特許 5752147 Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのメチル基の特異的同位体標識化のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】5752147

(24)【登録日】2015年5月29日

(45)【発行日】2015年7月22日

(54)【発明の名称】Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅのメチル基の特異的同位体標識化のための方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20150702BHJP

   G01R 33/32 20060101ALI20150702BHJP

   G01N 24/08 20060101ALI20150702BHJP

   C07B 59/00 20060101ALI20150702BHJP

   C07C 69/716 20060101ALI20150702BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/13

   G01N24/02 530K

   G01N24/08 510L

   G01N24/08 510S

   C07B59/00

   C07C69/716 Z

【請求項の数】16

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2012-547554(P2012-547554)

(86)(22)【出願日】2010年1月6日

(65)【公表番号】特表2013-516452(P2013-516452A)

(43)【公表日】2013年5月13日

(86)【国際出願番号】IB2010000282

(87)【国際公開番号】WO2011083356

(87)【国際公開日】20110714

【審査請求日】2012年12月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】506423291

【氏名又は名称】コミサリア ア レネルジィ アトミーク エ オ ゼネ ルジイ アルテアナティーフ

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ

(73)【特許権者】

【識別番号】502205846

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク

(73)【特許権者】

【識別番号】509340517

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ジョセフ フーリエ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ガンズ ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ボワブヴィエ ジェローム

(72)【発明者】

【氏名】アヤラ イザベル

(72)【発明者】

【氏名】アムラン オリヴィエ

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第００／０６１５２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Am. Chem. Soc.，２００３年１１月１２日，Vol.125, No.45，p.13868-13878

【文献】 Biochemistry，１９７９年１０月１６日，Vol.18, No.21，p.4529-4531

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質および生体分子集合体中のバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法であって、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下の式：

【化1】

（式中、
Ｘは、¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
Ｒ¹は、炭素原子が¹³Ｃまたは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ²は、炭素原子が¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではない）
を有するアセトラクテートの誘導体を導入するステップを含む方法。

【請求項2】

ｂ）培地中に含有される細菌によりタンパク質を過剰発現させるステップと、
ｃ）タンパク質を精製するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

アセトラクテート誘導体が、式Ｉ（式中、
Ｒ¹は、以下の基：
¹²ＣＨ₃、¹²ＣＤ₃、¹³ＣＨ₃、¹³ＣＤ₃、¹³ＣＨＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ
の中から選択され、
Ｒ²は、以下の基：
¹²ＣＨ₃、¹²ＣＤ₃、¹³ＣＨ₃、¹³ＣＤ₃、¹³ＣＨＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ、¹²ＣＨ₃¹²ＣＤ₂、¹²ＣＤ₃¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₃¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₃¹³ＣＤ₂、¹³ＣＤ₃¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨＤ₂¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨＤ₂¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ¹²ＣＤ₂
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

アセトラクテート誘導体が、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４（²Ｈ₃）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４（¹³Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（¹³Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₃）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
３６＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
３７＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₃，¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
４６＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₅，¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有する化合物からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

アセトラクテート誘導体が、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１'−（²Ｈ₂），２'−（²Ｈ），２'−（¹³Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸
を有する化合物の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

アセトラクテート誘導体が、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ，¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ，¹³Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ，¹³Ｃ）ブタン酸
の化合物の群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

以下の式Ｉ−１：

【化2】

（式中、
Ｘは、¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
Ｒ¹は、炭素原子が¹³Ｃまたは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ²は、炭素原子が¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ¹の全ての水素原子が²Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に¹²Ｃではない）
の化合物。

【請求項8】

式Ｉ−１（式中、
Ｒ¹は、以下の基：
¹²ＣＨ₃、¹²ＣＤ₃、¹³ＣＨ₃、¹³ＣＤ₃、¹³ＣＨＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ
の中から選択され、
Ｒ²は、以下の基：
¹²ＣＨ₃、¹²ＣＤ₃、¹³ＣＨ₃、¹³ＣＤ₃、¹³ＣＨＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ、¹²ＣＨ₃¹²ＣＤ₂、¹²ＣＤ₃¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₃¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₃¹³ＣＤ₂、¹³ＣＤ₃¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨＤ₂¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ¹³ＣＤ₂、¹³ＣＨＤ₂¹²ＣＤ₂、¹³ＣＨ₂Ｄ¹²ＣＤ₂
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ¹の全ての水素原子が²Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に¹²Ｃではない）
を有する、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４（²Ｈ₃）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４（¹³Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（¹³Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₃）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
３６＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
３７＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₃，¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（¹³Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
４６＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（²Ｈ₅，¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（¹³Ｃ）−２−（１'−（²Ｈ₂），¹³Ｃ₂）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。

【請求項10】

以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₂，¹³Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１'−（²Ｈ₂），２'−（²Ｈ），２'−（¹³Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。

【請求項11】

以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ，¹³Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ₃）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（²Ｈ₃）メチル−３−オキソ−４−（²Ｈ，¹³Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（²Ｈ₅）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（²Ｈ，¹³Ｃ）ブタン酸
の化合物の中から選択される式Ｉ−１の請求項７または８に記載の化合物。

【請求項12】

式Ｉ：

【化3】

の化合物を製造するための方法であって、
（式中、
Ｘは、¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
Ｒ¹は、炭素原子が¹³Ｃまたは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ²は、炭素原子が¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではない）
ａ）式Ｒ²−Ｉ（Ｒ²は前記式Ｉの化合物のＲ²と同じであり、Ｉはヨウ素原子）により、以下の式を有する３−オキソブタノエート誘導体をアルキル化するステップと、

【化4】

ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化し、以下の式を有する化合物を得るステップと、

【化5】

を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法。

【請求項13】

ｃ）ステップ（ｂ）で得られた前記化合物を脱保護して²Ｈ原子で所望の¹Ｈ原子を交換するステップであって、Ｒ¹の水素原子及び前記式（Ｉ）の化合物のＸは水素原子²Ｈであるステップをさらに含む請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

請求項１から６のいずれか一項に記載の方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。

【請求項15】

以下の式Ｉ：

【化6】

（式中、
Ｘは、¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
Ｒ¹は、炭素原子が¹³Ｃまたは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ²は、炭素原子が¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。

【請求項16】

以下の式Ｉ−１：

【化7】

（式中、
Ｘは、¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して¹²Ｃまたは¹³Ｃであり、
Ｒ¹は、炭素原子が¹³Ｃまたは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ²は、炭素原子が¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して¹³Ｃもしくは¹²Ｃであり、水素原子が互いに独立して¹Ｈもしくは²Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ¹の水素原子およびＲ²の水素原子は、同時に全てが¹Ｈまたは²Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ¹の全ての水素原子が²Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に¹²Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、タンパク質および生体分子集合体中のバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ロイシンおよびバリンのメチル基の立体特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化のための方法に関する。

