特許 5746813 皮膚の老化の外観を処置、低減及び抑制する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5746813

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月8日

(54)【発明の名称】皮膚の老化の外観を処置、低減及び抑制する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20150618BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20150618BHJP

   A61P 17/16 20060101ALI20150618BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20150618BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20150618BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   A61K8/64

   A61P17/16

   A61P43/00 111

   A61Q19/08

【請求項の数】10

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2008-557569(P2008-557569)

(86)(22)【出願日】2007年3月9日

(65)【公表番号】特表2009-532332(P2009-532332A)

(43)【公表日】2009年9月10日

(86)【国際出願番号】CA2007000396

(87)【国際公開番号】WO2007101354

(87)【国際公開日】20070913

【審査請求日】2010年3月9日

【審判番号】不服2013-9817(P2013-9817/J1)

【審判請求日】2013年5月28日

(31)【優先権主張番号】60/780,352

(32)【優先日】2006年3月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】60/797,352

(32)【優先日】2006年5月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(74)【代理人】

【識別番号】100080816

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 朝道

(74)【代理人】

【識別番号】100098648

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 潔人

(72)【発明者】

【氏名】グランビル、デビッド、ジェームズ

(72)【発明者】

【氏名】クルス、ラニ、プリヤ、ゴメス

【合議体】

【審判長】 内藤 伸一

【審判官】 新留 素子

【審判官】 大久保 元浩

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００５−５２２４３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−１３６１２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０００年，Ｖｏｌ．１４７７（１−２），ｐｐ．３０７−３２３

【文献】 ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ ＪＯＵＲＮＡＬ，１９９７年，Ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３６−４０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

A61K 45/00-45/08

ＣＡＰｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍ２）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚の弾力性を増加するため、
皮膚の脆弱性を維持又は低減するため、
皮膚の厚さを維持又は増加するため、
対象の皮膚のしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、
皮膚のしわの深さを維持又は低減するため、
皮膚の細かいしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、
対象の皮膚の変色の外観ないし発現を維持又は低減するため、及び／又は
対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。

【請求項2】

前記皮膚の細胞外蛋白質の含有量を維持又は増加するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量を維持又は増加するための請求項１に記載の美容剤。

【請求項3】

細胞外蛋白質の含有量の減少速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量の減少速度を低減するための請求項１に記載の美容剤。

【請求項4】

前記皮膚の弾力性の減少速度を低減するため、
前記皮膚の脆弱性の増加速度を低減するため、
前記皮膚の厚さの減少速度を低減するため、
前記対象の前記皮膚のしわの発現の増加速度を低減するため、
前記皮膚のしわの深さの増加速度を低減するため、
前記皮膚の細かいしわの発現の増加速度を低減するため、
前記皮膚の変色の発現の増加速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の体毛の毛包密度の増加速度を増加するための請求項１又は３に記載の美容剤。

【請求項5】

対象の皮膚の非弾力性を低減するため、
対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減するため、又は
対象の皮膚の弾力性を維持するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。

【請求項6】

前記美容剤は、局所的に適用するため、
皮下的に適用するため、又は
全身的に適用するための組成物として調製される請求項１〜５のいずれか一に記載の美容剤。

【請求項7】

前記対象は人間を除く哺乳動物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一に記載の美容剤。

【請求項8】

前記対象は人間であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一に記載の美容剤。

【請求項9】

対象の皮膚の細胞外基質蛋白質の劣化ないし変質を抑制するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。

【請求項10】

前記細胞外基質蛋白質がエラスチンである、請求項９に記載の美容剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚の美容の分野に関する。特に、グランザイムＢ阻害剤を用いる皮膚の老化の外観（ないし発現）の処置、低減及び抑制に関する。

【背景技術】

【0002】

ＷＯ０３／０６５９８７で公開された国際出願には、自己免疫性慢性炎症やその他の疾病及び障害の治療のためにグランザイムＢ阻害剤を用いることが開示されている。

【0003】

２００３／０１４８５１１で公開された米国特許出願には、細胞傷害性Ｔ細胞を媒介した免疫反応を増大させるための方法と共に、ウイルス及び／又は癌に対するホスト（宿主）免疫を増大させるためにグランザイムＢ阻害剤を用いることが開示されている。

【0004】

Ｂｕｚｚａら（The Journal of Biological Chemistry, Volume 280, No. 25, pages 23549-23558(2005)）によると、グランザイムＢは細胞外の基質を再構築する強い能力があると記載している。Ｂｕｚｚａらはまた、原初（未組換え）の及び組換え型のグランザイムＢはいずれも、主に内皮細胞及び軟骨細胞の不死化及び形質変換された株化細胞を分離すると記載している。Ｂｕｚｚａらはまた、グランザイムＢは細胞外基質の構造や機能に関与する３つの蛋白質、ビトロネクチン、フィブロネクチン及びラミニンを切断（開裂）すると記載している。

【0005】

皮膚は人体の中で最も大きな臓器の１つであり、その状態や外観は、皮膚に含まれるエラスチンの量と状態により部分的に決定される。エラスチンは基質蛋白質であり、トロポエラスチンモノマーから構成され、架橋してより大きな三次構造を形成している。エラスチンは弾力性を与え、負荷状態での伸張による組織の動的変形を抑制又は制止し、負荷がなくなった後に組織がもとの配列に戻ることを可能にする。皮膚のしなやかさや弾力性の喪失、関節のこわばりそして柔軟性の喪失は、エラスチンの劣化と組織の結合構造の変質に関連している。

【特許文献1】ＷＯ０３／０６５９８７

【特許文献2】ＵＳ２００３／０１４８５１１

【特許文献3】ＷＯ２００４／１００８８９

【非特許文献1】Buzza, et. al., The Journal of Biological Chemistry, Volume 280, No. 25, pages 23549-23558(2005)

【非特許文献2】Bird et. al.、Mol. Cell. Biol. 18, 6387-6398(1998)

【非特許文献3】Kam et. al.、Biochim Biophys Acta 1477(12):307:23(2000)

【非特許文献4】Alfonso Gennaro, Remington: the Science & Practice of Pharmacy, 20th ed., Williams & Wilkins (2000)

【非特許文献5】Agache et. al., Measuring the Skin, Springer (2004)

【非特許文献6】Chapman et.al., British Journal of Dermatology (2005),152: 646-649

【非特許文献7】Banda, M. J. and Werb, Z., (1981) Biochem J, 193:589-605

【非特許文献8】Gordon, S., Werb, Z, and Cohn, Z.A. (1976), In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, Bloom, B.R.とDavid, J.R.による共同編集, Academic Press, New York, page 349-350

