特許 5745212 検出用オリゴマーおよびこれを利用したバイオチップのＱＣ方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5745212

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月8日

(54)【発明の名称】検出用オリゴマーおよびこれを利用したバイオチップのＱＣ方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20060101AFI20150618BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20150618BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20150618BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20150618BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   G01N37/00 102

   G01N33/53 M

   C12N15/00 A

【請求項の数】8

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2009-14715(P2009-14715)

(22)【出願日】2009年1月26日

(65)【公開番号】特開2009-171970(P2009-171970A)

(43)【公開日】2009年8月6日

【審査請求日】2012年1月26日

(31)【優先権主張番号】10-2008-0007675

(32)【優先日】2008年1月24日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】390019839

【氏名又は名称】三星電子株式会社

【氏名又は名称原語表記】Ｓａｍｓｕｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(72)【発明者】

【氏名】李 周遠

(72)【発明者】

【氏名】金 秉撤

(72)【発明者】

【氏名】鄭 善玉

(72)【発明者】

【氏名】▲チョ▼ 昇惠

【審査官】 森井 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−１４６１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０２５２８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／０５０９１６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nucleic Acids Res. (2001) vol.29, no.4, p.996-1004

【文献】 Nucleic Acids Res. (2001) vol.29, no.19, e92

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１プローブおよび第２プローブの一端が固定相にカップリングされたバイオチップであって、所望する数のモノマーを含む第１プローブおよび所望しない数のモノマーを含む第２プローブを含むバイオチップを提供する工程、
前記第１プローブおよび第２プローブにＱＣプローブをハイブリダイズする工程、
前記第１プローブと前記ＱＣプローブを連結させる工程、
前記第１および第２プローブと前記ＱＣプローブのハイブリダイズ結合を切断する工程を含む、バイオチップのＱＣ方法であって、
前記ＱＣプローブが、前記第１プローブの塩基配列と相補的な塩基配列を有する鋳型および前記鋳型の一端に連結されたヘアピンを含む、バイオチップのＱＣ方法。

【請求項2】

前記第１および第２プローブに前記ＱＣプローブをハイブリダイズする前に、前記第１および第２プローブの他端をリン酸化する工程をさらに含む、請求項１に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項3】

前記ＱＣプローブの前記ヘアピンが、第１一本鎖および第２一本鎖がハイブリダイズしたステムとループを含み、
前記第１一本鎖の一端は前記ループとカップリングされて、他端は前記鋳型の一端にカップリングされ、前記第２一本鎖の一端は前記ループとカップリングされて、他端は前記第１プローブの他端とカップリングされ得、
前記第１プローブと前記ＱＣプローブを連結することは、前記ＱＣプローブの前記第２一本鎖の他端と前記第１プローブの他端をカップリングすることによって達成される、請求項１に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項4】

前記ＱＣプローブの前記ヘアピンが、第１一本鎖および第２一本鎖がハイブリダイズしたステムとループを含み、
前記ＱＣプローブの前記第２一本鎖の他端は前記第２プローブの他端から離れているために、前記第２プローブに前記ＱＣプローブを連結することができない、請求項１に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項5】

前記ハイブリダイズ結合を切断した後に、前記第１プローブと前記ＱＣプローブの鋳型をハイブリダイズして二重鎖を形成して、
前記二重鎖にラベルをカップリングして前記ラベルから提供される信号を検出することをさらに含む、請求項１に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項6】

前記ＱＣプローブが、前記鋳型および／または前記ヘアピンにカップリングされたラベルをさらに含み、
前記ハイブリダイズ結合を切断した後に、前記第１プローブとカップリングされたＱＣプローブの前記ラベルから提供される信号を検出することをさらに含む、請求項１に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項7】

前記信号を検出した後に、前記ＱＣプローブと前記第１プローブをデカップリングすることをさらに含む、請求項５に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【請求項8】

