセンサス部位およびＯ結合型グリコシル化のための部位、（ｂ）グリコシルトランスフェラーゼに対する受容体である末端グリコシル部分、（ｃ）アルギニン、アスパラギン、およびヒスチジン、（ｄ）遊離のカルボキシル基、（ｅ）システインのものなど遊離のスルフヒドリル基、（ｆ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなど遊離のヒドロキシル基、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、あるいは（ｈ）グルタミンのアミド基が挙げられる。本発明において有用である例示的な方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０、ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＣＨＥＭ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）で記載されている。

【0238】

一実施形態では、本発明は、結合基を介して２つ以上のペプチドを連結するための方法を提供する。結合基は、任意の有用な構造を有し、直鎖構造体および分枝構造体から選択され得る。好ましくは、ペプチドに結合されるリンカーの各末端は、修飾された糖を含む（すなわち、新生の完全なグリコシル結合基）。

【0239】

本発明の例示的な方法では、２つのペプチドが、ＰＥＧリンカーを含むリンカー部分を介して相互に連結される。この構築体は、上記の図で説明した一般構造に一致する。本明細書で記述するように、本発明の構築体は、２つの完全なグリコシル結合基（すなわち、ｓ＋ｔ＝１）を含む。２つのグリコシル基を含むＰＥＧリンカーに焦点をあわせるのは、明確にするためであって、本発明の本実施形態において有用なリンカーアームのアイデンティティを限定するものとして解釈されるべきではない。

【0240】

したがって、ＰＥＧ部分は、第１の末端を第１のグリコシル単位で、また、第２の末端を第２のグリコシル単位で官能化されている。第１および第２のグリコシル単位は、好ましくは、第１および第２のペプチドをそれぞれ第１および第２のグリコシル単位に相互作用しないように結合させることができる様々なトランスフェラーゼの基質である。実際には、（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２リンカーを、第１のペプチドと、第１のグリコシル単位を基質とする第１のランスフェラーゼとに接触させ、それによって、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２を形成させる。次に、場合によっては、トランスフェラーゼおよび／または未反応ぺプチドを反応混合物から除去する。第２のペプチドと、第２のグリコシル単位を基質とする第２のトランスフェラーゼとを（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２コンジュゲートに加え、（ペプチド）^１−（グリコシル）^１−ＰＥＧ−（グリコシル）^２−（ペプチド）^２を形成させる。この際、グリコシル残基のうちの少なくとも１つは、直接または間接的にＯ結合している。上記に概説した方法は、例えば、分枝状ＰＥＧ、デンドリマー、ポリアミノ酸、多糖（ｐｏｌｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）などの使用による、２つ以上のペプチド間のコンジュゲート形成にも適用可能であることが、当業者には理解されよう。

【0241】

例示的な実施形態では、インターフェロンα２β（ＩＦＮ−α２β）は、ＰＥＧ部分の各末端に完全なグリコシル結合基を含む二官能性リンカーを介してトランスフェリンに結合される（スキーム１）。ＩＦＮコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、コンジュゲートの分子サイズが大きくなることにより、ＩＦＮ単独での半減期より長くなる。さらに、トランスフェリンにＩＦＮを結合させると、コンジュゲートを脳に選択的に導くのに役立つ。例えば、ＰＥＧリンカーの一方の末端は、ＣＭＰシアル酸で官能化され、他方は、ＵＤＰ ＧａｌＮＡｃで官能化される。リンカーは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの存在下でＩＦＮと結合し、リンカーアームのＧａｌＮＡｃをＩＦＮ上のセリンおよび／またはトレオニン残基に結合させる。

【0242】

【化10】

【0243】

前述のプロセスは、所望の回数繰り返して実施することができ、また、単一のリンカーを用いて２つのペプチド間のコンジュゲートを形成することに限定されない。さらに、ＰＥＧ（または他の）リンカー末端の完全なグリコシル結合基をペプチドで官能化する反応は、同じ反応容器中で同時に起こすこともでき、あるいは、それらの反応を段階的に実施することもできることが、当業者には理解されよう。反応を段階的に実施するとき、場合によっては、各ステップで作製されるコンジュゲートを１種また複数の反応成分（例えば、酵素、ペプチド）から精製する。

【0244】

さらに別の例示的な実施形態をスキーム２で説明する。スキーム２は、選択されたタンパク質、例えば、ＧＭ−ＣＳＦを、骨へと導き、選択されたタンパク質の循環半減期を延長させるコンジュゲートを調製する方法を示す。

【0245】

【化11】

（式中、Ｇは、コンジュゲート中の完全なグリコシル結合基に変換される、活性化糖部分（例えば、糖ヌクレオチド）上のグリコシル残基である。）ｓが０より大きいとき、Ｌは、ＧａｌＮＡｃやＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌなどのサッカリル結合基である。

【0246】

１つまたは複数のペプチド部分をリンカーに結合させるためにＰＥＧ（または他のリンカー）の反応性誘導体を使用することは、本発明の範囲内である。本発明は、反応性のＰＥＧ類似体のアイデンティティによって制限されない。ポリエチレングリコールの多くの活性化誘導体が市販されており、また、文献に記載されている。本発明において有用な基質を調製するのに用いる適切な活性化ＰＥＧ誘導体を選択し、また、必要な場合には合成することは、当業者の能力で十分に対応できる範囲内である。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、７：１７５〜１８６頁（１９８４年）、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２：３５８２〜３５８６頁（１９７７年）、Ｊａｃｋｓｏｎ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１６５：１１４〜１２７頁（１９８７年）、Ｋｏｉｄｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１１：６５９〜６６７頁（１９８３年）、トレシラート（Ｎｉｌｓｓｏｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１０４：５６〜６９頁、Ｄｅｌｇａｄｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１２：１１９〜１２８頁（１９９０年））、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドにより誘導した活性エステル（Ｂｕｃｋｍａｎｎ他Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８２：１３７９〜１３８４頁（１９８１年）、Ｊｏｐｐｉｃｈ他、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０：１３８１〜１３８４頁（１９７９年）、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．７：１７５〜１８６頁（１９８４年）、Ｋａｔｒｅ他Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：１４８７〜１４９１頁（１９８７年）、Ｋｉｔａｍｕｒａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５１：４３１０〜４３１５頁（１９９１年）、Ｂｏｃｃｕ他、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、３８Ｃ：９４〜９９頁（１９８３年））、カルボナート（Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＣＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｈａｒｒｉｓ編Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９２年、３４７〜３７０頁、Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５：１００〜１１４頁（１９９２年）、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１：１４１〜１５２頁（１９８５年））、イミダゾリルホルマート（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１：２５〜３３頁（１９８３年）、Ｂｅｒｇｅｒ他、Ｂｌｏｏｄ．７１：１６４１〜１６４７頁（１９８８年））、４−ジチオピリジン（Ｗｏｇｈｉｒｅｎ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、４：３１４〜３１８頁（１９９３年））、イソシアナート（Ｂｙｕｎ他、ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．６４９〜６５３頁（１９９２年））、ならびにエポキシド（Ｎｏｉｓｈｉｋｉ他らに発行された（１９８９年）米国特許第４８０６５９５号）を参照のこと。他の結合基としては、アミノ基と活性化ＰＥＧ間のウレタン結合が挙げられる。Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｏｈｎｏｌ．、１１：１４１〜１５２頁（１９８５年）を参照のこと。

【0247】

反応性ＰＥＧ誘導体が利用される別の例示的な実施形態では、本発明は、糸球体によるタンパク質のろ過を遅延させるのに十分なサイズの合成ポリマーまたは天然ポリマー（例えば、アルブミン）にペプチドを結合させることによって、選択されたペプチドの血液循環半減期を延長させるための方法、要するに、血液プールにそのペプチドを導くための方法を提供する。スキーム３を参照のこと。本発明のこの実施形態をスキームに示す。図中、Ｇ−ＣＳＦは、化学的修飾および酵素的修飾の組合せを用いて、ＰＥＧリンカーを介してアルブミンに結合されている。

【0248】

【化12】

【0249】

したがって、スキーム３で示されるように、アルブミンの残基（例えば、アミノ酸側鎖）は、Ｘ−ＰＥＧ−（ＣＭＰ−シアル酸）（式中、Ｘは、活性化基（例えば、活性エステル、イソチオシアナートなど）である）などの反応性ＰＥＧ誘導体で修飾される。ＰＥＧ誘導体およびＧ−ＣＳＦを混合し、ＣＭＰ−シアル酸を基質とするトランスフェラーゼに接触させる。別の例示的な実施形態では、リシンのε−アミンをＰＥＧリンカーのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させて、アルブミンコンジュゲートを形成させる。リンカーのＣＭＰ−シアル酸をＧＣＳＦ上の適切な残基、例えば、ＧａｌまたはＧａｌＮａｃに酵素的に結合させ、それによってコンジュゲートを形成させる。前述の方法は説明した反応相手に限定されないことが、当業者には理解されよう。さらに、この方法を実施して、例えば、２つより多い末端を有する分枝リンカーを利用することにより、２つより多いタンパク質部分を含むコンジュゲートを形成させることもできる。

【0250】

修飾された糖
修飾されたグリコシル供与体種（「修飾された糖」）は、好ましくは、修飾された糖ヌクレオチド、活性化された修飾された糖、およびヌクレオチドでもなく活性化もされていない単純糖である修飾された糖から選択される。本発明の方法を用いて、所望の任意の糖構造体をペプチドに付加することができる。一般には、この構造体は単糖と考えられるが、本発明は、修飾された単糖の使用に限定されない。すなわち、オリゴ糖および多糖も同様に有用である。

【0251】

修飾基は、酵素的手段、化学的手段、またはそれらの組合せによって糖部分に結合され、それにより、修飾された糖を生じる。これらの糖は、修飾部分の結合を可能にし、さらに、修飾された糖をペプチドに連結するのに使用される酵素の基質として糖が機能することを可能にする任意の位置で置換される。別の実施形態では、シアル酸が糖であるとき、シアル酸は、ピルビル側鎖上の９位、またはシアル酸で通常アセチル化されているアミン部分上の５位で、修飾基に置換されている。

【0252】

本発明のいくつかの実施形態では、修飾された糖ヌクレオチドを利用して、修飾された糖をペプチドに付加する。修飾された形態で本発明において使用される例示的な糖ヌクレオチドには、１リン酸ヌクレオチド、２リン酸ヌクレオチド、もしくは３リン酸ヌクレオチド、またはその類似体が含まれる。別の実施形態では、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−グリコシド、ＣＭＰ−グリコシド、またはＧＤＰ−グリコシドから選択される。さらにより好ましくは、修飾された糖ヌクレオチドは、ＵＤＰ−ガラクトース、ＵＤＰ−ガラクトサミン、ＵＤＰ−グルコース、ＵＤＰ−グルコサミン、ＧＤＰ−マンノース、ＧＤＰ−フコース、ＣＭＰ−シアル酸、またはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃから選択される。糖ヌクレオチドのＮ−アセチルアミン誘導体も、本発明の方法において有用である。

【0253】

本発明は、修飾された糖、例えば、修飾されたガラクトース、フコース、ＧａｌＮＡｃ、およびシアル酸を用いて修飾ペプチドを合成するための方法も提供する。修飾されたシアル酸を使用するとき、シアリルトランスフェラーゼまたはトランスシアリダーゼ（α２，３結合型シアル酸のみ）をこれらの方法で使用することができる。

【0254】

別の実施形態では、修飾された糖は、活性化糖である。本発明において有用な修飾された活性化糖は、一般に、活性化された脱離基を含むように合成によって改変されたグリコシドである。本明細書では、「活性化された脱離基」という用語は、酵素に調節された求核置換反応で容易に置換される部分を意味する。多くの活性化糖が、当技術分野では公知である。例えば、Ｖｏｃａｄｌｏ他、Ｉｎ ＣＡＲＢＯＨＹＤＲＡＴＥ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ、２巻、Ｅｒｎｓｔ他編、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ：バインハイム、ドイツ、２０００年、Ｋｏｄａｍａ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：６４１９頁（１９９３年）、Ｌｏｕｇｈｅｅｄ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７７１７頁（１９９９年）を参照のこと。

【0255】

活性化基（脱離基）の例としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、トシラートエステル、メシラートエステル、トリフラートエステルなどが挙げられる。本発明で使用するための好ましい活性化脱離基は、受容体へのグリコシドの酵素的な転移を立体的にあまり妨害しないものである。したがって、活性化されたグリコシド誘導体の好ましい実施形態としては、グリコシルフルオリドおよびグリコシルメシラートが挙げられ、グリコシルフルオリドが特に好ましい。グリコシルフルオリドのうちでは、α−ガラクトシルフルオリド、α−マンノシルフルオリド、α−グルコシルフルオリド、α−フコシルフルオリド、α−キシロシルフルオリド、α−シアリルフルオリド、α−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリド、β−ガラクトシルフルオリド、β−マンノシルフルオリド、β−グルコシルフルオリド、β−フコシルフルオリド、β−キシロシルフルオリド、β−シアリルフルオリド、β−Ｎ−アセチルグルコサミニルフルオリド、およびβ−Ｎ−アセチルガラクトサミニルフルオリドが最も好ましい。

【0256】

例示として、グリコシルフルオリドは、最初に糖をアセチル化し、次いで、ＨＦ／ピリジンでそれを処理することによって、遊離の糖から調製することができる。これにより、保護された（アセチル化された）グリコシルフルオリド（すなわち、α−グリコシルフルオリド）の熱力学的に最も安定なアノマーが生成される。安定性がより低いアノマー（すなわち、β−グリコシルフルオリド）が望ましい場合は、過アセチル化された糖をＨＢｒ／ＨＯＡｃまたはＨＣｌを用いて変換してアノマーの臭化物または塩化物を生じさせることによって、調製することができる。この中間体をフッ化銀などのフッ化塩と反応させて、グリコシルフルオリドを得る。メタノールに溶かした緩和な（触媒作用の）塩基（例えばＮａＯＭｅ／ＭｅＯＨ）と反応させることによって、アセチル化したグリコシルフルオリドを脱保護することができる。また、多くのグリコシルフルオリドが市販されている。

【0257】

当業者に公知である従来の方法を用いて、他の活性化されたグリコシル誘導体を調製することができる。例えば、糖の完全にベンジル化されたヘミアセタール型を塩化メシルで処理し、続いて接触水素化によってベンジル基を除去することによって、グリコシルメシラートを調製することができる。

【0258】

別の例示的な実施形態では、修飾された糖は、アンテナ構造を有するオリゴ糖である。別の実施形態では、アンテナの末端の１つまたは複数が、修飾部分を有する。複数の修飾部分がアンテナ構造を有するオリゴ糖に結合しているとき、このオリゴ糖は、修飾部分を「増幅する」のに有用であり、ペプチドに結合している各オリゴ糖単位は、修飾基の複数のコピーをペプチドに結合させる。上記の図面で説明した本発明の典型的なコンジュゲートの一般構造は、アンテナ構造を利用して本発明のコンジュゲートを調製した結果として生じる多価の種を包含する。多くのアンテナ型の糖構造体が当技術分野では公知であり、無制限にそれらを用いて本発明の方法を実施することできる。

【0259】

例示的な修飾基を以下に考察する。修飾基は、１種または複数の望ましい特性をペプチドに与えるそれらの能力に関して選択することができる。例示的な諸特性としては、それだけには限らないが、改善された薬物動態、改善された薬力学的特性、改善された体内分布、多価の種の提供、改善された水溶性、増大もしくは低減された親油性、および組織標的性が挙げられる。

【0260】

水溶性ポリマー
多くの水溶性ポリマーが当業者に公知であり、本発明を実施するのに有用である。水溶性ポリマーという用語は、糖（例えば、デキストラン、アミロース、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、ヘパラン、ヘパリンなど）；ポリアミノ酸、例えば、ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸；核酸；合成ポリマー（例えば、ポリアクリル酸、ポリエーテル、例えば、ポリエチレングリコール）；ペプチド、タンパク質などの化学種を包含する。本発明は、任意の水溶性ポリマーを用いて実施してよく、唯一の制約は、そのポリマーが、コンジュゲートの残りの部分が結合され得る箇所を含んでいなければならないことである。

【0261】

ポリマーを活性化するための方法も、ＷＯ９４／１７０３９号、米国特許第５３２４８４４号、ＷＯ９４／１８２４７号、ＷＯ９４／０４１９３号、米国特許第５２１９５６４号、米国特許第５１２２６１４号、ＷＯ９０／１３５４０号、米国特許第５２８１６９８号、さらにＷＯ９３／１５１８９号で確認することができ、また、活性化ポリマーとペプチド、例えば、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４４１２９８９号）、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ他、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１〜４５頁（１９８５年））とを結合させる方法も各文献で確認できる。

【0262】

好ましい水溶性ポリマーは、ポリマーサンプル中のかなりの比率のポリマー分子が、ほぼ同じ分子量を有するものである。このようなポリマーは、「均一分散性」である。

【0263】

本発明は、ポリエチレングリコールコンジュゲートを参照することにより、さらに例示される。ＰＥＧの官能化および結合に関するいくつかの総説および研究論文が入手可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ、Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５〜３７３頁（１９８５年）；Ｓｃｏｕｔｅｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １３５：３０〜６５頁（１９８７年）；Ｗｏｎｇ他、Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６〜８７４頁（１９９２年）；Ｄｅｌｇａｄｏ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ９：２４９〜３０４頁（１９９２年）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：１５０〜１６５頁（１９９５年）；およびＢｈａｄｒａ他、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、５７：５〜２９頁（２００２年）を参照のこと。反応性ＰＥＧ分子を調製し、反応性分子を用いてコンジュゲートを形成させるための手段は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５６７２６６２号は、直鎖状または分枝状のポリアルキレンオキシド、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリオレフィンアルコール、およびポリアクリロモルホリンから選択されるポリマー酸の活性エステルの水溶性で単離可能なコンジュゲートを開示している。

【0264】

米国特許第６３７６６０４号は、有機溶媒中でポリマーの末端ヒドロキシルとジ（１−ベンゾトリアゾリル）炭酸とを反応させることによって、非ペプチド性水溶性ポリマーの水溶性１−ベンゾトリアゾリル炭酸エステルを調製するための方法を発表している。活性エステルは、タンパク質やペプチドなどの生物学的に活性な作用物質とのコンジュゲートを形成させるのに使用される。

【0265】

ＷＯ９９／４５９６４号は、生物学的に活性な作用物質と活性化された水溶性ポリマーを含むコンジュゲートを記述しており、その水溶性ポリマーは、少なくとも１つの末端が安定な結合によってそのポリマー主鎖に結合しているポリマー主鎖を含み、その少なくとも１つの末端は、近接した反応性基がその分枝部分に結合している分枝部分を含み、生物学的に活性な作用物質は、近接した反応性基のうちの少なくとも１つに結合している。他の分枝状ポリエチレングリコールが、ＷＯ９６／２１４６９号で記載されている。米国特許第５９３２４６２号では、反応性官能基を含む分枝状末端を含む分枝状ＰＥＧ分子を用いて形成されるコンジュゲートが記載されている。タンパク質やペプチドなどの生物学的に活性な化学種と反応して、ポリエチレングリコールと生物学的に活性な化学種とのコンジュゲートを形成させるために、遊離の反応性基が利用可能である。米国特許第５４４６０９０号では、二官能性のＰＥＧリンカー、およびＰＥＧリンカー末端のそれぞれにペプチドを有するコンジュゲートを形成させる際のその使用が記載されている。

【0266】

分解性のＰＥＧ結合を含むコンジュゲートは、ＷＯ９９／３４８３３号およびＷＯ９９／１４２５９号、ならびに米国特許第６３４８５５８号で記載されている。このような分解性の結合は、本発明で適用可能である。

【0267】

当業者に認知されている前述のポリマー活性化方法は、本発明において、本明細書で示す分枝状ポリマーを形成させるのに有用であり、また、それらの分枝状ポリマーを他の化学種、例えば、糖、糖ヌクレオチドなどに結合させるのにも有用である。

【0268】

本発明で有用である例示的なポリエチレングリコール分子には、それだけには限らないが、以下の式を有するものが含まれる。

【0269】

【化13】

（式中、Ｒ^８は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ_２、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、例えば、アセタール、ＯＨＣ−、Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ｑ−、ＨＳ−（ＣＨ_２）_ｑ、または−（ＣＨ_２）_ｑＣ（Ｙ）Ｚ^１である。添字「ｅ」は、１〜２５００の整数を表す。添字ｂ、ｄ、およびｑは、それぞれ独立に整数０〜２０を表す。記号ＺおよびＺ^１は、それぞれ独立に、ＯＨ、ＮＨ_２、脱離基、例えば、イミダゾール、ｐ−ニトロフェニル、ＨＯＢＴ、テトラゾール、ハライド、Ｓ−Ｒ^９、活性化エステルのアルコール部分；−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｙ^１）Ｖ、または−（ＣＨ_２）_ｐＵ（ＣＨ_２）_ｓＣ（Ｙ^１）_Ｖを表す。記号Ｙは、Ｈ（２）、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｎ−Ｒ^１０を表す。記号Ｘ、Ｙ、Ｙ^１、Ａ^１、およびＵは、それぞれ独立に、Ｏ、Ｓ、Ｎ−Ｒ^１１部分を表す。記号Ｖは、ＯＨ、ＮＨ_２、ハロゲン、Ｓ−Ｒ^１２、活性化エステルのアルコール成分、活性化アミドのアミン成分、糖ヌクレオチド、およびタンパク質を表す。添字ｐ、ｑ、ｓ、およびｖは、整数０〜２０からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。記号Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、およびＲ^１２は、Ｈ、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のヘテロアルキル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロシクロアルキル、および置換もしくは非置換のヘテロアリールをそれぞれ独立に表す。）

【0270】

他の例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール分子は、以下のものから選択される。

【0271】

【化14】

【0272】

本発明のコンジュゲートを形成させるのに有用なポリエチレングリコールは、直鎖状または分枝状である。本発明で使用するのに適した分枝状ポリエチレングリコール分子には、それだけには限らないが、以下の式で示されるものが含まれる。

【0273】

【化15】

（式中、Ｒ^８およびＲ^８’は、Ｒ^８に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。Ａ^１およびＡ^２は、Ａ^１に関して上記に定義した群からそれぞれ独立に選択されるメンバーである。添字ｅ、ｆ、ｏ、およびｑは、前述したとおりのものである。ＺおよびＹは、前述したとおりのものである。Ｘ^１およびＸ^１’は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ、およびＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨからそれぞれ独立に選択されるメンバーである。）

【0274】

他の例示的な実施形態では、分枝状ＰＥＧは、システイン、セリン、またはジリシンのコアをベースとしている。したがって、さらなる例示的な分枝状ＰＥＧには、以下のものが含まれる。

【0275】

【化16】

【0276】

さらに別の実施形態では、分枝状ＰＥＧ部分は、トリリシンペプチドをベースとしている。トリリシンは、１箇所、２箇所、３箇所、または４箇所、ＰＥＧ化され得る。この実施形態の例示的な化学種は、以下の式を有する。

【0277】

【化17】

（式中、ｅ、ｆ、およびｆ’は、それぞれ独立に選択された１〜２５００の整数であり、ｑ、ｑ’、およびｑ’’は、それぞれ独立に選択された１〜２０の整数である。）

【0278】

本発明の例示的な実施形態では、ＰＥＧは、ｍ−ＰＥＧ（５ｋＤ、１０ｋＤ、または２０ｋＤ）である。例示的な分枝状ＰＥＧ種は、セリン−（ｍ−ＰＥＧ）_２またはシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）_２（式中、ｍ−ＰＥＧは２０ｋＤのｍ−ＰＥＧである）である。

【0279】

当業者には明らかであるように、本発明で有用な分枝状ポリマーには、前述した趣旨に基づく変形体が含まれる。例えば、上記に示したジリシン−ＰＥＧコンジュゲートは、３つの重合体サブユニットを含むことができ、第３のものは、上記の構造において未修飾として示されているαアミンに結合される。同様に、３つまたは４つの重合体サブユニットで官能化されたトリリシンの使用も、本発明の範囲内である。

【0280】

本発明の特定の実施形態は、以下のもの、

【0281】

【化18】

ならびに、以下のものなどこれらの化学種のカルボナートおよび活性エステルを含む。

【0282】

【化19】

【0283】

本明細書で説明する化合物を調製するのに有用な直鎖状ＰＥＧを活性化させるのに適した他の活性化基または脱離基には、それだけには限らないが、以下の化学種が含まれる。

【0284】

【化20】

【0285】

これらおよび他の化学種によって活性化されるＰＥＧ分子ならびに活性化ＰＥＧを作製する方法は、ＷＯ０４／０８３２５９号で説明されている。

【0286】

分枝状ポリマーのｍ−ＰＥＧアームのうちの１つまたは複数を、異なる末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１０アルキルなどを有するＰＥＧ部分で置換できることが、当業者には理解されよう。さらに、上記の構造体は、α炭素原子と側鎖の官能基との間にアルキルリンカーを挿入することによって（または、炭素原子を除去することによって）、容易に修飾される。したがって、「ホモ」誘導体および高級同族体、ならびに低級同族体は、本発明において有用な分枝状ＰＥＧのコアの範囲に含まれる。

【0287】

本発明書で説明する分枝状ＰＥＧ種は、以下のスキームで示すものなどの方法によって容易に調製される。

【0288】

【化21】

（式中、Ｘ^ａはＯまたはＳであり、ｒは、１〜５の整数である。添字ｅおよびｆは、１〜２５００からそれぞれ独立に選択される整数である。）

【0289】

すなわち、このスキームに従い、天然または非天然のアミノ酸を活性化ｍ−ＰＥＧ誘導体、この場合ではトシラートと接触させ、側鎖のヘテロ原子Ｘ^ａをアルキル化することによって１を形成させる。モノ官能化されたｍ−ＰＥＧアミノ酸を、反応性ｍ−ＰＥＧ誘導体とともにＮ−アシル化条件下におき、それによって、２の分枝状ｍ−ＰＥＧを構築する。当業者なら理解するように、トシラート脱離基は、任意の適切な脱離基、例えば、ハロゲン、メシラート、トリフラートなどに交換することができる。同様に、アミンをアシル化するのに利用する反応性カルボナートも、活性エステル、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどに交換することができ、あるいは、酸は、ジシクロヘキシルカルボジイミドやカルボニルジイミダゾールなどの脱水剤によってｉｎ ｓｉｔｕで活性化することができる。

