特許 5750646 ＳＣＣＡ２濃度測定によるアレルギー疾患の検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5750646

(24)【登録日】2015年5月29日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】ＳＣＣＡ２濃度測定によるアレルギー疾患の検査方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20150702BHJP

   G01N 33/53 20060101ALN20150702BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   !G01N33/53 Q

【請求項の数】4

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2009-298690(P2009-298690)

(22)【出願日】2009年12月7日

(65)【公開番号】特開2011-117923(P2011-117923A)

(43)【公開日】2011年6月16日

【審査請求日】2012年12月4日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用 学術団体が開催する研究集会名：第２１回日本アレルギー学会春季臨床大会、主催者名：社団法人日本アレルギー学会（大会長：岐阜大学大学院医学系研究科小児病態学 教授 近藤 直実）、開催日：平成２１年（２００９年）６月４日（木）〜６日（土）〔公開日：６月５日（金）〕

(73)【特許権者】

【識別番号】000131474

【氏名又は名称】株式会社シノテスト

(73)【特許権者】

【識別番号】504209655

【氏名又は名称】国立大学法人佐賀大学

(73)【特許権者】

【識別番号】504136993

【氏名又は名称】独立行政法人国立病院機構

(72)【発明者】

【氏名】太田 昭一郎

(72)【発明者】

【氏名】出原 賢治

(72)【発明者】

【氏名】柴田 瑠美子

(72)【発明者】

【氏名】東 義則

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０９８５２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００７／０４６４６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００６−５１６１１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 再公表特許第２００７／０４６４６３（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 再公表特許第２００６／０９８５２３（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 再公表特許第０３／０１４３９５（ＪＰ，Ａ１）

【文献】 太田昭一郎、他４名，オーダーメイド医療を目指したアレルギー疾患診断の確立−ＳＣＣＡの新規ＥＬＩＳＡシステムの確立−，臨床病理，日本，２００８年１１月２５日，Vol.56,No.11，Page.980-985

【文献】 出原賢治、他２名，学術推進プロジェクト２ オーダーメイド医療を目指したアレルギー疾患における病因診断システムの確立，臨床病理，日本，２００８年１０月３１日，Vol.56,補冊，Page.78

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料（ヒト又は動物の血液、血清又は血漿）中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合にはアレルギー疾患であるとすることを特徴とする、アレルギー疾患の検査方法。

【請求項2】

対照となるＳＣＣＡ２濃度が、アレルギー疾患の非罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、請求項１記載のアレルギー疾患の検査方法。

【請求項3】

対照となるＳＣＣＡ２濃度が、癌の罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、請求項１記載のアレルギー疾患の検査方法。

【請求項4】

対照となるＳＣＣＡ２濃度が、アレルギー疾患の非罹患者及び癌の罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、請求項１記載のアレルギー疾患の検査方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アレルギー疾患の検査方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野等において有用なものである。

【背景技術】

【0002】

アレルギー疾患は、外来由来の環境アレルゲンに対し、過剰に免疫応答を起こした結果、炎症を生じる疾患である。
このアレルギー疾患としては、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、又はアレルギー性結膜炎等が知られている。

【0003】

現在、アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。
また、アレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。
前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、又はリンパ球幼若化試験等が挙げられる。
アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。

【0004】

しかし、患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。
また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。

【0005】

白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎ ｖｉｔｒｏで観察する方法である。
これらの方法は、操作が煩雑である。

【0006】

一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。
プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、又は誘発試験等が、この種の試験に含まれる。
これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であるということができる。

【0007】

この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。
たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。
血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。
アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
したがって、患者に対する危険が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー疾患のマーカーが提供されれば有用である。

【0008】

ところで、ＳＣＣＡ（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ；扁平上皮細胞癌抗原）は、分子量４５，０００のタンパク質であり、Ｓｅｒｐｉｎファミリーに属するプロテアーゼインヒビターである。
このＳＣＣＡは、子宮頸部扁平上皮癌、子宮体癌、食道癌、肺扁平上皮癌、及びその他の扁平上皮癌において、血中濃度が上昇し、腫瘍マーカーとして知られている。
そして、このＳＣＣＡに特異的に結合する抗体、及びこの抗体を用いるＳＣＣＡの免疫学的測定方法が知られている（特許文献１参照。特許文献２参照。）。

【0009】

なお、ＳＣＣＡには、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２の２つのアイソフォームが存在し、ＳＣＣＡ１とＳＣＣＡ２との相同性はアミノ酸レベルで９１％である。
そして、本発明者らにより、また、他の研究者らにより、このＳＣＣＡ１に特異的に結合する抗体、ＳＣＣＡ２に特異的に結合する抗体、ＳＣＣＡ１の免疫学的測定方法、及びＳＣＣＡ２の免疫学的測定方法が発明された（特許文献３参照。非特許文献１参照。非特許文献２参照。）。

【0010】

なお、本発明者の一人である出原は、他の研究者と共に、従来腫瘍マーカーとして知られていたＳＣＣＡの遺伝子が、気管支喘息発作の指標遺伝子となることを見出し、ＳＣＣＡ１および／またはＳＣＣＡ２の蛋白質のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息発作の検査用試薬等を発明した。（特許文献４参照。）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】特開昭６１−１６００６０号公報

【特許文献2】特開昭６２−８４１００号公報

【特許文献3】特表２００６−５１６１１４号公報

【特許文献4】国際公開公報ＷＯ２００３／０１４３９５

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ ａｃｔａ．２０００，Ｖｏｌ．２９５，Ｎｏ．１−２，ｐ．１０７−１２７

【非特許文献2】臨床病理，２００８，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．１１，ｐ．９８０−９８５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

上述の通り、本発明者の一人である出原は、他の研究者と共に、腫瘍マーカーとして知られていたＳＣＣＡの遺伝子が、気管支喘息発作の指標遺伝子となることを見出し、ＳＣＣＡ１および／またはＳＣＣＡ２の蛋白質のアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体からなる、気管支喘息発作の検査用試薬等を発明したが、生体試料中のＳＣＣＡの濃度は、気管支喘息発作において高くなるだけではなく、癌の罹患においても高くなるため、生体試料中のＳＣＣＡ濃度が高い場合に、それが気管支喘息発作によるものか、又は癌の罹患によるものか、区別することができなかった。
つまり、生体試料中のＳＣＣＡ濃度を測定しても、アレルギー疾患の罹患と、癌の罹患とを、区別することができない、という問題点（課題）があった。

【0014】

本発明は、アレルギー疾患の罹患と非罹患とを明確に区別することができ、かつアレルギー疾患の罹患と癌の罹患とを明確に区別することができる、アレルギー疾患の検査方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者らは、アレルギー疾患と生体試料中のＳＣＣＡ濃度との関係について検討を重ねたところ、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0016】

すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。

【0017】

（１） 生体試料（ヒト又は動物の血液、血清又は血漿）中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合にはアレルギー疾患であるとすることを特徴とする、アレルギー疾患の検査方法。
（２） 生体試料（ヒト又は動物の血液、血清又は血漿）中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合にはアレルギー疾患であるとし、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度と同じ又はより低い場合にはアレルギー疾患ではないとすることにより、アレルギー疾患の罹患と非罹患とを区別する、前記（１）記載のアレルギー疾患の検査方法。
（３） 生体試料（ヒト又は動物の血液、血清又は血漿）中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合にはアレルギー疾患であるとし、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度と同じ又はより低い場合にはアレルギー疾患ではないとすることにより、アレルギー疾患の罹患と扁平上皮癌の罹患とを区別する、前記（１）記載のアレルギー疾患の検査方法。
（４） 対照となるＳＣＣＡ２濃度が、アレルギー疾患の非罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のアレルギー疾患の検査方法。
（５） 対照となるＳＣＣＡ２濃度が、癌の罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のアレルギー疾患の検査方法。
（６） 対照となるＳＣＣＡ２濃度が、アレルギー疾患の非罹患者及び癌の罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、前記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のアレルギー疾患の検査方法。
（７） 生体試料（ヒト又は動物の血液、血清又は血漿）中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合には対照としたＳＣＣＡ２の重症度よりも重症であるとし、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度と同程度である場合には対照としたＳＣＣＡ２の重症度と同じ重症度であるとし、当該測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、当該対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも低い場合には対照としたＳＣＣＡ２の重症度よりも軽症であるとすることにより、アレルギー疾患の重症度を区別することを特徴とする、アレルギー疾患の検査方法。
（８） 対照となるＳＣＣＡ２濃度が、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度である、前記（７）記載のアレルギー疾患の検査方法。