前記ヘアピンが、第１一本鎖および第２一本鎖がハイブリダイズしたステムとループを含み、
前記第１一本鎖の一端は、前記ループとカップリングされて、他端は前記鋳型の一端にカップリングされ、前記第２一本鎖の一端は前記ループとカップリングされ、
前記第１一本鎖の他端部および第２一本鎖の他端部は特異的な配列を含み、
前記デカップリングすることは、前記特異的な配列に反応するヌクレアーゼを使用しデカップリングすることによって達成される、請求項７に記載のバイオチップのＱＣ方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、検出用オリゴマーおよびこれを利用したバイオチップのＱＣ方法に関するものであって、より詳細にはヘアピンを含む検出用オリゴマーおよびこれを利用したバイオチップのＱＣ方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

バイオチップは、基板に固定されたプローブのマトリクスにバイオ試料を提供してプローブとバイオ試料間に反応が起きるのかの可否を観察することで、バイオ試料の具体的な成分を分析する。一つのバイオチップには様々な種類の互いに異なるプローブがセル別に固定されて多様なデータを判読できる。

【0003】

分析しようとするデータの量がぼう大になるつれ、バイオチップにはバイオ分子と混成化できる多様な種類のプローブがカップリングされて固定化される。バイオチップにカップリングされて固定化されたプローブの種類が多様化されるほど、所望する塩基配列を有するプローブがバイオチップに形成されたのかの可否などを判断する、バイオチップの品質管理が重要になる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明が解決しようとする課題は、効率的にバイオチップの品質を管理できる検出用オリゴマーを提供することにある。

【0005】

本発明が解決しようとする他の課題は、効率的にバイオチップの品質を管理できるバイオチップのＱＣ方法を提供することにある。

【0006】

本発明が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されなく、言及されていないまた他の課題は次の記載から当業者に明確に理解できるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決するための本発明のいくつかの実施形態による検出用オリゴマーは、特定の配列のオリゴマーに相補的な配列を有する鋳型、および前記鋳型の一端に連結されたヘアピンを含む。

【0008】

前記課題を解決するための本発明のいくつかの実施形態による検出用オリゴマーは、特定の配列のオリゴマーに相補的な配列を有する一本鎖第１オリゴマー、および前記第１オリゴマーの一端に連結されてヘアピン構造を形成できる配列を有する一本鎖第２オリゴマーを含む。

【0009】

前記他の課題を解決するための本発明のいくつかの実施形態によるバイオチップのＱＣ方法は、プローブの一端が固定相にカップリングされたバイオチップを提供するものであって、前記プローブは所望する数のモノマーを含む第１プローブと所望しない数のモノマーを含む第２プローブを含み、固定相にカップリングされた前記第１および第２プローブにＱＣプローブを混成化（ハイブリダイズ）して、前記第１プローブと前記ＱＣプローブを連結して、前記第１および第２プローブと前記ＱＣプローブの混成化（ハイブリダイズ化）結合を切断することを含み、前記ＱＣプローブは、前記第１プローブの塩基配列と相補的な塩基配列を有する鋳型および前記鋳型の一端に連結されたヘアピンを含む方法である。

【0010】

本発明のその他具体的な内容は詳細な説明および図に含まれている。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の一実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。

【図2】本発明の他の実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。

【図3】本発明のまた他の実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。

【図4A】本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図4B】本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図4C】本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図4D】本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図4E】本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図5】本発明の他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。

【図6】本発明の実施形態によるバイオチップのＱＣが用いられるバイオチップの断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明の利点、特徴、そしてそれらを達成する方法は、添付される図面と共に詳細に後述される実施形態を参照すれば明確になるであろう。しかし、本発明は、以下で開示される実施形態に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現されることが可能である。本実施形態は、単に本発明の開示が完全になるように、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に対して発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は請求項の範囲によってのみ定義される。

