特許 5747084 ターゲティング、検出、イメージング及び処置に有用な組成物、並びにその製造及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5747084

(24)【登録日】2015年5月15日

(45)【発行日】2015年7月8日

(54)【発明の名称】ターゲティング、検出、イメージング及び処置に有用な組成物、並びにその製造及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/127 20060101AFI20150618BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20150618BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20150618BHJP

   A61K 47/42 20060101ALI20150618BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20150618BHJP

   A61K 41/00 20060101ALI20150618BHJP

   A61B 8/00 20060101ALI20150618BHJP

   A61B 5/055 20060101ALI20150618BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/127

   A61K9/107

   A61K9/48

   A61K47/42

   A61K49/00 C

   A61K41/00

   A61B8/00

   A61B5/05 383

【請求項の数】16

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2013-531697(P2013-531697)

(86)(22)【出願日】2011年9月26日

(65)【公表番号】特表2014-506867(P2014-506867A)

(43)【公表日】2014年3月20日

(86)【国際出願番号】US2011053249

(87)【国際公開番号】WO2012047582

(87)【国際公開日】20120412

【審査請求日】2013年5月27日

(31)【優先権主張番号】61/387,137

(32)【優先日】2010年9月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593063105

【氏名又は名称】シーメンス メディカル ソリューションズ ユーエスエー インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(74)【代理人】

【識別番号】100078662

【弁理士】

【氏名又は名称】津国 肇

(74)【代理人】

【識別番号】100131808

【弁理士】

【氏名又は名称】柳橋 泰雄

(74)【代理人】

【識別番号】100135873

【弁理士】

【氏名又は名称】小澤 圭子

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(74)【代理人】

【識別番号】100122736

【弁理士】

【氏名又は名称】小國 泰弘

(74)【代理人】

【識別番号】100122747

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 洋子

(74)【代理人】

【識別番号】100132540

【弁理士】

【氏名又は名称】生川 芳徳

(74)【代理人】

【識別番号】100146031

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 明夫

(74)【代理人】

【識別番号】100141357

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 音哉

(72)【発明者】

【氏名】オッペンハイマー，レス

(72)【発明者】

【氏名】グラカー，イスマイル

【審査官】 牧野 晃久

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５１２６９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１２９１３６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０１４１９２２（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７０

Ａ６１Ｋ ４７／００− ４７／４８

Ａ６１Ｂ ５／００− ５／２２

Ａ６１Ｂ ８／００− ８／１５

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

管腔において曝露されたターゲットをイメージングにより検出するのに有用である連続送達可能な薬学的試薬の複合体であって、管腔で形成され、
ターゲットに結合する少なくとも１つのステージＩ薬剤；
複数のステージＩＩ薬剤；
複数のステージＩＩＩ薬剤；
を含み、
（ａ）ステージＩ薬剤が、第１の結合部位及び第２の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩ薬剤が、第１の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−抗体と、第２の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクとを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｂ）ステージＩＩ薬剤が、第３の結合部位及び第４の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩ薬剤が、第３及び第４の結合部位として機能するビオチン化部位を有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｃ）ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位としてビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｄ）ステージＩ薬剤の第１の結合部位が、ターゲットと第１の結合複合体を形成し、ステージＩ薬剤の第２の結合部位が、ステージＩＩ薬剤の第３の結合部位と第２の結合複合体を形成し、ステージＩＩ薬剤の第４の結合部位が、ステージＩＩＩ薬剤の第５の結合部位と第３の結合複合体を形成し、
複数のステージＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩ薬剤に結合し、複数のステージＩＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩＩ薬剤に結合し、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つが、イメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合した複合体の検出が可能になる、複合体。

【請求項2】

ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つが、ガスを含む、請求項１記載の複合体。

【請求項3】

少なくとも１つのステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤が、それに組み込まれた／カプセル化された治療組成物をさらに含む、請求項１記載の複合体。

【請求項4】

ステージＩ薬剤によりターゲティングすると、治療組成物が送達、放出、活性化及び／又は励起される、請求項３記載の複合体。

【請求項5】

放出／活性化／励起が、熱、超音波及び化学的方法の少なくとも１つへの曝露に反応して起こる、請求項４記載の複合体。

【請求項6】

ステージＩＩ薬剤が、複数のステージＩＩＩ薬剤に結合する、請求項１記載の複合体。

【請求項7】

少なくとも２つのステージＩＩＩ薬剤が、同じものである、請求項１記載の複合体。

【請求項8】

少なくとも２つのステージＩＩＩ薬剤が、異なるものである、請求項１記載の複合体。

【請求項9】

ステージＩ薬剤に付着した複数のステージＩＩ薬剤を有する少なくとも１つのステージＩ薬剤
を含み、
少なくとも１つのステージＩ薬剤が管腔において曝露されたターゲットに結合する、請求項１記載の複合体。

【請求項10】

ステージＩＩＩ薬剤上の少なくとも１つの結合部位も、ステージＩ薬剤に結合できる、請求項１記載の複合体。

【請求項11】

連続送達可能な複合可能製剤であって、
管腔において曝露されたターゲットに結合できるステージＩ薬剤を含む第１の投与可能な組成物；
ステージＩＩ薬剤を含む第２の投与可能な組成物；
ステージＩＩＩ薬剤を含む第３の投与可能な組成物；
を含み、
（ａ）ステージＩ薬剤が、第１の結合部位及び第２の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩ薬剤が、第１の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−抗体と、第２の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクとを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｂ）ステージＩＩ薬剤が、第３の結合部位及び第４の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩ薬剤が、第３及び第４の結合部位として機能するビオチン化部位を有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｃ）ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位としてビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｄ）ステージＩ薬剤の第１の結合部位が、ターゲットと第１の結合複合体を形成可能であり、ステージＩ薬剤の第２の結合部位が、ステージＩＩ薬剤の第３の結合部位と第２の結合複合体を形成可能であり、ステージＩＩ薬剤の第４の結合部位が、ステージＩＩＩ薬剤の第５の結合部位と第３の結合複合体を形成可能であり、
複数のステージＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩ薬剤に結合可能であり、複数のステージＩＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩＩ薬剤に結合可能であり、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つが、イメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合した複合体の検出が可能となる、製剤。

【請求項12】

被験体の体の強調画像を作成する方法において用いられる請求項１１記載の複合可能製剤であって、
前記方法が、複合可能製剤を前記体に投与する工程；及び
前記体の少なくとも一部の超音波画像、磁気共鳴画像Ｘ線画像、又は放射線画像を作成する工程
を含む、複合可能製剤。

【請求項13】

投与工程が、
第１の投与可能な組成物を前記体に投与すること；及びその後、
第２の投与可能な組成物を前記体に投与すること；及びその後、
第３の投与可能な組成物を前記体に投与すること
とさらに定義される、請求項１２記載の複合可能製剤。

【請求項14】

投与工程が、
第１の投与可能な組成物を前記体に投与すること；
ステージＩ薬剤が管腔において曝露されたターゲットに結合し、そして未結合のステージＩ薬剤が管腔から実質的にクリアランスされることを可能にする時間の分だけ、体をインキュベーションすること；
第２の投与可能な組成物を前記体に投与すること；
ステージＩＩ薬剤が、ステージＩ薬剤に結合し、そして未結合のステージＩＩ薬剤が管腔から実質的にクリアランスされることを可能にする時間の分だけ、体をインキュベーションすること；
第３の投与可能な組成物を前記体に投与すること；並びに
ステージＩＩＩ薬剤の結合、及び未結合のステージＩＩＩ薬剤の管腔からの実質的なクリアランスを可能にする時間の分だけ、体をインキュベーションすること；
とさらに定義される、請求項１３記載の複合可能製剤。

【請求項15】

管腔におけるターゲットをイメージングするのに有用なキットであって、
管腔において曝露されたターゲットに結合できるステージＩ薬剤を含む第１の投与可能な組成物；
ステージＩＩ薬剤を含む第２の投与可能な組成物；
ステージＩＩＩ薬剤を含む第３の投与可能な組成物；
を含み、
（ａ）ステージＩ薬剤が、第１の結合部位及び第２の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩ薬剤が、第１の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−抗体と、第２の結合部位としてのビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクとを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｂ）ステージＩＩ薬剤が、第３の結合部位及び第４の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩ薬剤が、第３及び第４の結合部位として機能するビオチン化部位を有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｃ）ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位を含むとさらに定義され、
ステージＩＩＩ薬剤が、第５の結合部位としてビオチン結合タンパク−ＰＥＧ−ビオチン結合タンパクを有するビオチン化マイクロバブル又はビオチン化リポソームを含み；
（ｄ）ステージＩ薬剤の第１の結合部位が、ターゲットと第１の結合複合体を形成可能であり、ステージＩ薬剤の第２の結合部位が、ステージＩＩ薬剤の第３の結合部位と第２の結合複合体を形成可能であり、ステージＩＩ薬剤の第４の結合部位が、ステージＩＩＩ薬剤の第５の結合部位と第３の結合複合体を形成可能であり、
複数のステージＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩ薬剤に結合可能であり、複数のステージＩＩＩ薬剤のそれぞれが、少なくとも１つのステージＩＩ薬剤に結合可能であり、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つが、イメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合した複合体の検出が可能となる、
キット。

【請求項16】

ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤を検出する画像配信装置によって作成された情報を分析するソフトウェアモジュールをさらに含む、請求項１５記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づいて、２０１０年９月２８日に出願された米国仮出願番号第６１／３８７，１３７号の利益を主張する。上記出願のすべての内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究開発に関する記述
該当せず。

【0003】

発明概念の背景
１．発明概念の分野
本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、一般的には、ターゲット検出及び／又は処置に有用な組成物、並びにその製造方法及び使用方法に関する。

【0004】

２．背景技術の説明
ターゲティングされたマイクロバブルは、重要かつ新たな超音波分子イメージング及び治療のツールである。多くの疾患状態（例えば、限定されないが、ガン、炎症及び血栓症）は、管腔表面上における固有のタンパク質発現を有する。

【0005】

Lanza et al. (1996)は、ビオチン化バイオマーカー、アビジン及びペルフルオロカーボンエマルジョンの連続送達を記載している。US Patent No. 7,186,399において、Lanza et al.は、脂質カプセル化粒子を表面上の分子エピトープにリガンドに基づいて結合させるためのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を記載している。これは、ビオチン活性化剤、アビジン活性化剤で活性化された部位特異的リガンド、及びビオチン活性化剤で活性化された脂質カプセル化粒子の連続送達によって達成される。

【0006】

造影剤のターゲティングされた高次集合体の同時送達も文献に記載されている。これらの高次集合体は、マイクロバブル、リポソーム、ナノ粒子、バブルリポソーム、リポソームバブル、ナノ構造材料、超分子集合体、量子ドット、ナノチューブ、及びミセルを様々な組み合わせで使用する。これらの粒子の多くは、マルチモーダルであり、治療特性を有する。例えば、Lentacker et al. (2010); Suzuki et al. (2007 and 2008); Myhr et al. (2006); Tinkov et al. (2009); Kheirolomoom et al. (2007); Huang (2008); Kim et al. (2009); Cai et al. (2008); Accardo et al. (2009); Ghaleb et al. (2008); Husseini et al. (2008); Schroeder et al. (2009); McCarthy et al. (2008); US Patent No. 7,078,015を参照のこと。上記各特許及び刊行物のすべての内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0007】

残念なことに、ターゲット部位で保持されるマイクロバブルの典型例な接着率は、音響放射力を加えても低い（組織１マイクロリットルあたり約１０個のマイクロバブル（Dayton, 2009））。特に、Dayton (2009)は、ターゲティングされた造影剤技術に関して、以下の制限を挙げた：（１）ターゲット部位に接着する造影剤が少数であること；（２）少数の造影剤に対して感度が不足していること；及び（３）ターゲティングされていない循環造影剤のバックグラウンドが高いこと。これらの制限は、本明細書において下記により詳細に考察される。

【0008】

ターゲティングされた超音波造影剤は、疾患に対して良好な特異性を示すが、疾患状態の診断は、イメージング技術によって達成可能な感度によって制限される。造影剤が特定部位をターゲティングする場合、それらは、管腔の内皮表面上の利用可能な結合部位の数に制限されるため、１つの結合部位は、１個のマイクロバブルの結合を可能にするだけである。加えて、マイクロバブルと内皮表面上の部位との相互作用は、管腔を通る血流により作られる剪断力によって制限される；従って、マイクロバブルは、それが「接し」ない表面に結合できない（すなわち、それが接触するもの）。従って、先行技術の方法は、１マイクロリットルあたり約１０個のマイクロバブルという典型的な結合レベルをもたらす。

【0009】

先行技術のさらなる技術的な制限が、イメージング装置にある：深度及び周波数に依存する減衰は超音波で見られ、高出力イメージングでは、高ピークの陰圧はマイクロバブルの破裂をもたらす。加えて、同様の深度制限が、他のイメージングモダリティ（例えば、限定されないが、ＭＲＩ及びＰＥＴ）で見られる。

【0010】

従って、当技術分野において、ターゲティングされたイメージング及び／又は処置において有用な改善された新規薬剤の必要性がある。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念が対象とするのは、このような組成物、並びにその製造方法及び使用方法である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の普遍的なマルチモーダルターゲティング並びに治療システムを図示する。

【図2】図２は、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の連続送達可能な複合可能製剤を例示する。

【図3】図３は、増幅が造影剤イメージングのペネトレーションを向上させることをグラフで図示する。

【図4】図４は、組織１mm³の出力放散対周波数をグラフで図示する。

【図5】図５は、加熱時間対周波数をグラフで図示する。

【図6A】図６Ａは、１個のターゲティングリポソームの１段階増幅をグラフで図示する。ターゲティングリポソーム（ステージＩ薬剤）を黒色で示す。

【図6B】図６Ｂは、１個のターゲティングリポソームの増幅の第２ステージをグラフで図示する。１個のターゲティングリポソームを黒色で示し、９個の接着増幅リポソーム（ステージＩＩ薬剤）を灰色で示す。最終的な接着クラスターを形成する２８個のイメージングリポソーム（ステージＩＩＩ薬剤）を白抜きの円として示す。

【図7a】図７ａは、シグナルの大きさとマイクロバブルの結合との間の関係を証明する用量反応曲線を示す。図７ｂの表は、BIACORE（商標）X100光バイオセンサーを使用するマイクロバブルの多段階増幅を要約する。

【図7b】図７ａは、シグナルの大きさとマイクロバブルの結合との間の関係を証明する用量反応曲線を示す。図７ｂの表は、BIACORE（商標）X100光バイオセンサーを使用するマイクロバブルの多段階増幅を要約する。

【図8】図８〜図１０は、多段階複合体ｉｎ ｓｉｔｕのｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを示す暗視野位相差顕微鏡の顕微鏡写真を含む。図８は、ステージＩの結合（すなわち、ターゲティング剤の結合）を示し、図９は、ステージＩＩの結合（すなわち、増幅剤の結合）を示し、図１０は、ステージＩＩＩの結合（すなわち、イメージング剤の結合）を示す。

