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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】5753334
(24)【登録日】2015年5月29日
(45)【発行日】2015年7月22日
(54)【発明の名称】検出用に核酸を調製する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20060101AFI20150702BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20150702BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20150702BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 A
C12M1/00 A
C12N15/00 A
C12N15/00 F
【請求項の数】1
【全頁数】17
(21)【出願番号】特願2006-539673(P2006-539673)
(86)(22)【出願日】2004年11月4日
(65)【公表番号】特表2007-510430(P2007-510430A)
(43)【公表日】2007年4月26日
(86)【国際出願番号】US2004036959
(87)【国際公開番号】WO2005047855
(87)【国際公開日】20050526
【審査請求日】2007年11月5日
【審判番号】不服2012-9759(P2012-9759/J1)
【審判請求日】2012年5月25日
(31)【優先権主張番号】10/703,368
(32)【優先日】2003年11月7日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506154915
【氏名又は名称】ナノスフィア，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094112
【弁理士】
【氏名又は名称】岡部 讓
(74)【代理人】
【識別番号】100128657
【弁理士】
【氏名又は名称】三山 勝巳
(72)【発明者】
【氏名】パトノ，ティモシイ
(72)【発明者】
【氏名】ホーレンスタイン，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】クロンシャゲ，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】クオーリイ，クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ウエバー，マーク
(72)【発明者】
【氏名】ウエストバーグ，トム
(72)【発明者】
【氏名】コーク，ウィリアム
【合議体】
【審判長】
中島 庸子
【審判官】
高堀 栄二
【審判官】
今村 玲英子
(56)【参考文献】
【文献】
独国特許出願公開第１９９２８４１０（ＤＥ，Ａ１）
【文献】
国際公開第０３／０３５８２９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第０３／０４８２９５（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第０１／５９４４０（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
国際公開第０２／１８８２３（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
特開２０００−０８３６４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００３−１２１３１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００３−２２７８２７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
C12N15/00-15/90
C12Q1/68
C12M1/00-3/10
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
所定の標的核酸を検出することを目的としてテスト・サンプルを調製する方法であって、
ナノ粒子に付着されているオリゴヌクレオチドを含むテスト・プローブを用意する工程と、
前記テスト・サンプルおよび前記テスト・プローブを含むハイブリッド形成ユニットを用意する工程であって、前記ハイブリッド形成ユニットは、さらに、標的サンプル基板および前記基板の第１の面に結合された分配多岐管を備える、工程と、
処理流体源多岐管を前記ハイブリッド形成ユニットの前記分配多岐管に固定する工程と、
前記テスト・サンプルを変性する工程と、
前記所定の標的核酸を検出するために前記テスト・サンプルを調製する工程であって、前記処理流体源多岐管と分配多岐管との間に複数の処理流体をポンプで送り込み、前記テスト・プローブおよび所定の標的核酸のハイブリッドを前記標的サンプル基板に形成し、前記ハイブリッド形成されたサンプルを洗浄し、前記ハイブリッド形成されたサンプルの検出可能なパラメータを増幅することにより、調製する工程とを含む方法。
ナノ粒子に付着されているオリゴヌクレオチドを含むテスト・プローブを用意する工程と、
前記テスト・サンプルおよび前記テスト・プローブを含むハイブリッド形成ユニットを用意する工程であって、前記ハイブリッド形成ユニットは、さらに、標的サンプル基板および前記基板の第１の面に結合された分配多岐管を備える、工程と、
処理流体源多岐管を前記ハイブリッド形成ユニットの前記分配多岐管に固定する工程と、
前記テスト・サンプルを変性する工程と、
前記所定の標的核酸を検出するために前記テスト・サンプルを調製する工程であって、前記処理流体源多岐管と分配多岐管との間に複数の処理流体をポンプで送り込み、前記テスト・プローブおよび所定の標的核酸のハイブリッドを前記標的サンプル基板に形成し、前記ハイブリッド形成されたサンプルを洗浄し、前記ハイブリッド形成されたサンプルの検出可能なパラメータを増幅することにより、調製する工程とを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野は、動物実験に関するものであり、また特に核酸を検出することに関する。