【0013】

したがって、いくつかの実施形態において、公知の工程、段階、構造および技術は、本発明が不明瞭に解釈されるのを避けるために、説明を省略する。

【0014】

本明細書において使用された用語は実施形態を説明するためであり、本発明を制限しようとするものではない。本明細書において単数形は、文言で特別に言及しない限り複数形も含む。明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及した構成要素、段階、動作および／または素子は、一つ以上の他の構成要素、段階、動作および／または素子の存在または追加を排除するものではない。そして、「および／または」は、言及されたアイテムの各々および一つ以上のすべての組合せを含む。

【0015】

また、本明細書で記述する実施形態は、本発明の理想的な実施形態の断面図または概略図を参照して説明する。したがって、製造技術または許容誤差などによって、例示図の形態が変形されてもよい。したがって、本発明の実施形態は、図示された特定形態に制限されるものではなく、製造工程によって生成される形態の変化も含むものである。また、本発明に図示された各図面において各構成要素は説明の便宜を考慮して多少拡大または縮小されて図示されたものである。明細書全体にかけて同一の参照符号は同一の構成要素を指称する。

【0016】

図１は、本発明の一実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。以下で検出用オリゴマーは説明の便宜のため、鋳型の自由末端（ｆｒｅｅ ｔｅｒｍｉｎｕｓ）が５’−末端であり、鋳型とカップリングされていないヘアピンのステム末端は３’−末端である検出用オリゴマーを例示するが、これに制限されるものではない。また、以下で検出用オリゴマーの鋳型およびヘアピンの塩基配列は説明の便宜のための例示的なものであり、検出対象がオリゴマーの特定の配列およびヘアピンの構造などによって変わり得ることは本発明の技術分野に属する当業者に自明である。

【0017】

図１においては、本発明の一実施形態による検出用オリゴマー１は鋳型１００およびヘアピン２００を含む。

【0018】

鋳型１００は、特定の配列のオリゴマーに相補的な配列を有し、検出用オリゴマー１を特定の配列のオリゴマーに混成化する役割を果たす。ここで、混成化は相補的な配列の塩基が例えば、水素結合によって結合されることであり得る。特定の配列のオリゴマーはバイオチップに固定化されたプローブ（ｐｒｏｂｅ）であり得る。すなわち、鋳型１００は、バイオチップに固定化されたプローブの塩基配列と相補的な塩基配列を有するので、プローブに混成化することができる。

【0019】

ここで、バイオチップは、バイオ試料に含まれているバイオ分子（ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を分析することによって、遺伝子発現分析（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）、遺伝子型分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のような突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）および多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の検出、蛋白質およびペプチド分析、潜在的な薬のスクリーニング、新薬開発と製造などに利用され得る。バイオチップのプローブとしてオリゴマープローブを含み得る。オリゴマープローブは採用されるプローブのモノマー数がオリゴマー水準であることを暗示する。ここで、オリゴマーは共有結合された２つ以上のモノマーから成るポリマーのうちモノマーの分子量が概ね１０００以下であり得る。具体的に約２〜５００個のモノマー、好ましくは約５〜３００個のモノマー、さらに好ましくは約５〜１００個のモノマーを含むものであり得る。しかし、オリゴマープローブの意味が前記数値に制限されるものではない。

【0020】

オリゴマープローブを構成するモノマーは分析対象になるバイオ試料の種類によって変形可能であり、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチドなどであり得る。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、公知のプリンおよびピリミジン塩基を含むだけではなく、メチル化されたプリンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジンなどを含み得る。また、ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、従来のリボースおよびデオキシリボース糖を含むだけではなく、一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族に置換されたりエーテル、アミンなどの官能基が結合した変形された糖を含み得る。アミノ酸は自然で発見されるアミノ酸のＬ−、Ｄ−、および非キラル（ｎｏｎｃｈｉｒａｌ）型アミノ酸だけではなく、変形アミノ酸（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、またはアミノ酸類似体（ａｎａｌｏｇ）などであり得る。ペプチドとは、アミノ酸のカルボキシル基と異なるアミノ酸のアミノ基の間のアミド結合によって生成された化合物を指す。