【図9】図８〜図１０は、多段階複合体ｉｎ ｓｉｔｕのｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを示す暗視野位相差顕微鏡の顕微鏡写真を含む。図８は、ステージＩの結合（すなわち、ターゲティング剤の結合）を示し、図９は、ステージＩＩの結合（すなわち、増幅剤の結合）を示し、図１０は、ステージＩＩＩの結合（すなわち、イメージング剤の結合）を示す。

【図10】図８〜図１０は、多段階複合体ｉｎ ｓｉｔｕのｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを示す暗視野位相差顕微鏡の顕微鏡写真を含む。図８は、ステージＩの結合（すなわち、ターゲティング剤の結合）を示し、図９は、ステージＩＩの結合（すなわち、増幅剤の結合）を示し、図１０は、ステージＩＩＩの結合（すなわち、イメージング剤の結合）を示す。

【図11】図１１は、ステージＩのターゲティング及びステージＩＩの増幅のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリを示す顕微鏡写真を含む。

【0012】

発明概念の詳細な説明
例示的な図面、実験、結果及び検査法によって本発明概念の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明概念は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は図面、実験及び／若しくは結果に例示される要素の構成並びに配置の詳細に限定されないと理解されるべきである。本発明概念は、他の実施態様であり得るか、又は様々な方法により実施若しくは実行され得る。そのため、本明細書において使用される言語は、最大限広い範囲及び意味を与えられることを意図する；及び、他の実施態様は、包括的ではなく例示的なものであることを意味する。また、本明細書において使用される語句及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定的なものとみなされるべきではない。と理解されるべきである。

【0013】

本明細書において特に定義されない限り、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み得るし、複数形の用語は単数形を含み得る。一般に、本明細書において記載される細胞培養及び組織培養、分子生物学並びにタンパク質及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法並びに技術は、当技術分野において周知であり、通常使用されるものである。標準的な技術が、リコンビナントＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成並びに組織培養及びトランスフォーメーション（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、あるいは当技術分野において一般に行われるように若しくは本明細書において記載されるように実施される。前述の技術及び手順は、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、また本明細書を通じて引用され、記述される様々な一般的な文献及びより専門的な文献に記載されるように、実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)及びColigan et al. Current Protocols in Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994))（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。本明細書において記載される分析化学、有機合成化学並びに医薬品化学及び薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの検査法及び技術は、当技術分野において周知であり、当技術分野において通常使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品製造、製剤化及び送達、そして患者の処置に使用される。

【0014】

本明細書において言及されるすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示す。すべての刊行物及び特許出願は、個々の各刊行物又は特許出願が、参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0015】

本明細書において開示されるか、又は特許請求の範囲に記載されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示を考慮して、過度の実験をせずに作製及び実行できる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施態様によって説明したが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱せずに本明細書において記載される組成物及び／又は方法に対して、並びに方法の工程若しくは一連の工程において、変形を適用できることは当業者に明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明概念の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。

【0016】

本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：

【0017】

「ａ」又は「ａｎ」という用語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」と共に使用される場合、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたそれ以上」という意味とも一致する。本開示は、選択肢にのみ言及する定義と「及び／又は」とをサポートするが、特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、選択肢にのみ言及することが明らかに意図されない限り、又は選択肢が相互排他的ではない限り、「及び／又は」を意味するのに使用される。本出願を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するのに使用されている装置、方法に固有の誤差変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すのに使用される。「少なくとも１つ」という用語の使用は、１及び１を超える任意の数量（限定されないが、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００などを含む）を含むと理解される。「少なくとも１つ」という用語は、それが付けられる用語に応じて、１００若しくは１０００又はそれ以上まで拡大され得る；加えて、より大きな上限も満足のいく結果をもたらし得るので、１００／１０００の数量は、限定的なものとはみなされない。

【0018】

「約」という用語は、ある値が、その値を決定するのに使用されている装置、方法に固有の誤差変動、及び／又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すのに使用される。

【0019】

本明細書及び特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇのあらゆる形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇのあらゆる形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇのあらゆる形）又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇのあらゆる形）という用語は、包含的又は非制限的であり、記載されていないさらなる要素又は方法の工程を排除するものではない。

【0020】

本明細書において使用される「又はそれらの組み合わせ」という用語は、その用語の前に挙げられた項目のすべての順列組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣの少なくとも１つ、及び特定の文脈において順序が重要である場合はＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。引き続きこの例では、明らかに含まれるものは、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせである。当業者であれば、文脈から明らかではない限り、典型的には、いかなる組み合わせにおいても項目又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。

【0021】

本明細書において使用される「複合可能製剤」という用語は、特定の手順に従って調製され、１つ以上の特定の用途に有用な成分の混合物を指すと理解される。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念のある実施態様では、複合可能製剤の成分は、投与前に一緒に配合されない；むしろ、この成分は別々に準備され、製剤／複合体がｉｎ ｓｉｔｕで形成されるように逐次送達又は連続送達される。

【0022】

本明細書において使用される「薬剤」という用語は、被験体の管腔におけるターゲット及び／又は別の薬剤との相互作用のための１つ以上の結合部位をその上に有し得る表面を有する任意のビヒクルを指すと理解される。ある実施態様では、「薬剤」は、ベシクル、リポソーム、エコージェニックリポソーム、マルチモーダルエコージェニックリポソーム、マイクロバブル、マイクロバルーン、マイクロスフェア、マトリックス粒子、ミセル、凝集に基づく構築物、ナノ粒子、ペルフルオロカーボンナノ液滴、及びそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。

【0023】

本明細書において使用される「造影剤」という用語は、イメージング分析中に器官又は組織を強調して分解能を向上させるのに使用される物質と理解される。造影剤は、メディカルイメージングにおいて、体内の構造物又は流体のコントラストを強調するのに使用される物質である。

【0024】

「ターゲティングされた造影剤」という用語は、それに付着したバイオマーカーを有する造影剤であって、バイオマーカーが造影剤をバイオマーカーが結合するターゲット部位に「ターゲティング」する造影剤を指す。

【0025】

本明細書において使用される「ターゲット」という用語は、管腔壁表面上に存在する任意の部分を指すと理解され、ターゲティング剤は、それに対して親和性を有するため、前記部分に結合できる。「ターゲット」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、エピトープ、抗原、レセプター、複合体（すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体、及びそれらの組み合わせ又は誘導体であり得る。

【0026】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って使用される「結合部位」という用語は、別の物質／結合部位に対して結合親和性を有し、それと複合体を形成でき、それにより、２つの薬剤／ベシクル間の親和性を提供する任意の生体分子を指すと理解される。例えば、限定されないが、結合部位は、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、抗体フラグメント、レセプター、リガンド、複合糖質、及びそれらの組み合わせ又は誘導体であり得る。一実施態様では、「結合部位」は、相補対（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン、抗体−抗原など）の一方である。材料は、一般的には、アレルギー反応を引き出さないが、試験管腔内に通常見られない群から選択されるべきである。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得る非ターゲティング結合部位（すなわち、予めターゲティングした薬剤若しくは薬剤複合体への増幅剤、イメージング剤及び／又は治療剤の結合に利用される下部構造結合部位）の例は、それらの対応するヒト化抗体に加えて、タンパク質（例えば、限定されないが、脳型クレアチニンキナーゼ（ＣＫＢＢ））、又は治療薬（例えば、限定されないが、カルバマゼピン、コルチゾール、トブラマイシン、テオフィリン、フェニトイン、バンコマイシン、ジギトキシン、ジゴキシン、ゲンタマイシン、フェノバルビタール、及びバルプロ酸）を含むが、これらに限定されない。

【0027】

本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、ネイティブなタンパク質、フラグメント、又はポリペプチド配列の類似物を指すための総称である。従って、ネイティブなタンパク質、フラグメント、及び類似物は、ポリペプチド属の種である。

【0028】

本明細書において使用される「レセプター」という用語は、１つ以上の特定の種類の分子（すなわち、リガンド）が付着し得る生体分子を含むと理解される。一実施態様では、「レセプター」という用語は、ターゲティングされるべき器官／組織の管腔壁表面上で発現しており、循環ターゲティング剤との相互作用を可能にする様式で曝露されているリガンド、任意のペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ポリ炭水化物、又は脂質を指す；すなわち、前記実施態様では、「レセプター」は、本明細書において上記に詳細に記載される「ターゲット」として機能する。しかしながら、当技術分野において公知であるか、あるいは当業者によって企図される任意のレセプターは、本明細書において上記に記載されるように、「結合部位」として機能し得ると理解されるべきである。

【0029】

本明細書において使用される「天然に存在する」という用語は、対象に適用される場合、対象が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、研究者によって又は他の方法によって意図的に改変されていない生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。

【0030】

「抗体」又は「抗体ペプチド」は、インタクトな抗体、又は特異的結合に関してインタクトな抗体と競合するその結合フラグメントを指す。「抗体」という用語は、広い意味で使用され、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を明確に包含する。抗体（Ａｂ）及び免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。抗体結合フラグメントは、リコンビナントＤＮＡ技術、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的な切断によって製造される。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体を含む。「二重特異性」又は「二機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同じであると理解される。

【0031】

「キメラ」抗体は、少なくとも２つの異なる供給源に由来する要素から構成される抗体を指す。ある実施態様では、キメラ抗体は、第１の種に由来する抗体の一部を別の分子（例えば、第２の種に由来する抗体の一部）に融合させたものを含む。このようなある実施態様では、キメラ抗体は、非ヒト動物に由来する抗体の一部をヒトに由来する抗体の一部に融合させたものを含む。このようなある実施態様では、キメラ抗体は、非ヒト動物に由来する抗体の可変領域の全部又は一部をヒトに由来する抗体の定常領域に融合させたものを含む。

【0032】

抗体が、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され、ヒトに投与される場合、前記抗体は、それに対する免疫反応の誘導を防ぐために、「ヒト化」され得る。「ヒト化」抗体は、それがヒト抗体に（アミノ酸配列において）より厳密に適合するように改変された非ヒト抗体を指す。ヒト化抗体は、その抗原性部分が除去され、その結果、ヒト抗体の部分と同様に置換されるが、所望のエピトープに対する抗体の親和性は保持されるように操作されている。この操作は、数個のアミノ酸のみに関与し得るか、又は抗体のフレームワーク領域、可変領域及び／若しくは相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部又は全体を含み得る。従って、ヒト化抗体は、キメラ抗体の一種である。抗体をヒト化する多くの方法が当技術分野において公知であり、２００１年１月３０日にQueen et alによって発表されたUS Patent Nos. 6,180,370; ２０００年４月２５日にBrickellによって発表された6,054,927; １９９９年２月９日にStudnickaによって発表された5,869,619; １９９９年１月１９日にLinによって発表された5,861,155; １９９８年１月２７日にRodriquez et alによって発表された5,712,120; １９９３年７月６日にWinterによって発表された5,225,539;及び１９８９年３月２８日にCabilly et alによって発表された4,816,567（これらの明細書はすべて、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる）に開示されている。加えて、ヒト化抗体の作製又は使用に関する多くの公開された論文が先行技術にある。例えば、限定されないが、Sandborn et al., Gatroenterology, 120:1330 (2001); Mihara et al., Clin. Immunol. 98:319 (2001); Yenari et al., Neurol. Res. 23:72 (2001); Morales et al., Nucl. Med. Biol. 27:199 (2000); Richards et al., Cancer Res. 59:2096 (1999); Yenari et al., Exp. Neurol. 153:223 (1998);及びShinkura et al., Anticancer Res. 18:1217 (1998)（これらはすべて、その全体が参照により明示的に組み込まれる）などのこれらの研究の多くは、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念と共に利用され得るプロトコールの有用な例を教示している。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、完全ヒトモノクローナル抗体の使用をさらに含む；完全ヒトモノクローナル抗体を提供する方法は当技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、以下に記載されている：U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,916,771; 5,939,598; PCT publication WO 94/02602;並びにKozbor, et al., Hybridoma, 2:7 (1983); Cole, et al., PNAS 82:859 (1985) Cote, et al., PNAS 80:2026 (1983); Cole, et al., (1985); Marks et al., J Biol. Chem. 267:16007 (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856 (1994); Morrison, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845 (1996); Neuberger, Nat. Biotechnol. 14:826 (1996);及びLonberg and Huszar, Int Rev Immunol. 13:65 (1995)の非特許文献。

【0033】

しかしながら、本発明概念は上記プロトコールに限定されず、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体を製造する他のプロトコールが当業者公知であり、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得ると理解されるべきである。

【0034】

「有効量」という用語は、本発明概念の方法で使用した場合に、合理的なリスク対効果比に見合っており、過度の有害な副作用（例えば、毒性、炎症及びアレルギー反応）を伴わずに検出可能な治療効果を示すのに十分な生物活性分子若しくはコンジュゲート又はそれらの誘導体の量を指す。治療効果は、例えば、限定されないが、望ましくない組織又は悪性細胞の成長を阻害することを含み得る。被験体のための有効量は、被験体の種類、被験体のサイズ及び健康、処置されるべき病態の性質及び重症度、投与方法、処置期間、併用している治療法の性質（もしあれば）、使用した特定の製剤などに依存するであろう。従って、正確な有効量を予め特定することは不可能である。しかしながら、当業者であれば、本明細書において提供される情報に基づいて、定型的な実験を使用して、所定の状況のための有効量を決定し得る。

【0035】

「と共に」という語句は、本明細書において記載される１つ以上の薬剤の使用に関連して使用される場合、薬剤が、生物に対するそれらの生理学的活性及び／又は結合において、少なくともいくつかの時間的なオーバーラップが存在するように投与されることを示す。このようにして、薬剤は、連続投与され得る。連続投与では、２番目に投与される薬剤が投与され、及び／又は生物内で活性化する際に、最初に投与される薬剤が生物に対していくつかの生理学的効果を発揮し、及び／又は生物に結合したままである限り、２番目の部分の投与前に、いくつかの実質的な遅れ（例えば、分、あるいは時間又は日）があってもよい。

【0036】

本明細書において使用される「投与」又は「投与する」という用語は、経口経路、局所経路、経皮経路、非経口経路、皮下経路、鼻腔内経路、粘膜経路、筋肉内経路及び静脈内経路（局所適用及び全身適用の両方を含む）を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知のすべての投与経路を含むと理解される。加えて、投与方法は、当技術分野において周知の製剤化技術を使用して、遅延放出又はコントロール放出を提供するように設計され得る。

【0037】

本明細書において使用される「管腔」という用語は、生物学的な管状構造の内部空間を指すと理解される。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用される管腔の例は、血管腔、脊髄腔、リンパ管内腔などを含むが、これらに限定されない。

【0038】

「薬学的に許容しうる」という用語は、合理的なリスク対効果比に見合っており、過度の有害な副作用（例えば、毒性、炎症及び／又はアレルギー反応）を伴わないヒト及び／又は動物への投与に適切な化合物並びに組成物を指す。