【背景技術】
【0002】
核酸を検出する方法は、一般に知られている。実際、特定の核酸配列を検出するために利用できる方法は多数ある。
【0003】
知られている方法は、電気泳動法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス、さまざまなハイブリッド形成技術、および多数の他の技術に基づく方法を含む。これらの方法は効果的ではあるが、すべて時間のかかるものであり、また費用も高くつき、人間が無視できない誤りを犯した場合にその影響を受けやすい。
【0004】
例えば、ある製造者は、サンプルをチップにハイブリッド形成し、その後チップの染色を行うマイクロ流体システムを製造している。ハイブリッド形成プロセスは、約１２時間を要する。染色が完了するまでに約１．５時間を要する。
【0005】
他の供給者は、一塩基多型（ＳＮＰ）に依拠するシステムを提供する。このシステムは、アッセイを何回も実行するためにマイクロチップを使用する。プローブがカートリッジに追加され、粒子は電界内の電荷に基づいて移動する。検出システムは、サンプルＤＮＡとのハイブリッド形成の後、カートリッジを分析するために使用することができる。
【0006】
さらに他の供給者は、ＰＣＲ増幅とＤＮＡ検出の機能を１つのプロセスにまとめたＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒと呼ばれるデバイスを提供する。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒは、検出に２つのプロセスのうちの１つを使用することができる。第１のプロセスは、ＰＣＲおよびハイブリッド形成に依拠する。第２のプロセスは、ＰＣＲおよび染料および融解曲線解析に依拠する。【特許文献1】米国特許第６，４１７，３４０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
核酸を検出し、核酸の配列を決定する確実な方法を策定することが、遺伝病、細菌性の病気、およびウイルス性の病気の診断に欠かせない。保健医療および疾病予防が重要であるため、核酸を同定するための迅速で安価な方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
所定の標的核酸を検出するためにテスト・サンプルを調製する方法および装置を提供する。この方法は、ナノ粒子に付着されたオリゴヌクレオチドを含むテスト・プローブを用意する工程と、テスト・サンプルおよびテスト・プローブを含むハイブリッド形成ユニットを用意する工程を含み、前記ハイブリッド形成ユニットは、さらに、標的サンプル基板およびその基板の第１の面に結合された分配多岐管を含む。この方法は、さらに、処理流体多岐管をハイブリッド形成ユニットの分配多岐管に固定し、テスト・サンプルを変性させ、ポンプで複数の処理流体を処理流体源多岐管と分配多岐管との間に供給してテスト・プローブおよび所定の標的核酸を標的サンプル基板にハイブリッド形成し、ハイブリッド形成されたサンプルを洗浄し、ハイブリッド形成されたサンプルの検出可能パラメータを増幅することにより所定の標的核酸を検出するためにテスト・サンプルを調製する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【0009】
図１は、概して本発明の例示されている一実施形態に従って示されている、核酸検出システム１０の斜視図である。処理システム１０は、多数の所定の標的核酸のどれかを検出するために使用することができる。実際、どのような種類の核酸でも検出することができ、これらの方法は、疾病の診断および核酸の配列決定に使用することができる。本発明の方法により検出できる核酸の例は、遺伝子（例えば、特定の疾病に関連する遺伝子）、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、カビのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、単鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸などを含む。核酸を検出する方法の使用例は、ウイルス性の病気（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペス・ウイルス、サイトメガロ・ウイルス、およびエプスタイン−バー・ウイルス）、細菌性の病気（例えば、結核、ライム病、ヘリコバクター・ピロリ、大腸菌感染、レジオネラ菌感染症、マイコミコプラズマ感染症、サルモネラ感染症）、性感染症（例えば、淋病）、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症、デュシェーヌ型筋ジストロフィー、フェニールケトン尿症、鎌状赤血球貧血）、および癌（例えば、癌発症に関連する遺伝子）の診断および／またはモニタリング、科学捜査での使用、ＤＮＡ塩基配列決定での使用、親子鑑定での使用、細胞株認証での使用、遺伝子治療のモニタリングでの使用、および他の多くの目的のための使用を含む。
【0010】
システム１０には、サンプル処理システム１２およびサンプル処理システム１２により自動的に調製されたサンプルを読み取るための光学式読取装置１４を含めることができる。光学式読取装置１４は、イリノイ州ノースブルックのＮａｎｏｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．社製のモデルＶｅｒｉｇｅｎｅ ＩＤ（商標）としてよい。
【0011】
サンプル処理システム１２は、コントローラ３００、および処理溶液およびサンプルの保管および取り扱いに使用される多数の機能的に異なる要素を含むことができる。例えば、処理システム１２は、１つまたは複数の取り外し可能なハイブリッド形成ユニット２０を含むことができる。ハイブリッド形成ユニット２０は、所定の（複数）標的核酸を検出するために処理容器として処理システム１２により使用することができる。
【0012】