【0021】

ヘアピン２００は、鋳型１００の一端（３’−末端）に連結され、ステム（ｓｔｅｍ、２１０）とループ（ｌｏｏｐ、２３０）を含む。

【0022】

ステム２１０は、ヘアピン２００で相補的な塩基が混成化されてカップリングされた二本鎖領域で、鋳型１００の一端にカップリングされた第１一本鎖（ステム２１０において大文字で表示された塩基配列の部分）および第１一本鎖に混成化された第２一本鎖（ステム２１０において小文字で表示された塩基配列の部分）を含む。

【0023】

第１一本鎖の一端はループ２３０にカップリングされ、他端は鋳型１００の一端にカップリングされる。ここでカップリングは共有結合などによって結合されたことであり得る。

【0024】

第２一本鎖の一端はループ２３０にカップリングされ、他端は３’−末端を有する。第２一本鎖は第１一本鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、これによって第２一本鎖と第１一本鎖は混成化されてカップリングされた二本鎖領域を形成することができる。

【0025】

ステム２１０の第１一本鎖の他端部および／または第２一本鎖の他端部は、特定ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）または化学反応に対して特異的な配列２１５を含む。ここで、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）またはエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）であり得る。例えば、第１一本鎖の他端部および／または第２一本鎖の他端部は、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）に特異的な回文配列（ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み得る。

【0026】

図２は、本発明の他の実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。

【0027】

図２においては、本発明の他の実施形態による検出用オリゴマー２が図１の実施形態による検出用オリゴマー１と異なる点は、鋳型１００にカップリングされたラベル３００をさらに含むという点である。

【0028】

具体的に、本発明の他の実施形態による検出用オリゴマー２は、鋳型１００の他端（５’−末端）にカップリングされたラベル３００をさらに含む。ラベル３００は、バイオチップに固定化されたプローブと検出用オリゴマーの混成化反応以後、光学的検出方法に用いられる。ラベル３００は蛍光または燐光物質であり得る。例えば、ラベル３００はローダミン２００（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ２００）、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ）、シアニン２（Ｃｙａｎｉｎｅ２）、シアニン３（Ｃｙａｎｉｎｅ３）、シアニン５（Ｃｙａｎｉｎｅ５，）、マグネシウムグリーン（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）などから選択されうるが、これに限定されない。

【0029】

また、図面には図示しなかったが、本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマーはヘアピンのループにカップリングされたラベルをさらに含むこともある。類似に検出用オリゴマーは鋳型およびヘアピンのループにカップリングされたラベルをさらに含むこともある。

【0030】

図３は、本発明のまた他の実施形態による例示的な検出用オリゴマーを説明する図である。

【0031】

図３においては、本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマー３は、特定の配列のオリゴマーに相補的な配列を有する一本鎖第１オリゴマー（１０３、以下「第１オリゴマー」と称する）および第１オリゴマー１０３の一端に連結されてヘアピン構造を形成できる配列を有する一本鎖第２オリゴマー（２０３、以下「第２オリゴマー」と称する）を含む。検出用オリゴマー３は、第２オリゴマー２０３が例えば、温度、溶液のような周囲環境に応じた分子内反応（ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を介して、ヘアピン構造を形成することができる。

【0032】

本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマー３で第１オリゴマー１０３は、図１の実施形態によるオリゴマー１の鋳型１００と実質的に同一であり得る。すなわち、第１オリゴマー１０３は、例えば、バイオチップに固定化されたプローブと相補的な配列を有し、これによって第１オリゴマー１０３は、バイオチップに固定化されたプローブと混成化することができる。