【発明の開示】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

皮膚の性質を改善処理するさまざまな組成物や方法が知られている。例えば、ＷＯ２００４／１００８８９で出願公開された国際出願には、皮膚の美観を改善するための、３，３’−チオジプロピオン酸又はその誘導体を含む抗老化剤が開示されている。皮膚の性質を改善処理する一つの方法は、美容外科手術である。他の方法は、腐食性組成物の適用のみか、又は皮膚の外皮を物理的に剥ぎ取る、いわゆる「皮膚剥離」及び「化学的脱皮」処理を組み合わせるものである。皮膚の性質を改善処理する多くの組成物は、疾病の治療のための医薬ではなく、しわやたるみ（窪み）といった皮膚の正常な状態を改変するものである。このような正常な皮膚の状態は、しばしばエラスチン即ち細胞外蛋白質の劣化（ないし変質、degradation）に関係している。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、部分的に、グランザイムＢが、皮膚中のエラスチンとともに、及び皮膚中のエラスチンの近傍に共存しているという観察結果に基づいている。本発明はまた、部分的に、グランザイムＢは、他の細胞外基質（マトリックス）蛋白質に加えて、細胞及び血漿を取り囲む間質空間のエラスチンを切断するという観察結果に基づいている。

【0008】

本発明の１つの視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象（subject）の皮膚に適用する（ないし施す、application）ことを含む、対象の皮膚の外観を若々しく保つための方法が提供される。

【0009】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を低減するための方法が提供される。

【0010】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を抑制するための方法が提供される。

【0011】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の老化の外観の発現速度を低減するための方法が提供される。

【0012】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の非弾力性（弾力性のなさ、inelasticity）を低減するための方法が提供される。

【0013】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の非弾力性の増加速度（弾力性の喪失速度）を低減するための方法が提供される。

【0014】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の弾力性を保つための方法が提供される。

【0015】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚に適用することを含む、対象の皮膚の体毛（hair）の毛包（follicle）密度を増加するための方法が提供される。

【0016】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の外観を若々しく保つためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0017】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を低減するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0018】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を抑制するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0019】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化的外観の発現速度を低減するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0020】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化的外観の発現速度を低減するための薬剤の調製のためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0021】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の非弾力性を低減するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0022】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0023】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減するための薬剤を調製するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0024】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の弾力性を維持するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0025】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の弾力性を維持するための薬剤を調製するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0026】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0027】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するための薬剤を調製するためのグランザイムＢ阻害剤の使用が提供される。

【0028】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の外観を若々しく保つために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0029】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0030】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化の外観ないし発現を抑制するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0031】

本発明の他の視点において、皮膚の細胞外蛋白質の含有量を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0032】

本発明の他の視点において、皮膚の皮膚エラスチンの含有量を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0033】

本発明の他の視点において、皮膚の弾力性を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0034】

本発明の他の視点において、皮膚の脆弱性を維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0035】

本発明の他の視点において、皮膚の堅牢性を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0036】

本発明の他の視点において、皮膚の剥がれ落ちやすさを維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0037】

本発明の他の視点において、皮膚の乾燥度を維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0038】

本発明の他の視点において、皮膚のポア（細孔ないし毛穴）サイズを維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0039】

本発明の他の視点において、皮膚の厚さを維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0040】

本発明の他の視点において、皮膚の細胞の代謝回転速度を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0041】

本発明の他の視点において、対象の皮膚のしわの外観ないし発現を維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0042】

本発明の他の視点において、皮膚のしわの深さを維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0043】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の細かいしわの外観ないし発現を維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0044】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の変色の外観ないし発現を維持又は低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0045】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の老化的外観の発現速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0046】

本発明の他の視点において、細胞外蛋白質の含有量の減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害が提供される。

【0047】

本発明の他の視点において、皮膚の皮膚エラスチンの含有量の減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0048】

本発明の他の視点において、皮膚の弾力性の減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0049】

本発明の他の視点において、皮膚の脆弱性の増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0050】

本発明の他の視点において、皮膚の堅牢性の減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0051】

本発明の他の視点において、皮膚の剥がれ落ちやすさの増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0052】

本発明の他の視点において、皮膚の乾燥度の増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0053】

本発明の他の視点において、皮膚のポアサイズの増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0054】

本発明の他の視点において、皮膚の厚さの減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0055】

本発明の他の視点において、皮膚の細胞の代謝回転速度の減少速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0056】

本発明の他の視点において、対象の皮膚のしわの発現の増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0057】

本発明の他の視点において、皮膚のしわの深さの増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0058】

本発明の他の視点において、皮膚の細かいしわの発現の増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0059】

本発明の他の視点において、皮膚の変色の発現の増加速度を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0060】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の非弾力性を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0061】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の非弾力性の増加速度（弾力性の喪失速度）を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0062】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の弾力性を維持又は増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0063】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0064】

本発明の他の視点において、体毛の灰色化（しらが化）を低減するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0065】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を局所的に適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0066】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を皮下的に適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0067】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚全体に適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0068】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の皮膚の一部に適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0069】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を対象の頭皮のみに適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0070】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤を全身的（systemic）に適用するために使用するグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0071】

本発明の他の視点において、適用の対象は哺乳動物であることを特徴とするグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0072】

本発明の他の視点において、適用の対象は家庭用ペットであることを特徴とするグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0073】

本発明の他の視点において、適用の対象は人間であることを特徴とするグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0074】

本発明の他の視点において、適用の対象は犬であることを特徴とするグランザイムＢ阻害剤が提供される。

【0075】

本発明の他の視点において、皮膚の細胞外蛋白質の含有量を維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0076】

本発明の他の視点において、皮膚のエラスチン含有量を維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0077】

本発明の他の視点において、皮膚の弾力性を維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0078】

本発明の他の視点において、皮膚の脆弱性（fragility）を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0079】

本発明の他の視点において、皮膚の堅牢性（引き締まり、firmness）を維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0080】

本発明の他の視点において、皮膚の剥がれ落ちやすさ（flakiness）を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0081】

本発明の他の視点において、皮膚の乾燥度を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0082】

本発明の他の視点において、皮膚のポアサイズを維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0083】

本発明の他の視点において、皮膚の厚さを維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0084】

本発明の他の視点において、皮膚細胞の代謝回転速度を維持又は増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0085】

本発明の他の視点において、対象の皮膚のしわ(wrinkles)の外観（ないし発現）を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0086】

本発明の他の視点において、皮膚のしわの深さを維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0087】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の細かいしわ（すじ、fine lines）の外観を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0088】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の変色（退色、discolouration）の外観を維持又は低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0089】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の細胞外蛋白質含有量の減少速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0090】

本発明の他の視点において、対象の皮膚のエラスチン含有量の減少速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0091】

本発明の他の視点において、皮膚の弾力性の減少速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0092】

本発明の他の視点において、皮膚の脆弱性の増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0093】

本発明の他の視点において、皮膚の堅牢性（引き締まり）の減少速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0094】

本発明の他の視点において、皮膚の剥がれ落ちやすさの増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0095】

本発明の他の視点において、皮膚の乾燥度の増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0096】

本発明の他の視点において、皮膚のポアサイズの増大速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0097】