【0039】

本明細書において使用される「実質的に純粋」は、対象の種が、存在する優勢種である（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された画分は、対象の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を構成する組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％超、９０％、９５％、及び９９％を構成する。最も好ましくは、対象の種は、本質的な均一性へと精製され（汚染物質種は、従来の検出方法によって組成物中に検出され得ない）、この組成物は、本質的に単一の高分子種からなる。

【0040】

「ガン」及び「ガン性」という用語は、典型的には、レギュレーションされない細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的条件を指すか、又は記載する。ガンの例は、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含むが、これらに限定されない。このようなガンのより具体的な例は、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、胃腸ガン、膵臓ガン、神経膠芽腫、頸部ガン、卵巣ガン、肝臓ガン（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱ガン、肝細胞ガン（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳ガン、結腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガン腫、唾液腺ガン腫、腎臓ガン（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）、腎ガン（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺ガン、外陰部ガン、甲状腺ガン、肝臓ガン腫（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、及び様々な種類の頭頸部ガンを含む。

【0041】

本明細書において使用される「転移」という用語は、ガンが原発腫瘍から体の他の部分に広がることを指すと理解される。転移は、腫瘍細胞が原発腫瘍から分離し、基底膜及び細胞外マトリックスを通じて移動し、リンパ系及び／又は血液系に侵入する連続的な多段階プロセスである。この後、二次腫瘍が遠隔部位に形成される。

【0042】

本明細書において使用される「抗ガン剤」という用語は、ガン細胞の機能を阻害できる分子又は分子の複合体を指す。この薬剤は、増殖を阻害し得るか、又は細胞に対して毒性であり得る。様々な抗ガン剤を使用でき、タンパク質合成を阻害するもの、及び細胞の成長又は生存に不可欠な特定の遺伝子の発現を阻害するものを含む。抗ガン剤は、細胞死をもたらすもの、及び細胞の成長、増殖及び／又は分化を阻害するものを含む。一実施態様では、抗ガン剤は、特定の種類のガン細胞に対して選択的に毒性であり得るが、他の正常細胞に対しては影響を与えないか、又はあまり有効ではない。別の実施態様では、抗ガン剤は細胞を等しく殺傷し得るが、より急速に成長する細胞はより迅速に殺傷される。さらなる実施態様では、抗ガン剤は、抗腫瘍剤である。

【0043】

「抗腫瘍剤」という用語は、本明細書において、ヒト若しくは動物における新生物、特に悪性（ガン性）病変（例えば、ガン腫、肉腫、リンパ腫、又は白血病）の発生又は進行を阻害する機能特性を有する薬剤を指すのに使用される。転移の阻害は、抗腫瘍剤の特性であることが多い。

【0044】

本明細書において使用される「患者」という用語は、ヒト及び動物の被験体を含む。処置目的の「哺乳動物」は、ヒト、家庭動物及び農業動物、非ヒト霊長類、並びに乳房組織を有する任意の他の動物を含む、哺乳動物と分類される任意の動物を指す。

【0045】

本明細書において使用される「健康患者」という用語は、処置に供されるべき別の患者において研究されている疾患／病態／障害を持たない患者を指すと理解される。

【0046】

本明細書において使用される「処置する」又は「処置」という用語は、症状の重症度及び／又は頻度の軽減、症状及び／又は根本原因の除去、症状及び／又はその根本原因の発症の予防、並びに損傷の改善又は修復を指す。従って、この用語が本明細書において使用される場合、患者又は個体を「処置」する本方法は、易罹患性の個体における障害の予防、症状の発症の減少、及び臨床的な症状がある個体における障害の処置のいずれも包含する。

【0047】

「障害」は、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の組成物による処置から恩恵を受け得る任意の病態である。これは、哺乳動物を問題の障害に罹患しやすくさせる病的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患を含む。

【0048】

本明細書において使用される「ガンを処置する」又は「ガンの処置」という用語は、ガンが広がるのを阻害すること、腫瘍サイズを減少させること、体内のガン細胞数を軽減若しくは減少させること、及び／又はガンに関連する症状を改善若しくは緩和することを意味する。死亡率及び／若しくは罹患率の減少、又は体内の悪性細胞数の減少によって証明された疾患負荷の減少がある場合、処置は治療的であると考えられる。

【0049】

「ガンを予防する」又は「ガンの予防」は、ガンの疾患状態の発症又は再発を予防することを意味することを意図する。そのため、転移、腫瘍成長、若しくはガン増殖を遅らせるか、阻害するか、又は妨げる処置は、予防的であるとみなされる。

【0050】

本明細書において使用される「ガンを管理する」という用語は、ガンに罹患している患者におけるガンの再発の機会を減少させること、患者が寛解の状態であり続ける時間を長くすること、ガンに罹患するリスクがある患者（例えば、大量の放射線又は発ガン性物質に曝露された患者；ガンの発症に関連するウイルスに感染した患者；及びガンに対する遺伝的な易罹患性を有する患者）におけるガンの発症を減少させること、及び前悪性又は非悪性ガンに罹患している患者における悪性ガンの発症を減少させることを包含する。

【0051】

治療有効量又は予防有効量の投与は、疾患／障害／病態（例えば、限定されないが、ガン）の処置、予防又は管理の治療効果を提供することを意図する。治療的に有効である具体的な量は、通常の医師によって容易に決定され得、当技術分野において公知の要因（患者の病歴及び年齢、疾患／障害／病態の種類及び段階、他の治療組成物の同時投与など）に応じて変化し得る。

【0052】

本明細書において使用される「ソノポレーション」という用語は、細胞原形質膜の透過性を改変するために、音波（典型的には、超音波周波数）を使用することを指すと理解される。この技術は、通常、細胞への大きな分子（例えば、ＤＮＡ）の取り込みを可能にし、それにより、細胞への遺伝子又は薬物の送達を促進するために、分子生物学及び非ウイルス性遺伝子治療において使用される。ソノポレーションは、これらの大きな分子の送達を促進するために、マイクロバブルの音響キャビテーション（すなわち、大きな力及びその即時の内破によって、液体中に空のキャビティを形成すること）を使用する。加えて、低周波数（＜MHz）超音波を長期間照射することにより、完全な細胞死（破裂）がもたらされることが実証されている。

【0053】

本明細書において使用される「音響放射力」という用語は、音波とその経路に沿って置かれた障害物との相互作用に起因する物理現象を指すと理解される。一般的には、障害物に与えられる力は、障害物の移動をもたらすであろう。音響放射力は、自由に流れている造影剤を内皮に向けて移動させ、それにより、ターゲット表面への造影剤の接着を促進するメカニズムとして利用される。

【0054】

本明細書において使用される「エコージェニックリポソーム」という用語は、ガスを含むリポソームを指すと理解される；エコージェニックリポソームは、高周波数音波を反射するため、超音波技術によってイメージングされ得る。音響放射力は、エコージェニックリポソームを内皮に向けて移動させ、それにより、ターゲット表面へのそれらの接着を促進するのに利用され得る。マイクロバブルは、ペルフルオロカーボンがキャビティ全体に充填されたエコージェニックリポソームの一種である。

【0055】

本明細書において使用される「アブレーション」という用語は、治療のために組織を正確にターゲティング（すなわち、組織の除去又は破壊）するために、高密度焦点式超音波を使用することを指すと理解される。超音波アブレーション技術の使用は、Halpern (2005)に詳細に記載されている。簡単に言えば、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）アブレーションによる組織破壊のメカニズムは、温熱療法及びキャビテーションに関係している。診断イメージングにおいて使用されているように、低密度超音波エネルギーは、害を及ぼさずに組織を伝搬する。高密度焦点式超音波アブレーションは、体外の超音波源を特定のターゲット組織に焦点を合わせる。超音波エネルギーは、しっかり焦点を合わせられたターゲット領域に向かう途中で、害を及ぼさずに上に横たわる組織を通過する。ターゲット組織における急速なエネルギー付与は、熱放速度をはるかに上回り、急速な温度上昇をもたらす。他の熱アブレーション技術は、隣接組織への熱放によって制限されるが、高密度超音波アブレーション（０．５〜１．０秒）を用いて超音波エネルギーを急速に焦点を合わせて付与することにより、局所キャビテーション及び６５°〜１００℃の温度がもたらされ、隣接組織はほとんど加熱されない。１秒間に５６℃超の温度は、不可逆的な細胞死をもたらし、組織壊死の領域がはっきり見える。リアルタイムの超音波又は磁気共鳴映像法ガイダンスを使用することによって、高密度焦点式超音波を用いて病変に焦点を合わせ、正確にターゲティングする能力は、周囲の構造を損傷させずに、任意の形状の病変を正確にアブレーションすることを可能にする。

【0056】

次に本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に移ると、ターゲティングされたマイクロバブルは、造影剤の使用に対して特異性の増大を提供する重要かつ新たな超音波分子イメージング及び治療ツールである。多くの疾患状態（例えば、限定されないが、ガン、炎症及び血栓症）は、血管腔表面上における固有のタンパク質発現を有する。造影剤に付着したバイオマーカーの使用は、特定の部位において造影剤の蓄積を増大させ、それにより、当該部位において有効なシグナルを増加させる；加えて、ターゲティングされた造影剤の使用は、造影剤が排除される割合を減少させ、それにより、イメージングの有用な臨床濃度範囲を増加させる。しかしながら、ターゲティングされた造影剤の先行技術の現状には、感度制限の不利点がある：この技術は、利用可能な結合部位の数（すなわち、結合部位１つあたり１個のターゲティングされたイメージング剤）によって制限される。加えて、音響放射力（典型的には、接着率を２倍にする）を加えても、典型的な接着率は低いため（１マイクロリットルあたり約１０個のバブル）、結合は、ターゲティングされた造影剤と管腔上の部位との相互作用によって制限される。

【0057】

ターゲティングされた超音波造影剤は、疾患に対して良好な特異性を示すが、疾患状態の診断は、イメージング技術によって達成可能な感度によって制限される。造影剤が特定の部位をターゲティングする場合、それらは、管腔の内皮表面上の利用可能な結合部位の数に制限されるため、１つの結合部位は、１個のマイクロバブルの結合を可能にするだけである。加えて、マイクロバブルと内皮表面上の部位との相互作用は、管腔を通る血流により作られる剪断力によって制限される；従って、マイクロバブルは、それが接触しない表面に結合できない。従って、マイクロバブル及び超音波を利用する先行技術の方法は、１マイクロリットルあたり約１０個のマイクロバブルという典型的な結合レベルをもたらす。先と同様に、結合部位１つあたり１個のイメージングベシクルに制限される他のイメージングモダリティでも同様の制限が見られるため、イメージングベシクル数は、利用可能な結合部位の濃度によって決定される。

【0058】

先行技術のさらなる技術的な制限が、イメージング装置にある：深度及び周波数に依存する減衰は超音波で見られ、高出力イメージングでは、高ピークの陰圧はマイクロバブルの破裂をもたらす。

【0059】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、ターゲット部位からのシグナルを増加させることによって、先行技術のこれらの不利点及び欠点を克服する。これは、具体的には、結合したマイクロバブル（又は、他のビヒクル剤）の数を有意に増加させ、それにより、ターゲティングされたイメージング感度の有意な改善を提供することによって達成される。

【0060】

加えて、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の強化されたターゲティング及び増幅機能は、超音波治療（例えば、限定されないが、指定の組織の加熱、ソノポレーション及びアブレーション）をより効率的に使用するために、適切な数のマイクロバブル（又は、他のビヒクル剤）を送達することを可能にする。組織の所定領域におけるターゲティングされたマイクロバブルの数を増加させることにより、ターゲティングされた音響エネルギーによって媒介される治療が可能になる。組織の領域における十分な数のバブルは、インソネーションされた領域における音響エネルギーの熱への変換を、周囲組織による通常の熱吸収よりも多い程度まで増加させるであろう。マイクロバブルの超音波吸収単位は、正常組織の超音波吸収単位よりも大きい。しかしながら、十分な超音波エネルギー吸収が起こって高熱が誘導されるのは、高濃度のマイクロバブルが局所領域にある場合のみである。次いで、組織の広範な領域をインソネーションすることができ、ターゲティングされたバブルの濃度に基づくデファレンシャルな加熱効果が生じるであろう。従って、治療は、分子レベルのターゲティング及び指向性超音波エネルギーの組み合わせによって限局され得る。

【0061】

本明細書において使用される「十分な数のバブル」という用語は、限定されないが、バブルのサイズ、インソネーション（すなわち、超音波照射）周波数及び強度、並びに特定の適用方法などの要因に応じて変化すると理解される。例えば、限定されないが、ターゲティングされたイメージング剤の場合、ターゲティングバブル数の増加は、後方散乱信号を増加させ、信号対雑音比を改善する。所定体積内のターゲティングされたバブル数を２倍にすることにより、受け取る後方散乱音響信号が約２倍になるはずである。増幅もイメージングのペネトレーションを高め得る。この効果は、周波数の関数である。例えば、３MHzにおいて、ターゲティングされた造影剤の結合を２倍に増加させることにより、音響信号をさらに１cmペネトレーションすることが可能になるであろう（図３を参照のこと）。別の非限定的な例では、音響エネルギーを熱エネルギーに変換するのにバブルを使用する治療用途において、周囲組織に対する音響エネルギーの本来の加熱効果に打ち勝つために、ターゲティングされたバブル数は、閾値を超えなければならない。約３マイクロメートルの平均気泡直径を用いたバブル及び組織の加熱効果の計算に基づくと、１マイクロリットルあたりおよそ２０〜１００個のバブルが、この効果を達成するのに必要とされる。より少数又はより多数のバブルが、上記リストの物理的要因に応じて必要とされ得る。ターゲティングされたアブレーションの場合、ターゲティングされたバブル数の増加は、より大きなアブレーション効果を引き起こすであろう。ターゲティングされた虚血の場合、毛細血管において実質的な閉塞を引き起こすのに十分な数のバブルが必要とされる。例えば、限定されないが、直径１０マイクロメートルの毛細血管を用いて、及び３マイクロメートルのリポソームを使用して、２段階増幅が、約６〜８マイクロメートルの直径を有する赤血球の流れを有意に遮断するのに十分であり得る。マイクロバブルのサイズが増加するので、部分的な閉塞を得るのに必要な工程の数は減少する。また、一般的には、リポソームは、閉塞を最小限にするために、より小さな直径を有するであろう。

【0062】

組織を数度加熱することにより、永久的な組織損傷を引き起こさずに、薬物の活性及び血流量を増加させ得る。より高レベルの加熱は、治療上有用であり得る永久的な組織損傷を引き起こし得る。加熱の増加に加えて、ターゲティングされたバブル数の増加も、組織をアブレーションするか、若しくはソノポレーションを誘導するのに使用され得るキャビテーション又はバブル崩壊などの他の治療効果の増加につながり得る。ソノポレーションは、薬物及び遺伝子送達並びに治療的有用性の増加に関連する。

【0063】

超音波の使用に加えて、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、ターゲティング剤が管腔に限定されるという独自の特徴により、他のイメージングモダリティ（例えば、限定されないが、ＭＲＩ及びＰＥＴ）も改善する。