【発明の効果】

【0018】

本発明のアレルギー疾患の検査方法は、アレルギー疾患の罹患を、アレルギー疾患の非罹患と明確に区別することができ、かつ癌の罹患とも明確に区別することができ、アレルギー疾患のみを特異的に検査することができる方法である。
また、本発明のアレルギー疾患の検査方法は、アレルギー疾患の重症度を区別することができる方法である。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】抗ＳＣＣＡ１抗体、抗ＳＣＣＡ２抗体、並びにＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体の、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した免疫沈降法及びウェスタンブロット法の結果を示した図である。

【図2】抗ＳＣＣＡ１抗体のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した酵素免疫測定法による結果を示した図である。

【図3】抗ＳＣＣＡ２抗体のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した酵素免疫測定法による結果を示した図である。

【図4】アレルギー疾患罹患（Ａ）及びアレルギー疾患非罹患（Ｂ）それぞれの生体試料中のＳＣＣＡ１濃度とＳＣＣＡ２濃度との関係を示した図である。

【図5】アレルギー疾患罹患、アレルギー疾患非罹患、及び癌罹患それぞれの生体試料中のＳＣＣＡ１濃度（Ａ）及びＳＣＣＡ２濃度（Ｂ）を示した図である。

【図6】アレルギー疾患の重症度と生体試料中のＳＣＣＡ１濃度（Ａ）及びＳＣＣＡ２濃度（Ｂ）との関係を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

〔１〕アレルギー疾患
本発明は、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することを特徴とする、アレルギー疾患の検査方法であるが、このアレルギー疾患としては特に限定はなく、アレルギー疾患であれば対象となる。

【0021】

このアレルギー疾患として、例えば、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、又はアレルギー性結膜炎等を挙げることができる。

【0022】

〔２〕ＳＣＣＡ２
本発明は、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することを特徴とする、アレルギー疾患の検査方法であるが、この濃度の測定を行うＳＣＣＡ２は、ＳＣＣＡ（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ；扁平上皮細胞癌抗原）のアイソフォームの一つであるＳＣＣＡ２又はこのＳＣＣＡ２の抗原性を有する断片、変異体若しくは修飾物のことをいう。

【0023】

本発明において、ＳＣＣＡ２は、ヒトのみならず、他種におけるホモログを含む。

【0024】

〔３〕生体試料中のＳＣＣＡ２濃度の測定
１．ＳＣＣＡ２濃度の測定
本発明における生体試料中のＳＣＣＡ２濃度の測定について、以下説明を行う。
本発明における生体試料中のＳＣＣＡ２濃度の測定は、特に限定はなく、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度を正確に測定することができるのであれば、どのような方法でも良い。
生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定は、抗原としてのＳＣＣＡ２とこれに対する抗体、プロテアーゼインヒビターとしてのＳＣＣＡ２とこれに対するプロテアーゼ等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用した方法により測定することが好ましい。
特に、抗原としてのＳＣＣＡ２とこれに対する抗体の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により測定することが好ましい。

【0025】

２．免疫学的測定法による測定
生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、抗原としてのＳＣＣＡ２とこれに対する抗体の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により測定する場合を例として、以下説明を行う。

【0026】

（１）抗体
本発明において、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、抗原としてのＳＣＣＡ２とこれに対する抗体の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法により測定する場合に用いる抗体は、ＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる抗体であれば、いかなるものでもよい。（このＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる抗体を、以下、「抗ＳＣＣＡ２抗体」という。）

【0027】

本発明において、抗ＳＣＣＡ２抗体それぞれの由来については特に限定はなく、それぞれ抗体の由来として、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等を挙げることができる。

【0028】

なお、本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体はそれぞれ、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、モノクローナル抗体、又はこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂又はＦａｂ’など）等のいずれのものであってもよい。

【0029】

（２）免疫原
本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体それぞれを取得するために使用する免疫原について、以下説明を行う。

【0030】

本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体を取得するための免疫原としては、ＳＣＣＡ２、又はＳＣＣＡ２にアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるＳＣＣＡ２の断片、変異体、類縁体若しくは修飾体、あるいはこれらのものと担体との結合物を挙げることができる。

【0031】

（３）免疫原の取得方法
本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体を取得するために使用する免疫原の取得方法について、以下説明を行う。

【0032】

前記の免疫原として、ＳＣＣＡ２、又はＳＣＣＡ２にアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるＳＣＣＡ２の断片、変異体、類縁体若しくは修飾体、あるいはこれらのものと担体との結合物を挙げることができるが、これはヒト又は動物の体液、細胞、組織又は臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。

【0033】

また、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよい。

【0034】

例えば、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年；泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができる。

【0035】

更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年；日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。

【0036】

例えば、ＳＣＣＡ２又はこのアミノ酸配列に対応する遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。
次に、この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質変換体を培養することにより前記のＳＣＣＡ２に対応するタンパク質又はペプチドを発現させることができる。
なお、遺伝子の塩基配列をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。

【0037】

なお、免疫原として、前記の担体との結合物を用いる場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。

【0038】

前記のＳＣＣＡ２等と担体との結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に前記のＳＣＣＡ２等を吸着させたものも免疫原とすることができる。

【0039】

（４）抗ＳＣＣＡ２抗体（ポリクローナル抗体）の取得方法
（ａ）ポリクローナル抗体の血清からの取得
本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により、免疫原を免疫した動物の血清から取得することができる。

【0040】

まず、前記の免疫原（ＳＣＣＡ２等）を、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等の動物に免疫する。

【0041】

なお、この前記の免疫原は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。

【0042】

免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この場合も、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。

【0043】

初回免疫の後、免疫した動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗ＳＣＣＡ２抗体を含む抗血清を得る。

【0044】

この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の方法、又はこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体（抗ＳＣＣＡ２抗体）を得る。

【0045】

（ｂ）ポリクローナル抗体の卵からの取得
本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体において、ポリクローナル抗体は、以下の操作により、免疫原を免疫した鳥類の卵から取得することができる。

【0046】

まず、前記の免疫原（ＳＣＣＡ２等）をニワトリ等の鳥類のメスに免疫する。

【0047】

なお、この前記の免疫原は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。

【0048】

免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この場合も、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。

【0049】

初回免疫の後、免疫した鳥類が産卵した卵中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、この時以降に産卵する卵より卵黄を得る。

【0050】

この卵黄を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の方法、又はこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。

【0051】

（ｃ）担体に対する抗体の吸収除去操作
免疫原として前記のＳＣＣＡ２等と担体との結合物を用いて動物に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体（即ち、当該担体に結合する抗体）が存在するので、このような担体に対する抗体の吸収除去処理を行うことが好ましい。

【0052】

以上、前記（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）に記載したようにして、本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体のポリクローナル抗体を単離して得ることができる。

【0053】

（５）抗ＳＣＣＡ２抗体（モノクローナル抗体）の取得方法
本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。

【0054】

モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。

【0055】

前記のケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）を例として、モノクローナル抗体を調製する方法を、以下記載する。
まず、前記の免疫原（ＳＣＣＡ２等）を、哺乳動物（マウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、若しくはウマなど）、又は鳥類（ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ、若しくはアヒルなど）等の動物に免疫する。

【0056】

なお、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。

【0057】

免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。

【0058】

初回免疫の後、免疫した動物の血清中又は免疫した動物が産卵した卵中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。

【0059】

この最終免疫の３〜５日後に、免疫した動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。

【0060】

この免疫した動物より得られた抗体産生能を有する細胞（脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等）と、哺乳動物又は鳥類等の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）又はＢ細胞とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましい。

【0061】

細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソーム若しくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法等により行うことができる。

【0062】

ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。

【0063】

このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、又はＳＣＣＡ２等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、抗ＳＣＣＡ２抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。

【0064】

また、前記のハイブリドーマの培養上清を、ＳＣＣＡ１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ＳＣＣＡ１等には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。

【0065】

この２種類のハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体のモノクローナル抗体を単離して得ることができる。

【0066】

このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明の抗ＳＣＣＡ２抗体のモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。

【0067】

このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本発明における抗ＳＣＣＡ２抗体のモノクローナル抗体を得ることができる。

【0068】

（６）免疫学的測定法によるＳＣＣＡ２濃度の測定
生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度を、免疫学的測定法により測定するには、ＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を使用することにより、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度を正確に測定することができる。