本発明の他の視点において、皮膚の厚さの減少速度を増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0098】

本発明の他の視点において、皮膚細胞の代謝回転速度の減少速度を増加することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0099】

本発明の他の視点において、対象の皮膚のしわの外観の増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0100】

本発明の他の視点において、皮膚のしわの深さの増大速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0101】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の細かいしわ（すじ）の外観の増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0102】

本発明の他の視点において、対象の皮膚の変色（退色）の外観の増加速度を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0103】

本発明の他の視点において、体毛の灰色化（しらが化）を低減することを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0104】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が局所的に適用されることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0105】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が皮下的に適用されることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0106】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が対象の皮膚全体に適用されることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0107】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が対象の皮膚の一部に適用されることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0108】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が対象の頭皮のみに適用されることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0109】

本発明の他の視点において、グランザイムＢ阻害剤が全身的（systemic）に適用されることされることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0110】

本発明の他の視点において、対象が哺乳動物、家庭内ペット、人間及び犬であることを特徴とする方法及び使用が提供される。

【0111】

本発明の他の視点において、以下の手順を含むグランザイムＢ阻害剤の識別方法が提供される。即ち、i）グランザイムＢを試験化合物と接触させ、初回刺激を受けたグランザイムＢを形成する、ii）初回刺激を受けたグランザイムＢを細胞外皮膚膜に接触させる、iii）切断された細胞外蛋白質の量を測定する。そして切断された細胞外蛋白質の量が小さければ、その試験化合物はグランザイムＢ阻害剤と判断される。

【0112】

本発明の他の視点において、以下の手順を含むグランザイムＢ阻害剤の識別方法が提供される。即ち、i）グランザイムＢを試験化合物と接触させ、初回刺激を受けたグランザイムＢを形成する、ii）初回刺激を受けたグランザイムＢをエラスチンに接触させる、iii）切断されたエラスチンの量を測定する。そして切断されたエラスチンの量が小さければ、その試験化合物はグランザイムＢ阻害剤と判断される。

【0113】

本発明の他の視点において、以下の手順を含むグランザイムＢアゴニスト（作用物質）の識別方法が提供される。即ち、i）グランザイムＢを試験化合物と接触させ、初回刺激を受けたグランザイムＢを形成する、ii）初回刺激を受けたグランザイムＢを細胞外皮膚膜に接触させる、iii）切断された細胞外蛋白質の量を測定する。そして切断された細胞外蛋白質の量が多ければ、その試験化合物はグランザイムＢアゴニストと判断される。

【0114】

本発明の他の視点において、以下の手順を含むグランザイムＢアゴニストの識別方法が提供される。即ち、i）グランザイムＢを試験化合物と接触させ、初回刺激を受けたグランザイムＢを形成する、ii）初回刺激を受けたグランザイムＢをエラスチンに接触させる、iii）切断されたエラスチンの量を測定する。そして切断されたエラスチンの量が多ければ、その試験化合物はグランザイムＢアゴニストと判断される。

【発明を実施するための最良の形態】

【0115】

グランザイムＢは、細胞及び血漿を取り囲む間質空間にあるエラスチン及びその他の細胞外蛋白質を切断することができるセリンプロテアーゼである。グランザイムＢを阻害することは、エラスチン及びその他の細胞外蛋白質の切断を低減する。エラスチン及びその他の細胞外蛋白質の切断を低減することは、皮膚の状態を改善し、維持し、又は皮膚の通常の劣化速度を低減する。

【0116】

グランザイムＢは、阻害できる酵素（エンザイム）である。グランザイムＢの阻害剤は、グランザイムＢによって細胞外蛋白質が切断されるのを阻害又は低減する物質である。例えば、グランザイムＢがエラスチンを切断するのを阻止する化合物又は組成物は、グランザイムＢ阻害剤であろう。多くの場合、阻害剤は拮抗剤（アンタゴニスト）と称される。その逆に、グランザイムＢの細胞外蛋白質切断能力を促進する物質はアゴニスト（作用物質）といわれる。例えば、グランザイムＢがエラスチンを切断する速度を増加させる化合物又は組成物はグランザイムＢアゴニストである。

【0117】

グランザイムＢ阻害剤は、初回刺激を受けたグランザイムＢを形成するために、グランザイムＢと試験化合物とを接触することにより識別される。試験化合物とは、それがグランザイムＢ阻害剤かどうか識別したい物質、化合物又は組成物である。初回（接触）刺激を受けた（primed）グランザイムＢとは、それに結合した試験化合物を有するか、又は有さないグランザイムＢエンザイムであり、試験化合物と接触又は混合されてできたものである。言い換えれば、初回刺激を受けたグランザイムＢとは、エラスチンのような細胞外蛋白質を加えることにより、試験化合物がグランザイムＢの阻害剤又は拮抗剤であるか、そうでないかを識別するという状況下でのグランザイムＢエンザイムである。いったん初回刺激を受けたグランザイムＢが形成されれば、それを所定量のエラスチンのような細胞外蛋白質と接触させ、所定の期間に蓄積される切断された細胞外蛋白質の量を測定し、それを通常の切断された細胞外蛋白質の量と比較することにより、その試験化合物がグランザイムＢ阻害剤かどうかを識別することができる。通常の切断された細胞外蛋白質の量は、同じ所定量の細胞外蛋白質をグランザイムＢ、即ち初回刺激を受けていないグランザイムＢに加え、先の所定期間に蓄積される切断された細胞外蛋白質の量を測定することによって得られる。所定期間とは、初回刺激を受けていないグランザイムＢにより、全ての所定量の細胞外蛋白質が切断されてしまうことのない期間である。もしも切断された細胞外蛋白質の量が、通常の切断された細胞外蛋白質の量よりも少なければ、試験化合物はグランザイムＢ阻害剤又は拮抗剤とされる。もしも、切断された細胞外蛋白質の量が、通常の切断された細胞外蛋白質の量と同じであれば、試験化合物はグランザイムＢ阻害剤又は拮抗剤ではないと判断される。択一的に、もしも切断された細胞外蛋白質の量が、通常の切断された細胞外蛋白質の量よりも多ければ、試験化合物はグランザイムＢのアゴニスト（作用物質）である。特定の阻害剤、拮抗剤又はアゴニストの存在下、又は非存在下でのグランザイムＢによるエラスチン切断速度の識別に、同様の試験方法が用いられる。

【0118】

皮膚は、３つの主要層即ち表皮、真皮及び皮下層からなる。これらの３つの層はそれぞれ独自の組成を持つ。これらの層の機能と構造は当業者には周知である。表皮は、皮膚の最も外側の層であり、生きている細胞層と死滅した細胞層とを含む。真皮は、皮膚の中間層で、多くの特殊化された細胞と構造を取り囲むコラーゲン繊維の配列からなる。体毛の毛包は真皮にあり、真皮層及び表皮層を貫通して成長し、体毛として見えるようになる体毛の幹を生産する。皮膚の最も内側の層は皮下層と呼ばれる。皮下層は、大部分が脂肪及び結合組織からなり、比較的大きな血管と神経を内蔵している。エラスチンは皮膚のどの層でも観察されるが、真皮層に最も多く見られる。