【0033】

第２オリゴマー２０３は、第１オリゴマー１０３の一端（３’−末端）に連結され、ヘアピン構造を形成できる塩基配列を有する。第２オリゴマー２０３のヘアピン構造を形成できる塩基配列は、形成しようとするヘアピン構造でステムを形成する部分のサイズおよび配列、ループを形成する部分のサイズおよび配列、またはヘアピン構造を形成しようとする温度などに応じて変わり得る。例えば、常温で第２オリゴマー２０３の一端部と他端部がカップリング時発生する自由エネルギーの変化が−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下になるように第２オリゴマー２０３の塩基配列が設計される場合、第２オリゴマー２０３は常温でヘアピン構造を形成することができる。

【0034】

第２オリゴマー２０３は第１オリゴマー１０３の一端に連結された部分から順に第１領域２１０ｂ、第２領域２３３および第３領域２１０ａに区分することができる。第２オリゴマー２０３の第１領域２１０ｂおよび第３領域２１０ａは互いに混成化してヘアピンのステムを形成して、第２領域２３３はヘアピンのループを形成することができる。

【0035】

第２オリゴマー２０３の第１領域２１０ｂおよび第３領域２１０ａは、互いに相補的な塩基配列を有し、これによって、第２オリゴマー２０３の第１領域２１０ｂおよび第３領域２１０ａは周囲環境によって互いに混成化されてカップリングされた二本鎖を形成することができる。すなわち、本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマー３における第２オリゴマー２０３の第１領域２１０ｂおよび第３領域２１０ａは、図１の実施形態による検出用オリゴマー１におけるステム２１０の第１一本鎖および第２一本鎖と実質的に同一であり得る。

【0036】

ここで、第２オリゴマー２０３の第２領域２３３と連結されていない第１領域２１０ｂおよび第３領域２１０ａの末端部は、特定のヌクレアーゼまたは化学反応に対して特異的な配列２１５ａ、２１５ｂを含み得る。

【0037】

本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマー３における第２オリゴマー２０３の第２領域２３３は、図１の実施形態による検出用オリゴマー１におけるヘアピンのループ２３０と実質的に同一であり得る。

【0038】

また、図面には図示しなかったが、本発明のまた他の実施形態による検出用オリゴマーは、図３の実施形態による検出用オリゴマーの第１オリゴマー１０３および／または第２オリゴマー２０３にカップリングされたラベルをさらに含むこともある。

【0039】

具体的に第１オリゴマー１０３の５’−末端にラベルがカップリングされた場合、検出用オリゴマーは周囲環境に応じた分子内反応を介して、図２に例示された検出用オリゴマーを形成することができる。類似に第２オリゴマー２０３の第２領域２３３にラベルがカップリングされた場合、検出用オリゴマーは周囲環境に応じた分子内反応を介して、ヘアピンのループにラベルがカップリングされた検出用オリゴマーを形成することができる。第１オリゴマー１０３および第２オリゴマー２０３にラベルがカップリングされた場合、鋳型の自由末端だけではなく、ヘアピンのループにラベルがカップリングされた検出用オリゴマーを形成することもできる。

【0040】

以下で、本発明の実施形態による検出用オリゴマーを用いたバイオチップのＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）方法を説明する。

【0041】

図４Ａから図４Ｆは、本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法において用いられるＱＣプローブは図１で例示的に説明した検出用オリゴマーから成るＱＣプローブであり得る。

【0042】

図４Ａを参考すれば、固定化相１０にカップリングされた多数のプローブ６０，６５を含むバイオチップを提供する。ここで、プローブ６０，６５は、バイオ試料に含まれた所定のバイオ分子を検出できる所望する数のモノマーを含む第１プローブ６０と、所望しない数のモノマーを含む第２プローブ６５を含む。以下では説明の便宜のため、所望する数のモノマーを含む第１プローブ６０は２５個のモノマーを含んでおり、所望しない数のモノマーを含む第２プローブ６５は２５個以外の数のモノマーを含むことを例にあげるが、これに制限されるものではない。また、第１および第２プローブ６０，６５の３’−末端は固定化相１０にカップリングされて固定され、５’−末端は自由末端であることを例にあげるが、これに制限されるものではない。