【0069】

なお、ＳＣＣＡ２に結合することができる抗体として２つ又はそれ以上の抗体を使用する免疫学的測定法においては、その２つ又はそれ以上の抗体のうち少なくとも１つが、ＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、これにより正確に測定することができる。
そして、他の抗体は、ＳＣＣＡ２に結合することができる抗体であれば如何なるものでもよい。
すなわち、この他の抗体は、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方に結合することができる抗体であってよい。

【0070】

なお、２つ又はそれ以上の抗体が、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよく、また、用いる全ての抗体が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0071】

例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法又は発光免疫測定法等のサンドイッチ法においては、酵素等により標識された抗体及び固相化抗体のいずれか一方又は両方が、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、また、両方の抗体とも前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0072】

この抗ＳＣＣＡ２抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。

【0073】

なお、本発明において、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度を、免疫学的測定法により測定するのに、特にその測定原理は限定されるものではない。

【0074】

この免疫学的測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、又は粒子凝集反応法等を挙げることができる。

【0075】

そして、前記の免疫学的測定法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、本発明における生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定に適用することができる。

【0076】

また、この免疫学的測定法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。

【0077】

（７）試料
本発明における生体試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液；大便；血管若しくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、ＳＣＣＡ２が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。

【0078】

（８）標識抗体を用いた免疫学的測定法
本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、標識物質を抗体（又は抗原）に結合した標識抗体（又は標識抗原）、及び抗体（又は抗原）を固相担体に固相化した固相化抗体（又は固相化抗原）を用いる、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施することが好ましい。

【0079】

本発明における生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、前記のサンドイッチ法により実施する時には、標識抗体及び固相化抗体のいずれか一方の抗体が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、また、標識抗体及び固相化抗体の両方が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0080】

前記の免疫学的測定法に用いる固相化抗体（又は固相化抗原）に使用する固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を使用することができる。

【0081】

固相化抗体（又は固相化抗原）は、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。

【0082】

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体（又は抗原）と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体（又は抗原）と固相担体を接触させること等により行うことができる。

【0083】

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（又は抗原）と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（又は抗原）と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基などと反応させること等により行うことができる。

【0084】

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体（又は抗原）を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

【0085】

標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、例えば、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。

【0086】

また、蛍光免疫測定法の場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。

【0087】

そして、放射免疫測定法の場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。

【0088】

また、発光免疫測定法においては、例えば、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ₂−ルシフェラーゼ反応系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ反応系、アクリジニウムエステル反応系、又はジオキセタン化合物反応系などの反応系に係わる物質等を用いることができる。

【0089】

なお、本発明においては、前記の標識物質を抗体又は抗原に結合させるだけではなく、標識物質と抗体又は抗原の間に「アビジン−ビオチン」又は「ストレプトアビジン−ビオチン」等を介在させてもよい。
なお、具体的には、例えば、「ビオチンを標識した抗体（又は抗原）」と共に、次のいずれかのものを用いる等すればよい。
・ 「アビジン（又はストレプトアビジン）」、及び「ビオチンを結合させた標識物質」
・ 「アビジン（又はストレプトアビジン）を結合させた標識物質」
・ 「アビジン（又はストレプトアビジン）と、ビオチンを結合させた標識物質との複合体」

【0090】

前記の抗ＳＣＣＡ２抗体等の抗体（又はＳＣＣＡ２等の抗原）と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（又は抗原）と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（又は抗原）と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。

【0091】

前記の酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定法における測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。

【0092】

例えば、固相化抗体（「固相担体−抗体」）と試料を反応させ、同時に標識抗体（「抗体−標識物質」）を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体−抗体」＝「ＳＣＣＡ２」＝「抗体−標識物質」の複合体を形成させる。

【0093】

そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相担体−抗体」＝「ＳＣＣＡ２」＝「抗体−標識物質」の結合により固相担体に間接的に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量を測ることにより生体試料中に含まれていたＳＣＣＡ２の量（濃度）を測定することができる。

【0094】

具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下等で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を測定する。
そして、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
更に、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。

【0095】

（９）凝集反応法による免疫学的測定法
本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測ることにより、生体試料中に含まれていたＳＣＣＡ２の量（濃度）を測定する、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法によっても実施することができる。

【0096】

前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を固相担体に固相化させて用いる場合には、固相担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。

【0097】

前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を固相担体に固相化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。

【0098】

物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。

【0099】

また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。

【0100】

また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。

【0101】

なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体及び測定対象物質であるＳＣＣＡ２を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。

【0102】

また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中に含まれる測定対象物質であるＳＣＣＡ２の濃度、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、生体試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。

【0103】

しかし、通常は、生体試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された前記の抗ＳＣＣＡ２抗体と試料中に含まれていた測定対象物質であるＳＣＣＡ２との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ＳＣＣＡ２抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。

【0104】

本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法により実施する場合には、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

【0105】

前記の免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法における測定の操作法は、公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と前記の抗ＳＣＣＡ２抗体、又は試料と固相担体に固相化させた前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。

【0106】

また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に固相化させた前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。

【0107】

なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。

【0108】

また、本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の測定を、前記の免疫複合体凝集物の生成を測定する方法により実施する場合、ＳＣＣＡ２に結合することができる抗体として２つ又はそれ以上の抗体を使用するときには、その２つ又はそれ以上の抗体のうち少なくとも１つが、ＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、これにより正確に測定することができる。
そして、他の抗体は、ＳＣＣＡ２に結合することができる抗体であれば如何なるものでもよい。
すなわち、この他の抗体は、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２の両方に結合することができる抗体であってよい。

【0109】

なお、２つ又はそれ以上の抗体が、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよく、また、用いる全ての抗体が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0110】

（１０）ＳＣＣＡ２濃度の免疫学的測定試薬
（ａ）免疫学的測定試薬
本発明における生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の免疫学的測定試薬は、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度を、このＳＣＣＡ２に特異的に結合する前記の抗ＳＣＣＡ２抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行うものであり、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を含むものである。

【0111】

なお、前記のＳＣＣＡ２に結合する抗体として２種類以上の抗体を含む免疫学的測定試薬においては、その２つ又はそれ以上の抗体のうち少なくとも１つが、この抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、これにより正確に測定することができる。
そして、他の抗体は「ＳＣＣＡ２に結合することができる抗体」であれば如何なるものでもよい。

【0112】

なお、この２種類以上の抗体のうち、２つ又はそれ以上の抗体が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよく、また、用いる全ての抗体がこの抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0113】

本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の免疫学的測定試薬においては、その測定原理として、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫学的測定方法（サンドイッチ法又は競合法等）のもの、又は免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法若しくは粒子凝集反応法などの免疫複合体凝集物の生成を測定する免疫学的測定方法のもの等、特に制限なく適用することができる。

【0114】

例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法又は発光免疫測定法等におけるサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、標識物質を抗体に結合した標識抗体、及び抗体を固相担体に固相化した固相化抗体のいずれか一方又は両方が、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、両方の抗体ともこの前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であってもよい。

【0115】

また、例えば、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、ラテックス粒子等の固相担体に固相化させる抗体が前記の抗ＳＣＣＡ２抗体であればよく、また、免疫比濁法を測定原理とする測定試薬においては、抗体として前記の抗ＳＣＣＡ２抗体を用いればよい。

【0116】

（ｂ）その他の試薬成分
本発明における、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度の免疫学的測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。

【0117】

この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。

【0118】

また、前記の免疫学的測定試薬には、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体などの抗体を固相担体に固相化した「固相化抗体」、及び／又は前記の抗ＳＣＣＡ２抗体などの抗体と酵素などの標識物質を結合させた「標識抗体」等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。

【0119】

そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

【0120】

〔４〕生体試料中のＳＣＣＡ２濃度
１．測定したＳＣＣＡ２濃度
本発明は、前記〔３〕に記載した測定した生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度より、アレルギー疾患の検査を行う方法である。

【0121】

また、本発明においては、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することにより、アレルギー疾患の罹患と非罹患とを区別することができる。

【0122】

更に、本発明においては、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することにより、アレルギー疾患の罹患と、癌の罹患とを区別することができる。

【0123】

本発明においては、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定することにより、アレルギー疾患の重症度を区別することができる。

【0124】

本発明においては、測定したＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と、比較することが好ましい。