検出システム１０は、検出用に核酸を調製するために多数の処理溶液を必要とする場合もある。例えば、処理システム１２は、１つまたは複数のプローブ２２およびハイブリッド形成緩衝流体（溶液）２４を含むことができる。さらに、洗浄溶液、滅菌水、１つまたは複数の増幅液（例えば、銀部Ａ、銀部Ｂなど）、および停止液を含む処理流体パッケージ１８を用意できる。
【0013】
ハイブリッド形成ユニット２０（図２）は、少なくとも３つの機能的に分離された部分を含むことができる。光透過性ガラスの標的サンプル基板４２は、所定の核酸を処理するための基盤として用意できる。基板に接触し、基板４２およびシリコーンガスケット５８とともにハイブリッド形成ユニット２０に処理溶液を流すことができる室と通路を定める分配多岐管４４を用意できる。最後に、基板４２を支える基部４０が用意される。
【0014】
多岐管４４は、それぞれそれと相補的な基板上の一組のペグ５４と弾力的に係合する一組の開口５６を含む向かい合う面にフランジ４３、４５を備えることができる。ペグ５４の係合面にテーパーを付け、これにより、フランジをペグ５４上に弾力的に広げ、開口５６をペグ５４に係合させることができる。シリコーンガスケット５８（多岐管４４の係合面に用意される）により、多岐管は、基板４２と弾力的に係合し、ハイブリッド形成ユニット２０の室および通路の周りをしっかり閉じることができる。
【0015】
図３は、多岐管４４の簡略化された図である。図４は、シリコーンガスケット５８を示す図である。
【0016】
図３および４に示されているように、それぞれのハイブリッド形成ユニット２０は、４つのサンプル処理領域１００、１０２、１０４、１０６を含むことができる。それぞれの処理領域１００、１０２、１０４、１０６は、ハイブリッド形成ゾーン１４０、１４２、１４４、１４６、関連するサンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４、それぞれのハイブリッド形成ゾーン１４０、１４２、１４４、１４６および相互接続通路（図４のガスケット内に配置されていることが示されている）に関連付けられている３つの処理ポート１１６、１１８、１２０；１２２、１２４、１２６；１２８、１３０、１３２；１３４、１３６、１３８を含むことができる。
【0017】
図４は、サンプル処理と併せて使用できる一定範囲のガスケット深さを示している。ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６内のハイブリッド形成要素間の流体混合および相互作用を最大にしつつ流路内の流体抵抗を最小にするために、さまざまな深さを使用できることに留意されたい。
【0018】
特定の核酸のテストの準備をするために、第１のオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの第１のグループ４６、４８、５０、５２を第１の所定の遺伝子配列とともに、基板４２上で各ハイブリッド形成ゾーン１４０、１４２、１４４、１４６内に配置することができる。第１のオリゴヌクレオチド４６、４８、５０、５２は、所定の標的核酸の遺伝子配列の第１の部分に相補的な遺伝子配列を持つことができる。
【0019】
プローブ２２は、第２の所定の遺伝子配列の第２のオリゴヌクレオチドの１つまたは複数の鎖がナノ粒子に付着されているナノ粒子で構成することができる。本発明を実施するうえで有用なナノ粒子は、金属（例えば、金、銀、銅、および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳでコーティングされたＣｄＳまたはＣｄＳｅ）、および磁性（例えば、強磁性）コロイド状材料を含むことができる。本発明を実施するうえで有用な他のナノ粒子は、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓを含む。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５ｎｍから約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約５から５０ｎｍ、最も好ましくは約１０から約３０ｎｍである。
【0020】
ナノ粒子、第２のオリゴヌクレオチドまたはその両方は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に接続するために機能化されている。このような方法は、当業では知られている。例えば、３‘末端または５’末端のところでアルカンチオールにより機能化されているオリゴヌクレオチドは容易に金ナノ粒子に付着する。
【0021】
第２のオリゴヌクレオチドは、所定の標的核酸の遺伝子配列の第２の部分に相補的な配列を持つことができる。第１および第２のオリゴヌクレオチドの調製およびそれぞれの粒子および基板への付着は、一般に、本発明の譲受人に譲渡され参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６，４１７，３４０号で説明されているように行うことができる。
【0022】
一般に、テスト・プローブおよびテスト・サンプル（所定の標的核酸を含む場合もあれば含まない場合もある）およびハイブリッド化流体は、サンプル・ウェル内で混合することができる。混合液は、変性され、ハイブリッド化室に通される。変性は、知られているプロセス（例えば、熱、化学薬品など）を使用して行うことができる。
【0023】
ハイブリッド化室内において、テスト・プローブおよび所定の核酸は、第１のオリゴヌクレオチドとハイブリッドを形成することができる。ハイブリッド形成された材料の光学特性は、増強しうる（例えば、銀溶液をハイブリッドのナノ粒子にメッキする）。増強した後、ハイブリッド形成された材料は、光学式読取装置１４内で光学的に検出することができる。この場合、銀溶液をハイブリッドの金ナノ粒子にメッキすることで、ハイブリッドの光反射が増幅される。その後、光反射率を閾値と比較することにより、標的核酸の存在を確認することができる。
【0024】
それとは別に、検出可能なパラメータは抵抗であってよい。この場合、ハイブリッドの金ナノ粒子にメッキされた銀は、ハイブリッドを通る電流路を増幅する。その後、この抵抗を閾値と比較することにより、標的核酸の存在を確認することができる。
【0025】