【0290】

例示的な実施形態では修飾基はＰＥＧ部分であるが、任意の修飾基、例えば、水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、治療効果を有する部分などを、適切な結合を通じてグリコシル部分に組み込むことができる。修飾された糖は、酵素的手段、化学的手段、またはそれらの組合せによって形成され、それにより、修飾された糖を生じる。例示的な実施形態では、これらの糖は、修飾部分の結合を可能にし、さらに、修飾された糖をＧ−ＣＳＦペプチドに結合させることができる酵素の基質として糖が機能することを可能にする任意の位置で活性アミンに置換されている。例示的な実施形態では、ガラクトサミンが修飾された糖であるとき、アミン部分は６位の炭素原子に結合している。

【0291】

水溶性ポリマーで修飾された化学種
糖部分が水溶性ポリマーで修飾されている、水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖種が、本発明において有用である。例示的な修飾された糖ヌクレオチドは、糖上のアミン部分を介して修飾されている糖基を有する。修飾された糖ヌクレオチド、例えば、糖ヌクレオチドのサッカリル−アミン誘導体も、本発明の方法において有用である。例えば、（修飾基の付いていない）サッカリルアミンをペプチド（または他の化学種）に酵素的に結合させ、続いて、その遊離なサッカリルアミン部分を所望の修飾基に結合させることができる。あるいは、修飾された糖ヌクレオチドが、基質、例えば、ペプチド、糖ペプチド、脂質、アグリコン、糖脂質などにあるサッカリル受容体に修飾された糖を転移させる酵素の基質として機能することもできる。

【0292】

糖コアがガラクトースまたはグルコースである一実施形態では、Ｒ^５はＮＨＣ（Ｏ）Ｙである。

【0293】

例示的な実施形態では、修飾された糖は、６−アミノ−Ｎ−アセチル−グリコシル部分をベースとしている。Ｎ−アセチルガラクトサミンについて以下に示すように、６−アミノ糖部分は、標準の方法によって容易に調製される。

【0294】

【化22】

【0295】

上記のスキームにおいて、添字ｎは、１〜２５００、好ましくは１０〜１５００、より好ましくは１０〜１２００の整数を表す。記号「Ａ」は、活性化基、例えば、ハロ、活性化エステルの成分（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、カルボナートの成分（例えば、ｐ−ニトロフェニルカルボナート）などを表す。他のＰＥＧ−アミドヌクレオチド糖は、この方法および類似した方法によって容易に調製されることが、当業者には理解されよう。

【0296】

他の例示的な実施形態では、アミド部分は、ウレタンや尿素などの基に置き換えられる。

【0297】

さらに別の実施形態では、Ｒ^１は、分枝状ＰＥＧ、例えば、前述した化学種のうちの１つである。この実施形態の例示的な化合物には以下のものが含まれる。

【0298】

【化23】

（式中、Ｘ^４は、結合またはＯであり、Ｊは、ＳまたはＯである。）

【0299】

さらに、前述したように、本発明は、直鎖状または分枝状の水溶性ポリマーで修飾されたヌクレオチド糖を用いて形成されるペプチドコンジュゲートを提供する。例えば、以下に示す式を有する化合物は、本発明の範囲内である。

【0300】

【化24】

（式中、Ｘ^４は、Ｏまたは結合であり、Ｊは、ＳまたはＯである。）

【0301】

同様に、本発明は、６位の炭素が修飾されている修飾された糖種のヌクレオチド糖を用いて形成されるペプチドコンジュゲートも提供する。

【0302】

【化25】

（式中、Ｘ^４は、結合またはＯであり、Ｊは、ＳまたはＯであり、ｙは０または１である。）

【0303】

本発明の組成物を含むペプチドおよび糖ペプチド、脂質および糖脂質のコンジュゲートも提供される。例えば、本発明は、以下の式を有するコンジュゲートを提供する。

【0304】

【化26】

（式中、Ｊは、ＳまたはＯである。）

【0305】

水不溶性ポリマー
別の実施形態では、前述のものと類似して、修飾された糖は、水溶性ポリマーではなく水不溶性ポリマーを含む。本発明のコンジュゲートは、１種または複数の水不溶性ポリマーを含んでもよい。本発明のこの実施形態は、制御された方式で治療用ペプチドを送達するのに用いられるビヒクルとしてコンジュゲートを使用することによって例示される。高分子薬物の送達システムは、当技術分野で公知である。例えば、Ｄｕｎｎ他編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年を参照のこと。実質上どの公知の薬物送達システムも本発明のコンジュゲートに適用可能であることが、当業者には理解されよう。

【0306】

代表的な水不溶性ポリマーとしては、それだけには限らないが、ポリホスファジン、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタラート、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン、ポリメチルメタクリラート、ポリエチルメタクリラート、ポリブチルメタクリラート、ポリイソブチルメタクリラート、ポリヘキシルメタクリラート、ポリイソデシルメタクリラート、ポリラウリルメタクリラート、ポリフェニルメタクリラート、ポリメチルアクリラート、ポリイソプロピルアクリラート、ポリイソブチルアクリラート、ポリ（オクタデシルアクリラート）ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタラート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、プルロニック、およびポリビニルフェノール、ならびにそれらの共重合体が挙げられる。

【0307】

本発明のコンジュゲートにおいて有用な合成により修飾された天然ポリマーとしては、それだけには限らないが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、およびニトロセルロースが挙げられる。合成により修飾された天然ポリマーの広範なクラスのうちの特に好ましいメンバーとしては、それだけには限らないが、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース、硫酸セルロースナトリウム塩、ならびにアクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、およびアルギン酸のポリマーが挙げられる。

【0308】

本明細書で説明するこれらおよび他のポリマーは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ワレントン（Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ）、ペンシルベニア州）、Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州）、Ｆｌｕｋａ社（ロンコンコマ（Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ）、ニューヨーク州）、およびＢｉｏＲａｄ社（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）などの商業的供給業者から容易に入手することができ、あるいは、標準の技術を用いてこれらの供給業者から得たモノマーから合成することができる。

【0309】

本発明のコンジュゲートにおいて有用な代表的な生分解性のポリマーとしては、それだけには限らないが、ポリラクチド、ポリグリコリド、およびそれらの共重合体、ポリエチレンテレフタラート、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、それらの混合物および共重合体が挙げられる。コラーゲン、プルロニックなどを含むものなど、ゲルを形成する組成物が特に有用である。

【0310】

本発明において有用なポリマーには、その構造の少なくとも１部分の内部に生体吸収性分子を有する水不溶性物質を含む「ハイブリッド」ポリマーが含まれる。このようなポリマーの例は、水不溶性の共重合体を含むものであり、ポリマー鎖ごとに生体吸収性領域、親水性領域、および複数の架橋性官能基を有する。

【0311】

本発明の目的において、「水不溶性の物質」とは、水または水を含有する環境に実質上不溶性である物質を含む。したがって、共重合体の一部の領域または部分は親水性でも、さらには水溶性でもよいが、ポリマー分子は全体として、実質的な量としては水に溶解しない。

【0312】

本発明の目的において、「生体吸収性分子」という用語は、代謝もしくは分解され、通常の排出経路を通じて身体に再吸収および／または排除されることができる領域を含む。このような代謝産物または分解産物は、身体に対して実質上非毒性であることが好ましい。

【0313】

共重合体組成物が全体として水溶性に変えられない限りは、生体吸収性領域は疎水性でも親水性でもよい。したがって、生体吸収性領域は、ポリマーが全体として水不溶性のままであるという優先条件に基づいて選択される。したがって、相対的諸特性、すなわち、含まれる官能基の種類、ならびに、生体吸収性領域および親水性領域の相対的比率は、有用な生体吸収性組成物が水不溶性のままであることを確実にするように選択される。

【0314】

例示的な再吸収性ポリマーには、例えば、ポリ（α−ヒドロキシ−カルボン酸）／ポリオキシアルキレンの合成により作製された再吸収性のブロック共重合体が含まれる（Ｃｏｈｎ他、米国特許第４８２６９４５号を参照のこと）。これらの共重合体は、架橋されておらず水溶性であり、したがって、身体は分解されたブロック共重合体組成物を排出することができる。Ｙｏｕｎｅｓ他、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２１：１３０１〜１３１６頁（１９８７年）、およびＣｏｈｎ他、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３〜１００９頁（１９８８年）を参照のこと。

【0315】

現在のところ好ましい生体吸収性ポリマーは、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリラクトン、ポリアミド、ポリエステルアミド、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカルボナート、ポリホスファジン、ポリリン酸エステル、ポリチオエステル、多糖、およびそれらの混合物から選択される１種または複数の成分を含む。さらにより好ましくは、生体吸収性ポリマーは、ポリヒドロキシ酸成分を含む。ポリヒドロキシ酸のうちでは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそれらの共重合体および混合物が好ましい。

【0316】

ｉｎ ｖｉｖｏで吸収される（「生体吸収される」）断片を形成することに加えて、本発明の方法で使用するのに好ましいポリマー被膜は、排出可能および／または代謝可能な断片を形成することもできる。

【0317】

高次の共重合体も本発明で使用することができる。例えば、１９８４年３月２０日発行のＣａｓｅｙ他、米国特許第４４３８２５３号は、ポリグリコール酸およびヒドロキシル末端のポリアルキレングリコールのエステル転移反応から作製されるトリブロック共重合体を開示している。このような組成物は、再吸収性モノフィラメント縫合糸として使用するために開示されている。このような組成物の柔軟性は、ｔｅｔｒａ−ｐ−トリルオルトカルボナートなどの芳香族オルトカルボナートを共重合体構造に組み込むことによって調節される。

【0318】

乳酸および／またはグリコール酸をベースとする他のポリマーも利用することができる。例えば、１９９３年４月１３日発行のＳｐｉｎｕ、米国特許第５２０２４１３号は、オリゴマージオールまたはジアミン残基上にラクチドおよび／またはグリコリドを開環重合させ、続いて、ジイソシアナート、ジアシルクロリド、ジクロロシランなどの二官能化合物を用いて鎖伸長させることにより作製される、ポリラクチドおよび／またはポリグリコリドの連続して配置されたブロックを有する生分解性マルチブロック共重合体を開示している。

【0319】

本発明において有用な被膜の生体吸収性領域は、加水分解および／または酵素によって切断可能となるように設計することができる。本発明の目的において、「加水分解により切断可能」とは、水または水を含有する環境における加水分解に対して、共重合体、特に生体吸収性領域が影響を受けやすいことを意味する。同様に、本明細書では「酵素により切断可能」とは、内因性または外因性の酵素による切断に対して、共重合体、特に生体吸収性領域が影響を受けやすいことを意味する。

【0320】

体内に入ると、親水性領域は、処理されて排出可能および／または代謝可能な断片になり得る。したがって、親水性領域としては、例えば、ポリエーテル、ポリアルキレンオキシド、多価アルコール、ポリビニルピロリジン、ポリビニルアルコール、ポリアルキルオキサゾリン、多糖、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ならびにそれらの共重合体および混合物を挙げることができる。さらに、親水性領域は、例えば、ポリアルキレンオキシドでもよい。このようなポリアルキレンオキシドとしては、例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ならびにそれらの混合物および共重合体を挙げることができる。

【0321】

ヒドロゲルの成分であるポリマーも、本発明において有用である。ヒドロゲルは、比較的大量の水を吸収することができるポリマー物質である。ヒドロゲル形成化合物の例としては、それだけには限らないが、ポリアクリル酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリジン、ゼラチン、カラゲナンおよび他の多糖、ヒドロキシエチレンメタクリル酸（ＨＥＭＡ）、ならびにそれらの誘導体などが挙げられる。安定で、生分解性かつ生体吸収性のヒドロゲルを作製することができる。さらに、ヒドロゲル組成物は、これらの特性のうちの１種または複数を示すサブユニットを含んでもよい。

【0322】

架橋によって完全性を調節することができる生体適合性ヒドロゲル組成物は公知であり、現在のところ、本発明の方法で使用するのに好ましい。例えば、Ｈｕｂｂｅｌｌ他、１９９５年４月２５日発行の米国特許第５４１００１６号および１９９６年６月２５日発行の米国特許第５５２９９１４号は、水溶性の系を開示しており、これらは、水溶性の中央のブロック部分が加水分解に対して不安定な２つの伸長部分の間にはさまれている架橋ブロック共重合体である。さらに、このような共重合体は、光重合性のアクリル酸官能基でエンドキャップされている。架橋されると、これらの系はヒドロゲルになる。このような共重合体の水溶性の中央ブロックはポリエチレングリコールを含んでよく、一方、加水分解に対して不安定な伸長部分は、ポリグリコール酸やポリ乳酸などのポリ（α−ヒドロキシ酸）でよい。Ｓａｗｈｎｅｙ他、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２６：５８１〜５８７頁（１９９３年）を参照のこと。

【0323】

別の実施形態では、ゲルは、熱可逆性ゲルである。プルロニック、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、多糖、ポリウレタンヒドロゲル、ポリウレタン尿素ヒドロゲル、およびそれらの組合せ物などの成分を含む熱可逆性ゲルが、現在のところ好ましい。

【0324】

さらに別の例示的な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リポソーム成分を含む。リポソームは、例えば１９８５年６月１１日発行のＥｐｐｓｔｅｉｎ他、米国特許第４５２２８１１号で記載されているような当業者に公知の方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、無機溶媒中で適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、およびコレステロールなど）を溶解させ、次に溶媒を蒸発させて容器の表面に乾燥した脂質の薄い被膜を残すことによって、調製することができる。次に、活性な化合物または薬剤として許容されるその塩の水溶液が、その容器中に導入される。次に、手動でその容器を回転させて、容器の側面から脂質物質を遊離させ、脂質凝集体を分散させ、それにより、リポソーム懸濁液を形成させる。

【0325】

上記に挙げた微粒子および微粒子の調製方法が、例として提供されるが、それらは、本発明で有用な微粒子の範囲を限定するためのものではない。様々な方法によって作製された一連の微粒子が本発明において有用であることは、当業者には明らかであろう。

【0326】

水溶性ポリマーに関して前述した構造の形態は、直鎖状と分枝状のどちらも、一般に、水不溶性ポリマーにも同様に適用できる。したがって、例えば、システイン、セリン、ジリシン、およびトリリシン分岐コアは、２つの水不溶性ポリマー部分で官能化することができる。これらの化学種を作製するのに使用される方法は、一般に、水溶性ポリマーを作製するのに使用される方法に極めて類似している。

【0327】

治療用糖ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期も、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのＰＥＧ部分を用いて向上させることができる。例えば、タンパク質をＰＥＧで化学修飾（ＰＥＧ化）すると、それらの分子サイズが大きくなり、表面および官能基の接近容易性が低減される。各接近容易性は、タンパク質に結合されるＰＥＧのサイズに依存する。この結果、血漿半減期およびタンパク質分解に対する安定性が改善され、免疫原性および肝臓への取込みが低減される（Ｃｈａｆｆｅｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６４３〜１６５１頁（１９９２年）、Ｐｙａｔａｋ他、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：１１３〜１２７頁（１９８０年））。インターロイキン−２をＰＥＧ化するとｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍力が増大されることが報告されており（Ｋａｔｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８４：１４８７〜１４９１頁（１９８７年））、また、モノクローナル抗体Ａ７由来のＦ（ａｂ’）２をＰＥＧ化すると、その腫瘍局在性が改善された（Ｋｉｔａｍｕｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８：１３８７〜１３９４頁（１９９０年））。したがって、別の実施形態では、本発明の方法によってＰＥＧ部分で誘導体化されたペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、非誘導体化ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期と比べて延長されている。

【0328】

ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増大は、その量の増大率の範囲として最もよく表現される。増大率の範囲の下限は、約４０％、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または約２００％である。この範囲の上限は、約６０％、約８０％、約１００％、約１５０％、または、約２５０％より高い。

【0329】

生体分子
別の実施形態では、修飾された糖は、生体分子を有する。さらに別の実施形態では、生体分子は、機能タンパク質、酵素、抗原、抗体、ペプチド、核酸（例えば、単一のヌクレオチドまたはヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ならびに１本鎖および多重鎖の核酸）、レクチン、レセプター、またはそれらの組合せ物である。

【0330】

好ましい生体分子は、本質的に非蛍光性であり、あるいは、アッセイで蛍光マーカーとして使用するのに不適切な程度の最低限の量しか蛍光を発しない。さらに、糖ではない生体分子を使用することが一般に好ましい。この選択に対する例外は、別の単位（例えば、ＰＥＧ、生体分子、治療効果を有する部分、診断用の部分など）の共有結合によって修飾されている、別の様式で天然に存在する糖の使用である。例示的な実施形態では、生体分子である糖部分は、リンカーアームに結合しており、続いて、本発明の方法によって、糖−リンカーアームのカセットがペプチドに結合される。

【0331】

本発明を実施するうえで有用な生体分子は、任意の供給源から得ることができる。生体分子は、天然供給源から単離することができ、あるいは、合成的な方法によってそれらを作製することもできる。ペプチドは、天然ペプチドでも変異ペプチドでもよい。変異は、化学変異誘発、部位特異的変異誘発または当業者に公知の他の変異誘発手段によって起こすことができる。本発明を実施するうえで有用なペプチドとしては、例えば、酵素、抗原、抗体、およびレセプターが挙げられる。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、完全体でも断片でもよい。ペプチドは、場合によっては、指向性進化のプログラムの産物である。

【0332】

天然由来のペプチドおよび合成ペプチドの双方、ならびに核酸が、本発明と組み合わせると有用である。これらの分子は、任意の利用可能な反応性基によって、糖残基成分または架橋物質に結合させることができる。例えば、反応性のアミン、カルボキシル、スルフヒドリル、またはヒドロキシル基を通じて、ペプチドを結合させることができる。反応性基は、ペプチド末端、またはペプチド鎖の内部の部位に存在することができる。塩基上の反応性基（例えば環外のアミン）または糖部分上の利用可能なヒドロキシル基（例えば、３’−または５’−ヒドロキシル）を通じて、核酸を結合させることができる。１つまたは複数の部位でペプチドおよび核酸鎖をさらに誘導体化して、鎖上への適切な反応性基の結合を可能にさせることができる。Ｃｈｒｉｓｅｙ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３０３１〜３０３９頁（１９９６年）を参照のこと。

【0333】

別の実施形態では、本発明の方法によって修飾されたペプチドを特定の組織に誘導し、それによって、その組織に送達される非誘導体化ペプチドの量に比べて、その組織へのペプチドの送達が増大されるように、生体分子が選択される。さらに別の実施形態では、選択された期間内に特定の組織に送達される誘導体化ペプチドの量は、誘導体化によって、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約１００％、増大される。現在、標的化用途に好ましい生体分子としては、抗体、ホルモン、細胞表面レセプターに対するリガンドが挙げられる。

【0334】

さらに別の例示的な実施形態では、ビオチンとのコンジュゲートとして提供される。すなわち、例えば、１つまたは複数の修飾基を有するアビジンまたはストレプトアビジン部分を結合させることによって、選択的にビオチン化されたペプチドを作製する。

【0335】

治療効果を有する部分
別の実施形態では、修飾された糖は、治療効果を有する部分を含む。治療効果を有する部分と生体分子の部類の間には重複があることが、当業者には理解されよう。多くの生体分子は、治療効果を有する諸特性または治療効果を有する可能性を有している。

【0336】

治療効果を有する部分は、臨床用途用にすでに容認されている薬剤でもよく、あるいは、その使用が実験的な薬物、または、その活性もしくは作用機序が調査中である薬物でもよい。治療効果を有する部分は、所与の疾患状態において証明された作用を有するものでもよく、あるいは、所与の疾患状態において望ましい作用を示すことが仮説立てられているだけのものでもよい。別の実施形態では、治療効果を有する部分は、選択した組織と相互に作用する能力についてスクリーニングされる化合物である。本発明を実施するうえで有用な治療効果を有する部分には、様々な薬理活性を有する広範な範囲の薬物クラスからの薬物が含まれる。好ましい治療効果を有する部分は、本質的に非蛍光性であり、あるいは、アッセイで蛍光マーカーとして使用するのに不適切な程度の最低限の量しか蛍光を発しない。さらに、糖ではない治療効果を有する部分を使用することが一般に好ましい。この選択に対する例外は、ＰＥＧ、生体分子、治療効果を有する部分、診断用の部分など別の単位の共有結合によって修飾されている糖の使用である。別の例示的な実施形態では、治療効果を有する糖部分は、リンカーアームに結合しており、続いて、本発明の方法によって、糖−リンカーアームのカセットがペプチドに結合される。

【0337】

治療効果を有する作用物質および診断用作用物質を他の様々な化学種に結合させる方法は、当業者には周知である。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６年、およびＤｕｎｎ他編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年を参照のこと。

【0338】

例示的な実施形態では、治療効果を有する部分は、選択された条件のもとで切断される結合を介して、修飾された糖に結合している。例示的な条件としては、それだけには限らないが、選択されたｐＨ、（例えば、胃、腸、エンドサイトーシスの空胞）、活性酸素の存在（例えば、エステラーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ）、光、熱などが挙げられる。多くの切断可能な基が、当技術分野では公知である。例えば、Ｊｕｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、７６１：１５２〜１６２頁（１９８３年）、Ｊｏｓｈｉ他、Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１４５１８〜１４５２５頁（１９９０年）、Ｚａｒｌｉｎｇ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２４：９１３〜９２０頁（１９８０年）、Ｂｏｕｉｚａｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５：１４１〜１４７頁（１９８６年）、Ｐａｒｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：２０５〜２１０頁（１９８６年）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３：１８５９〜１８６７頁（１９８９年）を参照のこと。

【0339】

有用な治療効果を有する部分のクラスには、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が含まれる。ＮＳＡＩＤＳは、例えば、以下のカテゴリー、すなわち、（例えば、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、フェナム酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体、およびオキシカム）；ヒドロコルチゾンなどを含むステロイド系抗炎症薬；抗ヒスタミン薬（例えば、クロルフェニラミン、トリプロリジン）；鎮咳薬（例えば、デキストロメトルファン、コデイン、カラミフェン、およびカルベタペンタン）；鎮痒薬（例えば、メトジラジンおよびトリメプラジン）；抗コリン作用薬（例えば、スコポラミン、アトロピン、ホマトロピン、レボドパ）；鎮吐薬および制嘔吐薬（例えば、シクリジン、メクリジン、クロルプロマジン、ブクリジン）；摂食障害用の薬物（例えば、ベンズフェタミン、フェンテルミン、クロルフェンテルミン、フェンフルラミン）；中枢興奮薬（例えば、アンフェタミン、メタンフェタミン、デキストロアンフェタミン、およびメチルフェニデート）；抗不整脈薬（例えば、プロパノロール、プロカインアミド、ジソピラミド、キニジン、エンカイニド）；βアドレナリン遮断薬（例えば、メトプロロール、アセブトロール、ベタキソロール、ラベタロール、およびチモロール）；強心薬（例えば、ミルリノン、アムリノン、およびドブタミン）；抗高血圧薬（例えば、エナラプリル、クロニジン、ヒドララジン、ミノキシジル、グアナドレル、グアネチジン）；利尿薬（例えば、アミロリドおよびヒドロクロロチアジド）；血管拡張薬（例えば、ジルチアゼム、アミオダロン、イソクスプリン、ナイリドリン、トラゾリン、およびベラパミル）；血管収縮薬（例えば、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、およびメチルセルギド）；抗潰瘍薬（例えば、ラニチジンおよびシメチジン）；麻酔薬（例えば、リドカイン、ブピバカイン、クロロプロカイン、ジブカイン）；抗うつ薬（例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン）；精神安定薬および鎮静薬（例えば、クロルジアゼポキシド、ベナシチジン（ｂｅｎａｃｙｔｙｚｉｎｅ）、ベンズキナミド、フルラゼパム、ヒドロキシジン、ロキサピン、およびプロマジン）；抗精神病薬（例えば、クロルプロチキセン、フルフェナジン、ハロペリドール、モリンドン、チオリダジン、およびトリフロペラジン）；抗微生物薬（抗菌薬、抗真菌薬、抗原虫薬、および抗ウイルス薬）から選択することができる。

【0340】

本発明の組成物に組み込むのに好ましい抗菌薬としては、例えば、β−ラクタム系薬物、キノロン系薬物、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アミカシン、トリクロサン、ドキシサイクリン、カプレオマイシン、クロルヘキシジン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、クリンダマイシン、エタンブトール、ヘキサミジンイソチオナート（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール、ペンタミジン、ゲンタマイシン、カナマイシン、リネオマイシン、メタサイクリン、メテナミン、ミノサイクリン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ミコナゾール、およびアマンタジンの薬剤として許容される塩が挙げられる。

【0341】

本発明を実施するうえで有用な他の薬物部分としては、抗腫瘍薬（例えば、抗アンドロゲン（例えば、ロイプロリドまたはフルタミド）、細胞破壊物質（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、シクロホスファミド、ブスルファン、シスプラスチン、β−２−インターフェロン）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、代謝拮抗物質（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン））が挙げられる。診断および治療の両方に用いる放射性同位体をベースとした薬剤、ならびに、リシン、ゲルダナマイシン、ミタンシン（ｍｙｔａｎｓｉｎ）、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン類、クリケアマイシン（Ｃｈｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）および関連構造体、ならびにそれらの類似体など結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）毒素もこのクラスに含まれる。

【0342】

治療効果を有する部分は、ホルモン（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、またはソマトスタチン）；筋弛緩薬（例えば、シンナメドリン、シクロベンザプリン、フラボキサート、オルフェナドリン、パパベリン、メベベリン、イダベリン、リトドリン、ジフェノキシラート、ダントロレン、およびアズモレン）；鎮痙薬；骨活性化薬（例えば、ジホスホン酸およびホスホノアルキルホスフィン酸の薬物化合物）；内分泌調節薬（例えば、避妊薬（例えば、エチノジオール、エチニルエストラジオール、ノルエチンドロン、メストラノール、デソゲストレル、メドロキシプロゲステロン）、糖尿病の調整物質（例えば、グリブリドまたはクロルプロパミド）、テストラクトンやスタノゾロールなどのアナボリック物質、アンドロゲン（例えば、メチルテストステロン、テストステロン、またはフルオキシメステロン）、抗利尿薬（例えばデスモプレシン）、ならびにカルシトニン）でもよい。