【0043】

固定化相１０は、プローブ６０，６５と直接または間接的にカップリングが可能な官能基を直接に提供することができ、また、アニーリング、オゾン処理、酸処理、塩基処理などの多様な表面処理により官能基の提供ができる物質で形成され得る。直接的にカップリングが可能であるということは、間に他の媒介物なしでプローブ６０，６５とカップリングする場合をいい、間接的にカップリングが可能であるということは、リンカー５０を媒介としてカップリングされる場合をいう。

【0044】

リンカー５０は、固定化相１０が有している官能基（例、ＳｉＯＨ）よりプローブ６０，６５とのカップリング反応性が大きい官能基を有し、バイオ試料との自由な相互作用ができるに充分な長さを提供できる物質で形成することができる。リンカー５０の形成は、必要によっては省略されることもできる。

【0045】

第１プローブ６０および第２プローブ６５が固定化相１０にカップリングされたバイオチップは、例えば、光分解性保護基（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）によって保護されている官能基を含む固定化相１０上に光照射を通して特定の領域の脱保護基を行い、官能基を露出した後、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）などのようなプローブ６０，６５を固定化相にカップリングする方法で製造され得る。また、光リソグラフィーによってモノマーをイン・サイチュ（ｉｎ−ｓｉｔｕ）合成する方法で製造したり、スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）などの方法によって、あらかじめ合成されたオリゴマープローブを固定化相にカップリングさせる方法で製造したりすることができる。

【0046】

前記のような製造工程によって製造されたバイオチップのプローブ６０，６５は、工程環境によって所望する数のモノマーを含む第１プローブ６０および所望しない数のモノマーを含む第２プローブ６５を含み得る。例えば、所定のバイオ分子を検出するための塩基配列を構成する２５個のモノマーを含むプローブをイン・サイチュ工程によって順に固定化相１０上に形成する場合、２５番目の配列のモノマーが形成されなかったり、１から２４番目の配列のうち一つ以上のモノマーが形成されず、所望しない数のモノマーを含む第２プローブ６５が形成され得る。これによって、固定化相１０にカップリングされた多数のプローブ６０，６５は、所定のバイオ分子を検出するための塩基配列を構成する２５個のモノマーを含む第１プローブ６０と２５個以外のモノマーを含む第２プローブ６５を含み得る。

【0047】

固定化相１０にカップリングされた第１および第２プローブ６０，６５の他端（５’−末端）は、第１および第２プローブ６０，６５にＱＣプローブ（図４Ｂの「１」参照）を混成化する前にリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｎｇ）することができる。リン酸化することは、例えば、キナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）を用いてリン酸化したり化学的にリン酸化したりすることができる。ここで、キナーゼは、例えば、Ｔ４ ＤＮＡキナーゼであり得る。

【0048】

次に、図４Ｂにおいては、固定化相１０にカップリングされた第１および第２プローブ６０，６５にＱＣプローブ１を混成化する。

【0049】

さらに、第１プローブ６０とＱＣプローブ１を連結する。具体的にＱＣプローブ１の第２一本鎖（ステム２１０において小文字で表示された塩基配列の部分）の他端（３’−末端）と第１プローブ６０の他端（５’−末端）をカップリングする。ここで、カップリングは、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）または化学反応によってされ得る。ライゲーションは、例えば、Ｔ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）、Ｅ．ｃｏｉｌリガーゼまたはＴａｑリガーゼなどのリガーゼを用いて行うことができる。

【0050】

所望する数のモノマーを有する第１プローブ６０の他端と、ＱＣプローブ１におけるヘアピン２００ステム２１０の第２一本鎖の他端は、互いに隣接して配置される部分７０でリガーゼによってカップリングされる。