次に、サンプル処理システム１４の動作に注目し、コントローラ３００およびコントローラ３００とハイブリッド形成ユニット２０との相互作用について説明する。この点で、図５は、コントローラ３００、およびハイブリッド形成ユニット２０内の処理サンプルにおけるサンプル処理システム１２により使用されるさまざまな作動要素を示している。
【0026】
図５の右側にそって、「サンプル・ウェル、Ｂ、Ａ、Ｃ」と記されている一組のポートが示されている。「サンプル・ウェル」という参照は、図３内の大きなポート１０８、１１０、１１２、１１４を指すために使用される。同様に、ポートＢは、小さなポート１１６、１２６、１２８、１３８を参照するために使用され、ポートＡは、ポート１１８、１２４、１３０、１３６を指すために使用され、ポートＣは、ポート１２０、１２２、１３２、１３４を指すために使用されることができる。
【0027】
サンプル処理領域１００、１０２、１０４、１０６内のサンプルの処理は、実質的に同一であると想定することができる。この点で、処理はそれぞれのサンプル処理領域１００、１０２、１０４、１０６について実質的に同じであってよいが、検出される標的核酸は、４つの領域１００、１０２、１０４、１０６のそれぞれの中で異なる場合があることに留意されたい。
【0028】
図５に示されているように、サンプル処理システム１２は、多数のポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、および真空源３１４を含むことができる。ポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２は任意の形態のものが使用できるが、以下の説明から明らかになる理由により、シリンジ・ポンプなどの容積移送式ポンプを使用することができると考えられる。
【0029】
シリンジ・ポンプは、シリンジ本体とリニア・アクチュエータを備えることができる。リニア・アクチュエータは、正確に制御された速度で充填し空にするように、コントローラ３００によりプログラムすることができる。
【0030】
ポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２の間の流体の経路は、多数の複数ポート弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６により制御することができる。ポートはいくつでも使用できるが、図５に示されている４ポート弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６は、後述の目的のために特によく適合されていると考えられる。
【0031】
この点で、弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６は１〜４のラベルが付けられたポートを持つことができる。弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６内のスプールにより、２つの対向するポートを合わせて接続できる（例えば、ポート１をポート３に接続することができるか、またはポート２をポート４に接続することができる）。
【0032】
シリンジ・ポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２とともに使用した場合、複数ポート弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６により、処理のそれぞれの段階で正確な量の選択された流体を移送することができる。例えば、接続されている（図５に示されているように）弁３２２のポート１および３では、シリンジ・ポンプ３０８は、ポンプ・サイクルの充填部分で、水容器３３４から正確な量の水を引き出すことができる。その後、複数ポート弁３２２は、ポート２および４を接続するように作動させることができる。シリンジ・ポンプ３０８にすでに引き込まれている水は、弁３２２のポート４を通じて放出され、ハイブリッド形成ユニット２０のポートＡに送り込まれるようにすることができる。
【0033】
いくつかのアプリケーションでは、弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６および容器３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８は必要でない場合があることに留意されたい。例えば、弁および容器は、それぞれの機能に対する全流量がシリンジ・ポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０の容量よりも小さい場合には必要ないであろう。このような場合、シリンジ・ポンプは、それぞれのテスト手順の実行後、またはそれぞれのテスト手順を複数回実行した後、単純に置き換えることができる。
【0034】
図２１は、本発明のさらに好ましい実施形態によるサンプル処理の流体流を例示している。図２１の実施例では、流体制御は、指定された経路で流体を送るために入口および出口ポート上でポンプを使用することにより弁を使用することなく維持される。
【0035】
ポンプ１では流体を導入し、ポンプ２では流体を引き出すだけにすることにより、流体をハイブリッド形成室および流路Ａに流すことができる。流体は、さらに、その流路用の制御ポンプ（２、３、４、または５）を作動させることにより並列に複数の経路で送ることもできる。並列流体処理は、洗浄およびすすぎの工程など高耐性ポンプ動作を必要としないときに、処理時間を短縮するために使用することができる。
【0036】
入口側の他の追加のポンプ（図２１に示されていない）は、追加の流体を送る。８つの特定の流体用に８つの入口ポンプがある図２１に示されているようなシステムは、さまざまな核酸テストを実行することができる。テストのタイプは、さまざまな流体を８つのポンプ室からの流路内に挿入することにより選択することができる。
【0037】
ユーザによってサンプル・ウェル内に挿入された流体にアクセスする場合も、（複数の）出口ポンプを引くだけである。サンプル・ウェルは、所望の特定の流路および出口ポンプに対する特定のサンプル・ウェルからのみ優先的に標的サンプルが流れ出るように簡単につぶれ、流れを阻止する設計となっている。
【0038】