【0343】

エストロゲン（例えばジエチルスチルベステロール）、糖質コルチコイド（例えば、トリアムシノロン、ベタメタゾンなど）、およびノルエチンドロン、エチノジオール、ノルエチンドロン、レボノルゲストレルなどの黄体ホルモン；甲状腺剤（例えば、リオチロニンもしくはレボチロキシン）または抗甲状腺剤（例えば、メチマゾール）；抗高プロラクチン血症薬（例えば、カベルゴリン）；ホルモン抑制物質（例えば、ダナゾールもしくはゴセレリン）、子宮収縮薬（例えば、メチルエルゴノビンもしくはオキシトシン）、ならびにミオプロストール（ｍｉｏｐｒｏｓｔｏｌ）、アルプロスタジル、もしくはジノプロストンなどのプロスタグランジンも使用することができる。

【0344】

他の有用な修飾基としては、免疫調節薬（例えば、抗ヒスタミン薬）、ロドキサミドおよび／またはクロモリンなどの肥満細胞安定化剤、ステロイド（例えば、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベクロメタゾン、またはクロベタゾール）、ヒスタミンＨ２拮抗薬（例えば、ファモチジン、シメチジン、ラニチジン）、免疫抑制薬（例えば、アザチオプリン、シクロスポリン）などが挙げられる。スリンダク、エトドラク、ケトプロフェン、およびケトロラクなど抗炎症活性を有する群も有用である。本発明組み合わせて有用な他の薬物は、当業者には明らかであろう。

【0345】

修飾された糖の調製
一般に、糖部分または修飾基は、反応性基の使用を通じて相互に結合され、それらは通常、結合プロセスによって、新しい有機官能基または非反応性化学種に変換される。糖の反応性官能基は、糖部分の任意の位置に位置する。本発明を実施する際に有用な反応性基および反応の種類は、通常、バイオコンジュゲート化学の分野で周知のものである。反応性の糖部分を用いて利用可能な反応の現時点で好ましい種類は、比較的緩和な条件下で進行する反応である。これらには、それだけには限らないが、求核置換反応（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換反応（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子多重結合への付加反応（例えば、マイケル反応、ディールス−アルダー付加）が含まれる。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、１９９６年；およびＦｅｅｎｅｙ他、ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ、１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８２年で論じられている。

【0346】

糖の核または修飾基から張り出た有用な反応性官能基としては、それだけには限らないが、以下のものが挙げられる：
（ａ）それだけには限らないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族エステルを含めて、カルボキシル基および様々なその誘導体、
（ｂ）例えば、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができるヒドロキシル基、
（ｃ）例えば、アミン、カルボキシラートアニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核基でハライドが後に置換され、それによって、ハロゲン原子の官能基位置に新しい基を共有結合させることができるハロアルキル基、
（ｄ）ディールス−アルダー反応に参加することができる求ジエン体の基、例えば、マレイミド基、
（ｅ）例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾン、もしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、または、グリニャール付加やアルキルリチウム付加などの機序を介して、その後に誘導体化することが可能であるようなアルデヒド基またはケトン基、
（ｆ）例えば、スルホンアミドを形成するために、その後でアミンと反応させるためのスルホニルハライド基、
（ｇ）例えば、ジスルフィドに変換させ、またはハロゲン化アシルと反応させることができる、チオール基、
（ｈ）例えば、アシル化、アルキル化、または酸化することができる、アミン基またはスルフヒドリル基、
（ｉ）例えば、環化付加、アシル化、マイケル付加などを受けることができるアルケン、ならびに、
（ｊ）例えば、アミンおよびヒドロキシル化合物と反応することができるエポキシド。

【0347】

反応性官能基は、反応性の糖の核または修飾基を構築するために必要な反応に参加および干渉しないように選択することができる。あるいは、保護基の存在によって、反応に参加しないように反応性官能基を保護することもできる。当業者なら、選択された一連の反応条件に干渉しないように特定の官能基を保護する方法を理解している。有用な保護基の例としては、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ他、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１年を参照のこと。

【0348】

以下の考察では、本発明を実施する際に有用な修飾された糖のいくつかの特定の例を説明する。例示的な実施形態では、修飾基が結合される糖の核としてシアル酸誘導体が利用される。シアル酸誘導体に基づいた考察の焦点は、例示を明確にするためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。例としてシアル酸を用いて説明する方法に類似した方法で、様々な他の糖部分を活性化および誘導体化できることが、当業者には理解されよう。例えば、いくつかの糖基質を挙げてみると、ガラクトース、グルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、およびフコースなどを修飾するために多数の方法が利用可能であり、これらは、当業者に認知されている方法によって容易に修飾される。例えば、Ｅｌｈａｌａｂｉ他、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：９３頁（１９９９年）、およびＳｃｈａｆｅｒ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５：２４頁（２０００年）を参照のこと。

【0349】

例示的な実施形態では、本発明の方法によって修飾されるペプチドは、原核細胞（例えば、大腸菌）、酵母および哺乳動物の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を含めた真核細胞、またはトランスジェニック動物で作製される糖ペプチドであり、したがって、不完全にシアル酸付加されたＮ−および／またはＯ−結合型オリゴ糖鎖を含む。シアル酸を欠き、末端ガラクトース残基を含む糖ペプチドのオリゴ糖鎖は、グリコＰＥＧ化し、グリコＰＰＧ化し、さもなければ修飾されたシアル酸を用いて修飾することができる。

【0350】

スキーム４では、保護されたアミノ酸（例えば、グリシン）誘導体の活性エステルでアミノグリコシド１を処理し、糖アミン残基を対応する保護されたアミノ酸アミド付加物に変換する。付加物をアルドラーゼで処理してα−ヒドロキシカルボキシラート２を形成させる。ＣＭＰ−ＳＡシンテターゼの作用によって、対応するＣＭＰ誘導体に化合物２を変換し、それに続いて、ＣＭＰ誘導体の接触水素添加により化合物３を得る。グリシン付加物の形成を介して誘導されるアミンは、化合物３を活性化された（ｍ−）ＰＥＧまたは（ｍ−）ＰＰＧ誘導体（例えば、ＰＥＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ、ＰＰＧ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳ）と反応させることによるＰＥＧまたはＰＰＧ結合の部位として利用され、それぞれ、４や５などの化学種を生じる。

【0351】

【化27】

【0352】

表２は、ＰＥＧまたはＰＰＧ部分で誘導体化される糖１リン酸の代表的な例を示す。表２の化合物のうちのいくつかは、スキーム４の方法によって調製される。他の誘導体は、当業者に認知されている方法によって調製される。例えば、Ｋｅｐｐｌｅｒ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１１：１１頁（２００１年）およびＣｈａｒｔｅｒ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ１０：１０４９頁（２０００年）を参照のこと。他のアミン反応性のＰＥＧおよびＰＰＧ類似体は、市販されており、または、当業者が容易に利用可能な方法によってそれらを調製することができる。

【0353】

【表1】

【0354】

本発明を実施する際に有用な修飾された糖リン酸は、前述の位置だけでなく他の位置でも置換することができる。現時点で好ましいシアル酸の置換体を式Ｉに示す。

【0355】

【化28】

（式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｓ、ＣＨ_２−、および−Ｎ（Ｒ）_２（各Ｒは、Ｒ^１〜Ｒ^５からそれぞれ独立に選択されるメンバーである）から好ましくは選択される、結合基である。記号Ｙ、Ｚ、Ａ、およびＢはそれぞれ、Ｘのアイデンティティに関して前述した群から選択される基を示す。Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ、およびＢは、それぞれ独立に選択され、したがって、同じものでも異なるものでもよい。記号Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、Ｈ、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子、またはその他の部分を表す。あるいは、これらの記号は、水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、生体分子、またはその他の部分に結合しているリンカーを表す。）

【0356】

本明細書で開示されるコンジュゲートに結合される例示的な部分としては、それだけには限らないが、ＰＥＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＥＧ、アシル−ＰＥＧ、アシル−アルキル−ＰＥＧ、アルキル−アシル−ＰＥＧカルバモイル−ＰＥＧ、アリール−ＰＥＧ）、ＰＰＧ誘導体（例えば、アルキル−ＰＰＧ、アシル−ＰＰＧ、アシル−アルキル−ＰＰＧ、アルキル−アシル−ＰＰＧカルバモイル−ＰＰＧ、アリール−ＰＰＧ）、治療効果を有する部分、診断用の部分、マンノース−６−ホスファート、ヘパリン、ヘパラン、ＳＬｅ_ｘ、マンノース、マンノース−６−ホスファート、Ｓｉａｌｙｌ Ｌｅｗｉｓ Ｘ、ＦＧＦ、ＶＦＧＦ、タンパク質、コンドロイチン、ケラタン、デルマタン、アルブミン、インテグリン、アンテナリーオリゴ糖、ペプチドなどが挙げられる。様々な修飾基を糖部分に結合させる方法は、当業者には容易に利用可能である（ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．、１９９２年；ＰＯＬＹ（ＥＴＨＹＬＥＮＥ ＧＬＹＣＯＬ）ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ編、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．６８０、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９７年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、１９９６年；およびＤｕｎｎ他編、ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ ＤＲＵＧＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ４６９巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１９９１年）。

【0357】

架橋基
本発明の方法で使用するための修飾された糖の調製は、糖残基に修飾基を付加し、グリコシルトランスフェラーゼの基質となる安定な付加物を形成させることを含む。糖および修飾基は、ゼロ次または高次の架橋剤によって結合させることができる。修飾基を糖部分に結合させるのに使用することができる例示的な二官能化合物としては、それだけには限らないが、二官能性ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエステルなどが挙げられる。糖を他の分子に結合させるための一般的手法は、文献で公知である。例えば、Ｌｅｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：１８５６頁（１９８９年）；Ｂｈａｔｉａ他、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：４０８（１９８９年）；Ｊａｎｄａ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：８８８６頁（１９９０年）、およびＢｅｄｎａｒｓｋｉ他、ＷＯ９２／１８１３５号を参照のこと。以下の考察では、反応性基は、新生の修飾された糖の糖部分上で好都合に処理される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。この考察は、修飾基上の反応性基にも同様に関連していることが、当業者には理解されよう。

【0358】

例示的な戦略は、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）を用いて糖上に保護されたスルフヒドリルを組み込み、次いで、修飾基上の別のスルフヒドリルとの間にジスルフィド結合を形成させるためにそのスルフヒドリルを脱保護することを含む。

【0359】

ＳＰＤＰが、修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質の役割を果たす能力に悪影響を及ぼす場合は、２−イミノチオランやＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセタート（ＳＡＴＡ）など他の一連の架橋剤のうちの１つを使用してジスルフィド結合を形成させる。２−イミノチオランは、第１級アミンと反応して、直ちにアミン含有分子上に未保護のスルフヒドリルを組み込む。ＳＡＴＡも第１級アミンと反応するが、その後にヒドロキシルアミンによって脱アセチル化（ｄｅａｃｅｔａｙｌａｔｅｄ）されて遊離のスルフヒドリルを生じる保護されたスルフヒドリルを組み込む。いずれの場合も、ＳＰＤＰと同様に、組み込まれたスルフヒドリルは、他のスルフヒドリルまたは保護されたスルフヒドリルと自由に反応して、必要なジスルフィド結合を形成する。

【0360】

上述の戦略は、例示的なものであり、本発明において有用なリンカーを限定するものではない。ペプチドに修飾基を架橋させるための様々な戦略において使用できる他の架橋剤が利用可能である。例えば、ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジドおよびＴＰＭＰＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカプト−プロピオノヒドラジド）は、緩和な過ヨウ素酸塩処理により先に酸化された糖部分と反応し、それにより、架橋剤のヒドラジド部分と過ヨウ素酸塩により生成されたアルデヒドとの間のヒドラゾン結合を形成させる。ＴＰＣＨおよびＴＰＭＰＨは、ＤＴＴを用いて脱保護し、その後に続いて構成要素間のジスルフィド結合形成などの結合用に使用することができる２−ピリジルチオンに保護されたスルフヒドリル基を糖上に導入する。

【0361】

ジスルフィド結合が、安定な修飾された糖を作製するのに適さないことが判明した場合は、構成要素間により安定な結合を組み込む他の架橋剤を使用してよい。ヘテロ二官能性架橋剤のＧＭＢＳ（Ｎ−ガマ−マルイミドブチルオキシ）（Ｎ−ｇａｍａ−ｍａｌｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）スクシンイミドおよびＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン）は、第１級アミンと反応し、それにより、構成要素上にマレイミド基を導入する。そのマレイミド基は、前述の架橋剤によって導入することができる、他方の構成要素上のスルフヒドリルと続いて反応し、それにより、それらの構成要素間に安定なチオエーテル結合を形成させることができる。それらの構成要素間の立体障害が構成要素の活性、または修飾された糖がグリコシルトランスフェラーゼの基質の役割を果たす能力のいずれかを阻害する場合は、構成要素間に長いスペーサーアームを導入し、また、前述の架橋剤（すなわちＳＰＤＰ）のうちのいくつかの誘導体を含む架橋剤を使用することができる。したがって、有用である適切な架橋剤が豊富にあり、各架橋剤は、最適なペプチドコンジュゲートおよび修飾された糖の作製に与える効果に応じて選択される。

【0362】

様々な試薬が、修飾された糖の構成要素を分子内化学架橋で修飾するのに使用される（架橋試薬および架橋手順の総説については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５：６２３〜６５１頁、１９７２年；Ｗｅｅｔａｌｌ，Ｈ．Ｈ．およびＣｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ａ．、ＥＮＺＹＭＥＳ ＡＳ ＤＲＵＧＳ．（ＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編）３９５〜４４２頁、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９８１年；Ｊｉ，Ｔ．Ｈ．、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１：５８０〜６０９頁、１９８３年；Ｍａｔｔｓｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１７：１６７〜１８３頁、１９９３年を参照のこと。これらはすべて、参照により本明細書に組み込む）。好ましい架橋試薬は、様々なゼロ長、ホモ二官能性、およびヘテロ二官能性の架橋試薬から誘導される。ゼロ長架橋試薬は、外因性の物質を導入せずに、２つの内因性の化学基を直接結合することを含む。ジスルフィド結合の形成を触媒する薬剤は、この部類に属する。別の例は、カルボジイミド、エチルクロロホルマート、ウッドワードの試薬Ｋ（２−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’−スルホナート）、およびカルボニルジイミダゾールなど、カルボキシル基と第１級アミノ基の縮合を誘導し、アミド結合を形成させる試薬である。これらの化学試薬の他に、酵素トランスグルタミナーゼ（グルタミル−ペプチドγ−グルタミルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．２．１３）も、ゼロ長架橋試薬として使用してよい。この酵素は、通常、第１級アミノ基を基質として用いて、タンパク質結合グルタミニル残基のカルボキサミド基でのアシル転移反応を触媒する。好ましいホモおよびヘテロ二官能試薬は、アミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、または非特異的な基と反応し得る２つの同一部位または２つの異なる部位をそれぞれ含む。

【0363】

ｉ．架橋試薬中の好ましい特異的部位
１．アミノ反応性基
一実施形態では、架橋剤上の部位は、アミノ反応性基である。アミノ反応性基の有用な非限定的例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、イミドエステル、イソシアナート、ハロゲン化アシル、アリールアジド、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルデヒド、および塩化スルホニルが挙げられる。

【0364】

ＮＨＳエステルは、構成要素である修飾された糖の（芳香族を含めて）第１級アミノ基と優先的に反応する。ヒスチジンのイミダゾール基は、反応に際し第１級アミンと競合することが知られているが、その反応生成物は不安定であり、容易に加水分解される。この反応は、アミドを形成し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを遊離する、ＮＨＳエステルの酸カルボキシル上でのアミンの求核攻撃を伴う。したがって、元のアミノ基の正電荷は失われる。

【0365】

イミドエステルは、修飾された糖である構成要素のアミン基との反応に関して最も特異的なアシル化試薬である。ｐＨ７〜１０では、イミドエステルは、第１級アミンとしか反応しない。第１級アミンは、イミダートを求核攻撃して、高ｐＨではアミジンに、または、より低いｐＨでは新しいイミダートに分解する中間体を生じる。新しいイミダートは、別の第１級アミンと反応し、それにより、２つのアミノ基を架橋することができる。これは、単官能性と推定されるミダートが二官能的に反応する事例である。第１級アミンとの反応の主要生成物は、元のアミンより強い塩基であるアミジンである。したがって、元のアミノ基の正電荷は保持される。

【0366】

イソシアナート（およびイソチオシアナート）は、修飾された糖である構成要素の第１級アミンと反応して、安定な結合を形成させる。スルフヒドリル、イミダゾール、およびチロシル基との反応は、比較的不安定な生成物を生じる。

【0367】

アシルアジドも、親和性構成要素の求核性アミンがわずかにアルカリ性の条件下、例えばｐＨ８．５で酸性のカルボキシル基を攻撃する、アミノ特異的試薬として使用される。

【0368】

１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなどのハロゲン化アリールは、修飾された糖である構成要素のアミノ基およびチロシンフェノール基と優先的に反応するが、スルフヒドリル基およびイミダゾール基とも反応する。

【0369】

モノカルボン酸およびジカルボン酸のｐ−ニトロフェニルエステルも、有用なアミノ反応性基である。試薬特異性はあまり高くないが、α−アミノ基およびε−アミノ基が最も迅速に反応するようである。

【0370】

グルタルアルデヒドなどのアルデヒドは、修飾された糖の第１級アミンと反応する。アルデヒド類のアルデヒドとアミノ基が反応すると、不安定なシッフ塩基が形成されるが、グルタルアルデヒドは、安定な架橋結合によって修飾された糖を修飾することができる。一般的な架橋条件であるｐＨ６〜８では、環状ポリマーは脱水を受けて、α，β−不飽和アルデヒドポリマーを形成する。しかし、シッフ塩基は、別の二重結合に結合されていると、安定である。双方の二重結合の共鳴相互作用により、シッフ結合の加水分解が防止される。さらに、アミンは、濃度が局部的に高くなると、エチレン二重結合を攻撃して、安定なマイケル付加生成物を形成させることができる。

【0371】

芳香族塩化スルホニルは、修飾された糖である構成要素の様々な部位と反応するが、アミノ基との反応が最も重要であり、安定なスルホンアミド結合を生じる。

【0372】

２．スルフヒドリル反応性基
別の実施形態では、これらの部位は、スルフヒドリル反応性基である。スルフヒドリル反応性基の有用な非限定的例としては、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ピリジルジスルフィド、およびチオフタルイミドが挙げられる。

【0373】

マレイミドは、修飾された糖である構成要素のスルフヒドリル基と優先的に反応して、安定なチオエーテル結合を形成させる。それらは、第１級アミノ基およびヒスジチンのイミダゾール基とも、ずっと遅い速度で反応する。しかし、ｐＨ７では、単純チオールの反応速度は、対応するアミンの反応速度の１０００倍であるため、マレイミド基は、スルフヒドリルに特異的な基とみなすことができる。

【0374】

ハロゲン化アルキルは、スルフヒドリル基、スルフィド、イミダゾール、およびアミノ基と反応する。しかし、中性からわずかにアルカリ性のｐＨでは、ハロゲン化アルキルは主にスルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成させる。より高いｐＨでは、アミノ基との反応が好まれる。

【0375】

ピリジルジスルフィドは、ジスルフィド交換を介して遊離のスルフヒドリルと反応して混合性のジスルフィドを生じる。結果として、ピリジルジスルフィドは、最も特異的なスルフヒドリル反応性基である。

【0376】

チオフタルイミドは、遊離のスルフヒドリルと反応してジスルフィドを形成する。

【0377】

３．カルボキシル反応性残基
別の実施形態では、水にも有機溶媒にも可溶性のカルボジイミドが、カルボキシル反応性試薬として使用される。これらの化合物は、遊離のカルボキシル基と反応して、利用可能なアミンとその後に結合してアミド結合を生じることができるプソイド尿素を形成し、これはカルボキシル基をカルボジイミドでどのように修飾するかを教示している（Ｙａｍａｄａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０：４８３６〜４８４２頁、１９８１年）。

【0378】

ｉｉ．架橋試薬中の好ましい非特異的部位
部位特異的な反応性部分の使用に加えて、本発明は、修飾基に糖を結合するための非特異的な反応性基の使用も企図する。

【0379】

例示的な非特異的架橋剤としては、適切なエネルギーの光子を吸収すると反応性化学種に変換される、暗所で完全に不活性な光活性化型の基が挙げられる。一実施形態では、光活性化型の基は、アジドを加熱または光分解すると生じるニトレンの前駆物質から選択される。電子不足のニトレンは、極めて反応性であり、Ｎ−Ｈ、Ｏ−Ｈ、Ｃ−Ｈ、およびＣ＝Ｃを含めて様々な化学結合と反応することができる。３つのタイプのアジド（アリール、アルキル、およびアシル誘導体）を使用してもよいが、アリールアジドが現在のところ使用される。光分解の際のアリールアジドの反応性は、Ｃ−Ｈ結合よりＮ−ＨおよびＯ−Ｈとの方がよい。電子不足のアリールニトレンは、迅速に環を拡大して、Ｃ−Ｈ挿入生成物を形成するよりも求核剤と反応する傾向があるデヒドロアゼピンを形成する。アリールアジドの反応性は、環中にニトロ基やヒドロキシル基などの電子求引性置換基が存在することによって、増大され得る。このような置換基は、アリールアジドの吸収極大をより長い波長に押し上げる。置換されていないアリールアジドの吸収極大は２６０〜２８０ｎｍの範囲であるのに対し、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、３０５ｎｍを超える有効な光を吸収する。したがって、ヒドロキシおよびニトロアリールアジドは、置換されていないアリールアジドより、より害の少ない光分解条件を親和性の構成要素に対して使用することを可能にするため、最も好ましい。

【0380】

他の好ましい実施形態では、光活性化型の基は、フッ化アリールアジドから選択される。フッ化アリールアジドの光分解生成物は、アリールニトレンであり、これらはすべて、Ｃ−Ｈ結合挿入を含めて、この基の特徴的な反応を高い効率で受ける（Ｋｅａｎａ他、Ｊ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：３６４０〜３６４７頁、１９９０年）。

【0381】

別の実施形態では、光活性化型の基は、ベンゾフェノン残基から選択される。ベンゾフェノン試薬は、一般に、アリールアジドより高い架橋形成率を与える。

【0382】

別の実施形態では、光活性化型の基は、光分解すると電子不足のカルベンを形成するジアゾ化合物から選択される。これらのカルベンは、Ｃ−Ｈ結合中への挿入、（芳香族系を含めて）二重結合への付加、水素の吸引、および炭素イオンを生じる、求核中心への配位を含めて、様々な反応を受ける。

【0383】

さらに別の実施形態では、光活性化型の基は、ジアゾピルバートから選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルジアゾピルバートのｐ−ニトロフェニルエステルは、脂肪族アミンと反応して、紫外光分解を受けてアルデヒドを形成するジアゾピルビン酸アミドを生じる。光分解されたジアゾピルバートに修飾された親和性の構成要素は、架橋を形成するホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドと同様に反応すると考えられる。

【0384】

ｉｉｉ．ホモ２官能性試薬
１．第１級アミンと反応するホモ２官能性架橋剤
アミン反応性の架橋剤の合成、諸特性、および用途は、商業的に文献で記載されている（架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと）。多くの試薬が入手可能である（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード、イリノイ州；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州）。

【0385】

ホモ２官能性ＮＨＳエステルの好ましい非限定的な例としては、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）、ビス−２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス−２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチルスルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシナート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）、およびジチオビス（プロピオン酸スルホスクシンイミジル）（スルホ−ＤＳＰ）が挙げられる。ホモ２官能性イミドエステルの好ましい非限定的な例としては、ジメチルマロンイミダート（ＤＭＭ）、ジメチルスクシンイミダート（ＤＭＳＣ）、ジメチルアジピミダート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミダート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミダート（ＤＭＳ）、ジメチル−３，３’−オキシジプロピオンイミダート（ＤＯＤＰ）、ジメチル−３，３’−（メチレンジオキシ）ジプロピオンイミダート（ＤＭＤＰ）、ジメチル−，３’−（ジメチレンジオキシ）ジプロピオンイミダート（ＤＤＤＰ）、ジメチル−３，３’−（テトラメチレンジオキシ）−ジプロピオンイミダート（ＤＴＤＰ）、およびジメチル−３，３’−ジチオビスプロピオンイミダート（ＤＴＢＰ）が挙げられる。

【0386】

ホモ２官能性イソチオシアナートの好ましい非限定的な例としては、ｐ−フェニレンジイソチオシアナート（ＤＩＴＣ）および４，４’−ジイソチオシアノ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）が挙げられる。

【0387】

ホモ２官能性イソシアナートの好ましい非限定的な例としては、キシレン−ジイソシアナート、トルエン−２，４−ジイソシアナート、トルエン−２−イソシアナート−４−イソチオシアナート、３−メトキシジフェニルメタン−４、４’−ジイソシアナート、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−アゾフェニルジイソシアナート、およびヘキサメチレンジイソシアナートが挙げられる。

【0388】

ホモ２官能性ハロゲン化アリールの好ましい非限定的な例としては、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）および４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホンが挙げられる。

【0389】

ホモ２官能性脂肪族アルデヒド試薬の好ましい非限定的な例としては、グリオキサール、マロンジアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが挙げられる。

【0390】

ホモ２官能性アシル化試薬の好ましい非限定的な例としては、ジカルボン酸のニトロフェニルエステルが挙げられる。

【0391】

ホモ２官能性の芳香族塩化スルホニルの好ましい非限定的な例としては、フェノール−２，４−ジスルホニルクロリド、およびα−ナフトール−２，４−ジスルホニルクロリドが挙げられる。

【0392】

追加のアミノ反応性のホモ２官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、アミンと反応してビスカルバマートを生じるエリスリトールビスカルボナートが挙げられる。

【0393】

２．遊離のスルフヒドリル基と反応するホモ２官能性架橋剤
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている（架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと）。これらの試薬のうちの多くが市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード、イリノイ州；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ミズーリ州；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州）。

【0394】

ホモ２官能性マレイミドの好ましい非限定的な例としては、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−フェニレン）ビスマレイミド、アゾフェニルジマレイミド、およびビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテルが挙げられる。

【0395】

ホモ２官能性ピリジルジスルフィドの好ましい非限定的な例としては、１，４−ジ−３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオンアミドブタン（ＤＰＤＰＢ）が挙げられる。

【0396】

ホモ２官能性ハロゲン化アルキルの好ましい非限定的な例としては、２，２’−ジカルボキシ−４，４’−ジヨードアセトアミドアゾベンゼン、α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸、α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｂ−ブロモエチル）ベンジルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジ（ブロモアセチル）フェニルチドラジン（ｐｈｅｎｙｌｔｈｙｄｒａｚｉｎｅ）、および１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルプロパンが挙げられる。