【0119】

皮膚の若々しい外観は、老化の特徴的な兆候が１つもないことによって得られる。これは通常若さによって達成される。にもかかわらず、状況によっては、若いからといっても若々しい外観を示さない場合がある。疾病や異常、又は年月に関係しない事象によって老化の特徴が現れることがあるからである。若々しい外観は、しばしば皮膚の状況によって特徴付けられる。そして以下の皮膚の特質が、これに限られないが、若々しい外観に典型的に関係している。小さいポア（細孔ないし毛穴）サイズ、健康的な色調、輝き、透明感、しなやかさ、引き締まり、豊満さ、柔軟さ、弾力性、柔らかさ、健康的な肌触り、しわがほとんどない健康的な輪郭、しわの浅さ、細かいしわ（すじ）がほとんどないこと、健康的な皮膚のつやと明るさ、みずみずしさ、健康的な肉付き及び弾力のある肌である。対象の皮膚が、これらの特徴のいずれか一つ以上を備えていれば、若々しい外観が達成される。

【0120】

老化の外観（ないし発現、appearance）はさまざまな原因により生じうるが、典型的には年月の経過にともなって通常の速度で発生する。老化の外観が発現する速度は、対象の違いによって異なり、年齢、性別、食餌及び生活習慣を含むさまざまな要因に依存する。老化の外観は、しばしば皮膚の状況によって特徴付けられる。皮膚の老化の外観に関連する特徴には、これらに限られないが、皮膚のもろさ（脆弱性）、皮膚の萎縮、皮膚のしわ、細かいしわ（すじ）、皮膚の変色（退色）、皮膚のたるみ（窪み）、皮膚の衰え（疲弊）、皮膚の緊張、皮膚の非弾力性、皮膚のもろさ、皮膚の軟化、皮膚の剥がれ落ち（flakiness）、皮膚の乾燥、ポアサイズの増大、皮膚の薄化、皮膚の細胞の代謝速度の減少、皮膚のしわが深くなること、である。老化の外観の発現速度は、これらの特徴の１つ以上が発現する速さで測定できる。老化の外観（ないし発現）は、これらの皮膚の特徴のいずれか一以上の状態を減少させ、又は維持することにより、抑制し、低減し、又は処置することができる。

【0121】

多くの場合、皮膚の外観における老化の低減は、グランザイムＢを阻害することにより、エラスチン生成速度がエラスチン切断（分解）速度を上回る場合に達成される。他の多くの場合、皮膚の若々しい外観は、グランザイムＢを阻害することにより、エラスチン生成速度とエラスチン切断（分解）速度とが同等となる場合に達成される。他の多くの場合、皮膚の老化の外観の発現速度の低減は、グランザイムＢ阻害剤を適用（ないし投与）することにより、エラスチン切断速度がエラスチン生成速度を上回り、エラスチン切断速度のエラスチン生成速度に対する比率が、グランザイムＢ阻害剤投与前に比べて、グランザイムＢ阻害剤投与後において、大きくなるように、エラスチンの切断速度を遅くすることによって達成される。他の多くの場合、エラスチンを除く細胞外蛋白質もまたグランザイムＢによって切断されるため、グランザイムＢを阻害する有利な効果は、エラスチンの切断を阻害するだけの場合の効果よりも大きくなりうる。

【0122】

多くのグランザイムＢ阻害剤が当業者に公知であり、例えば公開番号ＷＯ０３／０６５９８７の国際出願、米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１４８５１１、バードら(Bird et. al.)、Mol. Cell. Biol. 18, 6387-6398(1998)、カムら(Kam et. al.)、Biochim Biophys Acta 1477(12):307:23(2000)に開示されている。グランザイムＢ阻害剤（複数）は、ペプチド（複数）と小さな分子（複数）を含むが、それに限られるものではない。グランザイムＢ阻害剤の識別方法は、この明細書の他のところで説明する。

【0123】

多くのグランザイムＢ阻害剤は水溶性であり、塩を形成しうる。そのような場合、グランザイムＢ阻害剤の組成物は、当業者に公知の生理学（機能）的に受容可能な塩を含む。製剤は、一般的に製剤の投与モードに適した１以上の担体を含む。投与モードは、局所投与、洗浄、表皮投与、表皮下投与、経皮投与、真皮下投与、皮下（内）投与、全身投与、注射、吸入、経口投与又は選択した処置に適した他のモードである。適切な担体（複数）は、このような投与モードの利用分野に公知のものがある。

【0124】

公知の方法により適切な組成物が処方調製され、当業者によって投与モード及び投与量が決定される。非経口投与の場合、化合物は殺菌水又は生理食塩水に溶解され、あるいはビタミンＫの投与に用いられるような、非水溶性化合物に用いられる薬理学的に受容可能な担体に溶解される。経腸投与の場合、化合物はタブレット（錠剤）、カプセル又は溶液の形で投与される。タブレット又はカプセルは腸溶性コーティングされるか、持続的に放出される（徐放性）製剤とする。多くの適切な製剤が公知である。これらには、放出される化合物を高分子又は蛋白質でカプセル化した微粒子、軟膏、ペースト、ゲル、ハイドロゲル、泡、クリーム、パウダー、ローション、オイル、半固形物、石鹸、薬用石鹸、シャンプー、薬用シャンプー、スプレー、フィルム、溶液が含まれ、いずれも化合物の局所投与に用いることができる。長期間にわたって持続放出させるために、持続放出性（徐放性）パッチ又は埋め込み（インプラント）が適用されうる。多くの公知技術がアルフォンソ・ジェンナロ、「レミントン：薬学の科学と実践」（Remington: the Science & Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro, 20th ed., Williams & Wilkins (2000)）に記載されている。製剤は、例えば賦形剤、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール、野菜由来のオイル、又は水素化されたナフタレンを含みうる。生体適合（親和）性で生体中で分解するラクチドポリマー、ラクチド／グリコライドコポリマー（共重合体）、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが化合物の放出をコントロールするために用いられうる。そのほかに調節性化合物の運搬システムとして役に立つ可能性のあるものとして、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入システム、及びリポソームが含まれる。製剤として、例えばラクトースといった賦形剤を含み、又は例えばポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸及びデオキシコール酸を含む水溶液、又は液滴又はゲルの形態で投与する油状溶液でありうる。

【0125】

グランザイムＢ阻害剤を含む組成物は、浸透剤（penetrating agents）も含みうる。浸透剤は、グランザイムＢ阻害剤が皮膚のより深い層へ運搬される能力を改善する。使用される浸透剤は当業者に公知であり、Ｌアルギニン又はアルギニンを含むアミノ酸のほか、ヒアルロン酸、インスリン、リポソーム、又はこれらと同等なものを含むが、これらに限定されない。