【0002】

本発明はまた、本方法において使用される特異的メチル標識化２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸（以下においてアセトラクテート誘導体と呼ばれる）、ならびにそのような特異的メチル標識化アセトラクテート誘導体を製造するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ＮＭＲ分光法は、構造決定のための、および低ナノモル範囲から数ミリモル範囲にわたる親和性と複合した生体分子相互作用をマッピングするための、確立された有効な方法である。

【0004】

しかしながら、近年高分子量タンパク質のＮＭＲ分光法が発達しているものの、ＮＭＲスペクトルの低い分解能は、１メガダルトンまでの分子量を有するタンパク質等の巨大分子集合体へのこの方法の適用に対する主要な制限因子となっている。この発達は、新たな同位体標識化スキームの開発に強く関連している。完全に過重水素化されたタンパク質中のメチル基の選択的プロトン化と、横緩和最適化メチル分光法（メチル−ＴＲＯＳＹ）との組合せにより、局所構造および１メガダルトンまでの動的タンパク質集合体を、溶液ＮＭＲ分光法により調べることができるようになった。

【0005】

そのような標識化プロトコルは、過重水素化培地中の唯一のプロトン源としての特異的［^１Ｈ^１３Ｃ］メチル標識化生合成前駆体の添加に依存している。

【0006】

この手法は、検出可能な同位体スクランブリングなしに高レベルのメチルプロトン化を提供する。

【0007】

バリン（Ｖａｌ）およびロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）は、メチル基がタンパク質において利用可能な全メチルプローブの５０％超を占めるため、非常に興味深いアミノ酸である。

【0008】

過重水素化タンパク質中のＬｅｕおよびＶａｌメチル基のプロトン化は、一般に、そのようなアミノ酸の生合成における中間体であるメチルプロトン化２−オキソ−３−メチルブタン酸（以下でα−ケトイソバレレートと呼ばれる）を使用して達成される。

【0009】

しかしながら、特に３０ｋＤａから１メガＤａの巨大タンパク質の場合、この標識化方法は、非常に多くのＮＭＲ可視メチルプローブに起因して、［^１Ｈ^１３Ｃ］関連スペクトルの過密化をもたらし得る。ＮＭＲスペクトルにおける重複は、部位特異的構造または緩和パラメータの測定を大きく複雑化し得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｄ．Ｎｅｒｉ、Ｔ．Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ、Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ、Ｈ．Ｓｅｎｎ、Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９、２８、７５１０〜７５１６頁

【非特許文献2】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／

【非特許文献3】Ｖ．Ｔｕｇａｒｉｎｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ２００４、２８、１６５〜１７２頁

【非特許文献4】Ｒ．Ｌｉｃｈｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、５３４８〜５３４９頁

【非特許文献4】Ｓｏｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９、４７２〜４７３頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、組換え過重水素化タンパク質中のバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ロイシン、バリンおよびイソロイシンのメチル基の標識化のための方法を提供することにより、この方法の欠点を克服することを目的とする。

【0012】

この方法は、［^１３Ｃ^１Ｈ］−メチルＴＲＯＳＹスペクトルの分解能および感度の大幅な向上を提供し、巨大タンパク質における長距離にわたる構造的に重要な距離制限を検出するための能力を拡張する。この方法は、特に、巨大生体分子集合体内の分子間相互作用の調査に有用である。

【0013】

さらに、この方法は、非標識化および標識化前駆体（グルコースまたはピルベート）の混合物を使用した従来の方法と比較して、低分子量および中分子量（すなわち１００ｋＤａ未満）のタンパク質に対し、ロイシンおよびバリンアミノ酸のメチル基の立体特異的帰属の大幅な改善を可能とする。この最近の方法は、Ｄ．Ｎｅｒｉ、Ｔ．Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ、Ｇ．Ｏｔｔｉｎｇ、Ｈ．Ｓｅｎｎ、Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９、２８、７５１０〜７５１６頁に記載されている。

【課題を解決するための手段】

【0014】

この目的のために、本発明は、タンパク質および生体分子集合体中のＶａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化のための方法、より具体的には、ＬｅｕおよびＶａｌのメチル基の立体特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化のための方法であって、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下でアセトラクテート誘導体とも呼ばれる、以下の式：

【0015】

【化1】

【0016】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する２−アルキル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸（２位のアルキル置換基は、エチルまたはメチルである）を導入するステップを含む方法を提案する。

【0017】

式Ｉ中、Ｘは、溶媒の性質に依存して^１Ｈまたは^２Ｈであってもよい交換可能な水素である。

【0018】

この方法は、
ｂ）培地中に含有される細菌によりタンパク質を過剰発現させるステップと、
ｃ）タンパク質を精製するステップと
をさらに含む。

【0019】

本発明の標識化方法の第１の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、式Ｉ（式中、
Ｒ^１は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ^２は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ、^１２ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１２ＣＤ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＤ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１２ＣＤ_２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有する。

【0020】

本発明の標識化方法の第２の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有する化合物の群から選択される。

【0021】

本発明の標識化方法の第３の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸
を有する化合物の群から選択される。

【0022】

本発明の標識化方法の第４の好ましい実施形態において、アセトラクテート誘導体は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の群から選択される。

【0023】

本発明はまた、以下の式Ｉ−１：

【0024】

【化2】

【0025】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
の化合物を提案する。

【0026】

本発明の好ましい化合物は、式Ｉ−１（式中、
Ｒ^１は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ^２は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ、^１２ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１２ＣＤ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＤ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１２ＣＤ_２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
を有する化合物からなる群から選択される。

【0027】

式Ｉのアセトラクテート誘導体の活性部分は、実際は以下の式：

【0028】

【化3】

【0029】

（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｒ^１およびＲ^２は、式ＩおよびＩ−１の化合物に関して定義された通りである）
のアニオンであることに留意されたい。

【0030】

第１の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
の化合物の中から選択される。

【0031】

第２の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸
の化合物の中から選択される。

【0032】

第３の好ましい実施形態において、本発明の式Ｉ−１の化合物は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸
の化合物の中から選択される。

【0033】

本発明はまた、以下の式Ｉ：

【0034】

【化4】

【0035】

の化合物を製造するための方法であって、
ａ）炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基により、保護基、好ましくはメチルまたはエチル基で保護された１位にヒドロキシル基を有する３−オキソブタノエート誘導体をアルキル化するステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化するステップと、
ｃ）必要に応じて、脱保護して^２Ｈ原子で所望の^１Ｈ原子を交換するステップと
を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法を提案する。