【0397】

３．ホモ２官能性の光活性化型架橋剤
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている（架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと）。これらの試薬のうちのいくつかは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード、イリノイ州；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ミズーリ州；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州）。

【0398】

ホモ２官能性の光活性化型架橋剤の好ましい非限定的な例としては、ビス−β−（４−アジドサリチルアミド）エチルジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ジ−Ｎ−（２−ニトロ−４−アジドフェニル）−シスタミン−Ｓ，Ｓ−ジオキシド（ＤＮＣＯ）、および４，４’−ジチオビスフェニルアジドが挙げられる。

【0399】

ｉｖ．ヘテロ２官能性試薬
１．ピリジルジスルフィド部分を有するアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている（架橋の手順および試薬の総説については、上記を参照のこと）。これらの試薬のうちの多くは市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ロックフォード、イリノイ州；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ミズーリ州；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州）。

【0400】

ピリジルジスルフィド部分およびアミノ反応性のＮＨＳエステルを有するヘテロ２官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミドヘキサノアート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−３−（２−ピリジルチオ）プロピオンアミドヘキサノアート（スルホ−ＬＣＳＰＤＰ）、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、およびスルホスクシンイミジル６−α−メチル−α−（２−ピリジルチオ）トルアミドヘキサノアート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）が挙げられる。

【0401】

２．マレイミド部分を有するアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている。マレイミド部分およびアミノ反応性のＮＨＳエステルを有するヘテロ２官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、スクシンイミジルマレイミジルアセタート（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルプロピオナート（ＢＭＰＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノアート（ＥＭＣＳ）、スクシンイミジル３−マレイミジルベンゾアート（ＳＭＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、およびスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（スルホ−ＳＭＰＢ）が挙げられる。

【0402】

３．ハロゲン化アルキル部分を有するアミノ反応性ヘテロ２官能性試薬
これらの試薬の合成、諸特性、および用途は、文献で記載されている。ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性のＮＨＳエステルを有するヘテロ２官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾアート（スルホ−ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル−６−（ヨードアセチル）アミノヘキサノアート（ＳＩＡＸ）、スクシンイミジル−６−（６−（（ヨードアセチル）−アミノ）ヘキサノイルアミノ）ヘキサノアート（ＳＩＡＸＸ）、スクシンイミジル−６−（（（４−（ヨードアセチル）−アミノ）−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボニル）アミノヘキサノアート（ＳＩＡＣＸ）、およびスクシンイミジル−４（（ヨードアセチル）−アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＩＡＣ）が挙げられる。

【0403】

アミノ反応性ＮＨＳエステルおよびジハロゲン化アルキル部分を有するヘテロ２官能性試薬の例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオナート（ＳＤＢＰ）である。ＳＤＢＰは、そのアミノ基を結合させることによって、親和性構成要素に分子内架橋を導入する。第１級アミン基に対するジブロモプロピオニル部分の反応性は、反応温度によって制御される（ＭｃＫｅｎｚｉｅ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．７：５８１〜５９２頁（１９８８年））。

【0404】

ハロゲン化アルキル部分およびアミノ反応性のｐ−ニトロフェニルエステル部分を有するヘテロ２官能性試薬の好ましい非限定的な例としては、ｐ−ニトロフェニルヨードアセタート（ＮＰＩＡ）が挙げられる。

【0405】

他の架橋剤は、当業者には公知である。例えば、Ｐｏｍａｔｏ他、米国特許第５９６５１０６号を参照のこと。個々の用途に対して適切な架橋剤を選択することは、当業者の能力の範囲内である。

【0406】

ｖ．切断可能なリンカー基
さらに別の実施形態では、リンカー基は、切断されて糖残基から修飾基を遊離することができる基とともに提供される。多くの切断可能な基が当技術分野では公知である。例えば、Ｊｕｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７６１：１５２〜１６２頁（１９８３年）、Ｊｏｓｈｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５１８〜１４５２５頁（１９９０年）、Ｚａｒｌｉｎｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２４：９１３〜９２０頁（１９８０年）、Ｂｏｕｉｚａｒ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５５：１４１〜１４７頁（１９８６年）、Ｐａｒｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：２０５〜２１０頁（１９８６年）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１８５９〜１８６７頁（１９８９年）を参照のこと。さらに広範囲にわたる切断可能な２官能性（ホモ２官能性およびヘテロ２官能性の双方）リンカー基が、Ｐｉｅｒｃｅ社などの製造業者から市販されている。

【0407】

例示的な切断可能部分は、光、熱、またはチオール、ヒドロキシルアミン、塩基、過ヨウ素酸塩などの試薬を用いて切断することができる。さらに、いくつかの好ましい基は、エンドサイトーシスが行われるのに応じてｉｎ ｖｉｖｏで切断される（例えば、ｃｉｓ−アコニチル。Ｓｈｅｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０２：１０４８頁（１９９１年）を参照のこと）。好ましい切断可能な基は、ジスルフィド、エステル、イミド、カルボナート、ニトロベンジル、フェナシル、およびベンゾイン基からなる基から選択されるメンバーである切断可能な部分を含む。

【0408】

修飾された糖のペプチドへの結合
修飾された糖は、結合を媒介する適切な酵素によって、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドに結合される。修飾された糖供与体、酵素、受容体ペプチドの濃度は、受容体が使い尽くされるまでグリコシル化が進行するように選択されることが好ましい。以下に論じる考察はシアリルトランスフェラーゼの場合で説明するが、通常、他のグリコシルトランスフェラーゼ反応に適用可能である。

【0409】

グリコシルトランスフェラーゼを用いて所望のオリゴ糖構造体を合成するいくつかの方法が公知であり、通常、本発明に適用可能である。例示的な方法は、例えば、ＷＯ９６／３２４９１号、Ｉｔｏ他、Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３頁（１９９３年）、米国特許第５３５２６７０号、米国特許第５３７４５４１号、米国特許第５５４５５５３号で記載されている。

【0410】

本発明は、単一のグリコシルトランスフェラーゼまたは複数のグリコシルトランスフェラーゼの組合せ物を用いて実施される。例えば、シアリルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの組合せ物を使用することができる。複数の酵素を使用する実施形態では、酵素および基質が、好ましくは最初の反応混合物中で混合され、あるいは、第２の酵素反応用の酵素および試薬が、最初の酵素反応が完了またはほぼ完了した後に反応媒体に添加される。１つの容器中で２種の酵素反応を順に実施することによって、中間種を単離する手順よりも全収率が改善される。さらに、余分な溶媒および副産物の洗浄および廃棄が軽減される。

【0411】

別の実施形態では、第１および第２の酵素はそれぞれグリコシルトランスフェラーゼである。追加の実施形態では、１つの酵素はエンドグリコシダーゼである。追加の実施形態では、２つより多い酵素を使用して本発明の修飾された糖タンパク質を構築する。これらの酵素は、修飾された糖をペプチドに付加する前または後の任意の時点にペプチド上の糖構造体を改変するのに使用される。

【0412】

本発明のコンジュゲートのＯ結合型グリコシル部分は、一般に、ペプチドに結合しているＧａｌＮＡｃ部分に由来する。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのファミリーの任意のメンバーを用いて、ＧａｌＮＡｃ部分をペプチドに結合させることができる（Ｈａｓｓａｎ Ｈ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＥＰ、Ｍａｎｄｅｌ Ｕ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＭＡ、およびＣｌａｕｓｅｎ Ｈ（２０００年）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｕｃｉｎ−Ｔｙｐｅ Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｏ−Ｇｌｙｃａｎ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（Ｅｒｎｓｔ、ＨａｒｔおよびＳｉｎａｙ編）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ 章「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２７３〜２９２頁）。ＧａｌＮＡｃ部分それ自体が完全なグリコシルリンカーになり得る。あるいは、１種または複数の酵素およびその酵素に対する１種または複数の適切なグリコシル基質を用いて、サッカリル残基を付け足し、付け足されたグリコシル部分に修飾された糖を付加する。

【0413】

別の実施形態では、この方法は、１種または複数のエキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼを利用する。グリコシダーゼは、通常、グリコシル結合を切断するのではなく形成させるように改変された変異体である。変異体グリカナーゼは、通常、活性部位の酸性アミノ酸残基をあるアミノ酸残基で置換されている。例えば、エンドグリカナーゼがエンド−Ｈであるとき、置換される活性部位残基は、通常、１３０位のＡｓｐ、１３２位のＧｌｕ、またはそれらの組合せである。これらのアミノ酸は、通常、セリン、アラニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。

【0414】

変異体酵素は、通常、エンドグリカナーゼ加水分解ステップの逆反応に類似した合成ステップによって、反応を触媒する。これらの実施形態では、グリコシル供与体分子（例えば、所望のオリゴ糖構造体または単糖構造体）は脱離基を含み、反応は、タンパク質上のＧｌｃＮＡｃ残基への供与体分子の付加とともに進行する。例えば、脱離基は、フルオリドなどのハロゲンでよい。別の実施形態では、脱離基は、Ａｓｎ、またはＡｓｎ−ペプチド部分である。さらに別の実施形態では、グリコシル供与体分子上のＧｌｃＮＡｃ残基が修飾される。例えば、ＧｌｃＮＡｃ残基は、１，２オキサゾリン部分を含んでよい。

【0415】

別の実施形態では、本発明のコンジュゲートを作製するのに利用される各酵素は、触媒量で存在している。個々の酵素の触媒量は、その酵素の基質の濃度、ならびに温度、時間、ｐＨ値などの反応条件に応じて変動する。予め選択された基質濃度および反応条件における所与の酵素の触媒量を決定するための手段は、当業者には周知である。

【0416】

上記の方法が実施される温度は、氷点をちょうど上回る温度から最も敏感な酵素が変性する温度までの範囲をとり得る。好ましい温度範囲は、約０℃〜約５５℃、より好ましくは約２０℃〜約３０℃である。別の例示的な実施形態では、本発明の方法の１つまたは複数の構成要素が、好熱性酵素を用いて高温で実施される。

【0417】

受容体がグリコシル化されるのに十分な期間、反応混合物を維持し、それによって、所望のコンジュゲートを形成させる。多くの場合、コンジュゲートの一部を数時間後に検出することができ、回収可能な量が通常２４時間以内に得られる。反応速度は、選択された系に対して最適化されるいくつかの変動要因（例えば、酵素濃度、供与体濃度、受容体濃度、温度、溶媒体積）に依存していることが、当業者には理解される。

【0418】

本発明は、修飾ペプチドの工業規模の作製も提供する。本明細書では、工業規模では、通常、少なくとも約２５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約５００ｍｇ、より好ましくは少なくとも１グラムの完成され精製されたコンジュゲートを作製する。その際、１回の反応サイクルの後であること、すなわち、コンジュゲートは、連続的に反復された同一の合成サイクルから得られた反応生成物の組合せ物ではないことが好ましい。

【0419】

以下の考察において、本発明は、グリコシル化ペプチドへの修飾されたシアル酸部分の結合によって例示される。例示的な修飾されたシアル酸は、（ｍ−）ＰＥＧで標識される。ＰＥＧ修飾されたシアル酸およびグリコシル化ペプチドの使用に関する以下の考察の焦点は、例示を明確にするためのものであり、本発明がこれら２つのパートナーの結合に限定されることを意味するためのものではない。以下の考察は通常、シアル酸以外の修飾されたグリコシル部分の付加に適用可能であることが、当業者には理解される。さらに、以下の考察は、他の水溶性ポリマー、治療効果を有する部分、および生体分子を含めて、ＰＥＧ以外の作用物質によるグリコシル単位の修飾にも同様に適用可能である。

【0420】

（ｍ−）ＰＥＧ化または（ｍ−）ＰＰＧ化された糖をペプチドまたは糖ペプチド上に選択的に導入するために、酵素的手法を使用することができる。この方法は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはマスクされた反応性官能基を含む修飾された糖を利用し、また、適切なグリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシンターゼと併用される。所望の糖結合を作ると考えられるグリコシルトランスフェラーゼを選択し、修飾された糖を供与体基質として利用することによって、ペプチド主鎖、糖ペプチドの既存の糖残基、またはペプチドに付加された糖残基上に直接ＰＥＧまたはＰＰＧを導入することができる。

【0421】

シアリルトランスフェラーゼの受容体は、本発明の方法によって修飾しようとするペプチド上に、天然の構造体として、または組換えにより、酵素的に、もしくは化学的にそこに配置されたものとして存在する。適切な受容体としては、例えば、ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ、ラクト−Ｎ−テトラオース、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，３Ａｒａ、Ｇａｌβ１，６ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ（ラクトース）、および当業者に公知の他の受容体などのガラクトシル受容体が挙げられる（例えば、Ｐａｕｌｓｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：５６１７〜５６２４頁（１９７８年）を参照のこと）。

【0422】

一実施形態では、シアリルトランスフェラーゼの受容体は、糖ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ合成の際に修飾される糖ペプチド上に存在する。特許請求の範囲の方法によって、糖ペプチドのグリコシル化パターンを前もって変えずに、これらの糖ペプチドにシアル酸付加することができる。あるいは、本発明の方法を使用して、適切な受容体を含まないペプチドにシアル酸付加をすることもできる。その際、当業者に公知の方法によって、最初にペプチドを修飾して受容体を含むようにする。例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの作用によって、Ｏ結合型グリコシル化部位にＧａｌＮＡｃ残基を付加する。Ｈａｓｓａｎ Ｈ、Ｂｅｎｎｅｔｔ ＥＰ、Ｍａｎｄｅｌ Ｕ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＭＡ、およびＣｌａｕｓｅｎ Ｈ（２０００年）、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｕｃｉｎ−Ｔｙｐｅ Ｏ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ：Ｏ−Ｇｌｙｃａｎ Ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｓ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＧａｌＮＡｃ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（Ｅｒｎｓｔ、ＨａｒｔおよびＳｉｎａｙ編）Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ 章「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ−ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、２７３〜２９２頁。

【0423】

例示的な実施形態では、ペプチドに結合している適切な受容体、例えば、ＧａｌＮＡｃにガラクトース残基を結合させることによって、ガラクトシル受容体を構築する。この方法は、修飾しようとするペプチドを、適切な量のガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｇａｌβ１，３またはＧａｌβ１，４）と適切なガラクトシル供与体（例えばＵＤＰ−ガラクトース）とを含有する反応混合物とともにインキュベートすることを含む。反応は、ほぼ完了するまで進行させ、あるいは、予め設定した量のガラトース残基が付加された時点で終結させる。選択された糖受容体を構築する他の方法は、当業者には明らかであろう。

【0424】

さらに別の実施形態では、糖ペプチドが結合したオリゴ糖の全体または一部分を最初に「トリミング」し、シアリルトランスフェラーゼの受容体、または適切な受容体を得るために１つもしくは複数の適切な残基を付加させることができる部分を露出させる。グリコシルトランスフェラーゼやエンドグリコシダーゼなどの酵素（例えば、米国特許第５７１６８１２号を参照のこと）は、結合反応およびトリミング反応に有用である。

【0425】

以下の考察において、本発明の方法は、水溶性ポリマーが結合している修飾された糖を用いて例示される。考察の焦点は、例示を明確にするためのものである。以下の考察は、修飾された糖が治療効果を有する部分や生体分子などを有している実施形態にも同様に該当することが、当業者には理解されよう。

【0426】

例示的な実施形態では、Ｏ結合型糖残基は、修飾された糖を付加する前に「トリミング」される。例えば、ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ残基はトリミングされてＧａｌＮＡｃになる。水溶性ポリマーを有する修飾された糖が、「トリミング」によって露出された糖残基のうちの１つまたは複数に結合される。一実施例では、糖ペプチドが「トリミング」され、水溶性ポリマーは、生じたＯ側鎖のアミノ酸または糖ペプチドグリカンに、水溶性ポリマーに結合しているサッカリル部分、例えば、Ｓｉａ、Ｇａｌ、またはＧａｌＮＡｃ部分を介して付加される。修飾されたサッカリル部分は、「トリミングされた」糖ペプチド上の受容体部位に結合される。あるいは、未修飾のサッカリル部分、例えば、ＧａｌをＯ結合型グリカンの末端に付加させることもできる。

【0427】

別の例示的な実施形態では、水溶性ポリマーは、ガラクトース残基を有する修飾された糖を介して、ＧａｌＮＡｃ残基に付加される。あるいは、末端ＧａｌＮＡｃ残基に未修飾のＧａｌを付加させることもできる。

【0428】

さらに別の実施例では、修飾されたシアル酸を用いて、Ｇａｌ残基に水溶性ポリマーを付加させる。

【0429】

別の例示的な実施形態では、Ｏ結合型グリコシル残基が「トリミング」されて、アミノ酸に結合したＧａｌＮＡｃを生じる。一実施例では、水溶性ポリマーは、ポリマーで修飾されたＧａｌを介して付加される。あるいは、未修飾のＧａｌが、ＧａｌＮＡｃ、次いで水溶性ポリマーが結合したＧａｌに付加される。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の未修飾のＧａｌ残基が、ＧａｌＮＡｃ、次いで水溶性ポリマーで修飾されたシアル酸部分に付加される。

【0430】

前述した例示的な実施形態は、本明細書で説明する方法の権利の例示を提供する。本発明の方法によって、ほぼすべての所望の構造の糖残基を「トリミング」および構築することが可能である。修飾された糖は、前述したように糖部分の末端に付加させることもでき、あるいは、ペプチドコアと糖末端の間の介在物になることもできる。

【0431】

例示的な実施形態では、ポリマーで修飾されたシアル酸を用いて、水溶性ポリマーを末端のＧａｌ残基に付加する。適切なシアリルトランスフェラーゼを用いて、修飾されたシアル酸を付加する。この手法をスキーム５に要約する。

【0432】

【化29】

【0433】

スキーム６に要約するさらに別の手法では、マスクされた反応性官能基がシアル酸上に存在している。マスクされた反応性基は、修飾されたシアル酸をペプチドに付加するのに使用される条件によって影響されないことが好ましい。修飾されたシアル酸がペプチドに共有結合した後、マスク部分を除去し、ペプチドをＰＥＧ、ＰＰＧ、治療効果を有する部分、生体分子、または他の作用物質などの作用物質と結合させる。修飾された糖残基上のマスクされていない反応性基と反応することにより、作用物質は特異的にペプチドに結合される。

【0434】

【化30】

【0435】

任意の修飾された糖を、糖ペプチドのオリゴ糖側鎖の末端糖に応じて、適切なグリコシルトランスフェラーゼとともに使用することができる（表３）。前述したように、ＰＥＧ化またはＰＰＧ化構造を導入するのに必要とされる糖ペプチドの末端糖は、発現する間に自然に導入されることがあり、あるいは、適切なグリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、またはグリコシダーゼとグリコシルトランスフェラーゼの混合物を用いて発現後に作製することができる。

【0436】

【表2】

【0437】

代替の実施形態では、修飾された糖は、ペプチド主鎖上のＯ結合型グリコシル化部位に糖残基を転移させることが知られているグリコシルトランスフェラーゼによって、ペプチド主鎖に直接付加される。この例示的な実施形態をスキーム７で説明する。本発明を実施するのに有用である例示的なグリコシルトランスフェラーゼには、それだけには限らないが、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ Ｔ１〜２０）、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼなどが含まれる。この手法を使用することにより、任意の糖を欠くペプチド上に、あるいは、既存の糖ペプチド上に、修飾された糖を直接付加することが可能になる。いずれの場合も、修飾された糖の付加は、グリコシルトランスフェラーゼの基質特異性によって定められ、ペプチド主鎖上の特定の位置で起こり、化学的方法によるタンパク質ペプチド主鎖の修飾の最中に起こるようにランダムな方式では起こらない。ポリペプチド鎖中に適切なアミノ酸配列を人工的に作製することによって、グリコシルトランスフェラーゼ基質のペプチド配列を欠くタンパク質または糖ペプチドに、一連の作用物質を導入することができる。

【0438】

【化31】

【0439】

前述した例示的な各実施形態では、修飾された糖をペプチドに結合した後に、１種または複数の追加の化学的または酵素的修飾ステップを利用することができる。例示的な実施形態では、酵素（例えば、フコシルトランスフェラーゼ）を用いて、ペプチドに結合されている末端の修飾された糖にグリコシル単位（例えばフコース）を付加させる。別の実施例では、酵素反応を利用して、修飾された糖が結合することができなかった部位を「キャップ」（例えば、シアル酸付加）する。あるいは、化学反応を利用して、結合された修飾された糖の構造を改変する。例えば、結合された修飾された糖を、その修飾された糖が結合しているペプチド成分との結合を安定化または不安定化させる作用物質と反応させる。別の実施例では、修飾された糖の成分を、ペプチドへの結合の後に脱保護する。修飾された糖がペプチドに結合された後の段階で、本発明の方法において有用な一連の酵素的手順および化学的手順があることが、当業者には理解されよう。修飾された糖とペプチドのコンジュゲートのさらなる加工も本発明の範囲内である。

【0440】

別の例示的な実施形態では、糖ペプチドは、標的性作用物質、例えば、トランスフェリン（血液脳関門を越え、また、エンドソームへとペプチドを送達する）、カルニチン（ペプチドを筋肉細胞に送達する；例えば、ＬｅＢｏｒｇｎｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９：１３５７〜６３頁（２０００年）を参照のこと）、ならびにホスホナート、例えば、ビスホスホナート（骨および他の石灰質組織にペプチドを標的化する；例えば、Ｍｏｄｅｒｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００２年８月、１０頁を参照のこと）に結合される。標的化に有用な他の作用物質は、当業者には明らかである。例えば、グルコース、グルタミン、およびＩＧＦも、筋肉を標的とするのに有用である。

【0441】

標的性部分および治療用ペプチドは、本明細書で論じた任意の方法によって、または当技術分野公知の別の方法によって結合される。前述したものの他のペプチドも、本明細書で説明するように誘導体化できることが、当業者には理解されよう。例示的なペプチドは、本願の権利者が所有する同時係属中の２００１年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／３２８５２３号の付属書類において説明されている。

【0442】

例示的な実施形態では、標的性作用物質および治療用ペプチドは、リンカー部分を介して結合している。この実施形態では、治療用ペプチドまたは標的性作用物質のうちの少なくとも１つが、本発明の方法による完全なグリコシル結合基を通じてリンカー部分に結合している。例示的な実施形態では、リンカー部分は、ポリエチレングリコールなどのポリ（エーテル）を含む。別の例示的な実施形態では、リンカー部分は、ｉｎ ｖｉｖｏで分解されて、身体の標的とされている組織または領域にそのコンジュゲートを送達した後、標的性作用物質から治療用ペプチドを放出させる少なくとも１つの結合を含む。

【0443】

さらに別の例示的な実施形態では、標的性部分に治療用ペプチドを結合させずに治療用部分上のグリコフォームを改変することによって、治療効果を有する部分のｉｎ ｖｉｖｏでの分布を変える。例えば、グリコシル基の末端ガラクトース部分をシアル酸（またはその誘導体）でキャップすることによって、細網内皮系による取込みから、治療用ペプチドを回避させることができる。

【0444】

ｉ．酵素
１．グリコシルトランスフェラーゼ
グリコシルトランスフェラーゼは、タンパク質、糖ペプチド、脂質もしくは糖脂質、または、伸長中のオリゴ糖の非還元末端に、活性化された糖（供与体のＮＤＰ−糖）を段階的に付加する反応を触媒する。Ｎ−結合型糖ペプチドは、トランスフェラーゼおよび脂質結合型オリゴ糖供与体Ｄｏｌ−ＰＰ−ＮＡＧ_２Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９によって、ひとまとめの転移とそれに続くコアのトリミングによって合成される。この場合、「コア」の糖の性質は、後続の付加物とはいくらか異なる。非常に多くのグリコシルトランスフェラーゼが、当技術分野では公知である。

【0445】

本発明で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、修飾された糖を糖供与体として利用することができる限り、どれでもよい。このような酵素の例には、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、グルクロノニルトランスフェラーゼ（ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などルロワール経路のグリコシルトランスフェラーゼが含まれる。

【0446】

グリコシルトランスフェラーゼ反応を使用する酵素的糖合成のために、グリコシルトランスフェラーゼをクローン化し、または、任意の供給源から単離することができる。多くのクローン化グリコシルトランスフェラーゼが公知であり、それらのポリヌクレオチド配列が知られている。例えば、「Ｔｈｅ ＷＷＷ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｉ．ｃｏ．ｕｋ／ＴＧＮ／ｇｔ＿ｇｕｉｄｅ．ｈｔｍ）を参照のこと。グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列、およびアミノ酸配列をそれから推測できる、グリコシルトランスフェラーゼをコードしているヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＥＭＢＬ、およびその他のものを含めて、公的に入手可能な様々なデータベースにある。

【0447】

本発明の方法で使用できるグリコシルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、グルクロニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、グルクロン酸トランスフェラーゼ、ガラクツロン酸トランスフェラーゼ、およびオリゴサッカリルトランスフェラーゼが挙げられる。適切なグリコシルトランスフェラーゼとしては、真核生物、ならびに原核生物から得られるものが挙げられる。

【0448】

グリコシルトランスフェラーゼをコードしているＤＮＡは、化学合成によって、適切な細胞もしくは細胞系統培養物に由来するｍＲＮＡの逆転写物のスクリーニングによって、適切な細胞に由来するゲノムライブラリーのスクリーニングによって、または、これらの手順の組合せによって、得ることができる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製したオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施することができる。プローブは、公知の手順に従って、蛍光基、放射性原子、または化学発光基などの検出可能な基で標識し、従来のハイブリダイゼーションアッセイで使用することができる。代替方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）手順により、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子配列から作製されるＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子配列を得ることができる。Ｍｕｌｌｉｓ他、米国特許第４６８３１９５号、およびＭｕｌｌｉｓ他、米国特許第４６８３２０２号を参照のこと。

【0449】

グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを含むベクターで形質転換させた宿主細胞中で、グリコシルトランスフェラーゼを合成することができる。ベクターを用いて、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを増幅させ、かつ／または、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡを発現させる。発現ベクターは、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしているＤＮＡ配列が、適切な宿主中でグリコシルトランスフェラーゼ酵素の発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に連結している、複製可能なＤＮＡ構築体である。このような制御配列の必要性は、選択される宿主および選択される形質転換方法によって変わると考えられる。通常、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列を含む。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされるのは、複製起点によって通常与えられる、宿主中で複製する能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子のみである。