【0126】

なお、参考例として、グランザイムＢ阻害剤の化合物及び組成物は、インプラント、移植、プロステーシス（補綴）、衣類の着用、ステント等の医療用器具又は装具を用いて投与しうる。また、インプラントは、化合物や組成物を含み、放出するように細工しうる。一つの例は、化合物を長期にわたって放出するように調整した高分子材料からなるインプラントである。このようなインプラントは、対象が身に着ける衣類、例えば手袋、シャツ、マスク、又は帽子に配置しうる。

【0127】

グランザイムＢ（阻害剤）組成物の「有効（ないし効果的）な量」には、治療として有効（効果的）な量又は予防として有効（効果的）な量を含む。「治療として有効（効果的）な量」とは、皮膚の弾力性、皮膚の耐久性、皮膚の締り、及び皮膚のきめの改善といった望ましい治療的結果を達成するために必要な投与量及び投与期間としての有効（効果的）な量を指す。化合物の、治療として有効（効果的）な量は、対象の皮膚の状態、年齢、性別及び体重といった要素、及び対象に望ましい反応を引き起こさせる化合物の能力によって変わりうる。最適な治療効果を発現させるために、投与計画が調節されうる。治療として有効（効果的）な量とはまた、化合物の有毒又は有害な効果よりも、治療上の有益な効果のほうが勝る量でもある。「予防として有効（効果的）な量」とは、皮膚の弾力性、皮膚の耐久性、皮膚の締り、及び皮膚のきめの改善といった望ましい予防的結果を達成するために必要な投与量及び投与期間としての有効（効果的）な量を指す。一般的には、予防的投与量は、皮膚の劣化よりも前又はその初期段階に対象に用いられる。したがって、予防として有効（効果的）な量は治療として有効（効果的）な量よりも少ない。

【0128】

投与量は、皮膚の老化の発現程度によって変わりうるということに注意しなければならない。どのような対象であっても、その対象のための投与計画は各対象の必要性及び化合物の投与者又は投与監督者の判断に基づいて、投与期間中調整されうる。ここに説明する投与（量）の範囲は例示のみであり、選択される投与（量）範囲を限定するものではない。組成物中の活性化合物の量は、対象の皮膚の状態、年齢、性別及び体重といった要素によって変わりうる。投与計画は、最適な治療的効果を与えるために調整されうる。例えば、１種類の適用（投与）が処方されたり、複数の分割投与が期間中に処方されたり、あるいは投与量は状況の緊急性に比例して減少又は増加されうる。投与を容易にするため及び投与量を均一にするため、１回あたりの投与量の形態で製剤しておくことが有利である。

【0129】

一般に、本発明の化合物は重大な毒性を引き起こさないように用いなければならない。本発明の化合物の毒性は、標準的な技術、例えば培養細胞又は実験動物による試験、及び試験係数即ちＬＤ５０（個体数の５０％致死量）とＬＤ１００（個体数の１００％致死量）との比率を測定することによって決定することができる。しかしある状況下、例えば皮膚の老化の発現が著しい場合においては、組成物のかなり過剰な投与が必要になるかもしれない。

【0130】

ここで用いる「対象」（subject）とは、哺乳動物、人間を除く霊長類、家庭用ペット、人間、ラット、マウス、牛、馬、豚、羊、ヤギ、犬、猫、等である。対象は、皮膚の老化の発現が疑われる、又は発現のリスクがあるものである。皮膚のしわ及び皮膚のたるみを含む皮膚の老化現象の発現の種々の段階の診断方法は、当業者に公知である。例えばアガチェら、「皮膚の測定」（Measuring the Skin by Agache et. al., Springer (2004)）を参照のこと。

【0131】

グランザイムＢ阻害剤は、老化の発現を抑制又は低減するために用いられる。老化は自然現象であり、それ自体は元に戻すことはできないが、皮膚の弾力性の喪失、皮膚のもろさ、皮膚の軟化、皮膚の剥がれ易さ、皮膚の乾燥、ポアの大きさの増大、皮膚の薄化、皮膚細胞の代謝速度の減少、皮膚のしわ、しわが深くなること、皮膚のたるみ、細かいしわ（すじ）、及び皮膚の変色（退色）を含む皮膚の劣化（これらに限らないが）つまり老化の発現は、抑制又は低減しうる。

【0132】

グランザイムＢ阻害剤は、皮膚の特定の特徴の発現の増加速度又は低減速度を増加又は低減するために用いられる。言い換えれば、グランザイムＢ阻害剤は、対象の皮膚又は皮膚の一部に投与された場合、老化の発現の兆候を遅らせるのである。例えば、１つの母集団の中で、個体数の半分の皮膚にはグランザイムＢ阻害剤を投与し、他の半分にはグランザイムＢ阻害剤を投与しない場合、ある期間が経過した後、グランザイムＢ阻害剤を投与した半数の個体には、グランザイムＢ阻害剤を投与しなかった半数の個体ほどには老化は見られないであろう。グランザイムＢ阻害剤を投与した半数の個体には、若々しい外観を保っているであろう。

【0133】

ある特定の対象が、特定の皮膚の特徴の発現速度の変化、即ち特定の皮膚の特徴の発現速度の増加又は低減を生じる割合ないし程度（rate）は、対象の年齢、体重、性別、及び生活習慣（これらに限られるわけではないが）を含む種々の要素に依存する。このように、割合は必ずしも一定ではないが、本発明に係る方法及び使用に基づいて投与されるグランザイムＢ阻害剤を除く一連の諸条件（a set of conditions）の下で、所定の期間後に特定の特徴が新たに発現することとして定義される、特徴の発現が増加又は低減する通常の割合は、本発明に係る方法又は使用に基づくグランザイムＢ阻害剤の投与により増加し、又は低減するのである。皮膚の特徴、皮膚の特徴の発現の増加速度、及び皮膚の特徴の発現の低減速度を測定する方法は当業者に公知である。例えばアガチェら、「皮膚の測定」（Measuring the Skin by Agache et. al., Springer (2004)）を参照のこと。

【0134】

驚くべきことに、グランザイムＢ阻害剤は対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加させるためにも用いられ、また対象の皮膚の皮膚黄色腫の発生を減少させるためにも用いられうる。活発に成長する体毛の毛包は、基質ケラチン生成細胞に色素を送り、体毛に色を付ける働きをするメラニン細胞を含んでいる。さらに、皮脂分泌線で生成される皮脂は、しばしば体毛の毛包を経由して分泌される。体毛の毛包密度の増加は、色素の生成を増加し、そして皮脂の分泌を増加し、結果として健全な体毛と皮膚に改善されるとともに、体毛の外観が改善（例えば白髪が減少し、あるいは白髪がなくなる）される。グランザイムＢ阻害剤はまた、皮膚のより深い部分に体毛の毛包を発生させる。これにより、機械的な損傷に影響されにくい強い体毛を生成することができる。さらに、老化の特徴的な兆候は毛包密度の減少である。当業者には、年齢と毛包の微小化は体毛数とはあまり強い因果関係にないことが知られている（チャップマンら、Chapman et.al., British Journal of Dermatology (2005),152: 646-649を参照のこと）。したがって、体毛の毛包密度に関する老化の特徴的兆候は、体毛の濃さを予測させるものではない。

