特許 5743903 愛玩動物においてインターフェロン仲介による抗ウイルス活性を増強するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5743903

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月1日

(54)【発明の名称】愛玩動物においてインターフェロン仲介による抗ウイルス活性を増強するための方法

(51)【国際特許分類】

   A23K 1/18 20060101AFI20150611BHJP

   A23K 1/16 20060101ALI20150611BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20150611BHJP

   A61K 31/385 20060101ALI20150611BHJP

【ＦＩ】

   A23K1/18 A

   A23K1/16 302C

   A61P31/12 171

   A61K31/385

【請求項の数】13

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2011-542356(P2011-542356)

(86)(22)【出願日】2009年12月16日

(65)【公表番号】特表2012-511932(P2012-511932A)

(43)【公表日】2012年5月31日

(86)【国際出願番号】US2009068166

(87)【国際公開番号】WO2010077903

(87)【国際公開日】20100708

【審査請求日】2012年11月12日

(31)【優先権主張番号】12/336,024

(32)【優先日】2008年12月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502329223

【氏名又は名称】ヒルズ・ペット・ニュートリシャン・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100080137

【弁理士】

【氏名又は名称】千葉 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100096013

【弁理士】

【氏名又は名称】富田 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100162455

【弁理士】

【氏名又は名称】辻本 典子

(72)【発明者】

【氏名】ズィッカー，スティーヴン・シー

(72)【発明者】

【氏名】ブロックマン，ジェフリー・エイ

(72)【発明者】

【氏名】フランツ，ノーラン・ゼブロン

【審査官】 竹中 靖典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５２１８１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１２０５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１９００２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３５３６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６０−１８４０１１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｋ １／００ − １／２４

Ａ６１Ｋ ３１／３８５

Ａ６１Ｐ ３１／１２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

愛玩動物においてインターフェロン仲介による抗ウイルス活性を増強するための方法であって、愛玩動物にインターフェロン仲介による抗ウイルス活性を増強するのに有効な量のリポ酸を含むペットフード組成物を与えることを含み、その際、有効量が少なくとも２５ｐｐｍである方法。

【請求項2】

有効量が少なくとも５０ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

有効量が少なくとも１００ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

有効量が約１００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

有効量が約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

愛玩動物がイヌである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

愛玩動物がネコである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

有効量が愛玩動物において内的抗ウイルス活性を増強するのに有効である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

ペットフード組成物を少なくとも１５日間投与する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ペットフード組成物を少なくとも３０日間投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ペットフード組成物を少なくとも４５日間投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ペットフード組成物を少なくとも１日１回投与する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

組成物がさらに、イチョウ、柑橘類果肉、ブドウ搾りかす、トマト搾りかす、ニンジン、ホウレンソウ、ベータ−カロテン、セレン、コエンザイムＱ１０（ユビキノン）、ルテイン、トコトリエノール類、ダイズイソフラボン類、Ｓ−アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ−アセチルシステイン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、アルファ−リポ酸およびＬ−カルニチンから選択される抗酸化剤を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引照
[0001] 本出願は審査中のａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．１１／１５４，２１０（２００５年６月１６日出願）の一部継続出願であり、これはａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．０９／９７８，１３２（２００１年１０月１６日出願）の継続出願であり、これはＵ．Ｓ．ｐａｔｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ ６，９１４，０７１として発行され、これはａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．０９／９２２，６６０（２００１年８月６日出願）の一部継続出願であり、これはＰｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／２５３，４４８（２０００年１１月２８日出願）およびＰｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／２４４，５０４（２０００年１０月３１日出願）に基づく優先権を主張する；これらをそれぞれ本明細書に援用する。

【0002】

発明の分野
[0002] 本発明は、愛玩動物がウイルス感染症に抵抗し、および／またはそれらを克服する能力を増強するための組成物を包含する。本発明の組成物は、愛玩動物の抗ウイルス性免疫を増強するのに有効な量のリポ酸を含有する。

【背景技術】

【0003】

[0003] 愛玩動物、たとえばイヌおよびネコは、老化の問題をかかえていると思われる。これらのうち幾つかは決まり文句に現われている。これらのひとつは“高齢のイヌに新しい芸当を教えることはできない”である。この文句は、イヌが老化するのに伴ってそれらの精神能力は身体能力と同様に低下するらしいという所見から出ている。思考、学習および記憶に関連する精神活動が次第に低下するように思われる(Cummings, B. J., Head, E., Ruehl, W., Milgram, N. W. & Cotman, C. W. (1996): The canine as an animal model of aging and dementia. Neurobiology of Aging 17:259-268)。さらに、老化しつつある動物では、変化しつつある精神能力に付随して行動変化が発現する可能性がある。多くの原因がこの能力低下にあるとされてきた。