【0450】

例示的な実施形態では、本発明は、原核生物の酵素を利用する。このようなグリコシルトランスフェラーゼとしては、多くのグラム陰性細菌によって産生される、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の合成に関与する酵素が挙げられる（Ｐｒｅｓｔｏｎ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２３（３）：１３９〜１８０頁（１９９６年））。このような酵素には、それだけには限らないが、大腸菌やネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの種のｒｆａオペロンのタンパク質が含まれ、β１，６ガラクトシルトランスフェラーゼおよびβ１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、ＥＭＢＬアクセッション番号Ｍ８０５９９およびＭ８６９３５（大腸菌）；ＥＭＢＬアクセッション番号Ｓ５６３６１（ネズミチフス菌）、グルコシルトランスフェラーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２５７４０（大腸菌）、β１，２−グルコシルトランスフェラーゼ（ｒｆａＪ）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２７１２９（大腸菌）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９８１７（ネズミチフス菌））、ならびにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ｒｆａＫ）（ＥＭＢＬアクセッション番号Ｕ０００３９（大腸菌）が挙げられる。アミノ酸配列が公知である他のグリコシルトランスフェラーゼとしては、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、大腸菌、ネズミチフス菌、サルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｓｕｍ）などの生物で特徴付けられているｒｆａＢや緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のｒｈ１オペロンなどのオペロンによってコードされているものが挙げられる。

【0451】

ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−β−１，３−Ｄ−ガラクトシル−β−１、４−Ｄ−グルコース、ならびに、粘膜病原菌の淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｎｏｒｈｏｅａｅ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＬＯＳ中で同定されたＰ^ｋ血液型の３糖配列、Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−ガラクトシル−β−１，４−Ｄ−グルコース（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：２３６〜２４３頁（１９９４年））を含む構造体を作るのに関与しているグリコシルトランスフェラーゼも本発明で使用するのに適している。これらの構造体の生合成に関与しているグリコシルトランスフェラーゼをコードしている、髄膜炎菌および淋菌由来の遺伝子は、髄膜炎菌の免疫型Ｌ３およびＬ１（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：７２９〜７４０頁（１９９５年））ならびに淋菌変異体Ｆ６２（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２１８１〜２１９０頁（１９９４年））から同定されている。髄膜炎菌では、３種の遺伝子、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢ、およびｌｇＥからなる部位が、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース鎖中の糖の最後の３つを付加するのに必要なグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜７３頁（１９９６年））。最近、ｌｇｔＢおよびｌｇｔＡ遺伝子産物の酵素活性が実証され、提唱されているそれらのグリコシルトランスフェラーゼ機能に関して初めて直接的な証拠が提供された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４５）：２８２７１〜２７６頁（１９９６年））。淋菌では、２種の追加の遺伝子、すなわち、β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃをラクト−Ｎ−ネオテトラオース構造体の末端ガラクトースの３位に付加するｌｇｔＤと、切り縮められたＬＯＳのラクトース成分に末端α−Ｄ−Ｇａｌを付加し、それによって、Ｐ^ｋ血液型の抗原構造を作り出すｌｇｔＣがある（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ（１９９４年）、前掲書）。髄膜炎菌では、分離した免疫型Ｌ１も、Ｐ^ｋ血液型抗原を発現し、また、ｌｇｔＣ遺伝子を有することが示されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ他、（１９９５年）、前掲書）。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）のグリコシルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子は、米国特許第５５４５５５３号（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ）でも記載されている。ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）に由来するα１，２−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，３−フコシルトランスフェラーゼの遺伝子も、特徴付けられている（Ｍａｒｔｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１３４９〜２１３５６頁（１９９７年））。また、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のグリコシルトランスフェラーゼも本発明において有用である（例えば、ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／〜ｐｅｄｒｏ／ＣＡＺＹ／ｇｔｆ＿４２．ｈｔｍｌを参照のこと）。

【0452】

ａ）フコシルトランスフェラーゼ
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するグリコシルトランスフェラーゼは、フコシルトランスフェラーゼである。フコシルトランスフェラーゼは、当業者には公知である。例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースから受容体糖のヒドロキシ位置に転移させる酵素が挙げられる。ヌクレオチドを含まない糖を受容体に転移させるフコシルトランスフェラーゼも、本発明において有用である。

【0453】

いくつかの実施形態では、受容体糖は、例えば、オリゴ糖グリコシド中のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ基のＧｌｃＮＡｃである。この反応に適したフコシルトランスフェラーゼとしては、ヒトの乳から最初に特徴を明らかにされたＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ１−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（Ｐａｌｃｉｃ他、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．１９０：１〜１１頁（１９８９年）；Ｐｒｉｅｅｌｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６〜１０４６３頁（１９８１年）、およびＮｕｎｅｚ他、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６〜２０９５頁（１９８１年）を参照のこと）、ならびにヒト血清中に存在するＧａｌβ（１→４）ＧｌｃＮＡｃβ−αフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ、ＦＴＶ、ＦＴＶＩ）が挙げられる。ＦＴＶＩＩ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）、すなわちシアリルα（２→３）Ｇａｌβ（１→３）ＧｌｃＮＡｃβフコシルトランスフェラーゼも特徴を明らかにされている。Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃβ−α（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換型も特徴を明らかにされている（Ｄｕｍａｓ他、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ １：４２５〜４２８頁（１９９１年）、およびＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ４：１２８８〜１３０３頁（１９９０年）を参照のこと）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）が挙げられる。Ｍｏｌｌｉｃｏｎｅ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：１６９〜１７６頁（１９９０年）または米国特許第５３７４６５５号で記載されている方法によって、酵素的フコシル化を実施することができる。フコシルトランスフェラーゼを得るのに使用される細胞は、ＧＤＰ−フコースを合成するための酵素系も含むと考えられる。

【0454】

ｂ）ガラクトシルトランスフェラーゼ
実施形態の別の群では、グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼである。例示的なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例えば、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３年）およびＹａｍａｍｏｔｏ他、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：２２９〜２３３頁（１９９０年）を参照のこと。ウシ由来（Ｇｅｎｂａｎｋ ｊ０４９８９、Ｊｏｚｉａｓｓｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０〜１４２９７頁（１９８９年））、マウス由来（ＧｅｎＢａｎｋ ｍ２６９２５；Ｌａｒｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年））、ブタ由来（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ３６１５２；Ｓｔｒａｈａｎ他、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１０１〜１０５頁（１９９５年））。他の適切なα（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｂ血液型抗原の合成に関与しているものである（ＥＣ２．４．１．３７、Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６〜１１５１頁（１９９０年）（ヒト））。さらに別の例示的なガラクトシルトランスフェラーゼは、コアＧａｌ−Ｔ１である。

【0455】

β（１，４）ガラクトシルトランスフェラーゼも本発明の方法で使用するのに適しており、例えば、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃシンテターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンテターゼ）（ウシ由来（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１〜２１７頁（１９８９年））、ヒト由来（Ｍａｓｒｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７〜６６３頁（１９８８年））、マウス由来（Ｎａｋａｚａｗａ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５〜１６８頁（１９８８年））、ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．３８：２３４〜２４２頁（１９９４年））が挙げられる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼとしては、例えば、α１，２ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）由来のもの、Ｃｈａｐｅｌｌ他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：５１９〜５２８頁（１９９４年））が挙げられる。

【0456】

Ｃｈｏ，Ｓ．Ｋ．およびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、１３６２２〜１３６２８頁によって報告されているものなどα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの可溶型も、本発明を実施するうえで適切である。

【0457】

ｃ）シアリルトランスフェラーゼ
シアリルトランスフェラーゼは、組換え細胞および本発明の反応混合物において有用な別のタイプのグリコシルトランスフェラーゼである。組換型シアリルトランスフェラーゼを産生する細胞は、シアリルトランスフェラーゼに対するシアル酸供与体であるＣＭＰ−シアル酸も産生すると考えられる。発明で使用するのに適したシアリルトランスフェラーゼの例としては、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ（例えば、ラットまたはヒトのＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ）、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＶ、ＳＴ３Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ６Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ Ｖ、ＳＴ６Ｇａｌ ＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ ＩＩ、およびＳＴ６Ｇａｌ ＮＡｃ ＩＩＩが挙げられる（本明細書で使用するシアリルトランスフェラーゼの命名法は、Ｔｓｕｊｉ他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ６：５〜１４頁（１９９６年）で記載されているものである）。α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）と呼ばれる例示的なα（２，３）シアリルトランスフェラーゼは、２糖Ｇａｌβ１→３Ｇｌｃの非還元末端Ｇａｌまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁（１９８１年）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２年）、およびＷｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁（１９９２年）を参照のこと。別の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．９９．４）は、２糖の非還元末端Ｇａｌまたはグリコシドにシアル酸を転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：４４４４頁（１９７９年）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１００４頁（１９９２年）を参照のこと。別の例示的な酵素としては、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ α−２，６シアリルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｋｕｒｏｓａｗａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５〜３８１頁（１９９４年）を参照のこと）。

【0458】

好ましくは、糖ペプチドの糖をグリコシル化する場合、シアリルトランスフェラーゼは、完全にシアル酸付加された糖構造体上で末端シアル酸の土台となる最も一般的な末端から２番目の配列であるＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ配列にシアル酸を転移させることができると考えられる（表５を参照のこと）。

【0459】

【表3】

【0460】

特許請求の範囲の方法で有用なシアリルトランスフェラーゼの例は、α（２，３）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）とも呼ばれるＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩである。この酵素は、Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃグリコシドのＧａｌへのシアル酸の転移を触媒し（例えば、Ｗｅｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１０１１頁（１９９２年）、Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｉｊｎｄｅｎ他、Ｊ：Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：３１５９頁（１９９１年））を参照のこと）、糖ペプチド中のアスパラギン結合型オリゴ糖のシアル酸付加を司っている。シアル酸は、Ｇａｌに結合し、２つの糖の間にα結合が形成される。これらの糖の間の結合形成（結合）は、ＮｅｕＡｃの２位とＧａｌの３位の間にある。この特定の酵素は、ラットの肝臓から単離することができる（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１３８４５頁（１９８２年））。ヒトｃＤＮＡ（Ｓａｓａｋｉ他、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２２７８２〜２２７８７頁；Ｋｉｔａｇａｗａ＆Ｐａｕｌｓｏｎ（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３９４〜１４０１頁（１９９３年）およびゲノム（Ｋｉｔａｇａｗａ他、（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：９３１〜９３８頁）ＤＮＡ配列が公知であり、組換え発現によってこの酵素を作製することを容易にしている。別の実施形態では、特許請求の範囲のシアル酸付加の方法は、ラットＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩを使用する。

【0461】

本発明において有用な他の例示的なシアリルトランスフェラーゼとして、α（２，３）を含めて、カンピロバクタージェジュニから単離されるものが挙げられる。例えば、ＷＯ９９／４９０５１号を参照のこと。

【0462】

表５に記載したもの以外のシアリルトランスフェラーゼも、商業的に重要な糖ペプチドにシアル酸付加するための経済的かつ効率的な大規模プロセスにおいて有用である。これら他の酵素の有用性を調べるための簡単な試験として、様々な量の各酵素（１〜１００ｍＵ／ｍｇタンパク質）を、（１〜１０ｍｇ／ｍｌで）アシアロ−α_１ＡＧＰと反応させて、問題のシアリルトランスフェラーゼが糖ペプチドにシアル酸付加する能力を、ウシのＳＴ６Ｇａｌ Ｉ、ＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩ、または両方のシアリルトランスフェラーゼに対して比較する。あるいは、他の糖ペプチドもしくは糖ペプチド、または、ペプチド主鎖から酵素的に遊離されたＮ−結合型オリゴ糖を、アシアロ−α_１ＡＧＰの代わりにこの評価に使用することができる。（本開示においてＳＴ３Ｇａｌ ＩＩＩに関して例示するように）ＳＴ６Ｇａｌ Ｉより効率的に糖ペプチドのＮ−結合型オリゴ糖にシアル酸付加する能力を有するシアリルトランスフェラーゼは、ペプチドにシアル酸付加するための実用的な大規模プロセスにおいて有用である。他の例示的なシアリルトランスフェラーゼは、図１０に示す。

【0463】

ｄ）ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼは、本発明を実施する際、特に、ペプチドのＯ−結合型グリコシル化部位のアミノ酸にＧａｌＮＡｃ部分を結合させるのに有用である。適切なＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼとしては、それだけには限らないが、α（１，３）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｎａｇａｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２〜１２０８９頁（１９９２年）およびＳｍｉｔｈ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２頁（１９９４年））、ならびにポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９頁（１９９３年））が挙げられる。

【0464】

遺伝子工学によって、クローン化された遺伝子から酵素ＧａｌＮＡｃ Ｔ_Ｉ〜ＸＸなどのタンパク質を作製することは周知である。例えば、米国特許第４７６１３７１号を参照のこと。１つの方法は、十分なサンプルを収集し、次に、Ｎ末端配列決定によって酵素のアミノ酸配列を決定する。次に、この情報を用いて、昆虫細胞系統Ｓｆ９で発現されると十分に活性な酵素の合成をもたらした、完全長の（膜結合型）トランスフェラーゼをコードしているｃＤＮＡクローンを単離する。次に、１６種の異なるタンパク質の公知のグリコシル化部位の周囲のアミノ酸を半定量的に解析し、続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成ペプチドのグリコシル化を調査することによって、その酵素の受容体特異性を決定する。この研究は、いくつかのアミノ酸残基がグリコシル化ペプチド部分で過剰であること、およびグリコシル化されたセリンおよびトレオニン残基の周囲の特定の位置の残基が、他のアミノ酸部分よりも受容体の効率に対してより著しい影響を及ぼし得ることを実証した。

【0465】

２．スルホトランスフェラーゼ
本発明は、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、カラゲネン（ｃａｒｒａｇｅｎｅｎ）、および関連化合物などの硫酸化多糖を含めて、硫酸化分子を含むペプチドを作製するための方法も提供する。適切なスルホトランスフェラーゼとしては、例えば、コンドロイチン−６−スルホトランスフェラーゼ（Ｆｕｋｕｔａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５７５〜１８５８０頁（１９９５年）によって記載されているニワトリｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４９９１５）、グリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ１（Ｄｉｘｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：２３９〜２４１頁（１９９５年）；ＵＬ１８９１８）、ならびにグリコサミノグリカンＮ−アセチルグルコサミンＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルホトランスフェラーゼ２（Ｏｒｅｌｌａｎａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２７０〜２２７６頁（１９９４年）およびＥｒｉｋｓｓｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４３８〜１０４４３頁（１９９４年）で記載されているマウスｃＤＮＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２３０４で記載されているヒトｃＤＮＡ）が挙げられる。

【0466】

３．細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼ
別の実施形態では、本発明の方法で使用される酵素は、細胞結合型グリコシルトランスフェラーゼである。多くの可溶性グリコシルトランスフェラーゼが公知であるが（例えば、米国特許第５０３２５１９号を参照のこと）、グリコシルトランスフェラーゼは一般に、細胞と結合するとき、膜結合型である。これまで研究されている膜結合型酵素の多くは、内因性のタンパク質とみなされている。すなわち、それらは、超音波処理によっては膜から遊離されず、可溶化するために界面活性剤を必要とする。表面型のグリコシルトランスフェラーゼが、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の表面で確認されており、これらの表面型トランスフェラーゼは生理的条件下で触媒活性を維持することも認識されている。しかし、細胞表面型グリコシルトランスフェラーゼのより知られている機能は、細胞間認識のためのものである（Ｒｏｔｈ、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ｔｏ ＳＵＰＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ ＰＨＥＮＯＭＥＮＡ、１９９０年）。

【0467】

細胞によって発現されるグリコシルトランスフェラーゼを改変するための方法が開発されている。例えば、Ｌａｒｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２２７〜８２３１頁（１９８９年）は、細胞表面のオリゴ糖構造体およびそれらの同起源のグリコシルトランスフェラーゼの発現を決定するクローン化ｃＤＮＡ配列を単離するための遺伝的手法を報告している。ＵＤＰ−ガラクトースおよびβ−Ｄ−ガラクトシル−１，４−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを発現することが知られているマウス細胞系統から単離したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーを、ＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を培養し、α１−３ガラクトシルトランスフェラーゼ活性について解析した。

【0468】

Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：２７１３〜２７１７頁（１９９２年）は、β−ラクタマーゼを大腸菌の外表面に固着する方法を開示している。（ｉ）外膜タンパク質のシグナル配列、（ｉｉ）外膜タンパク質の膜貫通部分、および（ｉｉｉ）完全に発達したβ−ラクタマーゼ配列からなる３種間の融合物が作製されて、活性な表面結合型β−ラクタマーゼ分子を生じる。しかし、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏの方法は、原核細胞系のみに限定されており、著者が認識しているように、適切に機能するためには３種間の完全な融合が必要とされる。

【0469】

４．融合タンパク質
他の例示的な実施形態では、本発明の方法は、所望の糖ペプチドコンジュゲートの合成に関与している複数の酵素活性を有する融合タンパク質を利用する。融合ポリペプチドは、例えば、補助酵素の触媒活性ドメインに結合しているグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインから構成されるものでよい。補助酵素の触媒ドメインは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼのための供与体であるヌクレオチド糖を形成するステップを触媒することができ、または、グリコシルトランスフェラーゼサイクルに関与している反応を触媒することができる。例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド糖合成に関与している酵素をコードするポリヌクレオチドにインフレームで結合させることができる。得られた融合タンパク質は、次に、ヌクレオチド糖の合成だけでなく、受容体分子への糖部分の転移も触媒することができる。融合タンパク質は、１つの発現可能なヌクレオチド配列に結合された２種以上のサイクル酵素になることができる。他の実施形態では、融合タンパク質は、２種以上のグリコシルトランスフェラーゼの触媒活性ドメインを含む。例えば、５６４１６６８を参照のこと。本発明の修飾された糖ペプチドは、様々な適切な融合タンパク質を利用することによって、容易に設計し製造することができる（例えば、１９９９年６月２４日にＷＯ９９／３１２２４号として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＣＡ９８／０１１８０号を参照のこと）。

【0470】

５．固定化酵素
細胞結合型酵素に加えて、本発明は、固体および／または可溶性の支持体上に固定化された酵素の使用も提供する。例示的な実施形態では、本発明の方法による完全なグリコシルリンカーを介してＰＥＧに結合されているグリコシルトランスフェラーゼが提供される。ＰＥＧ−リンカー−酵素コンジュゲートは、場合によっては、固体支持体に結合されている。本発明の方法において固体に支持された酵素を使用することにより、反応混合物の精密な検査および反応生成物の精製が簡易になり、また、酵素を容易に回収することも可能になる。グリコシルトランスフェラーゼコンジュゲートは、本発明の方法で利用される。酵素および支持体の他の組合せ物は、当業者には明らかであろう。

【0471】

ペプチドコンジュゲートの精製
上記の方法で作製した生成物は、精製せずに使用することができる。しかし、通常は、生成物を回収することが好ましい。薄層もしくは厚層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または膜ろ過など、グリコシル化された糖を回収するための標準的な周知の技術を使用することができる。以下および本明細書に引用する文献で説明されているように、より好ましくは逆浸透膜による膜ろ過、または、１種もしくは２種のカラムクロマトグラフィー法を回収のために使用することが好ましい。例えば、分子量カットオフ値が約３０００〜１０，０００の膜による膜ろ過を用いて、グリコシルトランスフェラーゼなどのタンパク質を除去することができる。次に、ナノろ過または逆浸透法を用いて、塩類の除去および／または糖生成物の精製を行うことができる（例えば、ＷＯ９８／１５５８１号を参照のこと）。ナノフィルター膜は、使用する膜に応じて、１価の塩類を通過させるが多価の塩類および約１００〜約２０００ダルトンより大きい非荷電の溶質は保持する、ある種類の逆浸透膜である。したがって、典型的な適用例では、本発明の方法によって調製される糖は膜内に保持され、混入している塩は通過すると考えられる。

【0472】

修飾された糖タンパク質が細胞内で作製される場合は、第１のステップとして、粒子状の破片、すなわち、宿主細胞または溶解された断片を、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去する。場合によっては、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いてタンパク質を濃縮し、続いて、イムノアフィニティークロマトグラフィー、（例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、またはカルボキシメチルもしくはスルホプロピル基を含むマトリックスでの）イオン交換カラムによる分画、Ｂｌｕｅ−セファロース、ＣＭ Ｂｌｕｅ−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、Ｃｏｎ Ａ−セファロース、エーテルトヨパール、ブチルトヨパール、フェニルトヨパール、ＳＰ−セファロース、もしくはタンパク質Ａセファロース上でのクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（例えば、脂肪族基を付加されたシリカゲル）、例えばセファデックスの分子ふるいもしくはサイズ排除クロマトグラフィーを用いたゲルろ過、ポリペプチドを選択的に結合するカラムでのクロマトグラフィー、およびエタノールもしくは硫酸アンモニウム沈殿から選択される１種または複数のステップによって、他の不純物からポリペプチド変異体を分離してよい。

【0473】

培養状態で作製される修飾された糖ペプチドは、通常、細胞、酵素などから最初に抽出し、続いて、１種もしくは複数の濃縮、塩析、水系イオン交換、またはサイズ排除クロマトグラフィーのステップ、例えば、ＳＰセファロースを用いたステップを行うことによって単離される。さらに、修飾された糖タンパク質をアフィニティクロマトグラフィーによって精製してもよい。ＨＰＬＣを１つまたは複数のステップ用に使用してもよい。

【0474】

タンパク分解を阻害するために、前述のステップのいずれかに、プロテアーゼ阻害剤、例えばメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含めてよく、また、外因性の汚染菌の増殖を防止するために、抗生物質を含めてよい。

【0475】

別の実施形態では、本発明の修飾された糖ペプチドを作製する系から得た上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて、最初に濃縮する。濃縮ステップの後、適切な精製マトリックスに濃縮物を加えてよい。例えば、適切な親和性マトリックスは、ペプチドに対するリガンド、すなわち適切な支持体に結合されたレクチンまたは抗体分子を含んでよい。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ基が張り出たマトリックスまたは基材を使用してよい。適切なマトリックスとしては、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または、タンパク質精製で一般に使用される他のタイプのものが挙げられる。あるいは、陽イオン交換ステップを使用してもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が特に好ましい。

【0476】

最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばメチル基または他の脂肪族基が張り出たシリカゲルを使用する１種または複数のＲＰ−ＨＰＬＣステップを使用して、ポリペプチド変異体組成物をさらに精製してよい。前述した精製ステップのうちの一部またはすべてを様々な組合せで実施して、均質な修飾された糖タンパク質を提供することもできる。

【0477】

大規模な発酵から得られる本発明の修飾された糖ペプチドを、Ｕｒｄａｌ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１頁（１９８４年）によって開示されているものに類似した方法によって精製してよい。この参考文献では、分取ＨＰＬＣカラムで組換えヒトＩＬ−２を精製するための２回連続したＲＰ−ＨＰＬＣステップを記載している。あるいは、アフィニティクロマトグラフィーなどの技術を利用して、修飾された糖タンパク質を精製してもよい。

【0478】

医薬組成物
本発明の方法によって様々なＯ結合型グリコシル化部位で修飾されたポリペプチドには、広い範囲の医薬用途がある。例えば、修飾されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、一般的な貧血、再生不良性貧血、化学療法により誘発された傷害（骨髄傷害など）、慢性腎不全、腎炎、およびサラセミアを治療するのに使用することができる。さらに、修飾されたＥＰＯは、脳／脊椎障害、多発性硬化症、およびアルツハイマー病などの神経障害を治療するのにも使用することができる。

【0479】

第２の例は、ＡＩＤＳおよび肝炎ＢまたはＣ、ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）など様々なウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、ヘアリー細胞白血病などの癌、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、悪性黒色腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）陽性の慢性期の骨髄性白血病（ＣＭＬ）、腎臓癌、骨髄腫、慢性骨髄性白血病、頭部および頸部の癌、骨癌、ならびに子宮頚部異形成、および多発性硬化症など中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を治療するのに使用することができるインターフェロンα（ＩＦＮ−α）である。さらに、本発明の方法によって修飾されたＩＦＮ−αは、シェーグレン症候群（自己免疫疾患）、ベーチェット病（自己免疫性炎症性疾患）、線維筋痛症（筋骨格の疼痛／疲労を伴う疾患）、アフタ性潰瘍（口内糜爛）、慢性疲労症候群、および肺線維症など他の疾患および病態の組合せを治療するのにも有用である。

【0480】

別の例は、多発性硬化症（再発寛解型または慢性進行性）などのＣＮＳ障害、ＡＩＤＳおよび肝炎ＢまたはＣ、ヒトパピローマウイルス（ＨＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）など様々なウイルスによって引き起こされるウイルス感染症、耳感染症、筋骨格感染症、ならびに、乳癌、脳の癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、頭部および頸部の癌、基底細胞癌、子宮頚部異形成、黒色腫、皮膚癌、肝臓癌を含めて、癌を治療するのに有用であるインターフェロンβである。本発明の方法によって修飾されたＩＦＮ−βは、移植拒絶（例えば、骨髄移植）、ハンチントン舞踏病、大腸炎、脳炎、肺線維症、黄斑変性症、肝硬変、角結膜炎など他の疾患および病態を治療する際にも使用される。

【0481】

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、さらなる例である。本発明の方法により修飾されたＧ−ＣＳＦは、癌を治療するための化学療法における補助剤として使用することができ、また、一部の医療処置に関連した病態または合併症、例えば、化学療法により誘発された骨髄傷害、白血球減少症（全般的）、化学療法により誘発された発熱性好中球減少症、骨髄移植に関連した好中球減少、および重度の慢性好中球減少を予防または軽減するのに使用することができる。修飾されたＧ−ＣＳＦは、移植、末梢血細胞動員、骨髄破壊的化学療法または骨髄抑制性化学療法を受ける予定の患者において採取するための末梢血前駆細胞動員、ならびに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する導入／地固め治療の後の好中球減少、発熱、抗生物質使用、入院期間の低減に使用してもよい。喘息およびアレルギー性鼻炎を含めて、他の病態または障害を、修飾されたＧ−ＣＳＦで治療することができる。