【0064】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、ターゲティングされた材料の数量制限を増幅によって克服する普遍的なマルチモーダルターゲティング及び治療システムを提供する（図１及び図２を参照のこと）。本開示の及び特許請求の範囲に記載のシステムは、イメージング用途及び治療用途の両方を有する。本システムの治療アームにより、かなり多くの治療薬（例えば、限定されないが、エネルギー、薬物及び／又は遺伝子）をターゲット部位に送達する新たな適用が可能になる。具体例は、ソノポレーション及び血液脳関門；炎症（すなわち、クローン病）；ターゲティング及び指定された化学療法；様々な治療組成物の活性を熱で増加させること；ターゲティング及び指定されたアブレーションなどを含むが、これらに限定されない。

【0065】

図１及び図２に図示されるように、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、管腔において曝露されたターゲットをイメージングにより検出するのに有用である連続送達可能な薬学的試薬の複合体であって、管腔で形成される複合体に関する。前記複合体は、ターゲットに結合する（ステージＩの結合）少なくとも１つのターゲティング剤（本明細書において「ステージＩ薬剤」又は「ステージＩベシクル」とも称される）複数の増幅剤（本明細書において「ステージＩＩ薬剤」又は「ステージＩＩベシクル」とも称される）、及び複数のイメージング剤（本明細書において「ステージＩＩＩ薬剤」又は「ステージＩＩＩベシクル」とも称される）、を含む。複数の増幅剤のそれぞれは少なくとも１つのターゲティング剤に結合し（ステージＩＩの結合）、複数のイメージング剤のそれぞれは少なくとも１つの増幅剤に結合する（ステージＩＩＩの結合）。加えて、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つはイメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合した複合体の検出が可能になる。

【0066】

ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤は、超音波による検出及び／又は操作のためのガスを含み得る。加えて、ターゲティング剤、増幅剤及び／又はイメージング剤は、超音波以外のイメージングモダリティによって検出され得る材料を含み得る。さらに加えて、ターゲティング剤、増幅剤及び／又はイメージング剤は、それに組み込まれた／カプセル化された治療組成物をさらに含み得る。本明細書において下記により詳細に記載されるように、ステージＩ（ターゲティング）薬剤によりターゲティングすると、治療組成物は、送達、使用、放出、活性化、及び／又は励起され得る。前記放出／活性化／励起は、熱／超音波への曝露に反応して起こり得る。

【0067】

本明細書において利用される「治療組成物」という用語は、生物学的効果を発揮し、それにより、生物の生理系を改変する能力を有する任意の組成物を含むと理解される。「治療組成物」は、それ自体の機能性により生物学的に活性であり得るか、又は前記組成物は、それ自体が生物学的活性を有する分子を活性化又は阻害するその能力に基づいて、生物学的に活性であり得る。本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得る治療組成物の例は、薬物、小分子、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、タンパク質／ペプチド、コンジュゲート、ポリマー、ポリマーコンジュゲート、糖タンパク質、糖タンパク質コンジュゲート、ガス、エネルギー、及びそれらの組み合わせ又は誘導体を含むが、これらに限定されない。

【0068】

ある実施態様では、これらの薬剤は、その上に少なくとも１つの結合部位が提供され、各結合部位は、相補対（例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン、抗体−抗原、レセプター−リガンドなど）の一方である。ステージＩ（ターゲティング）薬剤は、第１の結合部位及び第２の結合部位を含み得るが、ステージＩＩ（増幅）薬剤は、少なくとも２つの結合部位（例えば、限定されないが、第３の結合部位及び第４の結合部位）を含み得る。増幅剤の少なくとも２つの結合部位は、同じものでもよく、異なるものでもよい。ステージＩＩＩ（イメージング）薬剤は、少なくとも１つの結合部位（例えば、限定されないが、第５の結合部位）を含み得る。この例では、ターゲティング剤の第１の結合部位はターゲットと第１の結合複合体を形成し、ターゲティング剤の第２の結合部位は増幅剤の第３の結合部位と第２の結合複合体を形成し、増幅剤の第４の結合部位はイメージング剤の第５の結合部位と第３の結合複合体を形成する。一代替態様では、増幅剤の第３及び第４の結合部位は同じであり、ターゲティング剤の第２の結合部位及びイメージング剤の第５の結合部位に相補的である。別の代替態様では、ターゲティング剤の第２の結合部位は増幅剤の第４の結合部位と同じであり、それにより、ターゲティング剤の第２の結合部位もイメージング剤の第５の結合部位に結合して、第３の結合複合体を形成できる。

【0069】

ステージＩ（ターゲティング）薬剤は、ターゲット／疾患状態に固有のターゲティングリガンドを含む；しかしながら、増幅剤及びイメージング剤（すなわち、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤）は、自在であり得る。すなわち、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の薬剤内容物並びにその上のリンカー／結合部位は、所定のイメージングモダリティに関して同じであり、ターゲット／疾患状態と無関係であり得る。ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤は、利用されるイメージングモダリティと無関係の同じ相補対と連結し得る。加えて、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤は、マルチモーダルであり得るため、複数のイメージングモダリティに関連する成分（すなわち、超音波、ＭＲＩ、ＣＲなどの試薬の組み合わせ）を含み得る。

【0070】

別の代替態様では、複数のイメージング剤が利用され得る。この例では、ステージＩＩ薬剤は、２つ以上のステージＩＩＩ薬剤のための結合部位が提供され得る；これらの結合部位は、両方のステージＩＩＩ薬剤に結合する１つの結合部位であり得るか、又は利用されるべき異なるステージＩＩＩ薬剤の数に基づいて、複数の異なる結合部位が提供され得る。

【0071】

ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤は、所定のステージに必要なリンカーによってのみ定義され、それらの内容物と無関係である（図２を参照のこと）。換言すれば、この技術は、ハブ及びペグを含むティンカートイに似ている。ペグ（すなわち、リンカー）は、ステージを定義する；ハブは、いかなるものも含み得る。

【0072】

本明細書において上記に記載される結合部位は、別の物質に対して結合親和性を有し、それと複合体を形成でき、それにより、２つの薬剤／ベシクル間の親和性を提供する任意の生体分子であり得る。例えば、限定されないが、結合部位は、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、抗体フラグメント、レセプター、リガンド、複合糖質、及びそれらの組み合わせ又は誘導体であり得る。

【0073】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得るターゲット部位の具体例は、ＩＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１（すなわち、炎症のターゲット）；αｖβ３インテグリン及びＶＥＧＦＲ２（当技術分野において、血管新生のターゲットとして公知である）；及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（当技術分野において、血栓のターゲットとして公知である）を含むが、これらに限定されない。第１の結合部位として使用され得る例示的な抗体のリストは、以下の参考文献に見られ得る：Paul Carter, Nature Reviews Cancer, Vol. 1, pp. 118-129 (November 2001)；この内容の全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0074】

別の実施態様では、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、管腔において曝露されたターゲットをイメージングにより検出するのに有用である連続送達可能な薬学的試薬の複合体であって、管腔で形成される複合体を対象とする。この複合体は、ステージＩ（ターゲティング）薬剤に付着した複数のステージＩＩ（増幅）薬剤を有する少なくとも１つのステージＩ（ターゲティング）薬剤を含み、少なくとも１つのステージＩ（ターゲティング）薬剤は管腔において曝露されたターゲットに結合する。前記複合体は、複数のステージＩＩＩ薬剤をさらに含み得、複数のステージＩＩＩ薬剤のそれぞれは、その表面上に曝露された少なくとも１つの結合部位であって、ステージＩＩ薬剤に結合するのための結合部位を含む。ステージＩＩＩ薬剤上の少なくとも１つの結合部位も、少なくとも１つのステージＩ（ターゲティング）薬剤に結合し得る。

【0075】

また、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、連続送達可能な複合可能製剤を対象とする。前記製剤は、管腔において曝露されたターゲットに結合できるステージＩ（ターゲティング）薬剤を含む第１の投与可能な組成物、ステージＩＩ（増幅）薬剤を含む第２の投与可能な組成物、及びステージＩＩＩ（イメージング）薬剤を含む第３の投与可能な組成物を含む。ステージＩＩ薬剤は、ステージＩ薬剤に対する親和性を有する第１の部分及びステージＩＩＩ薬剤に対する親和性を有する第２の部分を含む。ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤は、イメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合したターゲティング剤シグナルの増幅が可能になる。当該部分は、本明細書において上記に記載される結合部位を含む。

【0076】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、被験体の体の強調画像を作成する方法を対象とする。前記方法は、本明細書において上記に記載される連続送達可能な複合可能製剤を被験体の体に投与する工程、及び前記体の少なくとも一部の超音波画像、磁気共鳴画像Ｘ線画像、又は放射線画像を作成する工程を含む。

【0077】

本明細書において上記又は下記に記載される方法のいずれかでは、連続送達可能な複合可能製剤は、以下のように投与され得る：最初に、第１の投与可能な組成物を前記体に投与し、その後、第２の投与可能な組成物を前記体に投与し、その後、第３の投与可能な組成物を前記体に投与する。ある実施態様では、第１の投与可能な組成物の投与後に、ステージＩ（ターゲティング）薬剤が管腔において曝露されたターゲットに結合すること、及び未結合のステージＩ薬剤が管腔から実質的にクリアランスされることを可能にする時間、体をインキュベーションする。次いで、第２の投与可能な組成物の投与後に、ステージＩＩ（増幅）薬剤がステージＩ薬剤に結合すること、及び未結合のステージＩＩ薬剤が管腔から実質的にクリアランスされることを可能にする時間、体をインキュベーションする。加えて、第３の投与可能な組成物の投与後に、ステージＩＩＩ薬剤の結合、及び未結合のステージＩＩＩ薬剤が管腔から実質的にクリアランスされることを可能にする時間、体をインキュベーションする。第１、第２及び／又は第３の投与可能な組成物のさらなる投与も、この方法に含まれ得る。

【0078】

「実質的なクリアランス」、「実質的な排除」及び「実質的なウォッシュアウト」という語句の使用によって、第２の薬剤の投与前に、すべての第１の薬剤を管腔／血流から除去する必要はないと理解される。むしろ、これらの語句は、十分なコントラストが見られ得、十分な信号対雑音比が提供されるように、十分な数の第１の薬剤が管腔／血流から排除／ウォッシュアウトされたことを単に示す。

【0079】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、管腔におけるターゲットをイメージングするのに有用なキットを対象とする。前記キットは、本明細書において上記に記載される連続送達可能な複合可能製剤を含み得る。加えて、このキットは、ステージＩＩＩ薬剤を検出する画像配信装置によって作成された情報を分析するソフトウェアモジュールをさらに含み得る。

【0080】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、管腔におけるターゲットに結合したステージＩＩＩ（イメージング）薬剤によって発生されたシグナルを検出するための装置を対象とする。この装置は、コンピューターシステム、及びステージＩＩＩ薬剤を検出する画像配信装置を含み得る。コンピューターシステムは、アプリケーションモジュール及びプロセシングユニットを含む；アプリケーションモジュールは、画像配信装置によって作成された情報を分析するソフトウェアモジュールを含み、プロセシングユニットは、ソフトウェアモジュールを実行するように設定されている。画像配信装置によって検出されたステージＩＩＩ薬剤は、ターゲットに結合した少なくとも１つのステージＩ（ターゲティング）薬剤及びステージＩ（ターゲティング）薬剤に結合した複数のステージＩＩ薬剤と複合体を形成する。ある実施態様では、画像配信装置は、ステージＩ薬剤／ステージＩＩ薬剤／ステージＩＩＩ薬剤の複合体が結合した管腔のターゲットに指向性エネルギーを送達するエネルギー送達装置としても機能し得る。特定の実施態様では、画像配信装置／エネルギー送達装置は、超音波画像配信装置／超音波エネルギー送達装置であり得る。エネルギー送達装置は、音響放射力源としても働き得る。

【0081】

また、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、イメージングモダリティによって検出されたシグナル強度を増加させる方法を対象とする。この方法は、有効量のステージＩ（ターゲティング）薬剤を被験体に投与することを含み、ステージＩ薬剤は、被験体の系の中を移動し、被験体の管腔（すなわち、管腔壁）表面上に曝露されたターゲットに結合する。次いで、有効量のステージＩＩ（増幅）薬剤が被験体に投与され、複数のステージＩＩ薬剤は、ターゲットに結合したステージＩ薬剤に結合する。次いで、有効量のステージＩＩＩ薬剤が被験体に投与され、ステージＩＩＩ薬剤は、ステージＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤に結合する。次いで、ステージＩＩＩ薬剤によって生成されたシグナルが、イメージングモダリティによって検出される。

【0082】

本明細書において上記及び下記に記載される方法のある実施態様では、薬剤（すなわち、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤）の投与後に、方法が、非結合の薬剤が次の薬剤の投与前に管腔（すなわち、血流）から実質的に排除されるのを可能にする工程を含むことが望ましいかもしれない。

【0083】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、被験体における病態／障害を診断する方法を対象とする。この方法では、本明細書において上記に記載されるステージＩ（ターゲティング）薬剤の有効量が被験体に投与される；ステージＩ薬剤は、病態／障害に特異的なターゲットに結合する結合部位を含み、ステージＩ薬剤は、被験体の系の中を移動し、被験体の管腔表面上に曝露された任意のターゲットに結合する。次いで、本明細書において上記に記載されるステージＩＩ（増幅）薬剤の有効量が被験体に投与され、複数のステージＩＩ薬剤は、ターゲット部位に結合したステージＩ薬剤に結合する。次いで、本明細書において上記に記載されるステージＩＩＩ（イメージング）薬剤の有効量が被験体に投与され、ステージＩＩＩ薬剤は、ステージＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤に結合する。次いで、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤によって生成された任意のシグナルが１つ以上のイメージングモダリティによって検出され、シグナルが検出された場合に、被験体が病態／障害を有すると決定される。

【0084】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、被験体における病態／障害を処置する方法を対象とする。前記方法では、本明細書において上記に記載されるステージＩ薬剤の有効量が被験体に投与される；ステージＩ薬剤は、病態／障害に特異的なターゲットに結合する結合部位を含み、ステージＩ薬剤は、被験体の系の中を移動し、被験体の管腔表面上に曝露された任意のターゲットに結合する。次いで、本明細書において上記に記載されるステージＩＩ薬剤の有効量が被験体に投与され、複数のステージＩＩ薬剤は、ターゲット部位に結合したステージＩ薬剤に結合する。次いで、ステージＩＩＩ（治療）薬剤の有効量が被験体に投与され、ステージＩＩＩ薬剤は、ステージＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤に結合する。ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つは、病態／障害を処置するのに有効であり得る治療剤を含む。複合体が形成されるとすぐに、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤中に存在する前記治療剤は、病態／障害を処置するのに有効であり得る。あるいは、治療剤は、ターゲット部位への結合後に活性化され得、それにより、活性化された治療剤は、病態／障害を処置するのに有効である。