【0004】

[0004] これらの能力喪失は高齢のイヌ類およびネコ類に一般にみられる。７歳以上のイヌおよび７歳以上のネコ類は高齢とみなされ、この問題を生じる可能性がある。
[0005] 有意レベルの少なくとも１種類の抗酸化剤が成体の愛玩用ペットの食事中に存在するか、あるいはペットにその食事以外に与えられることにより、高齢の愛玩用ペットの精神能力の衰退開始を阻止し、および／または成体の愛玩用ペットの精神能力をさらに高齢になるまで維持することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Cummings, B. J., Head, E., Ruehl, W., Milgram, N. W. & Cotman, C. W. (1996): The canine as an animal model of aging and dementia. Neurobiology of Aging 17:259-268

【発明の概要】

【0006】

[0006] 本発明によれば、成体ペットの通常の栄養要求を満たし、その愛玩用ペットの高齢期における精神能力の衰退開始を阻止するのに十分な量の抗酸化剤またはその混合物をさらに含む、愛玩用ペットの食事が提供される。

【0007】

[0007] 他の態様は、高齢の愛玩用ペットの精神能力の衰退を阻止するための方法であって、ペットにその成体期に、この阻止を達成するのに十分なレベルの抗酸化剤またはその混合物を与えることを含む方法を包含する。

【0008】

[0008] 他の態様は、成体の愛玩用ペットの通常の栄養要求を満たし、そのペットの高齢期における精神能力の衰退を阻止するのに十分な量の、ビタミンＥ、ビタミンＣ、アルファ−リポ酸、Ｌ−カルニチンおよびその混合物からなる群から選択される抗酸化剤をさらに含む、成体の愛玩用ペットの食事を包含する。

【0009】

[0009] 本発明の他の態様は、高齢の愛玩用ペットの精神能力を増強するための方法であって、ペットにその成体期に、精神能力を高めるのに十分な量の抗酸化剤またはその混合物を与えることを含む方法を包含する。

【0010】

[0010] 他の態様は、成体の愛玩用ペットの精神能力を増強するための方法であって、ペットにそのペットの精神能力を高めるのに十分な量の抗酸化剤またはその混合物を与えることを含む方法を包含する。

【0011】

[0011] 他の態様は、愛玩動物の抗ウイルス活性を増強するのに有効な量の１種類以上の抗酸化剤、たとえばリポ酸を含有する、ペットフード組成物を包含する。

【発明を実施するための形態】

【0012】

全般的記載
[0012] 本発明は、愛玩動物において抗ウイルス活性を増強するのに有効な量である量のリポ酸を含有するペットフード組成物を包含する。特定の態様において、愛玩動物において抗ウイルス活性を増強するリポ酸の有効量は少なくとも約２５ｐｐｍである。

【0013】

[0013] 特定の態様において、有効量は少なくとも約５０ｐｐｍである。
[0014] 特定の態様において、有効量は少なくとも約１００ｐｐｍである。
[0015] 特定の態様において、有効量は約１００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである。

【0014】

[0016] 特定の態様において、有効量は約１００ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍである。
[0017] 特定の態様において、愛玩動物はイヌである。
[0018] 特定の態様において、愛玩動物はネコである。

【0015】

[0019] 特定の態様において、有効量は愛玩動物において先天性（ｉｎｎａｔｅ）抗ウイルス活性を増強するのに有効である。
[0020] 特定の態様において、リポ酸を含むペットフード組成物を少なくとも１５日間投与する。

【0016】

[0021] 特定の態様において、リポ酸を含むペットフード組成物を少なくとも３０日間投与する。
[0022] 特定の態様において、リポ酸を含むペットフード組成物を少なくとも４５日間投与する。

【0017】

[0023] 特定の態様において、リポ酸を含むペットフード組成物を少なくとも１日１回投与する。
[0024] 成体の愛玩用ペット、たとえばイヌ類およびネコ類に与える食事は、その年齢の動物に与える標準的な普通食である。下記は１〜６歳のイヌ類のための典型的な食事である：