【0482】

１つの追加の例として、本発明の方法により修飾されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を、小人症、小児および成人における低身長、カヘキシー／筋衰弱、全身の筋萎縮、および性染色体異常（例えばターナー症候群）など成長に関連した病態の治療に使用することもできる。修飾されたｈＧＨを用いて、短腸症候群、リポジストロフィー、骨粗しょう症、尿毒症（ｕｒａｅｍａｉａ）、火傷、女性の不妊症、骨再生、一般の糖尿病、ＩＩ型糖尿病、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および不眠症（ｉｎｓｏｍｉａ）を含めて、他の病態を治療することもできる。さらに、様々なプロセス、例えば、全組織の再生、骨再生、および創傷治癒を促進するために、または、ワクチン補助剤として、修飾されたｈＧＨを使用してもよい。

【0483】

したがって、本発明は、別の態様では医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、製薬上許容される希釈剤、ならびに非天然の水溶性ポリマー、治療効果を有する部分または生体分子と、グリコシル化ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドとの共有結合性コンジュゲートを含む。ポリマー、すなわち治療効果を有する部分または生体分子は、ペプチドとポリマー、すなわち治療効果を有する部分または生体分子の双方の間に介在し、かつそれらに共有結合している完全なグリコシル結合基を介してペプチドに結合している。

【0484】

本発明の医薬組成物は、様々な薬物送達システムで使用するのに適している。本発明で使用するのに適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ペンシルベニア州、第１７版（１９８５年）に記載されている。薬物送達のための方法の簡潔な総説については、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）を参照のこと。

【0485】

例えば、局所、経口、経鼻、静脈、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋肉内の投与を含めて、任意の適切な投与方法のために医薬組成物を調製することができる。皮下注射などの非経口投与の場合は、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与の場合は、上記の担体のうちの任意のもの、または、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの固形担体を使用してよい。マイクロスフェア（例えば、ポリラクタートポリグリコラート）など生分解性のマトリックス（ｍａｔｒｉｓｅｓ）も、本発明の医薬組成物用の担体として使用してよい。適切な生分解性マイクロスフェアは、米国特許第４８９７２６８号および米国特許第５０７５１０９号で開示されている。

【0486】

一般に、医薬組成物は、皮下または非経口的に、例えば静脈内に投与される。したがって、本発明は、許容される担体、好ましくは水性の担体、例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解または懸濁された化合物を含む、非経口投与用の組成物を提供する。この組成物は、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ８０などの界面活性剤、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロースなどの安定化剤、および、ＥＤＴＡやｍ−クレゾールなどの保存剤を含んでもよい。この組成物は、ｐＨ調整剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、界面活性剤など、近似的生理条件に必要な製薬上許容される補助剤を含んでよい。

【0487】

これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、または、滅菌ろ過してもよい。得られた水性液剤は、そのまま使用するために包装しても、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥した調製物は、投与する前に無菌の水性担体と混合する。調製物のｐＨは、通常、３〜１１、より好ましくは５〜９、最も好ましくは７〜８である。

【0488】

いくつかの実施形態では、標準の小胞形成脂質から形成させたリポソーム中に本発明の糖ペプチドを組み込むことができる。例えば、Ｓｚｏｋａ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７頁（１９８０年）、米国特許第４２３５８７１号、米国特許第４５０１７２８号、および米国特許第４８３７０２８号で記載されているように、様々な方法が、リポソームを調製するのに利用可能である。様々な標的性作用物質（例えば、本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームの標的化は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４９５７７７３号および米国特許第４６０３０４４号を参照のこと）。

【0489】

標的性作用物質をリポソームに結合させるための標準的な方法を使用することができる。これらの方法は、一般に、標的性作用物質を結合するために活性化され得る、ホスファチジルエタノールアミンなどの脂質成分、または、脂質誘導体化された本発明の糖ペプチドなど誘導体化された親油性化合物をリポソーム中に組み込むものである。

【0490】

標的化の機序は、通常、標的性部分が、標的、例えば、細胞表面の受容体との相互作用に利用可能となるように、標的性作用物質がリポソームの表面に位置していることを必要とする。本発明の糖は、リポソームが形成される前に、当業者に公知の方法（例えば、それぞれ長鎖ハロゲン化アルキルまたは脂肪酸による、糖上に存在するヒドロキシル基のアルキル化またはアシル化）を用いて、脂質分子に結合させてよい。あるいは、膜形成時に、連結部分が最初に膜中に組み込まれるような形で、リポソームを作製してもよい。連結部分は、膜中に堅く埋め込まれ固定される親油性部分を有していなければならない。それは、リポソームの水性表面上で化学的に利用可能な反応性部分も有していなければならない。後で加えられる標的性作用物質または糖と安定な化学結合を形成するのに化学的に適するように、反応性部分を選択する。いくつかの場合では、標的性作用物質を連結分子に直接結合させることが可能であるが、大半の場合、化学架橋の役目を果たす第３の分子を使用し、それによって、膜中の連結分子を標的性作用物質または糖と連結させ、それらを小胞表面から３次元的に離れて伸長させることがより適切である。

【0491】

本発明の方法によって調製される化合物は、診断試薬としても使用することができる。例えば、標識した化合物を用いて、炎症を有することが疑われる患者の炎症または腫瘍転移の領域を特定することができる。この用途のために、化合物を^１２５Ｉ、^１４Ｃ、またはトリチウムで標識することができる。

【0492】

以下の実施例は、本発明のコンジュゲートおよび方法を例示するために提供されるが、特許請求の範囲の発明を限定するためのものではない。

【実施例1】

【0493】

１．１ａ インターフェロンα−２β−ＧａｌＮＡｃの調製（ｐＨ６．２）
ＩＦＮα−２β ４ｍｇに水２００μＬを加えることによって、インターフェロンα−２βを溶解した。固体が溶解したとき、１．９２ｍＬの反応緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０５％ポリソルベート、および０．０５％ＮａＮ_３）を加えた。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（４．１６ｍｇ；３ｍＭ）およびＧａｌＮＡｃＴ２（８０ｍＵ；８０Ｌ）を加え、その反応混合物を低速回転させながら３２℃でインキュベートした。ＭＡＬＤＩ解析によってこの反応を観察した。反応は、７２時間後にほぼ完了した。完了後、反応混合物をペプチドマッピングおよび部位占有率の解析にかけた。

【0494】

１．１ｂ インターフェロンα−２β−ＧａｌＮＡｃの調製（ｐＨ７．４）
製造業者に説明されているようにして、インターフェロンα−２βを溶解した。水５０ｕＬをＩＦＮα−２β ５０μｇに加えた。固体が溶解したとき、５０μＬの反応緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０５％ポリソルベート、および０．０５％ＮａＮ_３）を加えた。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１００μｇ；３ｍＭ）およびＧａｌＮＡｃ Ｔ２（８ｍＵ；８μＬ）を加え、その反応混合物を低速回転させながら３２℃でインキュベートした。ＭＡＬＤＩ解析によってこの反応を観察した。反応は、約４８〜７２時間以内に完了することが判明した。

【0495】

１．２ ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを用いた、インターフェロン−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンの調製
５キロダルトンＭＷＣＯのセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）フィルターカートリッジおよび第２の緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０５％ポリソルベート、および０．０５％ＮａＮ_３）を用いて、１．１（上記）から得たＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ（１．０ｍＬ、〜２ｍｇ、０．１μモル）のバッファー交換（２回）を行った。スピンカートリッジ中のＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃを第２の緩衝液を用いて溶解し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン（１０ｍｇ、０．５マイクロモル）とＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１（２００μＬ）の双方を反応混合物に加えた。反応混合物を低速回転させながら３２℃で９６時間インキュベートした。ＳＰセファロースおよびＳＥＣ（スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５）クロマトグラフィーを用いて、生成物のＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを精製した。ＭＡＬＤＩ解析によって、シアル酸−ＰＥＧの付加を確認した。

【0496】

１．３．ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、コア−１−β１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ、およびＳＴ３Ｇａｌ２を用いた、インターフェロン−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンの調製
ＭＷＣＯ５キロダルトンのセントリコンフィルターカートリッジおよび第２の緩衝液（２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．０５％ポリソルベート、および０．０５％ＮａＮ_３）を用いて、前述（ｐＨ６．２）のＧａｌＮＡｃ付加から得たＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ（１．０ｍＬ、〜２ｍｇ、０．１μモル）のバッファー交換（２回）を行った。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン（１０ｍｇ、０．５マイクロモル）、ＵＤＰ−ガラクトース（１．８ｍｇ、３ｍＭ）、コア−１−β１，３−ガラクトシル−トランスフェラーゼ（２００ｍＵ、樹脂上）およびＳＴ３Ｇａｌ２（２００ｍＵ、α２，３−（Ｏ）−シアリトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））を含有する第２の緩衝液１．０ｍＬを用いて、スピンカートリッジ中のＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃを溶解した。反応混合物を低速回転させながら３２℃で９６時間インキュベートした。ＳＰセファロースおよびＳＥＣ（スーパーデックス７５）クロマトグラフィーを用いて、生成物のＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを精製した。ＭＡＬＤＩ解析によって、シアル酸−ＰＥＧの付加を確認した。

【0497】

１．９ タンパク質濃度のアッセイ
セル光路長１ｃｍ、２８０ｎｍの固定吸光度の条件で分光光度計を用いて、タンパク質濃度を決定した。対照としての水および緩衝液とともに、試験対象のサンプルに対して３回の読み取りを行った。０．７９９ｍＬ／ｍｇタンパク質の吸光係数を用いて、タンパク質濃度を決定した。

【0498】

１．１０ 最終生成物の調製
調製用緩衝液は、パイロジェンフリーのＰＢＳ、ｐＨ６．５、２．５％マンニトール、および０．０５％ポリソルベート８０を含有し、減圧により脱気し、滅菌ろ過（０．２μｍ）した。

【0499】

５カラムベッド体積の調製用緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ６．５、２．５％マンニトール、および０．０５％ポリソルベート８０）で平衡化した「Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）」を用いて、エンドトキシンを除去した。重力によって、流速を約０．３ｍＬ／分に制御した。生成物サンプルをゲル上に載せ、調製用緩衝液によって生成物を溶出させた。回収された生成物の体積を調製用緩衝液の追加により調整して、タンパク質濃度を約１００μｇ／ｍＬとした。

【0500】

ペプチド調製物を滅菌ろ過（０．２μ）し、溶出液の１ｍｌアリコートをパイロジェンフリーの２．０ｍＬバイアル中に分取した。さらに、エンドトキシンおよびタンパク質分析のためにアリコートを取り出した。すべての生成物を４℃で保存した。

【0501】

１．１３ 薬物動態学的研究
放射ヨウ素標識したタンパク質を用いて薬物動態学的解析を実施した。標識したインターフェロンをＩＶ 尾静脈注射によってラットに投与した後、７２時間後まで指定の間隔で抜き取った血液中の放射能低減としてクリアランス速度を測定した。それぞれの時点に少なくとも５匹のラットを測定した。

【0502】

１．１４ 結果
２種類のｐＨ、すなわち、中性のｐＨ（７．４）およびわずかに酸性のｐＨ（６．２）でＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の反応速度を測定した。ＧａｌＮＡｃによるグリコシル化は、ｐＨ６．２でもｐＨ７．４でも、首尾よく進行していた。反応経過のＭＡＬＤＩ解析で確認することができるように、反応速度は、ｐＨ６．２の場合より、ｐＨ７．４の場合の方が速かった。

【0503】

ｐＨ６．２またはｐＨ７．４において、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２およびＧａｌＮＡｃを定量的にインターフェロンα−２βに加えた。ＭＡＬＤＩによってこの反応を追跡した。酵素反応の進行中に、新しいインターフェロンαの質量イオンが形成した（１９，２８１ＤａのＩＦＮ−α−２ｂおよび１９，４８５ＤａのＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ）。

【0504】

ｐＨ６．２での反応生成物、ＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃを、タンパク質上でのＧａｌＮＡｃの置換位置を決定するために分析にかけた。ペプチドマッピングおよび部位占有率マッピングをこの目的に対して使用した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのＴＩＣおよびＩＦＮ−α−２ｂのＧｕｌＣ消化を用いたペプチドマッピングにより、質量１０１８．６９のペプチド断片を得た。ＧａｌＮＡｃを含有している１０１８．６９のペプチド質量イオンをＭＳ／ＭＳによりペプチドアミノ酸配列決定したところ、糖はＴ^１０６に結合していることが示された。

【0505】

ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを用いて、ＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃのシアリル−ＰＥＧ化を検討した。ＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃの反応により、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより目で見ることができるＰＥＧ化タンパク質が生成した。通常、反応は３２℃で９６時間進行した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってこの反応を観察した。ＳＤＳ ＰＡＧＥは、ＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃの約７０％がＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンに変換されていることを示した。新しいバンドのＭＡＬＤＩ解析により、４１，５００ダルトンの質量イオン、すなわちＩＦＮ−α−２ｂ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンの質量の存在が示された。

【0506】

ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ構造を有するＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂのグリコフォームも生成していた。前述の条件を用いて反応を実施した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって所望の生成物を検出した。コア−１−β３−ガラクトシルトランスフェラーゼ−１、ＳＴ３Ｇａｌ２、ＵＤＰ−ガラクトース、およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンとともにＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃを出発物質として、ワンポットの２ステップ反応を用いて所望の生成物を作製した。この反応物を３２℃で９６時間インキュベートした。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってこの反応を観察した。２４時間後、反応は約７０％完了していた。生成物のＭＡＬＤＩ解析により、所望の生成物ＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンに由来する、４１，９００Ｄａの質量イオンの存在が示された。

【0507】

ＰＥＧ化インターフェロンα−２ｂ生成物の双方のグリコフォームを、２ステップのプロセスによって精製した。第１のステップでは、ＳＰセファロースを用いてイオン交換クロマトグラフィーを実施した。この手順により、未反応のＰＥＧ材料が除去され、他のタンパク質がいくらか分離された。イオン交換ステップの後に、ＳＥＣを用いて分離を行った。スーパーデックス７５カラムを使用して、グリコシルトランスフェラーゼおよびＰＥＧ化されていないインターフェロンαを含めて、残存するより小型のタンパク質を除去した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによって示されるように、インターフェロンαのＰＥＧ化グリコフォームの双方を９０％を超える純度まで精製した。

【0508】

抗ウイルス性に関するデータは、ＰＥＧ化グリコフォームＡおよびＢが、抗ウイルス効果を保持していることを示唆している。

【0509】

放射ヨウ素標識したＰＥＧ化タンパク質をラットに尾静脈から注射した。双方のタンパク質のＡＵＣは、ＰＥＧ化されていないインターフェロンα−２βの５〜７倍大きかった。

【0510】

グリコフォームＡ（ＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン）およびＢ（ＩＦＮ−α−２β−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン）のいずれも、生理活性を有した。

【実施例2】

【0511】

２．１ Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの調製（ｐＨ６．２）
ＵＦフィルター（５キロダルトン）を用いた限外ろ過（ｕｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって、緩衝液３．２ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ ９６０μｇを濃縮し、１ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ_３）に溶解した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（４０μＬ、４ｍＭ）を加えて、得られた溶液を室温で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＭＡＬＤＩは、反応が完了していることを示した（質量イオンが１８８００から１９０２３質量単位にシフト）。ＳＥＣ（スーパーデックス７５およびスーパーデックス２００）を用いたＨＰＬＣによって、反応混合物を精製した。リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を用いて、カラムを溶出した。Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃに対応するピークを回収し、セントリコン ５キロダルトンフィルターを用いて約１５０μＬに濃縮し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて体積を１ｍｌに調整した。タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬ（Ａ_２８０）であった。

【0512】

２．２ Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌの調製（ｐＨ６．０）
２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０、１．５ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および８０ｍＵ ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を含有する溶液１００μＬにＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（１００μｇ）を加えた。次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン（０．５ｍｇ、０．０２５μモル）、ＵＤＰ−ガラクトース７５μｇ（０．１２５μモル）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ２０μＬ（１０ｍＵ）を加え、その溶液を３２℃で２４時間、ゆっくりと揺り動かした。ＭＡＬＤＩにより、Ｇ−ＣＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌへのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの完全な変換が示唆された。

【0513】

２．３ Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンの調製（Ｃ）
２．３ａ 連続的方法（ｐＨ６．２）
タンパク質１ｍｇを含有するＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ溶液を２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ_３）中に入れてバッファー交換し、次に、５ｍｇ（０．２５μモル）のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０キロダルトン）を加えた。最後に、１００ｍＭのＭｎＣｌ_２溶液１００μＬおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１００μＬ）を加え、反応混合物を３２℃でゆっくりと揺り動かした。指定の時点（２４、４８、および７２時間）にアリコートを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。２４時間後には、それ以上の反応は観察されなかった。反応混合物を遠心ろ過（５キロダルトン）によって濃縮し、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．９）でバッファー交換し、１ｍＬに濃縮した。イオン交換（ＳＰ−セファロース、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．９）およびＳＥＣ（スーパーデックス７５；ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．００５％ｔｗｅｅｎ８０、１ｍｌ／分）を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して０．５ｍＬにし、４℃で保存した。

【0514】

２．３ｂ ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを用いたワンポットの方法（ｐＨ６．０）
遠心ろ過（５キロダルトン）によって、３．２ｍＬの生成物調製緩衝液中に溶解した９６０μｇのＧ−ＣＳＦタンパク質を０．５ｍＬに濃縮し、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ_３）中に溶解して、全体積を約１ｍＬにし、またはタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。溶解後に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、８０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン（６ｍｇ、０，３μｍｏｌ）、およびマウス酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１２０μＬ）を加えた。３２℃で４８時間、溶液を揺り動かした。反応後、標準のクロマトグラフィー条件を用いて前述のＳＰ−セファロースおよびＳＥＣで生成物を精製した。合計０．５ｍｇのタンパク質（Ａ_２８０）が得られ、全収率は約５０％であった。ＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。

【0515】

２．４ Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンの調製（Ｄ）
２．４ａ Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃから出発
ＵＤＰ−ガラクトース（４ｍｇ、６．５μモル）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ_１（３２０μＬ、１６０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン（８ｍｇ、０．４μモル）、ＳＴ３Ｇａｌ２（８０μＬ、０．０７ｍＵ）、および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（８０μＬ）を、（上記の）実施例２．１から得られる、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（１．５ｍｇ）の粗製な１．５ｍＬの反応混合物に直接加えた。得られた混合物を３２℃で６０時間インキュベートした。ただし、反応は２４時間後に完了していた。反応混合物を遠心分離し、限外ろ過（５キロダルトン）によって溶液を０．２ｍＬに濃縮し、次に、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中に再び溶解させて最終体積を１ｍＬにした。ＳＰ−セファロースを用いて生成物を精製し、スピンフィルター（５キロダルトン）を用いてピーク画分を濃縮し、さらにＳＥＣ（スーパーデックス７５）を用いて残留物を精製した。スピンフィルター（５キロダルトン）を用いて濃縮した後、ＰＢＳ、２．５％マンニトール、０．００５％ポリソルベートからなるｐＨ６．５の調製緩衝液によって、タンパク質を１ｍＬに希釈し、タンパク質濃度が１ｍＬ当たり８５０μｇのタンパク質となるように調製した（Ａ_２８０）。全収率は５５％であった。ＭＡＬＤＩ解析の結果を図２８に示す。

【0516】

２．４ｂ Ｇ−ＣＳＦからの出発
スピンフィルター（５キロダルトン）によって、９６０μｇのＧ−ＣＳＦ（３．２ｍｌ）を濃縮し、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ_３）で溶解した。Ｇ−ＣＳＦ溶液の全体積を約１ｍｇ／ｍＬに調整し、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ）、ＵＤＰ−ガラクトース（６ｍｇ）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ_１（１６０μＬ、８０μＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０キロダルトン）（６ｍｇ）、ＳＴ３Ｇａｌ−２（１６０μＬ、１２０μＵ）、およびＭｎＣｌ_２（１００ｍＭ溶液、４０μＬ）を加えた。得られた混合物を３２℃で４８時間インキュベートした。

【0517】

２．５ ＳＰセファロースＨＰＬＣクロマトグラフィー
実施例１．４で説明したようにして、ＳＰセファロースを実施した。

【0518】

２．６ サイズ排除クロマトグラフィー
実施例１．５で説明したようにしてＳＥＣを実施した。精製したサンプルを４℃で保存した。

【0519】

２．６ａ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
クロマトグラフィーによるクロマトグラフィーの第１ステップに続いて、ＰＥＧ化されていないＧ−ＣＳＦ以外の混入物を除去するための第２の精製ステップとしてＨＩＣを使用することができる。すなわち、ゲル浸透カラムでの最初の精製を通過したグリコペグ化Ｇ−ＣＳＦを精製するための方法が利用可能である。

【0520】

２．７ ＳＤＳ ＰＡＧＥ解析
実施例１．６で説明したようにして、ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施した。

【0521】

２．８ ＭＡＬＤＩ解析
実施例１．７で説明したようにしてＭＡＬＤＩ解析を実施した。

【0522】

２．９ ペプチドマッピング解析
実施例１．８で例示したようにしてタンパク質マッピング解析を実施した。

【0523】

２．１０ タンパク質濃度のアッセイ
実施例１．９で説明したようにしてタンパク質濃度を決定した。

【0524】

２．１１ 生成物の調製
実施例１．１０で説明したようにして生成物を調製した。

【0525】

２．１２ エンドトキシンの測定
実施例１．１１で説明したようにしてエンドトキシンを測定した。

【0526】

２．１３ 細胞増殖アッセイ
ＮＦＳ−６０細胞系統およびＴｆ−１細胞系統を用いたＧ−ＣＳＦ増殖アッセイを標準手順に従って実施した。様々な濃度のＧ−ＣＳＦ（５１ｎＭ、２５．５ｎＭ、１２．７５ｎＭ、３．２ｎＭ、１．６ｎＭ、０．８ｎＭ、０ｎＭ）、化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ類似体、ならびに実施例２．３（上記）から得たＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｃおよび実施例２．４（上記）から得たＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｄの存在下で、９６ウェルプレート中に２５０００細胞／ｍｌの密度で細胞を播いた。３７℃で４８時間、細胞をインキュベートした。比色法のＭＴＴアッセイを使用して細胞生存率を測定した。

【0527】

２．１４ Ｉｎ Ｖｉｖｏ活性：ラットにおける白血球（ＷＢＣ）産生
マウスを用いて、Ｇ−ＣＳＦ Ｃ、および化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦのそれぞれについて２種類の薬物用量（５０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ）を検査した。２時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、および９６時間の時点で血液を抜き取り、ＷＢＣおよび好中球の総数を測定した（図４）。

【0528】

２．１５ 加速安定性試験
実施例２．３から得たＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｃおよび実施例２．４から得たＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｄの加速安定性試験を、４０℃に加熱したｐＨ８．０の緩衝液を用いて実施した。７２μｇのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｃを調製用緩衝液（ＰＢＳ、２．５％マンニトール、０．００５％ポリソルベート８０）で８ｍＬに希釈した。１ｍｇのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ Ｄを調製用緩衝液で１６ｍＬに希釈した。ＮａＯＨを用いて両方の溶液をｐＨ８．０に調整し、得られた溶液を滅菌ろ過してパイロジェンフリーの試験管に入れた。サンプルを４０℃で低速回転させ、０時間、７２時間、および１６８時間の時点でアリコート（０．８ｍＬ）を取り出した。前述のＳＥＣ（スーパーデックス２００）を用いて、解析を実施した（図６および図７）。

【0529】

２．１６ タンパク質の放射性標識
ボルトンハンター試薬を用いてＧ−ＣＳＦを放射性標識した。ｐＨ７．４で１５分間、反応を実施し、続いてＳＥＣ（スーパーデックス２００）による精製を行った。精製した後で、調製用緩衝液のｐＨを５．０に調整し、タンパク質濃度をＡ_２８０によって決定した。

【0530】

２．１７ ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｅｌｉｓａアッセイを利用して、ラット血漿中のＧ−ＣＳＦ誘導体を定量した。薬物動態学的な結果を図９に示す。

【0531】

２．１８ 薬物動態学的研究
２つの薬物動態学的研究を実施した。第１の薬物動態学的研究のために、タンパク質を放射性標識し、ＩＶ尾静脈注射によってラットに投与した。４８時間後までの指定の間隔で抜き取った血液中の放射能低減としてクリアランス速度を測定した。それぞれの時点に少なくとも５匹のラットを測定した。

【0532】

詳細には、動物１匹当たり１０μｇのＧ−ＣＳＦ誘導体（標識タンパク質〜１μｇおよび未標識タンパク質９μｇ）を注射した。前述したように抜き取られ計数される血液に加えて、血漿も採取し、タンパク酸（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｉｄ）を沈殿させた。次に、タンパク質沈殿物の放射能を計測した。これらの研究のデータを図２、図３、および図８に示す。

【0533】

第２の薬物動態学的研究では、未標識のＧ−ＣＳＦ誘導体（動物１匹につき３０μｇ）をＩＶ尾静脈注射によりラットに注射した。指定した時点に血液サンプルを抜き取り、それらのサンプルをＧ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡアッセイによって解析した。そのデータを図９に示す。

【0534】

２．１９ 結果
ヒトＧａｌＮＡｃＴ２は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを供与体として用いて、大腸菌で発現されるＧ−ＣＳＦにＧａｌＮＡｃを転移させた。反応緩衝液のｐＨに応じて、１つまたは２つのＧａｌＮＡｃ部分がＧ−ＣＳＦに付加されることがＭＡＬＤＩによって測定された。第２のＧａｌＮＡｃの付加は、ゆっくりと進行し、生成物全体の約１０〜１５％に達した。反応溶液のｐＨを６．０〜６．２に調整することによって、９０％を超える変換率で、１つのＧａｌＮＡｃを選択的にＧ−ＣＳＦに付加することができた。第２のＧａｌＮＡｃの付加は、反応が約７．２〜７．４のｐＨで行われたときに起こった。Ｃｏ^＋２とＭｎ^＋２のどちらも、反応において有用な２価の金属イオンである。反応生成物のペプチドマッピングは、反応の主な生成物が、トレオニン１３３、すなわち、哺乳動物系における天然のＯ結合型グリコシル化部位へのＧａｌＮＡｃの付加物であることを示唆した。第２のＧａｌＮＡｃは、Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端ペプチド断片でみとめられ、トレオニン−２で生じると仮定されている。

【0535】

ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−１（ニワトリまたはマウス）およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンとＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃとの反応により、生成物としてＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンが提供されることをＭＡＬＤＩによって確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定したこの反応の変換率は約５０％であった。コア−１−Ｇａｌ−ＴおよびＵＤＰ−ガラクトースを用いてＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃをさらに伸長して、完全にＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌに変換することもできる。ＳＴ３Ｇａｌ２およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを用いてこの中間体をグリコＰＥＧ化すると、生成物Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンが得られ、全収率は約５０％であった。これらの反応は、Ｇ−ＣＳＦまたはそのグリコシル化中間体から出発して、ワンポットで順次、またはワンポットで同時に実施した。これらの研究では、いずれの手法を用いても、全収率の差はほとんどまたは全く認められなかった。