【0051】

反面、所望しない数のモノマーを有する第２プローブ６５の他端と、ＱＣプローブ１におけるヘアピン２００ステム２１０の他端は、互いに交差する部分７５でリガーゼによってカップリングされないこともある。すなわち、第２プローブ６５の他端と、ＱＣプローブ１におけるヘアピン２００ステム２１０の他端の間には、一つのモノマーに対応する空間があるため、第２プローブ６５とＱＣプローブ１は互いにカップリングされないこともある。

【0052】

また、図面には図示しなかったが、１から２４番目の配列のうち一つ以上のモノマーが形成されていない第２プローブ６５の場合、ＱＣプローブ１の鋳型１００が折りたたまれて（ｆｏｌｄｅｄ）立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｅｒａｎｃｅ）が発生し得るため、リガーゼによって第２プローブ６５とＱＣプローブ１が互いにカップリングされないこともある。

【0053】

本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法においてＱＣプローブ１は鋳型１００によって第１プローブ６０に混成化して、ヘアピン２００によって第１プローブ６０とＱＣプローブ１が連結され得る。これによって、ＱＣプローブ１と第１プローブ６０が、ＱＣプローブ１と第１プローブ６０の２分子反応によって連結され得るため、バイオチップのＱＣ工程効率性が向上できる。すなわち、第１プローブ６０に相補的な塩基配列を含む第１鋳型を混成化させた後に、一端に検出用ラベルがカップリングされた第２鋳型を第１鋳型に混成化させて、第２鋳型と第１プローブ６０をカップリングさせる通常の３分子反応よりさらに速くバイオチップのＱＣ工程を行うことができる。

【0054】

図４Ｃにおいては、第１プローブ６０および第２プローブ６５とＱＣプローブ１の混成化結合が切断されるようにウォッシング（ｗａｓｈｉｎｇ）する。第１プローブ６０および第２プローブ６５とＱＣプローブ１の混成化結合を切断することは、例えば、塩基を添加してｐＨを調節したり、温度を高めたりすることであり得る。

【0055】

これによって、ＱＣプローブ１と混成化されているだけではなく、カップリングしていた第１プローブ６０は、ＱＣプローブ１が連結された一本鎖を形成することができる。反面、ＱＣプローブ１と混成化だけされていた第２プローブ６５はＱＣプローブ１が連結されていない一本鎖を形成することができる。

【0056】

図４Ｄにおいては、第１プローブ６０とＱＣプローブ１の鋳型１００を混成化して二重鎖を形成する。すなわち、第１プローブ６０とＱＣプローブ１がカップリングされた一本鎖を、第１プローブ６０とＱＣプローブ１鋳型１００の相補的な塩基配列およびＱＣプローブ１の第１一本鎖と第２一本鎖の相補的な塩基配列を混成化して二重鎖を形成することができる。二重鎖を形成することは、相補的な塩基配列が再び混成化できるように、ｐＨまたは温度を調節することであり得る。

【0057】

図４Ｅにおいては、二重鎖にラベル３１０をカップリングする。ここで、ラベル３１０は二重鎖にカップリングできる蛍光、燐光物質であり得る。ラベル３１０は、例えば、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＩＩ、ＳＹＢＲ ｇｏｌｄ、ＯＹ（Ｏｘａｚｏｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ）、ＴＯ（Ｔｈｉａｚｏｌｅ Ｏｒａｎｇｅ）、ＰＧ（Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ）などであり得る。

【0058】

これによって、バイオチップで所望する数のモノマーを含む第１プローブ６０を、第１プローブ６０にカップリングされたラベル３１０から提供される光信号によって検出することができる。すなわち、バイオチップでバイオ分子と混成化できる所望する塩基配列を有する第１プローブ６０と所望する塩基配列のうち一部が欠けた第２プローブ６５の比率を検出できるため、製造されたバイオチップの品質を測定することができる。