【0085】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、治療組成物をターゲット部位に送達する方法を対象とする。前記方法では、本明細書において上記に記載されるステージＩ薬剤の有効量が被験体に投与される；ステージＩ薬剤は、病態／障害に特異的なターゲットに結合する結合部位を含み、ステージＩ薬剤は、系の中を移動し、被験体の管腔表面上に曝露された任意のターゲットに結合する。次いで、本明細書において上記に記載されるステージＩＩ薬剤の有効量が被験体に投与され、複数のステージＩＩ薬剤は、ターゲット部位に結合したステージＩ薬剤に結合する。次いで、有効量のステージＩＩＩ薬剤が被験体に投与され、ステージＩＩＩ薬剤は、ステージＩＩＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤に結合する。治療組成物は、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つの中に組み込まれる／カプセル化される。一実施態様では、治療組成物は、ターゲット部位に結合するとすぐに、ターゲット部位に送達される。あるいは、この方法は、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤を活性化して、前記治療組成物を放出させ、それにより、組成物をターゲット部位に送達する工程をさらに含み得る。

【0086】

治療用途の例は、温熱療法；組織を数度加熱すること（これは、永久的な組織損傷を伴わずに、薬物の活性を増加させ得、及び／又は血流量を増加させ得る）；治療的有用性のための永久的な組織損傷を引き起こすより高いレベルまで組織を加熱すること；キャビテーション及び／又は薬剤の崩壊を増加させること；組織アブレーション；ソノポレーション誘導；薬物及び遺伝子送達を増加させることなどを含むが、これらに限定されない。本明細書において下記にさらに詳細に記載されるように、別の治療用途は、血管組織の虚血／壊死の誘発を含む。

【0087】

本明細書において上記に記載されるイメージング方法のいずれかは、有効量の治療剤を被験体に投与する工程をさらに含み得、治療剤は、ステージＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つに結合する。加えて、本明細書において上記に記載されるイメージング方法のいずれかは、有効量の第２のステージＩＩＩ薬剤を被験体に投与する工程をさらに含み得、第２のステージＩＩＩ薬剤は、ステージＩ薬剤を介してターゲット部位に結合したステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤の少なくとも１つに結合する。

【0088】

本明細書において上記又は下記に記載される方法のいずれかにおいて利用される薬物のいずれかは、ガス（すなわち、エコージェニックリポソーム）を含み得るため、音響放射力は、１種以上の薬剤を管腔の内部表面に押し付けることによって、ターゲティング効率を増加させるのに利用され得る。例えば、限定されないが、ステージＩ薬剤がガスを含む場合、超音波照射は、ステージＩ薬剤を管腔壁に押し付け、ステージＩ薬剤とターゲット部位との相互作用の可能性を増大させる。場合により、ステージＩＩ薬剤がガスを含む場合、超音波照射は、ステージＩＩ薬剤を管腔壁に押し付け、ステージＩＩ薬剤とターゲット部位に結合したステージＩ薬剤との相互作用の可能性を増大させる。

【0089】

本明細書において上記又は下記に記載される方法のいずれかでは、ターゲット部位は、血液脳関門、卵巣、膵臓、腎臓、肝臓、それらのいずれかのガン組織及び／又はそれを提供する組織の少なくとも１つの表面上に曝露され得る。ターゲット部位は、疾患特異的であり得る。

【0090】

本明細書において上記又は下記に記載される方法のいずれかでは、そこで利用されるイメージングモダリティは、超音波、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、デュアルソースＣＴ（灌流イメージング）、拡散テンソルイメージング（ＤＴＩ）、遅延強調イメージング、Ｘ線透視（造影透視）イメージング、コンピューターＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ又はＰＥＴ−ＣＴイメージング、及び分子イメージング（放射性医薬品）からなる群より選択され得る。

【0091】

ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤中に配置されたガスの使用は、超音波と共に使用することに関して本明細書において記載したが、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、他のイメージングモダリティ／治療モダリティと共に使用するための、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤中に配置された他の組成物の使用も包含すると理解されるべきである。例えば、限定されないが、ガドリニウムキレート誘導体（例えば、限定されないが、ガドリニウム−ジエチレン−トリアミン−五酢酸（例えば、Accardo et al, 2009を参照のこと））はＭＲＩモダリティと共に利用され得るのに対して、放射性核種はＸ線モダリティ（すなわち、放射線療法）と共に利用され得る。

【0092】

加えて、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤のいずれかは、マルチモーダルエコージェニックリポソームであり得（すなわち、前記薬剤は、前記薬剤が音響放射力の影響を受けやすいようなガスを含む）、本明細書において上記に記載される第２のイメージングモダリティ（すなわち、ＭＲＩ、ＣＴ、ＤＴＩ、ＰＥＴなど）も含み得る。従って、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の別の実施態様は、マルチモーダルエコージェニックリポソーム／マイクロバブル／ベシクルを含むステージＩ（ターゲティング）薬剤の使用を含む。前記ステージＩ薬剤は、増幅の存在下又は非存在下で利用され得る。

【0093】

加えて、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、管腔において曝露されたターゲットをイメージングにより検出するのに有用である連続送達可能な薬学的試薬の複合体であって、管腔で形成される複合体を対象とする。この複合体は、少なくとも１つの本明細書において上記に記載されるステージＩ薬剤、及び複数の本明細書において上記に記載されるステージＩＩＩ（イメージング）薬剤を含む。複数のステージＩＩＩ薬剤のそれぞれは少なくとも１つのステージＩＩ薬剤に結合し、ステージＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤はイメージングモダリティによって検出可能であり、それにより、ターゲットに結合した複合体の検出が可能になる。

【0094】

さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、イメージングモダリティによって可視化されたシグナルをターゲティングする方法を対象とする。前記方法では、有効量のステージＩ薬剤が被験体に投与され、ステージＩ薬剤は被験体の中を移動し、被験体の管腔上に曝露されたターゲット部位に結合する。次いで、有効量のステージＩＩＩ（イメージング）薬剤が被験体に投与され、それにより、ステージＩＩＩ薬剤はステージＩ薬剤に結合する。次いで、ステージＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤によって生成されたシグナルがイメージングモダリティによって検出される。

【0095】

本明細書において記載される方法のいずれかでは、管腔で形成された複合体は、管腔における流体の流れ（すなわち、血流）を実質的に妨げない。これは、薬剤を連続的に加えることによって、当該方法に利用される個々の薬剤のサイズ（構造寸法）を制限することによって、及び／又はステージＩＩ薬剤から形成される複合体の寸法が制限され、それにより、管腔の寸法を超えないように、利用されるステージＩＩ薬剤の量を制限することによって、達成される。例えば、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤は、十分に小さな直径が提供され得、それにより、３つの直径の合計は、毛細血管の直径を超えない（すなわち、≦１０μ；Dayton, 2002）。

【0096】

あるいは、本明細書において記載される方法のいずれかでは、管腔で形成された複合体は、被験体の管腔のターゲット部位における血流を実質的に妨げ、それにより、被験体のターゲット部分（すなわち、組織、器官、体の一部など）に虚血をもたらし得る。従って、さらに、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念は、本明細書において上記に記載されるように、被験体のターゲット部位において血管組織の虚血及び壊死を作る方法を対象とする。前記方法では、本明細書において上記に記載されるように、ステージＩ薬剤、ステージＩＩ薬剤及びステージＩＩＩ薬剤が投与される。次いで、管腔がターゲット部位で実質的に閉塞されるまで、複数回用量のステージＩＩ薬剤及び／又はステージＩＩＩ薬剤が投与される。従って、長時間にわたって連続的に加える場合、ステージＩＩＩ薬剤は、管腔を閉塞する「増幅剤」としても機能し得る。

【0097】

管腔で形成された複合体は、本明細書において記載される薬剤の任意の組み合わせ（すなわち、ターゲティング剤及びイメージング剤；ターゲティング剤、増幅剤及びイメージング剤；ターゲティング剤、増幅剤及び治療剤）を含み得る。加えて、管腔で形成された複合体が、ターゲティング剤、増幅剤及びイメージング剤を含む場合、治療剤（すなわち、それにカプセル化された化学療法物質又は他の細胞毒性物質を含む）がイメージング剤に結合し、細胞毒性物質を虚血性損傷組織に送達して、さらなる殺傷メカニズムを提供するように、治療剤が被験体にさらに投与され得る。場合により、イメージング剤は、治療剤の投与前に複合体から除去され得、それにより、連続投与される治療剤は、増幅剤に結合し、次いで、細胞毒性物質を虚血性損傷組織に送達して、さらなる殺傷メカニズムを提供するであろう。

【0098】

イメージング後にステージＩＩＩ薬剤を複合体から除去し、その後、次の薬剤（例えば、限定されないが、別のイメージング剤又は治療剤）を投与するするこの同じ技術が、本明細書において上記に記載されるか、あるいは本明細書において企図される方法のいずれかにおいて利用され得る。この方法では、ステージＩ薬剤及び１つ以上のステージＩＩ薬剤から形成された複合体は、多様に使用され得る（例えば、限定されないが、複合イメージング技術、又はイメージング技術及び治療技術の組み合わせ）基礎構造／骨格／格子ネットワークを形成する。場合により、基礎構造は、時間の経過とともに、複数の用途も可能にする。この方法では、骨格は、必要に応じて再利用され得る。

【0099】

さらなる代替態様では、ステージＩＩＩ薬剤及びステージＩＩ薬剤の両方を除去し、ステージＩ薬剤のみを残して、複数の使用又は複数の用途に再利用され得る骨格を形成させることが望ましいかもしれない。

【0100】

本明細書において記載される方法のいずれかは、プロトコール（イメージング及び／又は治療）が適用された後に、複合体の少なくとも一部（又は、複合体のすべて）を分解する工程も含み得る。分解は、エネルギー、熱、化学的方法（すなわち、独自の方法によるジスルフィド結合の還元）、ｐＨ変化、競合剤（Ａｂ）の追加など、の使用を含み得る。この方法では、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤の１つ以上は、必要に応じて（例えば、限定されないが、超音波によって）破裂され得る；加えて、複合体がもはや必要とされない場合、すべての薬剤は破裂され得る。例えば、限定されないが、スペーサーが、酵素によって切断されるアミノ酸配列を有するペプチドである場合、スペーサーが切断されると、複合体は分解されるであろう。酵素はビヒクルの１つに付着され得、活性化のために共因子又は熱を必要とし得る。

【0101】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用されるステージＩ（ターゲティング）薬剤は、本明細書において下記により詳細に記載されるように、ベシクルフレームワーク上に複数（すなわち、少なくとも２つ）の付着部位／結合部位又は付着点／結合点を提供することによって製造される。ステージＩ（ターゲティング）薬剤の場合、ターゲットに結合するための第１の結合部位はリンカーによりベシクルフレームワークに付着するが、ステージＩＩ薬剤に結合するための第２の結合部位は別のリンカーによりベシクルフレームワークに付着する。

【0102】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用されるステージＩＩ（増幅）薬剤は、ベシクルフレームワーク上に複数の付着点（すなわち、複数の結合部位）を提供することによって製造される。複数の付着点を使用することにより、（１）マルチモーダルイメージングのための複数の付着点；（２）複数の用途（時間の経過とともに）；及び／又は（３）複数の使用（例えば、限定されないが、イメージングの使用及び治療の使用）が可能になるであろう。本明細書において上記に記載されるように、増幅剤は第３及び第４の結合部位が提供され得、さらなるイメージング剤／治療剤（すなわち、第４の結合部位と相互作用するイメージング剤／治療剤以外）との相互作用を可能にするために、さらなる結合部位がさらに提供され得る。

【0103】

一実施態様では、第３及び第４の結合部位は、リンカーの使用によって付着され得る。増幅ベシクル上の複数の付着点は、本明細書において下記により詳細に記載されるように、リンカーの混合物を使用して調製される。しかしながら、リンカーは、第３及び第４の結合部位が増幅剤に付着するのに必要とされないと理解されるべきである。

【0104】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用されるイメージング剤／治療剤は、ベシクルフレームワーク上に少なくとも１つの付着点を提供することによって製造される。少なくとも１つの付着点は、リンカーによってベシクルフレームワークに付着され得る；しかしながら、リンカーは、第５の結合部位がイメージング剤／治療剤に付着するのに必要とされないと理解されるべきである。

【0105】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用されるターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤の製造は、フレームワークとしてマイクロバブル、リポソーム、又は他の種類のベシクルを提供し、次いで、結合部位（すなわち、リンカー／錯化剤）をそれに追加することによって開始し得る。イメージング用途／治療用途における使用に関して、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤に利用され得る一般的なベシクルフレームワークの例は、当技術分野において周知である（特許請求の範囲に記載される複合体の骨格を製造するのに利用されるターゲティング剤及び／又はリンカー／錯化剤の非存在下で製造された前記先行技術のベシクル）。具体例は以下のものを含むが、これらに限定されない。１９９２年６月２３日にUngerによって発表されたUS Patent No. 5,123,414は、超音波造影剤として適切なリポソームを開示しており、前記薬剤は、ｐＨ、温度及び／又は圧力によって活性化されるガス、ガス前駆体並びにペルフルオロカーボンを含む様々な種類の媒体を含む。Unger et al. (2004)は、生物活性材料の部位特異的な局所送達、及び血管内血栓の処置のためのマイクロバブルであって、診断用途及び治療用途の両方で脂質コーティング内に封入されたペルフルオロカーボンガスを有し、超音波エネルギーによりキャビテーションされる能力を含むマイクロバブルを開示している；前記参考文献は、低分子量治療薬及び高分子量治療薬の両方を脳に送達するために、超音波（これも、微小脳血管内でマイクロバブルをキャビテーションする）を使用して、血液脳関門（ＢＢＢ）が可逆的に開かれ得ることも開示している。The Review Article of Klibanov (2006)は、マイクロバブル表面上にターゲティングリガンドを提供することによって、マイクロバブル造影剤を、ターゲティングされた超音波イメージング及び超音波支援薬物送達の用途に使用することを開示している。Hernot and Klibanov (2008)は、超音波でトリガーされる薬物及び遺伝子送達のマイクロバブルを記載しており、マイクロバブルは、ターゲット組織において超音波エネルギー付与を増大させ、細胞内薬物送達の増加のためのキャビテーション核として働く。Ferrante et al. (2009)は、ポリエチレングリコール−ビオチン−ストレプトアビジン架橋と、ｍＡｂ ＭＶＣＡＭ．Ａ及び／又はシアリルLewisxポリマー（ＰＡＡ−ｓＬｅｘ）とを結合させることによって、接着分子Ｐ−セレクチン及びＶＣＡＭ−１にターゲティングされたペルフルオロカーボン充填リン脂質マイクロバブル造影剤を記載している。Liu et al. (2006)は、その表面に付着したターゲティングリガンドを有するカプセル化された超音波マイクロバブル、及び薬物送達又は遺伝子治療におけるその用途を開示している。Suzuki et al. (2007 and 2008)は、ペルフルオロプロパンを含むバブルリポソーム（これは、従来のマイクロバブルと直径が類似する）、並びに遺伝子治療及び超音波分解技術におけるその使用を記載している。Tinkov et al. (2009)は、超音波でトリガーされる薬物担体として使用するためのマイクロバブルの製造方法及び薬物ローディング方法を開示している。Jong et al. (2009)は、超音波造影剤（ＵＣＡ）を特性決定するための異なる戦略（音響法及び光学的方法を含む）を記載している。Schroeder et al. (2009)は、超音波とリポソームとの相互作用、及び低周波数超音波（ＬＦＵＳ）を使用するリポソームからの薬物放出の機械的メカニズム（リポソーム脂質組成物及び物理化学的特性並びにＬＦＵＳパラメーターのリポソーム薬物放出に対する効果、並びに音響キャビテーションの使用を含む）を記載している。Huang (2008)は、それにカプセル化されたガス及び／又は薬物を有するリポソームを介した、超音波でコントロールされる薬物放出並びに超音波で促進される薬物送達を開示している。上記特許及び刊行物それぞれの内容の全体が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0106】