【0536】

イオン交換およびＳＥＣを組み合わせて用いて、グリコシル化またはグリコＰＥＧ化反応の生成物を精製した。イオン交換ステップは、未反応のＧ−ＣＳＦまたはそのグリコシル化中間体（ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）ならびに任意の未反応のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを除去する。ＳＥＣステップは、未反応のＧ−ＣＳＦおよびこのプロセスで使用されたグリコシルトランスフェラーゼに由来する他のタンパク質混入物を除去した。ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンまたはＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンを含むＧ−ＣＳＦは、これらの精製方法によって、同一の特性および保持時間を示した。最終生成物は示された典型的なプロファイルを有した。

【0537】

精製後に、２．５％マンニトールおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含有するＰＢＳ緩衝液中でＰＥＧ化タンパク質を調製した。初めは、ｐＨ６．５を調製に使用したが、グリコＰＥＧ化されたタンパク質の凝集が懸念されたため（下記参照）、調製用緩衝液のｐＨを５．０に下げた。文献の報告では、溶液のｐＨを４〜５に維持することによってＧ−ＣＳＦの凝集が防止されることが示されている。エンドトキシン除去カートリッジを用いて、滅菌技術により、エンドトキシンを除去した。タンパク質濃度は、一般に、生物学的研究の必要に応じて、１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬに調整した。一般に、このプロセスによってエンドトキシンの計算値を３ＥＵ／ｍｌ未満にした。調製した生成物を４℃で保存した。

【0538】

Ｇ−ＣＳＦに対して感受性が高いＮＳＦ−６０細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞増殖アッセイにおいて生成物を試験した。ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン生成物とＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−２０キロダルトン生成物の双方が細胞増殖を開始するときに有効であることが観察された（図１）。

【0539】

化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦおよびＣ（Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン）に対して加速安定性調査を実施した。調製用緩衝液のｐＨを８．０に調整し、温度を４０℃に上げた。０、７２、および１６８時間の時点で、各タンパク質からサンプルを取った（図６および図７）。化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦは、これらの条件下では１６８時間以内に完全に凝集することが観察された。スーパーデックス２００クロマトグラフィーを用いたＳＥＣによって、凝集体を分離した。複合糖質Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトンも、ＳＥＣによって分離可能な凝集体を形成したが、凝集は、はるかに遅い速度で起こった。

【0540】

ボルトンハンター試薬を用いて、グリコＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを放射ヨウ素標識した。凝集の程度を測定し、形成された凝集体を除去するための方法論を確立するために、実際に放射標識をする前に非放射性（ｃｏｌｄ）標識調査も実施した。ボルトンハンター試薬（非放射性）の使用により、図５で示すように、いくらか凝集体が生じた。スーパーデックス２００カラムを用いたＳＥＣにより、凝集体が除去され、単量体の標識物質が得られた。^１２５Ｉで標識した試薬を用いても、同様の結果が得られた。この調製物を使用すると、保管時の凝集が最小化された。Ａ_２８０での吸光度を測定することにより、タンパク質含有量を測定した。

【0541】

ボルトンハンター試薬を用いて標識したＧ−ＣＳＦ、化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ、およびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの取込みに関するラットのｐＫ試験の結果を図３に示す。この試験では、ラット１匹当たり１０μｇのＧ−ＣＳＦコンジュゲートをＩＶ投与した後に、血液、および血漿から沈殿させたタンパク質の放射能を計測した。血液および血漿タンパク質の双方から得られたデータにより、ＰＥＧコンジュゲートおよび化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦが同一のクリアランス速度を有することが明確に示された（図３および図８）。

【0542】

次に、Ｇ−ＣＳＦ誘導体がＷＢＣ産生を開始する能力をマウスモデルにおいて検討した。各試験化合物を単回ボーラス静注し、ＷＢＣおよび好中球の誘導を経時的に観察した。２５０μｇ／ｋｇで投与したとき、化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦが最も強力な試験タンパク質であった。ＰＥＧコンジュゲート（Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０キロダルトン）は、２５０μｇ／ｋｇの化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦとほぼ同じ程度、また、同様の濃度のＧ−ＣＳＦよりはるかに強く、ＷＢＣ産生を誘導した。

【実施例3】

【0543】

本実施例は、変化を導入し、Ｏ結合型グリコシル化部位、すなわち、セリンまたはトレオニン残基を、Ｇ−ＣＳＦの１７５アミノ酸の野生型配列またはその改変された任意の変異体中の好ましくはプロリン含有部位に導入する、アミノ酸配列の変異を開示する。参照として、１７５アミノ酸の野生型Ｇ−ＣＳＦ配列を以下に示す。
MTPLGPASSLP QSFLLKCLEQ VRKIQGDGAA LQEKLCA
TYKLCHPEEL VLLGHSLGIP WAPLSSCPSQ ALQLAGCLSQ
LHSGLFLYQG LLQALEGISP ELGPTLDTLQ LDVADFATTI
WQQMEELGMA PALQPTQGAM PAFASAFQRR AGGVLVASHL
QSFLEVSYRV LRHLAQP (配列番号：１４３)

【0544】

３．１ Ｎ末端変異
Ｎ末端変異体では、野生型Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ^１ＴＰＬＧＰＡ（配列番号）のＮ末端が、Ｍ^１Ｘ_ｎＴＰＬＧＰＡまたはＭ^１Ｂ_ｏＰＺ_ｍＸ_ｎＴＰＬＧＰＡで置換されている。ｎ、ｏ、およびｍは０〜３から選択される整数であり、Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの少なくとも１つはＴｈｒまたはＳｅｒである。Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの複数がＴｈｒまたはＳｅｒであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。上付き文字がある場合は、それらは、野生型の出発配列におけるアミノ酸位置を示す。

【0545】

好ましい例としては、以下のものが挙げられる。

【数28】

【数29】

【0546】

３．２ 内部の変異部位１
これらの変異体では、野生型ＧＣＳＦ、Ｍ^１ＴＰＬＧＰ（配列番号８）のＮ末端が、Ｍ^１ＴＰＸ_ｎＢ_ｏＯ_ｒＰで置換されている。式中、ｎ、ｏ、およびｒは、０〜３から選択される整数であり、Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの少なくとも１つはＴｈｒまたはＳｅｒである。Ｘ、Ｂ、およびＯのうちの複数がＴｈｒまたはＳｅｒであるとき、これらの部分のアイデンティティはそれぞれ独立に選択される。上付き文字がある場合は、それらは、野生型の出発配列におけるアミノ酸位置を示す。

【0547】

好ましい変異体としては、以下のものが挙げられる。

【数30】

【0548】

３．３ 内部の変異部位２
この変異は、Ｇ−ＣＳＦ活性を維持するために作られる。これらの変異体では、Ｈ^５３を含有するアミノ酸配列、すなわち、ＬＧＨ^５３ＳＬＧＩ（配列番号：１９１）が、ＬＧＨ^５３Ｂ_ｏＬＧＩ（式中、ΘはＨ、Ｓ、Ｒ、Ｅ、またはＹであり、Ｂは、ＴｈｒまたはＳｅｒである）に変異している。

【0549】

好ましい例としては、以下のものが挙げられる。

【数31】

【0550】

３．４ 内部の変異部位３
このタイプの変異体では、Ｐ^１２９の周辺のアミノ酸配列、すなわち、Ｐ^１２９ＡＬＱＰＴ（配列番号：１９２）が、Ｐ^１２９Ｚ_ｍＪ_ｑＯ_ｒＸ_ｎＰＴ（式中、Ｚ、Ｊ、Ｏ、およびＸは、ＴｈｒまたはＳｅｒからそれぞれ独立に選択され、ｍ、ｑ、ｒ、およびｎは、０〜３から選択される整数である）に変異している。

【0551】

好ましい例としては、以下のものが挙げられる。

【数32】

【0552】

３．５ 内部の変異部位４
このタイプの変異体では、Ｐ^６１を含むアミノ酸配列、すなわち、ＬＧＩＰＷＡＰ^６１ＬＳＳＣ（配列番号：２１３）が、ＰＺ_ｍＵ_ｓＪ_ｑＰ^６１Ｏ_ｒＸ_ｎＢ_ｏＣ（式中、ｍ、ｓ、ｑ、ｒ、ｎ、およびｏは、０〜３から選択される整数であり、Ｚ、Ｊ、Ｏ、Ｘ、Ｂ、およびＵは、ＴｈｒまたはＳｅｒとして選択される）で置き換えられている。また、Ｚ、Ｊ、Ｏ、Ｘ、Ｂ、およびＵのうちの複数がＴｈｒまたはＳｅｒであるとき、各々はそれぞれ独立に選択される。

【0553】

好ましい例としては、以下のものが挙げられる。

【数33】

【数34】

【0554】

３．６ Ｃ末端変異
このタイプの変異体では、野生型Ｇ−ＣＳＦ、すなわち、ＲＨＬＡＱＰ^１７５（配列番号：１９３）が、θ_ａＧ_ｐＪ_ｑＯ_ｒＰ^１７５Ｘ_ｎＢ_ｏＺ_ｍＵ_ｓΨ_ｔ（式中、ａ、ｐ、ｑ、ｒ、ｎ、ｏ、ｍ、ｓ、およびｔは、０〜３から選択される整数であり、Ｚ、Ｕ、Ｏ、Ｊ、Ｇ、θ、Ｂ、およびＸのうちの少なくとも１つはＴｈｒまたはＳｅｒであり、Ｚ、Ｕ、Ｏ、Ｊ、Ｇ、θ、Ｂ、およびＸのうちの複数がＴｈｒまたはＳｅｒであるとき、それらはそれぞれ独立に選択される）で置き換えられている。θは場合によってはＲであり、Ｇは場合によってはＨである。記号Ψは、任意の非荷電アミノ酸残基またはＥ（グルタミン酸）を表す。

【0555】

好ましい例としては、以下のものが挙げられる。

【数35】

【0556】

３．７ Ｐ^１３３の周囲の内部変異
追加のＧ−ＣＳＦ変異体としては、アミノ酸Ｐ^１３３の周囲の内部変異を有するものが挙げられる。例としては、以下のものが挙げられる。

【数36】

【実施例4】

【0557】

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列中の変異により、Ｏ結合型グリコシル化のための追加の部位を導入して、本発明の方法によりタンパク質をこれらの部位で修飾できるようにすることができる。本実施例は、本発明の選択された代表的な変異体を説明する。
４．１ Ｇ−ＣＳＦ（野生型１７８ａａ変異体）

【数37】

（配列番号１４１）
４．２ Ｇ−ＣＳＦ（野生型１７５ａａ変異体）

【数38】

（配列番号１４３）
４．９ Ｇ−ＣＳＦ変異体１（アミノ末端変異）

【数39】

（配列番号：１９５）
４．１０ Ｇ−ＣＳＦ変異体２（アミノ末端変異）

【数40】

（配列番号：１５３）
４．１１ Ｇ−ＣＳＦ変異体３（アミノ末端変異）

【数41】

（配列番号：１５４）
４．１２ Ｇ−ＣＳＦ変異体４（部位１）

【数42】

（配列番号：１５５）
４．１３ Ｇ−ＣＳＦ変異体５（部位３）

【数43】

（配列番号：１５６）
４．１４ Ｇ−ＣＳＦ変異体６（部位４）

【数44】

（配列番号：１５７）

【実施例5】

【0558】

ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦのグリコＰＥＧ化
５ａ．アシアロ−顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の調製
ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ_２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過機で５００μＬに濃縮した。その溶液を、３００ｍＵ／ｍＬのノイラミニダーゼＩＩ（ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））とともに、３２℃で１６時間インキュベートした。反応を観察するために、反応物を少量分取して適切な緩衝液で希釈し、ゲルＩＥＦを実施した。次に、反応混合物を予め洗浄したＮ−（ｐ−アミノフェニル）オキサミド酸−アガロースコンジュゲートに加え（反応体積８００μＬ／ｍＬ）、洗浄したビーズを４℃で２４時間、穏やかに回転させた。混合物を１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を集めた。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で３回、０．４ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で１回、０．２ｍＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で１回、ビーズを洗浄し、上清をすべて集めてためた。上清を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３に対して、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３に対してさらに２回、４℃で透析した。次に、透析した溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ２０遠心ろ過機を用いて濃縮し、−２０℃で保管した。ゲルＩＥＦのための条件は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従って実施した。天然のＧ−ＣＳＦおよび脱シアル酸されたＧ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって解析した。

【0559】

５ｂ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，３）−シアリル−ＰＥＧの調製
脱シアル酸されたＧ−ＣＳＦを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ ＮａＮ_３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ３Ｇａｌ１とともに、３２℃で２日間インキュベートした。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって解析した。

【0560】

５ｃ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，８）−シアリル−ＰＥＧの調製
α２，３−シアル酸付加Ｏ結合型グリカンを含有する、ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＣＳＴ−ＩＩとともに、３２℃で２日間インキュベートした。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって解析した。

【0561】

５ｄ．Ｇ−ＣＳＦ−（α２，６）−シアリル−ＰＥＧの調製
Ｏ結合型ＧａｌＮａｃのみを含有するＧ−ＣＳＦを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ_３、ｐＨ７．２中に２．５ｍｇ／ｍＬで溶解させた。その溶液を、１ｍＭのＣＭＰ−シアル酸−ＰＥＧおよび０．１Ｕ／ｍＬのＳＴ６ＧａｌＮａｃＩまたはＩＩとともに、３２℃で２日間インキュベートした。シアル酸−ＰＥＧの組込みを観察するために、反応物の少量の分取物にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−蛍光リガンドを加えた。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分析カラムでゲルろ過することにより、ペプチドに取り込まれた標識を遊離の標識から分離した。インライン蛍光検出器を用いてペプチド中への蛍光標識の取込みを定量した。２日後、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を用いてＴｏｓｏ Ｈａａｓ Ｇ３０００ＳＷ分離カラムを使用し、紫外線吸収に基づいて画分を回収して、反応混合物を精製した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって提供される手順および試薬に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＥＦ解析を用いて、反応生成物を解析した。天然のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦのサンプルを水に対して透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって解析した。

【0562】

ＣＨＯ細胞で産生されたＧ−ＣＳＦを、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）シアリダーゼで処理し、次に、スーパーデックス７５でのサイズ排除によって精製し、ＳＴ３ Ｇａｌ１またはＳＴ３Ｇａｌ２、次いで、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ２０Ｋｄａで処理した。得られた分子をイオン交換およびゲルろ過によって精製し、また、ＳＤＳ ＰＡＧＥによる解析によって、ＰＥＧ化が完了していることを明らかにした。これは、Ｏ−結合型グリカンのグリコＰＥＧ化を初めて実証したものであった。

【実施例6】

【0563】

組換えＧＣＳＦの発現、リフォールディング、および精製
・遠心分離によって細胞を回収し、上清を廃棄する。様々な培地上での増殖の結果を図９に示す。
・１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（１０ｍｌ／ｇで使用、溶解緩衝液）中に細胞沈殿物を再懸濁する。
・細胞を微細な流体にする（Ｍｉｃｒｏｌｌｕｉｄｉｚｅ）（フレンチプレスも同様に使える）。
・５，０００ＲＰＭ、４℃で３０分、遠心分離する。上清を廃棄する。
・沈殿物を溶解緩衝液中に再懸濁させ、上記と同じように遠心分離する。
・２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＴＸ−１００、１％ ＮａＤＯＣ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中でＩＢを洗浄する。ピペッティングおよびボルテックス処理によって、沈殿物を再懸濁させる。５，０００ＲＰＭ、４℃で１５分、遠心分離する。このステップをもう１回繰り返す（合計２回洗浄）。
・２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ中で沈殿物を２回洗浄して界面活性剤を除去する。上記と同じように遠心分離する。
・沈殿物をｄＨ２Ｏ中に再懸濁して一定量にし、上記と同じように遠心分離する。沈殿物を−２０℃で凍結する。
・ピペットを用いて、６Ｍ塩酸グアニジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１０ｍＭ ＤＴＴ中に２０ｍｇ／ｍｌでＩＢを再懸濁し、続いて、室温で２〜４時間回転させる。
・１４，０００ＲＰＭ、室温で１分間、可溶化したＩＢを遠心分離する。上清を取っておく。
・リフォールディング用緩衝液５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、２４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭを用いて１：２０の比で上清を希釈する。
・ＫＣｌ、０．３ｍＭラウリルマルトシド、０．０５５％ ＰＥＧ３３５０、１ｍＭ ＧＳＨ、０．１Ｍ ＧＳＳＧ、０．５Ｍアルギニン。４℃で一晩、ローテーター上でリフォールディングさせる。
・リフォールディング物を透析用のピアススネークスキン（７ｋＤａ ＭＷＣＯ）に移す。透析緩衝液：２０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ。少なくとも２００倍を超える量に対して、４℃で合計３回透析する。
・透析後、０．４５μＭフィルターに物質を通す。
・透析緩衝液でＳＰ−セファロースカラムを平衡化し、サンプルを添加する。透析緩衝液でカラムを洗浄し、最大１Ｍ ＮａＣｌの塩勾配を有する透析緩衝液で溶出させる。タンパク質は、通常、３００〜４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出される。
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥで物質を検査する（例えば、図１０を参照のこと）。

【実施例7】

【0564】

２つのポットで２種の酵素を用いる方法
以下の実施例は、各中間生成物が次のステップで使用される前に精製される、２つの連続したステップでのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を例示する。

【0565】

７ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２による、Ｇ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの調製（ｐＨ６．２）
ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ ５Ｋ）を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液３．２ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ（９６０μｇ）を濃縮し、次いで、１ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ_３）に溶解した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（４０μＬ、４ｍＭ）を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。

【0566】

２４時間後、ＭＡＬＤＩは、反応が完了したことを示した。ＳＥＣ（スーパーデックス７５およびスーパーデックス２００）およびＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）からなる溶出緩衝液を用いるＨＰＬＣ精製に直接反応混合物をかけた。回収したピークのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ ５ＫＤａ ＭＷＣＯフィルターを用いて約１５０μＬに濃縮し、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ４．９および０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）を用いて体積を１ｍｌに調整した。最終タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬ（Ａ_２８０）、収率は１００％であった。サンプルを４℃で保存した。

【0567】

７ｂ．精製されたＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）、およびマウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−ＴＩ（ｐＨ６．２）を用いたＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
タンパク質１ｍｇを含有するＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ溶液を２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ_３）中に入れてバッファー交換し、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（５ｍｇ、０．２５ｕｍｏｌ）を加えた。溶解後、ＭｎＣｌ_２（１００ｍｃＬ、１００ｍＭ溶液）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１００ｍｃＬ、マウス酵素）を加え、反応混合物を３２℃で３日間、ゆっくりと揺り動かした。限外ろ過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって反応混合物を濃縮し、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．９）で１回バッファー交換し、次に、濃縮して全体積を１ｍＬにした。次に、保持時間１３〜１８分のＳＰ−セファロース（Ａ：２５ｍＭ ＮａＯＡｃ＋０．００５％ｔｗｅｅｎ−８０ ｐＨ４．５；Ｂ：２５ｍＭ ＮａＯＡｃ＋０．００５％ｔｗｅｅｎ−８０ ｐＨ４．５＋２Ｍ ＮａＣｌ）、保持時間８．６分のＳＥＣ（スーパーデックス７５；ＰＢＳ−ｐＨ７．２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０）（スーパーデックス７５、流速１ｍｌ／分）を用いて、生成物を精製した。所望の画分を回収し、濃縮して０．５ｍＬにし、４℃で保存した。

【実施例8】

【0568】

酵素の同時添加によってＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
以下の実施例は、酵素の同時添加によるワンポットでのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧの調製を例示する。

【0569】

８ａ．マウスＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを用いたワンポットの方法（ｐＨ６．０）
限外ろ過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって、Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍＬの生成物調製緩衝液中に溶解した９６０μｇのタンパク質）を０．５ｍｌに濃縮し、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ_３）で溶解して、全体積を約１ｍＬにし、またはタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２１μｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、８０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）（６ｍｇ、０．３μｍｏｌ）、ならびにマウス酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（１２０μＬ）および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（５０Ｌ）を加えた。３２℃で４８時間、溶液を揺り動かし、標準のクロマトグラフィー条件を用いてＳＰ−セファロースで精製した。合計０．５ｍｇのタンパク質（Ａ_２８０）が得られ、全収率約５０％であった。ＭＡＬＤＩおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥの双方を用いた解析によって、生成物の構造を確認した。

【0570】

８ｂ．ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉを用いたワンポットの方法（ｐＨ６．０）
１４．４ｍｇのＧ−ＣＳＦを濃縮して最終体積を３ｍＬにし、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０、０．０５％ＮａＮ_３、０．００４％Ｔｗｅｅｎ８０）でバッファー交換し、また、体積を１３ｍＬに調整した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（９０ｍｇ、１５０μモル）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（０．５９Ｕ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（９０ｍｇ）、ニワトリＳＴ６ＧａｌＮＡｃ−Ｉ（０．４４Ｕ）、および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（６００ｍｃＬ）を加えた。得られた混合物を室温で６０時間放置した。次に、ＵＦ（ＭＷＣＯ ５Ｋ）および遠心分離によって、反応混合物を濃縮した。残留物（約２ｍＬ）を２５ｍＭ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解させ、再度濃縮して最終体積を５ｍＬにした。ＳＰ−セファロースを約１０〜２３分、ＳＥＣ（スーパーデックス７５、１７分、流速０．５ｍｌ／分）、さらにＳＥＣ（スーパーデックス２００、２３分、流速０．５ｍｌ／分）を用いてサンプルを精製して、３．６ｍｇ（全収率２５％）のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（Ａ_２８０およびＢＣＡ法）を得た。

【実施例9】

【0571】

酵素の連続添加によってＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
以下の実施例は、酵素の連続添加によってワンポットでＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するための方法を例示する。

【0572】

９．１．ＧａｌＮＡｃ−Ｇ−ＣＳＦから出発
ａ．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いた、Ｇ−ＣＳＦおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ（ｐＨ６．２）の調製
ＵＦフィルター（ＭＷＣＯ ５Ｋ）を用いた限外ろ過によって、容器に入れた緩衝液３．２ｍＬ中のＧ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ）を濃縮し、次いで、１ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．２、０．００５％ＮａＮ_３）に溶解した。次に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ、９．２４ｍＭ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（４０μＬ、０．０４Ｕ）、および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（４０μＬ、４ｍＭ）を加えて、得られた溶液を室温でインキュベートした。

【0573】

ｂ．Ｇ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ガラクトース、ＳＡ−ＰＥＧ−２０Ｋダルトン、および適切な酵素からのＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧの調製
ＵＤＰ−ガラクトース（４ｍｇ、６．５μモル）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ（３２０μＬ、１６０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０ＫＤａ（８ｍｇ、０．４μモル）、ＳＴ３Ｇａｌ２（８０μＬ、０．０７ｍＵ）および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（８０μＬ）を、上記のステップａから得られる、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）１．５ｍｌ中のＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃの粗製な反応混合物（１．５ｍｇ）に直接加えた。得られた混合物を３２℃で６０時間インキュベートした。反応混合物を遠心分離し、限外ろ過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって０．２ｍＬに濃縮し、次に、２５ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）で溶解して最終体積を１ｍＬにした。ＳＰ−セファロース（保持時間１０〜１５分）を用いて生成物を精製し、スピンフィルター（ＭＷＣＯ ５Ｋ）を用いてピーク画分を濃縮し、さらにＳＥＣ（スーパーデックス７５、保持時間１０．２分）を用いて残留物を精製した。スピンフィルター（ＭＷＣＯ ５Ｋ）を用いて濃縮した後、ＰＢＳ、２．５％マンニトール、０．００５％ポリソルベート、ｐＨ６．５の調製緩衝液によって、タンパク質を１ｍＬに希釈し、タンパク質濃度が１ｍＬ当たり８５０ｍｃｇのタンパク質となるように調製した（Ａ_２８０）。全収率は５５％であった。

【実施例10】

【0574】

酵素の同時添加によってＧ−ＣＳＦ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧを作製するためのワンポットの方法
ａ．Ｇ−ＣＳＦからの出発
限外ろ過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって、Ｇ−ＣＳＦ（９６０ｍｃｇ、３．２ｍｌ）を濃縮し、２５ｍＭ Ｍｅｓ緩衝液（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ_３）で溶解した。Ｇ−ＣＳＦ溶液の全体積は約１ｍｇ／ｍｌとした。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（６ｍｇ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（８０μＬ、〜８０μＵ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（６ｍｇ）、コア１ ＧａｌＴ（１６０μＬ、８０μＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（６ｍｇ）、およびα２，３−（Ｏ）−シアリルトランスフェラーゼ（１６０μＬ、１２０μＵ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（４０μＬ）を加えた。得られた混合物を３２℃で４８時間インキュベートした。後述するように、ＩＥＸおよびＳＥＣを用いて精製を実施した。限外ろ過（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって、生成物を含有する得られた画分を濃縮し、緩衝液で体積を約１ｍＬに調整した。タンパク質濃度は、Ａ_２８０により０．３９２ｍｇ／ｍｌと測定され、Ｇ−ＣＳＦからの全収率は４０％となった。

【実施例11】

【0575】

以下の実施例は、多量のグリコＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを得るための代替の酵素的方法を例示する。

【0576】

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）タンパク質を大腸菌で発現させ、実施例Ｘ（上記）で開示したようにして封入体からリフォールディングさせた。

【0577】

１１ａ．ＧａｌＮＡｃの添加による反応の活性化（ｐｒｉｍｉｎｇ）
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの存在下でリフォールディングされたＧａｌＮＡｃＴ２を用いて、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２を含有するｐＨ６．５の５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液中、３３℃でＧ−ＣＳＦのＧａｌＮＡｃ化を実施した。このステップは、最大量のＧＣＳＦ−ＰＥＧを短時間で非常に効率的に生成するようにＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼとシアリルトランスフェラーゼの双方が後続のステップで共に作用することを可能にする反応を活性化する。