【0036】

さらに、本発明はまた、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法を提案する。

【0037】

第１の実施形態において、この方法は、本発明の標識化方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【0038】

第２の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ：

【0039】

【化5】

【0040】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【0041】

第３の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ−１：

【0042】

【化6】

【0043】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【発明を実施するための形態】

【0044】

以下の説明を読めば、本発明がより良く理解され、また本発明の他の特徴および利点がより明確となる。

【0045】

本発明の説明において、以下の用語は、以下の意味を有する。

【0046】

Ｖａｌは、アミノ酸バリンを示す。

【0047】

Ｌｅｕは、アミノ酸ロイシンを示す。

【0048】

Ｉｌｅは、アミノ酸イソロイシンを示す。

【0049】

Ｃ（イタリック体）は、^１３Ｃを示す。

【0050】

Ｃは、^１２Ｃを示す。

【0051】

Ｄは、^２Ｈを示す。

【0052】

Ｈは、^１Ｈを示す。

【0053】

ｐｒｏＲ、ｐｒｏＳ：それぞれ非標識化ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸のγおよびβ炭素上のメチル基は同じであり、結果としてそれぞれ非標識化ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸のγおよびβ炭素はキラルではない。しかしながら、基Ｒ^１およびＲ^２が式Ｉのアセトラクテート誘導体において同じ様式で標識化されていない場合、結果的にそれぞれＬｅｕおよびＶａｌのγおよびβ炭素上のメチル基は異なって標識化され、この差により、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのγおよびβ炭素はキラルとなる。これらのメチル基は、標識化がＲ配置を生じる場合ｐｒｏＲと示され、標識化がＳ配置を生じる場合ｐｒｏＳと示される。

【0054】

「アセトラクテート誘導体」は、式Ｉの化合物およびその対応するエステル、好ましくはメチルエステルまたはエチルエステルを示す。

【0055】

生体分子集合体：タンパク質および他の基を含有する分子である。

【0056】

本発明の標識化方法は、特異的に標識化されたメチルまたはエチル基を有するアセトラクテート誘導体の使用に基づく。これらのアセトラクテート誘導体は、対象タンパク質（複数可）を過剰発現する細菌を含有する培地中に導入される。

【0057】

換言すれば、本発明の方法は、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅ生合成の初期段階中に生体内で生じるアセトラクテート誘導体中の標識化または非標識化アルキル基の立体特異的再配列に基づく。

【0058】

タンパク質中のバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸のメチル基の特異的同位体標識化のための、本発明の提案される方法は、
ａ）タンパク質を過剰発現する細菌を含有する培地中に、以下の式：

【0059】

【化7】

【0060】

（式中、
Ｘは、溶媒の性質に依存して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）である交換可能な水素であり、すなわち、Ｘは、溶媒がＨ_２Ｏである場合^１Ｈであり、Ｘは、溶媒がＤ_２Ｏである場合^２Ｈであり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
を有するアセトラクテートの誘導体を導入するステップを含む。

【0061】

次いで、この方法は、対象タンパク質（複数種可）を過剰発現させるための培地を培養するステップと、タンパク質（複数種可）を精製および単離するステップとを含む。

【0062】

好ましくは、式Ｉのアセトラクテート誘導体は、以下の式：
（Ｒ^１は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ^２は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ、^１２ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１２ＣＤ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＤ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１２ＣＤ_２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物からなる群から選択される。

【0063】

これらのアセトラクテート誘導体は、以下の式１〜５７（式中、
（^１３Ｃ）メチルは、メチル基の炭素原子が^１３Ｃであることを意味し、
（^１３Ｃ_２）エチルは、エチル基の２個の炭素原子が^１３Ｃであることを意味し、
^２Ｈ_ｎ（ｎ＝１、２、３、４または５である）は、ｎ個の水素原子が^２Ｈであることを意味し、
Ｕは、全ての炭素原子が^１３Ｃであることを意味する）：
１＝２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸、
３＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
８＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１６＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
１８＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
１９＝２−（１’−（^２Ｈ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２０＝２−（（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２３＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２５＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２６＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
２８＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（（^２Ｈ_５）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
２９＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３０＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
３１＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
３２＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３３＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３５＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
３８＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４１＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
４２＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
４３＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
４４＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４８＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
５０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５１＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２）−２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５２＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５３＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５４＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５５＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５６＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸
を有する。

【0064】

本発明の化合物の式をより良く例示するために、化合物１〜１８の発展した式を以下に示す。

【0065】

これらの式中、Ｘは、^２Ｈまたは^１Ｈを示し、Ｄは、^２Ｈを示し、Ｃ(イタリック体)は、^１３Ｃを示し、Ｃは、^１２Ｃを示す。

【0066】

【化8】

【0067】

より具体的には、式１の化合物が本発明の方法において使用される場合、プロトン化メチル基はバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）であり、^１２ＣＨ_３である。

【0068】

従って、この化合物により、ＬｅｕおよびＶａｌアミノ酸を含有するタンパク質の構造的研究を行うことができる。この化合物を用いた標識化により、アミノ酸ＶａｌおよびＬｅｕの立体特異性を決定することができ、また３０ｋＤａ未満のタンパク質において、０．０５Ｈｚまでの低さの弱い双極子およびスカラー相互作用を検出することもできる。

【0069】

この式１の化合物（２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）−ブタン酸）により、以下の様式で、タンパク質中に組み込まれたアミノ酸ＬｅｕおよびＶａｌを標識化することができる。

【0070】

【化9】

【0071】

この式１の化合物が、３００ｍｇ／ｌのこの式１の化合物を使用した重水素化Ｍ９培地中での大腸菌細胞を用いたヒトユビキチンおよび連鎖球菌のタンパク質Ｇ（ＧＢ３）の生成に使用される場合、これらのタンパク質内でＶａｌおよびＬｅｕのｐｒｏＳメチル基のみがプロトン化され、次いで得られた化合物のＮＭＲ １Ｄスペクトルにおいて観察することができる。

【0072】

式２の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸）により、^１２ＣＨ_３でＬｅｕおよびＶａｌのｐｒｏＲメチル基を立体特異的に標識化することができる。この化合物により、３０ｋＤａ未満のタンパク質において、構造的研究、立体特異的帰属、ならびに弱い双極子およびスカラー相互作用の検出をＮＭＲで行うことができる。