図６〜１６は、所定の核酸を検出する際に使用できるプロセス工程を示している。例えば、図６のフレーム１は、試薬カートリッジ１８および廃液容器１６を備える予備工程を示している。フレーム２は、カートリッジ１６、１８をサンプル処理システム１２内にロードすることを示している。フレーム３は、ドアを閉じることを示しており、ドアを閉じると一組の接続金具が試薬および廃液容器上のシールを破るという事実を指している。それとは別に、またはそれに加えて、ドアを閉じることで、コントローラに信号が送られ、それにより、処理のため（複数の）流体を供給するポンプを係合するリニア・アクチュエータを制御する。バーコード・リーダー３４０を備えることにより、試薬カートリッジ上のバーコードを読み取り、正しい試薬カートリッジが挿入されていることを自動的に確認するようにすることができる。
【0039】
図７は、ハイブリッド形成ユニット２０の準備を示している。フレーム１は、ユーザが４つのサンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４を覆っている一組の蓋を開ける動作を示している。その後、ユーザは、フレーム２に示されているように、ハイブリッド形成緩衝液をピペットで取り４つのウェル１０８、１１０、１１２、１１４内に入れる。次いで、ユーザは、フレーム３に示されているように、プローブ２４をピペットで取り４つのウェル１０８、１１０、１１２、１１４内に入れる。第４工程として、ユーザは、フレーム４に示されているように、所定の標的核酸を含む可能性のあるサンプルをピペットで取り、ウェル１０８、１１０、１１２、１１４に入れる。最後に、ユーザは、フレーム５に示されているように、ウェル１０８、１１０、１１２、１１４上の蓋を閉じる。それとは別に、ユーザは、所定の標的核酸のみをサンプル・ウェル内に入れるか、または所定の標的核酸とハイブリッド形成緩衝液または所定の標的核酸およびプローブをサンプル・ウェル内に入れることができる。
【0040】
図８は、ハイブリッド形成ユニット２０を準備し、サンプル処理システムの１２内にロードすることを示している。第１工程として、図８のフレーム１に示されているように、ユーザは、バーコード・リーダー３４０を使用して、システム１２に対してハイブリッド形成ユニット２０を同定することができる。それとは別に、バーコード・リーダーをシステムのロード・ドアの内側に埋め込むことができ、バーコードを、ハイブリッド形成ユニットがシステム内にロードされているときに読み取ることができる。
【0041】
ハイブリッド形成ユニット２０をロードするには、ユーザは、サンプル処理システム１２のドアを開ける。処理システム１２の流体多岐管７２から出る流体を捕捉するバネ式リセプタクルは、図８のフレーム２に示されているように完全前進位置まで延びていることがわかる。その後、ユーザは、フレーム３に示されているように、ハイブリッド形成ユニット２０をサンプル処理システム１２内に押し込んでから、ドアを閉じる（フレーム４）。
【0042】
サンプル処理システム１２の起動は、ドアを閉じるか、またはＳＴＡＲＴボタン３４２を作動することにより生じる。いずれの場合も、システム１２が起動すると、ハイブリッド形成ユニット２０は持ち上がって処理流体多岐管７２と接触し、加熱／冷却ブロック６０は持ち上がってハイブリッド形成ユニット２０に接触する。ハイブリッド形成ユニット２０および加熱／冷却ブロック６０は、ドアに接続されている単純な機械的リンク機構により、または昇降機アセンブリに結合されているリニア・アクチュエータを通じて持ち上げられる。
【0043】
ハイブリッド形成ユニット２０が持ち上がると、ハイブリッド形成ユニット２０のポート１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８と処理流体多岐管７２のそれぞれのポートの間の、および図２１のポンプ１〜７と、またはそれぞれの弁３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６と、および図５のサンプル処理システム１２のポンプ３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４との接続が生じ、流体が移動するようになる。同様に、加熱／冷却ブロック６０が持ち上がると、ハイブリッド形成ユニット２０と加熱／冷却ブロック６０との間が接続し、熱が伝達するようになる。
【0044】
図９は、サンプル処理システム１２により実行される予備的処理工程４００（図１６）を示している。図に示されているように、加熱／冷却ブロック６０の第１の加熱要素６２および第２の加熱要素７０は、サンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４に接続して、それらを所定の標的核酸のサンプルを変性する温度（例えば、９５℃）に加熱する。本明細書で使用されているように、変性とは、核酸の三次構造を展開することを意味する。
【0045】
第１の冷却要素６４および第２の冷却要素６８は、変性サンプルがサンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４からハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に移送されるときに変性サンプルを冷却する機能を持つ。第３の加熱要素６６は、ハイブリッド形成の指定された温度（例えば、４０℃）にサンプルを加熱するためにハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に隣接して配置される。
【0046】
図１０のフレーム１は、サンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４内のサンプルを変性温度（例えば、９５℃）に加熱することを示している。図１０のフレーム２は、冷却ゾーンを通してサンプルをハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に移送することによるサンプルのロード４０２を示している。サンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４からのサンプルの移送は、図５に示されている位置にある廃液弁３２４を持つ廃液ポンプ３１２を作動させることにより行うことができる。冷却ゾーン上のサンプルの移送は、コントローラ３００でポンプ３１２が流体をポートＣから引き込むときに比較的遅い流体移動流量（例えば、１ｃｃ／ｍｉｎ）を選択し、冷却ゾーン上を通るときにサンプルが適切に冷却されるようにすることにより提供できる。