加えて、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得る市販の超音波造影剤は、SONAZOID（商標）(GE Healthcare, Oslo, Norway)−それに付着する抗体の開示に関しては、Otani et al. (2009)を参照のこと；DEFINITY（登録商標）(Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Billerica, MA);及びOPTISON（商標）(GE Healthcare, Oslo, Norway)を含むが、これらに限定されない。加えて、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用され得る様々な超音波造影剤が、Targeson, Inc. (San Diego, CA)によって製造されており、TARGESTAR-B（登録商標）（これは、ビオチン化リガンドのコンジュゲーションのためのビオチン化マイクロバブル造影剤である）を含むが、これに限定されない。

【0107】

ベシクルフレームワークが提供されるとすぐに、製造方法は、結合部位をそれに付着させることによって進行する；結合部位は、リンカーを使用することによって付着され得る。各リンカーは、錯化剤の相補対の一方のメンバーを含む。ステージＩ薬剤／ステージＩＩ薬剤の結合において、ステージＩ（ターゲティング）薬剤は、相補対の第１のメンバー（すなわち、第２の結合部位）を含むが、ステージＩＩ（増幅）薬剤は、前記相補対の第２のメンバー（すなわち、第３の結合部位）を含む。増幅剤／イメージング（又は、治療）剤の結合において、増幅剤は、別の相補対の第１のメンバー（すなわち、第４の結合部位）を含むが、イメージング（又は、治療）剤は、前記相補対の第２のメンバー（第５の結合部位）を含む。

【0108】

本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念に従って利用されるリンカーは、両末端が官能化される。両末端が同じ反応部分で活性化される場合、リンカーは「ホモ二重機能的」と称されるのに対して、存在する官能基が異なる場合、リンカーは「ヘテロ二重機能的」と称される。両末端の一方はリンカーをベシクルフレームワークに付着させるが、他方の末端は錯化剤の相補対の一方のメンバーを含む。ホモ二重機能的リンカーを利用する場合、同種のコネクターがリンカーの両端で利用されるため、リンカーを薬剤のベシクルフレームワークに接続し、錯化剤の相補対の他方のメンバーと相互作用して、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤を別のターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤に結合させる。ホモ二重機能的リンカーの非限定的な例は、アビジン−ＰＥＧ−アビジン（これは容易に作られ、及び／又は市販されている）である。リンカーの多くは、潜在的には、複数の結合部位を示す。分解されていない抗体は、二座である；アビジン、ストレプトアビジン及びニュートラアビジンは、最大４つの結合部位をそれぞれ提供する。多座分子は、ホモ二重機能的リンカーの代わりに使用され得る。

【0109】

ヘテロ二重機能的リンカーを利用する場合、第１の種類のコネクターはリンカーを薬剤のベシクルフレームワークに接続するのに利用され、第２の異なる種類のコネクターはターゲット部位及び／又は錯化剤の相補対の他方のメンバーと相互作用して、ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤を別のターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤に結合させるのに利用される。ヘテロ二重機能的リンカーの非限定的な例は、アビジン−ＰＥＧ−抗体である。ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤／治療剤は、適切な割合のホモ二重機能的連結剤及びヘテロ二重機能的連結剤（両連結剤は共通のコネクター型を共有しており、この共通のコネクター型は、ベースのベシクルに付着したリンカーの相補対である）を混合することによって調製され得る。次いで、混合物をベースのベシクルに添加して、所望の複数の付着点を得る。

【0110】

リンカーは、テザー分子又はエクステンダー分子（例えば、限定されないが、ペプチド又はＰＥＧ）をさらに含み得る。個々の薬剤のサイズは、リンカーを介した２つの薬剤の最大連結に十分であるべきである。テザー／リンカーは、薬剤を結合を最大にするのに十分の長さであるべきだが、テザー／リンカーの有意なエンタングルメントが起こるほど長くないべきである。

【0111】

ステージＩ（ターゲティング）薬剤の製造において、ヘテロ二重機能的リンカーは、第１の結合部位をステージＩ薬剤に付着させるのに利用される。例えば、限定されないが、アビジン化リポソーム／マイクロバブル（これは容易に作られ、及び／又は市販されている）が提供され得、ビオチン−ＰＥＧ−抗体（この抗体は、市販されているか、あるいは当技術分野において公知の任意の抗体であり得る）と相互作用し得る。アビジン化ベシクルフレームワーク−ビオチン−ＰＥＧ−の前駆体は、任意の結合分子を用いて任意の所望のステージＩ薬剤を形成するのに利用され得る一般的な前駆体を提供する。例えば、前記前駆体が提供され得、次いで、異なる種類の障害／疾患／ガンのための異なる抗体が、それに付着され得る。加えて、複数の抗体／結合分子が、第１の結合部位に利用され得る。

【0112】

次いで、ヘテロ二重機能的リンカー又はホモ二重機能的リンカーは、第２の結合部位（増幅剤への結合のための）をベシクルフレームワークに付着させるのに使用され得る。例えば、限定されないが、ホモ二重機能的リンカービオチン−ＰＥＧ−ビオチンが利用され得、ビオチンは、第２の結合部位を形成し、それにより、それに付着したアビジン−ＰＥＧ−アビジンリンカーを有するビオチン化リポソーム／マイクロバブルを含む増幅剤と相互作用し得る（すなわち、アビジンは、ビオチンの第２の結合部位と相互作用する第３の結合部位を形成する）。

【0113】

ステージＩＩ（増幅）薬剤の製造において、第３及び第４の結合部位は、当技術分野において公知の任意の方法によって、ベシクルフレームワークに付着され得る。例えば、ステージＩＩ薬剤は、単に、ビオチン化マイクロバブルを含み得、ステージＩＩ薬剤上のビオチンは、第３及び第４の結合部位を含み、第２及び第５の結合部位のようにアビジンと相互作用する。また、ステージＩＩ薬剤は、ベシクルフレームワークに付着したさらなる結合部位を含み得、前記さらなる結合部位はベシクルを多機能化し、それにより、マルチモーダルイメージング、複数の用途及び／又は複数の使用（イメージング及び／又は治療）を可能にする。

【0114】

ステージＩＩ薬剤を製造する別の方法では、ホモ二重機能的リンカー又はヘテロ二重機能的リンカーは、第３の結合部位をベシクルフレームワークに付着させるのに利用され得、少なくとも１つのさらなるヘテロ二重機能的リンカーは、第４の結合部位をベシクルフレームワークに付着させるのに利用され得る。また、ステージＩＩ薬剤は、ヘテロ二重機能的リンカーを介してベシクルフレームワークに付着したさらなる結合部位を含み得る。これらのさらなる結合部位はベシクルを多機能化し、それにより、マルチモーダルイメージング、複数の用途及び／又は複数の使用（イメージング及び／又は治療）を可能にする。例えば、限定されないが、第３の結合部位（ステージＩ薬剤のビオチンの第２の結合部位と相互作用する）を形成するために、ステージＩＩ薬剤は、それに付着したアビジン−ＰＥＧ−アビジンホモ二重機能的リンカーを有するビオチン化リポソーム／マイクロバブルを含み得、ヘテロ二重機能的リンカー（例えば、限定されないが、アビジン−ＰＥＧ−ビオチン（このビオチンは、ステージＩＩＩ薬剤の第５の結合部位と相互作用する第４の結合部位を形成する））をさらに含む。加えて、ステージＩＩ薬剤に付着した任意の遊離アビジン−ＰＥＧ−アビジンリンカーであって、ステージＩ薬剤に結合しない遊離アビジン−ＰＥＧ−アビジンリンカーは、第２のイメージング剤及び／又は治療剤を捕捉するためのさらなる結合部位としてさらに利用され得る。

【0115】

ステージＩＩＩ薬剤の製造において、第５の結合部位は、当技術分野において公知の任意の方法によって、ベシクルフレームワークに付着され得る。例えば、限定されないが、ステージＩＩＩ薬剤は、単に、ビオチン化マイクロバブルを含み得、ステージＩＩＩ薬剤上のビオチン（すなわち、第５の結合部位）は、ステージＩＩ薬剤に付着したアビジン（すなわち、第４の結合部位）と相互作用する。

【0116】

ステージＩＩＩ薬剤を製造する別の方法では、ホモ二重機能的リンカー又はヘテロ二重機能的リンカーは、第５の結合部位をベシクルフレームワークに付着させるのに利用され得る。例えば、限定されないが、ホモ二重機能的リンカーアビジン−ＰＥＧ−アビジンが利用され得、アビジンは第５の結合部位を形成し、それにより、ビオチン化リポソーム／マイクロバブルを含むステージＩＩ薬剤と相互作用し得る（すなわち、ビオチンは、アビジンの第５の結合部位と相互作用する第４の結合部位を形成する）。

【0117】

加えて、ステージＩＩＩ薬剤は、ベシクルフレームワークに付着したさらなる結合部位をさらに含み得る。これらのさらなる結合部位は、さらなる薬剤がそれ（すなわち、別のイメージング剤又は治療剤）に結合するのを可能にするように機能し得る。例えば、限定されないが、第１のイメージング剤（超音波造影剤）は、それに付着した抗フルオレセイン抗体のさらなる結合部位を含み得る。第１のイメージング剤は、ＭＲＩ検出のための第２のイメージング剤と共に利用され得、第２のイメージング剤は、その表面上にフルオレセインが提供される。これらのさらなる結合部位は、当技術分野において公知の任意の方法によって（例えば、限定されないが、ヘテロ二重機能的リンカーを介して）、付着され得る。

【0118】

実施例
実施例を以下に提供する。しかしながら、本発明は、特定の実験、結果及び検査法への適用に限定されないと理解されるべきである。むしろ、実施例は、様々な実施態様の１つとして提供されるにすぎず、包括的ではなく例示的なものである。

【0119】

実施例１：ステージＩ薬剤／ステージＩＩ薬剤／ステージＩＩＩ薬剤複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ形成
本実施例では、推奨するｉｎ ｖｉｔｒｏ薬剤の重要な原材料（ＣＲＭ）を、フルオレセイン標識ＢＳＡ及び２Ｈ１（フルオレセインに対する抗体）とした。ＢＳＡをフルオレセイン標識し、次いで、フルオレセイン標識ＢＳＡをポリスチレン（ｐＨ８、重炭酸塩緩衝液）に結合させることによって、ポリスチレン結合表面を調製した。フルオレセイン標識ＢＳＡが、ステージＩ（ターゲティング）薬剤の第１の結合部位のターゲットとして働いた。

【0120】

ステージＩ（ターゲティング）薬剤の調製：市販のビオチン化マイクロバブル（すなわち、Targeson, Inc., San Diego, CAから入手したターゲティング剤Targestar B）及び２Ｈ１抗体（これは、フルオレセイン標識ＢＳＡに結合する）を入手した。アビジン−ＰＥＧ−２Ｈ１（すなわち、ターゲティング剤上の第１の結合部位）をヘテロ二重機能的ＰＥＧから調製し、アビジン−ＰＥＧ−アビジン（すなわち、ターゲティング剤上の第２の結合部位）をホモ二重機能的ＰＥＧから調製したアビジン−ＰＥＧ−２Ｈ１及びアビジン−ＰＥＧ−アビジンをビオチン化マイクロバブルと反応させて、ステージＩ（ターゲティング）薬剤の第１及び第２の結合部位をそれぞれ形成させた。

【0121】

ステージＩＩ（増幅）薬剤の調製：本実施例では、市販のビオチン化マイクロバブルが、ステージＩＩ薬剤として機能した。ビオチン化部位は、ステージＩＩ薬剤の第３及び第４の結合部位の両方として機能する。

【0122】

ステージＩＩＩ（イメージング）薬剤の調製：市販のビオチン化マイクロバブルを準備し、アビジン−ＰＥＧ−アビジンと反応させて、ステージＩＩＩ薬剤の第５の結合部位を形成させた。

【0123】

ステージＩ（ターゲティング）薬剤／ターゲット複合体の形成：ステージＩ（ターゲティング）薬剤をポリスチレン結合表面と反応させ、ターゲティングマイクロバブル上のアビジン−ＰＥＧ−２Ｈ１を、ポリスチレン結合表面上のフルオレセイン標識ＢＳＡに結合させた。次いで、ポリスチレン結合表面を洗浄して、あらゆる未結合のマイクロバブルを除去した。必要に応じて、この時点で、結合及び超音波効果を測定した。

【0124】

増幅複合体の形成：ステージＩＩ（増幅）薬剤を、それに結合したステージＩ（ターゲティング）薬剤を有するポリスチレン結合表面と反応させ、ステージＩＩ（増幅）薬剤上のビオチン化部位（すなわち、第３の結合部位）を、ステージＩ（ターゲティング）薬剤上のアビジン−ＰＥＧ−アビジン（すなわち、第２の結合部位）と相互作用させ、それにより、ステージＩＩ（増幅）薬剤を、ポリスチレン結合表面に結合したステージＩ（ターゲティング）薬剤に結合させた。次いで、結合表面を洗浄して、あらゆる未結合のビオチン化マイクロバブル（すなわち、ステージＩＩ（増幅）薬剤）を除去した。必要に応じて、この時点で、結合及び超音波効果を測定した。

【0125】

イメージング複合体の形成：ステージＩＩＩ薬剤を、それに結合したステージＩ薬剤／ステージＩＩ薬剤を有するポリスチレン結合表面と反応させ、ステージＩＩＩ薬剤上のアビジン（すなわち、第５の結合部位）を、ステージＩＩ（増幅）薬剤上のビオチン化部位（すなわち、第４の結合部位）と相互作用させた。このようにして、ステージＩＩＩ薬剤を、ポリスチレン結合表面に結合したステージＩ（ターゲティング）薬剤に結合したステージＩＩ（増幅）薬剤に結合させた。次いで、結合表面を洗浄して、あらゆる未結合のマイクロバブル（すなわち、イメージング剤）を除去した。

【0126】

この時点で、結合及び超音波効果を測定して、超音波造影剤シグナル（ＣＰＳ）の増大を確認し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのバブル加熱計算も検証して、バブル集合体は影響を受けなかったことを実証した。