【0135】

グランザイムＢ阻害剤又はグランザイムＢ阻害剤を含む組成物は、対象の皮膚の一部又は全体に投与することができる。例えば、グランザイムＢ阻害剤及びグランザイムＢ阻害剤を含む組成物は、顔面のみ、頭皮のみ、顔を含む頭部全体又は体の各部ごとに適用ないし投与することができる。グランザイムＢ阻害剤及びグランザイムＢ阻害剤を含む組成物は、例えば、皮膚の老化の外観ないし発現の処置、低減及び抑制するための製剤、つまり、皮膚の美容剤、即ち、美容のための製剤である。

【0136】

以下に本発明の択一的な実施形態及び実施例をいくつか説明する。これらの実施形態及び実施例は例示のみであり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。

【実施例】

【0137】

（実施例１）
アポリポ蛋白Ｅ(ApoE)／グランザイムＢ ダブルノックアウト(DKO)マウス
（１）C57Bl/6 野生型(WT)、（２）C57/ApoE -/-(ApoE-KO)、（３）C57/GrB -/-(GrB-KO)及び（４）C57 GrB/ApoE-DKO(DKO)からなる４つのグループのマウスに、通常の固形飼料又は高脂質の「ウェスタン（Western）」ダイエット飼料（２１％脂肪、０．２％コレステロール）を３０週間与えた。最初の３ヶ月間は、マウスに明らかな表現型の違いは見られなかった。３０週齢でマウスを殺し、組織を採取した。過去の文献による報告のとおり、ＡｐｏＥ−ＫＯマウスには重度の皮膚黄色腫症、体毛の脱落、体毛の変色（退色）及び種々の動脈硬化性病変が現れていた。

【0138】

血中コレステロール及びリポ蛋白量については、ＡｐｏＥ−ＫＯマウスとＤＫＯマウスとで差はない。血漿中の総コレステロール及びＬＤＬ−Ｃ濃度については、２つのグループで同じである。ＨＤＬ、ＬＤＬ及びトリグリセリドについては、ウェスタンダイエット飼料を与えたＡｐｏＥ−ＫＯマウス（斜線棒）とＤＫＯマウス（格子棒）とで有意な差は見られない（図１）。グランザイムＢ活性のみを除去したグループ（白棒）には、Ｃ５７／Ｂｌ６（黒棒）グループに比べて血中脂質分布に与える有意な影響は見られない。

【0139】

３０週目において、ＤＫＯマウスには黄色腫は肉眼観察されなかった（表１）。ＤＫＯマウスの皮膚はなめらかでしわがなかった。

表１ 皮膚黄色腫に冒された動物数

数字は、黄色腫罹患動物数／全体数で示している。

【0140】

ＡｐｏＥ−ＫＯマウスの体毛はむらができ、変色（灰色化）し、皮膚には弱く保持されている（脱毛剤で容易に抜け落ちた）。それに対して、ＤＫＯマウスは、黒い（dark）体毛のままであり、変色あるいは灰色化せず、皮膚にしっかりと保持されている。むしろＤＫＯマウスの体毛は、ＧｒＢ−ＫＯマウスの体毛よりもしっかりと保持されている。ＧｒＢ−ＫＯマウス及びＤＫＯマウスの体毛の毛包は、野生型又はＡｐｏＥ−ＫＯマウスに比べるとより豊富であり、皮膚の脂肪層のより深い部分に位置している（表２）。標準的なＮａｉｒ（脱毛剤）を用いた脱毛処理では、ＧｒＢ−ＫＯマウス及びＤＫＯマウスでは４５分間超かかったのに対し、ＷＴ（野生型）及びＡｐｏＥ−ＫＯマウスでは５分間であった。

表２ マウスの系統による皮膚サンプルの毛包密度

数字は８．９ｍｍ^２中の毛包数で示す。個体数はＮ＝８（各系統とも）。

【0141】

（実施例２）
エラスチン及びグランザイムＢの分布
大動脈根の病変部のグランザイムＢとマクロファージの共存解析(colocalization)が行われ、共焦点顕微鏡で映像化（撮像）した。ＡｐｏＥ−ＫＯマウスの病変部はグランザイムＢ及びマクロファージの両方が染色されたが、双方の共存はプラークの特定の領域、線維性被膜(fibrotic cap)及びショルダー(shoulder)領域にのみ発生した。染色されたグランザイムＢは、内部弾性膜層に局在化していた。

【0142】

大動脈壁に付着するため、平滑筋細胞はエラスチンを必要とする。Ｃ５７ｗｔ、ＧｒＢ−ＫＯ、ＡｐｏＥ−ＫＯ及びＤＫＯマウスの大動脈は、弾性のファンギーソン(elastic van Gieson)で染色された。ＡｐｏＥマウスの染色された大動脈セクションの大動脈壁は非常に薄く見え、Ｃ５７ｗｔマウスの染色された大動脈セクションに比べるとエラスチン染色は大きく減少している。ＤＫＯマウスの染色大動脈セクションでは、大動脈壁は非常に厚く見え、エラスチン染色はそれに伴ってより濃かった。グランザイムＢは、ＡｐｏＥ−ＫＯのアテローム硬化性プラークの内部弾性膜層と流入するマクロファージと共存していた。ＤＫＯマウスでは、このような共存は共焦点顕微鏡染色では観察されなかった。

【0143】

（実施例３）
ＤＫＯマウスの皮膚の炎症の減少及び皮膚の外観の改善
マウスの外観が観察され、ＡｐｏＥ−ＫＯマウスの皮膚はより老化して、不健康に、そして非常に剥がれ落ちやすく見えた。皮膚は著しく弾力性を失っていた。グランザイムＢ活性を喪失させたＤＫＯマウスは、このような弾力性の減少は示さなかった。ＡｐｏＥ−ＫＯマウスには免疫細胞が大量に浸潤している範囲が観察されたが、ＤＫＯマウスにはこれも見られなかった。

【0144】

ＤＫＯマウスの皮膚は、ＡｐｏＥ−ＫＯマウスと比べると、より厚く、より強く、より弾力性があり、より健康そうな色調であり、より健康そうなきめないし組織（texture、即ちしわが少ない）のように見えた。