【0047】
サンプルをハイブリッド形成ゾーン１４０、１４２、１４４、１４６内にロードする場合に、コントローラ３００は、ポンプ３１２のリニア・アクチュエータを制御するためにメモリから一組の弁およびモーター制御パラメータ（命令）３４６を取り出して実行できることに留意されたい。パラメータ３４６は、モーター識別子３４８、方向３５０、速度３５２、時間３５４、および弁位置３５６を含むことができる。
【0048】
リニア・アクチュエータがそれ専用のコントローラを備える場合、方向３５０、速度３５２、および時間をコントローラに単にダウンロードして実行するだけである。コントローラがコントローラ３００内の専用プログラムを使用することにより提供される場合、命令の実行は、コントローラ３００の中から行うことができる。
【0049】
（サンプルのロード前に）ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４は、最初、空気が充填されている可能性があることに留意されたい。したがって、ポートＣから引き込まれる流体は空気であろう。ポートＣから空気を引き出すと、サンプルはサンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４からハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６内に引き込まれる。
【0050】
サンプルをロードするプロセスの最後の工程として、コントローラ３００は、廃液ポンプ３１０をリセットすることができる。廃液ポンプ３１０をリセットするとは、一組の命令３５８をメモリから取り出すことを意味することがある。命令３５８は、廃液弁３２６にポート２と４との間の接続を形成させる命令３６８を含むことができる。命令３５８は、さらに、廃液ポンプ３１０を完全放出位置にまで移動させるのに必要なモーター識別子３６０、方向３６２、速度３６４、および時間３６６も含むことができる。
【0051】
サンプルをロードし、廃液ポンプ３１０をリセットし、本明細書で説明されている他のプロセス工程を実行する命令は、図１６および１７に示されているプロセス制御アプリケーションにより実行できることに留意されたい。図１６は、制御アプリケーションの機能全体を示すために使用することができ、図１７は、図１６の個別のブロック内で実行される活動を示すために使用することができる。
【0052】
制御アプリケーションの実行に関して、ＳＴＡＲＴボタン３４２を作動する、またはドアを閉じる動作で、ハイブリッド形成ユニット２０は多岐管７２および加熱／冷却ブロック６０に接触する。起動により、さらに、変性プロセス４００の完了を検出するコントローラ３００内のタイマーを起動できる。制御アプリケーションは、変性プロセス４００から、サンプル・ロード・プロセス４０２に進む。サンプル・ロード・プロセス４０２の第１工程として、アプリケーション５００はサンプル・ロード・ファイル３４６をロードし、実行する。第２の工程として、アプリケーション５００は、ポンプ・リセット・ファイル３５８をロードし、実行する。それぞれの場合において、アプリケーション５００は、弁の位置を決め、アクチュエータ位置決めパラメータをロードし、位置決めパラメータを実行する。プロセスが完了する毎に、アプリケーション５００は、次のプロセス工程に進む。
【0053】
図１０のフレーム３は、ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６内のオリゴヌクレオチドの鎖があるサンプルおよびプローブのハイブリッド形成を示している。この場合、コントローラ３００は、部分的にハイブリッド形成されたサンプルおよびプローブをハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６上で行き来させる機能を持つ４０４。
【0054】
部分的にハイブリッド形成されたサンプルをハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６上で往復させるために、アプリケーション５００は、洗浄ポンプ３１０および廃液ポンプ３１２を作動させ、反対方向に移動する一組の命令３７０、３７２を取り出して、実行する。この場合、命令３７０、３７２は、洗浄弁３２４がポート２と４の間の接続を形成し、廃液弁３２６がポート１と３の間の接続を形成するようにする。往復前進命令３７０は、洗浄ポンプ３１０が事前定義された距離だけ空位置へ移動し、廃液ポンプ３１２が事前定義された距離だけ充填位置へ移動するようにすることができる。洗浄ポンプ３１０および廃液ポンプ３１２が事前定義された距離に到達すると、アプリケーション５００は往復後退命令３７２を実行する。往復後退命令３７２は、洗浄ポンプ３１０が類似の距離だけ満杯位置に向けて移動し、廃液ポンプ３１２が類似の距離だけ空位置へ移動するようにすることができる。所定の距離に到達した場合、アプリケーション５００は、再び、往復前進命令３７０を実行することができる。
【0055】
アプリケーション５００が往復前進命令３７０を実行する毎に、カウンタ３７４は、インクリメントされる４０６。インクリメント毎に、カウンタ３７４内の値は、定義済みサイクル数の経過後に往復プロセスを終了させる往復サイクル限界値が設定されている比較器３７６内で比較できる４０８。
【0056】
ポンプ３１０、３１２は、最初は、空気を含んでいるので、ポンプ３１０、３１２の相互作用は、単に、サンプルをハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６のいずれかの末端上の通路内に押し込んだり、そこから押し出したりするだけであり、部分的にハイブリッド形成されたサンプルがいずれかのポンプ３１０、３１２に入ることはもしあったとしても非常に少ない。ハイブリッド形成ゾーン１４０、１４２、１４４、１４６上で部分的にハイブリッド形成されたサンプルを往復させることは、サンプルの同一性およびタイプにより決定される期間（例えば、１０〜６０分間）続けることができる。
【0057】
ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６内でオリゴヌクレオチド鎖を含むサンプルおよびプローブのハイブリッド形成の後、ハイブリッド形成された物質は、図１１のフレーム１および２内で示されているように洗浄することができる４１０。ハイブリッド形成された物質を洗浄するために、コントローラ３００は、洗浄ポンプ３１０および廃液ポンプ３１２を同時に作動させることができる一組の洗浄命令３７８を実行することができる。第１の工程として、命令３７８により、洗浄弁３２４はポート１と３との間に接続を形成することができる。次いで、洗浄ポンプ３１０が作動され、洗浄容器３３６から水を引き込むことができる。
【0058】
シリンジ・ポンプ３１０がいっぱいになると、命令３７８により、弁３２４はポート２と４との間に接続を形成することができる。廃液弁３２６も、ポート１と３との間に接続を形成するように移動することができる。洗浄ポンプ３１０および廃液ポンプ３１２は、同時に作動し、同じ速度で動作するようにすることができる。洗浄ポンプ３１０は、水をポートＡに押し込む機能を持ち、廃液ポンプ３１２は、流体をポートＣから引き出す機能を持つ。
【0059】
洗浄ポンプ３１０のシリンジが空位置に達すると、洗浄ポンプ３１２はその満杯位置に到達する。この段階で、洗浄弁３２４は移動してポート１と３の間の接続を形成し、廃液弁３２６は移動してポート２と４の間の接続を形成することができる。洗浄ポンプ３１０および廃液ポンプ３１２は、再び作動できる。この場合、洗浄ポンプ３１０は、そこで、洗浄容器３３６から再充填し、廃液ポンプ３１２は、次いで、廃液容器３３８内に放出する。充填するプロセスおよび空にするプロセスは、ハイブリッド形成ユニット２０から非ハイブリッド形成物質をフラッシングするために必要なサイクル数だけ繰り返すことができる。カウンタは、毎回の充填するサイクルと空にするサイクルの後にインクリメントされ、カウンタ内の値は、比較器内のサイクル限界値と比較され、それにより洗浄サイクルの完了を判定することができる。
【0060】
ハイブリッド形成された物質が洗浄された後、ハイブリッド形成された物質の検出可能なパラメータを増幅し、ハイブリッド形成を検出可能なようにする。検出可能なパラメータは、ハイブリッド形成された物質の有無を示す測定可能な数量とすることができる。例示されている実施形態では、ハイブリッド形成された物質の光学特性または導電特性を検出目的のために増幅することができる４１２。増幅は、この場合、ハイブリッドのナノ粒子上に銀溶液をメッキすることにより行われる。
【0061】
増幅は、銀Ａ溶液および銀Ｂ溶液をハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に通すことにより実行できる。銀Ａ溶液および銀Ｂ溶液をハイブリッド形成室に通すために、コントローラ３００は、銀Ａ弁３２０および銀Ｂ弁３１６にポート１と３との間の接続を形成させる一組の命令３８０を実行することができる。銀Ａポンプ３０６および銀Ｂポンプ３０２は、その後、命令３８０により作動し、銀Ａ溶液を銀Ａ容器３３２から銀Ａポンプ３０６に引き込み、銀Ｂ溶液を銀Ｂ容器３２８から銀Ｂポンプ３０２内に引き込むことができる。
【0062】
次いで、銀Ａ弁３２０および銀Ｂ弁３１６がポート２と４との間に接続を形成するように命令することができる。廃液弁３２６がポート２と４との間に接続を形成するように命令することができる。命令３８０で、銀Ａポンプ３０６および銀Ｂポンプ３０２の放出速度を指定することができ、コントローラ３００は、それらの速度で放出するようにポンプ３０６、３０２を作動させることができる。銀Ａポンプ３０６は、ポートＡに放出し、銀Ｂポンプ３０２は、ポートＢに放出することができる。命令３８０では、さらに、廃液ポンプ３１２の吸い込み速度を銀Ａポンプ３０６および銀Ｂポンプ３０２の出力に等しくなるように指定することもでき、コントローラ３００は、廃液ポンプ３１２を作動させて、ポートＣから選択された速度で流体を引き込むことができる。銀Ａポンプ３０６および銀Ｂポンプ３０２がそれらの物質をそれぞれのポートに放出し、廃液ポンプ３１２がポートＣから引き込まれた流体で満たされた後、弁３１６、３２０、３２６は、再び、命令３８０の制御の下で移動することができる。銀Ａ弁３２０および銀Ｂ弁３１６は、再び銀Ａポンプ３０６および銀Ｂポンプ３０２に銀溶液を充填するように位置決めすることができる。廃液弁３２６は、引き込まれた物質を廃液容器３３８内に放出するように位置決めできる。充填する工程および空にする工程は、サイクル限界値に基づきカウンタおよび比較器の制御の下で再びハイブリッド形成された物質を十分に増幅するために必要なサイクル数だけ繰り返すことができる。
【0063】
増幅工程が完了した後、停止溶液を図１３に示されているようにハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に通し、増幅を停止することができる４１４。この点で、コントローラ３００により一組の停止命令が実行され、ポート１と３との間の接続により停止弁３１８を位置決めすることができる。停止ポンプ３０４を作動させて、停止溶液容器３３０からポンプ３０４を充填することができる。その後、命令３８２の制御の下でコントローラ３００は、停止弁を移動して、ポート２と４との間に接続を形成し、廃液弁を移動して、ポート１と３との間に接続を形成することができる。その後、コントローラ３００は、停止ポンプ３０４の放出速度を選択し、停止ポンプ３０４を作動させることができる。コントローラ３００は、廃液ポンプ３１２の同じ引き込み速度を選択し、それと同時に、廃液ポンプ３１２を作動させ、ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６を通して停止溶液を引くことができる。弁３１８、３２６は、停止ポンプ３０４を再充填し、廃液ポンプ３１２を空にするように再配置することができ、プロセスを繰り返すことができる。
【0064】
さらに好ましい実施形態では、ポンプは決して再充填されない。この場合、ポンプ本体は、空になったら単純に交換される試薬カートリッジに一体化される。
【0065】