【0059】

次に、第１プローブ６０でＱＣプローブ１をデカップリングすることができる。第１プローブ６０でＱＣプローブ１をデカップリングすることは、ヌクレアーゼを用いたり他の化学反応によって行うことができる。ヌクレアーゼは、例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼなどであり得る。例えば、ＱＣプローブ１のステム２１０の一端部の特異的な回文配列２１５に反応する制限酵素を用いて第１プローブ６０とＱＣプローブ１をデカップリングすることができる。

【0060】

本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法においては、ＱＣプローブ１は、第１プローブ６０と混成化されて二重鎖を形成しているため、ヌクレアーゼなどによって効果的に第１プローブ６０をデカップリングすることができる。これによって、バイオチップで所定のバイオ分子を検出できるプローブ（例、所望する塩基配列を有する第１プローブおよび所望しない塩基配列を有する第２プローブ）に対する品質を測定した後、他のバイオ分子を検出できるプローブに対する品質を測定するために前に言及した過程を再び繰り返すことができる。

【0061】

図５は、本発明の他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法を説明する図である。本発明の他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法において用いられるＱＣプローブは、図２で例示的に説明した検出用オリゴマーから成るＱＣプローブであり得る。

【0062】

図５においては、本発明の他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法が本発明の一実施形態によるバイオチップのＱＣ方法と異なる点は、ラベル３１０を含むＱＣプローブ２を用いることである。これによって、第１プローブ６０および第２プローブ６５とＱＣプローブ２の混成化結合を切断した後に、所望する数のモノマーを含む第１プローブ６０を検出することができる。

【0063】

具体的に、本発明の他の実施形態によるＱＣ方法においては、ＱＣプローブ２はラベル３１０を含んでいるため、図４Ｄおよび図４Ｅに例示したＱＣ方法のような、本発明の一実施形態における第１プローブ６０とＱＣプローブ２を再び混成化して別途のラベルをカップリングさせる段階を必要とせずに、第１プローブ６０を検出することができる。

【0064】

図面には図示しなかったが、本発明のまた他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法ではヘアピンループにラベルがカップリングされたＱＣプローブを用いることもできる。

【0065】

また、本発明のまた他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法では、ＱＣプローブとして図３に図示した検出用オリゴマーを用いることもできる。すなわち、第１および第２プローブとＱＣプローブが混成化される段階でヘアピン構造を形成できるＱＣプローブを用いてバイオチップの品質を測定することもできる。

【0066】

さらに、本発明のまた他の実施形態によるバイオチップのＱＣ方法では、ＱＣプローブとして、図３に図示した検出用オリゴマーの第１オリゴマーおよび／または第２オリゴマーにラベルがカップリングされたＱＣプローブを用いることもできる。

【0067】

図６は、本発明の実施形態によるバイオチップのＱＣが用いられるバイオチップの断面図である。

【0068】

図６においては、第１および第２プローブ６０，６５は、バイオチップ９０の少なくとも第１層１００にカップリングされ得る。本発明の他の実施形態で、バイオチップ９０は、第１層、第２層、または第３層１００，１１０，１２０にカップリングされたバイオ分子、プローブおよび／またはオリゴマーと制御部９０との間の電気的通信が可能なように第２層および第３層１１０，１２０をさらに含み得る。第１層１００は、第１および第２プローブ６０，６５が固定できるリンカー５０をさらに含むこともある。

【0069】

一実施形態で制御部９０は、電気的コネクション８５を通じてバイオチップ９０で形成される電気的な信号を制御、感知および／または測定することができる。他の実施形態で、制御部９０はリンカー５０、第１および第２プローブ６０，６５が形成された電極（図示せず）をさらに含むこともある。また、他の実施形態で、制御部９０は、電源提供部を用いてバイオチップ９０に電気的信号を提供することもできる。

【0070】

以上添付された図面を参照して、本発明の実施形態について説明したが、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明を、その技術的思想や必須の特徴を変更しない範囲で、他の具体的な形態において実施され得ることを理解することができる。したがって、上記記述した実施形態はすべての面で例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6】