【0127】

加えて、バブル集合体を光学顕微鏡法で研究して、３つの結合ステージを確認した。

【0128】

実施例２：ターゲティング剤／イメージング剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ超音波用途
ターゲティング成分の調製：最初に、リン脂質をアビジン化すること以外はSzoka and Papahadjopoulos (1978)に記載されている手順に従って、アビジン化単層リポソーム調製物を調製した。Thermo-Fisherから入手したヘテロ二重機能的架橋剤から、ビオチン−ＰＥＧ_３０−抗体を調製した。この場合、Nature Reviews Cancer, Vol. 1, pp. 118-129 (November 2001)に見られるリストから、抗体を選択し得る。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、ビオチン−ＰＥＧ_３０−ビオチンを調製した。ビオチン−ＰＥＧ_３０−ビオチン及びビオチン−ＰＥＧ_３０−抗体をアビジン化単層リポソームと混合して、ターゲティング試薬を調製した。

【0129】

イメージング成分の調製：市販のビオチン化マイクロバブルを使用した。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンを調製した。ビオチン化マイクロバブルをアビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンと混合して、メージング成分を得た。

【0130】

この使用方法では、ターゲティング成分／リポソーム調製物を血流に注入し、ターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量のイメージング成分を患者に注射し、第２のターゲティングが起こり、循環遊離マイクロバブルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、ターゲティングした薬剤又はターゲティングした治療活性の診断イメージングを実施する。

【0131】

実施例３：ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ超音波用途
ターゲティング成分の調製：最初に、Szoka and Papahadjopoulos (1978)に記載されている手順に従って、ビオチン化単層リポソーム調製物を調製した。Thermo-Fisherから入手したヘテロ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−抗体を調製した。この場合、Nature Reviews Cancer, Vol. 1, pp. 118-129 (November 2001)に見られるリストから、抗体を選択し得る。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンを調製した。アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジン及びアビジン−ＰＥＧ_３０−抗体をビオチン化単層リポソームと混合して、ターゲティング試薬を調製した。

【0132】

増幅成分の調製：Szoka and Papahadjopoulos (1978)に記載されている手順に従って、ビオチン化単層リポソーム調製物を調製した。

【0133】

超音波イメージング成分の調製：市販のストレプトアビジン超音波イメージング剤（Targeson, Inc., San Diego, CAからのTargestar SA）を使用した。

【0134】

この使用方法では、ターゲティング成分／リポソーム調製物を血流に注入し、ターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量の増幅成分を患者に注射し、第２のターゲティングが起こり、循環遊離ベシクルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量のイメージング成分を患者に注射し、第２のターゲティングが起こり、循環遊離ベシクルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、ターゲティングした薬剤又はターゲティングした治療活性の診断イメージングを実施する。

【0135】

実施例４：ターゲティング剤／増幅剤／イメージング剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ ＭＲＩ用途
本実施例は、超音波イメージング成分をＭＲイメージング成分に代える以外は、実施例３と同様の方法で行う。ＭＲイメージング成分を以下のように調製する：造影剤を、ビオチン化リポソームの内部水性水空間内にトラップする；シグナルを増大するために、造影剤は、高分子量を有するべきである。造影剤の例は、高分子ガドリニウム（ＩＩＩ）キレート、例えばデンドリマー、線状ポリマー、ガドフラーレン、ガドナノチューブ、及び大きなタンパク質を含むが、これらに限定されない（例えば、Accardo et al., 2009を参照のこと）。

【0136】

脂溶性造影剤は、複層リポソームの脂質二重層に組み込まれる。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンを調製する。ビオチン化リポソームをアビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンと混合して、ＭＲイメージング成分を得る。

【0137】

Ｇｄ−ＤＴＰＡは、一般的なＭＲＩ造影剤である。典型例な用量は、０．１７mmol/kg体重である。この分子は、０．５６kDaの分子量及び１０．０Åの直径を有する（Higgins et al., 2006）。
０．１７×１０^−３mole/kg×１００kg／体×分子６．０２２×１０^２３個／mole
＝分子１．０２×１０^２３個／体

【0138】

一体あたり６リットルの血液と仮定すると、常用量の薬剤中、血液１μLあたり１．７ｘｌ０^１５個の粒子が存在し得る。血液は、組織の所定領域の体積の約１０％（組織の種類に応じて５〜１４％）を形成するため、組織１μL中、約１．７ｘｌ０^１４個の粒子が存在する。

【0139】

造影分子の表面ローディング：球半径ｒの表面積は、４πｒ^２によって与えられる。直径３μmの球は、２．８ｘ１０^−１１m²の表面積を有する。Ｇｄ−ＤＴＰＡ分子は、７．８５ｘ１０^−１９m²の断面積を有する。従って、約３６ｘ１０^６個のＧｄ−ＤＴＰＡ粒子が、各球の表面の周囲にフィットするであろう。

【0140】

ターゲット領域１μL中、１００個の球が存在すると仮定すると、３．６ｘ１０^９個のＧｄ−ＤＴＰＡ粒子がターゲティングされ、各球の周囲は粒子で完全にパッキングされるであろう。これは、常用量の約０．００２％である。

【0141】

しかしながら、University of Wisconsinにおけるいくつかの取り組みでは、分子１個あたり１００個のＧｄイオンに結合できる抗体が作られた（Glazer et al., 2004）。この取り組みでは、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングに十分な低い抗体濃度として０．１μMが挙げられた。
０．１×１０^−６mole／リットル×１０^−６リットル／uL×分子６．０２２×１０^２３個／mole
＝抗体６０．２×１０^９個／μL→Ｇｄイオン６．０２×１０^１２個／μL

【0142】

この取り組みによれば、１μL中、約６×１０^１２個のＧｄ複合体が、ＭＲＩ画像を実現するはずである。これは、１００個の球が粒子で完全にパッキングされると仮定した場合を上回る１６００倍超の増幅を必要とする。

【0143】

従って、本実施例は、良好なコントラストを有するＭＲＩ剤を利用して、より多数のＧｄ−ＤＴＰＡ粒子をターゲット球にターゲティングすることを提供する。一実施態様では、ＰＥＧ鎖は、各球に結合したＧｄ−ＤＴＰＡ粒子数を大きく増加させ得るさらなる結合部位を提供する。

【0144】

造影分子の容積ローディング：半径がｒの場合、球の体積は、４／３πｒ^３によって与えられる。直径３μmの球は、１．４ｘ１０^−１７m³の体積を有する。Ｇｄ−ＤＴＰＡ分子は、約５．２８ｘ１０^−２８m³の体積を有する。従って、約２６ｘｌ０^９個のＧｄ−ＤＴＰＡ粒子が、各球の体積の中にフィットするはずである。ＭＲＩ反応が最大になるように、この分子を懸濁するか、又は何らかのかたちで拘束する。

【0145】

１μLあたり１０個の球をターゲティングすることによって、１μLあたり約２６０ｘ１０^９個のＧｄ複合体が達成され、これは、ＭＲＩでイメージングするのに必要とされる（１μLあたり約６ｘ１０^１２個の複合体）よりも約２３倍少ない。ＭＲＩの検出能の限界は、２３倍の増幅で達成できる。より大きいレベルの増幅により、球にローディングしなければらないＧｄ−ＤＴＰＡ粒子数の要件を緩和し得る。

【0146】

より多くのＧｄ複合体をローディングできるように、ターゲティング球の体積を増加させることも役立つであろう。直径を１０％増加させることにより、Ｇｄペイロード容量の３０％の増加がもたらされるであろう。

【0147】

結論：増幅は、領域に送達されるＧｄ複合体数を、検出されるのに十分なレベルに増加させることによって、ターゲティングされたＭＲＩ造影イメージングを可能にするであろう。血管腔に限定して、ターゲティングされたＭＲＩ造影剤を増幅する。

【0148】

実施例５：熱を体の局所部位に送達して、疾患状態／病気／ガンを処置する方法
体内の局所部位をターゲティングする抗体でコーティングしたリポソームのセットを準備する。リポソームのセットを錯化剤の相補対の一方のメンバーでもコーティングする。

【0149】

錯化剤の相補対の他方のメンバーでコーティングしたマイクロバブルのセットを準備する。マイクロバブルの各セットをガスで充填する。

【0150】

有効量のリポソームのセットを患者に注射し、ターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者をリポソームと共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量のマイクロバブルのセットを患者に注射し、第２のターゲティング（すなわち、増幅）が起こり、循環遊離マイクロバブルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記マイクロバブルと共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。

【0151】

次いで、超音波を患者の局所部分に適用し、それにより、超音波エネルギーが材料によって吸収され、熱に変換されるように、超音波を適切な周波数及び振幅で適用する。この方法では、周囲組織への損傷を最小にしつつ壊死が起こる温度まで、局所組織を加熱する。

【0152】

この方法では、血流を遮断せずに音波の吸収を最大にするように、バブルサイズを選択する。

【0153】

実施例６：ターゲティング剤／イメージング剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ治療用途
実施例２のように、ターゲティング成分を調製する。

【0154】

ＵＳ及びＰＥＴ適用における使用のための治療成分の調製：市販のビオチン化マイクロバブルを、超音波適用に使用する。市販のビオチン化放射性医薬品を、ＰＥＴ適用に使用する。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンを調製する。ビオチン化マイクロバブルをアビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンと混合して、治療成分を得る。

【0155】

この使用方法では、ターゲティング成分／リポソーム調製物を血流に注入し、ターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量のイメージング成分を患者に注射し、第２のターゲティングが起こり、循環遊離マイクロバブルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。第２のターゲットの遊離バブル活性は、イメージングモダリティでモニタリングできる。次いで、ターゲティングした薬剤及び／又はターゲティングした治療活性の診断イメージングを実施する。

【0156】

いくつかの一般的なＰＥＴトレーサーの同位体は、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^１２４Ｉ、^７６Ｂｒ、^８２Ｒｂ及び^６８Ｇａ、特に^１８Ｆである。典型例な感度のＰＥＴスキャナーにより、１０^−１１〜１０^−１２mol/L濃度の検出が可能になるであろう。本実施例では、約数ミリメートルの分解能も説明する。
１０^−１１mole/L×分子６．０２２×１０^２３個／mole×１０^−６L/μL＝分子６×１０^６個／μL
ターゲット領域１μL中、１００個のターゲティング球が存在すると仮定すると、約６０，０００個の同位体粒子が、各ターゲティング球の中に必要とされる。

【0157】

５nmの厚いホスファチジルコリン二重層から構成される直径１００nm（０．１μm）の単層リポソームは、

【数1】

又は約８０，０００個の分子を含む。二重層の厚さが同じ５nmの場合、１０００nm（１μm）のリポソームは、約８８０万個の分子を含む。

【0158】

従って、同位体を含む唯一の場所がシェルであると仮定すると、分子８．８ｘ１０^６個あたり約６００００個の同位体粒子、又は濃度０．６８％の放射性物質が必要とされる。

【0159】

しかしながら、同位体水を、１μmのシェルの体積の中にカプセル化してもよく、従って：

【数2】

を提供する。
分子１７．５×１０^９個あたり６０，０００個の同位体粒子は、水１００万あたり約３部の放射性同位体濃度に対応する。

【0160】

先行技術は、内部の水よりもむしろリポソームのシェルをラベルすることを開示している。しかしながら、脂質二重層は、水分子に対して透過性であり、イオン及び親水性小分子（グルコースなど）及びより大きな高分子（タンパク質及びＲＮＡなど）に対して不透過性である。従って、本実施例は、リポソームのシェルだけではなく、その中にカプセル化された水をラベリングすることも包含する。リポソームのシェルにカプセル化された水の中のより大きな放射性標識分子の使用はラベリングに必要であり、それらがリポソームのシェルの中で維持されることを確実にする。

【0161】

実施例７：ターゲティング剤／増幅剤／治療剤複合体のｉｎ ｖｉｖｏ治療用途
実施例３に記載されるように、ターゲティング成分及び増幅成分を調製する。

【0162】

治療成分の調製：市販のビオチン化マイクロバブルを、超音波適用に使用する（イメージング剤及び治療剤は、同じ薬剤でもよいことに留意すること）。市販のビオチン化放射性医薬品を、ＰＥＴ適用に使用する。Thermo-Fisherから入手したホモ二重機能的架橋剤から、アビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンを調製する。ビオチン化マイクロバブルをアビジン−ＰＥＧ_３０−アビジンと混合して、治療成分を得る。

【0163】

この使用方法では、ターゲティング成分／リポソーム調製物を血流に注入し、ターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。次いで、有効量の増幅成分を患者に注射し、第２のターゲティングが起こり、循環遊離リポソームが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。第２のターゲットの遊離バブル活性は、イメージングモダリティでモニタリングできる。次いで、有効量の治療成分を患者に注射し、ターゲット／増幅複合体への治療成分の結合が起こり、循環遊離マイクロバブルが血流から実質的にウォッシュアウトするように、患者を前記成分と共に十分な時間（例えば、限定されないが、約３〜１０分）インキュベーションする。治療成分の遊離バブル活性は、イメージングモダリティでモニタリングできる。次いで、ターゲティングした薬剤及び／又はターゲティングした治療活性の診断イメージングを実施する。

【0164】

実施例８：虚血を誘発するための、ターゲティング／増幅／治療複合体のｉｎ ｖｉｖｏ治療用途
実施例７に記載されるように、本実施例を行う。診断イメージングにより、ターゲット部位においてステージＩ薬剤／ステージＩＩ薬剤／ステージＩＩＩ薬剤の複合体が形成されたことを確認するとすぐに、さらなる量のステージＩＩ（増幅）薬剤及び／又はステージＩＩＩ（イメージング）薬剤を投与する。イメージングによって可視化しながら、複合体上に曝露したものに対する相補対（結合部位）を有する薬剤のさらなる量を、ターゲット部位において血管が実質的に閉塞されるまで連続的方法で投与する。ターゲット部位における管腔の閉塞は、ターゲット部位において血管新生組織の壊死をもたらす。適切なイメージングモダリティを使用して、壊死の過程をモニタリングし、必要な時点において、閉塞を超音波によって除去し得る。

【0165】

実施例９：組織におけるバブルの加熱効果に関する計算
バブルの動態エネルギー：Kirk T. McDonald, "Single-Bubble Sonoluminescence", Joseph Henry Laboratories, Princeton University, Princeton, NJ 08544 (February 2, 1995) (www.physics.princeton.edu/~mcdonald/examples/ sonobubble.pdfにおいて公開)に基づいて、バブル崩壊で利用可能な最大動態エネルギーをコンピューターで計算した。バブルが名目上は直径３μmから始まって、１０μm（容量にフィットする最大）まで膨張し、破裂せずに崩壊して１μmになると仮定すると、１０μmから１μmへのサイズ変化で利用可能なエネルギー量は、

【数3】

によって与えられる。

【0166】

インソネーション１サイクルあたりのバブルで利用可能なエネルギー：体積１μL中、１０個のターゲティングされたバブルのサイズ変化（増加段階及び減少段階の両方）からの動態エネルギーが１００％熱に変換され得ると仮定すると、１サイクルあたりの熱に変換されるエネルギー量は、体積１μL中、
Ｅ_バブル＝２・５．２ｘ１０^−１１ｘ１０＝１０^−９Ｊ／サイクル
によって与えられる。