停止溶液がハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６に通された後、ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６は、ｄｄ水でフラッシングされ４１６、吸引され、図１４に示されているように残留流体が除去されるようにすることができる。
【0066】
ハイブリッド形成室１４０、１４２、１４４、１４６をフラッシングするために、フラッシュ命令３８４の下で動作するコントローラ３００は、フラッシュ弁３２２を移動し、ポート１と３との間に接続を形成し、フラッシュ・ポンプ３０８を作動させて、給水容器３３４から水を充填することができる。次いで、コントローラ３００は、フラッシュ・ポンプ３０８がポートＡに放出できるようにフラッシュ弁３２２を再配置し、またポートＣから流体を引き出せるように廃液弁３２６を再配置することができる。フラッシュ・ポンプ３０８が空になった後、弁３２２、３２６は、フラッシュ・ポンプ３０８を再充填し、廃液ポンプ３１２を空にするように再配置することができ、そのプロセスを繰り返すことができる。
【0067】
フラッシングが完了した後、命令３８４の制御の下で動作しているコントローラ３００は、吸引３１４を作動させることができる。吸引３１４では、流体をそれぞれのサンプル・ウェル１０８、１１０、１１２、１１４を通じて引き込まれた空気で追い出すことによりハイブリッド形成ユニット２０から残留流体を引き出すことができる。
【0068】
残留流体が除去された後、サンプル処理ユニット１２は、図１５に示されているようにロック解除し、ハイブリッド形成ユニット２０を取り外すことができる。基板５８をハイブリッド形成ユニット２０から取り外し、光学式読取装置１４内に置き、そこで、ハイブリッド形成されたサンプルの光学特性を読み取ることができる。
【0069】
本発明の他の例示されている実施形態では（図１８〜２０に示されている）、図２のハイブリッド形成ユニット２０上に示されている分配多岐管４４は、分配多岐管６００（図１８の完全なハイブリッド形成ユニット２０として示されている）で置き換えられる。図１９は、多岐管６００の裏側の図である。図２０は、図１８および１９の多岐管６００とともに使用できるガスケット７００を示している。
【0070】
図２の多岐管４４と同様に、図１８の分配多岐管６００は、対向する角にサンプル・ウェル６０２、６０４、６０６、６０８を備える。この分配多岐管６００は、それぞれのハイブリッド形成ゾーン７０８、７０６、７０４、７０２（図２０）に関連付けられている４つの廃液ポート６１０、６１２、６１４、６１６を備える。さらに図１９には、共通注入ポートが示されている。図１８、１９、および２０の多岐管６００は、図２１のシステムと併用するように特にうまく適合されていると考えられる。
【0071】
図１９は、図１９の分配多岐管６００の下側を示している。図に示されているように、図１８の各ポート６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８は、対応するフィードスルー６０２、６０４、６０６、６０８、６１０、６１２、６１４、６１６、６１８を備える。また、注入ポート６１８は、４つのフィードスルー点６２２、６２４、６２６、６２８で終端する分配多岐管６００の表面に配置されている溝６２０を備えることに留意されたい。
【0072】
次にガスケット７００を参照すると、ガスケット７００は、ハイブリッド形成室７０２、７０４、７０６、７０８および多数の接続溝を定めることがわかる。例えば、第１のハイブリッド形成室７０２は、サンプル・ウェル６０６、フィードスルー６２８、およびハイブリッド形成室７０２の第１の末端を接続する接続溝を備える。第１のハイブリッド形成室７０２は、さらに、ハイブリッド形成室７０２の第２の末端を廃液ポート６１６に接続する接続溝を備える。
【0073】
第２のハイブリッド形成室７０４は、サンプル・ウェル６０８、フィードスルー６２２、およびハイブリッド形成室７０４の第１の末端を接続する接続溝を備える。第２のハイブリッド形成室７０４は、さらに、ハイブリッド形成室７０４の第２の末端をプロセス・ポート６１４に接続する接続溝を備える。
【0074】
第３のハイブリッド形成室７０６は、サンプル・ウェル６０２、フィードスルー６２４、およびハイブリッド形成室７０６の第１の末端を接続する接続溝を備える。第３のハイブリッド形成室７０６は、さらに、ハイブリッド形成室７０６の第２の末端をプロセス・ポート６１２に接続する接続溝を備える。
【0075】
同様に、第４のハイブリッド形成室７０８は、サンプル・ウェル６０４、フィードスルー６２６、およびハイブリッド形成室７０８の第１の末端を接続する接続溝を備える。第２のハイブリッド形成室７０８は、さらに、ハイブリッド形成室７０８の第２の末端をプロセス・ポート６１０に接続する接続溝を備える。
【0076】
処理ユニット１２との流体多岐管７２およびポンプ接続も、分配多岐管６００が収まるように変更することもできることに留意されたい。この点で、図５のポート接続部ＡおよびＢは組み合わされ、それぞれのプロセス・ポート６１０、６１２、６１４、６１６に接続されることがわかる。図１８の廃液ポート６１８は、図５のポートＣに対応する。他の点では、分配多岐管６００を使用するハイブリッド形成ユニット２０は、上述のものと実質的に同じ動作をするであろう。
【0077】
本発明の他の例示されている実施形態では、多岐管７２は、ハイブリッド形成緩衝液および／またはプローブ用の交換可能カートリッジとの接続を備えることができる。この実施形態では、ユーザは、標的サンプルを単純にテスト・ウェルに加え、ハイブリッド形成ユニット２０をサンプル処理システム１２に挿入する。システム１２は、不足している要素をサンプル・ウェルに追加する。
【0078】
核酸サンプルを処理する方法および装置の特定の実施形態は、本発明が実施され使用される方法を例示することを目的として説明されている。本発明およびさまざまな態様の他の変更形態および修正形態の実装は、当業者には明らかであり、また本発明は、説明されている特定の実施形態によって限定されないことは理解されるであろう。したがって、これは、本発明および本明細書で開示され請求されている基本的な根底にある原理の真の精神および範囲に収まるあらゆる修正形態、変更形態、または均等物を包含することが企図されている。