【0018】

【表1】

【0019】

[0025] 有意量の抗酸化剤またはその混合物を成体の愛玩用ペットの食事に添加することにより、高齢のペットにおいて、立証できるほどの行動変化の開始、特に、具体的には問題解決能力により示されるような精神能力の衰退の開始の遅延をもたらすことができる。１種類以上の抗酸化剤を成体の愛玩用ペットの食事に添加することにより、愛玩動物における抗ウイルス活性の増強をもたらすこともできる。用語、成体は、一般に少なくとも１〜６歳のイヌ類および少なくとも１〜６歳のネコ類を意味するものとする。高齢のイヌまたはネコは、７歳以上である。

【0020】

[0026] イヌ類およびネコ類の精神能力の喪失は、多年にわたって観察されている。この精神能力喪失は多数の形で発現する。たとえばイヌ類については、それは見当識障害、小屋の汚染、睡眠−起床パターンの変化、ヒトや他のペットとの交流の減少または変化、ならびに学習および集中する能力の障害として発現する可能性がある。これらの状態はネコ類にも発現する可能性がある。ヒトにおいて示されるようなアルツハイマー病はイヌ類およびネコ類にはみられない。

【0021】

[0027] この精神能力喪失について多数の説が提示されている。現在まで、イヌおよびネコにおいてこの精神能力喪失を阻止するか、あるいは客観的パラメーターにより測定して実際に精神能力にプラスの変化をもたらすことができる、何らかの食事作用クールを本発明者らは知らない。

【0022】

[0028] 本発明者らは、この衰退の開始の遅延を達成するのに成功した。本発明の食事を成体の愛玩用ペットに使用することにより、高齢のペットの精神能力をより長期間維持しうることを示すことができる。本質的に、精神能力の衰退を停止または遅延させることができる。記憶および学習能力を改善することができる。全体的な精神覚醒状態を向上させることができる。加齢性認知低下を遅らせることができる。認知機能障害症候群に関して、高齢のイヌにおいてそれの進行を遅らせることができ、この症候群に関連する臨床徴候を抑制することができる。適切な場合には予防、およびこれらの成分を必要とするペットが目標グループである。

【0023】

[0029] 本発明者らは意外にも、１種類以上の抗酸化剤、たとえばリポ酸の添加が、愛玩動物、たとえばイヌおよびネコにおいて、先天性抗ウイルス免疫機能を増強するのに有用であることも見出した。本明細書中で用いる用語“増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）”または“増強（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）”は、抗ウイルス免疫機能について述べる場合、愛玩動物が抗原に対して増大した免疫応答をもち、これによって感染症に対してより抵抗性となり、または愛玩動物の身体からより速やかにウイルス感染症を消失させる能力を表わす。したがって、抗酸化剤、たとえばリポ酸を含有するペットフードを食べている愛玩動物、たとえばイヌは、抗酸化剤を摂取していない動物よりウイルス感染症に対して抵抗性であり、それをより速やかに消失させるであろう。

【0024】

[0030] これを達成する食事の成分は、抗酸化剤またはその混合物である。抗酸化剤は、フリーラジカルを消滅させる物質である。そのような物質の例には、イチョウ（ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、柑橘類果肉、ブドウ搾りかす、トマト搾りかす、ニンジンおよびホウレンソウなどの食物（すべて、好ましくは乾燥したもの）、ならびに他の多様な物質、たとえばベータ−カロテン、セレン、コエンザイムＱ１０（ユビキノン）、ルテイン、トコトリエノール類、ダイズイソフラボン類、Ｓ−アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ−アセチルシステイン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、アルファ−リポ酸、Ｌ−カルニチンなどが含まれる。ビタミンＥはトコフェロールまたはトコフェロール混合物、およびその多様な誘導体、たとえばエステル、たとえばビタミンＥ酢酸、コハク酸、パルミチン酸などとして投与できる。アルファ形が好ましいが、ベータ、ガンマおよびデルタ形が含有されていてもよい。Ｄ形が好ましいが、ラセミ混合物も許容される。これらの形態および誘導体は、ペットが摂取した後、ビタミンＥ様の活性で機能するであろう。ビタミンＣはこの食事にアスコルビン酸およびその多様な誘導体、たとえばリン酸カルシウム塩、コレステリル塩、２−モノホスフェートなどとして投与でき、これらはペットが摂取した後にビタミンＣ様の活性で機能するであろう。それらは、液体、半固体、固体および熱安定形態など、いかなる形態であってもよい。アルファ−リポ酸は、この食事にアルファ−リポ酸として、またはそのリポエート誘導体（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６２１，１１７の場合のような）、ラセミ混合物、塩類、エステルもしくはアミドとして投与できる。Ｌ−カルニチンを食事に投与でき、カルニチンの多様な誘導体、たとえば塩類、たとえば塩酸塩、フマル酸塩およびコハク酸塩、ならびにアセチル化カルニチンなどを使用できる。