【0125】

この場合、アレルギー疾患の非罹患者（アレルギー疾患非罹患者）のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることが好ましい。
この場合、単一のアレルギー疾患非罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度としてもよい。
しかし、一定数以上のアレルギー疾患非罹患者について、その生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、このＳＣＣＡ２濃度を複数求め、これにより得られた一定数以上のアレルギー疾患非罹患者のＳＣＣＡ２濃度の平均値等を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることが好ましい。
なお、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、アレルギー疾患非罹患者のＳＣＣＡ２濃度を求めるのは、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める際に、同時に行ってもよい。
また、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、アレルギー疾患非罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、予め求めておき、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める毎に、前記の対照となる濃度を使用してもよい。

【0126】

また、癌の罹患者（癌罹患者）のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることも好ましい。
この場合、単一の癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度としてもよい。
しかし、一定数以上の癌罹患者について、その生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、このＳＣＣＡ２濃度を複数求め、これにより得られた一定数以上の癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度の平均値等を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることが好ましい。
なお、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を求めるのは、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める際に、同時に行ってもよい。
また、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、予め求めておき、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める毎に、前記の対照となる濃度を使用してもよい。

【0127】

あるいは、アレルギー疾患の非罹患者（アレルギー疾患非罹患者）及び癌の罹患者（癌罹患者）のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることも好ましい。
この場合、単一のアレルギー疾患非罹患者及び単一の癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度としてもよい。
しかし、一定数以上のアレルギー疾患非罹患者及び一定数以上の癌罹患者について、その生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、このＳＣＣＡ２濃度を複数求め、これにより得られた一定数以上のアレルギー疾患非罹患者及び一定数以上の癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度の平均値等を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることが好ましい。
なお、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、アレルギー疾患非罹患者及び癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を求めるのは、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める際に、同時に行ってもよい。
また、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、アレルギー疾患非罹患者及び癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、予め求めておき、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める毎に、前記の対照となる濃度を使用してもよい。

【0128】

また、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることも好ましい。
この場合、単一の、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度としてもよい。
しかし、一定数以上の、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者について、その生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、このＳＣＣＡ２濃度を複数求め、これにより得られた一定数以上の、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度の平均値等を、対照となるＳＣＣＡ２濃度とすることが好ましい。
なお、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度を求めるのは、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める際に、同時に行ってもよい。
また、この対照となるＳＣＣＡ２濃度とする、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度を、予め求めておき、アレルギー疾患の検査のために、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度を測定し、これらの濃度を求める毎に、前記の対照となる濃度を使用してもよい。

【0129】

生体試料を測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較する場合、この対照となるＳＣＣＡ２濃度が、アレルギー疾患非罹患者のＳＣＣＡ２濃度、癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度、又はアレルギー疾患非罹患者及び癌罹患者のＳＣＣＡ２濃度である場合には、測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、前記の対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合には、アレルギー疾患であるとする。
また、測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、対照となるＳＣＣＡ２濃度と同じ又はより低い場合には、アレルギー疾患ではない（アレルギー疾患に非罹患）とする。
これにより、本発明においては、アレルギー疾患の罹患と非罹患とを明確に区別することができ、かつアレルギー疾患の罹患と癌の罹患とを明確に区別することができる。
従って、本発明により、アレルギー疾患を検査することができる。

【0130】

また、生体試料を測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較する場合、この対照となるＳＣＣＡ２濃度が、異なる重症度のアレルギー疾患罹患者のＳＣＣＡ２濃度である場合には、次の通りとする。
すなわち、測定して得たＳＣＣＡ２濃度を、前記の対照となるＳＣＣＡ２濃度と比較し、測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも高い場合には、対照としたＳＣＣＡ２濃度の重症度よりも重症であるとする。
また、測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、対照となるＳＣＣＡ２濃度と同程度である場合には、対照としたＳＣＣＡ２濃度の重症度と同じ重症度であるとする。
更に、測定して得たＳＣＣＡ２濃度が、対照となるＳＣＣＡ２濃度よりも低い場合には、対照としたＳＣＣＡ２濃度の重症度よりも軽症であるとする。
これにより、本発明においては、アレルギー疾患の重症度を区別することができる。
従って、本発明により、アレルギー疾患を検査することができる。

【実施例】

【0131】

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0132】

〔実施例１〕（抗体のＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ２との結合性の確認）
ＳＣＣＡ１に特異的に結合することができる抗ＳＣＣＡ１抗体、ＳＣＣＡ２に特異的に結合することができる抗ＳＣＣＡ２抗体、並びにＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体の、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を免疫沈降法及びウェスタンブロット法により確認した。
また、抗ＳＣＣＡ１抗体、及び抗ＳＣＣＡ２抗体の、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を酵素免疫測定法により確認した。

【0133】

〔１〕．免疫沈降法及びウェスタンブロット法
１．抗体
（１）抗ＳＣＣＡ１抗体
ＳＣＣＡ１のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ ＫＬら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，Ｖｏｌ．１９２，ｐ．２６２−２６７）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションした。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したＳＣＣＡ１を精製した。

【0134】

このＧＳＴ付加ＳＣＣＡ１を、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＣｙｔＲｘ社、米国）と混合して、Ｗｉｓｔａｒラットの足蹠皮下に投与した（５０μｇ／ラット）。
２週間〜２ヵ月後、同じ抗原を足蹠皮下に投与し、３日後に、鼠径、膝窩、及び腸骨リンパ節よりリンパ球を調製し、Ｓｐ２／Ｏミエローマ細胞とポリエチレングリコール法にて細胞融合した。
抗体産生ハイブリドーマクローンのスクリーニングは、固相化抗体としてＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を用い、抗原についてはＳＣＣＡ１抗原として２９３Ｔ／ＳＣＣＡ１細胞株の培養上清を用い（又はＳＣＣＡ２抗原として２９３Ｔ／ＳＣＣＡ２細胞株の培養上清を用い）、そして検出抗体としてこの抗体産生ハイブリドーマの培養上清を用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により行った。
ＳＣＩＤマウスの腹腔内にハイブリドーマを投与して、貯留した腹水を採取し、腹水よりプロテインＧセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を用いて抗体（クラス：ＩｇＧ）を精製した。
ＳＣＣＡ１に結合し、ＳＣＣＡ２には結合しないモノクローナル抗体を産生する細胞株（クローン）であったＳＳ１１Ｇ細胞株を、ＳＣＣＡ１に特異的に結合する抗体である抗ＳＣＣＡ１抗体の産生細胞株として選択した。
そして、以後、このＳＳ１１Ｇ細胞株が産生するモノクローナル抗体を、抗ＳＣＣＡ１抗体として用いた。

【0135】

（２）抗ＳＣＣＡ２抗体
ＳＣＣＡ２のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ ＫＬら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，Ｖｏｌ．１９２，ｐ．２６２−２６７）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションした。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したＳＣＣＡ２を精製した。

【0136】

このＧＳＴ付加ＳＣＣＡ２を、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＣｙｔＲｘ社、米国）と混合して、Ｗｉｓｔａｒラットの足蹠皮下に投与（５０μｇ／ラット）する以外は、前記（１）の記載の通りに行い、ＳＣＣＡ２に結合し、ＳＣＣＡ１には結合しないモノクローナル抗体を産生する細胞株（クローン）であったＳＳ８Ｇ細胞株を、ＳＣＣＡ２に特異的に結合する抗体である抗ＳＣＣＡ２抗体の産生細胞株として選択した。
そして、以後、このＳＳ８Ｇ細胞株が産生するモノクローナル抗体を、抗ＳＣＣＡ２抗体として用いた。

【0137】

（３）ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体
ＳＣＣＡ２のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ ＫＬら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，Ｖｏｌ．１９２，ｐ．２６２−２６７）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションした。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したＳＣＣＡ２を精製した。

【0138】

このＧＳＴ付加ＳＣＣＡ２を、ＴｉｔｅｒＭａｘ Ｇｏｌｄアジュバント（ＣｙｔＲｘ社、米国）と混合して、Ｗｉｓｔａｒラットの足蹠皮下に投与（５０μｇ／ラット）する以外は、前記（１）の記載の通りに行い、ＳＣＣＡ１に結合し、かつＳＣＣＡ２にも結合するモノクローナル抗体を産生する細胞株（クローン）であったＳＳ１４Ｂ細胞株を、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体の産生細胞株として選択した。
そして、以後、このＳＳ１４Ｂ細胞株が産生するモノクローナル抗体を、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体として用いた。