【0145】

（実施例４）
グランザイムＢの細胞外基質蛋白質エラスチンとの結合
生体外でのグランザイムＢのエラスチン結合分析は次のような方法で行った。グランザイムＢの５０、１００、３００ｎｇをそれぞれ人間の不溶性皮膚（Ｓｋ）及び大動脈（Ａｏ）エラスチン（エラスチンプロダクツカンパニー、モンタナ州オーウェンスビル(Elastin Products Company, Owensville, MO)）１５μｇとＰＢＳ中で３時間室温で培養した。試料は、室温で１０００Ｇで３分間遠心分離し、不溶性エラスチンをペレット状で回収した。結合していないグランザイムＢを含む上澄み液は、ＳＤＳを含む緩衝液で変性し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。グランザイムＢはウェスタンブロット法で検出した。各ゲルは、３つのレーンを含んでいた。第１のレーンは、エラスチンのないグランザイムＢを含む試料に関するもの、第２のレーンは、グランザイムＢと人間の不溶性皮膚エラスチンを含む試料に関するもの、第３のレーンは、グランザイムＢと大動脈エラスチンを含む試料に関するものである。エラスチンのないグランザイムＢを含む試料に関するレーンは、上澄み液で太いバンドを示し、ペレットでは薄い（わずかな）バンドしか示さなかった。グランザイムＢと皮膚エラスチンを含む試料に関するレーン及びグランザイムＢと大動脈エラスチンを含む試料に関するレーンはいずれも、ペレットに太いバンドを示し、このバンドはエラスチンのないグランザイムＢを含む試料に関するペレットの薄いバンドよりもずっと大きなバンドを示した。さらに、グランザイムＢと皮膚エラスチンを含む試料の上澄み液のバンドは、エラスチンのないグランザイムＢを含む試料の上澄み液のバンドに比べて、劇的に少なかった。グランザイムＢと大動脈エラスチンを含む試料の上澄み液には、バンドは見られなかった。したがって、上澄み液にはグランザイムＢはより少なく、このことはグランザイムＢはペレット中のエラスチンと関連している（associating）ことを示す。この現象は投与量に依存し、用いたエラスチンのタイプ（即ち皮膚エラスチン又は大動脈エラスチン）に限定されることはなかった。

【0146】

（実施例５）
グランザイムＢの細胞外基質蛋白質の切断
人間の冠状動脈の平滑筋細胞（ＳＭＣ）の基質をグランザイムＢで処理すると、多数の細胞外蛋白質の切断が生じた。ＳＭＣ培養組織の細胞外蛋白質がビオチン化され、グランザイムＢとともに培養された。上澄み液が処理後２、４及び２４時間で採取され、全不溶性細胞外蛋白質の標本が処理後２４時間で採取された。細胞外蛋白質はビオチンのウェスタンブロットにより可視化された。ベータアクチンのウェスタンブロットにより、細胞外蛋白質の標本は細胞内蛋白質を全く含んでいないことが確認された。グランザイムＢで処理したＳＭＣの溶解液（ライセート）について、フィブロネクチン、リン酸化ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）及びＦＡＫのウェスタンブロットも行った。採取された不溶性蛋白質の中に、およそ５０−７０ｋＤａの範囲及びおよそ２３６ｋＤａの４つの蛋白質バンドが、グランザイムＢ処理後２４時間で消失し、およそ２５−３９ｋＤａの断片の切断が同じ時点で基質中において明白に見られた。さらに、グランザイムＢ処理後早くも２時間後には、およそ２９−１４８ｋＤａからの分子量範囲の６つの蛋白質及び／又は切断片が、上澄み液に溶出していた。用いたＳＭＣ細胞外蛋白質標本に細胞内蛋白質を含んでいないことを確認するため、採取した上澄み液と細胞外蛋白質に対してベータアクチンのウェスタンブロットを実施した。ベータアクチンは、ＳＭＣライセート（陽性対照）には明白に存在したが、基質及び上澄み標本には存在しなかった。

【0147】

グランザイムＢによって切断された細胞外蛋白質を識別するため、グランザイムＢで処理していないＳＭＣのライセート及びグランザイムＢで処理したＳＭＣのライセートの、フィブロネクチン、コラーゲン及びビトロネクチンのウェスタンブロットを行った。グランザイムＢで２４時間処理した全てのＳＭＣは、ＳＭＣから採取したライセート中の全フィブロネクチンの量が減少していた。グランザイムＢで２４時間処理したＳＭＣの上澄み液中には、フィブロネクチンの切断生成物が検出された。コラーゲンIV及びビトロネクチンの切断は測定されなかった。したがって、グランザイムＢはＳＭＣ細胞外基質のフィブロネクチンは切断するが、コラーゲンIV及びビトロネクチンは影響（切断）しない。

【0148】

（実施例６）
生体外でのグランザイムＢのエラスチン結合及び分解
バンダら（Banda, M. J. and Werb, Z., (1981) Biochem J, 193:589-605）及びゴードンら（Gordon, S., Werb, Z, and Cohn, Z.A. (1976), In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, Bloom, B.R.とDavid, J.R.による共同編集, Academic Press, New York, page 349-350）の記載に修正を加えてトリチウム（標識）化したエラスチンを準備した。１ｍｇの皮膚又は大動脈エラスチンを１ｍｌの蒸留水に希釈し、ｐＨを９．２に調整した。これに１ｍＣｉのＮａＢ_３Ｈ_４（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム(PerkinElmer, Waltham, MA)）及び２ｍｇの非放射性ＮａＢ_３Ｈ_４（シグマ、モンタナ州セントルイス(Sigma, St. Louis, MO)）を加えた。２時間培養した後、ｐＨを３．０に調整し、エラスチンをさらに３０分間培養した。エラスチンを３分間５０００Ｇで遠心分離し、ペレットを繰り返し洗浄して過剰のＮａＢ_３Ｈ_４を除去した。切断分析のため、トリチウム化したエラスチン０．１５ｍｇをグランザイムＢ（５回の合計で０．７５μｇ加えた）とともに室温で７日間培養した。培養して７日目に、陽性対照として２５μｇのエラスターゼ（エラスチンプロダクツカンパニー、モンタナ州オーウェンスビル(Elastin Products Company, Owensville, MO)）をエラスチンに加えて２時間培養した。培養後、反応生成物を３分間５０００Ｇで遠心分離した。上澄み液中の、切断された溶解性のエラスチン切断片の放射能をレディセイフシンチレーション液（Ready Safe Scintillation Fluid、ベックマン−コールター、カリフォルニア州フラートン（Beckman-Coulter, Fullerton, CA））中で測定した。切断された溶解性のエラスチン切断片の放射能は、皮膚エラスチン及び大動脈エラスチンのバックグラウンドに比べて、それぞれ４．８倍及び２．７倍であった（図２）。エラスターゼによるエラスチンの蛋白分解では、皮膚エラスチンではバックグラウンドの１４．９倍、大動脈エラスチンでは７．７倍の放射能増加が測定された。これらのデータは、グランザイムＢにはエラスチン親和性があり、弾性組織の分解を促進する作用があることを示している。