【0025】

[0031] 食事に投与する量−すべて食事に対するｗｔ％（乾燥物質基準）として−は、遊離物質として測定される有効物質自体として計算される。最大使用量は毒性をもたらすべきでない。

【0026】

[0032] 少なくとも約１００ｐｐｍまたは少なくとも約１５０ｐｐｍのビタミンＥを使用できる。特定の態様においては、約５００〜約１，０００ｐｐｍの範囲を使用できる。必ずしもそうではないが、約２，０００ｐｐｍまたは約１，５００ｐｐｍの最大量を一般に超えない。

【0027】

[0033] ビタミンＣに関しては、少なくとも約５０ｐｐｍ、望ましくは少なくとも約７５ｐｐｍ、より望ましくは少なくとも約１００ｐｐｍを使用する。無毒性である最大量を使用できる。

【0028】

[0034] リポ酸の量は、少なくとも約２５ｐｐｍ、望ましくは少なくとも約５０ｐｐｍ、より望ましくは約１００ｐｐｍから変更できる。種々の態様において、イヌに投与できるリポ酸の範囲は約１５０ｐｐｍ〜約４５００ｐｐｍである。種々の態様において、ネコに投与できるリポ酸の範囲は約６５ｐｐｍ〜約２６００ｐｐｍである。最大量は約１００ｐｐｍから６００ｐｐｍまで、またはペットに対して無毒性のままである量まで変更できる。特定の態様において、範囲は約１００ｐｐｍから約２００ｐｐｍまでである。

【0029】

[0035] Ｌ−カルニチンについては、イヌ類には約５０ｐｐｍ、望ましくは約２００ｐｐｍ、より望ましくは約３００ｐｐｍが有用な最小量である。ネコ類には、これよりわずかに高い最小量のＬ−カルニチン、たとえば約１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、および５００ｐｐｍを使用できる。無毒性最大量、たとえば約５，０００ｐｐｍ未満を使用できる。イヌ類には、これより低い量、たとえば約５，０００ｐｐｍ未満を使用できる。イヌ類には、好ましい範囲は約２００ｐｐｍ〜約４００ｐｐｍである。ネコ類には、好ましい範囲は約４００ｐｐｍ〜約６００ｐｐｍである。

【0030】

[0036] ベータ-カロテンは約１〜１５ｐｐｍで使用できる。
[0037] セレンは約０．１から約５ｐｐｍまでで使用できる。
[0038] ルテイン：少なくとも約５ｐｐｍを使用できる。

【0031】

[0039] トコトリエノール類：少なくとも約２５ｐｐｍを使用できる。
[0040] コエンザイムＱ１０：少なくとも約２５ｐｐｍを使用できる。
[0041] Ｓ−アデノシルメチオニン：少なくとも約５０ｐｐｍを使用できる。

【0032】

[0042] タウリン：少なくとも約１０００ｐｐｍを使用できる。
[0043] ダイズイソフラボン類：少なくとも約２５ｐｐｍを使用できる。
[0044] Ｎ−アセチルシステイン：少なくとも約５０ｐｐｍを使用できる。

【0033】

[0045] グルタチオン：少なくとも約５０ｐｐｍを使用できる。
[0046] イチョウ：少なくとも５０ｐｐｍの抽出物を使用できる。
[0047] 以下は、ＯＲＡＣ（Ｏｘｙｇｅｎ ｒａｄｉｃａｌ ａｂｓｏｒｂｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ、酸素ラジカル吸収能）含量の高い原料成分である：食事に１％の含有率（トウモロコシのように低ＯＲＡＣ成分については合計５％の置換）として添加した場合、それらは食事全体のＯＲＡＣ含量を増大させ、これらの成分を含有する食事を食べた動物の血漿のＯＲＡＣ含量を増大させた。好ましくは、乾燥物質のグラム当たりＯＲＡＣ含量＞２５．ｍｕ．ｍｏｌｅをもついずれかのＴｒｏｌｏｘ均等成分を、１％で他の４種類の１％成分と組み合わせて合計５％を食事に添加すれば使用できる。