【0139】

２．ＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ２
（１）ＳＣＣＡ１
ＳＣＣＡ１のｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）に組み込んで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性株を選択して、ＳＣＣＡ１の安定発現細胞株（２９３Ｔ／ＳＣＣＡ１）を樹立した。
この２９３Ｔ／ＳＣＣＡ１細胞株の培養上清には、Ｈｉｓタグを付加したＳＣＣＡ１が含まれる。

【0140】

（２）ＳＣＣＡ２
ＳＣＣＡ２のｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、米国）に組み込んで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性株を選択して、ＳＣＣＡ２の安定発現細胞株（２９３Ｔ／ＳＣＣＡ２）を樹立した。
この２９３Ｔ／ＳＣＣＡ２細胞株の培養上清には、Ｈｉｓタグを付加したＳＣＣＡ２が含まれる。

【0141】

３．免疫沈降法及びウェスタンブロット法
（１）抗ＳＣＣＡ１抗体
（ａ） 前記１の（１）の抗ＳＣＣＡ１抗体の産生細胞株（ＳＳ１１Ｇ細胞株）の培養上清（抗ＳＣＣＡ１抗体を含む）の１ｍＬと、予め４℃で１時間反応させたプロテインＧセファロースビーズの２０μＬを、前記２の（１）の２９３Ｔ／ＳＣＣＡ１細胞株の培養上清（ＳＣＣＡ１を含む）の１ｍＬと混合し、４℃で１時間静置し、免疫沈降法を行った。
次に、一次抗体として、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体（ポリクローナル抗体）を用いて、常法によりウェスタンブロット法を行った。

【0142】

（ｂ） また、前記２９３Ｔ／ＳＣＣＡ１細胞株の培養上清（ＳＣＣＡ１を含む）に代えて、前記２の（２）の２９３Ｔ／ＳＣＣＡ２細胞株の培養上清（ＳＣＣＡ２を含む）を用いる以外は、前記（ａ）の記載の通りに行い、免疫沈降法及びウェスタンブロット法を行った。

【0143】

（ｃ） 前記（ａ）及び（ｂ）の免疫沈降法及びウェスタンブロット法の結果、すなわち、前記の抗ＳＣＣＡ１抗体（ＳＳ１１Ｇ細胞株）のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した結果（写真）を、図１に示した。
なお、この図において、上段はＳＣＣＡ１との結合性を示し、下段はＳＣＣＡ２との結合性を示す。

【0144】

（２）抗ＳＣＣＡ２抗体
前記の抗ＳＣＣＡ１抗体の産生細胞株（ＳＳ１１Ｇ細胞株）の培養上清（抗ＳＣＣＡ１抗体を含む）に代え、前記１の（２）の抗ＳＣＣＡ２抗体の産生細胞株（ＳＳ８Ｇ細胞株）の培養上清（抗ＳＣＣＡ２抗体を含む）を用いる以外は、前記（１）の記載の通りに行い、免疫沈降法及びウェスタンブロット法を行った。

【0145】

この免疫沈降法及びウェスタンブロット法の結果、すなわち、前記の抗ＳＣＣＡ２抗体（ＳＳ８Ｇ細胞株）のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した結果（写真）についても、図１に示した。
なお、この図において、上段はＳＣＣＡ１との結合性を示し、下段はＳＣＣＡ２との結合性を示す。

【0146】

（３）ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体
前記の抗ＳＣＣＡ１抗体の前記産生細胞株（ＳＳ１１Ｇ細胞株）の培養上清（抗ＳＣＣＡ１抗体を含む）に代え、前記１の（３）のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体の産生細胞株（ＳＳ１４Ｂ細胞株）の培養上清（ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体を含む）を用いる以外は、前記（１）の記載の通りに行い、免疫沈降法及びウェスタンブロット法を行った。

【0147】

この免疫沈降法及びウェスタンブロット法の結果、すなわち、前記のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体（ＳＳ１４Ｂ細胞株）のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２それぞれとの結合性を確認した結果（写真）についても、図１に示した。（この図において、この抗体を「抗ＳＣＣＡ１／２共通抗体」と表した。）
なお、この図において、上段はＳＣＣＡ１との結合性を示し、下段はＳＣＣＡ２との結合性を示す。

【0148】

４．まとめ
（１） 前記の免疫沈降法及びウェスタンブロット法の結果である図１より、抗ＳＣＣＡ１抗体（ＳＳ１１Ｇ細胞株）は、ＳＣＣＡ１には結合するものの、ＳＣＣＡ２には結合しないことが分かる。
よって、この抗ＳＣＣＡ１抗体は、ＳＣＣＡ１に特異的に結合する抗体であることが、この免疫沈降法及びウェスタンブロット法により確かめられた。

【0149】

（２） また、この図１より、抗ＳＣＣＡ２抗体（ＳＳ８Ｇ細胞株）は、ＳＣＣＡ２には結合するものの、ＳＣＣＡ１には結合しないことが分かる。
よって、この抗ＳＣＣＡ２抗体は、ＳＣＣＡ２に特異的に結合する抗体であることが、この免疫沈降法及びウェスタンブロット法により確かめられた。

【0150】

（３） また、この図１より、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体（ＳＳ１４Ｂ細胞株）は、ＳＣＣＡ１に結合し、かつＳＣＣＡ２にも結合することが分かる。
よって、このＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体は、ＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体であることが、この免疫沈降法及びウェスタンブロット法により確かめられた。

【0151】

〔２〕．酵素免疫測定法
１．測定試薬
（１）抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレート
前記〔１〕の１の（３）の抗体産生細胞株〔ＳＳ１４Ｂ細胞株〕の培養上清に含まれるＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体（モノクローナル抗体）をプロテインＧを用いて精製し、これをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でその濃度が２μｇ／ｍＬとなるように希釈した。
次に、これを、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）〔Ｎｕｎｃ社、商品名：Ｍａｘｉｓｏｒｐ〕の各ウェルに１００μＬずつ分注し、２５℃で一晩静置し、前記のＳＣＣＡ１及びＳＣＣＡ２に結合する抗体をマイクロプレートのウェルに固相化した。
次に、マイクロプレートのウェル中の液を除去し、０．５％カゼイン及び０．１％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）の２５０μＬずつを各ウェルに分注し、室温で３時間静置し、ブロッキング処理を行った。
この後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、蒸発しないようにして、使用時まで冷蔵保存した。
これを、抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートとした。

【0152】

（２）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体
前記〔１〕の１の（１）の抗体産生細胞株〔ＳＳ１１Ｇ細胞株〕の培養上清に含まれる抗ＳＣＣＡ１抗体（モノクローナル抗体）を、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社、商品コード番号：２１３３５）を用いてビオチン標識を行った。
これを、ビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体とした。

【0153】

（３）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体
前記〔１〕の１の（２）の抗体産生細胞株〔ＳＳ８Ｇ細胞株〕の培養上清に含まれる抗ＳＣＣＡ２抗体（モノクローナル抗体）を、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社、商品コード番号：２１３３５）を用いてビオチン標識を行った。
これを、ビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体とした。

【0154】

（４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＰｏｌｙＨＲＰ４０（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ドイツ、商品コード番号：ＳＰ４０Ｃ）を、０．５％カゼインナトリウム及び１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で１５，０００倍に希釈した。
これを、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートとした。

【0155】

（５）洗浄液
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を、洗浄液とした。

【0156】

（６）希釈液
０．５％カゼインナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、希釈液とした。

【0157】

（７）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を、発色液とした。

【0158】

（８）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を、基質液とした。

【0159】

（９）発色基質
前記の発色液と基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。

【0160】

（１０）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を、反応停止液とした。

【0161】

２．試料
（１）ＳＣＣＡ１
ＳＣＣＡ１のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ ＫＬら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，Ｖｏｌ．１９２，ｐ．２６２−２６７）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションした。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したＳＣＣＡ１を精製した。

【0162】

このＧＳＴ付加ＳＣＣＡ１について、トロンビンにてＧＳＴを切断し、再度グルタチオンセファロース４Ｂにより精製し、ＳＣＣＡ１を得た。
これをＢｒａｄｆｏｒｄ法〔プロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社）を使用〕にてタンパク質濃度を決定し、この精製標品をＳＣＣＡ１として用いた。

【0163】

このＳＣＣＡ１を、前記１の（６）の希釈液で希釈して、０．００６２５ｎｇ／ｍＬ、０．０１２５ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、及び０．２ｎｇ／ｍＬの各濃度のＳＣＣＡ１溶液を調製した。
なお、前記１の（６）の希釈液を、ＳＣＣＡ１もＳＣＣＡ２も含まない、ＳＣＣＡ１濃度及びＳＣＣＡ２濃度が０ｎｇ／ｍＬのＳＣＣＡ１溶液とした。
これにより、濃度が異なる７種類のＳＣＣＡ１試料を調製した。