【0149】

理解を容易にするために、本発明を実施及び実施例を用いてある程度詳細に説明してきたが、当業者であれば本発明の教示に基づいて、本発明の請求項の本質又は範囲を離れることなく修正及び変形を行うことが可能である。ここに引用した全ての特許、特許出願及び刊行物は引用により繰り込まれ記載されているものとする。
なお、ここに、まとめとして、本発明の好ましい実施の形態シリーズＩ及びＩＩを示す。
形態シリーズＩ
（形態１）
対象の皮膚の若々しい外観を維持するため、
対象の皮膚の老化の外観ないし発現を低減するため、又は
対象の皮膚の老化の外観ないし発現を抑制するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態２）
前記皮膚の細胞外蛋白質の含有量を維持又は増加するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量を維持又は増加するための形態１のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態３）
前記皮膚の弾力性を維持又は増加するため、
前記皮膚の脆弱性を維持又は低減するため、
前記皮膚の堅牢性を維持又は増加するため、
前記皮膚の剥がれ落ちやすさを維持又は低減するため、
前記皮膚の乾燥度を維持又は低減するため、
前記皮膚のポアサイズを維持又は低減するため、
前記皮膚の厚さを維持又は増加するため、
前記皮膚の細胞の代謝回転速度を維持又は増加するため、
前記対象の前記皮膚のしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、
前記皮膚のしわの深さを維持又は低減するため、
前記対象の前記皮膚の細かいしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、及び／又は
前記対象の前記皮膚の変色の外観ないし発現を維持又は低減するための形態１又は２のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態４）
対象の皮膚の老化的外観の発現速度を低減するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態５）
細胞外蛋白質の含有量の減少速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量の減少速度を低減するための形態１又は４のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態６）
前記皮膚の弾力性の減少速度を低減するため、
前記皮膚の脆弱性の増加速度を低減するため、
前記皮膚の堅牢性の減少速度を低減するため、
前記皮膚の剥がれ落ちやすさの増加速度を低減するため、
前記皮膚の乾燥度の増加速度を低減するため、
前記皮膚のポアサイズの増加速度を低減するため、
前記皮膚の厚さの減少速度を低減するため、
前記皮膚の細胞の代謝回転速度の減少速度を低減するため、
前記対象の前記皮膚のしわの発現の増加速度を低減するため、
前記皮膚のしわの深さの増加速度を低減するため、
前記皮膚の細かいしわの発現の増加速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の変色の発現の増加速度を低減するための形態１、４及び５のいずれか一のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態７）
対象の皮膚の非弾力性を低減するため、
対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減するため、又は
対象の皮膚の弾力性を維持するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態８）
対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態９）
前記グランザイムＢ阻害剤を局所的に適用するため、
前記グランザイムＢ阻害剤を皮下的に適用するため、又は
前記グランザイムＢ阻害剤を全身的に適用するための形態１〜８のいずれか一のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態１０）
前記対象は人間を除く哺乳動物であることを特徴とする、形態１〜９のいずれか一のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態１１）
前記対象は人間であることを特徴とする、形態１〜９のいずれか一のグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態１２）
対象の皮膚の若々しい外観を維持する、
対象の皮膚の老化の外観ないし発現を低減する、
対象の皮膚の老化の外観ないし発現を抑制する、
対象の皮膚の老化の発現速度を低減する、
対象の皮膚の非弾力性（弾力性のなさ）を低減する、
対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減する、
対象の皮膚弾力性を維持する、又は
対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するための美容的処置方法であって、該対象の皮膚にグランザイムＢ阻害剤を局所的に塗布することを含む、美容的処置方法。
（形態１３）
対象の皮膚の細胞外基質蛋白質の劣化ないし変質を抑制するためのグランザイムＢ阻害剤の使用。
（形態１４）
前記細胞外基質蛋白質がエラスチンである、形態１３のグランザイムＢ阻害剤の使用。
形態シリーズＩＩ
（形態１）
皮膚の弾力性を増加するため、
皮膚の脆弱性を維持又は低減するため、
皮膚の厚さを維持又は増加するため、
対象の皮膚のしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、
皮膚のしわの深さを維持又は低減するため、
皮膚の細かいしわの外観ないし発現を維持又は低減するため、
対象の皮膚の変色の外観ないし発現を維持又は低減するため、及び／又は
対象の皮膚の体毛の毛包密度を増加するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。
（形態２）
前記皮膚の細胞外蛋白質の含有量を維持又は増加するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量を維持又は増加するための形態１の美容剤。
（形態３）
細胞外蛋白質の含有量の減少速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の皮膚エラスチンの含有量の減少速度を低減するための形態１の美容剤。
（形態４）
前記皮膚の弾力性の減少速度を低減するため、
前記皮膚の脆弱性の増加速度を低減するため、
前記皮膚の厚さの減少速度を低減するため、
前記対象の前記皮膚のしわの発現の増加速度を低減するため、
前記皮膚のしわの深さの増加速度を低減するため、
前記皮膚の細かいしわの発現の増加速度を低減するため、
前記皮膚の変色の発現の増加速度を低減するため、及び／又は
前記皮膚の体毛の毛包密度の増加速度を増加するための形態１又は３の美容剤。
（形態５）
対象の皮膚の非弾力性を低減するため、
対象の皮膚の非弾力性の増加速度を低減するため、又は
対象の皮膚の弾力性を維持するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。
（形態６）
前記美容剤は、局所的に適用するため、
皮下的に適用するため、又は
全身的に適用するための組成物として調製される形態１〜５のいずれか一の美容剤。
（形態７）
前記対象は人間を除く哺乳動物であることを特徴とする、形態１〜６のいずれか一の美容剤。
（形態８）
前記対象は人間であることを特徴とする、形態１〜６のいずれか一の美容剤。
（形態９）
対象の皮膚の細胞外基質蛋白質の劣化ないし変質を抑制するための、グランザイムＢ阻害剤を含む美容剤。
（形態１０）
前記細胞外基質蛋白質がエラスチンである、形態９の美容剤。

【図面の簡単な説明】

【0150】

【図1】ウェスタンダイエット食餌を与えたマウスの血漿脂質の分布特性を示す棒グラフであり、黒い棒はC57/Bl/6、白抜き棒はGrB-KO、斜線棒はApoE-KO、及び格子棒はApoE/GrB-DKOマウスをそれぞれ示す。「ＴＧ平均」はトリグリセリド平均値、「ＴＣ平均」は全コレステロール平均値である。各グループともＮ＝３である。

【図2】生体外における、グランザイムＢのエラスチンの切断を示す図である。グランザイムＢは^３Ｈ化エラスチンとともに７日間室温で培養した。エラスターゼは^３Ｈ化エラスチンとともに２時間室温で培養した。可溶性のエラスチン切断断片（フラグメント）を含む上澄み液を集めて計測した。データは対照（エラスチンのみ）に対する放射能量の倍数で示している。（ｎ＝２）

【図1】

【図2】