【0034】

[0048] ホウレンソウ搾りかす、トマト搾りかす、柑橘類果肉、ブドウ搾りかす、ニンジン顆粒、ブロッコリ、緑茶、イチョウ、およびトウモロコシグルテンミール。

【実施例】

【0035】

実施例１
[0049] ２〜４歳の成体ビーグル犬１７匹（対照ｎ＝８、抗酸化剤強化ｎ＝９）を、ランダムに対照食または強化食のグループに入れた。対照食は５９ｐｐｍのビタミンＥおよび＜３２ｐｐｍのビタミンＣを含有していた。試験食は９００ｐｐｍのビタミンＥおよび１２１ｐｐｍのビタミンＣ、２６０ｐｐｍのＬ−カルニチンならびに１３５ｐｐｍのアルファ−リポ酸を含んでいた。この食事の開始後、約１カ月目に、イヌに課された最初の問題解決作業はランドマーク識別学習作業であった；これは空間注意（ｓｐａｔｉａｌ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ）試験である(Milgram, N. W., Adams, B., Callahan, H., Head, E., Mackey, B., Thirlwell, C. & Cotman, C. W. (1999): Landmark discrimination learning in the dog. Learning & Memory, 6:54-61)。

【0036】

[0050] ランドマーク識別学習には、被験体が、ある物体との近接に基づいて特定の物体を選択することが要求される。しかし、最初の学習はイヌが物体識別作業を学習する能力に基づく。本発明者らは、識別学習に対する年齢の影響は作業の困難度に依存することを以前に見出した。

【0037】

[0051] ランドマーク０試験を学習させた場合、強化食を与えた成犬は対照食を与えた成犬よりエラーが少なかった（対照平均＝３１．１、強化平均＝１５．１）。成犬をランドマーク１および２試験へ進めた；これらの場合、ランドマークをプラスのウェルからさらに遠くへ移動させる。強化食を与えた成犬は、対照を与えた成犬より少ないエラーでランドマーク０〜２を学習した（ランドマーク０＋１＋２の平均エラー回数（対照）＝１３２．９；ランドマーク０＋１＋２の平均エラー回数（強化食を与えたイヌ）＝８７．１）。

【0038】

実施例２
[0052] ランダムな供給源の成犬３０匹をこの試験に用いた。イヌは、試験開始前に少なくとも１カ月齢であり、妊娠しておらず、授乳しておらず、かつ妥当な体重のものであった。動物を食事処理についてランダムに、各グループ当たり雄３匹および雌３匹を含む５グループに分けた。

【0039】

[0053] すべてのイヌに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｏｆｆｉｃｉａｌｓ（ＡＡＦＣＯ ２０００）が提唱する栄養素に関するすべての推奨を満たすかまたはそれらを上回る対照食（０ｐｐｍのＤＬ−アルファ−リポ酸を添加）を、２週間の前給餌期間中に与えた（表１）。この前給餌期間後、イヌをランダムに、下記のＤＬ−アルファ−リポ酸目標含有率のいずれかひとつを含む５つの処置グループに分けた（乾燥物質基準）：０ｐｐｍ、１５０ｐｐｍ、１，５００ｐｐｍ、３，０００ｐｐｍ、４，５００ｐｐｍ。対照およびアルファ−リポ酸のすべての食事にビタミンＥが添加されて６００〜１０００国際単位のレベルで存在し、かつビタミンＣを少なくとも１００〜２００ｐｐｍのレベルで添加した。

【0040】

[0054] 水以外は試験食が唯一の栄養素源であった。新鮮な水が適宜与えられた。イヌを選択し、初期体重を測定した後、食物の予想ＭＥに基づいて各イヌにつき食物量を計算した。初期食物量の計算は、次式により計算される、普通の活動をの説明となる係数を掛けたそのイヌについての維持エネルギー要求量（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）（ＭＥＲ）に基づいた：
ＭＥＲ（ｋｃａｌ／日）＝１．６×ＲＥＲ（Ｒｅｓｔｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ、安静時エネルギー要求量）
式中：ＲＥＲ（ｋｃａｌ／日）＝７０×体重（ｋｇ）．ｓｕｐ．０．７５。

【0041】

[0055] イヌを週１回、体重測定し、それらの最適体重を維持するのに十分な食物を与えるために必要に応じて食物量を調整した。最適体重を５点スケールで３と決定した。食物量を調整した後にイヌが初期体重の−１０％以内の体重を維持しなかった場合、それを試験から除外した。体重および食物摂取量のすべての測定値を記録した。