【0073】

化合物２によるこれらのメチル基の立体特異的標識化は、アミノ酸ＬｅｕおよびＶａｌの以下の標識化をもたらす。

【0074】

【化10】

【0075】

この式２の化合物を含有する培地の培養により得られるタンパク質のＮＭＲ １Ｄスペクトルにおいて、ロイシンおよびバリンのｐｒｏＲメチル基、より正確にはバリンのγ１メチル基およびロイシンのδ１メチル基のみを観察することができる。

【0076】

式３の化合物により、^１２ＣＨ_３でＩｌｅのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。この化合物により、３０ｋＤａ未満のタンパク質において、構造的研究、特異的帰属、ならびに弱い双極子およびスカラー相互作用の検出をＮＭＲで行うことができる。

【0077】

式３の化合物（２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸）によるＩｌｅのγ２メチル基の標識化を、以下のスキームに示す。

【0078】

【化11】

【0079】

この化合物により、タンパク質および生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。

【0080】

式４の化合物により、^１３ＣＨ_３でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。

【0081】

式４の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸）によるバリンおよびバリンのｐｒｏＳメチル基の立体特異的標識化を、以下のスキームに示す。

【0082】

【化12】

【0083】

式４の化合物が、３００ｍｇ／Ｌの式４の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で大腸菌細胞を用いて生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ３］^ｐｒｏＳＴＥＴ２）、およびリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）（Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ３］^ｐｒｏＳＭＳＧ）の立体特異的標識化に使用される場合、得られる化合物のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、メチル基の共鳴の半分のみを観察することができることを示す。

【0084】

式５の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸）により、^１３ＣＨ_３でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。

【0085】

この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。

【0086】

この式５の化合物による標識化は、以下のスキームに示されるように標識化されたアミノ酸ロイシンおよびバリンをもたらす。

【0087】

【化13】

【0088】

式５の化合物が、３００ｍｌ／Ｌの式５の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で大腸菌細胞を用いて生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^ｐｒｏＲＴＥＴ２）を得るために使用される場合、得られる化合物のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、２個のメチル基上でプロトン化されるイソバレレートから生成されるＴＥＴ２のスペクトルと比較して、メチル基の共鳴の半分のみを示す。

【0089】

式６の化合物（２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（^１３Ｃ）メチルブタン酸）により、^１３ＣＨ_３でイソロイシンのγ２メチル基を標識化することができる。

【0090】

この化合物により、タンパク質および巨大生体分子集合体の構造的研究を液体ＮＭＲで行うことができる。

【0091】

この化合物は、以下のスキームに示されるように標識化された（Ｌ）−イソロイシンをもたらす。

【0092】

【化14】

【0093】

３００ｍｇ／Ｌの式６の化合物の存在下で重水素化Ｍ９培地中で生成された、４６８ｋＤａの１２量体プロテアーゼであるＴＥＴ２（Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｉｌｅ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^γ２ＴＥＴ２）のメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、イソロイシンのγ２メチル基のみを示す。

【0094】

式７の化合物（Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸）により、タンパク質および巨大生体分子集合体中のバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を、液体ＮＭＲで立体選択的に帰属させることができる。

【0095】

この化合物は、ロイシンおよびバリンの以下の標識化をもたらす。

【0096】

【化15】

【0097】

式８の化合物（Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸）により、タンパク質および巨大生体分子集合体中のバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を、液体ＮＭＲで立体選択的に帰属させることができる。

【0098】

式８の化合物は、タンパク質および生体分子集合体中のロイシンおよびバリンアミノ酸の以下の標識化をもたらす。

【0099】

【化16】

【0100】

式９の化合物（１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸）により、タンパク質および生体分子集合体中のイソロイシンのγ２メチル基を、液体ＮＭＲで帰属させることができる。

【0101】

イソロイシンは、以下に示されるように標識化される。

【0102】

【化17】

【0103】

式１０の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸）により、^１３ＣＤＨ_２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。

【0104】

この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の^２Ｈ動力学的研究に使用することができる。

【0105】

以下のスキームは、アミノ酸ロイシンおよびバリンがこの式１０の化合物で標識化される様式を示している。

【0106】

【化18】

【0107】

式１１の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸）により、^１３ＣＤＨ_２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。

【0108】

この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の^２Ｈ動力学的研究に使用することができる。この化合物は、以下のスキームに示す様式で、アミノ酸ロイシンおよびバリンを標識化する。

【0109】

【化19】

【0110】

式１２の化合物（２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸）により、^１３ＣＤＨ_２でイソロイシンのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。

【0111】

この化合物は、液体ＮＭＲによるタンパク質の^２Ｈ動力学的研究に使用することができる。

【0112】

式１２の化合物は、以下のスキームに示されるように（Ｌ）−イソロイシンを標識化する。

【0113】

【化20】

【0114】

式１３の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸）により、^１３ＣＨＤ_２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を立体特異的に標識化することができる。

【0115】

この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。

【0116】

以下のスキームは、化合物１３がタンパク質中のロイシンおよびバリンを標識化する様式を示す。

【0117】

【化21】

【0118】

式１４の化合物（２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸）により、^１３ＣＨＤ_２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を立体特異的に標識化することができる。

【0119】

この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。

【0120】

この化合物は、以下のスキームに示されるようにロイシンおよびバリンを標識化する。

【0121】

【化22】

【0122】

式１５の化合物（２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸）により、^１３ＣＨＤ_２でタンパク質中のイソロイシンのγ２メチル基を特異的に標識化することができる。

【0123】

この化合物は、タンパク質の固体ＮＭＲ、および液体ＮＭＲによるタンパク質の動力学的研究に使用することができる。

【0124】

この化合物は、以下のスキームに示されるようにイソロイシンを標識化する。

【0125】

【化23】

【0126】

式１６の化合物（Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。

【0127】

この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中のバリンおよびロイシンの炭素鎖を、ならびに^１３ＣＨＤ_２でバリンのｐｒｏＳメチル基（γ２メチル）およびロイシンのｐｒｏＳメチル基（δ２メチル）を標識化することができる。

【0128】

【化24】

【0129】

式１７の化合物（Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。

【0130】

この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中のロイシンおよびバリンの炭素鎖を、ならびに^１３ＣＨＤ_２でバリンのｐｒｏＲメチル基（γ１メチル）およびロイシンのｐｒｏＲメチル基（δ１メチル）を標識化することができる。

【0131】

【化25】

【0132】

式１８の化合物（１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸）は、タンパク質の固体ＮＭＲに使用することができる。