【0167】

より多数のターゲティングされたバブルを用いて、より大量のエネルギーを放散し得る。すべての動態エネルギーが熱に変換されない場合、利用可能なエネルギーはより少量である。このエネルギーの画分のみが、バブル減衰係数に応じて、熱に変換されるであろう。

【0168】

バブルの熱放散：de Jong et al. (2009)によれば、小さい励起レベルに関して、液体環境における気泡壁の移動は、運動方程式：

【数4】

（式中、ｍはバブル−液体系の質量であり、βは放散に関する機械抵抗であり、Ｓは系の剛性であり、Ｆ_駆動（ｔ）は駆動力であり、ｘ（ｔ）は初期半径Ｒ_０に対する気泡壁の半径方向移動である）によって特徴付けられる。質量方程式、機械抵抗及び剛性は以下の通りである：
ｍ＝４πＲ_０ρ（式中、ｐは周囲媒質の密度である）
β＝δ_全ωｍ（式中、δ_全は全減衰であり、ωは角周波数である）
Ｓ＝１２πκＰ_０Ｒ_０（式中、κは熱容量比Ｃ_Ｐ／Ｃ_Ｖであり、Ｐ_０は周囲圧力である）
共振周波数及びＬ（ｓ^２＋２αｓ＋ω_０^２）（これは、

【数5】

と書き直される）によって特徴付けられる二次系のＱ係数の方程式は、

【数6】

である。βに先の方程式を代入して、

【数7】

を求める。

【0169】

de Jong et al.は、直径１〜１０μmの水中のガスバブルに関して、約０．１の減衰係数δ_全を示唆しているので、Ｑは２０となり、約５％（１／Ｑ）の変換係数が導かれる。

【0170】

実際には、血液の粘性減衰は、水よりも約３倍高いので、de Jong et al. (2002)は、直径４μm〜１０μmのバブルに関して、０．１５の水中減衰係数から出発して、０．５前後の全減衰係数を示唆しており、Ｑは４となるので、超音波から熱へのより高い変換（約２５％）が見られるであろう。

【0171】

２５％の変換係数を以下の計算に使用した。

【0172】

組織加熱：組織における高周波数音波のすべての減衰は吸収に起因し、このエネルギーはすべて熱に変換されると仮定する。減衰を０．４dB/cm-MHz、及び組織熱容量をρ＝３．５J/g℃と仮定して、インソネーション周波数の関数としての出力放散（７２０mW/cm²の最大許容出力を使用すると仮定する）を図４にプロットする。また、組織密度は水と等しい（これは、約５％以内の精度のはずである）と仮定する。

【0173】

ターゲティングされた熱治療の目的は、バブルからの加熱が組織からの加熱よりも大きいインソネーション周波数の範囲並びにバブルの形状及び組成を見出すことである。熱に変換されるバブルサイズ変化動態エネルギーからの加熱は、所定体積のバブル数の他に、どの程度の動態エネルギーがバブルシェルの粘性摩擦から熱に変換されるかということにも依存するであろう。

【0174】

バブルの破壊を回避するために、出力を最大から２１dB低減してコントラストパルスシーケンス（ＣＰＳ）イメージングを実施しながら、Siemens Acuson Sequoia ultrasound systemにおいて、特定のイメージング条件：深度１６０mm、広角２０mmで、４Ｃ１腹部プローブからの測定を行った。出力の空間ピーク時間平均（ＳＰＴＡ）及びメカニカルインデックス（ＭＩ）を表１に示す。

【0175】

【表1】

【0176】

すべての場合において、このシステムは、２６７μ秒ごとに約２サイクルを送信し、１２４Hzのフレームレートで３個の共線的なファイアリング及び１０個のトランジットラインに広がる。

【0177】

Ｐ２．０又は２．０MHzの送信の場合、２６７μ秒ごとに２サイクルを１２４Hzで３回繰り返すと、視野内の各ラインに関して、１秒あたり７４４サイクルになる。７２０mW/cm²のＦＤＡ熱限界により、負荷サイクルを２５０倍増加（２．８８mW/cm²から７２０mW/cm²）させることが可能になり、１秒あたりのバブルサイクル数を１８６，０００に増加させる。１μL中、１０個のバブルの最大動態エネルギーが１０^−９Ｊ／秒である場合、動態エネルギーが１００％熱に変換されると仮定すると、表２に示されるように、放散される全出力は１８６μWである。

【0178】

【表2】

【0179】

インソネーションによる組織加熱に関して、及びターゲティングされたバブルで音波を熱に変換することによる加熱に関して、組織温度を１℃上昇させるための時間を図５にプロットする。組織の熱容量は、ρ＝３．５J/g℃であると仮定する。

【0180】

ターゲティングされたバブルの治療有効性は、バブルによって所定体積の組織を１℃上昇させるための時間が、組織によるものよりも大きい場合に生じる。実際の治療効果は、数度の温度上昇で達成され、おそらくは数分で所望の温度に達するであろう。

【0181】

図４及び図５に示される実施例では、バブル数を１マイクロリットルあたり１０個のバブルから１マイクロリットルあたり１００個のバブルに増加させることにより、バブルの加熱寄与量は、組織の加熱寄与量よりもかなり大きな量に増加するであろう。バブルサイズインソネーション周波数及び強度に応じて、組織加熱主体からバブル加熱主体へのクロスオーバーを達成して、治療的有用性のレジームになるためには様々な数のバブルが必要とされる。

【0182】

これらの曲線は、十分なバブル集合体及び音波から熱への高レベルの変換が達成される場合に、ターゲティング剤の領域を正常組織よりも迅速に加熱することが可能であることを実証している。同様の最大バブルサイズにより、バブルによって放散される出力は減少するであろう。この出力は、第３の出力の半径に比例する。６kPa付近の圧力において、水は体温で沸騰するので、バブルが膨張し得る大きさの程度には限界がある。

【0183】

安全性を考慮して定められる熱及びＭＩの限界の範囲内を維持しつつ、超音波インソネーションビームを高度にさらにデフォーカスして、バブルへの出力伝達を体積を超えて最大にすることが可能であろう。

【0184】

球のパッキング並びにバブルの増幅及び集合
増幅段階は、ターゲティングリポソームによって提供されるターゲティング表面積の増加に比例する係数によって、組織の特定領域にターゲティングされるバブル数を増加させ得る。１個のターゲティングリポソームが毛細血管の表面リガンドに付着する以下の事例を検討する。すべてが同じ直径であり、半平面（すなわち、毛細血管壁）に結合した球で理想的にパッキングされているターゲティングリポソーム及びバブルのために、図６Ａに示されるように、最大９個のバブルを１個のターゲティングリポソームに付着させることができる。

【0185】

２段階増幅の場合、同じ直径の球で球の半面を完璧にパッキングすることにより、１個のターゲティングリポソームに対して最大３８倍の増幅が可能である。１個のターゲティングリポソーム（黒色で示されるステージＩ薬剤）は、９個の接着ステージＩＩ（増幅）リポソーム（灰色で示される）を有する。ステージＩＩＩでは、図６Ｂの３つの列レベルに示されるように、２８個のリポソームが、最終的な接着クラスターを形成する。ステージＩＩで結合した球９個、及びステージＩＩＩでさらに結合した球２８個から、（１個のステージＩリポソームと共に）３８倍の増幅が得られる。

【0186】

実際には、バブルはすべて一定の直径ではないため、バブルの間にギャップがあり、パッキング効率が下がるので、増幅の実際のレベルはより低くなり得る。

【0187】

高度にクラスター化されているバブルは、インソネーション圧力変化に対する直径の変化が、１個の遊離バブルよりも小さくなり、増加したバブル集合体からの熱変換の改善をいくらか制限する可能性がある。

【0188】

音響エネルギーをターゲットされたバブルに効率的に伝達して、有意義な治療効果を達成するために、組織領域内に付着するターゲットされたバブル数を増加させる必要があるだろう。バブル付着の増加は、前記増幅スキームで達成可能である。

【0189】

増幅を音響放射力などの他のバブル付着改善手段と組み合わせて、ターゲットされたバブル集合体をさらに増加させることができる。音響放射力は、最初のターゲティングリポソーム、又はリポソーム増幅段階（最後のガス充填イメージング段階又は治療リポソーム段階を含む）のいずれか若しくはすべてに適用できる。

【0190】

熱処理後に、高音圧パルス（すなわち、ＭＩ＞０．７）を適用して、ガスが充填されたバブルシェル集合体を破壊し、バブルを分散させることができる。これは、治療後における毛細血管のより長期間の閉塞を防ぐのに役立つ。

【0191】

治療エネルギーの送達前に、より大きな血管又は心室に対して音響エネルギーを高強度かつ短時間に爆発させることによって、循環遊離バブルを破壊して、その次の熱エネルギー送達段階が循環遊離バブルよりもむしろ処置ターゲット（ターゲットされたバブル集合体）により上手く限局されることを確実にすることができる。

【0192】

実施例１０：BIACORE（商標）X100光バイオセンサーを利用する多段階増幅の確認
本実施例は、多段階増幅ｉｎ ｓｉｔｕを実際に行う。実施例１０の多段階増幅のプロトコールは、４つの工程を含んでいた。最初に、フルオレセイン標識ＢＳＡ（Ｆ−ＢＳＡ）をBIACORE（商標）フローセルの金表面に付着させることによって、ターゲット／結合表面を調製した。ステージ１では、２Ｈ１ニュートラアビジンをＦ−ＢＳＡに結合させた。次いで、BIACORE（商標）表面上の２Ｈ１ニュートラアビジンの表面をビオチン化マイクロバブルで飽和した。ステージ２では、ニュートラアビジンをステージ１のビオチンマイクロバブルに結合させた。この後に、より多くのビオチンマイクロバブルを添加して、ステージ１のビオチンマイクロバブル複合体に結合させた。ステージ３では、ニュートラアビジンをステージ２のマイクロバブルに結合させた。次いで、ビオチンマイクロバブルをステージ２のニュートラアビジンマイクロバブル複合体に再び結合させた。

【0193】

図７ａは、ステージ１の結合に関するBIACORE（商標）用量反応曲線を図示する。本実験では、BIACORE（商標）表面を結合剤（すなわち、ニュートラアビジン）で飽和し、マイクロバブルを限定試薬とした。マイクロバブルを添加したので、シグナルは直線的に増加した。この観察結果は、シグナルの変化が、BIACORE（商標）表面上のマイクロバブルの結合に直接的に関係していたことを証明している。

【0194】

図７ｂの表は、BIACORE（商標）光バイオセンサーを使用したステージ２の増幅の結果を示す。用量反応曲線の実験とは異なり、過剰のマイクロバブル及び限定的なBIACORE（商標）表面上の結合部位を用いて、結合実験を行った。金表面をステージ１の結合で飽和したところ、１２．５反応単位（RU）のシグナル変位が観察された（図７ｂ）。次いで、ニュートラアビジンの添加よって、ビオチンマイクロバブルをニュートラアビジンマイクロバブルに変換した。ビオチン化マイクロバブルを添加することによって、ステージ２の増幅を得た。飽和が観察される（RUの増加が見られなくなる）まで、マイクロバブルを添加した。ステージ２の結合に関して、４６．３RUのシグナル変位が観察された。ステージＩＩのシグナル変位とステージＩのシグナル変位との比は、３．７の増幅係数を示す。

【0195】

実施例１１：暗視野位相差顕微鏡によって観察した多段階複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアセンブリ
本実施例では、ポリスチレンペトリ皿でビオチン化ＢＳＡを一晩インキュベーションすることによって、ポリスチレン結合表面を調製した；次いで、ニュートラアビジンをビオチン化ＢＳＡに結合させて、ターゲット部位を形成させた。ステージ１の結合のために、ビオチン化マイクロバブルをポリスチレン表面上のニュートラアビジンに結合させた；これを図８に図示する。

【0196】

ステージ２の結合のために、ニュートラアビジンをステージ１のビオチンマイクロバブルに結合させ、次いで、ビオチンマイクロバブルをステージ１のニュートラアビジンマイクロバブル複合体に結合させた。ステージ２の結合を図９に図示する。

【0197】

ステージ３の結合のために、ニュートラアビジンをステージ２のビオチンマイクロバブルに結合させ、次いで、ビオチンマイクロバブルをステージ２のニュートラアビジンマイクロバブル複合体に結合させた。ステージ３の結合を図１０に図示する。

【0198】

実施例１２：ステージ２の増幅のｉｎ ｖｉｔｒｏ実演例
材料：Corning, Inc. (Lowell, MA)から、６０mmの非ＴＣ処理培養皿を入手した。Targesson, Inc. (San Diego, CA)から、Targestar Bビオチン化マイクロバブルを入手した。５０μg/mlのビオチン化ＢＧＧコーティング溶液を調製した。２５μlのＢ−ＢＧＧ溶液をペトリ皿の中央にスポットし、スポットを乾燥させた。１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液にニュートラアビジンを最終濃度３０μg/mlで溶解させて、ニュートラアビジン（コート）−ＢＳＡ（ブロック）溶液を調製した。プレートをニュートラアビジン−ＢＳＡ溶液と共に混合せずに一晩インキュベーションし、次いで、０．０７５％TWEEN（登録商標）２０を混合した４容積のＰＢＳで洗浄した。

【0199】

ステージ１の結合のために、５０μlのビオチン化マイクロバブルをペトリ皿の中央に添加し、プレートを裏返し、手作業で穏やかに１０分間混合した次いで、プレートを４容積のＰＢＳで洗浄し、２００ｘで写真撮影した（図１１、左のパネル）。

【0200】

ステージ２の結合のために、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解させた０．２mMのビオチンを皿に添加し、プレートを穏やかに１時間混合して、過剰なニュートラアビジン部位をブロッキングした。４ｘ３mlのＰＢＳで洗浄した後、次いで、プレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解させた０．１５mMのニュートラアビジンと共に３０分間インキュベーションし、その後、４ｘ３mlのＰＢＳで洗浄した。添加したニュートラアビジンにより、ビオチン化マイクロバブルは、ニュートラアビジンマイクロバブルに変換された。５０μlのマイクロバブルをペトリ皿の中央に添加し、次いで裏返し、平面上で手作業で１０分間混合した。次いで、プレートを４容積のＰＢＳで洗浄した。次いで、１mlのＰＢＳを添加し、プレートを２００ｘで写真撮影した（図１１、右のパネル）。

【0201】

図１１に示される結果は、元のターゲットマイクロバブルの増幅を明確に実証している。

【0202】

従って、本発明により、ターゲット検出及び／又は処置のための組成物、並びにその製造方法及び使用方法が提供され、これらは、本明細書において上記に記載される目的及び利点を満たしている。本明細書において上記に記載される特定の図、実験、結果及び言語と共に発明概念を記載したが、多くの代替物、修正物及び変形物が当業者に明らかであろうことは明白である。従って、本開示の及び特許請求の範囲に記載の発明概念の精神並びに広い範囲に含まれるこのような代替物、修正物及び変形物のすべてを包含することを意図する。

【0203】

参考文献
以下の参考文献は、本明細書において記載されるものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

【0204】

【表3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7a】

【図7b】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】