【0042】

[0056] 試料を粉砕し、０．１００±０．００１ｇの試料を５．０ｍｌのリン酸緩衝液（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中へ２回抽出した。２５０μＬの抽出液を、テフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）内張り蓋付きの５ｍｌガラス製遠心管に入れた。１５μＬのＥＤＴＡ溶液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ；約１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．８に調整）および５０．ｍｕ．ｌの調製したばかりの５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＥ）を添加した。溶液を渦攪拌し、室温で５分間インキュベートした。次いで１０．ｍｕ．ｌの１Ｍ Ｈ_３ＰＯ_４および２．０ｍｌのジエチルエーテルを添加した。遠心管に蓋をし、渦攪拌し、１５００×ｇで３分間、室温において遠心した。エーテル層を別の５ｍｌガラス製遠心管へ移し、一方、水層をさらに２回、１．５ｍｌのエーテルで抽出した。同一試料からのすべての抽出液を合わせた。次いで抽出液を室温の水浴内の窒素蒸発器で乾燥させる。この時点で、試料に蓋をし、一夜凍結させた。

【0043】

[0057] 乾燥した抽出液を次いで融解し、７０．ｍｕ．ｌのＳＤＳ／ＥＤＴＡ溶液（０．１１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１５ｍＭのＥＤＴＡ、０．９％のＮａＣｌ）および５μＬの調製したばかりの１ｍＭ ＤＴＥで再構成した。５０μＬの調製したばかりのＮａＢＨ_４を次いで各試験管に添加した。試験管を渦攪拌し、室温で１０分間インキュベートした。１０分後、試料を−７０℃で凍結した。溶液を融解する前に、２０μＬの２Ｍ ＨＣｌを添加した。溶液を融解した後、８００μＬの１００ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３を添加した。溶液を渦攪拌し、５．ｍｕ．ｌのアセトニトリル中１００ｍＭモノブロモビマン（ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ）溶液（ｍＢＢｒ）を添加した。次いで溶液を暗所で９０分間、室温においてインキュベートした。

【0044】

[0058] インキュベーション後、１．５ｍｌのジクロロメタンで抽出することにより、過剰のｍＢＢｒおよびＤＴＥ誘導体を試料から除去した。水層をＨＰＬＣに乗せた。３０％アセトニトリル、１％酢酸からなる、約２ＭのＮＨ_４ＯＨでｐＨ３．９５に調整した移動相を用い、これを１．０ｍＬ／分の流速で送出し、注入当たり１５分間のイソクラティック溶離で、リポ酸を分離した。この調製により、押出し飼料の密度が１ｇ／ｍｌであることが確認される。

【0045】

[0059] 完全血球計数および血液生化学的分析のために、開始の２週間前、ならびに再び試験の０、２８、５６、８４、１１２、１４０および１６８日目に、血液を無菌的に採集した。さらに、リンパ球の単離のために、食事介入の０、２８および８４日目に１５ｍｌの全血を採集した。

【0046】

[0060] ヘパリン添加した全血を５０ｌ Ａｃｃｕｓｐｉｎコニカル遠心管（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）に積層し、等体積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を添加した。試料を７００×ｇで３０分間、ブレーキをかけずに遠心した。単球層を収穫し、１５ｍｌコニカル遠心管に移し、１〜３ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、前記と同様に遠心した（１回目の洗浄）。２回目の洗浄を１回目の洗浄と同様に実施した。最後に、細胞を収穫し、過塩素酸（１０％ ｗ／ｖ）に懸濁し、分析するまで７０℃で凍結した。

【0047】

[0061] 試料を−７０℃のフリーザーから、ドライアイスを入れたクーラーに移した。バイアルを冷却遠心機内において１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。グルタチオン（ＧＳＨ）分析用の部分上清をコニカル試験管へ移した。

【0048】

[0062] 酸可溶性抽出物の誘導体化は、Ｒｅｅｄおよび協同研究者らの方法（Ｆａｒｉｓｓ ｅｔ ａｌ）により、Ｊｏｎｅｓが改変したもの（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ）に従って行なわれた。

【0049】

[0063] 要約すると、１５０μＬの抽出液または外部標準品を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加し、続いて２０μＬのガンマ−ｇｌｕ−ｇｌｕ内部標準品および５０μＬのＩＡＡを添加し、続いて混合した。この溶液を、ＫＯＨ−ＫＨＣＯ_３作業溶液を用いてｐＨ約１０に調整した（紫色）。溶液を室温で暗所において１時間インキュベートした。サンガー試薬を全体積と同体積で添加し、溶液を室温で暗所において一夜（２０時間）インキュベートした。

【0050】

[0064] インキュベーション後、溶液を１２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を他の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。ＨＰＬＣ分析のために２００μＬの上清を容量３００μＬのこはく色オートバイアルに添加し、クリンパーで上を固定した。