【0133】

この化合物により、以下のスキームに示されるように、タンパク質中の炭素鎖を、および^１３ＣＨＤ_２でイソロイシンのγ２メチル基を標識化することができる。

【0134】

【化26】

【0135】

要約すると、式Ｉのアセトラクテート誘導体のうち、
１）ＮＭＲシグナルの帰属および／または構造的制限の測定により適切な誘導体は、以下の式：
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
を有し、
２）液体ＮＭＲによる動力学的研究、および固体ＮＭＲにおける使用に好ましく使用される誘導体は、以下の式：
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸
の化合物であり、また、
３）^２Ｈ ＮＭＲによる動力学的研究においては、好ましい式Ｉのアセトラクテート誘導体は、以下の式：
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸
を有する。

【0136】

式４の化合物を使用して、ＮＭＲ分光法により３Ｄ構造が決定されている最大モノマータンパク質（８２ｋＤａ）であるリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）に本発明の標識化方法を適用した。

【0137】

本発明の化合物４の存在下で大腸菌で過剰発現した特異的プロトン化ＭＳＧのメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルを、２−オキソ−３−（^２Ｈ_３）−３−（^２Ｈ）−４−（^１３Ｃ）−ケトイソバレレートの存在下で大腸菌で過剰発現したＭＳＧのメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルと比較した。

【0138】

これらのスペクトルの直接比較は、α-ケトイソバレレートを本発明の化合物と置き換えると、ＮＭＲスペクトルの感度が１．６倍（理論的には２倍）増加し、ピーク数が２つ減少することを示している。

【0139】

合成２−（^１３Ｃ）メチル−４−（^２Ｈ_３）−アセトラクテート（式４の化合物）を使用してタンパク質を調製すると、Ｖａｌ−γ_２およびＬｅｕ−δ_２メチル基のシグナルのみを観察することができる。

【0140】

Ｖａｌ−γ_１およびＬｅｕ−δ_１メチル基のシグナルが存在しないことは、２−（Ｓ）−アセトラクテートの２位における^１３Ｃ^１Ｈ_３メチル置換基が、生体内において、ケトール−イソメラーゼにより２，３−ジヒドロキシ−イソバレレートのｐｒｏＳ位に立体特異的に移動すること、また、Ｌｅｕ／Ｖａｌ生合成経路の後続の段階においてメチル相互交換が生じないことを裏付けている。

【0141】

さらに、ＣＨ_２ＤおよびＣＤ_２Ｈアイソトポマーのシグナルは検出されなかったが、これは、Ｍ９／Ｄ_２Ｏ培地へのアセトラクテートの導入後にＨ／Ｄ交換が生じないことを実証している。最後に、他のメチン、メチレンまたはメチル部位へのスクランブリングは検出されなかったが、これは、過剰のアセトラクテートが生体内で他の代謝経路に干渉しないことを示している。

【0142】

したがって、特異的に標識化されたアセトラクテートの使用は、検出可能なスクランブリングなしに、完全に過重水素化されたタンパク質バックグラウンドにおけるＬｅｕおよびＶａｌ側鎖の完全および立体特異的メチル標識化を実現するための効率的な方法である。

【0143】

アセトラクテート誘導体は、他の代謝経路内に組み込まれないため、これらの誘導体は、Ｉｌｅ−［ＣＨ_３］^δ１またはＡｌａ−［ＣＨ_３］^βメチル基の特異的標識化に提案されるもの等の他の前駆体と組み合わせて都合良く使用することができる。

【0144】

この新たな標識化スキームの明らかな第１の用途は、Ｌｅｕ、ＶａｌおよびＩｌｅのメチル基の立体特異的帰属である。

【0145】

メチル共鳴を連続的に帰属された骨格核に関連付けるための効率的な方法が存在するものの、プロキラルメチル基の立体特異的帰属は依然として困難である。従来の手法では、断片的［^１３Ｃ］標識化方法または小さいスカラーカップリングの測定が関与していた。

【0146】

これらの手法は、低分子量および中分子量のタンパク質には有用であることが示されているが、より大きなタンパク質へのその適用は困難である。それと比較して、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅメチル基の立体特異的帰属は、本発明による式４の化合物を用いて生成された特異的プロトン化タンパク質に対して記録された２Ｄメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルを視覚的に調べることにより、直接得ることができる。

【0147】

この方法は、Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル基の９８％が立体特異的に明白に帰属されたＭＳＧ（８２ｋＤａ）に対して実証されるように、巨大タンパク質に直接適用可能である。

【0148】

メチル基の特異的プロトン化は、タンパク質における長距離にわたる距離制限を抽出するための有効な方法である。

【0149】

巨大タンパク質に対して、メチル間ＮＯＥの抽出は、一般に、^１３Ｃ−ｅｄｉｔｅｄ ４Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルの低い固有分解能により妨げられる。

【0150】

本発明の方法によるプロキラルメチル基の立体特異的標識化を使用したスペクトルの単純化は、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｏｖｅｒ Ｈａｕｓｅｒ効果（ＮＯＥ）クロスピークの分析における曖昧さを大きく低減する。

【0151】

ｐｒｏＳおよびｐｒｏＲメチル基の間のＮＯＥは、立体特異的に標識化された試料を用いては検出されない。しかしながら、２−オキソ−３−（^２Ｈ_３）−３−（^２Ｈ）−４−（^１３Ｃ）−ケトイソバレレートの代わりに本発明の化合物４を使用すると、ｐｒｏＳメチル基のプロトン化レベルが理論的に２倍増加し、一方これは残りのＮＯＥクロスピークの強度を理論的に４倍増加させる。

【0152】

この感度の増幅は、より離れたｐｒｏＳメチル基間の構造的に重要な長距離にわたる新たなＮＯＥクロスピークの検出をもたらし、これにより、ｐｒｏＲメチル基が関与するＮＯＥの損失を補償する。

【0153】

４Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルから抽出された距離制限を比較すると、Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル基の立体特異的標識化により、ＮＯＥが検出され得る距離閾値が約２０％増加することが明らかとなった。メチル基のプロキラル特異的標識化は、ＮＯＥ分析の時間を要するステップを単純化するための魅力的な手法であるだけでなく、巨大タンパク質において測定され得る構造的に重要な^１Ｈ−^１Ｈ距離の範囲を大きく拡張させる。

【0154】

本発明の方法はまた、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸の特異的同位体標識化、より具体的には、ＬｅｕおよびＶａｌのメチル基の特異的標識化、ならびにイソロイシンのγ２メチル基の特異的標識化に使用することができる。