【0578】

１１ｂ．ペグ化の方法
活性化反応にＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）およびＳＴ６ＧａｌＮａｃＩ（ニワトリまたはヒト）を直接加えることによって、ＧａｌＮＡｃ化の２（＋／−１）時間後にＰＥＧ化を開始した。このステップは、シアリルトランスフェラーゼに対する基質（ＧＣＳＦ−Ｏ−ＧａｌＮＡｃ）を生成して、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよび他の反応成分から最初にＧＣＳＦ−Ｏ−ＧａｌＮＡｃを精製する（例えば、上記の実施例Ｘを参照のこと）２ステップの反応で実現し得る期間より短時間でより速く反応を推進する。さらに、活性化されたワンポット反応は、すべての成分が同時に加えられるワンポット反応よりも、より高収率の生成物を生成する。

【0579】

実際には、いくつかのタイプのワンポット反応を比較したところ、すべての成分を同時に加え、２３時間インキュベートしたとき、生成されたＧＣＳＦ−ＰＥＧは７７％であった。一方、ＰＥＧ化反応に必要とされる酵素を添加する前に、前述した２時間のＧａｌＮＡｃ化ステップを行ったとき、生成物の収率は８５％であった。したがって、反応成分を連続的に添加すると、すべての反応成分を同時に加えたときに得られるよりも１０％高い収率が得られた。

【実施例12】

【0580】

本実施例は、６種の変異Ｇ−ＣＳＦタンパク質のＯ結合型ＧａｌＮＡｃ化の結果を説明する。

【0581】

１２．１ 変異Ｇ−ＣＳＦタンパク質のＧａｌＮＡｃ化
変異Ｇ−ＣＳＦタンパク質のすべての配列を以下に表にする。これらのタンパク質を用いて、Ｏ結合型グリコシル化を調べた。天然Ｇ−ＣＳＦのグリコシル化と同じ条件下で、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶かしたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとともに、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（ＢＶ）をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用した。ＭＡＬＤＩを使用して反応を観察した。タンパク質の分子量増加を測定することにより、ＧａｌＮＡｃの付加数が得られた。ＧａｌＮＡｃが１つ付加した場合、分子量の増加は２０３Ｄａになるはずである。本発明者らは、ＭＡＬＤＩの結果に基づき、変異Ｇ−ＣＳＦ−２、３、４は、１つのＧａｌＮＡｃを受け入れること、変異Ｇ−ＣＳＦ−５でもいくらかの付加が観察されること、また、変異Ｇ−ＣＳＦ−１は２つのＧａｌＮＡｃを受け入れて、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（ＧａｌＮＡｃ）_２（分子量は１８９６５ダルトンから１９３６９ダルトンに増加）を形成することを発見した。

【0582】

【表4】

【0583】

ペプチドマッピングおよびＮ末端解析によって、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ）_２のグリコシル化部位を決定した。Ｇｌｕ Ｃ消化を用いたペプチドマッピングでは、Ｇ−１＋ＧａｌＮＡｃのピークが存在し、１つのＧａｌＮＡｃがＧ−１配列に付加されたことを示した。Ｎ末端のエドマン分解（ｄｅｇｄａｔｉｏｎ）法による解析は、通常のＴが失われていることを示し、ＧａｌＮＡｃがＴ残基上に付加されていることを示唆した。

【0584】

１２．２ 変異Ｇ−ＣＳＦ配列のグリコＰＥＧ化
ａ．変異Ｇ−ＣＳＦ配列のグリコＰＥＧ化およびＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦのグリコＰＥＧ化に対する緩衝液の影響
５種類の変異体のグリコＰＥＧ化（２０Ｋ）の調査を行った。３種類の酵素／３種類のヌクレオチドの系を用いて、グリコＰＥＧ化を行った。２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶かした（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２／ＵＤＰ−Ｇａｌ／コアＧａｌＴ／ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ／Ｏ−シアリルトランスフェラーゼ）。すべての変異体をモノグリコＰＥＧ化することができた。この条件では、測定できるほどのジＰＥＧ化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色によって検出されなかった。

【0585】

ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦは２つのＧａｌＮＡｃを受け入れるため、この変異体は、理論的には２つのＰＥＧを受け取るはずである。したがって、本発明者らは、出発原料としてのＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ化に対する緩衝液の影響を調査した。４種の異なる緩衝液（１．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液；２．２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）；３．５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．０）；４．１Ｍ ＨＥＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４））をこの反応について調査した。試験した緩衝液系のすべてでＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦをＰＥＧ化できることが判明した。しかし、モノＰＥＧ化生成物がやはり主要生成物であった。１Ｍ ＭＥＳおよび１Ｍ ＨＥＰＳ緩衝液を使用した場合は、ジＰＥＧ化生成物がいくらか形成され、高濃度の緩衝液がグリコＰＥＧ化を促進することを示唆した。

【0586】

ｂ．ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ）_２およびＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−ＳＡ−ＰＥＧ）_２を形成させることによるグリコＰＥＧ化効率の比較
様々な酵素によって触媒される変異Ｇ−ＣＳＦ−１のグリコＰＥＧ化効率を調べるために、２種類の酵素（Ｓｔ_６ＧａｌＮＡｃＩおよびＯ−シアリルトランスフェラーゼ）をシアリルＰＥＧ化について調査した。したがって、シアリルＰＥＧ化するために、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦをＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（ＧａｌＮＡｃ）_２およびＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）_２に変換した。前者をＣＭＰ−ＳＡ−ｌｙｓ−ＰＥＧ（２０Ｋ）／Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＩで処理し、後者をＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）／Ｏ−シアリルトランスフェラーゼで処理した。いずれの反応も、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で実施した。ＳＤＳ−ＰａｇｅゲルにおいてＰＥＧ化効率を確認することができた。２種の酵素は、試験した条件下でのＣＭＰ−ＳＡ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）によるこのタンパク質のグリコＰＥＧ化において非常に類似しているようであった。

【0587】

ｃ．高濃度のタンパク質により、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ））_２が主要生成物として形成された
前述したように、グリコＰＥＧ化に対する酵素および緩衝液の影響を調査した後で、グリコＰＥＧ化酵素としてＳＴ_６ＧａｌＮＡｃＩを用いて、高濃度の緩衝液の因子と組み合わせることによって、ＰＥＧ化に対するタンパク質濃度の影響を調査した。したがって、本発明者らは、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦをグリコＰＥＧ化するために、１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中での反応に対して８〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を用いて、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ／ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２およびＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ）／Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＩを加えた。この結果により、この条件下では所望のジＰＥＧ化生成物が主要生成物となることが示唆された。より多くのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）および酵素を加えることによって、９０％を超える変換も実現した。ＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ生成物、すなわち、ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ（（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０ＫＤａ））_２をＳＰ−セファロースおよびスーパーデックス２００を用いたＳＥＣ精製を併用することによって精製した。

【0588】

１２．３．ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ）_２の細胞増殖活性
ＮＦＳ−６０細胞系統およびＴｆ−１細胞系統を用いたＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ）_２の細胞増殖アッセイを実施した。０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度でこのアッセイを実施した。ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ））_２は、このアッセイでは活性であった。

【0589】

１２．４ 実験の詳細
１２．４ａ 変異Ｇ−ＣＳＦのＧａｌＮＡｃ化の一般的手順
ある体積の変異Ｇ−ＣＳＦ溶液（１００ｕｇのタンパク質）をＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ＋０．００５％ＮａＮ_３、ｐＨ６．０）でバッファー交換した。最終体積を１００ｕｇ／１００ｕｌに調整した。５ｕｌの１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（１ｍＵ）をこの溶液に加えた。ＭＡＬＤＩまたはＱＴＯＦ解析に必要とされる一定期間、室温で、得られた混合物を揺り動かした。

【0590】

１２．４ｂ ＭＡＰＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ）_２の調製
ＭＡＰＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ ５．４ｍｇ（ＫＪ−６７５−１５９、０．１８ｍｇ／ｍｌ、０．０５３ｕｍｏｌ）をＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ＋０．００５％ＮａＮ_３、ｐＨ６．０）でバッファー交換した。最終体積を５．４ｍｌに調整した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（５ｍｇ、０．１５ｕｍｏｌ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２ ０．２５ｍｌ、およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（１．０Ｕ／ｍｌ、５０ｕｌ）をこの溶液に加えた。３２℃で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。Ｍ^＋（ＭＡＬＤＩ）：１９３６４（ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ）_２）および１８９５１（ＭＶＰＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ）。

【0591】

１２．４ｃ ワンポット反応により変異Ｇ−ＣＳＦ配列をグリコＰＥＧ化する一般的手順
１００ｕｌの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０＋０．００５％ＮａＮ_３）中で、変異Ｇ−ＣＳＦ１００ｕｇ（変異Ｇ−ＣＳＦ−１、２、３、４、５）を、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（０．６ｍｇ、０．９２３ｕｍｏｌ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（２０ｕｌ、８ｍＵ）、ＵＤＰ−Ｇａｌ（０．６ｍｇ、０．９２３ｕｍｏｌ）、コア１ Ｇａｌ Ｔ（２０ｕｌ、１０ｍＵ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（１ｍｇ、０．０５ｕｍｏｌ）、Ｓｔ３ＧａｌＩＩ（２０ｕｌ、２８ｍＵ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２ ３ｕｌと混合した。室温で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。グリコＰＥＧ化に続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【0592】

１２．４ｄ 様々な緩衝液系における変異Ｇ−ＣＳＦ−１グリコＰＥＧ化（２０ＫＤａ）の比較
ＧａｌＮＡｃ_２−ＭＡＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ（５４ｕｇ）を、以下の４種の緩衝液系（１．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）；２．２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）；３．５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）；４．１Ｍ ＨＥＰＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にバッファー交換した。次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（２１６ｕｇ）ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ（ＢＶ、１Ｕ／ｍＬ、２．５ｕｌ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２ ２．５ｕｌを加えた。室温で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてこの反応を追跡した。

【0593】

１２．４ｅ ＳＴ_６ＧａｌＮＡｃ_ＩおよびＯ−シアリルトランスフェラーゼ（Ｗａｎｇ７８７−２９および７８７−４０）の使用によるＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦのグリコＰＥＧ化の比較
１２．４ｅ１ Ｓｔ６ＧａｌＮＡｃＩの使用
第１のステップ：３５００ｇで限外ろ過（ＭＷＣＯ５Ｋ）することによって３０ｍｌのＫＪ−６７５−１５９溶液（０．１８ｍｇ／ｍｌ、タンパク質総量５．４ｍｇ）を濃縮し、次いで、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）でバッファー交換した。プラスチック製チューブ中で最終体積を５．４ｍｌに調整した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（１．０Ｕ／ｍｌ、５０ｕｌ）を加え、続いて、０．２５ｍＬのＭｎＣｌ_２を添加した。３２℃で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。ＭＡＬＤＩにより、反応が完了したことが示唆された。この反応混合物をＵＦ（ＭＷＣＯ５Ｋ）によって濃縮し、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液で５ｍｌに希釈し、次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（２×２５ｍｇ）、ＳＴ_６ＧａｌＮＡｃ_Ｉ（ＢＶ、ｌＵ／ｍｌ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２ ０．２５ｍｌを加えた。３２℃で一晩、得られた混合物を揺り動かした。この反応に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。

【0594】

１２．４ｅ２ Ｏ−シリルトランスフェラーゼ（Ｏ−ｓｉｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｓｔ_３Ｇａｌ_ＩＩ）の使用
２００ｕｌの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶かした２００ｕｇのＧａｌＮＡｃ_２−ＭＡＴＰ−Ｇ−ＣＳＦを、ＵＤＰ−Ｇａｌ ０．６ｍｇおよびコア ＧａｌＴ（０．２Ｕ／ｍｌ、１０ｕｌ）ならびに１０ｕｌの１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２と混合した。３２℃で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。この反応混合物をＵＦ（ＭＷＣＯ ５Ｋ）によって濃縮し、２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液で２００ｕｌに希釈した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（８００ｕｇ）、Ｓｔ_３ＧａｌＩＩ（１．０Ｕ／ｍｌ、１０ｕｌ））、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２ １０ｕｌを加えた。室温で２４時間、得られた混合物を揺り動かした。３２℃で一晩、得られた混合物を揺り動かした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてこの反応を追跡した。

【0595】

１２．４ｆ ＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ）_２（Ｗａｎｇ７８７−４２）のグリコＰＥＧ化に由来するＭＡＰＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ））_２
ＭＡＰＴＰ−Ｇ−ＣＳＦ溶液（５４０ｕｇ）を濃縮して、１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）でバッファー交換し、５０ｕｌに調整した。次いで、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１００ｕｇ、０．１５ｕｍｏｌ、５当量）、ＧａｌＮＡｃＴ_２（５．０Ｕ／ｍｌ、５ｕｌ）および１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（５ｕｌ）を加えた。室温で一晩、得られた混合物を揺り動かした。次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（２．１６ｍｇ、０．１０８ｕｍｏｌ）およびＳｔ_６ＧａｌＮＡｃＩ（１．０Ｕ／ｍｌ、５０ｕｌ）を加えた。室温で６０時間、この溶液を揺り動かした。追加のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ）（２．１６ｍｇ、０．１０８ｕｍｏｌ）およびＳｔ６ＧａｌＮＡｃＩ（１．０Ｕ／ｍｌ、５０ｕｌ）を加え、次いで、室温で２４時間ゆっくり回転させた。反応混合物を緩衝液Ａ（２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ４．５）でバッファー交換し、次に、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＳＰ−ＦＦ（５ｍＬ）カラムで、１００％Ａの定組成溶離を１０分間、続いて、１００％Ａから２０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート８０、ｐＨ４．５）までの直線濃度勾配溶離を２０分間にわたって流速３ｍＬ／分で行い、精製した。保持時間１７分でのピーク画分をため、０．５ｍｌに濃縮し、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１６×６００ｍｍ、３４μｍ）で、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ５．０、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を用いて、流速０．４ｍＬ／分でさらにそれを精製した。保持時間１６０分の生成物画分をため、濃縮して３０ｕｇのＭＡＰＴ−Ｇ−ＣＳＦ−（ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０Ｋ））_２（ＢＣＡ）を得た。収率は最適化されなかった。

【0596】

１２．４ｇ Ｇ−ＣＳＦ変異体の配列
変異Ｇ−ＣＳＦ−１

【数45】

【数46】

（配列番号：１５４）
変異Ｇ−ＣＳＦ−２

【数47】

（配列番号：１５６）
変異Ｇ−ＣＳＦ−３

【数48】

（配列番号：１５８）
変異Ｇ−ＣＳＦ−４（Ｃ末端タグ）

【数49】

（配列番号：１５０）
変異Ｇ−ＣＳＦ−５（Ｎ末端ＭＩＡＴＰ）

【数50】

（配列番号：１９４）
変異Ｇ−ＣＳＦ−６（１７７Ｍｅｒ）

【数51】

（配列番号：１４１）
大腸菌で発現させたヒト組換Ｇ−ＣＳＦ

【数52】

（配列番号：１９５）

【実施例13】

【0597】

以下の実施例は、グリコＰＥＧ化されたｈＧＨタンパク質の調製を例示する。野生型ｈＧＨには天然のグリコシル化部位が無く、したがって、変異ｈＧＨタンパク質に新規なＯ−グリコシル化部位を人工的に作り出し、次いで、それをＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼでグリコシル化し、変異部位でシアリルＰＥＧ化した。アミノ末端またはタンパク質分子のループ領域にＯ−グリコシル化部位を組み込むように５種類の変異ｈＧＨタンパク質を設計した。５種の変異タンパク質を作製し、それぞれのｈＧＨ活性をＮｂ２−１１細胞増殖アッセイで試験した。

【0598】

１３．１ 変異ｈＧＨアミノ酸配列
Ｎ末端メチオニンを有する１９２アミノ酸の脳下垂体由来野生型ｈＧＨ

【数53】

（配列番号：１５９）
Ｎ末端メチオニンを欠いた１９１アミノ酸の脳下垂体由来野生型ｈＧＨ

【数54】

（配列番号：１６０）
ＭＶＴＰ変異体

【数55】

（配列番号：１９６）
ＰＴＯＧＡＭＰ変異体

【数56】

（配列番号：１９７）
ＴＴＴ変異体

【数57】

（配列番号：１９８）
ＭＡＰＴ変異体

【数58】

（配列番号：１９９）
ＮＴＧ変異体

【数59】

（配列番号：２００）

【0599】

グリコシルトランスフェラーゼＧａｌＮＡｃＴ２の基質の役割を果たす能力について、４種のｈＧＨ変異体を試験した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析により、４種のｈＧＨ変異体のうち、２種はＧａｌＮＡｃＴ２によってグリコシル化されることが判明した。

【0600】

１３．２ ｈＧＨ−（ＴＴＴ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａの調製
ＴＴＴ変異体の場合、ＧａｌＮＡｃを付加すると、非グリコシル化種、ならびに１−ＧａｌＮＡｃおよび２−ＧａｌＮＡｃ種の複合混合物が生じた。ペプチドマッピング実験（トリプシン消化）は、２つのＧａｌＮＡｃがＴＴＴ変異を含むＴ１２ペプチド（Ｌ１２９〜Ｋ１４１）に付加されていることを示した。ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより、（Ｍ）ＶＴＰ変異体では、ごく微量のＧａｌＮＡｃしか付加していないことが示された。

【0601】

ｈＧＨ−ＴＴＴ−変異体（４．０ｍＬ、６．０ｍｇ、０．２７マイクロモル）を洗浄用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）１５ｍｌで２回、反応用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）で１回、バッファー交換し、次に、セントリコン遠心ろ過機（５ＫＤａ ＭＷＣＯ）を用いて２．０ｍＬに濃縮した。

【0602】

ｈＧＨ−ＴＴＴ変異体をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１．３８マイクロモル、０．９０ｍｇ）およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（０．１２ｍＬ、１２０ｍＵ）と混合した。反応物を穏やかに振とうしながら３２℃で１９時間インキュベートした。反応物をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって解析し、ｈＧＨ−ＴＴＴ変異体に対するＧａｌＮＡｃの部分付加を観察した（約４０％）。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０Ｋ（１６ｍｇ、０．５３３マイクロモル）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ（０．３７５ｍＬ、３７５ｍＵ）を反応混合物に加えて全体積を２．８５ｍＬにした。反応物を穏やかに振とうしながら３２℃で２２時間インキュベートした。０時間および２２時間の時点で、反応物をＳＤＳＰＡＧＥによって観察した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって反応の程度を決定した。ＳＰセファロースを用いて生成物ｈＧＨ−（ＴＴＴ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。非常に低い収率の所望のｈＧＨ−（ＴＴＴ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａが観察された。

【0603】

１３．３ ｈＧＨ−（ＰＴＱＧＡＭＰ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａの調製
ＰＴＱＧＡＭＰ変異体は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃＴ２によって容易にグリコシル化され、次に、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩによってグリコＰＥＧ化され、その際、１０ｍｇのスケールで１．４５ｍｇの精製ｈＧＨ−（ＰＴＱＧＡＭＰ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａを生じる。ペプチドマッピング実験（トリプシン消化）により、ＧａｌＮＡｃは、ＰＴＱＧＡＭＰ変異を有するトリプシンＴ１２ペプチド（Ｌ１２９〜Ｋ１４１）上に配置された。

【0604】

ｈＧＨ−ＰＴＱＧＡＭＰ−変異体（４．５５ｍＬ、１０．０ｍｇ、０．４５マイクロモル）を洗浄用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）１５ｍＬで２回、反応用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．０２％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）で１回、バッファー交換し、次に、セントリコン遠心ろ過機（５ＫＤａ ＭＷＣＯ）を用いて３ｍＬに濃縮した。

【0605】

ｈＧＨ−ＰＴＱＧＡＭＰ変異体をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（２．２６マイクロモル、１．４７ｍｇ）およびＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（０．１ｍＬ、１００ｍＵ）と混合した。反応物を穏やかに振とうしながら３２℃で２２時間インキュベートした。反応物をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって解析し、ｈＧＨ−ＰＴＱＧＡＭＰ変異体に対するＧａｌＮＡｃの完全な付加を観察した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０Ｋ（２７ｍｇ、０．９マイクロモル）およびＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１（０．３５０ｍＬ、３５０ｍＵ）を反応混合物に加えて全体積を３．４ｍＬにした。反応物を穏やかに振とうしながら３２℃で２４時間インキュベートした。０時間および１６．５時間の時点で、反応物をＳＤＳＰＡＧＥによって観察した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって反応の程度を決定した。ＳＰセファロースおよびＳＥＣ（スーパーデックス２００）クロマトグラフィーを用いて、生成物ｈＧＨ−（ＰＴＱＧＡＭＰ）−ＧａｌＮＡｃ−ＳＡ−ＰＥＧ−３０ＫＤａを精製し、次いで、調製した。ＭＡＬＤＩ、ペプチドマッピング、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（銀染色）によって最終生成物を解析した。ＢＳＡを標準物質とするＢＣＡ法によりタンパク質を測定した。全単離収量（１．４５ｍｇ）は、タンパク質を基準として１２．５％であった。

【実施例14】

【0606】

本実施例は、本発明のＧＭ−ＣＳＦ ＰＥＧ複合糖質の調製を説明する。

【0607】

１４．１（ＰＥＧ（２０Ｋ）−ＳＡ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ）２−ＧＭ−ＣＳＦおよびＰＥＧ（２０ｋ）−ＳＡ−Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−ＧＭ−ＣＳＦの調製
ＧＭ−ＣＳＦ（１ｍｇ）を２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（１ｍＬ）（ｐＨ６．０、０．００５％ＮａＮ_３）中に溶解し、次いで、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（１ｍｇ）、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ_２（２００μＬ、０．３８Ｕ／ｍＬ、０．０７６Ｕ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（８０μＬ）を加えた。得られた混合物を室温で７２時間インキュベートした。ＭＡＬＤＩにより、ＧａｌＮＡｃ２−ＧＭ−ＣＳＦが形成されていることが示唆された。

【0608】

ＵＤＰ−Ｇａｌ（６ｍｇ、９．８ｍｍｏｌ）、コア−１−Ｇａｌ−Ｔ_１、（０．５Ｕ／ｍＬ、８０μＬ）、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ（２０キロダルトン）（６ｍｇ、０．３μｍｏｌ）、α−（Ｏ）−シアリルトランスフェラーゼ（１Ｕ／ｍＬ、１２０μＬ）、１００ｍＭ ＭｎＣｌ_２（５０μＬ）を加えた。得られた混合物を３２℃で４８時間ゆっくり回転させた。２ｒｐｍで５分間、反応混合物を遠心分離した。タンパク質溶液を取り出した。残存する樹脂状物質を１ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）と混合し、３０秒間揺り動かした。懸濁液を再び濃縮し、これらのタンパク質溶液を混合し、２００ｍｃＬに濃縮した。ＨＰＬＣ精製により、グリコＰＥＧ化されたＧＭ−ＣＳＦが得られた。

【実施例15】

【0609】

インターフェロンα−２と同様のＯ結合型グリコシル化部位を、任意のインターフェロンαタンパク質の対応する同じ位置に組み込むことができる。これは、ＩＦＮ−α−２ｂ配列（１０〜２０アミノ酸長）とともに目的のアミノ酸配列を整列させ、グリコシル化部位を組み込むようにそのアミノ酸配列を改変することによって、実施することができる。任意のアミノ酸を用いた変異、すなわち欠失または挿入を用いてこの部位を作り出すことができる。例示的な変異体は、１０６位のＴ（以下に太字で示す）を中心に、ＩＦＮ−α−２配列のこの領域と可能な限り高い相同性を維持している。どのようにこれが行われているかの例を以下に示す。

【0610】

ＮＣＢＩタンパク質データベースにおけるインターフェロンα類のアライメント

【表5-1】

【表5-2】

【0611】

グリコシル化／グリコＰＥＧ化は、Ｔ^１０６（ＩＦＮ−α−２）で起こる。タンパク質の番号付与は、天然に発現されるプレプロ型のタンパク質リーダー配列の除去後の第１アミノ酸から始まる。

【0612】

この部位を欠いているＩＦＮ−α類にＯ結合型グリコシル化部位を導入するためのインターフェロンα変異

【0613】

【表6-1】

【0614】

【表6-2】

【0615】

上記の表のＧＩ数は、最初の数の１２４４４９以外は、未改変の野生型タンパク質の番号を指す。

【0616】

Ｏ結合型グリコシル化部位は、上記に示した適切なアミノ酸部位にＴまたはＳを配置することによって、任意のインターフェロンαのアイソフォームで作り出すことができる。上記の表で示す置換はＴである。様々なインターフェロンαの型のアミノ酸配列は類似している。ＴまたはＳが、上記に示したアライメント配列中のＰ^１０９（ＩＦＮ−α−２）に対してグリコシル化／グリコＰＥＧ化に適切な位置にある限り、任意のアミノ酸変異、挿入、欠失をこの領域に作製してよい。

【0617】

特定の実施形態に関して本発明を開示してきたが、当業者が本発明の他の実施形態および変形法を本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案し得ることは明らかである。

【0618】

本明細書に引用したすべての特許、特許出願、および他の刊行物は、その全体を参照により組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0619】

【図1】ＮＳＦ−６０細胞増殖アッセイにおいて、未修飾のＧ−ＣＳＦおよびグリコＰＥＧ化された類似体について、ＧＣＳＦ濃度に対して吸光度をプロットしたグラフである。

【図2】放射性ヨウ素標識Ｇ−ＣＳＦおよびそのグリコールＰＥＧ化誘導体を用いてラットでの薬物動態学的研究を行い、時間に対してカウント毎分（ＣＰＭ）をプロットしたグラフである。

【図3】放射性ヨウ素標識Ｇ−ＣＳＦおよびそのグリコールＰＥＧ化誘導体を用いてラットでの薬物動態学的研究を行い、時間に対して血液中のＧ−ＣＳＦ（μｇ／ｍｌ）をプロットしたグラフである。

【図4】未修飾のＧ−ＣＳＦ、ならびに化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦおよびグリコＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦによる、マウスの白血球誘導を示すグラフである。

【図5】ボルトンハンター試薬による放射ヨウ素標識後の凝集アッセイの結果を示すグラフである。

【図6】グリコＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦの加速安定性試験の結果を示すグラフである。

【図7】図６の拡大図である。

【図8】ボルトンハンター放射標識法を用いたラットＩＶのｐＫ調査の結果を示すグラフである（沈殿させた血漿タンパク質）。

【図9】未標識のＧ−ＣＳＦ、ならびに化学的にＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦおよびグリコＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦを用い、ＥＬＩＳＡによって検出した、ラットＩＶのｐＫ調査の結果を示すグラフである。

【図10】本発明で有用である代表的なシアリルトランスフェラーゼを示す表である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図10I】

【図10J】

【図10K】

【図10L】

【図10M】

【図10N】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]