【0164】

（２）ＳＣＣＡ２
ＳＣＣＡ２のｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇｕａｎ ＫＬら，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９１，Ｖｏｌ．１９２，ｐ．２６２−２６７）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションした。
これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したＳＣＣＡ２を精製した。

【0165】

このＧＳＴ付加ＳＣＣＡ２について、トロンビンにてＧＳＴを切断し、再度グルタチオンセファロース４Ｂにより精製し、ＳＣＣＡ２を得た。
これをＢｒａｄｆｏｒｄ法〔プロテインアッセイキットＩＩ（バイオラッド社）を使用〕にてタンパク質濃度を決定し、この精製標品をＳＣＣＡ２として用いた。

【0166】

このＳＣＣＡ２を、前記１の（６）の希釈液で希釈して、０．００６２５ｎｇ／ｍＬ、０．０１２５ｎｇ／ｍＬ、０．０２５ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、及び０．２ｎｇ／ｍＬの各濃度のＳＣＣＡ２溶液を調製した。
なお、前記１の（６）の希釈液を、ＳＣＣＡ１もＳＣＣＡ２も含まない、ＳＣＣＡ１濃度及びＳＣＣＡ２濃度が０ｎｇ／ｍＬのＳＣＣＡ２溶液とした。
これにより、濃度が異なる７種類のＳＣＣＡ２試料を調製した。

【0167】

３．測定
（１） 前記１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。

【0168】

（２） 次に、前記２の（１）の７種類のＳＣＣＡ１試料それぞれの１００μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、室温で一晩静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0169】

（３） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0170】

（４） 次に、前記１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を、前記１の（６）の希釈液で２０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、この１００μＬを各ウェルに分注し、室温で９０分間静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0171】

（５） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0172】

（６） 次に、各ウェルに、前記１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを１００μＬ分注し、室温で６０分間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。

【0173】

（７） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0174】

（８） 次に、各ウェルに、前記１の（９）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるペルオキシダーゼによる発色反応を行わせた。

【0175】

（９） 次に、各ウェルに、前記１の（１０）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。

【0176】

（１０） 次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の７種類のＳＣＣＡ１試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0177】

（１１） 前記（２）における７種類のＳＣＣＡ１試料の代わりに、前記２の（２）の７種類のＳＣＣＡ２試料を用いる以外は、前記（１）〜（１０）の記載の通りに行い、前記の７種類のＳＣＣＡ２試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0178】

（１２） 前記（４）におけるビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体の代わりに、前記１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の７種類のＳＣＣＡ１試料及び前記の７種類のＳＣＣＡ２試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0179】

４．測定結果
（１） 前記３の（４）でビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を用い、前記の７種類のＳＣＣＡ１試料及び前記の７種類のＳＣＣＡ２試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を、図２に示した。
この図において、横軸はＳＣＣＡ１試料中のＳＣＣＡ１濃度（ｎｇ／ｍＬ）又はＳＣＣＡ２試料中のＳＣＣＡ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度を示す。
また、この図において、「◆」は試料がＳＣＣＡ１試料であるときの測定値（吸光度）を示し、「■」は試料がＳＣＣＡ２試料であるときの測定値（吸光度）を示す。

【0180】

（２） また、前記３の（４）でビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用い、前記の７種類のＳＣＣＡ１試料及び前記の７種類のＳＣＣＡ２試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を、図３に示した。
この図において、横軸はＳＣＣＡ１試料中のＳＣＣＡ１濃度（ｎｇ／ｍＬ）又はＳＣＣＡ２試料中のＳＣＣＡ２濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた吸光度を示す。
また、この図において、「◆」は試料がＳＣＣＡ１試料であるときの測定値（吸光度）を示し、「■」は試料がＳＣＣＡ２試料であるときの測定値（吸光度）を示す。

【0181】

５．まとめ
（１） 前記の酵素免疫測定法の結果である図２より、前記３の（４）でビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を用いた場合、すなわち、抗ＳＣＣＡ１抗体（ＳＳ１１Ｇ細胞株）を用いた場合には、ＳＣＣＡ１試料では試料中のＳＣＣＡ１の濃度に応じて得られる吸光度が増加するのに対して、ＳＣＣＡ２試料では試料中のＳＣＣＡ２の濃度がいずれの濃度であっても吸光度はほとんど得られていないことが分かる。
つまり、抗ＳＣＣＡ１抗体（ＳＳ１１Ｇ細胞株）は、ＳＣＣＡ１には結合するものの、ＳＣＣＡ２には結合しないことが分かる。
よって、この抗ＳＣＣＡ１抗体は、ＳＣＣＡ１に特異的に結合する抗体であること、及びこの抗ＳＣＣＡ１抗体を用いることにより生体試料中のＳＣＣＡ１を定量的かつ精確に測定することができることが、この酵素免疫測定法の結果から確かめられた。

【0182】

（２） また、前記の酵素免疫測定法の結果である図３より、前記３の（４）でビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いた場合、すなわち、抗ＳＣＣＡ２抗体（ＳＳ８Ｇ細胞株）を用いた場合には、ＳＣＣＡ１試料では試料中のＳＣＣＡ１の濃度がいずれの濃度であっても吸光度はほとんど得られていないのに対して、ＳＣＣＡ２試料では試料中のＳＣＣＡ２の濃度に応じて得られる吸光度が増加していることがわかる。
つまり、抗ＳＣＣＡ２抗体（ＳＳ８Ｇ細胞株）は、ＳＣＣＡ２には結合するものの、ＳＣＣＡ１には結合しないことが分かる。
よって、この抗ＳＣＣＡ２抗体は、ＳＣＣＡ２に特異的に結合する抗体であること、及びこの抗ＳＣＣＡ２抗体を用いることにより生体試料中のＳＣＣＡ２を定量的かつ精確に測定することができることが、この酵素免疫測定法の結果から確かめられた。

【0183】

〔実施例２〕（アレルギー疾患の検査方法としての適性の確認−１）
アレルギー疾患の罹患者、非罹患者それぞれの生体試料中のＳＣＣＡ１濃度、ＳＣＣＡ２濃度を測定し、アレルギー疾患の検査方法としての適性を確かめた。

【0184】

１．測定試薬
（１）抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレート
前記実施例１の〔２〕の１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートを用いた。

【0185】

（２）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を用いた。

【0186】

（３）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いた。

【0187】

（４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート
前記実施例１の〔２〕の１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた。

【0188】

（５）洗浄液
前記実施例１の〔２〕の１の（５）の洗浄液を用いた。

【0189】

（６）希釈液
前記実施例１の〔２〕の１の（６）の希釈液を用いた。

【0190】

（７）発色基質
前記実施例１の〔２〕の１の（９）の発色基質を用いた。

【0191】

（８）反応停止液
前記実施例１の〔２〕の１の（１０）の反応停止液を用いた。

【0192】

２．試料
（１）アレルギー疾患試料
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患している７２名（生後２ヵ月〜８歳）の計１８８の血清検体をアレルギー疾患試料とした。

【0193】

（２）非アレルギー疾患試料
アレルギー疾患に罹患していないことが確認されている４９名（１歳〜１０歳）の計４９の血清検体を非アレルギー疾患試料とした。

【0194】

３．測定
（１） 前記１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。

【0195】

（２） 次に、前記２の（１）の計１８８のアレルギー疾患試料それぞれを前記１の（６）の希釈液でＳＣＣＡ１濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように希釈し、そして、これらの１００μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、室温で一晩静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0196】

（３） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0197】

（４） 次に、前記１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を、前記１の（６）の希釈液で２０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、この１００μＬを各ウェルに分注し、室温で９０分間静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0198】

（５） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0199】

（６） 次に、各ウェルに、前記１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを１００μＬ分注し、室温で６０分間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。

【0200】

（７） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0201】

（８） 次に、各ウェルに、前記１の（７）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるペルオキシダーゼによる発色反応を行わせた。

【0202】

（９） 次に、各ウェルに、前記１の（８）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。

【0203】

（１０） 次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の計１８８のアレルギー疾患試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0204】

（１１） 次に、前記の測定により得られた吸光度から、前記の計１８８のアレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を求めた。
なお、この各生体試料中のＳＣＣＡ１の濃度は、前記の測定により得られた吸光度と、前記実施例１の〔２〕の２の（１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品を測定して得た吸光度とを対比して算出することにより得た。