【0051】

[0065] 溶剤および分離条件は記載に従った（Ｆａｒｉｓｓ，Ｊｏｎｅｓ）。ＧＳＨおよびＧＳＳＧのレベルを基準品と対比して定量した。誘導体化効率を評価するために、ガンマ−グルタリル−グルタメートを内部標準品として用いた。

【0052】

[0066] 臨床化学、血液学および体重の数値とベースラインとの対比を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＳＡＳでの対ｔ−検定により、有意性をＰ＜０．０５に設定して分析した。各測定時点における数値の平均を一元ＡＮＯＶＡにより、有意性をＰ＜０．０５に設定して分離した。８４日目とベースラインの間のＧＳＨ：ＧＳＳＧの差をグループ間でＷｉｎｄｏｗｓ用ＳＡＳにより一元ＡＮＯＶＡで、有意性をＰ＜０．０５に設定して分析した。

【0053】

結果
[0067] 連続７回のアッセイ（０、２８、５６、８４、１１２、１４０、１６８日目）にわたって測定した飼料中のリポ酸濃度（ｐｐｍ）は、予想アッセイ感度および本発明者らの施設で一般に遭遇する生産パラメーターの範囲内であった（表２）。

【0054】

[0068] 食物摂取データに目立つ点はなかった。６カ月目に、すべてのグループの大部分の動物が平均して試験開始時より多量の食物を摂取した。体重データに目立つ点はなかった；ただし、４，５００ｐｐｍ接種グループで最初に若干の体重減少が起きたけれども、その変化は６カ月目の時点までに元に戻るのが見られた。体重状態スコアはこのわずかな体重減少により影響されたようには見えなかった。

【0055】

[0069] ルーティンな身体検査により栄養関係の異常またはＤＬ−アルファ−リポ酸毒性の何らかの証拠は明らかにならなかった。被験集団のすべての動物が試験期間全体を通して正常なままであった。試験期間中に数匹の動物に時に嘔吐がみられた；しかし、この嘔吐がリポ酸に起因する可能性があるという結論に導く趨勢はみられなかった。最高含有率グループの１匹の動物を、体重減少および白血球増多症のため２１日目に試験から脱落させた。この動物における白血球増多症は試験終了時まで回復せず、他の何らかの疾患プロセスに起因する疑いがある。

【0056】

[0070] ２８、５６、８４、１１２、１４０および１６８日目の血清生化学的数値を同一グループのイヌについての初期値と比較すると、幾つかの統計的な差が認められたが、これらの数値は実験室基準範囲内またはそのごく近辺であって数ヶ月間にわたって一貫した趨勢が認められたので、これらはいずれも生物学的に有意であるとはみなされなかった。各期間における対照と他の処置グループとの比較によっても幾つかの統計的な差が見られたが、これらの数値は臨床実験室基準範囲内またはそのごく近辺であって何ら趨勢は存在しなかったので、これらはいずれも生物学的に有意であるとはみなされなかった。

【0057】

[0071] ２８、５６、８４、１１２、１４０および１６８日目の血液学的数値を同一グループのイヌについての初期値と比較すると、幾つかの統計的な差が認められた；しかし、これらの数値は実験室基準範囲内またはそのごく近辺であって何ら趨勢は存在しなかったので、これらはいずれも生物学的に有意であるとはみなされなかった。各期間における対照と他の処置グループとの比較によっても幾つかの統計的な差が見られた；しかし、これらの数値は臨床実験室基準範囲内またはそのごく近辺であって何ら趨勢は存在しなかったので、これらはいずれも生物学的に有意であるとはみなされなかった。

【0058】

ＧＳＨ：ＧＳＳＧ比
[0072] ８４日間の給餌にわたるＧＳＨ：ＧＳＳＧ比の変化は食事の有意の全般的影響を示し（Ｐ＝０．０２４）、すべての補給グループがこの比の上昇を伴った（表３）。ＡＮＯＶＡにより基礎食物と比較して最低および最高含有率の食物について有意差が見られたが、数値の最大上昇は最低含有率レベルにおいてであった。すなわち、最高および最低含有率の食物についてのＧＳＨ：ＧＳＳＧ比の変化は、この同一期間にわたって基礎食物にみられた変化と有意に異なっていた。８４日目には４点について比率を判定できなかった；これらの試料（１つの対照グループ、３つの処置グループ）のいずれにおいてもＧＳＳＧを検出できなかったからである。したがって、８４日目のこの低レベルのＧＳＳＧを検出するのに十分なほどアッセイが高感度であれば、補給グループについての数値はより高いＧＳＨ：ＧＳＳＧ比を示した可能性すらある。