【0155】

本発明の別の目的は、以下の式Ｉ−１：

【0156】

【化27】

【0157】

（式中、
Ｘは、溶媒の性質に依存して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）である交換可能な水素であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
のアセトラクテート誘導体である。

【0158】

本発明の好ましい化合物は、式Ｉ−１（式中、
Ｒ^１は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ
の中から選択され、
Ｒ^２は、以下の基：
^１２ＣＨ_３、^１２ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＤ_３、^１３ＣＨＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ、^１２ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１２ＣＤ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＤ_３^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２^１２ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ^１２ＣＤ_２
の中から選択され、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
を有する。

【0159】

本発明の好ましい化合物は、以下の式２〜５７の化合物である。
２＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸、
３＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
８＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１６＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
１８＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
１９＝２−（１’−（^２Ｈ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２０＝２−（（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２３＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２５＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２６＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
２８＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（（^２Ｈ_５）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
２９＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３０＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
３１＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
３２＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３３＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３５＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
３８＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４１＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
４２＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
４３＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
４４＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４８＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
５０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５１＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２）−２’−（^２Ｈ），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５２＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５３＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５４＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２）ブタン酸、
５５＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ）ブタン酸、
５６＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５７＝Ｕ−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ_２））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸。

【0160】

これらの化合物のうち、以下の式の化合物が好ましい。
４＝２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４（^２Ｈ_３）ブタン酸、
５＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタン酸、
６＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸、
９＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２１＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
２２＝１，２，３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
２４＝１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル）−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
３６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、

３７＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸
４０＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^１３Ｃ）メチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４５＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
４６＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（^２Ｈ_５，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸、
４９＝３，４−（^１３Ｃ）−２−（１’−（^２Ｈ_２），^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソブタン酸。

【0161】

しかしながら、さらに他の好ましい化合物は、以下の式を有する。
１３＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１４＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
１５＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_２，^１３Ｃ）ブタン酸、
３４＝２−（１’−（^２Ｈ_２），２’−（^２Ｈ），２’−（^１３Ｃ））エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸。

【0162】

本発明による他の好ましいアセトラクテート誘導体は、以下の式を有する。
１０＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸、
１１＝２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸、
１２＝２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ，^１３Ｃ）ブタン酸。

【0163】

本発明はまた、式１、より具体的には式１〜１８の化合物を製造するための方法であって、
ａ）炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基により、保護基、好ましくはメチルまたはエチル基で保護された１位にヒドロキシル基を有する３−オキソブタノエートをアルキル化するステップと、
ｂ）ステップａ）において得られた化合物をヒドロキシル化するステップと、
ｃ）必要に応じて、脱保護して^２Ｈ原子で所望の^１Ｈ原子を交換するステップと
を含み、
ヒドロキシル化するステップｂ）は、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でジメチルジオキシランを用いることにより行われる方法を提案する。

【0164】

本発明の方法によるヒドロキシル化するステップｂ）により、方法の全収率を９０％超まで改善することができ、一方、先行技術により示唆されるように、このヒドロキシル化ステップを、触媒としてのコバルトまたはセリウムイオンの存在下で酸素分子を用いて行うと、方法の全収率は、他のいずれかのステップが変更されない限り、わずか約５０％である。

【0165】

本発明の標識化方法は、生体分子集合体に含まれるものを含むタンパク質のＮＭＲによる分析に特に適切である。

【0166】

したがって、本発明はまた、ＮＭＲによりタンパク質を分析するための方法を提案する。

【0167】

第１の実施形態において、この方法は、本発明の標識化方法により、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【0168】

第２の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ：

【0169】

【化28】

【0170】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【0171】

第３の実施形態において、この方法は、以下の式Ｉ−１：

【0172】

【化29】

【0173】

（式中、
Ｘは、^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であり、
各Ｙは、互いに独立して^１２Ｃまたは^１３Ｃであり、
Ｒ^１は、炭素原子が^１３Ｃまたは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基であり、
Ｒ^２は、炭素原子が^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるメチル基、または、炭素原子が互いに独立して^１３Ｃもしくは^１２Ｃであり、水素原子が互いに独立して^１Ｈもしくは^２Ｈ（Ｄ）であるエチル基であり、
ただし、
１）式Ｉのアセトラクテート誘導体の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
２）Ｒ^１の水素原子およびＲ^２の水素原子は、同時に全てが^１Ｈまたは^２Ｈ（Ｄ）ではなく、
３）Ｒ^１の全ての水素原子が^２Ｈである場合、式Ｉ−１中の炭素原子は、全て同時に^１２Ｃではない）
の化合物で、分析するタンパク質を標識化するステップを含む。

【0174】

本発明をより良く理解するために、本発明の標識化方法を行う例を以下に示す。この例は、例示のみを目的とし、決して本発明を制限しない。

【実施例】

【0175】

１．選択的メチル標識化アセトラクテートの合成
エチル２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート
エチル３−オキソブタノエート（Ａ）１２．１５ｍＬ（９５．４ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３１４．５ｇ（１０４．９ｍｍｏｌ）およびヨウ化^１３Ｃ−メチル（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．製）１５．０ｇ（１０４．９ｍｍｏｌ）の無水エタノール１２０ｍＬ中の混合物を、アルゴン下で９０時間４０℃に加熱した。濾過後、濾液を真空下で濃縮すると、生成物１２．３０ｇ（収率８９％）が得られたが、これはそれ以上精製することなく使用するのに十分純粋であった。¹H NMR (CDCl₃); 4.21 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.51 (dq, J = 7.2, 4.4 Hz, 1H), 2.25 (s, 3H), 1.35(dd, J = 130.4, 7.2 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
エチル２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート（Ｂ）
新しく調製したジメチルジオキシランにより、ニッケル（ＩＩ）イオンの存在下でヒドロキシル化反応を行った。エチル２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート５０ｍｇ（０．３４５ｍｍｏｌ）の蒸留水３ｍＬ中の混合物に、Ｎｉ（ＯＡｃ）_２．４Ｈ_２Ｏ ８．６ｍｇ（０．０３５ｍｍｏｌ）を、および０℃でジメチルジオキシラン（０．０５〜０．１０Ｍ）のアセトン中の未滴定溶液２０ｍＬを続けて添加した。得られた溶液を室温まで温め、２４時間撹拌した。次いで有機溶媒を真空下で蒸発させ、得られた水性残渣をジクロロメタンで抽出した（４回）。有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空下で濃縮すると、エチル２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート５１ｍｇ（０．３１７ｍｍｏｌ、収率９２％、変換率＞９０％）が無色液体として得られたが、これはそれ以上精製せずに使用するのに十分純粋であった。
NMR分光法:¹H NMR (CDCl₃); 4.25(q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.27 (s, 3H), 1.58 (d, ¹J_H-13C = 130.3 Hz, 3H), 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）−ブタノエート（または２−（^１３Ｃ）メチル−４−（^２Ｈ_３）−アセトラクテート）（式４の化合物）
エチル２−ヒドロキシ−２−（^１３Ｃ）メチル−３−オキソブタノエート（Ｂ）の４位のメチル基の脱保護およびプロトン交換を、ｐＨ１３のＤ_２Ｏ中で達成した。典型的には、３００ｍｇのＢを０．１Ｍ ＮａＯＤ／Ｄ_２Ｏ溶液２４ｍＬに添加した。脱保護は、ＮＭＲ分光法で観察されるように、即時的であった。４−メチルに対する交換の完了もまた、ＮＭＲ分光法によりリアルタイムで追跡した。末端メチル基の９７±１％のプロトンが、３０分後に交換され、一方２位のメチル置換基が、９８±１％のレベルでプロトン化されたままであった。脱保護反応は水酸化物イオンを消費するため、ｐＨ、ひいては重水素交換率は反応中に減少する。交換が完了したら、溶液をＤＣｌで中性ｐＨに調節し、Ｄ_２Ｏ中の１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８）２ｍＬを添加した。次いで、式４の化合物の溶液を、必要となるまで−２０℃で保存した。