【0205】

（１２） 前記（２）における計１８８のアレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（２）の計４９の非アレルギー疾患試料を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計４９の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0206】

（１３） 前記（２）においてＳＣＣＡ２濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように生体試料を希釈すること、前記（４）におけるビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体の代わりに、前記１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いること、及び前記（１１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品の代わりに、前記実施例１の〔２〕の２の（２）のＳＣＣＡ２の濃度が既知であるＳＣＣＡ２の精製標品を用いること以外は、前記（１）〜（１２）の記載の通りに行い、前記の計１８８のアレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ２の濃度、及び前記の計４９の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ２の濃度を得た。

【0207】

４．測定結果
（１） 前記の計１８８のアレルギー疾患試料のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ１の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を横軸に、ＳＣＣＡ２の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を縦軸に取ってプロットしたグラフを図４の（Ａ）に示した。
なお、このグラフにおいて、ｘをＳＣＣＡ１の濃度とし、ｙをＳＣＣＡ２の濃度としたときの回帰式はｙ＝２．１２ｘ−１．５４であり、相関係数Ｒは０．９８であった。

【0208】

（２） また、前記の計４９の非アレルギー疾患試料のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ１の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を横軸に、ＳＣＣＡ２の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を縦軸に取ってプロットしたグラフを図４の（Ｂ）に示した。
なお、このグラフにおいて、ｘをＳＣＣＡ１の濃度とし、ｙをＳＣＣＡ２の濃度としたときの回帰式はｙ＝０．８９ｘ−０．０８であり、相関係数Ｒは０．８７であった。

【0209】

５．まとめ
（１） 前記の図４の（Ａ）より、アレルギー疾患試料、すなわちアレルギー疾患の罹患においては、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度が、ＳＣＣＡ１の濃度のおよそ２倍以上となっていることが分かる。
すなわち、同一のアレルギー疾患試料を測定しても、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、より高い測定値（シグナル）を得ることができることが分かる。
このことより、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、測定の感度が高く、測定の正確性及び精密性において有利であり、アレルギー疾患の検査に適していることが確かめられた。
なお、この図４の（Ａ）のグラフの回帰式の相関係数Ｒが０．９８であり、この測定結果が非常に精確なものであることが分かる。

【0210】

（２） また、前記の図４の（Ｂ）より、非アレルギー疾患試料、すなわちアレルギー疾患に罹患していない非罹患においては、生体試料中のＳＣＣＡ２の濃度は、概してＳＣＣＡ１の濃度以下となっていることが分かる。
すなわち、同一の非アレルギー疾患試料を測定しても、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、より低い測定値（シグナル）を得ることができることが分かる。
このことより、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、アレルギー疾患の非罹患を反映したより低い測定値（シグナル）を得ることができ、高い測定値となるアレルギー疾患の罹患の測定値との差をより広げ、差異を明確にすることができるので、この点においても有利であり、アレルギー疾患の検査に適していることが確かめられた。
なお、この図４の（Ｂ）のグラフの回帰式の相関係数Ｒが０．８７であり、この測定結果が精確なものであることが分かる。

【0211】

〔実施例３〕（アレルギー疾患の検査方法としての適性の確認−２）
アレルギー疾患の罹患者、非罹患者、癌罹患者それぞれの生体試料中のＳＣＣＡ１濃度、ＳＣＣＡ２濃度を測定し、アレルギー疾患の検査方法としての適性を確認した。

【0212】

１．測定試薬
（１）抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレート
前記実施例１の〔２〕の１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートを用いた。

【0213】

（２）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を用いた。

【0214】

（３）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いた。

【0215】

（４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート
前記実施例１の〔２〕の１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた。

【0216】

（５）洗浄液
前記実施例１の〔２〕の１の（５）の洗浄液を用いた。

【0217】

（６）希釈液
前記実施例１の〔２〕の１の（６）の希釈液を用いた。

【0218】

（７）発色基質
前記実施例１の〔２〕の１の（９）の発色基質を用いた。

【0219】

（８）反応停止液
前記実施例１の〔２〕の１の（１０）の反応停止液を用いた。

【0220】

２．試料
（１）アレルギー疾患試料
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患している７２名（生後２ヵ月〜８歳）の計１８８の血清検体をアレルギー疾患試料とした。

【0221】

（２）非アレルギー疾患試料
アレルギー疾患に罹患していないことが確認されている４９名（１歳〜１０歳）の計４９の血清検体を非アレルギー疾患試料とした。

【0222】

（３）癌罹患試料
癌（子宮頸癌）に罹患している１９４名の計１９４の血清検体を癌罹患試料とした。

【0223】

３．測定
（１） 前記１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。

【0224】

（２） 次に、前記２の（１）の計１８８のアレルギー疾患試料それぞれを前記１の（６）の希釈液でＳＣＣＡ１濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように希釈し、そして、これらの１００μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、室温で一晩静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0225】

（３） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0226】

（４） 次に、前記１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を、前記１の（６）の希釈液で２０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、この１００μＬを各ウェルに分注し、室温で９０分間静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0227】

（５） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0228】

（６） 次に、各ウェルに、前記１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを１００μＬ分注し、室温で６０分間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。

【0229】

（７） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0230】

（８） 次に、各ウェルに、前記１の（７）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるペルオキシダーゼによる発色反応を行わせた。

【0231】

（９） 次に、各ウェルに、前記１の（８）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。

【0232】

（１０） 次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の計１８８のアレルギー疾患試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0233】

（１１） 次に、前記の測定により得られた吸光度から、前記の計１８８のアレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を求めた。
なお、この各生体試料中のＳＣＣＡ１の濃度は、前記の測定により得られた吸光度と、前記実施例１の〔２〕の２の（１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品を測定して得た吸光度とを対比して算出することにより得た。

【0234】

（１２） 前記（２）における計１８８のアレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（２）の計４９の非アレルギー疾患試料を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計４９の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0235】

（１３） 前記（２）における計１８８のアレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（３）の計１９４の癌罹患試料を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計１９４の癌罹患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0236】

（１４） 前記（２）においてＳＣＣＡ２濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように生体試料を希釈すること、前記（４）におけるビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体の代わりに、前記１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いること、及び前記（１１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品の代わりに、前記実施例１の〔２〕の２の（２）のＳＣＣＡ２の濃度が既知であるＳＣＣＡ２の精製標品を用いること以外は、前記（１）〜（１３）の記載の通りに行い、前記の計１８８のアレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ２の濃度、前記の計４９の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ２の濃度、及び前記の計１９４の癌罹患試料中のＳＣＣＡ２の濃度を得た。

【0237】

４．測定結果
（１） 前記の計１８８のアレルギー疾患試料、前記の計４９の非アレルギー疾患試料、及び前記の計１９４の癌罹患試料のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ１の濃度の範囲を、各疾患毎にまとめて、図５の（Ａ）に示した。
この図において、横軸はアレルギー疾患試料、非アレルギー疾患試料、及び癌罹患試料の別を示し、縦軸は測定により得たＳＣＣＡ１の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を示す。

【0238】

（２） また、前記の計１８８のアレルギー疾患試料、前記の計４９の非アレルギー疾患試料、及び前記の計１９４の癌罹患試料のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ２の濃度の範囲を、各疾患毎にまとめて、図５の（Ｂ）に示した。
この図において、横軸はアレルギー疾患試料、非アレルギー疾患試料、及び癌罹患試料の別を示し、縦軸は測定により得たＳＣＣＡ２の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を示す。

【0239】

５．まとめ
（１） 前記の図５の（Ａ）及び（Ｂ）より、生体試料中のＳＣＣＡ１濃度において、アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ１濃度の範囲は、非アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ１濃度の範囲とはその相違は明らかである。
しかし、癌罹患におけるＳＣＣＡ１濃度の範囲とは、その相違は明確ではないことが分かる。
これに対し、生体試料中のＳＣＣＡ２濃度において、アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ２濃度の範囲は、非アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ２濃度の範囲とはその相違は明らかであり、癌罹患におけるＳＣＣＡ２濃度の範囲ともその相違は明らかである。
すなわち、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、アレルギー疾患の罹患と癌の罹患とをより明確に区別することができる点で、アレルギー疾患の検査方法として優れていることが確かめられた。