【0059】

【表2】

【0060】

【表3】

【0061】

^* 対照および４，５００ｐｐｍグループの１匹のイヌは８４日目に検出可能なＧＳＳＧがなく、一方、３，０００ｐｐｍグループの２匹のイヌは８４日目に検出可能なＧＳＳＧがなかった。

【0062】

[0073] アルファ-リポ酸に関するさらに他の所見を適用できる。食事におけるアルファ-リポ酸の長期給餌は、安全かつ有効である。それは還元型グルタチオン（ＧＳＨ）：酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）比を改善する。食事におけるアルファ−リポ酸の長期投与は、最低１、２、３、４、５もしくは６カ月の期間から１、２、３、４、５もしくは６年の期間まで、または動物の生涯を含めてさらにそれ以上であってもよい。アルファ−リポ酸は封入など特別な保護をしなくても食事において機能し、錠剤、丸剤、カプセル剤など医薬において用いるような単位剤形で食事に存在する必要がない。リポ酸は食事に食事の約２５、５０、７５または１００ｐｐｍの最小量で供給される。最大範囲はその毒性レベルの直下からそれよりはるかに低く、食事の約４００、３００または２００ｐｐｍである。一般に１日当たり約６または７ｍｇ／ｋｇ（動物の体重）を超えず、より一般的には約５ｍｇ／ｋｇを超えない。アルファ−リポ酸は抗酸化剤の防御能を改善し、かつ動物が酸化的損傷に抵抗する能力を改善する。これはすべて、存在する適正な量の他の抗酸化剤、たとえばビタミンＥおよびビタミンＣについて行われる。これは、アルファ−リポ酸の作用がビタミンＣおよび／またはビタミンＥの作用を超えることを証明する。

【0063】

実施例３
実験条件
[0074] ２０匹のイヌに３０日間給餌した。１０匹にはＡＡＦＣＯレベルの対照食、他の１０匹のイヌには１５０ｐｐｍのアルファ−リポ酸を含有するＡＡＦＣＯレベルの対照食を与えた。３０日間の終了時に各イヌから全血試料をＰａｘｇｅｎチューブに採集した。

【0064】

[0075] 全血試料からＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡ単離キットを用いて全ＲＮＡを単離した。すべての測定をｃａｎｉｎｅ ２ Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップにより行なった。統計分析のために、すべての測定値をＲＭＡで正規化した。すべての分析をＰａｒｔｅｋにより実施した。対照食と試験食の間で差次発現する遺伝子（＜０．０５の数値を伴う少なくとも２０％の発現変化）についてＡＮＯＶＡ ｔ−検定を実施した。

【0065】

[0076] 差次発現する遺伝子をＧｅｎｅＧｏパスウェイ分析ソフトウェアで分析した。リポ酸を３０日間与えたイヌはインターフェロン仲介による抗ウイルス応答を示した。イヌにリポ酸を３０日間与えることによりアップレギュレートされた遺伝子であってインターフェロン仲介による抗ウイルス応答に関与するものを表４に挙げる。

【0066】

【表4-1】

【0067】

【表4-2】

【0068】

[0077] リポ酸を３０日間与えたイヌの試験に基づいて、本発明者らは意外にも、インターフェロンアルファ／ベータおよびガンマに対する細胞表面受容体が増加し、これによって全体的なインターフェロン仲介による抗ウイルス防御機序を増大させる効力が生じることを見出した。ＪＡＫ２、すなわちＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２の重要なアクチベーターがアップレギュレートされることを本発明者らは見出した。インターフェロン調節因子９（ＩＦＲ９）がアップレギュレートされる。ＩＦＲ９、ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２は複合体（ＩＳＦＧ３）を形成し、これは核へ移行し、抗ウイルス遺伝子、インターフェロン誘導による二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、および２−５Ａ−依存性リボヌクレアーゼ（ＲｎａｓｅＬ）をアップレギュレートする。ＰＫＲはｅｌＦ２Ｓ１をリン酸化により阻害し、これによりウイルスタンパク質合成を阻害する。ＲｎａｓｅＬはウイルスＲＮＡを開裂し、その結果、ウイルスの複製および機能を阻害する。

【0069】

[0078] 本発明の範囲は実施例に開示した特定の態様により限定されるべきでない；実施例は本発明の幾つかの観点の説明のためのものであり、機能的に均等ないずれの態様も本発明の範囲に含まれる。実際に、本明細書に提示および記載したもののほか本発明の多様な改変が当業者に明らかであろう；それらは特許請求の範囲に含まれるものとする。

【0070】

[0079] 引用したいずれの文献についてもその開示内容全体を本明細書に援用する。