【0176】

【化30】

【0177】

２−（^１３Ｃ）メチル−４−（^２Ｈ_３）−アセトラクテートの化学合成のための詳細なプロトコルを上に示す。^１３Ｃ核は、イタリック体の太字で示されている。アセトラクテートに^１３Ｃ^１Ｈ_３基を組み込んだ後の、Ｌｅｕ／Ｖａｌ生合成経路の異なる中間体における立体化学が図に示されている（Ｍ９／Ｄ_２Ｏ系培地中での成長を想定）。各生合成中間体は、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）に従い命名されている。反応の触媒を担う酵素は、ＥＣ番号で示されている。ＥＣ１．１．１．８６：ケトール酸リダクトイソメラーゼ、ＥＣ４．２．１．９：ジヒドロキシ酸脱水酵素、ＥＣ２．６．１．４２：分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、ＥＣ２．３．３．１３：２−イソプロピルマレートシンターゼ、ＥＣ４．２．１．３３：３−イソプロピルマレート脱水酵素、ＥＣ１．１．１．８５：３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ。Ｌｅｕ／Ｖａｌ代謝経路に関するさらなる情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／でオンラインで見出すことができる。
２．大腸菌におけるメチル立体特異的標識化タンパク質の過剰発現
過剰発現タンパク質へのアセトラクテートの組込みの最適化
ユビキチンをモデル系として使用して、過剰発現タンパク質へのアセトラクテートの組込みレベルを決定するための初期実験を行った。ヒトＨｉｓタグユビキチン（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）遺伝子を有するｐＥＴ４１ｃプラスミドで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換し、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＵ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１３Ｃ］，グルコースを含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地中で形質転換細胞を成長させた。６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．８に達したら、未標識化アセトラクテートを含有する溶液を添加した。さらに１時間後、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導した。誘導は、３７℃で３時間行った。Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社製）クロマトグラフィーによりユビキチンを一段階で精製した。

【0178】

過剰発現タンパク質へのほぼ完全な組込みを達成するために必要なアセトラクテートの最適量を、異なる量の非標識化前駆体が０、１００、２００、３００および８００ｍｇ／Ｌの最終濃度まで誘導の１時間前に添加された一連の培地（それぞれ９０ｍＬ）中で算定した。精製タンパク質への組込みレベルを、直接検出^１３Ｃ １Ｄ ＮＭＲにより監視した。過剰発現タンパク質に前駆体が組み込まれると、^１３Ｃ−Ｌ、Ｖ残基は、^１２Ｃ側鎖を有するアミノ酸により置き換えられる。定量化は、４つの分離されたＬｅｕ／Ｖａｌメチル共鳴（１９〜２１ｐｐｍ）のシグナルの積分値を、Ｉｌｅ、Ａｌａ（９〜１９ｐｐｍの間）のメチル基のシグナルに対して比較することにより行った。Ｍ９／Ｄ_２Ｏ培地１リットル当たり純粋アセトラクテート３００ｍｇを添加することにより、他のアミノ酸生合成経路への検出可能なスクランブリングなしに、Ｌｅｕ／Ｖａｌ側鎖への９５％の組込みレベルが達成される。
Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^ｐｒｏＳタンパク質の生成
過剰発現タンパク質（ＴＥＴ２またはＭＳＧ）のプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ_７（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地に、２４時間にわたり３段階で徐々に馴化した。最終的培養において、９９．８５％Ｄ_２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ社製）で調製したＭ９培地中で細菌を３７℃で成長させた。Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．８に達したら、２−（^１３Ｃ）メチル−４−（^２Ｈ_３）−アセトラクテート（式４の化合物）を含有する溶液（上述のプロトコルを用いて調製）を添加した。３００ｍｇ／Ｌの最終濃度までアセトラクテートを培地に添加した。１時間後、１ｍＭ（／０．１ｍＭ）の最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりＴＥＴ２（／ＭＳＧ）発現を誘導した。採取前に、３７℃（／２０℃）で３時間（／１２時間）発現を行った。ＭＳＧに対して、６００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ_２Ｏ中３７℃で^１３Ｃスペクトルを記録した。^１３ＣスペクトルにおいてＬｅｕおよびＶａｌメチル炭素のシグナルのみが観察されたが、これは、アセトラクテートの^１３Ｃ^１Ｈ_３基が他のアミノ酸の代謝経路内に組み込まれなかったことを示している。
Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｉｌｅ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^γ２タンパク質の生成
過剰発現タンパク質（ＴＥＴ２またはＭＳＧ）のプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ_７（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地に、２４時間にわたり３段階で徐々に馴化した。最終的培養において、９９．８５％Ｄ_２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐ社製）で調製したＭ９培地中で細菌を３７℃で成長させた。Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．８に達したら、２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４（^１３Ｃ）ブタノエート（式６の化合物）を含有する溶液（上述のプロトコルを用いて調製）を添加した。３００ｍｇ／Ｌの最終濃度まで生成物を培地に添加した。１時間後、１ｍＭ（／０．１ｍＭ）の最終濃度までＩＰＴＧを添加することによりＴＥＴ２（／ＭＳＧ）発現を誘導した。採取前に、３７℃（／２０℃）で３時間（／１２時間）発現を行った。
Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３，^１２Ｃ^２Ｈ_３］タンパク質の生成
比較を目的として、ＬｅｕおよびＶａｌメチル基を非立体特異的に^１３Ｃ^１Ｈ標識化した過重水素化タンパク質の生成を、本発明の前に使用されていたプロトコル、すなわち、Ｖ．Ｔｕｇａｒｉｎｏｖら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ２００４、２８、１６５〜１７２頁およびＲ．Ｌｉｃｈｔｅｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４、１２６、５３４８〜５３４９頁に記載のプロトコルを使用して達成した。