【0240】

（２） また、前記の図５の（Ａ）及び（Ｂ）より、アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ１濃度の範囲に比べ、アレルギー疾患におけるＳＣＣＡ２濃度の範囲は、およそ２倍高く拡がっていることが分かる。
このことからも、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、測定の感度が高く、測定の正確性及び精密性において有利であり、アレルギー疾患の検査に適していることが分かる。

【0241】

〔実施例４〕（アレルギー疾患の検査方法としての適性の確認−３）
異なる重症度のアレルギー疾患の罹患者、アレルギー疾患の非罹患者それぞれの生体試料中のＳＣＣＡ１濃度、ＳＣＣＡ２濃度を測定し、アレルギー疾患の検査方法としての適性を確認した。

【0242】

１．測定試薬
（１）抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレート
前記実施例１の〔２〕の１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートを用いた。

【0243】

（２）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を用いた。

【0244】

（３）ビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体
前記実施例１の〔２〕の１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いた。

【0245】

（４）ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲート
前記実施例１の〔２〕の１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いた。

【0246】

（５）洗浄液
前記実施例１の〔２〕の１の（５）の洗浄液を用いた。

【0247】

（６）希釈液
前記実施例１の〔２〕の１の（６）の希釈液を用いた。

【0248】

（７）発色基質
前記実施例１の〔２〕の１の（９）の発色基質を用いた。

【0249】

（８）反応停止液
前記実施例１の〔２〕の１の（１０）の反応停止液を用いた。

【0250】

２．試料
（１）非アレルギー疾患試料
アレルギー疾患に罹患していないことが確認されている計７７の血清検体を非アレルギー疾患試料とした。

【0251】

（２）アレルギー疾患試料〔軽症〕
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患していて軽症である計４９の血清検体をアレルギー疾患試料〔軽症〕とした。

【0252】

（３）アレルギー疾患試料〔中等症〕
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患していて中等症である計３４の血清検体をアレルギー疾患試料〔中等症〕とした。

【0253】

（４）アレルギー疾患試料〔重症〕
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患していて重症である計２７の血清検体をアレルギー疾患試料〔重症〕とした。

【0254】

（５）アレルギー疾患試料〔最重症〕
アレルギー疾患（アトピー性皮膚炎及び食物アレルギーの合併）に罹患していて最重症である計５の血清検体をアレルギー疾患試料〔最重症〕とした。

【0255】

３．測定
（１） 前記１の（１）の抗ＳＣＣＡ１・ＳＣＣＡ２抗体固相化マイクロプレートの各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで３回洗浄した。

【0256】

（２） 次に、前記２の（１）の計７７の非アレルギー疾患試料それぞれを前記１の（６）の希釈液でＳＣＣＡ１濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように希釈し、そして、これらの１００μＬを各ウェルに分注した後、各ウェルの上をプレートシールで封をし、室温で一晩静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0257】

（３） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0258】

（４） 次に、前記１の（２）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体を、前記１の（６）の希釈液で２０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、この１００μＬを各ウェルに分注し、室温で９０分間静置し、抗原抗体反応を行わせた。

【0259】

（５） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0260】

（６） 次に、各ウェルに、前記１の（４）のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを１００μＬ分注し、室温で６０分間静置し、「ビオチン−ストレプトアビジン」の結合反応を行わせた。

【0261】

（７） 次に、各ウェルを、前記１の（５）の洗浄液の２５０μＬで５回洗浄した。

【0262】

（８） 次に、各ウェルに、前記１の（７）の発色基質を１００μＬ分注し、室温で２０分間静置し、標識酵素であるペルオキシダーゼによる発色反応を行わせた。

【0263】

（９） 次に、各ウェルに、前記１の（８）の反応停止液を１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。

【0264】

（１０） 次に、各ウェルの液の吸光度（主波長：４５０ｎｍ、副波長：５５０ｎｍ）を測定し、前記の計７７の非アレルギー疾患試料をそれぞれ測定した場合の吸光度を得た。

【0265】

（１１） 次に、前記の測定により得られた吸光度から、前記の計７７の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ１の濃度を求めた。
なお、この各生体試料中のＳＣＣＡ１の濃度は、前記の測定により得られた吸光度と、前記実施例１の〔２〕の２の（１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品を測定して得た吸光度とを対比して算出することにより得た。

【0266】

（１２） 前記（２）における計７７の非アレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（２）の計４９のアレルギー疾患試料〔軽症〕を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計４９のアレルギー疾患試料〔軽症〕中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0267】

（１３） 前記（２）における計７７の非アレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（３）の計３４のアレルギー疾患試料〔中等症〕を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計３４のアレルギー疾患試料〔中等症〕中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0268】

（１４） 前記（２）における計７７の非アレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（４）の計２７のアレルギー疾患試料〔重症〕を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計２７のアレルギー疾患試料〔重症〕中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0269】

（１５） 前記（２）における計７７の非アレルギー疾患試料の代わりに、前記２の（５）の計５のアレルギー疾患試料〔最重症〕を用いる以外は、前記（１）〜（１１）の記載の通りに行い、前記の計５のアレルギー疾患試料〔最重症〕中のＳＣＣＡ１の濃度を得た。

【0270】

（１６） 前記（２）においてＳＣＣＡ２濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ以内となるように生体試料を希釈すること、前記（４）におけるビオチン標識抗ＳＣＣＡ１抗体の代わりに、前記１の（３）のビオチン標識抗ＳＣＣＡ２抗体を用いること、及び前記（１１）のＳＣＣＡ１の濃度が既知であるＳＣＣＡ１の精製標品の代わりに、前記実施例１の〔２〕の２の（２）のＳＣＣＡ２の濃度が既知であるＳＣＣＡ２の精製標品を用いること以外は、前記（１）〜（１５）の記載の通りに行い、前記の計７７の非アレルギー疾患試料中のＳＣＣＡ２の濃度、前記の計４９のアレルギー疾患試料〔軽症〕中のＳＣＣＡ２の濃度、前記の計３４のアレルギー疾患試料〔中等症〕中のＳＣＣＡ２の濃度、前記の計２７のアレルギー疾患試料〔重症〕中のＳＣＣＡ２の濃度、及び前記の計５のアレルギー疾患試料〔最重症〕中のＳＣＣＡ２の濃度を得た。

【0271】

４．測定結果
（１） 前記の計７７の非アレルギー疾患試料、前記の計４９のアレルギー疾患試料〔軽症〕、前記の計３４のアレルギー疾患試料〔中等症〕、前記の計２７のアレルギー疾患試料〔重症〕、及び前記の計５のアレルギー疾患試料〔最重症〕のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ１の濃度の範囲を、罹患の有無及び各重症度毎にまとめて、図６の（Ａ）に示した。
この図において、横軸は、非アレルギー疾患試料（「なし」と表示）、アレルギー疾患試料〔軽症〕、アレルギー疾患試料〔中等症〕、アレルギー疾患試料〔重症〕、及びアレルギー疾患試料〔最重症〕の別を示し、縦軸は測定により得たＳＣＣＡ１の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を示す。

【0272】

（２） 前記の計７７の非アレルギー疾患試料、前記の計４９のアレルギー疾患試料〔軽症〕、前記の計３４のアレルギー疾患試料〔中等症〕、前記の計２７のアレルギー疾患試料〔重症〕、及び前記の計５のアレルギー疾患試料〔最重症〕のそれぞれについて、前記３の測定で得たＳＣＣＡ２の濃度の範囲を、罹患の有無及び各重症度毎にまとめて、図６の（Ｂ）に示した。
この図において、横軸は、非アレルギー疾患試料（「なし」と表示）、アレルギー疾患試料〔軽症〕、アレルギー疾患試料〔中等症〕、アレルギー疾患試料〔重症〕、及びアレルギー疾患試料〔最重症〕の別を示し、縦軸は測定により得たＳＣＣＡ２の濃度〔ｎｇ／ｍｌ（ｎｇ／ｍＬ）〕を示す。

【0273】

５．まとめ
前記の図６の（Ａ）及び（Ｂ）より、アレルギー疾患〔重症〕の範囲とアレルギー疾患〔中等症〕の範囲の重なり度合いは、ＳＣＣＡ２濃度測定の場合よりもＳＣＣＡ１濃度測定の場合の方が、重なり度が大きいことが分かる。
すなわち、ＳＣＣＡ１の濃度を測定するよりも、ＳＣＣＡ２の濃度を測定する方が、アレルギー疾患の重症度をより明確に区別することができる点で、アレルギー疾患の検査方法として優れていることが確かめられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】