【0179】

このプロトコルは、上述のプロトコルであるが、誘導の１時間前に、３００ｍｇ／Ｌの標識化アセトラクテート（式４の化合物）の代わりに、１２５ｍｇ／Ｌの３−（^２Ｈ_３）メチル−３−（^２Ｈ）−４−（^１３Ｃ）−ケトイソバレレート（Ｉｓｏｔｅｃ社製）を添加した。
Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｕ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^ｐｒｏＳ−Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ｕ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］−Ａｌａタンパク質の生成
上述の一般的プロトコルを使用して、Ｌｅｕ／Ｖａｌ ｐｒｏＳメチル基およびＡｌａ位を立体特異的に^１３Ｃ^１Ｈ標識化した過重水素化タンパク質の生成を達成したが、誘導の１時間前に、３００ｍｇ／Ｌの標識化アセトラクテート（式４の化合物）と共に、８００ｍｇ／Ｌの２−（Ｓ）−２−（^２Ｈ）−３−（^１３Ｃ）−アラニン（ＣｏｒｔｅｃＮｅｔ社製）を添加した。８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ_２Ｏ中３７℃で２Ｄ^１３Ｃ−メチルＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。アラニンメチル基ならびにＬｅｕおよびＶａｌ側鎖のｐｒｏＳメチル基の予測されるシグナルに対応するピークのみが観察されたが、これは、アセトラクテート誘導体を使用した標識化が他のメチル標識化プロセスに干渉しないことを示している。
タンパク質精製
最初にキレート化セファロースクロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）により、続いてゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によりリンゴ酸シンターゼＧ（ＭＳＧ）を精製した。精製後の典型的な最終収率は、６０〜８０ｍｇ／Ｌのメチル特異的プロトン化ＭＳＧであった。典型的なＮＭＲ試料中のＭＳＧの濃度は、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ７．０、非補正）、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＤＴＴを含有する１００％Ｄ_２Ｏ緩衝液中１ｍＭであった。ＮＭＲデータは、３７℃で取得した。

【0180】

２つの陰イオン交換クロマトグラフィーステップ（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、およびＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ ６ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を使用し、続いてゲル濾過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ ＨＲ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によりＴＥＴ２を精製した。精製後の典型的な最終収率は、２０ｍｇ／Ｌのメチル特異的プロトン化ＴＥＴ２であった。このようにして調製された試料は、完全に活性であることが実証された（Ｌｅｕ−４−ニトロアニリドを使用した加水分解活性により測定）。ＴＥＴの最終ＮＭＲ試料は、Ｄ_２Ｏ３００μＬに溶解した２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４、非補正）、２０ｍＭのＮａＣｌ中の約８０μＭのＴＥＴ２ １２量体（約１ｍＭのモノマー）からなっていた。ＮＭＲデータは、５０℃で取得した。
３．ＮＭＲ分光法
実験の詳細
ユビキチンおよびＭＳＧの全ての^１Ｈおよび^１３Ｃ １Ｄ ＮＭＲスペクトルは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、６００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。

【0181】

２Ｄメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。ＭＳＧ（／ＴＥＴ２）の^１Ｈ−^１３Ｃ ＨＭＱＣは、直接次元（最大ｔ_２＝９９ｍｓ（／６０ｍｓ））において１２８８（／７８０）の複合データポイントで、および炭素次元（最大ｔ_１＝１２８ｍｓ（／４７ｍｓ））において５１２（／３８０）のポイントで記録した。

【0182】

４Ｄ ＨＭＱＣ−ＮＯＥＳＹ−ＨＭＱＣ実験データは、極低温三重共鳴パルス場勾配プローブヘッドを備えた、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＶａｒｉａｎ ＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光器で記録した。データは、３００ｍｓのＮＯＥ混合時間で、９６時間のＭＳＧの１ｍＭ試料で取得した。実験データは、間接^１Ｈ次元（最大ｔ_１＝３０ｍｓ）において２０の複合ポイント、第１および第２の炭素次元（最大ｔ_２＝２１ｍｓおよびｔ_３＝１１ｍｓ）において３６および１８の複合ポイント、ならびに直接次元（最大ｔ_４＝８０ｍｓ）において２０１の複合ポイント、また増分当たり４スキャンで収集した。全てのデータは、ｎｍｒＰｉｐｅ／ｎｍｒＤｒａｗおよびＮＭＲＶｉｅｗを使用して処理および分析した。距離は、Ｓｏｕｎｉｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７、１２９、４７２〜４７３頁に記載のように、メチル特異的プロトン化タンパク質における離れたプロトン間のＮＯＥの完全緩和行列解析を用いて定量化した。
Ｌｅｕ／Ｖａｌメチル特異的標識化ＴＥＴ２試料（４６８ｋＤａ）に対して記録されたメチル−ＴＲＯＳＹスペクトルの比較
３−（^２Ｈ_３）メチル−３−（^２Ｈ）−４−（^１３Ｃ）−ケトイソバレレートを使用して調製された、非立体特異的に［^１３Ｃ^１Ｈ_３］−メチル標識化したＵ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１２Ｃ^２Ｈ_３，^１３Ｃ^１Ｈ_３］ＴＥＴ２に対して、および２−（^１３Ｃ）メチル−４−（^２Ｈ_３）−アセトラクテート（式４の化合物）を使用して調製された、立体特異的に標識化したＵ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１２Ｃ］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］^ｐｒｏＳＴＥＴ２に対して、８００ＭＨｚのプロトン周波数で動作するＮＭＲ分光器で、Ｄ_２Ｏ中５０℃で２Ｄ^１３Ｃ−メチルＴＲＯＳＹスペクトルを記録した。非立体特異的標識化スキームを使用したＴＥＴ２集合体の調製では、アマスタチン誘導化学シフト変化の観察を大きく妨げるであろう相当量のクロスピーク重複を有するスペクトルが得られた（アマスタチンは、ＴＥＴ２の阻害剤である）。